螢光焦點調製顯微系統和方法

2023-05-15 08:09:26 2

專利名稱：螢光焦點調製顯微系統和方法
技術領域：
本發明總體地涉及光學顯微鏡，更具體地涉及螢光共焦光學顯微系統和方法。
背景技術：
已經開發多種光學顯微鏡，並且在現代生物研究和臨床診斷中已經使用了這些光學顯微鏡。常常需要這些光學顯微鏡來觀察細胞及其亞細胞結構。作為現代細胞生物學的 起源，在300多年以前開始發現了細胞，這是發明顯微鏡的直接結果。傳統的光顯微鏡具有 非常有限的成像深度。僅有表面顯微結構能夠被觀察，或者需要將樣品機械地分割為非常 薄的切片(slice)。作為光學層析能力(optical sectioningcapability)的結果，如美國 專利No. 3013467中所描述的共焦顯微術的發明導致成像深度的飛躍。用生物組織可以實 現至多200微米的穿透深度(penetration depth)。共焦顯微鏡通常用螢光染料工作，以提 供分子敏感性(sensitivity)和特異性。通過使用螢光分子的多光子激發，成像深度可以 進一步被提高到大約700微米。然而，多光子顯微鏡需要使用昂貴的脈衝雷射器。另外，脈 衝激光輸出可以對活體細胞產生非線性光子誘導破壞，對於人體的應用尤其不希望這樣。從微觀尺度到宏觀尺度，生物組織是非均質的(heterogeneous)。通常，由於光子 經受強散射和吸收，所以這些生物組織似乎對於可見光和近紅外光不透明。散射，尤其是 多次散射，在改變光子的傳播方向的成像科學中是不希望的現象。妨礙共焦顯微鏡看見生 物組織內的更深處的主要問題是多次散射。可以擴散到焦點體積(focal volume)的從焦 點區域發出的螢光不能被共焦針孔(confocal pinhole)充分地拒斥，從而有助於背景信 號。信號背景比(signal to background ratio)和空間解析度隨著深度增加而快速地劣 化。散射平均值自由程/s，即連續的散射事件之間的平均距離，在人的軟組織中的典型值 為大約100微米。雖然傳統的寬場顯微術僅僅能夠處理非常薄的樣品，但是由於提供光學 層析能力，所以共焦顯微術的發明在現代光顯微術中是一個顯著的進步。在共焦顯微鏡中， 用聚焦的光束照射樣品，對樣品逐點進行掃描，並且通過使用共焦針孔，將檢測系統聚焦到 樣品中的同一區域。在理想的情況中，在收集來自焦點的信號的同時，來自樣品的離焦光 (out-of-focus light)大部分地被拒斥。然而，在焦點移動到樣品中的散射光子佔彈道光 子(ballistic photon)中的主導的這樣深度時，這種選擇檢測機制不是如此有效。確定空 間解析度的點擴展函數隨著成像深度的增加而在空間中快速地擴寬。雖然在幾個/s的深 度可以檢測到強目標，但是即使在目標位於離表面的僅一個/s處時，通過背景信號也可以 容易地掩蓋高解析度細節。通常用共焦顯微鏡在幾十個微米的最大成像深度處執行亞細胞 成像。在多光子顯微術中，在小於1皮秒的超短時間窗內將聚焦的照明光束進一步會 聚。非線性吸收率在離焦時急劇地衰減，並且，在成像深度小於Imm時，這種選擇激發方法 是有效的。作為提高了的成像深度和局部化的光化學(localized photochemistry)的結 果，多光子顯微術已經日益成為對共焦顯微術的流行的另一種選擇。然而，多光子顯微術是 使用超短脈衝的雷射源的非常昂貴的技術。另外，在下述一些情況中單光子激發優於多光子激發其中，非線性光子破壞、螢光探針的可用性、組織自發螢光背景和圖像獲取速度備 受關注。光學相干X線體層照相術(tomography)是能夠提供高解析度結構圖像的相對較 新的成像技術。使用相干光柵來分解(resolve)來自不同深度的信號。由於多次散射光 子的相干性質在散射後喪失了，所以來自多次散射光子的貢獻被嚴重地抑制。用這種技術 可以輕易地實現幾個毫米的成像深度。該技術在視網膜前段成像(retinal andanterior segment imaging)中的應用已經被商業化。對該技術在下述領域中的潛在的應用正在進行 積極的研究組織工程產品表徵、血管評價、皮膚癌診斷和用於腸胃(GI)跟蹤的癌症檢測。 