人乳頭瘤病毒8e7蛋白表達及應用的製作方法

2023-05-15 06:00:26 1

人乳頭瘤病毒8e7蛋白表達及應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供一種人類乳頭瘤病毒HPV-8E7蛋白的表達純化方法，通過設計HPV-8E7的擴增引物，並從HPV-8E7質粒中有效擴增出這個基因，插入到載體pGEX-4T2和pEGFP-C1中，獲得重組載體，轉染，收集上清與4B磁珠結合，再用凝血酶切除GST標籤，獲取HPV-8E7蛋白，行多點免疫，獲得純化的多克隆抗體。本發明增加了該蛋白原核表達時的可溶性，從而降低下遊大規模生產成本以及分離純化難度，在提高表達量的同時也有利於分離純化，使該蛋白在工業化放大生產時降低難度，減少成本，並經純化、免疫，得到高特異性、高效價比的多克隆抗體，能大大提高檢測的準確率，為進一步研究治療宮頸癌等疾病奠定基礎。
【專利說明】人乳頭瘤病毒8E7蛋白表達及應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬生物【技術領域】，涉及病毒蛋白的誘導表達和抗體製備，具體涉及人乳頭 瘤病毒8型E7蛋白原核表達及在製備多克隆抗體中的應用。

【背景技術】
[0002] 人乳頭瘤病毒8型（Human Papillomavirus type 8，HPV-8)與皮膚癌的發生發 展密切相關，HPV-8E7是其主要的致癌蛋白之一。HPV-8E7蛋白的表達成功可為疫苗的研製 提供技術支持，也可作為感染幹預性研究提供理論方法。目前臨床上缺乏可靠的檢測方法， HPV-8E7蛋白抗體的發明可為HPV臨床檢測提供新的方法，同時為科學研究提供新的方法 學基礎。


【發明內容】

[0003] 本發明的目的是提供一種人類乳頭瘤病毒HPV-8E7蛋白的表達、純化方法，通過 以下步驟實現： (&)^/平-6￡7基因的調取及擴增：設計Κ/ν---Τ的擴增引物，並從HPV-8E7質粒中有效 擴增出這個基因。
[0004] 其中用於擴增用於原核表達的故V-貓7序列的上遊引物序列SEQ ID NO. 1 :5' GATCCATGATTGGTAAAGAGGTCACTGT-3'，劃線部分為AcoR I酶切位點，下遊引物序列SEQ ID NO. 2 :5' -GAATTCTTATGATCCGCCATGTTTGCA-3'，劃線部分為你 g?H I 酶切位點； 用於擴增用於真核表達的故V-貓7序列的上遊引物序列SEQ ID NO. 3 :5' - GAATTCTATG ATTGGTAAAGAGGTCACTGT-3'，劃線部分為I酶切位點，下遊引物序列SEQ ID NO. 4 :5'_ GGATCCTTATGATCCGCCATGTTTGCA-3'，劃線部分為 AcoR I 酶切位點； (Ο/Ζ/ν---Τ基因原核及真核表達載體的構建：將步驟（a)中得到的這兩個含不同酶切 位點的HPV-8E7基因序列按照先後順序插入到載體pGEX-4T2和pEGFP-Cl中，獲得用於後 續同源重組的重組載體 pGEX-4T2-(HPV-8E7)和 pEGFP-Cl-(HPV-8E7)。
[0005] (c)GST-(HPV_8E7)融合蛋白的原核表達：將步驟（b)中構建的重組載體 pGEX-4T2-(HPV-8E7)轉入大腸埃希菌DH5 α，優化IPTG濃度、誘導時間和誘導溫度。在 250-300W超聲功率下，超聲時間9秒，間歇時間9秒，總時長約3分鐘以破碎細菌，收集上 清。
[0006] (d) GST- (HPV-8E7)融合蛋白的純化及HPV-8E7蛋白的獲得：通過（C )步驟獲 得的上清與Glutathione-Sepharose 4B磁珠 （GE healthcare)結合，再用凝血酶（GE healthcare)切除GST標籤，獲取HPV-8E7蛋白，PBS透析過夜獲得純化的HPV-8E7蛋白。
[0007] 步驟（1)、（2)、（3中，大腸埃希菌宿主DH5 α、真核表達載體PEGFP-C1購於大連寶 生物TaKaRa。原核表達載體pGEX-4T2從GE health care公司購得，HPV-8型E7質粒來源 於德國癌症研究中心應用病毒研究所。
