用於上皮幹細胞和包含所述幹細胞的類器官的培養基的製作方法

2023-05-15 09:05:26

專利名稱：用於上皮幹細胞和包含所述幹細胞的類器官的培養基的製作方法
用於上皮幹細胞和包含所述幹細胞的類器官的培養基本發明涉及用於培養上皮幹細胞、尤其是腸和結腸上皮幹細胞的新的培養基以及用於培養包含所述幹細胞的類器官的新的培養基。本發明還涉及用本發明的培養基所培養的細胞後代和類器官，以及所述後代在毒性測定和再生醫學中的用途。自我更新的小腸上皮排列成隱窩和絨毛(Gregorieff and Clevers, 2005. Genes Dev 19,877-90)。細胞在隱窩中新生成，並在絨毛頂部通過凋亡而喪失，導致小鼠中上皮的更新時間為5天。一直以來都認為自我更新的幹細胞定居在隱窩底部附近，並且產生能向所有譜系分化的快速增殖的過渡放大(TA)細胞。估計每個隱窩的幹細胞數量為4-6個 (Bjerknes and Cheng, 1999. Gastroenterology 116，7_14)。三種分化的細胞類型，即腸上皮細胞、杯狀細胞和腸內分泌細胞由TA細胞形成，並且繼續沿著隱窩-絨毛軸在結合帶 (coherent band)中遷移。每個絨毛接受來自多個不同的隱窩的細胞。第四種主要的分化細胞類型是帕內特細胞，其定居在隱窩底部。最近鑑定出在第五種細胞類型循環隱窩基部柱狀(CBC)細胞中特異表達的基因 Lgr5，所述循環隱窩基部柱狀細胞是散布在帕內特細胞之間的小細胞(在圖8b用黑色箭頭指示)(Barker et al. ,2007. Nature 449:1003-1007)。利用將 GFP/他莫西芬誘導型 Cre 重組酶盒整合入Lgr5基因座中的小鼠，通過譜系追蹤顯示，Lgr5+CBC細胞構成產生所有上皮細胞類型的多能幹細胞，甚至在Cre誘導後14個月評估時也是如此。最近發現，除了 Lgr5之外，Lgr6(而不是Lgr4)也是成體幹細胞的特有標誌物。 Lgr5在腦、腎、肝臟、視網膜、胃、腸、胰腺、乳房、毛囊、卵巢、腎上腺髓質和皮膚的幹細胞中表達，同時Lgr6在腦、肺、乳房、毛囊皮膚的幹細胞中表達。通常認為，需要上皮幹細胞和上皮下成纖維細胞的密切接觸來錨定和支持上皮幹細胞，和提供產生正確極化的三維結構所必需的正確方向。儘管已經描述了多種用於培養包括腸上皮幹細胞在內的初級上皮幹細胞的培養體系(Bjerknes and Cheng, 2006. Methods Enzymol 419 :337-83)，但是至今還沒有建立能維持上皮幹細胞的多能性的長期培養體系。此外，還沒有已知能用於保護從結腸或腸分離的隱窩的基本隱窩-絨毛生理機能，或能用於保護分離的胰腺組織塊或胃組織塊的基本生理機能的培養體系。因此，本發明提供了培養上皮幹細胞、培養包含所述上皮幹細胞的分離的上皮組織塊或腺瘤細胞的方法，所述方法包括提供細胞外基質，將上皮幹細胞，包含所述上皮幹細胞的分離的組織塊、或腺瘤細胞與所述細胞外基質一起孵育，在存在細胞培養基的條件下， 培養所述幹細胞、分離的組織塊或腺瘤細胞，所述細胞培養基包含動物或人類細胞的基礎培養基，並向該細胞培養基添加5-500ng/ml的骨形態發生蛋白(BMP)抑制劑或至少5並且不超過500ng/ml的有絲分裂生長因子，如果培養上皮幹細胞和分離的組織塊，還添加Wnt 激動劑。本發明人意外發現，本發明的方法允許培養上皮幹細胞、從包含所述幹細胞的小腸、結腸、胃和胰腺所分離的組織塊和腺瘤細胞，同時還能維持保留未分化表型和自我維持能力的幹細胞的存在。例如，按本發明方法培養的分離的隱窩發育成為隱窩-絨毛的類器官，所述隱窩-絨毛的類器官包含襯有絨毛樣上皮的中央腔。隱窩中存在的幹細胞維持分離的隱窩的生長。產生的類器官經歷多次隱窩分裂事件。更意外的是觀察到，在不存在幹細胞龕的條件下，本發明方法允許單個分離的上皮幹細胞長成隱窩-絨毛的類器官。從胃幽門部分離的胃組織塊充當腸隱窩的類器官。該單元的開放的上部分封閉，並且腔充有凋亡細胞。新形成的胃的類器官經歷連續的出芽事件(表明腺體分裂)，同時保持它們與中央腔的極性。此外，培養胰腺組織塊導致出現能表達胰島素和其它胰島特異性標誌物的胰島樣結構，類似於郎格罕氏胰島。襯於小腸和大腸幽門部的上皮包括腔突起、絨毛和內陷、隱窩。沿隱窩-絨毛軸的每個細胞被極化，其中腸絨毛頂部的細胞或結腸隱窩上部的細胞的分化程度是最高，並且被持續丟失於腔中。定居於隱窩基部的幹細胞的連續增殖和定居於隱窩中部的祖細胞的大量增殖確保脫落細胞的正確更替。在成年人和成年小鼠的多個器官中發現幹細胞。儘管個體組織中成體幹細胞的確切特性存在很大的變化，但是成體幹細胞都具有以下特性它們保留了未分化的表型；它們的後代能向相關組織中存在的所有譜系分化；它們在整個生命中保留自我維持能力；它們能在損傷後再生為相關組織。