不幸的，光學相干X線體層照相術的對比機制是基於背散射，並且與螢光不兼容。很多研究 組一直試圖將諸如吸收和第二諧振產生的其它分子特定技術與光學相干X線體層照相術 連接起來。然而，除了其它限制以外，空間解析度通常與這些組合嚴格地妥協。光學相干X 線體層照相術中的相干光柵機制在拾取期望的信號方面是非常有效的。雖然多次散射的光 中的一些仍然到達光電檢測器，但是具有很好限定的光程長和偏振狀態的背散射、散射一 次或反射的光產生用於圖像形成的條紋信號。近來用傅立葉域技術進一步提高了成像深度 和速度。不幸的，光學相干X線體層照相術與螢光不兼容。雖然光學相干X線體層照相術 已經成功地應用到對人眼和中空器官的精細結構的可視化，但是其分子成像能力是相當有 限的。因此，需要一種解決上述缺陷或者至少減輕上面對傳統的光學 顯微鏡討論的問題 的光學顯微鏡。特別地，需要保持較深區域中的近衍射限制解析度並開發有效地防止與圖 像形成有關的多次散射光子的機制。

發明內容
本發明的一個方面提供一種螢光焦點調製顯微系統，該螢光焦點調製顯微系統包 括光源組件，用於產生光束並照射樣品的目標區域；空間相位調製器，被布置在光束的路 徑中並將光束分離為第一光束和第二光束，第一光束與第二光束平行並與第二光束在空間 上分離，第二光束被調製有與第一光束不同的相位延遲；聚焦組件，接收第一光束和第二光 束並照射樣品的目標區域；以及光電檢測器組件，用於接收從樣品的照射目標區域發射的 發光信號，並且將由光電檢測器檢測到的發光信號轉換為具有直流分量和交流分量的光電 信號。在實施例中，該系統還包括處理器和顯示器，處理器基於接收光電信號並根據交 流分量的交流振幅和直流分量的直流幅度之和計算最大發射強度，處理顯示器上的圖像， 並且/或者，處理器基於接收光電信號和將圖像基於光電信號的交流分量，處理顯示器上 的圖像。空間相位調製器可以包括波長掃描源和差分延遲線，並且，波長掃描源可以被布 置為在光路中以預定的差重複地掃動光源的波長。空間相位調製器可以包括第一反射鏡 和第二反射鏡，第二反射鏡可相對於第一反射鏡移動，以相對於第一光束調製第二光束，其 中，第二反射鏡可以被安裝在壓電致動器上，並且第一光束和第二光束之間的相對相移取 決於施加到壓電致動器的電壓。空間相位調製器可以沿著從光源產生的光束的路徑和從 樣品的照射目標區域發射的光的路徑布置。聚焦組件可以包括二向色鏡和物鏡，並且，空間相位調製器可以沿著光束的路徑布置在二向色鏡的上遊或下遊。該系統還可以包括掃 描組件，用於相對於樣品掃描第一光束和第二光束，其中，掃描組件可以包括轉向反射鏡 (steering mirror)，用於相對於樣品掃描第一光束和第二光束，並且/或者，掃描組件包括 用於保持樣品的保持器或可移動載物臺(movable stage)和用於相對於第一光束和第二光 束可移動地掃描樣品的致動器。該系統還可以包括在從樣品的照射目標區域發射的發光信 號的路徑中的光闌，以防止從樣品的非目標區域發射的光到達光電檢測器，其中，光闌可以 是，例如，針孔、狹縫、長通濾波器、光纜等。光源可以被布置用於單光子激發、多光子激發 等。光電檢測器組件還可以包括光電倍增器，用於將由光電檢測器檢測到的發光信號轉換 為具有直流分量和交流分量的光電信號。本發明的一個方面提供一種用於執行螢光焦點調製顯微術的方法，該方法包括 產生用於照射樣品的目標區域的光束；用被布置在光束的路徑中的空間相位調製器將光束 分離為第一光束和第二光束，第一光束與第二光束平行並與第二光束在空間上分離，第二 光束被調製有與第一光束不同的相位延遲；用聚焦組件將第一光束和第二光束聚焦；用第 一光束和第二光束照射樣品的目標區域；接收從樣品的照射目標區域發射的發光信號；以 及將由光電檢測器檢測到的發光信號轉換為具有直流分量和交流分量的光電信號。在實施例中，該方法還包括基於接收光電信號並根據交流分量的交流振幅和直流 分量的直流幅度之和計算最大發射強度，處理顯示器上的圖像，並且/或者，基於接收光電 信號和將圖像基於光電信號的交流分量，處理顯示器上的圖像。將光束分離可以包括將光 束分離為第一光束和第二光束，並且包括在光路中以預定的差重複地掃動光源的波長。