[0008] 本發明的另一個目的是提供HPV-8E7蛋白在製備多克隆抗體中的應用。本發明獲 得的人類乳頭瘤病毒HPV-11E7蛋白，通過免疫動物獲得血清並經過純化獲得高特異性、高 效價比的多克隆抗體。
[0009] 本發明解決的技術問題是通過原核表達產生可溶性HPV-8E7蛋白，並經純化、免 疫，得到高特異性、高效價比的多克隆抗體，為進一步研究治療宮頸癌等疾病奠定基礎。 [0010] 利用本領域周知的方法可以完成同源重組載體的構建，在引物的兩端引入酶切位 點，通過酶切產生粘性末端，可克隆到所需載體。所用標準的分子克隆過程見（J.薩姆布魯 克等，《分子克隆實驗指南》第三版，科學出版社，2008.)。
[0011] 大腸埃希菌DH5 α購於大連寶生物TaKaRa公司，PGEX-4T2原核表達載體購於GE healthcare，HPV-8型E7基因質粒來源於德國癌症研究中心應用病毒研究所，293T細胞購 於中科院上海生命科學研究院細胞資源中心。
[0012] 轉化重組質粒至宿主細菌中可用通常的方法，如電穿孔、製備感受態細胞等。成功 轉化的細胞可通過人們熟知的技術加以鑑定，如細菌經收集並裂解，提取質粒，然後PCR鑑 定、酶切鑑定或測序鑑定。
[0013] 體外獲得HPV-8E7蛋白，是通過基因工程手段先在大腸埃希菌中進行原核表達 GST-HPV-8E7融合蛋白，經過純化，並切除GST標籤蛋白，最終得到HPV-8E7蛋白。該蛋白在 尖銳溼疣發病機制研究中極具前景，是HPV診斷試劑開發和疫苗研發的基礎。
[0014] 病毒蛋白一般具有不同程度的毒性，原核表達極容易形成不溶性的包涵體，申請 人前期在大量的實驗條件下，摸索可溶性蛋白的表達方式。後採用引入GST標籤，並降低 IPTG濃度，降低誘導時的溫度，縮短誘導時間等措施。增加了該蛋白原核表達時的可溶性， 從而降低下遊大規模生產成本以及分離純化難度，在提高表達量的同時也有利於分離純 化，使該蛋白在工業化放大生產時降低難度，減少成本。為進一步研究治療宮頸癌等疾病奠 定基礎。
[0015] HPV 8型是引起尖銳溼疣的主要原因之一，目前的檢測手段很有限，如PCR，容易造 成假陽性，或假陰性。HPV-8抗體的發明可通過免疫組化，免疫螢光，酶聯免疫吸附反應等技 術來檢測HPV 8型病毒的感染，並且可與PCR技術聯用，來檢測HPV 8型的感染，能大大提高 檢測的準確率。
[0016] 說明書附圖 圖1為重組質粒pGEX-4T2-(HPV-8E7)的電泳示意圖。圖中泳道Ml :TaKaRaDL 15,000 DNA marker ;泳道1 : HPV-8E7基因（用PCR法從HPV-8E7質粒中擴增得到）；泳道2 :重 組 PMD-18T-HPV-8E7 質粒；泳道 3 :重組 pMD-18T-HPV-8E7 經^boR I 和通〇 I 酶切；泳 道4 : pGEX-4T2質粒；泳道5 : pGEX-4T2質粒經feoR I和沿ο I酶切；泳道6 :重組 PGEX-4T2-HPV-8E7 ;泳道 7 :重組 pGEX-4T2-HPV-8E7 經feoR I 和通〇 I 酶切；泳道 M2 : TaKaRa DL 2, 000 DNA marker 〇
[0017] 圖 2 為重組質粒 pEGFP-Cl- (HPV-8E7)的電泳示意圖。泳道 Ml :TaKaRa DL 15, 000 DNA marker ;泳道1 : HPV-8E7基因（用PCR法從HPV-8E7質粒中擴增得到）；泳道2 :重 組 PMD-18T-HPV-8E7 質粒；泳道 3 :重組 pMD-18T-HPV-8E7 經^boR I 和 I 酶切；泳 道4 : pEGFP-Cl質粒；泳道5 : pEGFP-Cl質粒經feoR I和I酶切；泳道6 :重組 pEGFP-Cl-(HPV-8E7);泳道 7:重組 pEGFP-Cl-(HPV-8E7)經 feoR I 和漢·Η I 酶切；泳道 M2 ：TaKaRa DL 2, 000 DNA marker〇