幹細胞定居於專門的場所，即幹細胞龕，所述幹細胞龕提供合適的細胞-細胞接觸和維持所述幹細胞群的信號。上皮幹細胞能形成組成上皮的不同的細胞類型。諸如皮膚和腸的某些上皮表現出快速的細胞更新，這表明定居的幹細胞必須連續增殖。諸如肝臟或胰腺的其它上皮在正常條件下表現出非常慢的更新。可以通過本領域技術人員已知的方案從十二指腸、小腸和大腸(包括空腸、迴腸和結腸)和胃幽門部分離隱窩。例如，可以通過將分離的組織與螯合劑一起孵育來分離隱窩，所述孵育使細胞從其與基膜和基質細胞類型的鈣依賴性和鎂依賴性相互作用中釋放出來。洗滌組織之後，用載玻片從黏膜下層刮出上皮細胞層，並將其切碎。隨後在胰酶或更優選EDTA和/或EGTA中孵育，並利用例如過濾和/或離心步驟從隱窩分離未消化的組織塊和單細胞。諸如膠原酶和/或分散酶I的其它蛋白水解酶可以用來代替胰酶。同樣的方法用於分離胰腺和胃的組織塊。從上皮組織分離幹細胞的方法在本領域是已知的。優選的方法基於以下事實幹細胞在其表面表達Lgr5和/或Lgr6，Lgr5和/或Lgr6屬於大的G蛋白偶聯受體(GPCR) 超家族。Lgr亞家族的獨特之處在於攜帶大的富含亮氨酸的胞外結構域，該結構域對於配體結合是重要的。文獻中尚沒有描述Lgr5和Lgr6的配體。因此，優選的方法包括從所述上皮組織製備細胞懸液，使所述細胞懸液與Lgr5和/或Lgr6結合化合物接觸，分離所述Lgr5 和/或Lgr6結合化合物，並從所述結合化合物分離幹細胞。優選的是從分離的隱窩通過機械方式產生包含上皮幹細胞的單細胞懸液，因為發現在這個階段用胰酶處理的上皮幹細胞導致相當低的存活率。優選的Lgr5和/或Lgr6結合化合物包括抗體，例如特異性地識別和結合Lgr5或 Lgr6的胞外結構域的單克隆抗體，例如包括小鼠和大鼠單克隆抗體的單克隆抗體。禾Ij用這種抗體，例如藉助於磁珠或通過螢光活化細胞分選可以分離表達Lgr5和/或Lgr6的幹細胞，這對本領域技術人員是顯而易見的。在本發明的優選方法中，從隱窩、胃組織塊或胰腺組織塊分離所述上皮幹細胞。例如，從分離自腸的隱窩中分離所述上皮幹細胞。優選的上皮幹細胞分離自小腸(包括十二指腸、空腸和迴腸)、胰腺或胃。優選在這樣的微環境中培養分離的幹細胞所述微環境至少在一定程度上模擬所述幹細胞天然定居的細胞龕。通過在生物材料存在的條件下培養所述幹細胞來模擬所述細胞龕，所述生物材料例如代表控制幹細胞命運的重要調節信號的基質、骨架和培養基底。所述生物材料包括天然的、半合成的和合成的生物材料，和/或其混合物。骨架提供二維或三維網絡。適用於所述骨架的合成材料包括選自多孔固體、納米纖維和水凝膠的聚合物，例如，包含自組裝肽的肽、由聚乙二醇磷酸酯、聚乙二醇延胡索酸酯、聚丙烯醯胺、聚甲基丙烯酸羥乙酯、聚纖維素醋酸酯和/或以上的共聚物組成的水凝膠(參見，例如，Saha et al., 2007.Curr Opin Chem Biol. 11(4) :381-387 ；Saha et al.,2008.Biophysical Journal 95 :4426-4438 ；Little et al.，2008. Chem. Rev 108,1787-1796)。如本領域技術人員所已知的，骨架的機械特性(例如彈性)影響幹細胞的增殖、分化和遷移。優選的骨架包含生物可降解的(共)聚合物，在移植入個體中之後所述可降解的(共)聚合物被天然存在的組分替代，例如從而促進組織再生和/或傷口癒合。此外，優選的是，所述骨架在移植入個體中之後基本上不會誘導免疫應答。所述骨架補充有天然的、半合成的或合成的配體，這些配體提供幹細胞的增殖和/或分化、和/或遷移所需的信號。在優選的實施方案中，所述配體包含限定的胺基酸片段。所述合成的聚合物的實例包括Pluronic: F127嵌段共聚物表面活性劑(BASF)和 Ethisorb (Johnson and Johnson)。細胞龕在一定程度上由幹細胞和周圍的細胞、以及所述龕中的細胞產生的細胞外基質(ECM)所確定。在本發明的優選方法中，使分離的隱窩或上皮幹細胞附著於ECM。ECM 由多種多糖、水、彈性蛋白和糖蛋白組成，其中所述糖蛋白包括膠原蛋白、內動蛋白(巢蛋白)、纖連蛋白和層粘連蛋白。ECM由結締組織細胞分泌。不同類型的ECM是已知的，其包括不同的組成，所述不同的組成包含不同類型的糖蛋白和/或糖蛋白的不同組合。可以通過在容器中培養產ECM的細胞(例如成纖維細胞)來提供所述ECM，然後取出這些細胞並添加分離的隱窩或上皮幹細胞。