內抑制素的突變體,具有抗血管生成活性的「em1」及其使用方法

2023-05-15 06:59:06 2

專利名稱：內抑制素的突變體,具有抗血管生成活性的「em1」及其使用方法
相關申請本申請要求1997年12月8日提交的60/082，663申請，1998年4月22日提交的60/083，663申請，和1998年11月16日提交的60/108，536申請的優先權，其全部內容參考收入本篇。
本發明的背景轉移性癌症的預後症狀保持著較大可能的不利情況。儘管有放療和化療的改進，但經過過去幾十年接受治療的患者的長期存活率僅表現出邊界改進。缺少適用於轉移性癌症的顯著治療方法強調了應集中發展新型治療方法。在這一方面，針對固體腫瘤的腫瘤脈管系統治療在幾種動物模型系統中顯示出很有希望的結果(Baillie 等人(1995)Br.J.癌症72257-67；Bicknell，R.(1994)Ann.Oncol.5(增刊)445-50；Fan等人(1995)趨勢Pharmacol.科學1657-66；Thorpe，P.E.及Burrows，F.J.(1995)乳腺癌研究。治療34237-51；Burrows，F.J.和THhorpe，P.E.(1994)Pharmacol.Ther.64155-74)。如在裸鼠模型中，將野生VHL基因引入到786-0細胞，RCC腫瘤細胞系中，抑制了腫瘤生長(Iliopoulos等人。(1995)Nat.Med.1822-26)和血管生成。
超過若干立方毫米(mm3)的固體腫瘤的生長取決於新血管的形成(Folkman，J.(1971)N.Engl.J.Med.2851182-86)。大量的研究已顯示原發性腫瘤和轉移性生長都與血管生成有關(Folkman，J.(1971)N.Engl.J.Med.2851182-86；Folkman，J.(1972)Ann.Surg.175409-16；Folkman，J.和Shing，Y.(1992)J.生物化學。26710931-34；Folkman，J(1996)科學.Am．275150-54)。一些血管生成抑制劑已經確定。某些種類，如血小板因子-4(Maione等人(1990)科學24777-79；Gupta等人(1995)Pro，Natl.Acad.科學(USA)927799-7803)，幹擾素α，幹擾素-可誘導蛋白質-10，和PEX(Angiolillo等人(1995)J.Exp.Med.182155-62；Strieter等人(1995)生物化學，生物物理，研究，交流。21051-57；Brooks等人(1998)細胞92391-400)，是「與腫瘤無關的」，而其他兩種，即抗血管生成素(angiostatin)和內抑制素(endostatin)是「與腫瘤有關的」(O』Reilly等人(1994)細胞79315-28；O』Reilly等人(1997)細胞88277-85)。抗血管生成素，一種由調節基質金屬彈性蛋白酶的腫瘤-滲透巨噬細胞產生的有效的血管生成內生抑制劑，抑制很多種原發及轉移性腫瘤的生長(Lannutti等人(1997)癌症研究，575277-80；O』Reilly等人(1994)冷泉港，Symp.Quant.Biol.59471-82；O』Reilly，M.S.，(1997)Exs.79273-94；Sim等人(1997)癌症研究。571329-34；Wu等人(1997)生物化學，生物物理，研究，交流236651-54)。
目前，O』Reilly等人[(1997)細胞88277-85]從鼠血管內皮瘤細胞系(EOMA)中分離的了內抑制素，一種血管生成抑制劑。在患有慢性腎不足但沒有可檢測到的腫瘤的患者中已檢測到人類內抑制素片段的循環量，但這個片段含有缺失，沒有抗-血管生成活性(Standker等人(1997)FEBS LETT.420129-33)。內抑制素的氨基端序列與膠原質ⅩⅧ的羧基段部分對應。內抑制素是內皮擴增和血管生成的特異抑制劑。在Eschericha coli中表達的非重摺疊沉澱蛋白質的系統用藥會在異種移植物模型中產生Lewis肺癌，T241纖維肉瘤，B16惡性黑素瘤和EOMA細胞的生長退化[O』Reilly等人(1997)細胞88277-85]。並且，在所研究的三種腫瘤類型中沒有抗藥記錄。對內抑制素重複周期用藥已報導會致使腫瘤休眠[Boehm等人(1997)自然390404-407]。
這些研究得到的結果給治療癌症帶來了新方法，並為克服常在化療期間可觀察到的抗藥性提供令人鼓舞的方法。然而，在所有這些研究中，抑制劑蛋白質的非重摺疊沉澱形式是以懸浮態給腫瘤攜帶動物服用的。此外，需要大量的蛋白質產生腫瘤退化及致使腫瘤休眠。如Kerbel所指出的[(1997)自然390335-36]，需要口服這些蛋白質的等同物。如果可獲得可溶解態的這些蛋白質重組形式，那麼就可進行理論研究。並且，在活體內條件下研究其功效之前，可用溶解蛋白質在體外進行初始試驗。此外，還報導儘管這些蛋白質有很大希望，但由於製備充足蛋白質進行試驗有很大困難及有關它們抗血管生成性能的不一致結果[King，R.T.(1998)華爾街J，.第一頁11月12日；Leff，D.N.(1998)今日生物世界91，10月20日]，使得評價它們的臨床潛力受到阻礙。目前明顯地存在需要一種製備大量抗血管生成蛋白質可溶解形式的方法，並且其在體內和體外都有可靠的性能。
本發明的簡述本文描述了內抑制素的新型突變體，其中一種稱為「EM1」，具有與野生型內抑制素相同或超過它的抗血管生成活性。
本發明涉及發現一種分離的抗-血管生成肽，其中肽的C-末端包括胺基酸序列SYIVLCIE，其具有抗血管生成性能。稱為「EM1」的，這種蛋白質包括突變的內抑制素蛋白質，其中突變包括從突變內抑制素蛋白質的C末端的9個連續胺基酸缺失(如NSFMTSFSK)。EM1終止在胺基酸序列SYEVCIE中。本發明還包括編碼EM1的分離的多核苷酸，與表達序列實施連接，及用這種構建轉化的宿主細胞。也公開了EM1的抗體。本發明還涉及製備EM1，含EM1的融合蛋白質，及含EM1或其融合細胞的組合物的方法。本發明還公開了製備編碼EM1的多肽的方法。
本發明還涉及製備EM1，含EM2的融合蛋白質，以及含EM1或其融合產物的組合物的方法。本發明還公開了製備編碼EM1的多肽的方法。
此外，本發明包括抑制哺乳動物組織內血管生成活性的方法，包括用含EM1的組合物接觸組織，特別抑制產生在許多疾病和病狀中的血管生成，包括癌症。
本發明還公開了使用EM1誘導細胞程序死亡，或EM1的抗體阻止細胞程序死亡。本發明進一步公開在基因治療法中使用EM1。靶細胞可以是任何哺乳動物細胞，具體地是淋巴細胞，血細胞，TIL細胞，骨髓細胞，脈管細胞，腫瘤細胞，肝細胞，和成纖維細胞。
本發明的示圖簡介

圖1是內抑制素核苷酸序列示圖(SEQ ID NO1)。編碼EM1的多核苷酸包括多核苷酸序列到核苷酸525。編碼EM2的多核苷酸包括多核苷酸序列到核苷酸501。
圖2是圖1的核苷酸序列的翻譯(SEQ ID NO2)。
圖3是用Ni-NTA柱的洗脫結果。沿X-軸顯示組分數，每種組分(○)在280nm的吸收率在Y-軸。對於每種組分，洗脫緩衝液的PH(■)在右Y軸顯示。
圖4顯示從原核表達系統中製備的蛋白質的12％非還原SDS-PAGE凝膠。尺寸kDa在左邊顯示，第一道含尺寸標記。2道含粗製蛋白質，3道和4道含組分7和8的樣品，其在PH6.3洗脫。5和6道含組分21和22的樣品，在PH4．3洗脫。7道含用DTT還原的組分22樣品。
圖5表示使用肝磷脂-瓊脂糖柱提純在酵母中表達的溶解鼠內抑制素。組分數沿X-軸表示，，每種組分(○)在280nm的吸收率在左邊Y-軸。用來洗脫每種組分氯化鈉的濃度(■)在右Y軸顯示。
圖6表示從肝磷脂-瓊脂糖柱提純的重組溶解鼠內抑制素的12％非還原SDS-PAGE凝膠。尺寸kDa在左邊顯示，第一道含尺寸標記。2道含粗製蛋白質，3道含未結合蛋白質，4道含衝洗組分，5和6道分別含組分9和10的樣品，其都用0.3ml氯化鈉洗脫。7和8道分別含組分21和22，其都用0.6M氯化鈉洗脫。
圖7是用Ni-NTA柱在酵母中表達的溶解組氨酸內抑制素的洗脫圖。沿X-軸顯示組分數，每種組分(○)在280nm的吸收率在左邊Y-軸。用來洗脫每種組分的咪唑(mM)的濃度(■)在右Y軸顯示。
圖8表示在酵母中表達的溶解組氨酸內抑制素的選取組分的12％非還原SDS-PAGE凝膠。尺寸kDa在左邊顯示，第一道含尺寸標記。2道含粗製蛋白質，3道含流經組分(即未結合蛋白質)，4道含衝洗組分，5道含組分9，其用10mM咪唑洗脫，6和7道分別含組分35和36的樣品，其用50mM咪唑洗脫，8和9道分別含組分53和54的樣品，其用100mM咪唑洗脫。
圖9表示由酵母和細菌表達的重組鼠內抑制素的Western印跡分析。1道含細菌表達啊組氨酸內抑制素，2道含酵母中表達的內抑制素，3道含酵母產生的組氨酸內抑制素。
圖10描述了內皮細胞增殖檢測法的結果。測試由酵母表達的提純的鼠內抑制素的抑制C-PAE細胞內胸苷(甲基-3H)插入的能力。內抑制素的濃度(100ng到10000ng)在X軸表示，3H-胸苷的摻入率在Y軸表示。酵母衍生的溶解內抑制素(○)和酵母衍生的溶解組氨酸(■)的摻入率隨著內抑制素的濃度增加穩定下降。
圖11是柱狀圖，表示重組鼠內抑制素對非內皮細胞的作用。空柱表示786-0細胞，陰影柱表示A498細胞。兩種都是腎癌細胞，用2％血清中bFGF(3ng/m1)刺激。
圖12A和12B是兩張照片，表示使用bFGF(25ng/ml)作刺激物溶解鼠內抑制素對內皮細胞(ECV304)的抑制作用。圖12A表示在對照物(+bFGF，無內抑制素)中移動的內皮細胞，圖12B表示用內抑制素(20μg/ml)和bFGF治療的移動的內皮細胞。
圖13是柱狀圖，表示使用不同濃度的內抑制素對內皮細胞移動的抑制作用。相對細胞移動在Y軸表示治療方式(對照物，25ng/ml bFGF，20，10，5，2.5μg/ml內抑制素)在X軸表示。
圖14A，14B和14C是顯微攝像圖，表示存在內抑制素時對由VEGF(250ng/粒)調節的血管生成的抑制作用。圖14A是負對比，圖14B是正對比(VEGF)，圖14C表示內抑制素加VEGF的效果。
圖15A和15B是兩張柱狀圖，表示在CAM檢測法中，使用內抑制素(20，10，1，0μg/目)對VEGF(板頂部)和bFGF(板底部)調節的血管生成的抑制作用。兩張圖都顯示隨著內抑制素的濃度增加對血管生成的抑制作用穩定增加。
圖16是柱狀圖，表示在內皮細胞增殖檢測法中，多克隆抗血清對鼠內抑制素的抑制效果的中和。3H-胸苷的摻入率在Y軸表示，治療方式(對照物，10μg內抑制素+抗血清，5μg內抑制素，5μg內抑制素+抗血清，預免疫血清，內抑制素抗血清，和內抑制素IgG)在X軸表示。
圖17A和17B是兩張照片，表示CAM檢測法的結果，演示了多克隆抗血清對內抑制素抑制活性的中和作用。圖17A表示VEGF和內抑制素(10μg/粒)的效果，圖17表示內抑制素(10μg/粒)加多克隆抗血清加VEGF的效果。
圖18表示通過重組內抑制素系統治療，對786-0腫瘤生長的抑制作用。Y軸表示腫瘤體積為mm3，治療後的天數為時間在X軸上。以10mg/kg/天實施腹腔內注射內抑制素，開始於第一天(箭頭)。每個時間點表示每組5隻鼠的平均值，打叉柱表示S.E.M。治療方式為對照物PBS(○)，酵母表達內抑制素(●)，酵母表達組氨酸內抑制素(x)，和細菌表達內抑制素(□)。
圖19A到19E是一組照片，表示用重組內抑制素治療的786-0腫瘤。在治療階段的最後，在解剖顯微鏡下，全面對比物腫瘤和治療腫瘤組檢測。圖19A和19B是對照物腫瘤，圖19C表示用酵母衍生的內抑制素治療的腫瘤，圖19D表示細菌衍生的組氨酸內抑制素的效果，圖19E表示用酵母衍生的組氨酸內抑制素治療的腫瘤。
圖20表示內抑制素突變體對無胸腺裸鼠786-0腫瘤的作用。治療後天數在X軸上表示，腫瘤體積在Y軸。每個時間點表示每組中5隻鼠的平均值。治療方式為對照物PBS(○)，細菌衍生的野生型組氨酸內抑制素(點劃線，□)，細菌衍生的EM1(△)，細菌衍生的EM2(實線，◆)。EM2和EM2都含有N-末端組氨酸標記。腹腔內注射開始於第一天(箭頭)。
圖21是柱狀圖，表示由於內抑制素的治療增加的caspase 3活性。Y軸表示在405nm的吸收率，治療方式(對照物，TNF-α(10ng/ml)，內抑制素(10μg/ml))在X軸表示。每種治療方式的兩個柱分別讀取存在(空柱)或不存在(陰影柱)抑制劑DEVD-fmk的A405。
圖22是柱狀圖，表示在非內皮細胞中的caspase3活性。Y軸表示在405nm的吸收率，X軸分別表示對NIH3T3和H9c2(2-1)-成肌細胞的治療方式(對照物，對照物+DEVD，內抑制素(10μg/ml)，內抑制素(10μg/ml)+DEVD，)。
圖23是柱狀圖，表示用TUNEL檢測法定量確定細胞程序死亡。治療方式在X軸上表示，在X軸表示的有用內抑制素治療的粘附細胞，用內抑制素治療的懸浮細胞，和用TNF-α治療的粘附細胞。細胞程序死亡的細胞百分比在X軸上表示。
圖24A和24B分別為對C-PAE細胞裂解物的Bcl-2蛋白質含量的Western印跡分析圖，及對總細胞裂解物的Bax表達水平的免疫印跡檢測圖。C-PAE細胞不用(-)或用內抑制素(10μg/ml)(+)治療指定的時間段(0，12，24，28小時)。也表示了肌動蛋白探測。
圖25A，25B，25C和25D是一組非內皮細胞裂解物的Bax蛋白質含量的兩張Western印跡分析圖(圖25A和25B)和兩張免疫印跡圖(圖25C和圖25D)。細胞不用(-)或用內抑制素(10μg/ml)(+)治療指定的時間段(0，12，24，28小時)。也表示了肌動蛋白探測。圖25ANIH3T3細胞裂解物；圖25BIMR-90細胞裂解物；圖25CC-PAE細胞裂解物；圖25DNIH3T3細胞裂解物。
圖26A-B是表格，表示用來克隆和表達不同抗-血管生成蛋白質的構建，克隆位點，和載體。還列出了表達蛋白質的胺基酸序列。
本發明的詳述很多疾病是由於不需要的血管生成造成的。換句話說，在一些條件下，在某些時候，或在具體組織中如果可能終止毛細血管的生長和擴張，許多疾病和令人不舒服的病狀可能會被抑制或減輕。幾種抗血管生成蛋白質已經被發現了(如抗血管生成素，內抑制素)，但也報導了一些問題涉及(1)能夠製備充足量的蛋白質使得徹底測試它們的性能，(2)由這些蛋白質產生的抗-血管生成性能的再生性。