將 光束分離為第一光束和第二光束可以包括空間相位調製器，該空間相位調製器包括第一反 射鏡和第二反射鏡，並且相對於第一反射鏡移動第二反射鏡以相對於第一光束調製第二光 束。第二反射鏡可以被安裝在壓電致動器上，並且通過將電壓施加到壓電致動器，在第一光 束和第二光束之間產生相對相移。該方法還可以包括相對於樣品掃描第一光束和第二光 束。該方法還可以包括通過將光闌放置在從樣品的照射目標區域發射的發光信號的路徑 中，防止從樣品的非目標區域發射的光到達光電檢測器。用於分離光束的空間相位調製器 可以沿著從光源產生的光束的路徑布置。空間相位調製器還可以沿著從樣品的照射目標區 域發射的光的路徑布置。


為了可以通過非限制性的例子全面、更清楚地理解本發明的實施例，結合附圖進 行如下的描述，在附圖中相同的附圖標記表示相似或相應的元件、區域和部分，並且，在附 圖中圖1是根據本發明實施例的具有空間相位調製的螢光焦點調製顯微鏡的示意框 圖；圖2A-B示出根據本發明實施例的空間相位調製的配置；圖3是根據本發明實施例的具有波長掃描源的空間相位調製器的示意框圖；圖4是根據本發明實施例的空間相位調製器的示意圖；圖5是根據本發明實施例的具有空間相位調製的螢光焦點調製顯微鏡的示意框 圖6A-C示出根據本發明實施例的螢光微球的圖像的共焦顯微圖像(圖6A)和焦點調製顯微圖像(圖6B)、以及共焦顯微信號和焦點調製顯微信號的作為離焦的函數的曲 線圖(圖6C)；圖7A-D示出根據本發明實施例的以400微米的深度的軟骨細胞的圖像的共焦顯微圖像(圖7A)和焦點調製顯微圖像(圖7B)、以及各自較高的放大(圖7C-D)；以及圖8示出根據本發明實施例的方法的流程圖。
具體實施例方式公開了焦點調製顯微系統和方法。根據本發明實施例的技術以可比得上結合有分 子特異性的光學相干X線體層照相術的成像深度為目標。通過在激發光路中使用空間相 位調製器，即使在焦點位於混濁介質內的深處時，也主要僅僅在焦點體積中實現強度調製。 可以輕易地將檢測到的螢光信號中的振蕩分量與由多次散射引起的背景信號區分開。實 施方式允許同時獲取共焦顯微圖像和焦點調製顯微圖像。使用取自雞的組織模型(tissue plantom)和軟骨組織，用一系列圖像實驗來演示焦點調製顯微術的優點。可以用根據本發 明實施例的焦點調製顯微術實現相對於傳統共焦顯微系統的改進的成像穿透深度，該焦點 調製顯微術包括較低噪聲雷射器和較低暗電流的光電檢測器。在圖1中示出根據本發明實施例的螢光焦點調製顯微系統10。系統機構(system setup)類似於共焦顯微鏡，該系統機構包括激發光源16 ；包括物鏡的聚焦組件30 ；2維掃 描鏡28 ；二向色鏡22 ；透鏡20 ；光闌24 ；光電檢測器26 ；和用於保持樣品40的保持器或載 物臺32。光源產生激發光束34。空間相位調製器18被引入到激發光路中，並且，為圖像形 成檢索時間改變發射信號。由光源產生激發光束，該光源可以是，例如，雷射器或者低時間 相干源等。然而，激發光束34可以具有良好的空間相干性，並且可以被形成為平行光束。空 間相位調製器可以是反射的或透射的。空間調製器18可以具有快時間響應，使得可以使用 高調製頻率(f MHz)。具有處理器38、存儲器118、輸入器116和數據獲取(DAQ)系統14 的個人計算機12可以處理在檢測器上檢測到的信號，以在顯示器114上顯示樣品的圖像。圖2A-B示出相位調製器調製圖案的兩個例子。在圖2A中，光闌被分成兩個大致 相同面積的圓形區50。激發光束34被分成相同強度的中心光束52和外周光束54。通過 透明區的周圍光束經受恆定的相位延遲。用例如頻率(f)的諧振信號的時間改變信號調製 中心光束的相位，使得這兩條光束之間的相差在0和Ji之間交替地切換。在圖2B中，光闌 60被分成兩個半圓62，64。相位調製僅僅被引入到陰影區52，62。在這兩種情況中，兩條平 行光束被形成有時間改變相差。這些光束通過二向色鏡並被2D掃描鏡偏轉到無限校正的 物鏡。焦點周圍的激發光強度取決於兩條入射光束之間的相差。當這兩條光束同相位時， 它們彼此相長幹涉，並且焦點體積內的強度達到最大值。