mRNA莖環結構探針及其製備方法以及它在EMSA中的應用的製作方法

2023-05-15 07:45:06 1

專利名稱：mRNA莖環結構探針及其製備方法以及它在EMSA中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種mRNA莖環結構探針及其製備方法，以及它在 EMSA中的應用。
背景技術：
無論是真核細胞還是原核細胞，mRNA不僅含有遺傳信息，而且含有調控元件。已經發現，調控元件位於5'端或3'端非翻譯區(UTR)，由局部區域形成的雙鏈結構，呈"髮夾型"(hairpin)結構，也稱為"莖環結構"(stem-loop)。不同的調控元件參與不同功能的調節。細胞中含有相應的特異結合蛋白，稱為RNA結合蛋白(RNA-binding proteins),它在與靶mRNA上特異的莖環結構結合後，對mRNA的穩定性(半衰期)及其蛋白翻譯的啟動或肽鏈的引伸等過程發揮重要的調節作用，從而調控蛋白合成或表達水平，這種現象屬於轉錄後調節(posttranscriptional regulation)。這種調節在細胞生理穩態或病理情況下發揮重要的調節作 用。由於mRNA中存在的莖環結構在細胞中發揮重要的調節作用，目前研究的焦點是，第一 方面是，對莖環結構進行研究，包括研究哪些mRNA存在莖環結構，或同一種mRNA存在 多少以及什麼樣的莖環結構；第二方面是針對已知的莖環結構，研究細胞內是否存在特異的 RNA結合蛋白；第三方面是，對於已知的莖環結構及其在細胞內特異的結合蛋白，進一步研 究兩者之間相互作用的特點、功能和意義。對於上述研究的第二和第三方面，涉及兩個關鍵 性技術一個關鍵性技術是，需要設計和製備一種RNA探針，它是含有莖環結構特異序列的帶 有標記信號的RNA片段。當用於上述第二方面的研究時，通過探針與細胞蛋白提取液孵育， 可尋找或篩選細胞內可能存在的結合蛋白，或通過探針與目前已知某種莖環結構的結合蛋白 進行結合反應，可以了解與該探針相應的莖環結構是否也是己知的結合蛋白的耙點。當用於 上述第三方面的研究時，所製備的探針與其結合蛋白進行孵育，可以是對相互作用的特點進 行分析，也可以是用於觀察不同生理情況下或病理情況下對結合蛋白的改變進行檢測分析。 此外，在上述第二或第三方面的研究中，有時還需要針對莖環結構特異序列設計突變的RNA 片段，用於觀察結合反應的特異性或用於對莖環結構中蛋白結合位點的觀察。另一個關鍵技術是，要使標記的探針與蛋白在合適的條件中孵育，進行特異的結合反應， 並採取適當措施將探針一蛋白複合物與游離的即未與蛋白結合的探針進行分離，從而對所形 成的複合物進行分析和檢測。凝膠電泳遷移方法(Electrophoretic mobility shift assays, EMSA) 或其延伸的凝膠電泳超遷移方法(Electrophoretic mobility supershift assays, EMSSA)是一種檢 測蛋白質和核酸相互結合或相互作用的理想技術，能夠有效地實現探針一蛋白複合物與游離 探針分離，並具有操作簡單、價格低廉、可以用於定性和定量觀察等優點，因此，該技術不 僅在DNA及其結合蛋白的相互作用中得以廣泛應用，在RNA與其結合蛋白的研究中也成為 優先使用的技術。上述兩方面的關鍵性技術是相輔相成的。對於探針的設計、合成和標記等一系列方面、 結合反應體系的組成和條件、檢測分析方法，需要統籌考慮。例如，探針的結構決定了與蛋 白反應的特異性，而這種特異性結合的實現，需要合適的結合反應體系的組成和反應條件， 此外，探針的標記方法的選擇決定了相應的檢測方法及檢測的靈敏度。因此，儘管EMSA技 術本身上面提到的若干優點，但是，在具體操作中實驗結果常常很不理想，表現為反覆失敗， 實驗觀察的重複性差等現象，其主要原因是來自於探針製備方法的選擇及其決定的反應體系和檢測方法等方面存在的問題。當前在研究mRNA莖環結構及其結合蛋白方面所採用的相關技術用於研究mRNA莖環結構及其結合蛋白的RNA探針的製備方法，有別於核酸雜交技術 中所使用的RNA探針。 