本發明包括內抑制素的突變體，本文稱為Ems。特別包括內抑制素的兩個突變體，稱為「EM1」和「EM2」。對這些突變體進行整體內抑制素測試。突變體表現非常不同的活性。不可預料地，一種突變體(「EM1」)表現出同整體內抑制素一樣好或超過其的活性，另一種突變體(「EM2」)表現出損失的抗血管生成活性。在裸鼠模型中。通過系統服用EM1(20mg/kg體重)腎癌細胞的生長被抑制了。對腫瘤生長的抑制作用與從野生型內抑制素獲得的抑制作用的可比的。在兩者之間只有8個胺基酸殘基差異的條件下，EM1和EM2之間的活性差異令人驚異。在治療血管生成疾病中，EM1提供了一種優勢，因為以重量為基礎時增加小分子肽會更有效，並能更好地滲透組織。
在本發明中，描述了一種新型抗-血管生成蛋白質，EM1，一種內抑制素的突變體，以及其片段，衍生物，融合蛋白質和抗體。還描述了製備上述物質的方法。還公開了含EM1的治療組合物，以及使用這些組合物的方法。還公開了編碼EM1的多核苷酸，以及含有這些多核苷酸的載體和宿主細胞。還描述了含EM1作為生物活性組分的組合物，以及在哺乳動物組織內使用EM1抑制血管生成活性的方法，如治療以血管生成為特點的疾病和病狀。本發明還包括用來檢測和治療由血管生成引起的或與之相關的疾病和病狀的組合物和方法。此外，本發明還包括使用EM1誘導細胞或組織內的細胞程序死亡，及EM1的抗體抑制細胞或組織內的細胞程序死亡。
特別地，EM1是內抑制素的缺失突變體，其中最後的9個胺基酸缺失。EM1可以膠原質ⅩⅦ類分子自然存在，但也可重組製備，如多核苷酸序列(圖1，SEQ ID NO1)編碼EM1蛋白質(圖2，SEQ ID NO2)可擴增，如可使用下列表1中列出的正向和反向引物。本發明還包括哺乳動物的EM1，其片段，突變體，衍生物或融合蛋白質。
表1用來擴增抗-血管生成蛋白質的構建和引物序列
然後結果擴增產物能克隆到適當的載體中。「引物」表示與靶核苷酸序列互補的特異寡核苷酸序列，用來與靶核苷酸序列雜化並作為由DNA聚合酶，RNA聚合酶或反轉錄酶催化的核苷酸聚合反應的起始點。本文所使用的「EM1」意指內抑制素的缺失突變體，其中最後的9個胺基酸殘基已缺失(即NSFMTSFSK)，術語包括(SEQ ID NO)的胺基酸序列的片段，突變體，同系物，類似物，和等位基因變體，以及鼠靜息蛋白(restin)，鼠靜息蛋白胺基酸序列的片段，突變體，同系物，類似物和等位基因變體。儘管EM1最初的從鼠核酸克隆來的，但在標準檢測法中，它比完整型內抑制素(即沒有突變的內抑制素)表現的要好。因此，EM1包括任何與本文所描述的EM1基本上相同的哺乳動物序列，以及哺乳動物EM1胺基酸序列的哺乳動物EM1片段，突變體，同系物，類似物和等位基因變體。同樣，本發明還具體地包括人類內抑制素，更具體地，人類EM1的缺失突變體等同物。
可以理解認為，本發明考慮包括任何具有內皮抑制活性(如組合物總體抑制血管生成的能力，如抑制含成纖維細胞生長因子，血管生成相關因子，或其他已知生長因子的培養基中的牛毛細管內皮細胞的生長和移動)的EM1的衍生物。本發明包括整體EM1蛋白質，EM1蛋白質的衍生物和EM1蛋白質的生物活性片段。這些包括具有EM1活性，含胺基酸取代基或含糖或其他附著在胺基酸官能團上的分子的蛋白質。本發明還包括編碼EM1和EM1受體的基因，和由這些基因編碼的蛋白質。
本發明還包括含分離的編碼EM1的多核苷酸的組合物。以及含這種多核苷酸的載體和宿主細胞，及製備EM1和其片段，突變體，同系物，類似物和等位基因變體的方法。本文所使用的「載體」意指其中核苷酸片段能插入或克隆的載體，其有將片段核酸轉移到宿主細胞中的載體功能。這樣的載體還可完成轉移的核酸片段的複製和/或表達。載體實例包括如從質粒，抗菌素，或哺乳動物，植物或昆蟲病毒，或非病毒載體如配體核酸共軛物，脂質體，或脂質核酸複合物衍生的核酸分子。所需要的是，將轉移的核酸分子與表達對照序列實施連接以形成能表達轉移核酸的表達載體。核酸的這種轉移通常稱作「轉化」，是指將外源多核苷酸插入到宿主細胞中，與用來插入的方法無關。如，包括直接吸收，轉導或f-交配。外源多核苷酸可保持為非整合載體，如質粒，或者，可整合到宿主基因組中。「實施連接」是指一種狀態，其中所描述的組分處於使得它們以意圖的方式起作用的關係中，如控制序列與編碼序列「實施連接」是以在編碼序列的表達是在與控制序列相容的條件下，獲得這樣的方式的連接。「編碼序列」是多核苷酸序列，當置於適當的調節序列的控制下時(如實施連接)，其轉錄成mRNA並翻譯成多肽。編碼序列的邊界由5』-端的翻譯起始密碼子和3』-端的終止密碼子確定。這種邊界能自然產生，或能通過此領域中已知的方法引入到或加入到多核苷酸序列中。編碼序列可包括，但不限於此，mRNA，cDNA，和重組多核苷酸序列。
選取克隆的多核苷酸克隆在其中的載體，可能是由於其在原核生物體中起作用，或者，它的選取是由於其在真核生物體中起作用，允許編碼EM1蛋白質的多核苷酸克隆，和從多核苷酸獲得的蛋白質表達的載體的兩種實例，是Pet28(a)載體(美國威斯康星州Madison，Novagen)和修飾pPICαZA載體(美國加利弗尼亞州聖地牙哥InVitrogen)，其分別允許在細菌和酵母中表達蛋白質。
一旦多核苷酸已被克隆到適當的載體中，它可被轉化成適當的宿主細胞。「宿主細胞」意指通過載體已經或能用作為轉化核酸的受體的細胞。宿主細胞可以是原核生物或真核生物，哺乳動物，植物，或昆蟲，能以單純細胞存在，或以收集態存在，如作為培養基，或在組織培養基中，或在組織或生物體中存在。宿主細胞還可從多細胞生物體，如哺乳動物的正常或疾病組織中衍生得到。本文所使用的宿主細胞不僅包括用核酸轉化的原始細胞，還包括仍然含有核酸的這種細胞的子代。
在一個具體實施中，分離的編碼抗-血管生成蛋白質的多核苷酸還包括編碼肽的多核苷酸接頭。這樣的接頭對此領域中的技術人員是已知的，如接頭可包括至少一種編碼至少一種附加胺基酸的附加密碼子。通常接頭包括一個到約20或30個胺基酸。多核苷酸接頭被翻譯，如編碼抗血管生成蛋白質的多核苷酸，致使在抗-血管生成蛋白質的氨基或羧基端帶有至少一個其他胺基酸殘基的抗-血管生成蛋白質的表達。一些附著在抗-血管生成蛋白質上的接頭在圖26中作了演示。重要的是，附加胺基酸，或胺基酸，沒有損害抗-血管生成蛋白質的活性。
將選取的多核苷酸插入到載體中後，載體被轉化成適當的原核株，在適合製備有生物活性的抗-血管生成蛋白質的條件下培養株(如維持在條件下)，從而製備有生物活性的抗-血管生成蛋白質，或其突變體，衍生物，片段或融合蛋白質。在一個具體實施中，本發明包括將編碼抗-血管生成蛋白質克隆到載體pET17b或pET28a中，然後轉化到細菌中。然後細菌宿主株表達抗-血管生成蛋白質。通常，製備的抗-血管生成蛋白質量為每升培養液約10-20毫克，或更多。
在本發明的另一個具體實施中，真核載體包括修飾酵母載體。如本文所描述的，一種方法使用pPICza質粒，其中質粒含有多克隆位點。多克隆位點已將一His.Tag基元序列插入到多克隆位點中。再者，載體能修飾加上NdeI位點，或其他適當的限制性位點。這樣的位點對此領域中的技術人員是熟知的。通過這個具體實施製備的抗-血管生成蛋白質包括一個含有一個，或多個組氨酸，通常為約5-20個組氨酸的組氨酸標記基元序列(His.tag)。令人驚異地，這個His.tag沒有損害抗-血管生成活性。
在這個具體實施中，較好的酵母表達體系是Pichia pastores。並且，通常製備的生物活性蛋白質的濃度為每升培養基質(液體)約10-20毫克。
一種製備EM1的方法是，如擴增SEQ ID NO1的多核苷酸，將它克隆到表達載體中，如pET28(a)，pPIZAaA，或一些其他表達載體中，將含SEQ ID NO1的多核苷酸的載體轉化到能表達由多核苷酸編碼的多肽的宿主細胞中，在適於表達蛋白質的條件下培養轉化的宿主細胞，然後從培養基中提取並提純蛋白質。總體上講是製備抗-血管生成蛋白質，具體講是製備EM1的方法示例，在下列實例中提供，也在Vikas P.Sukhatme的1998年12月8日提交的U.S.S.N.XX/XXX，XXX，「製備抗-血管生成蛋白質的方法」中提供，其全文參考收入本篇。EM1蛋白質還可表達為轉基因動物的產物如，表達為轉基因牛，山羊，綿羊或豬的奶，或表達為轉基因植物的產物，如與玉米中的澱粉分子相結合或化合的產物。
EM1還可通過傳統的，已知的化學合成法製備。通過合成方法構建本發明的蛋白質的方法對此領域中的技術人員是已知的。合成構建的EM1蛋白質序列，由於享有初級，二級或三級結構和/或與如重組製備的EM1一致的特性，可擁有與之相同的生物屬性，包括生物活性。這樣，合成構建的EM1蛋白質，在篩查治療化合物及發展抗體的免疫學方法中，可用來作為如重組製備的提純EM1蛋白質的生物活性或免疫學上的取代物。
EM1蛋白質對於抑制血管生成是很有用的，如在下列實例中提供的標準測試中所確定的，並在下列實例中提供。EM1不抑制其他細胞種類如，IMR-90，或IC-21細胞生長。
如本文所使用的，「血管生成」意指在組織或器官中產生新血管，並包括內皮細胞擴增。在正常生理條件下，人類或動物僅在非常特異限制性的情況下進行血管生成。如，血管生成常常在傷口癒合，胎兒及胚胎發育，黃體，子宮內膜，及胎盤形成時可觀察到。「內皮細胞」指襯於漿液膜腔，淋巴管，血管的薄層平坦的上皮細胞。因此，「抗-血管生成活性」是指組合物抑制血管生長的能力。血管生長是複雜的連續事件，包括局部破壞位於具體內皮細胞下的基低膜，擴增那些細胞，將細胞移動到未來血管的位置，重新組織細胞形成新的脈管膜，停止內皮細胞擴增，並且，摻入外膜細胞和其他細胞支持新血管壁。因此本文所使用的「抗-血管生成活性」包括中斷任何或所有這些階段，最終結果抑制新血管形成。
抗-血管生成活性可包括內皮細胞抑制活性，指組合物總體上抑制血管生成的能力，如在存在成纖維細胞生長因子，血管生成相關因子，或其他已知的生長因子的培養基中，抑制牛毛細管內皮細胞生長或移動的能力。「生長因子」是刺激細胞生長，再生，或合成活性的組合物。「血管生成相關因子」是抑制或促進血管生成的因子，如鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)，是一種血管生成促進劑。血管生成相關因子的另一種實例是血管生成抑制因子，如抗血管生成素(參閱如美國專利No.，5，801，012，美國專利No.5，837，682，美國專利No.733，876，美國專利No.5，776，704，美國專利No.5，639，725，美國專利No.5，792，845，WO96/35774，WO95/29242，WO96/41194，WO97/23500)或內抑制素(參閱如WO97/15666)。
「基本相同的生物活性」或「基本相同或較高的生物活性」是指組合物具有抗血管生成活性，並與EM1表現類似，如在標準測試中所確定的。「標準測試」包括，但不限於此，那些使用在分子生物領域中的測試抗-血管生成活性，細胞周期停滯，及細胞程序死亡的方法。這樣的測試包括，但不限於此，內皮細胞擴增測試，內皮細胞移動測試，細胞周期分析測試，內皮細胞管形成測試，細胞程序死亡檢測，如通過程序死亡細胞形態或Annexin V-FITC測試，絨毛尿囊膜(CAM)測試，及裸鼠腎癌症腫瘤生長的抑制檢測。這樣的測試在下面的實例中提供，並在1997年12月8日提交的U.S.S.N.60/067，888，1998年4月22日提交的U.S.S.N.60/082，663，1998年11月16日提交的U.S.S.N.60/108，536，及Vikas P.Sukhatme，1998年12月8日提交的U.S.S.N.XX/XXX，XXX，「抗-血管生成肽及其使用方法」，和Vikas P.Sukhatme，1998年12月8日提交的U.S.S.N.XX/XXX，XXX，「製備抗-血管生成蛋白質的製備方法」中提供，所有文獻全文參考收入本篇。這樣的方法還包括在Dhanabal等人(1998)(「內抑制素誘導內皮細胞的細胞程序死亡」J.生物化學，提交的)中，和Dhanabal等人(1999)(「人類內抑制素的克隆，表達及體內活性」，癌症研究，出版中)中。本文所描述的在一項檢測中評估突變體的ED50對應比較活性是一種有用的方法。
如本文所使用的，「ED50」是與不存在組合物情況下所觀察到的生物活性相比，將生物活性減少一半的組合物量的縮寫。
本發明還描述了EM1的片段，突變體，同系物和類似物。EM1的「片段」是比EM1分子短的任何胺基酸序列，包括EM1多肽的至少25個連續胺基酸。這樣的突變體可能包括或也可能不包括從克隆過程中衍生的附加胺基酸，如與全部或部分接頭序列對應的胺基酸殘基或胺基酸序列。包含在本發明中的這種突變體，有或沒有這種附加胺基酸殘基的，都必須具有與自然或全長模式的參比多肽基本相同的生物活性。
EM1的「突變體」是指與等同物參比EM1多肽的胺基酸序列相比，在胺基酸序列中包含任何變化的多肽。這種變化可以自然產生，或通過人為，化學能(如X-射線)處理產生，或通過其他形式化學引發突變產生，或通過遺傳工程，或通過交配或其他形式的遺傳信息交換產生。突變包括如鹼基改變，缺失，摻入，倒位，轉位，或重複。EM1的突變體形式與等同物參比EM1多核苷酸相比，可能表現出增加或減小的抗-血管生成活性，這樣的突變體可能包含也可能不包含克隆過程衍生的附加胺基酸，如與全部或部分接頭序列對應的胺基酸殘基或胺基酸序列。
EM1的「類似物」是指基本上與整體EM1分子或其片段或等位基因變體相同的非自然分子，具有基本上相同的或超出的生物活性。這樣的類似物包括生物活性EM1的衍生物(如化學衍生物，如上所述)，以及其片段，突變體，同系物，和等位基因變體，其衍生物表現出與未修飾的EM1多肽，片段，突變體，同系物，或等位基因變體性質上相似的拮抗效果。
EM1的「等位基因」是指與參比EM1多肽的多肽序列相比，含自然產生序列變異的多肽序列。編碼EM1多肽的多核苷酸的「等位基因」是指與編碼參比EM1多肽的參比多核苷酸序列相比，含序列變異的多核苷酸，其中編碼EM1多肽的多核苷酸的等位基因編碼了EM1多肽的等位基因形式。
假定多肽是EM1的片段，突變體，類似物或等位基因變體，或它可能是兩種或多種這些物質，如多肽可能即是EM1多肽的類似物也是其突變體，這些都是可能的。如EM1分子的縮短模式(如EM1的片段)可在實驗室製備。如果片段通過此領域中已知的方法引發突變，那麼製備的分子就即是EM1的片段，也是EM1的突變體。在另一個實例中，製備EM1的突變體，後來發現其作為一些哺乳動物個體的EM1的等位基因存在。因此，這樣的突變體EM1分子會即是EM1的突變體又是EM1的等位基因變體。片段，突變體，等位基因變體，及類似物的組合包括在本發明的範圍內。