[0018] 圖3為重組蛋白GST-HPV-8E7誘導表達、純化、酶切的PAGE分析。泳道1 :蛋白預 染marker ;泳道2 :細菌超聲破碎後離心所得的上清；泳道before dialysis :純化酶切後的 HPV-8E7蛋白；泳道after dialysis :透析後的HPV-8E7蛋白。
[0019] 圖4為兔抗HPV-8E7蛋白多克隆抗體的Western-Blot效價鑑定。
[0020] 圖5為Western blotting檢測HPV-8E7在293T細胞中的表達。泳道1 :293T ;泳 道 2 :293Τ 轉染 pEGFP-Cl 質粒；泳道 3 :293Τ 轉染 pEGFP-Cl-HPV-8E7 質粒。
[0021] 圖6為免疫螢光檢測HPV-8E7在293Τ細胞中的表達。

【具體實施方式】
[0022] 本發明結合附圖和具體實施例做進一步的說明。
[0023] 實施例1 :HPV 8型Ε7基因原核表達載體的構建 用 PCR 方法從 HPV-8 purified plasmid DNA 擴增出 HPV-8E7 基因序列（SEQ ID N0. 5)，所 用的引物逆貓7_P up (SEQ ID NO. 1)、故V-貓7_P dn (SEQ ID NO. 2)由上海生工合成。用 於原核表達的上下遊引物分別引入價〇R I和通〇 I酶切位點 HPV~8E7_? up ：5, ~GGATCCATGATTGGTAAAGAGGTCACTGT~3, HPV~8E7_? dn ：5, -GAATTCTTATGATCCGCCATGTTTGCA-3' PCR反應條件：50 μ L反應體系中，加入1 μ L含HPV-8型E7基因的質粒，20 μ mol/L的 上下遊引物各 1 μ L，2. 5mmol/L 的 dNTP mixture 4 μ L，5XBufTer (Mg2+ plus) 10 μ L，rTaq 聚合酶0. 5 μ L，剩餘用ddH20補足。用ABI公司的（型號為2720) PCR儀，PCR反應條件為 94°C預變性5分鐘；94°C變性30s ;56°C退火30s ;72°C延伸30s，共40個循環以後，再72°C 延伸7min。通過1. 5%凝膠電泳分析得到預期為340bp的用與原核表達的HPV-8E7序列（SEQ ID NO. 6)。
[0024] 將上述擴增的產物電泳純化後用DNA片段回收試劑盒回收純化目的條帶。連接至 pMD?18_T Vector (TaKaRa :D101A)，轉化入 DH5 α 後，鋪於含 1〇〇 μ g/ mL Amp 的 LB 瓊脂平 皿，37°C培養過夜。挑選平皿上數個克隆接種5mL含100 μ g/ mL Amp的LB液體培養基中， 37°C培養過夜。用質粒抽提試劑盒提取pMD-18T-HPV-8E7質粒，並用feoR I和通ο I雙酶 切進行初步鑑定，陽性克隆送上海博尚進一步測序驗證正確。
[0025] 將測序正確的PMD-18T-HPV-8E7 (原核）用feoR I和沿ο I雙酶切，酶切後的產 物電泳純化後用DNA片段回收試劑盒回收純化目的條帶。
[0026] 原核表達質粒PGEX-4T2也用feoR I和沿ο I雙酶切，電泳純化後用DNA片段回 收試劑盒回收純化目的條帶。以適當比例將上述線性PGEX-4T2和HPV-8E7基因片段混合， 用T4 DNA連接酶在16°C水浴中連接過夜。，轉化入DH5a後，鋪於含l〇〇yg/ mL Amp的LB 瓊脂平皿，37 °C培養過夜。挑選平皿上數個克隆接種5mL含100 μ g/ mL Amp的LB液體培 養基中，37°C培養過夜。用質粒抽提試劑盒提取pGEX-4T2-(HPV-8E7)質粒，並用feoR I和 通ο I雙酶切進行初步鑑定，陽性克隆送上海博尚進一步測序驗證正確。從而完成HPV-8E7 基因原核表達載體的構建(見圖1)。
[0027] 實施例2 :HPV 8型E7基因真核表達載體的構建 用 PCR 方法從 HPV-8 purified plasmid DNA (ATCC :45150D)擴增出 HPV-8 基因，所用的 引物故V-貓7_E up (SEQ ID N0. 3)、故V-貓7_E dn (SEQ ID N0. 4)由上海生工合成。用於真 核表達的上下遊引物分別引入&oR I和I酶切位點。