產細胞外基質的細胞的實例是主要產膠原蛋白和蛋白聚糖的軟骨細胞，主要產IV型膠原蛋白、層粘連蛋白、間質前膠原蛋白和纖連蛋白的成纖維細胞， 和主要產膠原蛋白(I、III和V型)、硫酸軟骨素蛋白聚糖、透明質酸、纖連蛋白和肌糖蛋白 C的結腸成肌纖維細胞。可選地，所述ECM是商業提供的。可商購的細胞外基質的實例是細胞外基質蛋白anvitrogen)和基質膠(Matrixgel ) (BD Biosciences)。利用ECM培養幹細胞能提高幹細胞的長期存活和未分化幹細胞的持續存在。在不存在ECM的條件下，不能長時間培養幹細胞培養物，並且不能觀察到未分化的幹細胞的持續存在。此外，ECM的存在允許培養三維的組織類器官，在不存在ECM的條件下不能培養三維的組織類器官。本發明方法中所用的優選ECM包含至少兩種不同的糖蛋白，例如兩種不同類型的膠原蛋白或一種膠原蛋白與一種層粘連蛋白。所述ECM可以是合成的水凝膠細胞外基質或天然存在的ECM。最優選的ECM由基質膠(Matrixgel ) (BD Biosciences)提供，其包含層粘連蛋白、內動蛋白和膠原蛋白IV。本發明方法中所用的細胞培養基包括任何細胞培養基。優選的細胞培養基是用基於碳酸鹽的緩衝液緩衝至PH7. 4 (優選7. 2-7. 6或至少7. 2且不高於7. 6)的規定合成培養基，同時細胞在含5% -10% CO2或至少5%且不超過10% CO2，優選5% CO2的環境中培養。優選的細胞培養基選自補充有穀氨醯胺、胰島素、青黴素/鏈黴素和轉鐵蛋白的DMEM/F12 和RPMI1640。在另一個優選的實施方案中，使用改進DMEM/F12或改進RPMI，其經優化用於無血清培養，並且包含胰島素。在這種情況下，所述改進DMEM/F12或改進RPMI培養基優選補充穀氨醯胺和青黴素/鏈黴素。此外，優選的是，所述細胞培養基補充純化的、天然的、 半合成的和/或合成的生長因子，並且不包含非規定組分，諸如胎牛血清或小牛血清。諸如 B27anvitrogen)、N-乙醯半胱氨酸(Sigma)和N2 (Invitrogen)的補充物刺激某些細胞的增殖，並且如果需要，也可以將這些補充物加到培養基中。添加到基礎培養基中的成分是BMP抑制劑。BMP作為二聚配體與由兩種不同的受體絲氨酸/蘇氨酸激酶(即I型和II型受體)組成的受體複合物結合。II型受體將I型受體磷酸化，導致該受體激酶的活化。I型受體隨後將特異性受體底物(SMAD)磷酸化，產生的信號轉導通路引起轉錄活性。所述BMP抑制劑被定義為與BMP分子結合而形成複合物的試劑，其中例如通過阻止或抑制BMP分子與BMP受體的結合來中和BMP活性。可選地，所述抑制劑是起拮抗劑或反向激動劑作用的試劑。這類抑制劑與BMP受體結合，並阻止BMP與所述受體結合。後者試劑的實例是抗體，所述抗體與BMP受體結合，並防止BMP與抗體結合的受體結合。所述BMP抑制劑將細胞中的BMP依賴性活性抑制到相對於不存在所述抑制劑時的 BMP活性水平的至多90%，更優選至多80%、更優選至多70%、更優選至多50%、更優選至多30%、更優選至多10%、更優選0%。如本領域技術人員所已知的，可以通過測定BMP的轉錄活性來測定BMP活性，例如Zilberberg et al. , 2007. BMC Cell Biol. 8 :41中所示。已知幾類天然的BMP結合蛋白，包括Noggin (P^rotech)、脊索蛋白和包含脊索蛋白結構域的脊索蛋白樣蛋白(R&D sytems)、卵泡抑素和包含卵泡抑素結構域的卵泡抑素相關蛋白(R&D sytems)、DAN和包含DAN半胱氨酸結結構域的DAN樣蛋白(R&D sytems)、硬化蛋白/SOST (R&D sytems)、核心蛋白多糖(R&D sytems)和 α-2 巨球蛋白(R&D systems)。本發明方法中所用的優選的BMP抑制劑選自Noggin、DAN和包括Cerberus和 Gremlin在內的DAN樣蛋白(R&D sytems) 0這些可擴散的蛋白能以不同的親和度與BMP配體結合，並抑制這些BMP配體接近信號轉導受體。向基礎培養基中添加任何這些BMP抑制劑能防止幹細胞丟失，否則在培養約2-3周之後就會發生幹細胞丟失。最優選的BMP抑制劑是Noggin。優選以至少lOng/ml的濃度將Noggin添加到基礎培養基，Noggin的濃度更優選至少20ng/ml、更優選至少50ng/ml、更優選至少100ng/ml。 最優選的濃度是約lOOng/ml或lOOng/ml。在幹細胞的培養過程中，優選每兩天向培養基添加所述BMP抑制劑，而優選每四天更換培養基。添加到基礎培養基中的另一成分是Wnt激動劑。Wnt信號通路由Wnt蛋白與Frizzled受體家族成員的細胞表面受體結合時發生的一系列事件界定。