包括在本發明中的是含與EM1基本上相同的胺基酸序列的蛋白質，或含與編碼EM1的多核苷酸基本上相同的核酸序列的多核苷酸。「基本上相同的序列」意指核酸或多肽表現出至少約70％的序列與參比序列一致，如另一種核酸或多肽，通常至少約80％的序列與參比序列一致，較好的至少約90％的序列與參比序列一致，更好的至少約95％一致，最好的至少約97％序列與參比序列一致。序列的比較長度一般至少75個核苷酸鹼基或25個胺基酸，更好所是至少150個核苷酸鹼基或50個胺基酸，最好的是243-264個核苷酸鹼基或81-88個胺基酸。本文所使用的「多肽」指胺基酸分子鏈，不是指產物的具體長度。這樣，肽，寡肽和蛋白質包含在多肽的定義內。這項術語還包括已進行表達後修飾，如糖基化，乙醯基化，磷酸化等的多肽。一般，EM1含有低於70％的胺基酸序列與內抑制素一致。
本文所使用的「序列一致性」指兩種聚合分子之間的亞基序列相似性，如在兩種多核苷酸或兩種多肽之間。當在兩種分子的亞基位置上被相同的單體亞基佔據時，如，如果在兩種肽中每種肽的一個位置上，被絲氨酸佔據，那麼它們在那個位置上是一致的。兩種序列間的一致性與匹配的或一致的位置數量呈正比，如，如果在兩種肽或化合物序列中一半位置(如10個亞基長度的聚合物中的5個位置)是一致的，那麼兩種序列50％是一致的；如果90％的位置，如10個中9個是匹配的，兩種序列享有90％序列一致性。作為實例，胺基酸序列VRGLQP和HAFLQP 6個位置中有3個一致，因此有50％的序列一致性，而序列VRGLQP和AFLQP 5個位置中有3個一致，因此有60％的序列一致性。兩種序列之間的一致性與匹配的或一致的位置數量呈正比。這樣，如果在具體肽中參比序列部分缺失，那麼要計算序列一致性時，缺失的部分不作計算，如VRGLQP和VRGLP 6個位置有5個一致，因此有83.3％的序列一致性。
一致性常常用序列分析軟體計算，如BLASTN或BLASTP(可從http//www.ncbi，nlm.nih.gov/BLAST/獲得)。使用BLASTN(適用於核苷酸序列)對比兩種序列(如將兩種序列彼此「Blast」，http//www.ncbi.nlm.nih，gov/gorf.bl2.html)的預設參數賦值為，匹配=1，錯配補償=-2，open gap=5，extensiongap=2。當使用適用於蛋白質序列的BLASTP時，預設參數賦值為，匹配=0，錯配補償=0，open gap=11，extension gap=1。
當兩種序列享有「序列同源性」時，意指兩種序列彼此僅保守置換不同。對於多肽序列，這種保守置換包括在序列中的給定位置用一個胺基酸置換另一個同種類別胺基酸(如，共同具有疏水性，電荷，pK或其他構象或化學屬性的胺基酸，如用纈氨酸置換亮氨酸，用精氨酸置換賴氨酸)，或位於序列的某些位置上的一中或多種非保守胺基酸置換，缺失，或插入，但沒有將多肽的構象或摺疊改變到多肽的生物活性被毀壞的程度。「保守置換」的實例包括用一個非極性(疏水性的)殘基如異亮氨酸，纈氨酸，亮氨酸或蛋氨酸置換另一個；用一個極性(親水性的)殘基置換另一個，如精氨酸和賴氨酸之間，穀氨醯胺和天冬醯胺之間，甘氨酸和絲氨酸之間；用一個鹼性殘基如賴氨酸，精氨酸或組氨酸置換另一個；或用一個酸性殘基如天冬氨酸或穀氨酸置換另一個；或使用化學衍生殘基置換非衍生殘基；只要多肽表現出所必需的生物活性。共享序列同源性的兩個序列可稱為「序列同系物」。
對於多肽，同源性一般使用序列分析軟體測得(如威斯康星州生物技術中心大學的遺傳計算機組的序列分析軟體包，大學路1710，麥迪遜，WI53705)。蛋白質分析軟體通過對不同置換，缺失，及其他修飾賦值同源性程度匹配類似的序列。保守置換一般包括下列組中的置換甘氨酸，丙氨酸；纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，穀氨酸；天冬醯胺，穀氨醯胺；絲氨酸，蘇氨酸；賴氨酸，精氨酸；和苯基丙氨酸，酪氨酸。
本發明還包括EM1的化學衍生物。「化學衍生物」是指含一個或多個反應官能側基團化學衍生的殘基的多肽。這樣的衍生殘基包括如，其中游離氨基基團已被衍生形成氫氯化胺，p-甲苯磺醯基基團，苄氧羰基基團，叔-丁基氧羰基基團，氯乙醯基基團或甲酸基基團。游離羧基基團可被衍生形式鹽，甲基和乙基酯或其他類型的酯或醯肼。游離羥基基團被衍生形成O-醯基或O-烴基衍生物。組氨酸的咪唑氮可被衍生形成N-imbenzyl組氨酸。作為化學衍生物還包括含一個或多個二十種標準胺基酸的自然產生的胺基酸衍生物的肽。如4-羥基脯氨酸可被脯氨酸置換；5-羥基賴氨酸可被賴氨酸置換；3-甲基組氨酸可被組氨酸置換；高絲氨酸可被絲氨酸置換；尿氨酸可被賴氨酸置換。
編碼EM1的多核苷酸可在分離的DNA或cDNA文庫外克隆。核酸或多肽，本文稱作的「分離的」是指核酸或多肽基本上不含(即從中分離的)它們從其中獲得的生物源的物質(如存在於核酸混合物中或細胞中)，其可能已經進行了進一步的加工。「分離的」核酸或多肽包括使用本文所描述的方法，相似的方法，或其他適當的方法獲得的核酸或多肽，包括基本上純的核酸或多肽，通過化學合成製備的，通過化學或生物技術組合方法製備的核酸或多肽，及重組製備分離的核酸或多肽。因此，分離的多肽意指一種相對不含其他蛋白質，碳氫化物，脂質，以及其他與其通常相關的細胞組成的多肽。分離的核酸不會與其在生物體自然產生的基因組中立即鄰接的核酸，以及核酸是從其中衍生的核酸立即鄰接(即共價結合)。因此，這項術語包括如，摻入到載體中的核酸(如自主病毒或質粒)，或以與其他核酸如通過化學方法或限制內切核酸酶處理製備的核酸片段無關的獨立分子存在的核酸。
本發明的多核苷酸和蛋白質還可用來設計成探針來分離的其他抗-血管生成蛋白質。較好的方法在Jacobs等人的美國專利No.5，837，490中提供，其全文參考收入本篇。設計寡核苷酸探針應較好地符合這些參數(a)它應設計在含最少量多義鹼基(「N’s」)的序列區域，如果有也很少，(b)它應設計成Tm為約80℃(對A或T假設2℃，對G或C為假設4度)。
寡核苷酸應較好地使用標記寡核苷酸通常採用的技術，用g-32p ATP(特異活性6000Ci/毫摩爾)和T4多核苷酸激酶標記。其他標記技術也可使用。非摻入的標記應較好地通過凝膠過濾層析法或其他確定的技術除去。摻入到探針中的放射性活度的量應由閃爍計數儀測量定量。較好地，產物探針的特異活性應為約4×106dpm/pmole。較好地，含全長克隆體庫的細菌培養基應解凍，使用100μl的原種接種含25ml無菌L-肉湯(含氨卡青黴素100μg/ml)的無菌培養燒瓶。培養基應較好地在37℃飽和狀態生長。飽和培養物應較好地用新鮮的L-肉湯稀釋。這些稀釋液的等分份應較好地平置以確定稀釋度和體積，當在37℃在含1.5％瓊脂的150mm培養皿中生長過夜後，在含L-肉湯(含100μg/ml氨卡青黴素)的固態細菌介質上將產出約5000個明顯的分離良好的集落。其他獲得明顯的分離良好的集落的方法也可使用。
然後，應使用標準集落雜交方法將集落轉移到硝化纖維濾膜中並溶解，變性，烘烤它們。高度嚴格條件是至少與，如在65℃1×SSC，或在42℃1×SSC及50％甲醯胺一樣嚴格條件。中度嚴格條件是至少與，在65℃4×SSC，或在42℃4×SSC及50％甲醯胺一樣的嚴格條件。比嚴格條件是至少與，在50℃4×SSC，或在40℃6×SSC及50％甲醯胺一樣的嚴格條件。
然後，較好地將濾膜在65℃伴隨輕柔攪拌在6×SSC中溫育1小時，SSC(20×原種為175.3 gNaCl/l，88.2g檸檬酸鈉/l，用氫氧化鈉調節至PH7.0)含0.5％SDS，100μg/ml酵母RNA，10mMEDTA(每150mm濾膜約10mL)。較好地，然後將探針加入到濃度大於或等於1×106dpm/ml雜交混合物中。較好地將濾膜在65℃輕柔攪拌溫育過夜。較好地在室溫無攪拌情況下用500ml2×SSC/0.5％SDS衝洗濾膜，接著在室溫用500ml 2×SSC/0.1％SDS輕柔晃動15分鐘。在65℃用0.1×SSC/0.5％SDS第三次衝洗是隨意的。然後較好地將濾膜乾燥，並進行放射自顯影充分長的時間以在X-射線膠片上顯現正象。其他已知的雜交方法也可使用。然後挑選正集落，在培養基中生長，使用標準方法分離的質粒DNA。然後可通過限制酶切分析，雜交分析，或DNA測序檢驗克隆體。
本發明還包括含EM1，及其片段，突變體，同源物，類似物和等位基因變體的融合蛋白質和嵌合蛋白質。融合或嵌合蛋白質可包括單一蛋白質的多聚體，如EM1的重複或apomigren的重複，或者融合及嵌合蛋白質可由幾種蛋白質組成，如EM1和apomigren。融合蛋白質可包括兩種或多種已知的抗-血管生成蛋白質的組合(如，抗血管生成素，內抑制素，靜息蛋白，或抗血管生成素和它們的生物活性片段)，或抗-血管生成蛋白質與導向試劑的組合[如內抑制素和上皮生長因子(EGF)或RGD肽]，或抗血管生成蛋白質與免疫球蛋白的組合(如，內抑制素和IgG，特別將Fc部分除去)。在本文中的「靜息蛋白」，是一種含約170個胺基酸到約200個胺基酸的蛋白質，與人類XV類膠原質的α1鏈的NC10域的約200個C-末端胺基酸相對應。如本文描述的「apomigren」，是靜息蛋白的片段，含最後的80到90個連續胺基酸，與人類XV類膠原質的α1鏈的NC10域的C-末端相對應。融合和嵌合蛋白質還可包括EM1，其片段，突變體，同源物，類似物和等位基因變體，和其他抗-血管生成蛋白質，如內抑制素，抗血管生成素。本文所使用的「融合蛋白質」還可包括其他組成，如用來傳遞化療試劑，其中編碼化療試劑的多核苷酸與編碼抗-血管生成蛋白質的多核苷酸連接。融合蛋白質還可包括抗-血管生成蛋白質的多聚體，如內抑制素的二聚物或三聚物。這樣的融合蛋白質可通過翻譯後修飾連接(如化學連接)，或整體融合蛋白質可重組製備。
包括在本發明中的還有含EM1，以及其片段，突變體，同源物，類似物和等位基因變體作為生物組分，抑制或促進哺乳動物組織內血管生成的組合物，及使用這種組合物來診斷，預後，及治療特點在於或與血管生成活性或血管生成活性缺少有關的疾病或病狀。這種方法可包括口服，局部，注射，移植，持續釋放用藥，或其他給藥方式。
本發明包括使用EM1和其片段，突變體，同源物，類似物，等位基因變體，以及融合和嵌合蛋白質作為組合物中的生物活性試劑，來治療與血管生成活性有關的疾病或病狀。治療這種疾病的方法包括用含EM1，其片段，突變體，同源物，類似物，或等位基因變體的組合物接觸疾病侵襲組織。
本發明包括使用治療上有效量的EM1，或其生物活性片段，或具有抗-血管生成活性的EM1片段組合，或EM1刺激物和拮抗劑治療由血管生成調節的疾病的方法。血管生成-調節的疾病包括，但不限於此，癌症，固體腫瘤，血液生腫瘤(如白血病)，腫瘤轉移，良性腫瘤(如，血管瘤，聽覺神經瘤，纖維神經瘤，砂眼，化濃性肉芽瘤)，風溼性關節炎，牛皮癬，視覺血管生成疾病(糖尿病視網膜病，早發視網膜病，斑點惡化，角膜移植排斥，新脈管青光眼，晶狀體後纖維增生，虹膜發紅)，Osler-Webber症，心肌血管生成，空斑新血管生成，毛細血管擴張，血友病關節，血管纖維瘤，傷口粒化。EM1對治療內皮細胞超常或不正常興奮的疾病也是有用的。這些疾病包括，但不限於此，腸粘連，Orohn’s症，動脈硬化，硬皮病，疤痕肥大(即瘢痕瘤)。EM1還可通過阻止胎兒種植所需的血管生成而用作避孕試劑。EM1可用於治療作為病理結果而生成血管的疾病如貓抓痕症(Rochele minalia quintosa)和潰瘍(Heliobacterpylori)。EM1和apomigren還可用來防止透析性移植脈管管路狹窄，和肥胖，如通過抑制在脂肪組織的毛細管形成從而防止其擴張。EM1還可用來治療定位(非轉移性的)疾病。「癌症」意指瘤生長，增生或增殖生長或不正常細胞發育的病理狀態，包括固體腫瘤，非固體腫瘤，及任何不正常的細胞增殖，如在白血病中所觀察到的。如本文所使用的，「癌症」還指血管生成有關的癌症和腫瘤，即腫瘤為了其生長(體積和/或質量的擴張)，需要增加提供其血液的血管的數量和密度。「衰退」是指腫瘤質量和尺寸的減小。如本文所使用的，「治療上有效量」意指組合物或方法中的每種活性組分的總量足以顯示出有意義的患者受益，即治療，治癒，防止或改善有關治療狀況，或增加治療，治癒，防止或改善這種病狀的比率。當使用組合時，這項術語是指活性組分的組合量產生治療效果，不論是組合，連續用藥還是同時用藥。
或者，其中增加血管生成是所需的，如在傷口癒合中，或梗塞後心臟組織中，EM1蛋白質的抗體或抗血清可用來阻斷局部的自身的抗-血管生成和過程，從而增加新血管的形成以抑制組織的萎縮。
為治療疾病，EM1可與其他組合物和方法結合使用。如傳統上治療治療可採用外科手術，放療，化療，或免疫治療，結合使用EM1，則EM1可隨後給患者服用以擴大微小轉移的休眠，穩定並抑制任何殘留原發性腫瘤的生長。EM1，EM1片段，EM1抗血清，EM1受體刺激劑，EM1受體拮抗試劑，或它們的組合，也可與其他抗-血管生成化合物，或蛋白質，片段，抗血清，其他抗-血管生成蛋白質(如抗血管生成素，內抑制素，靜息蛋白，apomigren)的受體刺激劑，受體拮抗試劑結合。此外，EM1，EM1片段，EM1抗血清，EM1受體刺激劑，EM1受體拮抗試劑，或它們的組合，可與藥用可接受的賦形劑，及任意的持續釋放基質，如生化能分解的聚合物，形成治療組合物。本發明的組合物還可含有其他抗-血管生成蛋白質或嵌合化合物，如內抑制素，抗血管生成素，靜息蛋白，apomigren(兩個都在Vikas P.Sukhatme 1998年12月8日提交的U.S.S.N，XX/XXX，XXX，「靜息蛋白及其使用方法」中所描述的，其全文參考收入本篇)，及它們的突變體，片段，和類似物。組合物可進一步含有其他試劑，或加強蛋白質活性或贈呈試劑活性或使用在治療中，如化療或放療試劑。這種額外的因子和/或試劑可包括在組合物中以和本發明的蛋白質製備配合功效，或減小副作用。此外，本發明組合物的用藥可與其他治療方式同時進行，如與化療或放療法聯合用藥。
本發明包括通過使用含本發明的蛋白質的組合物與組織接觸抑制哺乳動物組織中血管生成的方法。「接觸」不僅意指局部使用，還指其他將組合物傳遞到組織中或組織細胞中的方式。
使用定時釋放或持續釋放給藥系統也包括在本發明中。這種系統在外科手術很難進行或不可能進行的情況下是非常必要的，如患者年老，或疾病進程本身，或風險-受益分析顯示控制好於治癒的情況。
如本文所使用的，持續釋放基質是由可被酶分解的或酸/鹼水解的或溶解的物質製成的，通常是聚合物。一旦插入到體內，基質被酶和體液作用。所需的持續釋放基質是從生物相容物質中選取的，如；脂質體，聚交酯(聚合乳酸)，聚乙交酯(乙醇酸的聚合物)，聚交酯共聚乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)，聚酐，聚(原酸)酯，聚合蛋白，透明質酸，膠原質，軟骨素硫酸鹽，羧酸，脂肪酸，磷脂，多糖，核酸，聚合胺基酸，胺基酸如苯基丙氨酸，酪氨酸，異亮氨酸，多核苷酸，聚乙烯基丙烯，聚乙烯基吡咯烷酮，及矽樹脂。較好的生物可分解基質是聚交酯，聚乙交酯，或聚交酯共聚乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)中的一種。