當相差為n時，這兩條光束在焦 點處彼此相消幹涉，並且光功率被引導到焦點體積的右外側。在相位調製的同一頻率處發 生強度波動，並且，強度波動被限制在焦點周圍的區域。在厚組織樣品的其它區域中的激發 光的分布保持恆定。這是因為入射光束的彈道分量僅僅在焦點處彼此相遇。多次散射的光 子喪失了其相干性，並且不會產生任何強度漲落。來自焦點體積的螢光發射36被同一物鏡 收集，被2D掃描鏡解掃描(descan)，被二向色鏡反射，被透鏡聚焦，並且在被光電檢測器檢 測之前通過針孔。另一個濾光器可以被插入在光電檢測器之前，以進一步抑制激發光。光闌24可以是針孔，並且可以用具有小芯直徑的光纖替代。針孔與其它光纖部件一起限定樣 品內的檢測體積。光電檢測器組件26可以包括諸如線CCD等的檢測器陣列。包括這種檢 測器陣列的光電檢測器組件可以與狹縫光闌等一起使用，或者，在另一個實施例中，檢測器 陣列自身可以充當狹縫光闌。光電檢測器組件還可以包括光電倍增器(PMT)102，用於將由 光電檢測器檢測到的發光信號轉換為具有直流分量和交流分量的光電信號。當檢測體積與 焦點體積匹配或者被包圍在焦點體積內時，強交流分量存在於檢測的光電信號中。交流信 號的振幅僅僅在檢測體積中與螢光分子的濃度成比例。該機構也可以在沒有針孔的情況下 工作。在這種情況下，交流信號與焦點周圍的螢光團濃度的差分變化相關。正如傳統共焦 顯微鏡中一樣，逐點對樣品進行掃描，以獲得交流振幅和/或相位的2D或3D圖，這些2D或 3D圖是可以由該顯微鏡實現的分子特定圖像。圖2A-2B示出調製圖案的例子，但是將會理 解，可以想像到相位調製器的其它配置，例如，可以在這兩條光束之間存在比圖2A-2B中示 出的間隙大的間隙，光闌可以是具有粗邊界的鋸齒狀光闌等。實現空間相位調製的另一可選擇的方法是使用波長掃描源80，如圖3所示。示出了具有波長掃描源的空間相位調製器70，並且來自光源的輸出光束78通過 差分延遲線72，該差分延遲線72導致在光程長中具有一定(例如，非零)差的兩條平行光 束。第一光束74是未調製的光束84，並且，第二光束76是調製光束86。當重複地掃動光 源的波長時，對這兩條光束之間的相差進行調製。由於檢測到的螢光發射中的交流信號僅 僅來自焦點體積，所以焦點調製技術等同於多光子顯微術中的選擇激發。在單光子激發的 系統的實施例中，僅僅需要低功率CW光源。然而，原則上，可以將該技術與甚至更大的成像 深度的多光子激發相結合。圖5示出該系統的另一個實施例。圖5是根據本發明實施例的原型焦點調製顯微系統100的示意圖。圖5示出原型 焦點調製顯微系統的示意圖。660nm激發光束34的空間相位分布通過使用兩個平行反射鏡 90，92(分別為M1，M2)來被調製。該系統可以具有擴束器110。如在圖4中詳細地示出，Ml 相對於光束是穩定的，並且，M2是相對於Ml是軸向振蕩的。例如，M2可以以5kHz振蕩。來 自焦點體積的螢光發射36由基於光纖的共焦檢測系統收集，然後，從圖像信息檢索以5kHz 的振蕩分量94。個人計算機12與該系統互連112，並且用於使用處理器38的數據獲取和 分析(DAQ) 14、使用快轉向反射鏡28的橫向掃描和使用3D載物臺的軸向掃描。將會理解， 掃描組件可以不同地配置，使得保持樣品40的保持器或載物臺32可以相對於光束被掃描。 另外，空間相位調製器18被示出布置在由光源產生的光束的路徑中，將會理解，空間相位 調製器18也可以被配置在沿著光束路徑的其它位置處，並且可以被配置在例如二向色鏡 22或掃描鏡28和物鏡20之間的從樣品的照射目標區域發射的光的路徑中。在實施例中， 調製器被放置為例如，通過將調製器放置在分束器和掃描鏡之間，使得螢光在被檢測之前 也通過調製器。圖8示出根據本發明實施例的方法200的流程圖。產生202光束。將光束分成 204第一光束和第二光束。相對於第一光束對第二光束進行調製，並且，對第一光束和第二 光束進行聚焦206，以在樣品的目標區域上進行照射。檢測器接收208從樣品的照射目標區 域發射的發光信號。將發光信號轉換210為具有直流分量和交流分量的光電信號。光電信 號的圖像可以由計算機12中的處理器14，38處理，並且在顯示器114上顯示。