這導致 Dishevelled家族蛋白的活化，這會抑制包含axiruGSK-3的蛋白和蛋白APC的複合體從而降解細胞內聯蛋白。產生的核富集的聯蛋白通過TCF/LEF家族轉錄因子而增強轉錄。Wnt激動劑被定義為激活細胞中TCF/LEF介導的轉錄的試劑。因此，Wnt激動劑選自結合併活化Frizzled受體家族成員(包括任何和所有的Wnt家族蛋白)的真正的 Wnt激動劑、細胞內β-聯蛋白降解的抑制劑和TCF/LEF的激活劑。相對於不存在Wnt激動劑時的Wnt活性水平，所述Wnt激動劑將細胞中的Wnt活性刺激至少10 %，更優選至少 20%、更優選至少30%、更優選至少50%、更優選至少70%、更優選至少90%、更優選至少 100%。如本領域技術人員所已知的，可以通過測定Wnt的轉錄活性來確定Wnt活性，例如通過 pTOPFLASH 和 pFOPFLASH Tcf 螢光素酶報告構建體(Korinek et al.，1997. Science 275 :1784-1787)。Wnt激動劑包括分泌型糖蛋白，該分泌型糖蛋白包括Wnt-l/lnt-l ；ffnt-2/ Irp(Int-l 相關蛋白)；Wnt-2b/13 ；ffnt-3/Int-4 ；ffnt-3a (R&D sytems) ；ffnt-4 ；ffnt-5a ； ffnt-5b ；ffnt-6(Kirikoshi H et al.2001. Biochem Biophys Res Com 283 :798-805)； ffnt-7a(R&D sytems) ；ffnt-7b；ffnt-8a/8d ；ffnt-8b ；ffnt-9a/14 ；ffnt-9b/14b/15 ；Wnt-IOa ； Wnt-10b/12 ;Wnt-ll 和 Wnt-16。在「THE WNT FAMILY OF SECRETED PROTEINS (分泌型蛋白的WNT家族)」，R&D Systems目錄，2004中提供了關於人Wnt蛋白的概述。其它的Wnt激動劑包括分泌型蛋白的R-spondin家族，該家族參與Wnt信號通路的激活和調節，並由4個成員(R-spondin 1 (NU206, Nuvelo, San Carlos, CA)、R-spondin 2 (R&D sytems)、R-spondin 3和R-spondin 4)組成；Wnt激動劑還包括Norrin (也被稱為Norrie病蛋白或NDP) (R&D sytems)，其是功能類似於Wnt蛋白的分泌型調控蛋白，能以高親和力與Frizzled-4受體結合併誘導 Wnt 信號通路的活化(Kestutis Planutis et al. (2007) BMC Cell Biol. 8:12)。 最近鑑定出Wnt信號通路的小分子激動劑，即氨基嘧啶衍生物，並且其也明確包括在Wnt激動劑(Liu et al. (2005) Angew Chem Int Ed Engl. 44，1987-90)中。已知的GSK 抑制劑包括小幹擾 RNA(siRNA ；Cell Signaling)、鋰(Sigma)， kenpaullone(Biomol International ；Leost, Μ. et al. (2000)Eur.J.Biochem.267, 5983-5994)、6-溴靛玉紅-30-丙酮廂(Mei jer, L. et al. (2003) Chem. Biol. 10, 1255-1266)、SB 216763 和 SB 415286 (Sigma-Aldrich)、以及能阻止 GSK-3 與 axin 相互作用的FRAT家族成員和FRAT衍生的肽。由Meij er et al.，(2004) Trends in Pharmacological Sciences 25，471-480提供了綜述，通過引用將其併入本文。測定 GSK-3抑制水平的方法和測定是本領域技術人員已知的，並且包括例如Liao et al 2004， Endocrinology, 145 (6) :2941-9)所描述的方法和測定。在優選的實施方案中，所述Wnt激動劑選自Wnt家族成員、R-spondin 1-4,Norrin 和GSK抑制劑中的一種或多種。本發明人發現，向基礎培養基添加至少一種Wnt激動劑對於上皮幹細胞或分離的隱窩的增殖是必需的。在另一個優選的實施方案中，所述Wnt激動劑包含R-spondin 1或由R-spondin 1組成。優選地，以至少50ng/ml的濃度將R-spondin 1添加到基礎培養基中，R-spondin 1的濃度更優選至少100ng/ml、更優選至少200ng/ml、更優選至少300ng/ml、更優選至少 500ng/ml。R-spondin 1的最優選的濃度是約500ng/ml或500ng/ml。在幹細胞的培養過程中，優選每兩天向培養基添加所述Wnt家族成員，而優選每四天更換培養基。在優選的實施方案中，Wnt激動劑選自R_spondin、Wnt_3a和Wnt_6。更優選地， R-spondin和Wnt-3a都用作Wnt激動劑。該組合是特別優選的，因為該組合對類器官形成具有意想不到的協同效應。對於R-spondin，優選的濃度是約500ng/ml或500ng/ml，並且對於Wnt3a，優選的濃度是約100ng/ml或100ng/ml。添加到基礎培養基中的另一成分是選自生長因子家族的有絲分裂生長因子，