一方面，這種探針具有莖環結構並用於與結合蛋白發生結合反應，不 同於在核酸雜交(RNA-DNA或RNA-RNA)試驗中用於與DNA或RNA結合的RNA單鏈探 針，另一方面，探針中的莖環結構要能夠與特異的結合蛋白的特異位點結合，因此，探針不 僅要呈現與mRNA中目的莖環結構相同，才能在體外重建與細胞內發生的該莖環結構與結合 蛋白的特異性結合，從而用於研究mRNA與結合蛋白的相互作用，或者用於特異性檢測結合 蛋白。此外，由於這種探針屬於RNA單鏈片段，又容易被環境中的RNase水解，因此，在 設計、製備和貯藏等方面受到很多方面的限制，往往難以借用於DNA-蛋白相互作用及其相 關檢測中DNA雙鏈或單鏈探針的設計和製備方法。當前採用的方法(RNA探針的製備方法、 靶核酸的檢測方法以及RNA探針的製備試劑盒，專利申請號02122265.7，公丌號CN1405325,
公開日2003.03.26) (M. J. Rincker, S. L. Clarke, R. S. Eisenstein, J. E. Link, and G M. Hill-Effects of iron supplementation on binding activity of iron regulatory proteins and the subsequent effect on growth performance and indices of hematological and mineral status of young pigs. J Anim Sci. 2005, 83:2137—2145) (H. A. Barton, R.S. Eisenstein, A. Bomford叫d H. N. Munro. Determinants of the interaction between the iron-responsive element binding protein and its binding site in rat L-ferritin mRNA. J Biol Chem, 1990， 265(12):7000陽7008.)及其存在的主要問題是(1) RNA探針的設計和合成方法當前普遍採用的是體外轉錄合成單鏈RNA探針，可以是採用克隆技術合成，也可以是 由公司最近所推出的試劑盒進行體外轉錄合成。無論是前者還是後者，其原理均是利用T7 或T3等啟動子，在依賴於DNA的RNA聚合酶的作用下，以四種rNTP為底物，以cDNA 為模板在適當條件下合成RNA片段。在上述技術中，需要根據RNA的序列預先合成高純度 的DNA模板，若模板中混雜其他DNA片段，則會產生幹擾。在克隆技術中，儘管可以在一 次克隆後可隨時合成，但是，其後的每次合成和純化等一系列操作複雜，價格比較昂貴，如 果對載體的酶切作用不完全或不當，則在探針合成過程中超螺旋DNA可合成極長的RNA， 從而有可能帶上質粒的序列而降低探針的特異性。應用試劑盒體外轉錄法，雖然克服了該問 題，但是，價格也昂貴。此外，由於RNA對RNase特別敏感，即使對所用的器皿試劑等處 理以及對操作嚴格控制，在製備RNA探針過程中的降解和探針不宜長期保存甚至成為不可避 免的缺點。(2) RNA探針的標記方法當前普遍採用的是在上述體外轉錄反應體系中加入經放射性同位素標記的NTP，從而在 探針合成過程中同時對探針進行放射性同位素標記。從標記效果考慮，這種在RNA合成期間 實現標記的方法屬於高效標記，以放射性同位素作為標記物又具有靈敏度高的特點。但是， 放射性同位素的應用不僅涉及價格昂貴、半衰期短、實驗室安全和放射性廢物處理等諸多問 題，而且對於實驗結果的檢測必須依賴於應用膠片曝光等方法進行放射自顯影，既耗時長， 又難以進行定量分析。儘管放射性同位素標記法存在很多的局限性，但是，到目前為止還沒有發現應用非同位 素標記法尤其是螢光直接標記法標記莖環結構RNA探針的報導。事實上，非同位素標記如化 學致發光、地高辛標記、生物素標記等技術已經得到廣泛應用，但主要應用於核酸雜交試驗 中RNA探針或DNA探針的標記，或用於DNA-蛋白相互作用中DNA探針的標記，或用於 RNA與核因子相互作用中RNA的標記。