基於接收光電信號和從交流分量的交流振幅和直流分量的直流幅度之和計算最大發射強度，處理器可 以處理顯示器114上的圖像。基於接收光電信號和將圖像基於光電信號的交流分量，處理 器可以處理顯示器114上的圖像。可以檢測信號的其它分量。例如，與檢測信號的同相和 正交分量的鎖定放大器一樣，可以檢測交流信號的相位。如已經討論的，焦點調製顯微系統是基於共焦顯微鏡。將空間相位調製器18插入 到激發光路中。光源是，例如，660nm固態雷射器，該固態雷射器的5mW輸出光束的直徑從 1mm擴展到大約5mm。這樣的雷射器是，例如，美國新澤西州Barrington的Edmund Optics Inc.的NT57-968。當光束通過空間相位調製器時，該光束被分成兩條空間分離的半光束， 對這些光束進行不同的相位延遲。在實施例中，用虛線框內的兩個平行反射鏡(Ml和M2) 實施空間相位調製，每一個反射鏡將激發光束的一半偏轉到另一個反射鏡M3。在M2被安裝 在壓電致動器上的同時，將Ml被安裝在固定基底上。這種壓電致動器是，例如，美國新澤西 州Newton的Thorlabs Inc.的AE0203D04。這兩半光束之間的相對相移取決於施加到壓電 致動器的電壓。在當前配置中，單頻率f_5kHz的正弦電壓信號被重疊在適當的DC偏壓上， 以周期性地改變0和Ji之間的相對相移。被M3偏轉後的空間相位調製激發光束通過50/50分束器(BS)或二向色鏡，並且 由2維快轉向反射鏡引導到20X物鏡。轉向反射鏡可以是，例如，得自美國加利福尼亞州 Irvine的Newport Corporation的FSM-300-01，並且，物鏡可以是，例如，得自日本東京的 Olympus Inc.的LUCPLFLN 20X。由於改變的空間相位分布，進入物鏡光闌的激發光束不必 一定會聚到焦點。因此，在焦點周圍實現激發光的強度調製。當焦點在混濁介質內時，到達 焦點的激發光子包括兩個彈道的、未散射的和散射的光子。僅有彈道光子有助于振蕩的激 發率，因為它們具有很好限定的相位和偏振。若有的話，螢光發射由同一物鏡收集，並且，由 同一快轉向反射鏡執行解掃描。長通濾波器106用來拒斥660nm的激發光。長通濾波器可 以是，例如，得自美國佛蒙特州Brattleboro的Omega Optical Inc.的3RD670LP。然後， 用消色差透鏡108對螢光進行聚焦，並且，將螢光耦合到單模式光纖119中，該單模式光纖 可以充當檢測針孔。光電倍增管(PMT)102將由光纖傳送的弱光信號轉換為電信號，該電信 號在被數位化到個人計算機12中之前由40分貝放大器104進一步增強。由於調製激發和 隨機噪聲，獲取的光電信號包含直流分量、以5kHz的交流分量。光電倍增管116可以是，例 如，日本的Hamamatsu Photonics Co.的R7400U-20。在個人計算機上執行快傅立葉變換 (FFT)，以檢索交流和直流信號二者。交流振幅和直流幅度之和等於最大發射強度，從而等 同於傳統的共焦顯微信號。然而，焦點調製顯微術僅僅使用交流振幅用於圖像形成。個人 計算機12還控制2D快轉向反射鏡以逐點掃描樣品，從而同時獲得共焦顯微圖像和焦點調 制顯微圖像。螢光微球的成像用組織模型執行成像，以表徵散射介質中的焦點調製顯微術的光學層析能力。猩 紅的螢光聚苯乙烯微球，例如，得自美國加利福利亞州Carlsbad的Invitrogen Inc.的 FluoSpheres F8843，被分布在蓋玻片的表面上。微球的激發/發射峰分別是645/680nm。 用例如得自Olympuslnc.的LUCPLFLN 20X的20X物鏡對微球直接成像，在橫向和軸向分辨 率方面顯示共焦顯微圖像和焦點調製顯微圖像之間略有不同。然後，螢光層由白色膠製的 均質散射層覆蓋。散射層的厚度是大約100微米，大致等於2/s。以50nm的最小增量運動將樣品安裝在例如得自Thorlabs Inc.的T25XYZ/M的3-軸電動平移載物臺。圖6A示出在將激發光束聚焦在這些較小微球的頂表面上獲取的微球的共焦顯微 圖像。在圖6B中示出同時獲取的焦點調製顯微圖像，這清楚地揭示了關於表面的更多的細 節。