8所述生長因子家族包括表皮生長因子伍6 ;( 印1~0切(^)、轉化生長因子-0 (TGF- α ； P印rotech)、基本的成纖維細胞生長因子(bFGF ；P印rotech)、腦源性神經營養因子(BDNF ； R&D Systems)和角質化細胞生長因子(KGF ;Peprotech)。EGF對於多種培養的外胚層和中胚層細胞是有效的有絲分裂因子，並且對特定細胞的體內和體外分化和細胞培養物中的某些成纖維細胞的分化具有重要影響。EGF前體以膜結合分子的形式存在，其經蛋白水解被切割而產生能刺激細胞的53個胺基酸的肽激素。優選的有絲分裂生長因子是EGF。優選地， 以5-500ng/ml或至少5且不高於500ng/ml的濃度將EGF添加到基礎培養基中。優選的濃度為至少 10、20、25、30、40、45 或 50ng/ml 且不高於 500、450、400、350、300、250、200、150 或lOOng/ml。更優選的濃度為至少50且不超過lOOng/ml。更優選的濃度為約50ng/ml或 50ng/ml。同樣的濃度可用於FGF，優選用於FGFlO或FGF7。如果使用多於一種FGF，例如 FGF7和FGF10，那麼FGF的濃度按上文所述來限定並且指的是所用的FGF的總濃度。在幹細胞的培養過程中，優選每兩天向培養基添加所述有絲分裂生長因子，而優選每四天更換培養基。可以使用bFGF家族的任何成員。優選地，使用FGF7和/或FGF10。FGF7也被稱為KGF(角質化細胞生長因子)。在另一個優選的實施方案中，向基礎培養基添加有絲分裂生長因子的組合，例如，EGF和KGF，或者EGF和BDNF。在另一個優選的實施方案中，向基礎培養基添加有絲分裂生長因子的組合，例如，EGF和KGF，或者EGF和FGF10。本發明方法的另一個實施方案包括含有RockO^ho激酶)抑制劑的培養基。發現添加Rock抑制劑能防止失巢凋亡，尤其當培養單一幹細胞時。所述Rock抑制劑優選地選自R)_(+)_反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)環己烷甲醯胺二鹽酸鹽單水合物 (Y-27632 ；Sigma-Aldrich)、5-(1，4_ 二氮雜-1-基磺醯基)異喹啉(法舒地爾或 HA1077 ； Cayman Chemical)和(S) - (+)-2-甲基 _1_[ (4-甲基-5-異喹啉基)磺醯基]-六氫-1H-1， 4-二氮雜卓二鹽酸鹽(H-1152 ;Tocris Bioschience)。在培養所述幹細胞的前7天中，優選每兩天向培養基添加所述Mio激酶抑制劑，例如Y-27632。Y27632的優選濃度是10 □ M。在另一個實施方案中，本發明的方法包括還含有Notch激動劑的培養基。已經表明，Notch信號轉導在細胞命運決定以及在細胞存活和增殖中起重要的作用。Notch受體蛋白能與多種表面結合配體或分泌型配體相互作用，所述表面結合配體或分泌型配體包括但不限於Delta 1、Jagged 1和2，以及Delta樣1、Delta樣3、Delta樣4。配體結合後， Notch受體由涉及ADAM蛋白酶家族成員的一系列切割事件和受λ分泌酶早老素調節的膜內切割而被激活。結果是Notch的細胞內結構域轉位到細胞核，在細胞核中Notch的細胞內結構域轉錄激活下遊基因。優選的Notch激動劑選自Jagged 1和Delta 1，或其活性片段或衍生物。最優選的Notch激動劑是具有序列CDDYYYGFGCNKFCRra的DSL肽(Dontu et al. ,2004. Breast Cancer Res 6 :R605_R615)。優選以 10 μ M-IOOnM或至少 10 μ M且不高於 IOOnM的濃度使用所述DSL肽(ANA spec) 0尤其在培養的第一周，添加Notch激動劑能使培養效率增加2-3倍。在培養所述幹細胞的前7天中，優選每兩天向培養基添加所述Notch 激動劑。