本發明的調節血管生成組合物可以是固態，液態或浮質的，可通過任何已知的用藥途徑用藥。固態組合物的實例包括丸劑，霜劑和可植入藥劑單元。丸劑可口服，治療霜劑可局部用藥。可植入藥劑單元可定位用藥如在腫瘤位置上，或為了系統釋放調節血管生成的組合物，可植入藥劑如在皮下。液態組合物的實例包括適合皮下，靜脈內，動脈內注射的配方，及適合局部和眼內用藥的配方。浮質配方的實例包括適合肺臟用藥的吸劑配方。
使用此領域中普通技術人員已知的配製方法，在藥用可接受的配方中，上面所描述的EM1蛋白質和有抗血管生成活性的蛋白質片段能以分離的及基本上純的蛋白質和蛋白質片段提供。這些配方能提通過標準途徑用藥。通常，組合可通過局部，經皮，腹腔內，顱骨內，腦室內，腦內，陰道內，子宮內，口服，直腸，注射(如靜脈內，脊椎內，皮下，或肌肉)途徑用藥。此外，EM1可摻入到生物可分解的聚合物中使得化合物持續釋放，將聚合物植入需要給藥部位的鄰近，如腫瘤部位或植入到EM1緩慢系統釋放的部位。也可使用滲透微型泵通過套管對有關部位提供高濃度EM1控制給藥，如直接進入轉移性生長部位或進入脈管提供給腫瘤。生物可分解聚合物及它們的應用在，如Brem等人(1991)(J.神經外科.74441-446)中作了詳細描述，其全文參考收入本篇。
本發明的含多肽的組合物可用靜脈內用藥，如通過注射單位劑量。「單位劑量」當關係到本發明的治療組合物時，是指物理上不連續的單元，適合用作受試者的單一用量，每個單元含與所需稀釋劑(載體或賦形劑)一起計算產生所需療效的預定量的活性物質。
本發明組合物的用藥模式包括靜脈內，肌肉，腹腔內，胸骨內，皮下，關節腔內注射和灌注。注射用藥用組合物包括藥用可接受的無菌水性或非水性溶液，分散體，懸浮體，或乳液，以及在使用前重組在無菌可注射溶液或分散體中的無菌粉末。適合的水性及非水性載體，稀釋劑，溶劑或賦形劑包括水，乙醇，多元醇(如丙三醇，丙烯丙二醇，聚乙烯乙二醇等等)，羧基甲基纖維素，和它們適當的混合物，植物油(如棕櫚油)和可注射的有機酯如乙基油酸酯。如可通過使用塗覆物質如卵磷脂，通過保持分散體中所需的顆粒大小，及通過使用表面活性劑可維持適當的流動性。這些組合物也可含輔劑如防腐劑，潤溼劑，乳化劑和分散劑。可加入各種抗細菌和抗真菌試劑如對羥基苯甲酸酯類，氯丁醇，苯酚山梨酸等以確保預防微生物作用。還可按需要加入等張試劑如糖，氯化鈉等。可通過加入試劑如一硬脂酸鋁和白明膠，它們可延遲吸收作用，來延長可注射藥用形式的吸收時間。可注射緩釋形式是通過在生物可分解聚合物如聚交酯-聚乙交酯，聚(原酸酯)和聚(酐)中形成藥物微型膠囊基質而製備。根據聚合物與藥物的比率和使用具體聚合物的性質，可控制藥物釋放率。緩釋可注射配方還可通過將藥物捕集在與身體組織相容的脂質體或微乳劑中而製備。可注射配方可通過保留細菌的濾膜過濾殺菌，或通過摻入殺菌試劑殺菌，固體殺菌組合物在使用前將其溶解或分散在無菌水或其他無菌可注射介質中。
本發明治療組合物可在其中包括藥用可接受的鹽組分，如可從有機或無機酸獲得的鹽。「藥用可接受的鹽」是指在合理的醫學判定範圍內，適合用來與人類和低等動物的組織接觸並沒有不適當的毒性，刺激，過敏反應等的，並與合理的受益/風險比率相匹配的那些鹽。藥用可接受的鹽在此領域中是眾所周知的。如S.M.Berge等人在J.藥科學(1997)661 et seq.中詳細描述了藥用可接受的鹽，其參考收入本篇。藥用可接受的鹽包括與無機酸如鹽酸或磷酸，或有機酸如醋酸，酒石酸，扁桃酸等形成的酸加成鹽(與多肽的游離氨基基團形成的)。與游離羧基基團形成的鹽也可從無機鹼如氫氧化鈉，氫氧化鉀，氫氧化銨，氫氧化鈣或氫氧化鐵，及有機鹼如異丙基胺，三甲基胺，2-乙基胺乙醇，組氨酸，普魯卡因等獲得。鹽也可在本發明的化合物最後分離的和提純期間原位製備，或獨立地通過用適當的有機酸與游離鹼官能反應製備。典型的酸加成鹽包括，但不限於此，醋酸鹽，己二酸鹽，海藻酸鹽，檸檬酸鹽，天冬氨酸鹽，安息香酸鹽，苯磺酸鹽，硫酸氫鹽，丁酸鹽，樟腦酸鹽，樟腦磺酸鹽，雙葡萄糖酸鹽，甘油磷酸鹽，半硫酸鹽，庚酸鹽，己酸鹽，延胡索酸鹽，氫氯化物，氫溴化物，氫碘化物，2-羥基甲烷磺酸鹽(羥乙磺酸鹽)，乳酸鹽，馬來酸鹽，甲烷磺酸鹽，煙酸鹽，2-萘磺酸鹽，草酸鹽，雙羥萘酸鹽，果膠脂酸鹽，過硫酸鹽，3-苯基丙酸鹽，苦味酸鹽，特戊酸鹽，丙酸鹽，琥珀酸鹽，酒石酸鹽，硫氰酸鹽，磷酸鹽，穀氨酸鹽，重碳酸鹽，p-甲苯磺酸鹽，十一酸鹽。並且，鹼性含氮基團可被一些試劑季銨化如小分子烷基滷代物如甲基，乙基，丙基和丁基的氯代物，溴代物和碘代物；硫酸二烷基酯如硫酸二甲酯，二乙基酯，二丁基酯和二戊基酯；長鏈滷代物如癸基，十二烷基，十四烷基，十八烷基氯代物，溴代物，碘代物；芳烷基滷代物如苄基和苯乙基溴代物及其他。從而獲得水或油溶或可分散產物。可用來製成藥用可接受的酸加成鹽的酸的實例包括，無機酸如鹽酸，硫酸和磷酸，有機酸如草酸，馬來酸，琥珀酸，檸檬酸。
如本文所使用的，「藥用可接受的」，「生理上可忍受的」及它們合乎文法的變通，如它們所指的組合物，載體，稀釋劑和試劑，是可互換使用的，表示物質可給哺乳動物服用，有最小量的不利生理反應如噁心，眩暈，胃部不適等。製備含活性組分溶解或分散其中的藥用組合物在此領域中是眾所周知的，不必限制在配方上。通常這種組合物製備成可注射液體溶液或懸浮體，然而，在使用前可溶解或懸浮在液體中的固體形式也可製備。也可製備乳化溶液。
可將藥用可接受的並與活性組分相容的適合使用在本文所描述的治療方法中的量的賦形劑與活性組分混合。適當的賦形劑包括如，水，鹽水，葡萄糖，丙三醇，乙醇等及它們的組合。此外，如果需要，組合物可含有少量輔助物質如潤溼劑或乳化劑，PH緩衝試劑等加強活性組分效力的輔劑。
本發明的EM1多肽還可包括在含前體藥物的組合物中。如本文所使用的，「前體藥物」是指在體內很快地轉化產生母體化合物的化合物，如在血液中通過酶解或水解。充分的討論在T.Higuchi和V.Stella。的前體藥物作為新型給藥系統ACS討論會系列的14卷中以及在Edward B.Roche.，的藥物設計中的生物可逆載體美國藥協會和Permagon出版社，1987中提供，兩篇文獻參考收入本篇。如本文所使用的，「藥用可接受的前體藥物」指(1)在合理的醫學判定範圍內，適合用來與人類和動物的組織接觸並沒有不適當的毒性，刺激，過敏反應等的，並與合理的受益/風險比率相匹配的，對它們要作的應用有效的本發明化合物的前體藥物。(2)母體化合物的兩性離子形式，在可能的場合。
本發明EM1的劑量取決於要治療的疾病狀況和病狀，以及其他臨床因素如體重和人類或動物狀態和化合物服用途徑。治療人類或動物，可服用約每公斤體重約10mg到每公斤體重約20mg的EM1蛋白質或apomigren蛋白質。在組合治療中，如，本發明的EM1蛋白質和apomigren蛋白質與放療，化療或免疫治療結合時，可減小劑量，如每公斤體重約0.1mg到每公斤體重約0.2mg。根據EM1在具體動物或人體內的半衰期，EM1可每天服用幾次到一周服用一次。可以理解認為本發明對人類和牲畜都適用。本發明的方法預期考慮了單次服用和多次服用，假定在同時或在經過延長的一段時間服用。此外，EM1可結合其他形式的治療服用，如化療，放療，或免疫治療。
EM1配方包括適於口服，直腸，眼(包括晶狀體內，intracameral)，鼻，局部(包括口腔，舌下)，子宮內，陰道或注射(包括皮下，腹腔內，肌肉，靜脈內，經皮，顱骨內，氣管內，硬腦膜外)用藥的配方。EM1配方可方便地置於單位劑量形式中，可通過傳統製藥技術製備。這樣的技術包括產生活性組分和藥用載體或附形劑結合物的步驟。通常，製備配方是通過均一完全地產生活性組分與液體載體或均分固體載體或兩者都有的結合物，如果需要，然後定形產品。
適於注射用藥的配方包括水性或及非水性無菌注射溶液，其中含抗氧化劑，緩衝液，抑菌劑及給配方提供與預接受體的血液等張的溶質；水性及非水性無菌懸浮液，其中包括懸浮試劑和增稠試劑。配方可置於單位劑量的藥劑中或置於多劑量的容器中，如密封的一次用量針劑和小瓶，也可儲存在冷凍-乾燥(凍幹)狀態，僅需要在使用前加入無菌液態載體，如注射用水。臨時注射溶液和懸浮液可從前面描述的無菌粉末，顆粒和片劑種類製備。
當口服治療上有效量的本發明的蛋白質時，本發明的EM1蛋白質可以是片劑，膠囊，粉末，溶液或西也劑的形式。當以片劑形式服用時，本發明藥用組合物可以另外包含固體載體如白明膠或輔劑。片劑，膠囊，和粉末含約5％到約95％的本發明的蛋白質，較好地含約25％到90％的本發明的蛋白質。當以液態形式服用時，可加入液態載體如水，石油，動物或植物源的油如花生油，礦物油，大豆油，或芝麻油或合成油。液態藥用組合物可進一步包括生理鹽水溶液，葡萄糖或其他糖類溶液，或乙二醇如1，2-亞乙基二醇，丙二醇，或聚乙二醇。當以液態形式服用時，藥用組合物含約0.5％到90％重量比的本發明的蛋白質，較好地含約1％到50％的本發明的蛋白質。
當靜脈內，皮膚或皮下注射服用治療上有效量的本發明的蛋白質時，本發明的蛋白質的形式是不含熱原質，注射可接受的水性溶液。製備具有適當的PH，等張性，穩定性等的這種注射接受的蛋白質溶液在此領域的技術範圍內。適用於靜脈內，皮膚，或皮下注射的較好的藥用組合物中除了本發明的蛋白質外，還應含有等張賦形劑如氯化鈉注射液，Ringer注射液，葡萄糖注射液，葡萄糖和氯化鈉注射液，乳酸鹽Ringer注射液，或其他此領域已知的賦形劑。本發明的藥用組合物還可含有穩定劑，防腐劑，緩衝液，抗氧化劑，或其他此領域中的技術人員已知的添加劑。
在本發明的藥用組合物中的本發明的蛋白質的量取決於要治療病狀的性質和嚴重性，及患者已進行的前期治療的性質。根本上，由參與的醫生來決定用本發明的蛋白質治療每個具體患者的量，開始，參與醫生給患者服用少劑量的本發明的蛋白質並觀察患者的反應。加大服用本發明的蛋白質的量直到對患者獲得最優的治療效果，到這一點後劑量不再增加。
使用本發明的藥用組合物靜脈內治療的持續時間是變化的，取決於要治療的疾病的嚴重性和每個具體患者的病狀和潛在特殊反應。可考慮認為本發明的蛋白質的每種應用的持續時間在連續靜脈內用藥的12到24小時範圍內。最終，參與醫生決定使用本發明的藥用組合物靜脈內治療的適當的持續時間。
較好的單位藥劑配方含有服用組分的日劑量或單位，日亞-劑量，或其適當的部分劑量。應理解認為，除了具體上面提及的組分，本發明的配方還可包括其他此領域中有關這類配方的傳統試劑。任意地，可摻入胞毒試劑或與EM1蛋白質，或其生物官能片段結合，給患者提供雙重治療。
目前，治療組合物對牲畜應用也是很有價值的。除了人類外，家養動物和純種馬也是使用本發明的蛋白質進行這種治療的理想患者。
胞毒試劑如蓖麻毒素與EM1，及高親和力EM1蛋白質片段結合，從而提供一種破壞EM1結合細胞的工具。這些細胞可在許多位置發現包括，但不限於此，微小轉移和原發性腫瘤。與胞毒試劑結合的蛋白質以設計給所需位置最大給藥的方式灌注。如通過套管將蓖麻毒素結合高親和力EM1片段傳遞到脈管中，提供給靶部位或直接給藥到靶部位。這樣的試劑還以可控方式通過與灌注套管連接的受體泵傳遞。EM1拮抗劑的組合可與血管生成的刺激劑共同使用以增加組織的脈管形成。這種治療用藥法對破壞轉移性癌症提供了有效的方法。
其他治療方法包括服用與胞毒試劑結合的EM1，EM1片段，EM1類似物，EM1抗血清，或EM1受體刺激劑和拮抗劑。可以理解認為，EM1可來源於人類或動物。EM1也可通過化學反應合成製備，或通過結合表達系統的重組技術製備。EM1也可通過酶裂解分離的血纖維蛋白溶酶原或血纖維蛋白溶酶產生有抗血管生成活性的蛋白質而製備。EM1還可通過模擬內源酶作用將血纖維蛋白溶酶原裂解成EM1的化合物製備。EM1的產量也可通過影響血纖維蛋白溶酶原裂解酶活性的化合物來調節。
本發明還包括基因治療，其中將編碼EM1，或其突變體，片段，或融合蛋白質的多核苷酸引入或調節到患者體內。多種向細胞轉移或傳遞DNA表達基因產品蛋白質的方法，或者稱為基因治療法，在N.Yang(1992)體內基因轉移到哺乳動物體細胞中。Crit.Rev.生物技術。12(4)335-356中作了公開，其參考收入本篇。基因治療包括將DNA序列摻入到體細胞或生殖系細胞中，使用在來自體內或體內治療中。基因治療是替換基因，增大正常或不正常基因的功能，並對抗感染的疾病或其他病理狀況。
用基因治療法治療這些醫學問題的方案包括，確定缺損基因，然後加入功能基因替換缺損基因的功能或增加微弱功能基因；或預防方案，如加入產物蛋白質基因治療病狀，或使得組織或器官對治療更敏感。預防方案的一個實例是，將基因如EM1置於患者體內預防血管生成的發生，或插入使腫瘤細胞對輻射更敏感的基因，然後輻射腫瘤會產生增強殺死腫瘤細胞效果。
在本發明中預想了許多轉移EM1 DNA或EM1調節序列的方案。轉染啟動子序列，即是通常發現與EM1特異相關的序列，或其他增加EM1蛋白質產量的序列也預想作為基因治療的方法。這項技術的實例在麻薩諸塞州，Cambridge的Transkaryotic治療有限公司中可找到，使用同源重組插入開啟細胞中促紅細胞生成素基因的「遺傳開關」。參閱1994年4月15日的基因工程新聞。這種「遺傳開關」可用來激活細胞中通常不表達EM1(EM1受體)的EM1(或EM1受體)。
基因治療的基因轉移法分成三個主要的種類物理法(如電泳，直接基因轉移和粒子轟擊)，化學法(脂質基載體，或其他非濾過性病毒載體)和生物法(如病毒-衍生載體和受體吸收)。如可使用的非濾過性病毒載體包括塗覆DNA的脂質體。這種脂質體/DNA複合物可直接靜脈注射到患者體內。可以相信認為，脂質體/DNA複合物集中在肝臟，在肝臟複合物將DNA傳遞給巨噬細胞和Kupffer細胞。這些細胞壽命長，這樣可提供傳遞DNA的長期表達。並且，為治療DNA的定向傳遞，載體或基因的「裸」DNA可直接注射到需要治療的器官，組織或腫瘤中。
基因治療方法也可通過傳遞部位描述。傳遞基因的基本方法包括來自體內細胞基因轉移，體內基因轉移，和體外基因轉移。在來自體內細胞基因轉移中，從患者獲取細胞並在細胞培養基中培養。將DNA轉移到細胞中，轉染的細胞數量擴增，然後重新植入患者體內。在體外基因轉移中，轉化的細胞是在培養基中生長的細胞，如組織培養細胞，及不是從具體患者獲取的具體細胞。轉染這些「實驗室細胞」，選取轉染的細胞並擴增，用來植入患者體內或作其他用途。
體內基因轉移包括當細胞在患者體內時，將DNA引入到患者的細胞內。方法包括使用濾過性病毒調節基因轉移，使用未感染病毒在患者體內傳遞基因，或在患者體內注射裸DNA，DNA被一部分基因產物蛋白質在其中表達的細胞吸收。另外，本文描述的其他方法，如使用「基因槍」，適用於體外插入EM1 DNA或EM1調節序列。