容易看出，在焦點調製顯微圖像的中間的微球在中心呈暗色，並且，僅僅其邊界是可見 的。原因是，該微球大於其它的微球，並且其頂表面是離焦的。相反，同一微球看起來完整 無缺，並且幾乎與共焦顯微圖像中的其它微球一樣亮。為了進一步比較光學層析能力，通過 將平移載物臺以4微米增量移動來軸向地掃描樣品。在圖6C中，在微球處於焦平面中被歸 一化為峰值的信號電平被描繪為散焦量AZ的函數。焦點調製顯微信號被限制在大約7微 米的FWHM(半峰全寬)，這比得上物鏡場深度( 6.5微米)。共焦顯微信號的峰值位置向 後稍微偏移，並且，FWHM被增大至大約23微米。如圖6A-C所示，實現大約400微米的成像 深度。圖6A-B示出被2/s厚的散射介質覆蓋的螢光微球的圖像。圖6A示出螢光微球的共 焦顯微圖像120。圖6B示出同時獲取的焦點調製顯微圖像122，示出高解析度細節。圖6C 示出共焦顯微信號132和焦點調製顯微信號134作為散焦的函數的曲線圖130。焦點調製 顯微術的很窄的軸向輪廓表示不被散射妥協的光學層析能力。雞軟骨中的軟骨細胞的成像為了演示用於細胞和亞細胞結構和功能的活體成像的方法，雞軟骨是樣品組織， 以評價焦點調製顯微術的性能。軟骨細胞是在軟骨中發現的唯一細胞。這些細胞通常呈圓 形或鈍角形式，位於腺狀或幾乎均質的母體中的兩個以上的組中。親脂螢光示蹤劑用來標 記細胞膜，使得僅有軟骨細胞在螢光焦點調製顯微圖像和共焦顯微圖像中是可見的。雞軟骨被切成大約1mm厚的切片，並且用DiR(DilC18(7))、即具有780nm的發射峰 的親脂示蹤劑標記。用原型焦點調製顯微系統以220至400微米的範圍內的各種深度掃描 樣品。在大約220微米的深度處獲取共焦顯微圖像。各個細胞的邊界是模糊的，並且，它們 都具有相似的形狀。在相應的焦點調製顯微圖像中，較高的解析度和更好的對比度是顯然 的。在280微米的深度處，在共焦顯微圖像中，背景信號似乎甚至更強。聚焦深度以外的細 胞投下了不能與焦平面中的細胞區分開的陰影。此外，焦點調製顯微圖像被獲取，並且顯示 了不妥協的光學層析能力和空間解析度，這些對於精確評價細胞密度、研究細胞形態學和 螢光染料的位點特異性結合能力而言是基本的。製備組織樣品獲得新鮮的雞翅，並且將軟骨切成1mm厚的切片。用PBS清洗軟骨切片，然後，用 4%多聚甲醛將軟骨切片固定在4°C下24個小時。在4°C下將固定的組織浸沒在乙醇的ImM DiR(DilC18(7),Invitrogen)儲備溶液中大於24個小時，以允許深區域中的細胞充分著色。 用PBS衝洗標記的樣品，然後用抗衰減的聚乙烯醇安裝介質將標記的樣品安裝在玻璃載片 上並被蓋玻片覆蓋，例如，該抗衰減的聚乙烯醇安裝介質得自美國密蘇裡州的St. Louis的 Sigma-Aldrich 的產品 No. 10981。焦點調製顯微圖像和共焦顯微圖像獲取，樣品被安裝在3-軸載物臺上，以便精確 電動定位。用點至點掃描同時獲取焦點調製顯微圖像和共焦顯微圖像。根據成像深度和信 號強度，在每一個像素上的停留時間在1至20ms之間變化。每一個圖像由具有0. 5微米步 長的200X200像素構成，並且被插入到400X400像素。在具有雞軟骨的成像實驗中，附加 的 射濾波器，例如，得自Thorlabs Inc.的RG715，被添加用來進一步拒斥激發光。
圖7A-D示出從400微米深度處的雞軟骨獲得的軟骨細胞的共焦調製圖像140 (圖 7A)和焦點調製顯微圖像142(圖7B)。在圖7A-B中的框區域的較高放大率顯示圖像144， 146分別被示出在圖7C-D中，其中，尺度棒是20微米。圖7B示出焦點調製顯微圖像，圖7A 示出從400微米深度獲得的共焦顯微圖像。從焦點調製顯微圖像即圖7B評價的細胞密度 類似於較淺區域中的那些細胞密度，然而共焦顯微圖像即圖7A包含更多的來自鄰近層的 細胞。視場的左下角中的小區域被放大並被顯示在圖7C-D中，以便圖像質量比較。因此，公開一種螢光焦點調製顯微系統和方法，以便對具有單光子激發螢光的厚 生物組織進行高解析度分子成像。通過使用焦點調製，即用於抑制由散射光激發的背景熒 光信號的技術，對於多散射介質內的成像，保持光學層析和衍射有限空間解析度。