螢光標記法是較為理想的標記方法，但目前主要應 用於PCR、報告基因分析等技術中，也有用於DNA—結合蛋白相互作用觀察中DNA探針的標記。既然應用非同位素標記法尤其是螢光標記法有其明顯的優點，那麼，為什麼沒有應用 於莖環結構RNA探針的標記，其原因不清楚。可能的原因是，或許是考慮到在體外轉錄合成 探針期間可以同時進行放射性同位素標記，或許是擔心某些非同位素標記可能影響莖環結構 與蛋白的結合，也有可能是由於非同位素標記的靈敏度低，不易檢測。(3) EMS A如前已述及，儘管EMSA試驗本身比較簡單，但是影響因素很多，涉及探針製備、反應 體系的優化及EMSA技術本身存在很多環節，往往或者不出現核酸一蛋白複合物條帶，或者 在出現核酸一蛋白複合物條帶的情況下，背景不清晰。這些問題是在核酸雜交和DNA—蛋白 相互作用研究中普遍存在的問題，在這方面，不少公司因此採取了不同的標記方法並推出了 各種EMSA試劑盒。而在有關RNA—蛋白相互作用時所面臨的上述問題更為明顯，儘管使用 放射性同位素標記法標記探針具有極高的靈敏度，但仍然需要花費很多的時間去優化結合反 應條件和凝膠電泳的條件。綜上所述，當前對於mRNA—蛋白相互作用遠不及DNA-蛋白或核酸雜交的^f究那樣廣 泛，但由於這種相互作用在細胞蛋白表達水平的重要調節作用，研究潛力巨大。探針的製備 尤其是具有莖環結構的探針的設計、合成和標記以及EMSA反應條件等方面的優化是當前需 要解決的瓶頸。發明內容針對現有技術中存在的缺陷和不足，本發明的目的是提供一種mRNA莖環結構探針，及其 在設計、合成和標記方法方面進行優化，使探針在EMSA中與結合蛋白的結合反應達到高特 異性、高穩定性和有利於定量檢測的要求。為達到上述目的，本發明所採用的技術方案是 一種mRNA莖環結構探針，其特徵在於， 由以下方法製得根據目的莖環結構的核酸序列，採取化學合成法直接合成核酸序列長度不 超過70nt的探針，然後採用螢光標記法對探針進行標記。上述mRNA莖環結構探針的製備方法是根據目的莖環結構的核酸序列，採取化學合成法 直接合成核酸序列長度在不超過70n的探針，然後採用螢光標記法對探針進行標記。其中，RNA探針的序列與長度的設計毫無疑問，RNA探針應當是與所要研究的mRNA 中目的莖環結構的核酸序列相同。對於核酸序列的長度，在不同的報導中不盡相同，包括幾 十到上百個核苷酸。本發明主要策略是，限制探針的核酸序列長度，與所要研究的mRNA中 目的莖環結構的核酸序列的長度相同或相近。核酸長度控制在70nt或70nt以下， 一般在10nt 一50nt之間即可。如果mRNA中目的莖環結構的核酸序列較短，則在其莖環結構區鄰近兩側 做適當的延長，如果mRNA中目的莖環結構的核酸序列較長，可將莖環的莖適當縮短。所說的RNA探針的合成方法，以體外直接化學合成單鏈RNA片段方法取代一直沿用的體 外轉錄技術。 一方面，可嚴格控制RNA探針的長度，達到設計的要求，另一方面，不僅合成 簡單、錯誤率低，而且價格低廉。關於RNA探針的標記，以螢光標記物取代普遍使用的放射性同位素標記法，最好是採取 末端直接標記法，對RNA探針的5'端或3'端標記，不僅可獲得高標記效率的探針，並且盡 量避免對蛋白結合的位點的影響。本發明推薦優先應用FAM (6-羧基螢光素)標記探針的5' 端。本發明方法製備的探針可以應用於以下情形之一①針對RNA中已知的莖環結構及其特異結合蛋白，研究其相互作用及其改變。例如，為了研究其相互作用的特點及其在不同生理情況下或病理情況下的變化和意義， 設計特異的RNA探針並作螢光標記，通過探針與特異結合蛋白，可觀察結合反應的特點或變 化，或檢測結合蛋白含量的變化。在研究特異結合部位或觀察基因突變的影響時，還可根據 莖環結構中鹼基位點的突變設計相應的探針，觀察特異結合的改變。② 針對潛在的莖環結構，證明是否特異調控元件，篩選或證實其特異結合蛋白例如，在利用生物信息學手段搜索RNA序列或其他任何手段所獲得RNA中可能存在的 莖環結構時，構建具有相應莖環結構的探針並作螢光標記，通過與已知的RNA結合蛋白進行 結合反應，可用於證明是否屬於功能相關的調控元件，或通過與細胞蛋白提取液孵育，觀察 細胞內是否存在相應的結合蛋白， 一旦發現存在特異結合反應，不僅可用於判斷是否屬於調 控元件，而且可利用這種探針作為相應結合蛋白的提取、分離純化和鑑別中的檢測工具。