基因治療的化學方法可包括脂質基化合物，沒有必要是脂質體，穿過細胞膜轉移DNA。脂質轉染劑或細胞轉染劑，脂質基正離子與負電荷DNA結合，產生能穿過細胞膜複合物，提供DNA進入細胞內部。另一種化學方法使用受體基胞吞作用，包括將特異配體與細胞表面受體結合，將其包裹並穿過細胞膜運送。配體與DNA結合，整個複合物被運送到細胞內。將配體基因複合物注射到血流中，然後靶中含有特異結合配體的受體的細胞，將配體-DNA複合物運送到細胞中。
許多基因治療法採用濾過性病毒載體將基因插入到細胞中。如，在來自體內方法已使用改變的逆轉錄病毒載體將基因引入到外圍及腫瘤-滲透的淋巴細胞，肝細胞，上皮細胞，肌細胞，或其他體細胞中。然後將這些改變的細胞引入到患者體內提供插入DNA的基因產物。
在體內方案中，濾過性病毒載體也已使用將基因插入到細胞中。為了指導外源基因的組織特異表達，可使用已知的對組織特異的順式作用調節元素或啟動子。或者，這也可採用將通過DNA或濾過性病毒載體原位傳遞到體內特異解剖部位來實現。如，將基因轉移到體內血管中可通過將體外轉導的內皮細胞植入到在動脈管壁上選取的部位上實施。病毒感染了也表達基因產物的環境細胞。濾過性病毒載體可直接被傳遞到體內部位上，如通過導管，這樣僅使某些區域被病毒感染，提供了長期部位特異基因表達。使用逆轉錄病毒載體進行體內基因轉移也已在乳房組織和肝臟組織中通過將改變的病毒注射到導向器官的血管中得到論證。
已使用在基因治療方案中的濾過性病毒載體包括，但不限於此，逆轉錄病毒，其他RNA病毒如脊髓灰質炎病毒或Sindbis病毒，腺病毒，腺相關病毒，皰疹病毒，SV40，牛痘，和其他DNA病毒。複製缺損鼠逆轉錄病毒載體是最廣泛使用的基因轉移載體。鼠白血病逆轉錄病毒由單鏈RNA組成，複合核核心蛋白質和聚合酶(pol)酶，由蛋白質核心(gag)包裹及被糖蛋白包膜(env)圍繞，確定了宿主範圍。逆轉錄病毒的基因組結構包括被5』和3』長端重複單元(LTR)包圍的gag，pol，及env基因。只要濾過性病毒結構蛋白質在包裝細胞系中以反式提供，逆轉錄病毒載體系統利用最小載體含5』和3』LTRs和包裝信號的事實，足以使載體包裝，感染及整合到靶細胞中。適合基因轉移的逆轉錄病毒的基本優點包括高效感染及在多數細胞類型中基因表達，精確單拷貝載體整合到靶細胞染色體DNA中，逆轉錄病毒基因組的操作輕鬆。
腺病毒由線性，雙鏈DNA組成，複合核心蛋白質並由衣殼蛋白質包圍。分子病毒學的先進技術已能利用這些生物體的生物學知識創造能將新型基因序列轉導到體內靶細胞中的載體。腺病毒基載體能高水平表達基因產物蛋白質。腺病毒載體具有高效感染性，即使使用低效價病毒。另外，病毒能如不含細胞病毒一樣充分感染，所以不需要注射生產者細胞系。腺病毒另一個潛在優點是能獲得體內異源基因的長期表達。
DNA傳遞的機械方法包括融合脂質囊如脂質體或其他膜融合囊，DNA脂質粒子摻和陽離子脂質如脂質轉染劑，DNA的多賴氨酸調節轉移，直接注射DNA，如將DNA顯微注射到生殖細胞或體細胞中，氣動傳遞DNA塗覆粒子，如在「基因槍」中使用的金粒子，無機化學法如磷酸鈣轉染。粒子-調節基因轉移方法在轉移植物組織中首先使用。使用粒子轟擊裝置，或「基因槍」，產生動力將DNA-塗覆高密度粒子(金或鎢)加速到能穿過靶器官，組織或細胞的高速。粒子轟擊可使用在體外系統，或使用來自體內或體內技術將DNA引入到細胞，組織或器官中。另一種方法，配體調節基因治療，包括將DNA與特異配體複合形成配體-DNA綴合物，指導DNA到特異細胞或組織中。
已經發現將質粒DNA注射到肌肉細胞中產生高比率的轉染並含標記基因持續表達的細胞。質粒的DNA能或不能整合到細胞的基因組中。未整合的轉染DNA會使基因產物蛋白質在末端分化，未增殖的組織中的轉染和表達延長一段時間，並且不用擔心在細胞或線粒體基因組中突變插入，缺失，或改變。長期，但沒有必要永久，將治療基因轉移到特異細胞中能對基因疾病提供治療或預防。DNA能定期重新注射以保持基因產物含量，在受體細胞的基因組中沒有突變產生。未整合外源DNA能允許在一個細胞內存在幾種不同的外源DNA構建，所有的構建表達不同的基因產物。
基因轉移電穿孔法使用電流使細胞或組織對電穿孔-調節調節的基因轉移敏感。使用一定電場強度的短暫電脈衝增加膜的穿透性，使DNA分子能穿過進入到細胞中。這種技術也可使用在體外系統中，或使用來自體內或體內技術將DNA引入到細胞，組織或器官中。
載體調節體內基因轉移可用來轉染外源DNA進入到細胞中。載體-DNA複合物能方便地引入到體液或血流中，然後部位特異地定向到身體內的靶器官或組織中。脂質體和多聚陽離子都可使用，如多賴氨酸，脂質轉染劑或細胞轉染劑。脂質體可培養成細胞特異的或器官特異的，這樣脂質體攜帶的外源DNA可被靶細胞吸收。針對某些細胞的特異受體注射免疫脂質體可用來作為一種將DNA插入到攜帶受體細胞中的便利方法。已使用的另一個載體系統是適用於體內基因轉移攜帶DNA到肝細胞中的脫唾液酸糖蛋白/多賴氨酸綴合物系統。
轉染的DNA也可與其他種類載體複合，這樣DNA可被攜帶到受體細胞中，然後居留在細胞質或核質中。DNA能與載體核蛋白質偶合在特異基因工程囊複合物中，並被攜帶直接進入細胞核中。
EM1的基因調節可通過服用與EM1基因，或與resin基因有關的控制區域，或與EM1基因的對應RNA轉錄物結合的化合物調節轉錄或翻譯率來實施。另外，用編碼EM1的DNA序列轉染的細胞也可給患者服用以維持體內EM1源。如細胞可以用含編碼EM1的核酸序列的載體轉染。轉染細胞可以是從患者正常組織，患者病變組織中獲得的，或可以不是患者的細胞。
如，從患者體內移出的腫瘤細胞可用能表達本發明的EM1蛋白質的載體轉染，並重新引入到患者體內。轉染的腫瘤細胞在患者體內產生了抑制腫瘤生長的EM1含量。患者可以是人類或非人類的動物。細胞也可以通過非載體，或此領域中已知的物理或化學方法如電穿孔法，離子穿孔法，或通過「基因槍」轉染。另外，EM1 DNA可在沒有載體輔助的情況下直接注射到患者體內。具體地，EM1 DNA可注射到皮膚，肌肉或血液中。
轉染EM1到患者體內的基因治療方案可以是通過整合EM1DNA到細胞的基因組中，到微型染色體中，或者在細胞質或核質中作為單獨的複製或非複製DNA構建。EM1表達可持續較長的一段時間，或定期重新注射以維持細胞，組織，器官，或確定的血液含量中所需的EM1蛋白質含量。
此外，本發明包括抗體和抗血清，其可用來檢測新型抗-血管生成蛋白質，並也可使用在診斷，預後，或治療特點在於或與血管生成活性或活性缺少有關的疾病和病狀中。這樣的抗體和抗血清也可用來在需要的位置向上調節血管生成，如在梗塞後心臟組織中，EM1蛋白質的抗體或抗血清可用來阻斷局部的自身的抗-血管生成和過程，從而增加新血管的形成以抑制組織的萎縮。
這種抗體和抗血清可與藥用可接受的組合物和載體結合形成診斷，預後或治療用組合物。「抗體」或「抗血清」是指一群免疫球蛋白分子和/或免疫球蛋白分子的免疫活性蛋白質，即含抗體結合位點或互補位的分子。
使用特異結合EM1的抗體的被動抗體治療可用來調節與血管生成相關的過程如再生，發育，傷口癒合及組織修復。此外，定向EM1抗體的Fab區域的抗血清可服用以封閉內源EM1抗血清與EM1結合的能力。
本發明的EM1還可用來產生對抑制劑和其受體特異的抗體。抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。這些特異與EM1或EM1受體結合的抗體，可使用在此領域的技術人員眾所周知的診斷方法和工具中，來檢測或定量體液或組織中的EM1或EM1受體。這些測試的結果可用來診斷或預測癌症和其他血管生成調節的局部的出現和重現。
本發明還包括使用EM1，EM1的抗體，和含EM1和/或其抗體的組合物診斷或預後特點在於血管生成活性的疾病。如本文所使用的，「預後方法」意指能預測診斷患有疾病的人類或動物的疾病的進展的方法，具體地，是與血管生成有關的疾病。本文所使用的「診斷方法」指能在人類或動物體內確定有與血管生成有關的疾病存在或確定其類型的方法。
EM1可使用在檢測及定量能結合EM1的抗體的診斷方法和工具中。這些工具可檢測循環EM1抗體，其指示了在存在由原發性腫瘤原位分泌的EM1情況下微小轉移的擴散。有這種循環抗-EM1抗體的患者很可能發展多種腫瘤及癌症，並很可能在治療後或切除一段時間後重現癌症。這些抗-EM1抗體的Fab片段可用作抗原，產生抗-EM1 Fab片段抗血清，其可用來中和抗-EM1抗體。這種方法可減少被抗-EM1抗體排除的循環EM1，從而有效提高了循環EM1含量。
本發明還包括分離對EM1特異的受體。具有與組織結合高親和力的蛋白質片段可用來在親和柱上分離EM1受體。EM1受體的分離和提純是闡明EM1作用機制的基本步驟。分離EM1受體及鑑定EM1刺激劑和拮抗劑會促進藥物發展以調節EM1受體活性，最終途徑是調節生物活性。使用原位和溶液雜交技術，分離受體能構建核苷酸探針以監控受體的定位及合成。並且，可分離出EM1受體的基因，並摻入到表達載體中及轉染到細胞中，如患者的腫瘤細胞，以增加細胞種類，組織或腫瘤結合EM1及抑制局部血管生成的能力。
EM1蛋白質可用來製成親和柱從培養的腫瘤細胞中分離EM1受體。分離及提純EM1受體後進行胺基酸測序。利用這項信息，基因或編碼EM1受體的基因可被確定並分離。接著，將克隆的核酸序列插入到能表達受體的載體中培養。這些技術對此領域的技術人員是眾所周知的。將編碼EM1受體的核酸序列轉染到腫瘤細胞中，轉染的腫瘤細胞表達受體增強了這些細胞對內源或外源EM1的反應，從而減小了轉移生長率。
本發明的血管生成抑制蛋白質可在標準微量化學設備中合成，用HPLC和質量分光光度測定法檢查純度。蛋白質合成，HPLC提純及質量分光光度法對這些領域中的技術人員是普遍了解的。EM1蛋白質和EM1受體也可在重組E.coli或酵母表達系統中製備，用柱層析提純。
可合成完整EM1分子的不同蛋白質片段使用在幾種應用中包括，但不限於下面列出的作為培養特異抗血清的抗原，作為在EM1結合位點作用的刺激劑和拮抗劑，作為要與定向殺死結合EM1細胞的胞毒試劑結合，或結合中使用的蛋白質。包含這些蛋白質的胺基酸序列根據它們在分子外部區域的位置來選取，便於與抗血清結合。EM1的氨基和羧基末端，以及分子的中間區域在要合成的片段中獨立表示。
EM1的合成蛋白質片段有多種用途。與EM1受體結合具有高度特異性及親和力的蛋白質是放射性標記的，使用放射自顯影和膜結合技術時可用來觀察和定量結合位點。這種應用提供了重要的診斷和研究工具。了解EM1受體的結合屬性有利於研究與受體有關的轉導機制。
使用標準技術EM1和EM1衍生的蛋白質可與其他分子偶合。EM1的氨基和羧酸末端都含酪氨酸和賴氨酸殘基，並用許多技術等位素及非等位素標記，如使用傳統技術放射性標記(酪氨酸殘基-氯胺T，iodogen，乳過氧化物酶；賴氨酸殘基-Bolton-Hunter試劑)。這些偶合技術對此領域中的技術人員是眾所周知的。或者，將酪氨酸和賴氨酸加入到不含這些殘基的片段中，以便標記蛋白質上的活性氨基和羥基基團。根據在胺基酸上有的官能團選擇偶合技術，官能團包括，但不限於氨基，sulfhydral，羧基，醯銨，酚，咪唑。用來影響這些偶合的多種試劑包括戊二醛，重氮化對二氨基聯苯，碳化二亞胺，苯醌。
為了多種應用，EM1蛋白質可與同位素，酶，載體蛋白質，胞毒試劑，螢光分子，化學發光劑，生物發光劑，及其他化合物化學偶合。使用適於特異反應的不同技術來確定偶合反應的效率。如使用氯胺T和Na125I的高特異活性用125I放射性標記EM1蛋白質實施。用焦亞硫酸鈉終止反應，混合物在一次性柱上脫鹽。標記的蛋白質從柱上洗提出，分步收集。從每步收集物中移出等分份，並在用γ計數儀測量放射性活度。在這種方法中，未反應的Na125I從標記的EM1蛋白質分離。特異放射性活度最大的蛋白質組分保存作隨後使用，如分析與EM1抗血清結合的能力。
此外，具有短壽命同位素的標記EM1蛋白質能觀察體內受體結合位點，使用正電子發射線斷層顯影術或其他現代放射顯影技術用EM1結合位點定位腫瘤。
在這些合成的蛋白質內系統置換胺基酸產生對EM1受體高親和力蛋白質刺激劑和拮抗劑，增強或減小了EM1與其受體的結合。這樣的刺激劑用來抑制微小轉移的生長，從而限制了癌症的擴散。EM1的拮抗劑用在脈管生成不充分的情況中，阻斷對EM1的抑制作用促進血管生成。如，這種治療對促進糖尿病患者的傷口癒合有療效。
本發明的EM1蛋白質也可用作營養源或補充物。這種應用沒有限制包括用作蛋白質或胺基酸所補充物，用作碳源，用作氮源及用作碳水化合物源。在這種情況中，本發明的EM1蛋白質可加到具體生物體的食物中，或能以單獨的固態或液態製劑服用，如以粉末，丸劑，溶液，懸浮液或膠囊形式服用。對於微生物，本發明的蛋白質或多核苷酸可加到微生物在其中或其上培養的介質中。
本發明進一步由下列實例演示，這些實例並不意味著發明要以如在其範圍上強加限制的任何方式來解釋。相反，可清楚地理解認為，對發明的多種其他具體實施，修正，及等同物，也有這種藉助方式，在閱讀本文描述內容後，在此領域中的技術人員看來，這種藉助方式沒有背離本發明的精神和/或所附權利要求書的範圍。實例實例1細胞和細胞息從ATCC(美國典型培養物保藏中心，美國維吉尼亞州，Manassas，大學路10801)獲取細胞系786-0(ATCC No.CRL-1932)，腎癌細胞系；C-PAE(ATCC No.CCL-209)，牛肺部動脈內皮細胞，EVC304(ATCC No.CRL-209)，人類內皮細胞系。所有細胞系保持在DMEM(786-0和C-PAE)中或M199(ECV304)中，補充加入10％胎牛血清，100U/ml青黴素，100μg/ml鏈黴素和2mML-穀氨醯胺。波士頓哈弗醫學院分子生物學系B.R.Olsen提供鼠內抑制素pBACPak8的cDNA克隆。從Novagen(美國威斯康星州麥狄遜)購買原核表達載體pET17b。酵母表達系統，Pichia pastoris(pPICZαA)從(美國加利弗尼亞聖地牙哥)購買。限制性內切酶和Vent DNA聚合酶從新英格蘭生物實驗室(美國麻薩諸塞州，Beverly)購買。
實例2將鼠內抑制素克隆並表達到原核系統中從pBACPak8質粒擴增編碼數內抑制素的基因並在pET表達系統中開始表達。通過使用Vent DNA聚合酶，使用內抑制素pBACPαk8作為模板，將編碼數膠原質ⅩⅦ羧基末端部分的序列擴增。引物使用5』-GGC ATA TGC ATA CTC ATC AGG ACTTT-3』(SEQ ID NO3)和5』-AAC TCG AGA TTT GGA GAA GAGGGT-3』。用下列參數實施擴增30個周期94℃變性，60℃退火，722延伸，每種處理1分鐘。使用QIAquick提純工具提純擴增的DNA片段(555 bp)，用NdeI和XhoI(在上面的引物中劃線的限制性位點)消化，連接在表達載體pET17bhis[Dhanabal等人(1995)J.免疫學方法，182165-175]中。初始轉化用宿主株HNS174(美國威斯康星州麥迪遜，Novagen)實施。正克隆兩條鏈都進行測序。將所需的克隆體最終轉化到BL21(DE3)(美國威斯康星州麥迪遜，Novagen)中表達。在pET系統中表達重組蛋白質按照製造商(美國威斯康星州麥迪遜，Novagen)的建議實施。