[0028] HPV-8E73 up ：5, ~GAATTCTATGATTGGTAAAGAGGTCACTGT~3, HPV-8E73 dn ：5, -GGATCCTTATGATCCGCCATGTTTGCA-3' PCR反應條件：50 μ L反應體系中，加入1 μ L含HPV-8型E7基因的質粒，20 μ mol/L的 上下遊引物各 1 U L，2. 5mmol/L 的 dNTP mixture 4 μ L，5XBufTer (Mg2+ plus) 10 μ L，rTaq 聚合酶0. 5 μ L，剩餘用ddH20補足。用ABI公司的（型號為2720) PCR儀，PCR反應條件為 94°C預變性5分鐘；94°C變性30s ;56°C退火30s ;72°C延伸30s，共40個循環以後，再72°C 延伸7min。通過1. 5%凝膠電泳分析得到預期為310bp的用於真核表達的HPV-8E7序列（SEQ ID N0. 7)。
[0029] 將上述擴增的產物電泳純化後用DNA片段回收試劑盒回收純化目的條帶。連接至 pMD?18_T Vector (TaKaRa :D101A)，轉化入 DH5 α 後，鋪於含 1〇〇 μ g/ mL Amp 的 LB 瓊脂平 皿，37°C培養過夜。挑選平皿上數個克隆接種5mL含100 μ g/ mL Amp的LB液體培養基中， 37°C培養過夜。用質粒抽提試劑盒提取pMD-18T-HPV-8E7質粒，並用feoR I和漢·Η I雙 酶切鑑定重組質粒，陽性克隆送上海生工進一步測序驗證正確。
[0030] 將測序正確的PMD-18T-HPV-8E7 (真核）用feoR I和漢·Η I雙酶切，酶切後的產 物電泳純化後用DNA片段回收試劑盒回收純化目的條帶。
[0031] 真核表達質粒pEGFP-Cl也用feoR I和漢asH I雙酶切，電泳純化後用DNA片段 回收試劑盒回收純化目的條帶。以適當比例將上述線性PEGFP-C1和HPV-8E7基因片段混 合，用T4 DNA連接酶在16°C水浴中連接過夜。轉化入DH5 α後，鋪於含50 μ g/ mL kana的 LB瓊脂平皿，37°C培養過夜。挑選平皿上數個克隆接種5mL含50 μ g/ mL kana的LB液體 培養基中，37°C培養過夜。用質粒抽提試劑盒提取pEGFP-Cl-(HPV-8E7)質粒，並用feoR I 和及I雙酶切進行初步鑑定，陽性克隆送上海博尚進一步測序驗證正確。從而完成 HPV-8E7基因真核表達載體的構建(見圖2)。
[0032] 實施例3 :HPV 8型E7蛋白的誘導表達 PGEX-4T2- (HPV-8E7)質粒分別轉化至大腸桿菌JM109，接種於含氨苄青黴素（Amp ) 100 μ g/mL的LB培養液，待細菌0D值介於0. 6-0. 8之間，加 IPTG至終濃度為0. 2mM，誘導 溫度：26-28°C，誘導4-6h後收集細菌，冰浴超聲裂解菌體，4°C 12000 rpm 10min離心分離 上清和沉澱，並經15%聚丙烯凝膠電泳鑑定(見圖3)。
[0033] 實施例4 :HPV 8型E7蛋白的純化和酶切 取菌體上清與Glutathione-Sepharose 4B磁珠結合，再用凝血酶切除GST標籤，獲取 HPV-8E7蛋白，PBS透析蛋白過夜，並經聚丙烯凝膠電泳鑑定(見圖3 )。
[0034] 實施例5 :HPV 8 E7蛋白兔多克隆抗體的製備和純化 用純化後的HPV-8E7蛋白免疫紐西蘭雌兔，體重為2. 5kg為宜。初次免疫用含E7蛋白 500 μ g的抗原完全弗氏佐劑乳化劑1.6mL於兔子背部多點皮內注射，以後每隔10d用含E7 蛋白500yg的抗原不完全弗氏佐劑乳化劑加強免疫3次。耳緣靜脈採血，雙向免疫擴散 法測定血清中多價抗血清效價（1:8以上符合要求)。10d後，E7蛋白SOOyg直接腹股溝 區肌肉注射。5d後麻醉下心臟取血，分離血清後分裝並置-20°C保存。血清按rProteinG Agaros說明書操作，親和層析獲得抗體IgG。