焦點調製 顯微系統具有插入在激發光路34中的空間相位調製器18，該空間相位調製器以預定頻率 周期性地改變焦點體積周圍的相干激發光的空間分布。用解調的螢光在顯示器114上形成 螢光焦點調製圖像122，142，然而共焦圖像120，140同時是可變的。本發明的實施例實現了 可比得上光學相干X線體層照相術和多光子顯微術的穿透深度。根據本發明的實施例，所 實現的成像穿透深度明顯大於用傳統的共焦螢光顯微術可實現的成像穿透深度。然而，本 發明的實施例不需要用於選擇性激發的脈衝雷射源。如已經描述的那樣，本發明的實施例 使用彈道雷射的相干性來僅僅通過焦點調製技術選擇性地從焦點體積拾取分布。控制激發 光束以在焦點周圍產生強度波動。來自此區域的螢光發射具有不存在背景信號的同一頻率 的交流分量。由於交流信號的起源被限制在由彈道激發光限定的小體積內，所以對於比共 焦顯微術更大的成像深度，可以保持解析度和對比度。各實施例與螢光兼容，並且可以用寬 範圍的市售的螢光染料工作。對人體或動物模型中的細胞結構和機能的活體成像成為可能 且不太昂貴。對於此新成像技術，存在寬範圍的應用。將會這樣理解，如針對圖1-8所描述的各個實施例是出於示例性的目的，因為用 於實施公開的示例實施例的具體硬體的諸多變型是可能的。例如，可以通過一個或多個編 程計算機系統或裝置來實施上述實施例的個人計算機12的功能和這種變型，以執行這些 示例系統的一個或多個裝置和子系統的功能。針對圖1-8描述的示例系統可以用來存儲與 這裡描述的各種處理有關的信息。這種信息可以存儲在上述實施例的裝置和子系統的諸如 硬碟、光碟、磁光碟、RAM等的一個或多個存儲器中。上述裝置和子系統的一個或多個數據 庫可以存儲用於實施示例實施例的信息。使用包含在諸如各種存儲器的一個或多個存儲器 中的諸如記錄、表格、陣列、欄位(field)、圖形、樹(tree)、列表等的數據結構，可以組織上 述資料庫。使用根據公開的示例實施例的教導編程的一個或多個通用計算機系統、微處理 器、數位訊號處理器、微控制器等，可以方便地實施針對圖1-8描述的示例系統的所有和一 部分。本領域的普通程式設計師基於公開的示例實施例的教導可以輕易地製備合適的軟體。另 外，通過製備專用集成電路或者通過將元件電路的合適的網絡互聯，可以實施示例系統。雖然已經描述和示出本發明的各實施例，但是本領域的技術人員將會理解，在不 脫離本發明的情況下，可以對設計或構造的細節作出諸多變型或修改。
權利要求
一種螢光焦點調製顯微系統，包括光源組件，用於產生光束並照射樣品的目標區域；空間相位調製器，被布置在光束的路徑中並將光束分離為第一光束和第二光束，第一光束與第二光束平行並與第二光束在空間上分離，第二光束被調製有與第一光束不同的相位延遲；聚焦組件，接收第一光束和第二光束並照射樣品的目標區域；以及光電檢測器組件，用於接收從樣品的照射目標區域發射的發光信號，並且將由光電檢測器檢測到的發光信號轉換為具有直流分量和交流分量的光電信號。
2.根據權利要求1所述的系統，還包括處理器和顯示器，該處理器用於基於接收光電 信號和從交流振幅和直流幅度之和計算最大發射強度，處理顯示器上的圖像。
3.根據權利要求1所述的系統，還包括處理器和顯示器，該處理器基於接收光電信號 和將圖像基於光電信號的交流分量，在顯示器上顯示圖像。
4.根據權利要求1-3中的任意一項所述的系統，其中，空間相位調製器包括波長掃描 源和差分延遲線。
5.根據權利要求4所述的系統，其中，波長掃描源被布置為在光路中以預定的差重複 地掃動光源的波長。
6.根據權利要求1-5中的任意一項所述的系統，其中，空間相位調製器包括第一反射 鏡和第二反射鏡，第二反射鏡可相對於第一反射鏡移動，以相對於第一光束調製第二光束。
7.根據權利要求6所述的系統，其中，第二反射鏡被安裝在壓電致動器上，並且第一和 第二光束之間的相對相移取決於施加到壓電致動器的電壓。
8.根據權利要求1-7中的任意一項所述的系統，其中，聚焦組件包括二向色鏡和物鏡。
9.根據權利要求8所述的系統，其中，空間相位調製器沿著光束的路徑布置在二向色 鏡的上遊。