③ 可以是真核細胞和原核細胞或組織，其中任何一種有關上述①②的研究和檢測。④ 可以是在基因工程技術中利用RNA與其結合蛋白相互作用的有關檢測。 可以是用於實驗室研究檢測，也可以是用於臨床相關疾病的體外診斷性檢測。⑥ 優先應用於EMSA及其延伸方法如EMSSA、雙向電泳或作為Western blotting的前處 理。也可能用於ELISA或蛋白晶片的RNA與蛋白之間的雜交。⑦ 本技術也可延伸到具有莖環結構的DNA與其結合蛋白相互作用的研究和檢測。 本發明還提供了上述方法製備的探針在EMSA中的應用。蛋白樣品可以是純化的蛋白，部分純化的蛋白，或細胞提取液。由於探針長度較短，為避免非特異結合的增加，在探針一 蛋白結合反應體系中適當增加肝素濃度或BSA濃度，並適當降低凝膠的交聯度，推薦使用 8。/o非變性聚丙烯醯胺凝膠(60: 1)。本發明具有以下有益效果① 探針製備的價格低廉。由於探針片段短，可在核酸合成儀上直接合成，螢光標記方便，合成並螢光標記20D的這種探針，按照當前的價格計算，大約在800元左右，相當於當前應 用體外轉錄合成和同位素標記所需經費的10%以下。② 探針的製備方便。可隨時在核酸合成儀上合成，螢光標記簡單。而體外轉錄合成法不 僅需要應用克隆技術，而且在其後的每次轉錄時耗費時間長，對實驗室條件要求高，由於操 作複雜， 一般需要一周左右的時間才能完成。③ 探針的可貯藏時間長。這種既是短小的RNA探針，又由於是莖環結構對RNase有對 抗能力，因此，以RNA乾粉方式低溫保存(例如一20'C)的標記探針可以保存一年。相比較 而言，放射性同位素標記的探針由於所使用同位素的半衰期很短，只能在幾天內使用。④ 探針的特異性高、靈敏度高。由於採取與體內莖環結構的核酸序列相同或相近的長度， 莖環結構不存在或具有較短的尾巴，又採用5'端標記不影響探針的蛋白結合位點，因此，探 針的特異性較高。由於採用螢光標記技術，所標記的探針要比化學發光標記法具有較高的靈 敏度。此外，還避免了當前普遍採用的放射性同位素標記技術所面臨的實驗室安全和對同位 素的垃圾處理的問題。⑤ 滿意的信噪比。實驗已經證明，可獲得清晰的背景和理想的特異條帶。⑥ 可獲得穩定的實驗結果。由於探針的特異性、螢光的高靈敏度及其極高的標記效率、 直接合成的探針具有純度高、長度一致等特點，大幅度改善了 EMSA的實驗結果，EMSA不僅 具有很高的成功率，而且提高了實驗結果的穩定性和可重複性。⑦便於定量分析並能實現實驗結果的標化。應用螢光掃描儀直接掃描，避免了放射自顯 影在定量方面的不足。由於螢光標記效率高，螢光信號強度又與被檢測物濃度具有良好的線 性關係，探針分子量趨於一致，此外，在EMSA中的電泳期間，可選擇一個空白泳道，加入己 知量的標記探針，在EMSA完成後與樣品泳道同步螢光掃描，以此為marker,不僅可以消除 由於電泳條件本身以及獨立實驗之間由於圖像分析軟體中背景設定差異對分析結果的影響， 從而可對樣品進行絕對定量。上述這些優勢還可對不同實驗之間以及不同實驗室之間對實驗 結果進行標準化(Normalization)處理。


圖1是非變性凝膠的濃度對結果的影響。圖2是結合反應體系中蛋白加樣量對結果的影響。圖3是飽和試驗的結果。圖4是結合反應中BSA加入的重要性。圖5是蛋白樣品製備中不同離心速率對結果的影響。
具體實施方式
在本發明中所使用的術語，除非有另外說明， 一般具有本領域普通技術人員通常理解的 含義。下面結合具體的實施例，並參照數據進一步詳細地描述本發明。應理解，這些實施例只 是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的範圍。在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。所用試 劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現時標明，其後所用相同試劑 如無特殊說明，均以首次標明的內容相同。 