[0035] 實施例6 :HPV 8型E7多克隆抗體IgG的Western-Blot效價分析 將誘導表達的蛋白及牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA)作為空白對照，經 15% SDS-PAGE凝膠電泳後轉膜，5%脫脂奶粉封閉2h，以多個稀釋滴度的兔抗HPV 8型E7多 克隆抗IgG為一抗、1 :5000羊抗兔IgG-HRP為二抗進行免疫印跡，ECL顯色。（見圖4) 實施例7 :HPV 8型E7蛋白多克隆抗體IgG的特異性鑑定（Western blot) 轉染2處前將2931'細胞以5\106個/11^濃度接種於10〇11的培養皿(含109^^5和雙抗 的DMEM培養基、5%C0 2、37°C )。轉染前，培養基換成無血清的DMEM。轉染按Lipofectamine 2000說明書操作，將質粒pEGFP-Cl、重組質粒pEGFP-Cl - (HPV-8E7)各取10 μ g分別與 20 μ 1轉染試劑Lipofectamine 2000在DMEM培養基中形成複合物，混合室溫放置30分鐘 後覆蓋於l〇cm的培養皿，293T未轉染細胞做轉染空白對照。轉染6h後，將培養基換成含 10%FBS的DMEM，培養24h後，螢光顯微鏡下觀察轉染效率，終止轉染。用RIPA細胞裂解液 提取蛋白，用BCA試劑盒(碧雲天）測蛋白濃度，以每孔40 μ g的總蛋白經95°C變性後5min 後，以10% SDS-PAGE凝膠電泳後轉膜，5%脫脂奶粉封閉2h，以兔抗HPV 8型E7多克隆抗IgG 為一抗，稀釋比1 :5000,1 :5000羊抗兔IgG-HRP為二抗進行免疫印跡，ECL顯色。（見圖5) 實施例8 :HPV 8型E7蛋白多克隆抗體IgG的特異性鑑定(免疫螢光） 轉染24h前將293T細胞以2. 5X 105個/mL濃度接種於放有細胞爬片的6孔板(含 10%FBS和雙抗的DMEM培養基、5%C02、37°C )。轉染前，培養基換成無血清的DMEM。轉染按 Lipofectamine 2000 說明書操作，將質粒 pEGFP-Cl、重組質粒 pEGFP-Cl-(HPV-8E7)各取 4 μ g分別與8 μ 1轉染試劑Lipofectamine 2000在DMEM培養基中形成複合物，混合室溫放 置30分鐘後覆蓋於6孔板中，293T未轉染細胞做轉染空白對照。培養24h後，螢光顯微鏡 下觀察轉染效率，終止轉染。將6孔板中的細胞爬片用PBS洗3遍後依次4%多聚甲醛室溫 固定10分鐘、〇. l%TritonX-100室溫孵育7分鐘，期間PBS洗3遍，每次5分鐘。置於4°C保 存或進行免疫螢光分析。免疫螢光實驗在暗盒中進行。取出上述爬有293T細胞(未轉染的 作對照）蓋玻片於10%山羊血清室溫封閉2h，1 :500 (5%山羊血清稀釋）的HPV-8E7兔多克 隆抗體IgG為一抗4°C孵育過夜，1 :500 (5%山羊血清稀釋）的Alexa Flour555羊抗兔IgG 為二抗室溫孵育lh，0. 5 μ g/ml DAPI染色8分鐘，期間用PBS洗3遍每次5min。封片後熒 光顯微鏡觀察(見圖6)。 〈11〇>浙江大學 〈120>人乳頭瘤病毒8E7蛋白表達及應用 7 1 29 DNA 〈213>人工序列 〈223>從含HPV-8E7基因的質粒中擴增HPV-8E7基因的上遊引物(用於原核表達） 1 ggatccatga ttggtaaaga ggtcactgt 29 2 27 DNA 〈213>人工序列 〈223>從含HPV-8E7基因的質粒中擴增HPV-8E7基因的下遊引物(用於原核表達） 〈440> 2 gaattcttat gatccgccat gtttgca 27 3 30 〈212> DNA 〈213>人工序列 〈223>從含HPV-8E7基因的質粒中擴增HPV-8E7基因的上遊引物(用於真核表達） 3 gaattctatg attggtaaag aggtcactgt 30 4 27 〈212> DNA 〈213>人工序列 〈223>從含HPV-8E7基因的質粒中擴增HPV-8E7基因的下遊引物(用於真核表達） 4 ggatccttat gatccgccat gtttgca 27 〈210〉 5 〈211〉312 〈212〉DNA Human papillomavirus type 8 E7 gene 〈220〉 〈221〉CDS 〈222〉（1)?