Notch激動劑被定義為能刺激細胞中Notch活性的分子，相對於不存在Notch激動劑時Notch的活性水平，所述分子將細胞中的Notch活性刺激至少10%，更優選至少20%、 更優選至少30 %、更優選至少50 %、更優選至少70 %、更優選至少90 %、更優選至少100 %。 如本領域技術人員所已知的，可以通過測定Notch的轉錄活性來確定Notch活性，例如利用Hsieh et al.，1996. Mol. Cell. Biol. 16，952-959 所述的 4xwtCBFl_ 螢光素酶報告構建體。本發明還提供了這樣的細胞培養基，其包含動物或人類細胞的基礎培養基，並且所述基礎培養基添加了骨形態發生蛋白(BMP)抑制劑、Wnt激動劑和5-500ng/ml或至少5 且不超過500ng/ml的、選自EGF、TGF 口、KGF、FGF10和FGF的有絲分裂生長因子。優選地， 有絲分裂因子選自EGF、TGF- □和KGF、或選自EGF、TGF- □和FGF7、或選自EGF、TGF- □和 FGF、或選自EGF和KGF、或選自EGF和FGF7、或選自EGF和FGF、或選自TGF □和KGF、或選自 TGF □和FGF7、或選自TGF □和FGF。EGF可以用TGF □替換。根據待獲取的類器官將鑑定幾種優選的培養基。本發明的細胞培養基允許細胞外基質上上皮幹細胞或分離的隱窩的存活和/或增殖和/或分化。術語細胞培養基(cell culture medium)與培養基(medium)， 培養基(culture medium)或細胞培養基(cell medium)同義。在本發明優選的方法中，第一培養基包含作為BMP抑制劑的Noggin、作為有絲分裂生長因子的表皮生長因子和角質化細胞生長因子、和作為Wnt激動劑的R-spondin 1，並補充了 B27、N2和N-乙醯半胱氨酸。可以用FGF或FGFlO替換KGF。[Leul5]_促胃液素I、 Exendin和/或煙醯胺也可以被添加到第一培養基中。在另一個優選的實施方案，被稱為第二培養基的所述培養基與所述第一培養基相同，除了不含Noggin，並且優選不含[Leul5]-促胃液素LExendin和/或煙醯胺。因此，所述第二培養基包含作為有絲分裂生長因子的表皮生長因子和角質化細胞生長因子和作為 Wnt激動劑的R-spondin 1，並補充了 B27、N2和N-乙醯半胱氨酸。也可以用FGF或FGFlO 替換KGF。這兩種細胞培養基支持包含胰腺幹細胞的胰腺組織塊，所述胰腺幹細胞在基質膠細胞外基質中這些培養基中生長，從而在細胞外基質上形成包含胰島樣結構的胰腺的類器官。不含Noggin的第二培養基是最低培養基，而含Noggin的第一培養基形成用於胰腺組織塊擴增的改良的培養基。擴增培養基優選是在至少2天培養中能促進細胞的存活和/或
增殖的培養基。第三培養基被設計成能在至少5天內促進、誘導細胞向胰腺的類器官分化。一種優選的向胰腺的類器官形成的分化標誌物是神經發生素KNeurogenin-； )，能利用 RT-PCR或免疫組化檢測神經發生素-3的表達。例如，當在分化培養基中培養至少5天之後，能利用RT-PCR或免疫組化檢測到神經發生素-3時，則作為第三或第四培養基的所述分化培養基被認為是有功能的。優選地，在以上所定義的第一或第二培養基的培養基中進行第一擴增步驟之後，再實施該分化步驟。該第三培養基與以上的第二培養基相同，除了不含 FGF或KGF或FGF10。該第三培養基包含表皮生長因子和作為Wnt激動劑的R-spondin 1， 並補充了 B27、N2和N-乙醯半胱氨酸。第四培養基被設計成與所述第一培養基相同，其中所述第四培養基含還補充有 [Leul5]_促胃液素I和/或Exendin。所述第三培養基是最低分化培養基，而所述第四培養基是改良分化培養基。分化培養基是優選誘導或促進培養至少5天內的細胞發生特異性分化的培養基。對於胰腺的類器官，可以通過檢測本文之前所定義的與胰腺譜系相關的特異標誌物的存在來測定分化。與胰腺譜系相關的其它標誌物的實例包括在分化培養基中培養至少7、8、9、10天之後，可利用RTPCR或免疫組化檢測的胰島素分泌。因此，在獲得和/或培養胰腺的類器官的優選的方法中，在第一步驟中，在第一或第二培養基中培養上皮幹細胞、包含所述上皮幹細胞的分離的組織塊、或腺瘤細胞，隨後在第二步驟中，在第三或第四培養基中進行培養。第一步驟可以持續至少2周或可以更長。第一步驟可以進行大於1、2、3、4、5、6、7、8、9或大於10個月。所述第二步驟可以持續8、9、10、 11、12、13、14、15、16天或更長。優選地，利用本文所限定的細胞外基質進行每個步驟。每種培養基中存在的每種化合物的優選濃度已在本文的說明書或實施例中進行了限定。