使用Ni-NTA瓊脂糖柱提純重組蛋白質。存在於包含物體內的蛋白質溶解在8M尿素中，並在如O』Reilly等人(1997)(細胞88277-285)描述的變性條件下提純。結果在圖1(圖3)中顯示，圖1(圖3)顯示在280nm下洗脫組分(○)的吸收率。還標繪有洗脫緩衝液的(●)PH。圖1(圖3)中在約7-8組分周圍顯示有小峰值，在21-22組分周圍有明顯峰值，在約組分35周圍有小峰值。
選取的組分的10ml樣品進行的SDS-PAGE分析顯示，在非還原條件下有22-24kDa的不連續帶。結果在圖2(圖4)中顯示。圖2(圖4)中顯示組分7和8(分別為3和4道)，以及組分21和22(分別為5和6道)的22-24kDa帶。此外，也觀察到46和69kDa的大分子量複合物，其由於用DTT還原產生22-24kDa(圖2(圖4)中7道)帶。收集不同PH值(PH4.2和3.9)洗脫液的峰值，並進行梯度濃度尿素透析，終透析在PBS緩衝液(PH7.4)中進行，在這個時候大部分蛋白質從溶液中沉澱。因為從相同系統表達的非重摺疊沉澱蛋白質在體內顯示出生物活性，所以實施如O』Reilly等人(細胞88277-285)描述的「蛋白質重摺疊」精確程序。沉澱的蛋白質僅在體內試驗中用作懸浮狀態，用BCA檢測法測定蛋白質的濃度(美國伊利諾斯州Rockford Pierce化學公司)(以適當的間隔溶解在尿素中)，並在-70℃以小等分份儲存。因為鼠和人類的內抑制素zC-末端是保守的，所以製備兩個小缺失。設計引物使9或17個胺基酸從內抑制素的C-末端缺失，產生兩種突變體，分別稱為EM1和EM2。對於EM1，所有4個半胱氨酸缺失。對於EM2，大部分C-末端半胱氨酸也缺失了。EM1突變體的上遊引物是5』-TTCCAT ATG CAT ACT CAT CAG GAC TTT CAG GCA-3(SEQ IDNO7)，下遊引物是5』-TTA GAG GCC GCC TAC TCA ATG CAGAGG ACG ATG TA-3』(SEQ ID NO8)。EM2突變體的上遊引物是5』-TTC CAG ATG CAT ACT CAT CAG GAC TTT CAG CCA-3』(SEQ ID NO9)，下遊引物為5』-TTA GCG GCC GCC TAG TTGTGG CAG CTC GCA GCT TTC TG-3』(SEQ ID NO10)。
將擴增的DNA片段(EM1的528 bp，EM2的505 bp)提純，並用NdeI和NotI消化，連接在預消化的pET28(a)表達載體中。剩餘的試驗如上述實施。誘導條件和細菌粒子處理如O』Reilly等人(細胞88277-285)描述的實施。在存在8M尿素中使用Ni-NTA柱實施提純重組蛋白質，如QIA表達手冊(德國Hilden，Qiagen)中所描述的。簡要地，在室溫將細菌粒子溶解在平衡緩衝液(8M尿素，10mM Tris和100mM磷酸鈉緩衝液，PH8.0)中14小時。懸浮液超聲波降解3-4次，在10，000xg下離心，溶解組分以10-20ml每小時的流量加樣在用上述緩衝液預平衡的Ni-NTA柱上。用平衡緩衝液劇烈衝洗柱。用PH值從8.0到6.3，然後到4.2，最後到3.0梯度的緩衝液洗脫結合蛋白質。對於體內試驗使用的內抑制素突變體，非特異與柱結合的蛋白質用平衡緩衝液衝洗，接著用10mM和25mM咪唑衝洗除去。結合蛋白質洗脫在含0.2M乙酸的平衡緩衝液中。用SDS-PAGE分析提純組分，含提純內抑制素的組分(野生型內抑制素使用PH4.2和3.0，對內抑制素突變體使用含0.2M乙酸的平衡緩衝液)收集並緩慢重摺疊。終透析在4℃使用PBS(PH7.4)實施。透析期間蛋白質從溶液中沉澱出來。將其進一步濃縮並以小等分份儲存在-70℃。通過BCA檢測法測定蛋白質的濃度(美國伊利諾斯州Rockford Pierce化學公司)。
實例3在Pichia pastoris中表達鼠內抑制素Pichia pastoris，methanotropic酵母株，具有許多高級真核表達系統的優點(a)存在α因子信號序列以便表達的蛋白質分泌到介質中，(b)酵母株(GS115)僅分泌很低含量的簡化提出過程的內源宿主蛋白質，(c)沒有內毒素汙染，(d)能發生糖基化作用。選取pPICZαA載體表達哺乳動物內抑制素和其突變體和片段，因為這個系統產生高價效並具有優秀生物活性的抗-血管生成蛋白質，如在Vikas P.Sukhatme 1998年12月8日提交的U.S.S.N.XX/XXX，XX，「製備抗-血管生成蛋白質的方法」中所詳細描述的，其內容參考收入本篇。當使用這個表達系統時，發現哺乳動物的內抑制素在誘導後第二天表達為含峰值量表達的溶解蛋白質(20kDa)。
編碼鼠內抑制素的序列進一步通過使用Vent DNA聚合酶在pET17bhis構建模板上擴增修飾，其含有上述的鼠內抑制素。使用的上遊引物是5』-GGG AAT TCC ATA CTC ATC AGG ACT TT-3』(SEQ ID NO11)，下遊引物是5』-AAG CGG CCG CCT ATT TGGAGA AAG AGG T-3』(SEQ ID NO12)。將含EcoRI和NotI限制性位點的擴增片段亞克隆到預消化的酵母表達載體中。pPICZαA載體攜帶帶有抗生分泌的Zeocin標記的α因子分泌信號序列。初始轉化在Top 10』宿主株(美國加利弗尼亞州，聖地牙哥市，InVitrogen)中實施。產物克隆體進行插入存在篩查，正克隆體實施測序。然後將質粒用SacI線性化，並用來同源重組到酵母宿主株GS115(美國加利弗尼亞州，聖地牙哥市，InVitrogen)中。使用如在Pichia表達手冊中所描述的氯化鋰法實施轉化。通過平鋪在含100μg/ml的Zeocin的YPD板上篩查重組體。測試生長在YDP/Zeocin板上的克隆體的表達。
初始篩查用來確定具有高水平表達的酵母克隆體。在2升帶擋板攪拌器的燒瓶內實施大規模表達鼠內抑制素。過夜的培養物(A6002-6)用來接種2-升燒瓶，加入500ml緩衝甘油介質。在30℃，250rmp生長細胞直到A60016-20(2天)。隨後，在5000rmp離心細胞10分鐘，酵母重懸浮在300-400ml緩衝甲醇誘導介質中。收穫誘導後第二，第三，和第四天的含分泌重組蛋白質的上清液。終收穫後，立即處理不含細胞的上清液。
實例4通過肝磷脂-瓊脂糖層析儀提純鼠內抑制素根據O』Reilly等人的數據(1997)(細胞88277-285)，使用肝磷脂-瓊脂糖柱提純。含重組體蛋白質的粗製上清液通過硫酸銨(70％)沉澱濃縮。沉澱的蛋白質溶解在含150mM氯化鈉的10mM Tris緩衝液中，在4℃透析過夜，在6-8小時間隔有三個變化。透析樣品進一步使用Amicon濃縮儀(YM10)通過超濾法濃縮。用肝磷脂-瓊脂糖填充一次性的polyprep柱(美國加利弗逆亞州，Hercules，BioRad)，並用10mM Tris，150mM氯化鈉，PH7.4平衡。濃縮樣品以20ml/小時的流量使用蠕動泵加樣在柱上。用平衡緩衝液衝洗柱直到A280大於0.001。通過分級梯度氯化鈉濃度(0.3M，0.6M，1M，和2M的氯化鈉)將結合蛋白質洗脫在2-ml組分中。收集0.6M到1M的峰值組分，並用PBS，在PH為7.4透析。通過BCA檢測法(美國伊利諾斯州，Rockford，Pierce化學公司)測定蛋白質濃度。提純過程在4℃寒冷房間內進行。Pichia系統表達的重組體溶解內抑制素使用在所有體外檢測中。
圖3(圖5)和圖4(圖6)分別顯示了提純蛋白質的洗脫圖和SDS-PAGE分析圖。圖3(圖5)表示組分數(X軸)，對應在280nm的吸收率(○)(左Y軸)和用來洗脫組分的氯化鈉濃度(●)(右Y軸)標繪圖。隨著氯化鈉濃度的增加獲得兩個顯著的峰值。當與氯化鈉濃度在0.6M時的主要峰值相比時，在0.3M氯化鈉濃度的第一個峰值是小峰值。如在流經組分(圖4(圖6)，4道)中缺少蛋白質蛋白質所示的，大部分內抑制素蛋白質與柱結合。重組體蛋白質結合緊密，使用低度鹽Tris緩衝液除去其他緊酵母衍生蛋白質。從0.3M氯化鈉組分中洗脫的蛋白質含痕量內抑制素，但被其他宿主衍生大分子量蛋白質汙染。提純蛋白質在20kDa移動，因為在22kDa還原移動。收集0.6M和1M氯化鈉洗脫的蛋白質組分，濃縮並用PBS(PH7.4)透析。提純的蛋白質進一步通過FPLC使用Superose12大小分離柱(美國新澤西州，Piscataway，藥物生物技術有限公司)分離。這種柱的洗脫圖只顯示一個峰值。10ml選取組分的等分份在12％SDS-PAGE凝膠上分析，結果在圖4(圖6)中顯示。SDS-PAGE分析顯示存在與內抑制素對應的單一22-24 kDa離散帶。表達水平估定在每升培養物15-20mg。
為了進一步定性重組體蛋白質，N-末端微量測序實施7個周期。試驗顯示酵母α因子信號肽被加工並在丙氨酸被裂解。提純蛋白質的信號肽裂解後的開始的7個殘基(EGHTHQD)，與帶有從接頭序列衍生的首先的兩個殘基(EF)的內抑制素蛋白質的公布序列精確匹配。
實例5在Pichia表達系統中克隆表達組氨酸內抑制素將10個組氨酸殘基的組氨酸標記放在在pETl7bhis表達載體中的鼠內抑制素構建的編碼區域之前。編碼區域，包括組氨酸標記序列，通過用EcoRI和NotI位點擴增穿到pPICZαA載體中，如上所述實施線性化和重組到酵母宿主株GS115中。用70％硫酸銨沉澱不含細胞介質。沉澱的蛋白質溶解在含30mM氯化鈉的50mM磷酸鈉緩衝液(PH8.0)中，並在4℃在相同的緩衝液中透析，有6-8小時間隔的三個變化。使用Ni-NTA柱提純組氨酸內抑制素重組體蛋白質，如在QIA表達手冊(德國，Hilden，Qiagen)中所描述的。結合蛋白質用分級梯度咪唑(10mM，25mM，50mM，100mM)洗脫。收集50mM和100mM咪唑洗脫液的峰值組分，並用PBS透析，PH為7.4。
結果在圖5(圖7)中顯示，圖5(圖7)顯示了組分數(X軸)，與在280nm的吸收率(左Y軸)(○)和用來洗脫組分的咪唑濃度(右Y軸)(●)的標繪圖。觀察到幾個吸收率峰值，第一個是最大的，接著三個小峰值。Ni-NTA柱的組氨酸內抑制素洗脫圖顯示重組體蛋白質結合緊密。在培養物上清液中的酵母衍生蛋白質沒有與柱結合，在衝洗期間被除去。結合蛋白質通過分級梯度咪唑洗脫。加入10mM咪唑洗脫非特異結合宿主衍生蛋白質(圖5(圖7))。在25mM咪唑濃縮時，小組分重組蛋白質與大分子量蛋白質一起洗脫。50mM和100mM咪唑終洗脫顯示了顯著的峰值。SDS-PAGE分析在圖6(圖8)中顯示。流經組分(3道)不含任何內抑制素，說明大部分蛋白質與柱結合。增加咪唑濃度到10mM和25mM產生非特異蛋白質洗脫。，提純重組體組氨酸內抑制素以與在50mM咪唑中的22-24kDa對應的單一帶移動。分子量為22kDa的蛋白質連同少量的與44-46kDa對應的蛋白質在100mM濃度中可看到。提純蛋白質的濃度通過BCA檢測法確定。表達水平估定為15mg每升培養物。
實例6重組體酵母內抑制素的定性及多克隆抗體的產生和Western印跡分析製備在酵母中的鼠重組體內抑制素的多克隆抗血清，通過用10μg從Pichia表達系統衍生的提純蛋白質免疫兔子來培養。在12％SDS=PAGE凝膠上分離細菌系統及酵母系統表達的重組體內抑制素。通過半乾轉移法(美國加力弗尼亞州Hercules，轉-印跡，BioRad)將蛋白質轉移到PVDF膜中。初級抗血清用含5％脫脂幹奶的1xTBS緩衝液稀釋到1∶4000。山羊抗0兔子IgG/HRP綴合物用作二級抗體(1∶5000)。用化學發光法檢測免疫反應性(美國伊利諾斯州Rockford，Pierce化學公司)。
將細菌表達系統和酵母表達系統表達的提純內抑制素置於還原及非還原條件下。圖7(圖9)顯示與內抑制素對應的免疫反應帶。通過Western印跡估定的蛋白質大小在範圍22-24kDa。此外，用Penta組氨酸單克隆抗體(德國，Hilden，Qiagen)探測酵母及細菌表達的重組體組氨酸內抑制素。單克隆抗體僅對組氨酸內抑制素表現正反應，而原內抑制素沒有顯示任何免疫反應性。這個數據確證了在重組體蛋白質中存在組氨酸標記。抗血清對人類或鼠內抑制素沒有顯示交叉反應性，說明一些程度的免疫反應性對內抑制素特異。
實例7內皮細胞最增殖檢測製備在酵母系統中的內抑制素的抗增殖效果使用牛肺部動脈內皮細胞(C-PAE)測試。使用不同的內皮細胞及不同參數(「飢餓」時間，血清濃度，有絲分裂刺激劑的濃度和種類)實施初始試驗。C-PAE細胞給出最大的可再生的反應、將C-PAE細胞平鋪在塗有纖維結合蛋白的24個培養皿中，在每個培養皿上含2％FBS的0.5ml DMEM中有12，500個細胞。在37℃溫育24個小時後，用含或不含重組體鼠內抑制素的新鮮DMEM和含3ng/ml bFGF的2％FBS(美國明尼蘇達州Minneapolis研究發展體系)置換介質。細胞用1μCi的3H-胸苷脈衝24小時。將介質吸出，細胞用PBS衝洗三次，然後加入1.5N氫氧化鈉(每個培養皿100μl)溶解，在37℃溫育30分鐘。用液體閃爍計數器確定細胞-相關放射性活度。在相同的條件下試驗進行5次，每次結果相同。
觀察bFGF誘導增殖的劑量相關抑制作用。結果在圖8(圖10)中顯示，圖8(圖10)中在X軸顯示酵母衍生溶解內抑制素(○)和酵母衍生組氨酸溶解內抑制素(●)，在Y軸上顯示3H-胸苷的摻入率。通常，隨著內抑制素的濃度增加摻入率穩定下降。觀察隨著內抑制素濃度的增加(0.1μg/ml到10μg/ml)的抑制作用範圍(對照物的30-94％)，ED值在範圍600-700ng/ml。在用上述的檢測法測試酵母衍生的組氨酸內抑制素時，可觀察到對C-PAE細胞相同的抑制作用，如在圖8(圖10)中所示。隨著酵母衍生的溶解內抑制素(○)或酵母衍生的溶解組氨酸內抑制素(●)的濃度增加，3H-胸苷的摻入率穩定下降。
如圖9(圖11)所示，在濃度範圍在0.5μg/ml到10μg/ml時，重組體蛋白質不抑制腎癌細胞(786-0和A498)的增殖。圖9(圖11)是柱狀圖，顯示在786-0細胞(空柱)中和A498細胞(陰影柱)中3H-胸苷的摻入率。重組體內抑制素還對IMR90和NIH3T3成纖維細胞沒有作用。