(312) 〈223>人乳頭瘤病毒8型E7基因序列 5 001-060 atg att ggt aaa gag gtc act gtg caa gat ttt gtg ttg gag tta agt gag ata cag cct MET lie Gly Lys Glu Val Thr Val Gin Asp Phe Val Leu Glu Leu Ser Glu lie Gin Pro 15 10 15 20 061-120 gaa gtg tta cca gtt gac ctg ctt tgt gaa gag gaa tta cca aac gaa cag gaa acg gag Glu Val Leu Pro Val Asp Leu Leu Cys Glu Glu Glu Leu Pro Asn Glu Gin Glu Thr Glu 21 25 30 35 40 121-180 gag gag eta gac ate gaa aga act gta ttc aaa att gtt gca ccg tgt ggc tgc age tgc Glu Glu Leu Asp lie Glu Arg Thr Val Phe Lys lie Val Ala Pro Cys Gly Cys Ser Cys 41 45 50 55 60 181-240 tgt cag gtc aag eta cgt ctt ttt gtc aac gca act gat teg ggt ate agg acc ttt caa Cys Gin Val Lys Leu Arg Leu Phe Val Asn Ala Thr Asp Ser Gly lie Arg Thr Phe Gin 61 65 70 75 80 241-297 gaa ttg ctg ttc aga gac eta cag ctt ctg tgt cct gag tgc ege ggt aac tgc aaa cat Glu Leu Leu Phe Arg Asp Leu Gin Leu Leu Cys Pro Glu Cys Arg Gly Asn Cys Lys His 81 85 90 95 98 301 ggc gga tea taa Gly Gly Ser *** 101 103 〈210〉6 〈211〉1000 〈212〉DNA 〈213〉人工序列 〈221> CDS 〈222> (21)?（333) 〈223> 重組載體 pGEX-4T2- (HPV-8E7) 6 1 gga tct ggt teg cgt gga tee atg att ggt aaa gag gtc act gtg caa gat ttt gtg ttg MET lie Gly Lys Glu Val Thr Val Gin Asp Phe Val Leu 61 gag tta agt gag ata cag cct gaa gtg tta cca gtt gac ctg ett tgt gaa gag gaa tta Glu Leu Ser Glu lie Gin Pro Glu Val Leu Pro Val Asp Leu Leu Cys Glu Glu Glu Leu 121 cca aac gaa cag gaa aeg gag gag gag eta gac ate gaa aga act gta ttc aaa att gtt Pro Asn Glu Gin Glu Thr Glu Glu Glu Leu Asp lie Glu Arg Thr Val Phe Lys lie Val 181 gca ccg tgt ggc tgc age tgc tgt cag gtc aag eta cgt ett ttt gtc aac gca act gat Ala Pro Cys Gly Cys Ser Cys Cys Gin Val Lys Leu Arg Leu Phe Val Asn Ala Thr Asp 241 teg ggt ate agg acc ttt caa gaa ttg ctg ttc