在優選的實施方案中，如果胰腺的類器官用於再生醫學，則可以從上皮細胞或從分離的胰腺組織塊開始。在另一個優選的實施方案中，如果胰腺的類器官被用作藥物開發體系，則可從腺瘤開始。因此，通過本發明方法獲得的胰腺的類器官是本發明的另一方面。因此，另一方面， 本發明提供了本文所定義的第一、第二、第三、第四培養基。據我們了解，這是首次報導，在培養至少10個月後，獲得有功能的並且活的胰腺的類器官(參見實驗部分)。功能性優選的特徵為胰島素的分泌。由於獲得的胰腺的類器官的最終的量與培養的持續時間相關，因此本領域技術人員應當理解，本發明是開創性的發明，並且有潛力為例如再生醫學中帶來新的希望。因此，在獲得和/或培養胰腺的類器官的優選的方法中，在第一步驟中，在含EGF、 KGF或FGF和作為Wnt激動劑的R-spondin 1並補充了 B27、N2和N-乙醯半胱氨酸的培養基中，將上皮幹細胞、包含所述上皮幹細胞的分離的組織塊、或腺瘤細胞與細胞外基質接觸培養，隨後在第二步驟中，在含EGF和作為Wnt激動劑的R-spondin 1並補充了 B27、N2和 N-乙醯半胱氨酸的培養基中進行培養。在本發明的另一個優選的方法中，培養基包含作為BMP抑制劑的Noggin、作為有絲分裂生長因子的表皮生長因子、作為Wnt激動劑的R-spondin 1和/或Wnt3a。該細胞培養基支持分離的小腸隱窩在包含作為細胞外基質的基質膠的三維培養物中進行培養。在本發明的另一個優選的方法中，培養基包含作為BMP抑制劑的Noggin、作為有絲分裂生長因子的表皮生長因子、作為Wnt激動劑的R-spondin、作為Notch激動劑的 Jagged-DSL肽和I^ho激酶抑制劑Y-27632。該細胞培養基支持分離的單一上皮幹細胞在包含作為細胞外基質的基質膠的三維培養物中進行培養。在本發明的另一個優選的方法中，培養基包含作為BMP抑制劑的Noggin、作為有絲分裂生長因子的表皮生長因子和/或80順、作為Wnt激動劑的R-spondin 1和/或 Wnt3a，並補充了 B27、N2和N-乙醯半胱氨酸中的至少一種。在該優選的方法中，Wnt-3a是優選的Wnt激動劑。該細胞培養基支持分離的結腸隱窩在包含作為細胞外基質的基質膠的三維培養物中進行培養。該培養基能促進培養至少2天內的細胞的存活和/或增殖和/或分化。一種優選的向結腸隱窩形成的分化標誌物可以選自以下指示腸上皮細胞存在的鹼性磷酸酶、指示杯狀細胞存在的Muc2和指示內分泌細胞存在的Neurogenic 3或嗜鉻粒蛋白。 可以利用RTPCR或免疫組化檢測這些標誌物中每一種的表達。能起到促進用於獲得結腸隱窩的細胞的存活和/或增殖和/或分化功能的培養基能使得在培養至少2、3、4、5、6、7、8、9、 10天或更長的時間之後，可以檢測出至少一種上述標誌物。優選的培養基包含作為BMP抑制劑的Noggin、作為有絲分裂生長因子的表皮生長因子和作為Wnt激動劑的R-spondin 1 和/或Wnt-3a，並補充了 B27、N2和N-乙醯半胱氨酸中的至少一種。該培養基被稱為本發明的第五培養基，這代表本發明的另一方面。因此，在獲得和/或培養結腸隱窩的優選的方法中，在上文所示的培養基中培養上皮幹細胞、包含所述上皮幹細胞的分離的組織塊、或腺瘤細胞，優選在第五培養基中進行培養。優選利用本文所限定的細胞外基質實施該方法。培養基中存在的每種化合物的優選濃度已在本文的說明書或實施例中進行了限定。因此，可通過本發明方法獲得的結腸隱窩是本發明的另一方面。據我們了解，這是首次報導，在培養至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12個月後，獲得有功能的並且活的結腸隱窩(參見實驗部分)。功能性的特徵優選為至少一種上文所示的標誌物的存在。本發明是開創性的發明，並且有潛力為例如再生醫學中帶來新的希望。因此，在獲得和/或培養結腸隱窩的優選的方法中，在含Noggin、EGF和作為Wnt 激動劑的R-spondin 1和/或Wnt_3並補充了 B27、N2和N-乙醯半胱氨酸的培養基中，將上皮幹細胞、包含所述上皮幹細胞的分離的組織塊、或腺瘤細胞與細胞外基質接觸培養。在本發明的另一個優選的方法中，培養基含有作為BMP抑制劑的Noggin、作為有絲分裂生長因子的表皮生長因子、作為Wnt激動劑的R-spondin 1、並補充了 Wnt-3a或 KGF,並且還含有B27、N2、N-乙醯半胱氨酸。將該培養基稱為第六培養基，並因此代表本發明的另一方面。可以用TOF或FGFlO替代KGF。該培養基優選含有作為BMP抑制劑的 Noggin、作為有絲分裂生長因子的表皮生長因子和FGFlOdtS Wnt激動劑的R-spondin 1 和Wnt-3a，並且還含有B27，N2，N-乙醯半胱氨酸。