實施例一對於mRNA—蛋白相互作用的研究，較早丌展也是當前研究較為深入的是mRNA中鐵反 應元件(Iron-responsive elements, IRE)與胞質中含有的鐵調節蛋白(Iron-regulatory protein, IRP)的相互作用。研究已經清楚，轉鐵蛋白受體、二價陽離子轉運體DMT1的IRE位於3， 端UTR，而鐵蛋白(包括L型和H型)、S —氨基_ y —酮戊酸合成酶(ALAS)和ferroportinl 位於5，端UTR。在鐵缺乏時，IRP與這些mRNA中的IRE結合，從而增強轉鐵蛋白受體和二 價陽離子轉運體DMT1的mRNA的穩定性，並抑制鐵蛋白ALAS和ferroportinl的mRNA的 蛋白翻譯，而當鐵過多時IRP與這些IRE解離，對mRNA發生相反的影響。因此，IRE-IRP 的相互作用在細胞鐵攝入、鐵貯存、鐵利用和鐵釋放中發揮關鍵性的調節作用。IRE—IRP的 相互作用廣泛存在於真核和原核細胞，研究己經發現，人類大約有70多種mRNA含有IRE。 目前還發現APP (amyloid precursor protein)和酒石酸鹽拮抗性酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase)的表達也通過5'UTR端IRE接受鐵狀態的調控，K-C1複合轉運體(紅細胞特異)、 氨基肽酶A(降解鐵轉運相關蛋白)、Hexokinase III(信號轉導途徑)、MRP(multi-drug resistance associated protein)、禾n Uracil DNA glycosylase (參與DNA合成)等mRNA也含有IRE，從而 與參與細胞不同鐵狀態下的功能改變。實際上，最近的研究還發現IRE不僅與鐵代謝調控，而且涉及其他微量元素代謝的調節。以IRE—IRP相互作用為例，採用本發明中探針製備及應用於EMSA檢測大鼠肝臟組織 IRP的實施方式。(1) 探針的製備按照GENEBANK中查找包含大鼠L型鐵蛋白的mRNA序列，其IRE是位於5'UTR內 的莖環結構，本例中取包括"環"在內的29個鹼基作為探針的序列，艮口 5'國AUCUU GC UUC AACAGUGU UUGGACG GAAC-3'上述序列中不配對的鹼基CAGUGU形成"環"的空間結構。其餘部分形成"莖"。以這 個序列和長度(29nt)，在核酸合成儀上合成IRE探針，合成20D，對其中1個OD進行5， 末端FAM標記，剩餘的l個OD不標記，用作特異抑制片段，進行競爭抑制實驗。(2) 探針貯藏均以乾粉形式一20'C下保存待用。(3) 在EMSA中的應用① 蛋白樣品的準備取大鼠肝組織少量(100mg)，在裂解液中製備10%的勻漿，裂解液(pH7.4)的組成是， 20mMTris， 150mMNaCl， 1%TritonX-100， lmMPMSF，以及蛋白酶抑制劑(1 mM AEBSF、 HC1、 0.8 mM Aprotinin、 0.05 mM Bestatin、 0.015 mM E-64、 0.02mM Leupeptin Hemisulfate 和O.Ol mMPepstatinA)，勻漿在4'C環境中進行。以20，000g離心15min後，上清液轉移至高 速離心管中，再次以100， 000g離心30min (如圖5所示，經更高轉速的離心，相對富集目 的蛋白，目的條帶更深)，上清液轉移至微量離心管中，立即採用BCA法進行蛋白定量，用 裂解液稀釋蛋白濃度為5pg:l，並分裝放入-8(TC冰箱保存待用。② 結合反應所有溶液的配製均使用DEPC水。5X反應緩衝液(50mMHEPES、 15mMMgCl2、 200 mMKCl、 25%glycerol、 5mMDDT、 1%NP40， pH7.6)。反應體系的組成和操作順序是 無核酶水lO^ll蛋白溶液蛋白20嗎(如圖2所示，表明適中的蛋白量即能夠提高條帶清晰度又能避免上樣量過高造成的拖尾) 結合緩衝液(5X): 4^1 RNase抑制劑40UBSA: 8ng(如圖4所示，表明在反映體系中加入BSA，可提高條帶清晰度) *以上總體積20^1,充分混勻後在0—4。