實例8內皮細胞移動檢測因為C-PAE細胞對bFGF的刺激不移動，所以使用bFGF作為刺激物時使用含不同濃度的內抑制素的ECV304細胞。為了確定重組內抑制素阻斷ECV304細胞朝bFGF移動的能力，移動檢測使用帶有聚碳酸酯膜(25×80mm不含PVD，8μ孔，美國加力弗尼亞州Livermore，Poretics公司)的有12個培養皿的Boyden趨化式箱(神經-探針有限公司，美國馬裡蘭州CabinJohn)實施。通過用含0.5％白明膠，1mM氯化鈣和150mM氯化鈉的溶液塗覆箱在37℃過夜來預防生長因子與箱非特異結合。ECV304細胞在含的5ng/ml DiI(1，1』-dioctadecyl-3，3，3』，3』，-tetramethyindocarbocyanine，氯酸DiIC18，)的10％FBS中生長過夜，用含0.05％BSA的PBS衝洗。接著胰蛋白酶化，使用Coulter-計數儀(英國，Luton)計數細胞，並稀釋在含0.5％FBS的介質199(Gibco/BRL，美國馬裡蘭州Gaithersburg)中到300，000個細胞/ml。較低的箱用含25ng/ml bFGF的介質199填充。較高的箱用含不同濃度的重組蛋白質的15，000個細胞/培養皿接種。細胞允許在37℃移動4小時。這時，在膜上表面的細胞用細胞刮器移出，在較低表面的(移動的)細胞安裝在3％甲醛中並用PBS衝洗。用螢光顯微鏡及數位相機獲得在550nM的固定膜的成像。在每張膜上的細胞數量用OPTIMAS(6.0版本)軟體(媒介細胞計數術，美國MD，Sliver Spring，L.P.)確定。
如圖10A(圖12A)和10B(12B)及圖11(圖13)所示，加入內抑制素導致對移動的劑量相關抑制作用。圖10A(圖12A)和10B(12B)是兩張顯微照片，表示使用bFGF(25ng/ml)作刺激物溶解鼠內抑制素對內皮細胞(ECV304)的抑制作用。圖10A(圖12A)表示在對照物(+bFGF，無內抑制素)中移動的內皮細胞，圖10B(圖12B)表示用內抑制素(20μg/ml)和bFGF治療的移動的內皮細胞。
圖11(圖13)是柱狀圖，表示使用不同濃度的內抑制素對內皮細胞移動的抑制作用。相對細胞移動在Y軸表示，治療方式(對照物，25ng/ml bFGF，20，10，5，2.5μg/ml內抑制素)在X軸表示。每種治療方式重複實施。在每個培養皿中移動細胞的數量在三個不同區域計數，獲得平均值。每個值是典型試驗的平均值，打叉柱表示標準偏差。在濃度小於1μg/ml時，記錄了對移動邊緣抑制作用，而在10μg/ml時，可觀察到對內皮細胞移動的60％抑制作用。這些研究首先顯示了內抑制素對細胞移動的作用。內抑制素對兩種非內皮細胞系(IMCD)移動的作用也進行了檢測。在內髓質收集管腎細胞(IMCD)中沒有觀察到有效果，在IC-21巨噬前體細胞系中記錄了一些程度的作用(5μg/ml時15％；20μg/ml時50％)，這說明在高濃度下，內抑制素可阻斷一些細胞種類的細胞移動。
實例9絨毛尿囊膜(CAM)檢測法使用絨毛尿囊膜(CAM)檢測法測試鼠內抑制素體內阻斷bFGF誘導血管生成的能力。受精白Leghorn雞蛋(SPAFAS有限公司，Norwich CT)打開置於100mm2培養皿上，並在37℃溼潤溫育箱內生長11天。含vitrogen(膠原質生物物料，PaloAlto，CA)濃度為0.73mg/ml的沉澱粒子被補充加入僅載體；VEGF(25ng/沉澱粒子)，VEGF(25ng/沉澱粒子)和內抑制素(20-0.5μg/沉澱粒子)，bFGF(50ng/沉澱粒子)，或bFGF(50ng/沉澱粒子)和內抑制素(20-0.5μg/沉澱粒子)。沉澱粒子在37℃聚合2小時。將沉澱置於尼龍網上並取向在CAM周邊上。將胚胎重置於溫育箱內24小時。通過注射FITC-右旋糖苷到雞胚胎的循環系統中，評定在膠原質網上入侵的新毛細管。在試驗的最後，將網切碎，依據Iruela-Arispe等人的方法(1997)(Thromb.Haemost.78672-677)，使用程序NIH成像v1.59實施評定脈管密度。檢測進行三次，進行四次獨立的試驗。
如圖12(圖14)和13(15)中所示，內抑制素能抑制由bFGF和VEGF調節的血管生成反應。圖12(圖14)是一組三張顯微攝像圖，顯示只用載體[圖12A(圖14A)]，只用VEGF[250ng/粒子，圖12B(圖14B)]，及用VEGF和內抑制素[圖12C(圖14C)]時的脈管密度。圖13A(圖15A)和圖13B(圖15B)顯示劑量相關的抑制作用。圖13A(圖1 5A)是柱狀圖，表示重組蛋白質濃度(X軸)，與對VEGF(Y軸)反應的血管生成抑制作用標繪圖。圖13B(圖15B)是柱狀圖，表示重組蛋白質濃度(X軸)，與對bFGF(Y軸)反應的血管生成抑制作用標繪圖。所有計數用負對照物標準化。兩張圖都顯示隨著內抑制素濃度的增加對血管生成的抑制作用穩定增加。在20μg/目時，對VEGF反應的抑制(47％)一定程度上比對bFGF反應的抑制作用(39％)更有效。
實例10對內抑制素抑制作用的中和內抑制素抑制作用的特異性通過使用內皮增殖和CAM檢測的中和作用依據來演示。在內皮細胞增殖檢測中，在室溫將內抑制素用過量的多克隆抗血清或提純抗體(IgG)溫育1小時，然後加入存在3μg/ml的bFGF的C-PAT細胞中。預免疫血清用作負對照物。此外，單獨使用提純IgG和內抑制素抗體也用作對照物。通過加入1μCi的3H-胸苷24小時測定DNA合成，細胞-相關放射性活度如是所述測定。對於CAM檢測，在製備沉澱粒子前，在4℃將內抑制素(10μg)和抗血清(50μg)預溫育過夜。這些試驗的對照試驗包括只使用IgG和只使用預免疫血清。如上所述確定兩個檢測中的血管生成反應評定。
圖14(圖16)是柱狀圖，表示在內皮細胞增殖檢測法中，多克隆抗血清對鼠內抑制素的抑制效果的中和。3H-胸苷的摻入率在Y軸表示，治療方式(對照物，10μg內抑制素+抗血清，5μg內抑制素，5μg內抑制素+抗血清，預免疫血清，內抑制素抗血清，和內抑制素IgG)在X軸表示5每個值是從三份培養物中獲得的值的平均值，打叉柱表示標準偏差。圖15(圖17)是兩張顯微照片，表示CAM檢測法的結果。圖15A(圖17A)表示VEGF和內抑制素(10μg)的效果，圖15B(圖17B)表示VEGF，內抑制素(10μg)，和多克隆抗血清(50μg)的效果。圖14(圖16)和圖15(圖17)都顯示通過與特異抗血清溫育，內抑制素的抑制作用可被抑制。抗-內抑制素的抗血清抑制抑制作用的95％。只使用預-免疫血清和內抑制素沒有刺激作用，正常的兔子IgG也沒有。
實例11在裸鼠模型中對原發性786-0RCC腫瘤的抑制6-8周大的雄性裸鼠在右側皮下注射100ml2百萬個786-0細胞。腫瘤在植入後約兩周出現。腫瘤大小使用測徑器測定，腫瘤體積使用標準公式計算腫瘤體積=ab2×0.52，其中a=腫瘤長度，b=腫瘤寬度(O』Reilly等人(1994)，細胞79315-328)。腫瘤體積在範圍350mm3到400mm3。將動物完全打亂，每組有具有組內和組間腫瘤大小可比的5隻鼠。用重組內抑制素(細菌或酵母版的)開始治療，每隻鼠每天接受10mg/kg體重的重組體蛋白質，通過腹腔內注射服用10天時間。對照動物每天接受PBS。隔天測定所有組中的腫瘤大小，並計算腫瘤體積。在第10天終止治療，將動物殺死，取出每隻鼠的腫瘤，安裝在10％緩衝福馬林中。
結果在圖16(18)，17(19)和18(20)中顯示。圖16(圖18)表示通過重組內抑制素系統治療，對786-0腫瘤生長的抑制作用。Y軸表示腫瘤體積為mm3，治療後的天數為時間在X軸上。以10mg/kg/天實施腹腔內注射內抑制素，開始於第一天(箭頭)。每個時間點表示每組5隻鼠的平均值，打叉柱表示S.E.M。治療方式為對照物PBS(○)，酵母表達內抑制素(●)，酵母表達組氨酸內抑制素(x)，和細菌表達內抑制素(□)。在治療後第5天，在對照物(936mm3)和治療腫瘤之間出現不同。酵母內抑制素治療的腫瘤為405mm3，細菌製備的內抑制素治療的腫瘤為442mm3，組氨酸內抑制素治療的腫瘤為462mm3。
圖17A(圖19A)到17E(19E)是用重組內抑制素治療的786-0腫瘤的一組5張照片。圖17A(圖19A)和17B(19B)是對照物腫瘤，圖17C(圖19C)表示用酵母衍生的內抑制素治療的腫瘤，圖17D(圖19D)表示細菌衍生的組氨酸內抑制素的效果，圖17E(圖19E)表示用酵母衍生的組氨酸內抑制素治療的腫瘤。在治療階段的最後，在解剖顯微鏡下全面檢測對照物的腫瘤和治療組的腫瘤。對照組的腫瘤通常較大並具有較高可視性。在治療後的第5天，在對照組和治療組之間(圖16(圖18)和17(圖19))，可觀察到腫瘤體積減小到2.5倍。在所有治療組中腫瘤生長被抑制，與對照組比較可觀察到減緩的生長速度。在10μg/ml劑量下，細菌-(組氨酸標記的)或酵母衍生的(有或沒有組氨酸標記的)內抑制素都運作的同樣好。在治療後的第10天，在對照動物中腫瘤體積為1490mm3(p值＜0.005)。服用內抑制素沒有完全抑制腫瘤的生長；腫瘤生長顯示，在治療期間體積只有邊緣增加。實例12在E.coli中產生的兩個密切相關的C-末端內抑制素突變體在體內RCC中的活性方面表現出顯著的不同上述的RCC腫瘤模式使用在使用內抑制素，和在上面實例1中的原核系統中製備的突變體EM1和EM2的第二組試驗中。日劑量是每公斤體重20mg蛋白質，腹腔內注射。初始腫瘤體積是150-200mm3。野生型內抑制素，也是製備在pET28(a)載體中的，以每公斤體重20mg服用作為正對照試驗，服用PBS作為負對照試驗。
結果在圖18(圖20)中顯示。圖18(圖20)在X軸上表示治療後天數，在Y軸表示腫瘤體積。每個時間點表示每組中5隻鼠的平均值。治療方式為對照物PBS(○)，細菌衍生的野生型組氨酸內抑制素(點劃線，□)，細菌衍生的EM1(虛線，△)，細菌衍生的EM2(實線，◆)。腹腔內注射開始於第一天(箭頭)。治療後第9天，組間差距明顯[圖18(圖20)]。在治療後第11天，對照組中的腫瘤體積(397mm3)是兩個治療組的腫瘤體積的約兩倍內抑制素(182mm3)或EM1(259mm3)。然而，在同一天，EM2-治療組的腫瘤體積(389mm3)與對照組的腫瘤體積(397mm3)基本相同。重要性在於在EM2和內抑制素組之間有90％置信水平，在內抑制素和對照組之間有95％的置信水平。去掉第11天每組中的最大和最小腫瘤的值，使EM2和EM1之間及EM2和內抑制素之間的置信水平增加到95％。這樣，EM1蛋白質保留了內抑制素的原生物活性，而EM2，多含8個胺基酸的缺失，沒有保留內抑制素的原生物活性。此外，在內抑制素組的5隻鼠中的2隻和EM1組中的5隻鼠中的1隻，在治療的最後階段沒有檢測到腫瘤。
實例13Annexin V-FITC檢測Annexin V，一種具有對磷脂醯絲氨酸(PS)高親和力的鈣相關磷脂結合蛋白質，可用來檢測早期細胞程序死亡。細胞程序死亡開始後，多數細胞種類將膜磷脂磷脂醯絲氨酸(PS)從質粒膜的內表面移位到膜外。PS可通過用Annexin的FITC綴合物染色檢測，與PS自然結合的38kDa蛋白質。在PCD期間，PS的表面化通常在氣泡形成及DNA片段化之前。
簡要地，將200，000個細胞平鋪在纖維結合蛋白塗覆的6個培養皿上的含2％FBS和3ng/ml bFGF的DMEM中。給每個培養皿加入不同濃度的重組體鼠內抑制素，治療18小時後，收穫並加工細胞。對於時間進程研究，加入10μg/ml內抑制素，3，4。6，12和18小時後處理細胞。人類重組TNT-α(40ng/ml)作為正對照物。細胞用PBS衝洗，並懸浮在結合緩衝液(10mMHEPES/氫氧化鈉，PH7.4，140mM氯化鈉，2.5mM氯化鈣)中。加入Annexin V-FITC到終濃度為100ng/ml，然後在黑暗中溫育細胞10分鐘，再用PBS衝洗，並懸浮在300ml結合緩衝液中。在流動細胞計數分析前加入10μl的碘化丙錠(PI)。使用Becton Dickinson FACStar加流動細胞計數器分析細胞。使用電子補償消除傷流螢光。在每個樣品中，計數最小量10，000個細胞並以清單模式儲存。使用標準細胞Quest軟體(Becton-Dickinson)進行數據分析。建立四象限，以使負對照物允許小於1％正性。內抑制素以μl/ml加入到非內皮細胞(NIH3T3和786-0)中，如上述加工分析細胞。
在10μg/ml時，內抑制素顯示明顯的升高了Annexin螢光強度。在5和10μg/ml時，對照物和內抑制素治療的比之間的平均螢光強度差距是很顯著的(p=0.01)。對於10μg/ml的內抑制素和正對照物TNF-α(40ng/ml)，螢光強度的升高是相似的。濃度低於0.10μg/ml的內抑制素不顯示任何顯著的Annexin V正性。為了研究內抑制素最早引發PS表面化的時間點，我們實施了時間進程試驗(圖2B)。在治療12小時後，內抑制素的效果是顯著的(p=0.01)。在6小時之前的時間點，對照物和治療樣品之間沒顯示差異。
用螢光顯微鏡(Nikon)法分析樣品進行FACS形態檢測，顯示在12小時時Annexin V染色定位在細胞膜，沒有染色在細胞質中。在這段時間，大部分細胞對PI是負效應的，顯示了早期的細胞程序死亡。隨著增加暴露時間(24-36小時)，除了膜對Annexin V染色，一些細胞對PI轉為正效應，與細胞程序死亡的更前面的階段一致。
在研究的兩種其他內皮細胞系中觀察到了相同量的AnnexinV染色，BAE和BCE。我們已測試了人類內抑制素對三種牛內皮細胞系的作用。在給置信細胞加入人類內抑制素時，我們沒有檢測到Annexin V染色，而當使用人類內皮細胞(HUVE，和HMVE-L)時，它產生了Annexin V螢光強度的明顯升高(準備中的原稿)。這些數據顯示，細胞程序死亡，如用AnnexinV染色所測定的，發生在不同的對鼠和人類內抑制素反應的內皮細胞中。
至於非內皮細胞，786-0和NIH3T3細胞沒有顯示任何明顯的Annexin正性。此外，對其他非內皮細胞(IMR-90，A10和H9c2(2-1)-成肌細胞)進行篩查，發現內抑制素沒有效果。根據這些結果，內抑制素的作用顯示對內皮細胞的選擇性。
實例14Caspase 3檢測Caspase 3(CPP32)是一種在哺乳動物細胞程序死亡期間早期激活的細胞內蛋白酶，其通過降解特異結構，調節，和DNA修復蛋白質引發細胞斷裂。這種蛋白酶活性可通過檢測從標記的低物(DEVD-pNA)裂解後的生色團的(p-硝基醯苯胺)分光光度法測定。