10.根據權利要求8所述的系統，其中，空間相位調製器沿著光束的路徑布置在二向色 鏡的下遊。
11.根據權利要求1-10中的任意一項所述的系統，其中，空間相位調製器沿著從光源 產生的光束的路徑和從樣品的照射目標區域發射的光的路徑布置。
12.根據權利要求1-11中的任意一項所述的系統，還包括用於相對於樣品掃描第一光 束和第二光束的掃描組件。
13.根據權利要求12所述的系統，其中，掃描組件包括用於相對於樣品掃描第一光束 和第二光束的轉向反射鏡。
14.根據權利要求12所述的系統，其中，掃描組件包括用於保持樣品的保持器和用於 相對於第一光束和第二光束可移動地掃描樣品的致動器。
15.根據權利要求1-14中的任意一項所述的系統，還包括在從樣品的照射目標區域發 射的發光信號的路徑中的光闌，以防止從樣品的非目標區域發射的光到達光電檢測器。
16.根據權利要求15所述的系統，其中，光闌是從包括針孔、狹縫、長通濾波器或光纜 的組中選擇的。
17.根據權利要求1-16中的任意一項所述的系統，其中，光源被布置用於單光子激發。
18.根據權利要求1-16中的任意一項所述的系統，其中，光源被布置用於多光子激發。
19.根據權利要求1-18中的任意一項所述的系統，其中，光電檢測器組件還包括光電 倍增器，用於將由光電檢測器檢測到的發光信號轉換為具有直流分量和交流分量的光電信號。
20.一種用於執行螢光焦點調製顯微術的方法，包括產生用於照射樣品的目標區域的光束；用被布置在光束的路徑中的空間相位調製器將光束分離為第一光束和第二光束，第一 光束與第二光束平行並與第二光束在空間上分離，第二光束被調製有與第一光束不同的相 位延遲；用聚焦組件將第一光束和第二光束聚焦；用第一光束和第二光束照射樣品的目標區域；接收從樣品的照射目標區域發射的發光信號；以及將由光電檢測器檢測到的發光信號轉換為具有直流分量和交流分量的光電信號。
21.根據權利要求20所述的方法，還包括基於接收光電信號和從交流振幅和直流幅 度之和計算最大發射強度，處理顯示器上的圖像。
22.根據權利要求20所述的方法，還包括基於接收光電信號和將圖像基於光電信號 的交流分量，處理顯示器上的圖像。
23.根據權利要求20-22中的任意一項所述的方法，其中，將光束分離為第一光束和第 二光束包括在光路中以預定的差重複地掃動光源的波長。
24.根據權利要求20-23中的任意一項所述的方法，其中，將光束分離為第一光束和第 二光束包括空間相位調製器，該空間相位調製器包括第一反射鏡和第二反射鏡，並且相對 於第一反射鏡移動第二反射鏡以相對於第一光束調製第二光束。
25.根據權利要求24所述的方法，其中，第二反射鏡被安裝在壓電致動器上，並且通過 施加電壓到壓電致動器來產生第一和第二光束之間的相對相移。
26.根據權利要求20-25中的任意一項所述的方法，還包括相對於樣品掃描第一光束 和第二光束。
27.根據權利要求20-26中的任意一項所述的方法，還包括通過將光闌放置在從樣品 的照射目標區域發射的發光信號的路徑中，防止從樣品的非目標區域發射的光到達光電檢 測器。
28.根據權利要求20-27中的任意一項所述的方法，其中，用於分離光束的空間相位調 制器沿著從光源產生的光束的路徑和從樣品的照射目標區域發射的光的路徑布置。
全文摘要
公開一種螢光焦點調製顯微系統(10)和方法(200)，以便對具有單光子激發螢光的厚生物組織(140)進行高解析度分子成像。通過使用焦點調製，即用於抑制由散射光激發的背景螢光信號的技術，對於多散射介質內的成像，保持光學層析和衍射有限空間解析度。焦點調製顯微系統具有插入在激發光路(34)中的空間相位調製器(18)，該空間相位調製器以預定頻率周期性地改變焦點體積周圍的相干激發光的空間分布。用解調的螢光在顯示器(114)上形成螢光焦點調製圖像(122，142)，然而共焦圖像(120，140)同時是可變的。
文檔編號G02B21/00GK101802675SQ200880023668
公開日2010年8月11日 申請日期2008年7月7日 優先權日2007年7月6日
發明者C·H·翁, C·謝潑德, Ng·陳 申請人:新加坡國立大學