C環境中孵育10min標記探針2.5—3nM*以上充分混勻後在室溫下安置孵育30min肝素100(ag*以上充分混勻後在室溫下安置孵育10min，離心取上清液準備電泳。③ 電泳製備8%非變性聚丙烯醯胺(60:1)凝膠(如圖1所示，表明在右側8%的非變性聚丙烯 醯胺凝膠中條帶較左側4%的更為清晰、緊密)，符合實驗要求。在4'C環境中預電泳10min。上樣8nl/每泳道X2，在冰箱中電泳，龜壓9V/cm，在電泳開始後90min時暫停，加入標記 的RNA探針(用作參照)。注意，RNA探針加入量的多少應當儘可能與樣品條帶的螢光強度 相近，不要偏離過大。
檢測分析拆除凝膠設備，擦乾玻璃，使用Typhoon9400掃描儀對凝膠進行螢光掃描(激發波長 495nm，發射波長535nm)。根據參照的RNA的螢光強度以及探針含量，分別將其他泳道中 樣品條帶和游離探針的螢光強度分別換算獲得條帶和游離探針的量。在上述操作中，可通過改變標記探針的加入量或蛋白加入量，可進行飽和試驗，獲得理 想的飽和曲線(如圖3所示，表明加入的探針已經達到飽和狀態)。；在結合反應中加入未標 記的相同探針，可進行競爭抑制試驗，獲得理想的競爭抑制曲線；如果在上述分析基礎上進 一步轉膜雜交(Western blotting),可以對其雜交條帶進一步分析；如果在結合反應中加入結 合蛋白的特異抗體，即進行凝膠電泳超遷移方法(Electrophoretic mobility supershift assays, EMSSA)試驗，則可對以上進行的平行試驗結果進行比較，可分析結合反應的特異性。⑤異常情況及其處理一般來說，與應用當前其他方法的實驗結果比較，在上述操作後， 一個明顯的優勢是可 獲得較為清晰的背景和理想的條帶。當條帶不出現時，應當考慮蛋白樣品及其中結合蛋白含 量方面的問題，此時，可以增大結合反應中蛋白加入量。條帶明顯拖尾較長時表明蛋白加樣 量過大。試劑盒試劑盒組成螢光標記探針2或40D。(探針序列按需提供)組織細胞裂解液(100ml)。5X結合反應緩衝液(lml)。特異抑制劑(4000U)。非特異抑制齊U(4000U)。DEPC水(10ml)以上可用於ioo次結合試驗
權利要求
1. 一種mRNA莖環結構探針，其特徵在於，由以下方法製得根據目的莖環結構的核酸序列，採取化學合成法直接合成核酸序列長度不超過70nt的探針，然後採用螢光標記法對探針進行標記。
2. —種權利要求1所說的mRNA莖環結構探針的製備方法，其特徵在於，根據目的莖環 結構的核酸序列，採取化學合成法直接合成核酸序列長度不超過70nt的探針，然後採用螢光 標記法對探針進行標記。
3. 如權利要求2所說的mRNA莖環結構探針的製備方法，其特徵在於，所說的探針的長 度是10nt—50nt。
4. 如權利要求2所說的mRNA莖環結構探針的製備方法，其特徵在於，所說的探針的標 記方法是末端螢光標記。
5. 如權利要求4所說的mRNA莖環結構探針的製備方法，其特徵在於，所說的末端螢光 標記是5'端螢光素標記。
6. 權利要求l所說的mRNA莖環結構探針，應用於凝膠電泳遷移試驗、EMSA延伸的其 它試驗方法、蛋白印跡的前處理，或其它基於RNA—蛋白結合反應對mRNA莖環結構或其 結合蛋白進行分析的實驗方法。
7. 權利要求6所說的應用，其特徵在於，應用於真核細胞和原核細胞中的任何一種，或 者是應用於任何一種mRNA的結合蛋白。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種mRNA莖環結構探針及其製備方法，以及它在EMSA中的應用。所說的mRNA莖環結構探針，由以下方法製得根據目的莖環結構的核酸序列，採取化學合成法直接合成核酸序列長度不超過70nt的探針，然後採用螢光標記法對探針進行標記。這種帶有螢光標記的莖環結構的探針用於EMSA技術中，可獲得高特異性、高靈敏度、可重複性和穩定性的優點，製備方法簡單、價格低廉。
文檔編號C12N15/11GK101270391SQ20081002534
公開日2008年9月24日 申請日期2008年4月25日 優先權日2008年4月25日
發明者梅 劉, 肖德生, 海 錢 申請人:江蘇大學