這種檢測在75cm2組織培養燒瓶內實施，或在纖維結合蛋白-塗覆的6個培養皿中實施。用每個培養皿0.5-1×106個細胞接種6個培養皿，用2×106個細胞接種燒瓶。細胞在含10％FBS的DMEM中保持過夜。第二天，舊介質用新鮮介質(2％FBS)置換，細胞在37℃溫育過夜。接著飢餓處理，細胞在DMEM(5％FBS)中用bFGF(3ng/m1)刺激。與bFGF一起，加入酵母內抑制素(10μg/ml終濃度)，細胞生長24小時。對於對照培養皿，僅加入PBS緩衝液。作為正對照物，使用TNF-α，終濃度為20ng/ml。24小時後，離心上清液並收集。培養皿(燒瓶)胰蛋白酶化並收集附著細胞並與上清液細胞混合。計數細胞，並重新懸浮在細胞裂解緩衝液(美國加利弗尼亞州Palo Alto，克隆技術)中，濃度為4×106個細胞/ml。剩餘步驟按照製造商的建議(美國加利弗尼亞州Palo Alto，克隆技術)。Caspase的特異抑制劑，DEVD-fmk，用來確證如製造商所建議的特異性。在微型板讀取器(美國加利弗尼亞州，Hercules，BioRad)上測定在405nm的吸收率。通過比較誘導的樣品(酵母內抑制素或TNF-α)與未誘導的對照物可確定蛋白酶活性的增加倍數。同樣地，使用非內皮細胞(NIH3T3和H9c2(2-1)-成肌細胞)，並如上所述進行分析。
首先用10μg/ml的內抑制素實施時間進程試驗，確定caspase3活性的增加。在2，4，8，和14小時時，治療的樣品和對照樣品之間caspase 3活性沒有差距。然而，在用內抑制素治療24小時後caspase 3活性超過對照物。用內抑制素和TNF-α(正對照物)治療的樣品在圖21中顯示。當與對照物比較時，24小時後用內抑制素治療的樣品顯示出caspase 3活性增加到1.8倍，而TNF-α也提供了可比的增加(1.75倍)。檢測至少重複5次獲得相同的結果。當caspase 3(DEVD-fmk)特異抑制劑包含在相同的樣品中時，蛋白酶活性基線位置(比較黑色塊與相應的白色塊)，說明測定的活性增加是對caspase 3特異的。圖22顯示，僅對於NIH3T3細胞，可觀察到caspase-3的邊緣增加，而在成肌細胞中，在治療樣品和對照培養物之間沒有差異。
實例15TUNEL染色的顯微鏡檢測核DNA的片段化是一種出現在細胞程序死亡的細胞核中的明顯形態改變。TUNEL(末端脫氧核苷酸轉移酶-調節dUTP切口-末端-標記)檢測在用內抑制素，TNF-α治療的細胞和對照細胞上實施。對於附著細胞，C-PAE細胞以5，000個細胞每個培養皿密度接種在纖維結合蛋白塗覆的(10μg/ml)Lab-Tek箱的玻片上，並在含10％FBS的0.4ml的DMEM介質中生長。兩天後，將舊介質吸去，加入含2％FBS的新鮮DMEM，細胞飢餓過液。接著，含3ng/ml bFGF的0.36ml新鮮介質(含2％FBS)連同酵母內抑制素(10μg/ml)或TNF-α(20ng/ml)一同加入。對於對照樣品，加入含3ng/ml bFGF的新鮮介質(含2％FBS)。接著進行誘導(24小時)，玻片用PBS衝洗兩次，隨後在4℃安裝在新鮮的4％甲醛/PBS中25分鐘。玻片用PBS衝洗，在0.2％Triton X-100/PBS中在冰上透化處理細胞5分鐘，然後在室溫用新鮮PBS衝洗兩次，每次5分鐘。如下述實施TUNEL檢測。
TUNEL檢測如在ApoAlert DNA片段化檢測工具使用手冊(美國加利弗尼亞州Palo Alto克隆技術)中所描述的實施，除了碘化丙錠(美國密蘇裡州聖路易斯，Sigma)的終濃度是1μg/ml。檢測後，加入一滴抗褪色溶液，玻片的治療部分用玻璃蓋片覆蓋，邊緣用透明指甲油密封。玻片立即置於配有綠螢光(520nm)和紅螢光(＞620nm)雙濾光片的螢光顯微鏡下觀察。使用數碼顯微鏡(Nikon顯微攝像-SA)攝像，並使用1.1.02版本的SPOT軟體處理。對於正對照物(TNF-α)，選取5個隨機區域，對於樣品，選取15個隨機區域。然後計數每個區域的紅色細胞和綠色細胞的量，(在給定區域內確定綠色細胞除以紅色細胞量的百分比)。然後計算不同區域的平均值(用S.E.M)。
對於在懸浮液中的細胞，飄浮細胞通過在4℃在300xg下離心作用收集。將舊介質吸乾，細胞重新懸浮到500ml PBS(PH7.4)中。細胞再次離心，將PBS除去，沉澱粒子重新懸浮在75ml新鮮PBS中。使用乾淨的玻片，將重懸浮的細胞鋪在聚-L-賴氨酸塗覆的玻片(Jersey實驗室提供)上。通過在4℃將玻片浸沒在新鮮的4％甲醛/PBS中25分鐘，將細胞固定。剩餘步驟如上所述實施。
在存在酶TdT的情況下，在綠螢光下用內抑制素和TNF-α治療的玻片顯示大量的正細胞，而在對照物中沒有觀察到正細胞。在沒有酶的情況下，用內抑制素治療的玻片顯示背景細胞螢光。
計數在若干區域內的細胞程序死亡的細胞數量，細胞程序死亡細胞的百分比(綠色細胞除以每區域的紅色細胞量)在圖23中標繪出，圖23這柱狀圖。在對照細胞中的細胞程序死亡率是1.24％。在用內抑制素治療的細胞中，在懸浮細胞中觀察到細胞程序死亡率增加到30倍(38.3％)，而在附著細胞中觀察到細胞程序死亡率增加到15倍(19.4％)。使用TNF-α時，細胞程序死亡率是6.4％。相反，在抗血管生成素治療的BCE(牛腎上腺皮層毛細管內皮細胞)細胞中TUNEL-正性百分比為2％，當與對照細胞(1.2％)相比時，有1.6倍增加，說明內抑制素是比抗血管生成素更強的細胞程序死亡試劑。
實例16通過Western印跡分析Bc-1和Bax表達將C-PAE細胞接種在10cm的培養皿上，培養皿上育塗覆纖維結合蛋白(10μg/ml)和含3ng/ml的bFGF的2％FBS。加入10μg/ml濃度的內抑制素，收穫治療後12，24和28小時的細胞。細胞用PH為7.4的PBS緩衝液衝洗三次，細胞重新懸浮在1ml含新鮮加入的完全蛋白酶抑制劑片(BoerhingerMannheim)，100mg/ml Pefabloc，1mg/ml抑肽素的1X EBC緩衝液(50mM Tris-Hcl，PH 8.0，120mM氯化鈉，1％NonidetP-40)。在整個細胞裂解液中的蛋白質濃度通過BCA法測定。將30mg整個細胞提取物加樣到415％梯度聚丙烯醯胺凝膠上。使用半乾轉移印跡設備(美國加利弗尼亞州Hercules，BioRad)實施轉移。將膜封閉在含5％脫脂幹奶的衝洗緩衝液(1×TBS)中，並在37℃溫育1小時。從Santa Cruz生物技術(美國加利弗尼亞州Santa Cruz)購買人類Bcl-2(N-19){sc-492-G}的直接羊抗體。從相同的製造商購買Bax(B-9){sc7490}和Bcl-XS/L{sc1690}的親和提純鼠多克隆抗體。多克隆抗-肌動蛋白抗體(美國密蘇裡州聖路易斯，Sigma)用來標準化蛋白質加樣。二級抗體是與辣根過氧化物酶(美國伊力諾斯州，ArlingtonHeights，Amersham公司)綴合的抗山羊，鼠和兔子免疫球蛋白。使用加強的化學發光試劑(美國伊力諾斯州，Rockford，Pierce化學公司)檢測免疫反應性。使用平床掃描儀(Scan-Jet 4C)掃描影像，並使用NIH影像軟體定量影像。通過用每個試驗內的Bcl-2信號除以肌動蛋白信號實施正態化。
抗-細胞程序死亡成員如Bcl-2和Bcl-XL預防PCD對多數刺激劑反應。相反地，促-細胞程序死亡蛋白質如Bax和Bak能加速細胞死亡；在某些情況下，它們足以致使細胞程序死亡而與其他信號無關。內抑制素治療細胞的及對照物C-PAE細胞的整體細胞體提取物進行Bcl-2和Bax表達水平檢測。在生長滯留C-PAE細胞中，Bcl-2表達水平高。其保持相對一致達28小時。相反，內抑制素治療的細胞表現Bcl-2的明顯減少，如圖24A中所示。光密度檢測顯示與對照細胞相比，在治療後12，24和28小時Bcl-2的量為減少1.2，1.5，和3倍，使用肌動蛋白含量作為正態化對照物。相反，對照物和治療培養物之間Bax表達相似(圖24B)。
在NIH3T3和IMR-90細胞中沒有檢測到Bcl-2蛋白質。在這些細胞系中Bax表達水平不受內抑制素治療的影響，如在圖25A和25B中所示。在C-PAE細胞中，在早期時間點(12小時)，Bcl-2量減少2倍，而在NIH3T3細胞中它的表達不變(圖25C和圖25D)。有趣的是，我們在C-PAE細胞中僅檢測到Bcl-X的大分子促細胞程序死亡形式，而在NIH3T3細胞中大分子和小分子形式都檢測到了。
這些發現表明，內抑制素通過改變Bcl-2的表達來發揮其調節活性。有趣地，VEGF已顯示出增加內皮細胞中Bcl-2含量。因為內抑制素拮抗VEFG的增殖作用，Bcl-2顯示為一個調節點。最近的研究表明Bc-2蛋白質與其他蛋白質結合，如Bax，BclXS，Bik，和Bad，最終加強細胞存活(Newton，K，和Strasser，A(1998)，Curr.Opin.Genet，Dev.868-75；Jacobson，M.D.(1997)，Curr，Biol7R277-81)。另一種Bcl-2同系物的功能，Bax的功能還沒有解開。Bcl-2和Bcl-XL通過Bax的異二聚化作用發揮功能，過量表達Bax加速細胞程序死亡。最近，有顯示FGF-2通過與BCL-2有關和無關的機制抑制內皮細胞的細胞程序死亡。在我們的研究中，我們確實在內抑制素治療的培養物中觀察到Bcl-2(和Bcl-XL)表達的不同。但沒有觀察到Bax量的不同。這可能說明Bcl-2作用與Bax無關，如T細胞所顯示的。等同物雖然本發明用其較好的具體實施進行了具體的顯示及描述，但此領域中的技術人員應該理解的是，在沒有背離如所附權利要求書所限定的本發明精神和範圍的條件下，可以有各種形式及細節上的不同的改變。
權利要求
1．一種分離的抗血管生成肽，其中分離的肽的C-末端包括胺基酸序列SYIVLCIE。
2．一種分離的EM1，其包括突變的內抑制素蛋白質，其中從內抑制素的C末端包括9個連續胺基酸的缺失，其中分離的EM1的特點在於具有抗血管生成活性。
3．依據權利要求2的分離的EM1，其中分離的EM1的C-末端包括胺基酸序列SYIVLCIE。
4．依據權利要求2的分離的EM1，其中9個連續胺基酸的缺失包括胺基酸序列NSFMTSFSK。
5．依據權利要求1的分離的多核苷酸，包括(a)SEQ ID NO的核苷酸序列；(b)與SEQ ID NO的核苷酸序列互補的序列；(c)在嚴格條件下與SEQ ID NO的核苷酸序列雜交的序列。
6．分離的多核苷酸，包括由SEQ ID NO7和SEQ ID NO8的引物擴增的核苷酸序列。
7．依據權利要求3的分離的多核苷酸，其中多核苷酸與表達控制序列實施連接。
8．用權利要求7的多核苷酸轉化的宿主細胞。
9． 依據權利要求8的宿主細胞，其中細胞是從包括細菌，酵母，哺乳動物昆蟲或植物的細胞中選取的。
10．一種製備由權利要求3的多核苷酸編碼的蛋白質的方法，其中方法包括(a)生長用權利要求3的多核苷酸轉化的宿主細胞的培養物，其中宿主細胞是從包括細菌，酵母，哺乳動物，昆蟲或植物的細胞中選取的；(b)從培養物中提純蛋白質；從而製備由權利要求3的多核苷酸編碼的蛋白質。
11．一種融合蛋白質，其包括兩種或多種蛋白質分子，並進一步包括權利要求3的EM1。
12．依據權利要求11的融合蛋白質，進一步包括至少一種蛋白質分子是從包括靜息蛋白，內抑制素，抗血管生成素，apomigren，和EM1的組中選取的。
13．一種組合物，其包括作為生物活性組分的權利要求3的EM1。
14．根據權利要求13的組合物，和藥用-相容的載體。
15．一種組合物，其包括作為生物活性組分的權利要求11的融合蛋白質。
16．一種組合物，其包括作為生物活性組分的權利要求12的蛋白質。
17．一種抑制哺乳動物組織中的血管生成活性的方法，該方法包括用包括權利要求3的EM1的組合物接觸組織。
18．一種使用權利要求17的組合物治療疾病的方法，該方法包括給患有特點在於血管生成活性的疾病的患者服用組合物。
19．依據權利要求18的方法，其中疾病是從下列疾病中選取的包括與血管生成有關的癌症，良性腫瘤，風溼性關節炎，牛皮癬，視覺血管生成疾病，Osler-Webber症，心肌血管生成，空斑新血管生成，毛細血管擴張，血友病關節，血管纖維瘤，傷口粒化，腸粘連，動脈硬化，硬皮病，疤痕肥大，貓抓痕症，Heliobacter pylori潰瘍，透析性移植脈管管路狹窄，避孕，肥胖。
20．依據權利要求19的方法，其中疾病是癌症。
21．依據權利要求20的方法，其中疾病是腎癌症。
22．一種使用包括權利要求3的分離的EM1的組合物誘導細胞或組織內細胞程序死亡的方法，該方法包括用組合物接觸細胞或組織。
23．一種使用權利要求13到16的任何組合物治療疾病的方法，該方法包括給患有特點在於血管生成活性的疾病的患者服用組合物。
24．依據權利要求23的方法，其中疾病是癌症。
25．依據權利要求24的方法，其中疾病是腎癌症。
26．一種提供哺乳動物EM1蛋白質的方法，該方法包括將哺乳動物細胞引入到人類體內，所說的哺乳動物細胞已在體外進行了將編碼含EM1的胺基酸序列的多核苷酸插入到其中的處理，並在所說的哺乳動物體內表達治療上有效量的EM1蛋白質。
27．依據權利要求26的方法，其中細胞是淋巴細胞。
28．依據權利要求27的方法，其中淋巴細胞從T-淋巴細胞和B-淋巴細胞中選取。
29．依據權利要求26的方法，其中細胞從下列中選取包括血細胞，TIL細胞，骨髓細胞，脈管細胞，腫瘤細胞，肝臟細胞，肌肉細胞，成纖維細胞。
30．依據權利要求26的方法，其中多核苷酸通過濾過性病毒載體插入到細胞中。
31．一種製備分離的多核苷酸的方法，該方法包括的步驟有(a)製備一種或多種多核苷酸探針，在中度嚴格條件下與從下列核苷酸序列中選取的序列雜交(ⅰ)SEQ ID NO1，從核苷酸1到核苷酸525；(ⅱ)編碼含SEQ ID NO2的胺基酸序列，從胺基酸1到胺基酸175的蛋白質的分離的多核苷酸；(b)將所說的探針與哺乳動物DNA雜交；(c)分離用探針探測的DNA多核苷酸；其中分離的多核苷酸的核苷酸序列與SEQ ID NO1的核苷酸序列，從核苷酸1到核苷酸525對應。
32．依據權利要求31製備的分離的多核苷酸。
33．分離的多核苷酸，其包括權利要求32的多核苷酸。
34．權利要求2的分離的抗血管生成內抑制素突變體片段的抗體。
35．權利要求2的EM1的分離的突變體，衍生物，類似物或同系物。
全文摘要
本文描述了內抑制素的新型突變體,其中一種稱為「 EMI」,具有與野生型內抑制素相同或超過它的抗血管生成活性。本發明涉及發現一種分離的抗—血管生成肽,其中肽的C－末端包括胺基酸序列SYIVLCE,其具有抗血管生成性能。稱為「EM1」 的,這種蛋白質包括突變的內抑制素蛋白質,其中突變包括從突變內抑制素蛋白質的C末端的9個連續胺基酸缺失(如NSFMTSFSK)。EM1終止在胺基酸序列SYEVCIE中。本發明還包括編碼EM1的分離的多核苷酸,與表達序列實施連接,及用這種構建轉化的宿主細胞。也公開了EM1的抗體。本發明還涉及製備EM1,含EM1的融合蛋白質,及含EM1或其融合細胞的組合物的方法。本發明還公開了製備編碼EM1的多肽的方法。
文檔編號A61P19/00GK1284130SQ98811953
公開日2001年2月14日 申請日期1998年12月8日 優先權日1997年12月8日
發明者維卡斯·P·薩克哈特姆 申請人:貝斯以色列護理醫療中心