aga gac eta cag ett ctg tgt cct gag Ser Gly lie Arg Thr Phe Gin Glu Leu Leu Phe Arg Asp Leu Gin Leu Leu Cys Pro Glu 301 tgc ege ggt aac tgc aaa cat ggc gga tea taa gaa ttc ccg ggt ega etc gag egg ccg Cys Arg Gly Asn Cys Lys His Gly Gly Ser *** 361 cat cgt gac tga ctg aeg ate tgc etc geg cgt ttc ggt gat gac ggt gaa aac etc tga 421 cac atg cag etc ccg 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【權利要求】
1. 人乳頭瘤病毒8E7蛋白表達及純化方法，其特徵在於，通過以下步驟實現： (1) Κ/ν---Τ基因的調取及擴增：設計Κ/ν---Τ的擴增引物，並從HPV-8E7質粒中有 效擴增出這個基因，其中用於擴增用於原核表達的///V-貓7序列的上遊引物序列SEQ ID NO. 1 :5' -GGATCCATGATTGGTAAAGAGGTCACTGT-3'，劃線部分為 AcoR I 酶切位點，下遊引物序 列 SEQ ID NO. 2 :5' -GAATTCTTATGATCCGCCATGTTTGCA-3'，劃線部分為沒ag?H I 酶切位點； 用於擴增用於真核表達的故V-貓7序列的上遊引物序列SEQ ID NO. 3 :5' - GAATTCTATG ATTGGTAAAGAGGTCACTGT-3'，劃線部分為I酶切位點，下遊引物序列SEQ ID NO. 4 :5'_ GGATCCTTATGATCCGCCATGTTTGCA-3'，劃線部分為 AcoR I 酶切位點； (2) ///平-部7基因原核及真核表達載體的構建：將步驟（1)中得到的這兩個含不同酶切 位點的HPV-8E7基因序列按照先後順序插入到載體pGEX-4T2和pEGFP-Cl中，獲得用於後 續同源重組的重組載體 pGEX-4T2-(HPV-8E7)和 pEGFP-Cl-(HPV-8E7); (3) GST-(HPV-8E7)融合蛋白的原核表達：將步驟（2)中構建的重組載體 pGEX-4T2-(HPV-8E7)轉入大腸埃希菌DH5 α，優化IPTG濃度、誘導時間和誘導溫度； 在250-300W超聲功率下，超聲時間9秒，間歇時間9秒，總時長約3分鐘以破碎細菌， 收集上清； (4) GST-(HPV-8E7)融合蛋白的純化及HPV-8E7蛋白的獲得：通過（3)步驟獲得的上清 與Glutathione-S印harose 4B磁珠結合，再用凝血酶切除GST標籤，獲取HPV-8E7蛋白，PBS 透析過夜獲得純化的HPV-8E7蛋白。
2. 根據權利要求1所述的人乳頭瘤病毒8E7蛋白表達純化方法，其特徵在於，在設計蛋 白表達載體時，選擇含GST標籤的pGEX-4T2，且在蛋白純化後，可將GST標籤切除，使獲得的 蛋白更接近天然HPV-8E7蛋白，在誘導蛋白表達時為避免形成不可溶的包涵體，採取降低 IPTG的濃度，縮短誘導時間，降低誘導溫度。
3. 根據權利要求1所述的人乳頭瘤病毒8E7蛋白表達純化方法，其特徵在於，步驟 (1)、（2)、（3)中，大腸埃希菌宿主DH5 α、真核表達載體PEGFP-C1購於大連寶生物TaKaRa， 原核表達載體PGEX-4T2從GE health care公司購得，HPV-8型E7質粒來源於德國癌症研 究中心應用病毒研究所。
4. 根據權利要求1所述方法獲得的人乳頭瘤病毒8E7蛋白在製備多克隆抗體中的應 用。
【文檔編號】C12N15/70GK104059934SQ201410194991
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年5月11日 優先權日:2014年5月11日
【發明者】程浩, 陳賢禎, 韓睿, 朱可建, 周強, 丁楊 申請人:浙江大學