FGF10優選作為FGF，因為它給出的結果優於例如FGF7(圖32)。該細胞培養基支持分離的胃組織塊或胃的類器官在含有作為細胞外基質的基質膠的三維培養物中進行培養。該第六培養基是用於擴增胃組織塊的培養基。擴增培養基是優選促進至少2天培養內的細胞的存活和/或增殖的培養基。另一種培養基，即第七培養基，被設計成能在至少 2天內促進、誘導細胞向胃的類器官或胃組織塊的分化。該第七培養基與上述的第六培養基相同，除了 Wnt-3a的濃度低於第六培養基。與第六培養基中存在的Wnt-3a濃度相比，第六培養基中 Wnt-3a 的濃度降低至少 25%、50%、100%、200%、300%、400%、500%、600% 或更多。該第七培養基含有表皮生長因子和作為Wnt激動劑的R-spondin 1與Wnt-3a、 Noggin和FGF10，並補充了 B27、N2、N-乙醯半胱氨酸和促胃液素。促胃液素的使用濃度優選為InM。所述第七培養基是分化培養基。分化培養基是優選在至少3、4、5、6、7、8、9、10天或更長時間培養內誘導或促進細胞發生特異性分化的培養基。對於胃的類器官或胃組織塊，可以通過檢測胃譜系相關的特異性標誌物的存在來確定分化。胃譜系相關的標誌物的實例包括MUC5AC(隱窩細胞標誌物)、促胃液素和/或生長抑制素(兩種都是內分泌細胞標誌物)。優選利用RT-PCR和/或免疫組化或免疫螢光來檢測至少一種所述標誌物的存在。優選在分化條件中至少6天，更優選在至少10天之後可以檢測至少一種這些標誌物中的存在。當在所述培養基中培養至少6天之後，可以通過RT-PCR或免疫組化檢測到至少一種上述標誌物時，諸如第七培養基的分化培養基被認為是有功能的。優選在上述限定的第六培養基中的第一擴增步驟之後進行該分化步驟。因此，在獲得和/或培養胃組織塊的優選的方法中，在第一步驟中，在第六培養基中培養上皮幹細胞、包含所述上皮幹細胞的分離的組織塊、或腺瘤細胞，隨後在第二步驟中，在第七培養基中進行培養。優選利用本文所限定的細胞外基質實施每一步驟。第一步驟可以持續至少3天並且可以持續更長的時間。第一步驟可以進行超過3、4、5、6、7、8、9或
12更多。第二步驟可以持續6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16天或更長時間。每種培養基中存在的每種化合物的優選濃度已在本文的說明書或實施例中進行了限定。因此，可通過本發明方法所獲得的胃組織塊是本發明的另一方面。因此，在獲得和/或培養胃組織塊的優選的方法中，在第一步驟中，在含有作為 BMP抑制劑的Noggin、作為有絲分裂生長因子的表皮生長因子和FGFlOdtS Wnt激動劑的 R-spondin 1和Wnt-3a，並且還含有B27、N2、N-乙醯半胱氨酸的培養基中，將上皮幹細胞、 包含所述上皮幹細胞的分離的組織塊、或腺瘤細胞與細胞外基質接觸培養，隨後在第二步驟中，在含有表皮生長因子和作為Wnt激動劑的R-spondin 1和Wnt_3a、Noggin和FGF10， 並補充了 B27、N2和N-乙醯半胱氨酸的培養基中進行培養，其中第二步驟中的Wnt-3的濃度低於第一步驟中存在的Wnt-3a濃度。在本發明的另一個優選的方法中，培養基含有作為BMP抑制劑的Noggin和作為有絲分裂生長因子的表皮生長因子。該細胞培養基支持分離的腺瘤組織塊或分離的單一腺瘤細胞在含有作為細胞外基質的基質膠的三維培養物中進行培養。可以向培養基中新鮮加入諸如Wnt3a的配體。可選地，通過用表達所述配體的合適的表達構建體轉染或感染細胞系使細胞系表達所述配體。培養所述細胞系，並在合適的時間間隔收集含有分泌配體的培養基。例如，當細胞達到匯合併停止生長時，細胞會產生 Wnt3a。將來自沒有用所述表達構建體轉染或感染的細胞的培養基用作對照。收集條件培養基並對其進行檢測，例如在測定中檢測受TCF反應元件控制的螢光素酶表達從而檢測諸如 Wnt3a 的 Wnt 激動劑的存在(Korinek et al.，1997. Science 275:1784-1787)。當用於培養來再生組織時，將所述培養基稀釋。如本領域技術人員所已知的，添加過量的配體有時與添加太少配體一樣，對培養物都是有害的。因此，條件培養基的實際稀釋度取決於測驗中所測定的配體的量。本發明還提供了本發明的培養基在細胞外基質上培養上皮幹細胞或包含這些幹細胞的分離的類器官結構中的用途，其中所述幹細胞優選不包含人胚胎幹細胞。優選的是人成體幹細胞。此外，從小腸、結腸和胃單分選的上皮幹細胞也能在本發明的培養基中起始這些三維類器官。本發明還提供了本發明的培養基在培養包含幹細胞的胰腺組織塊中的用途，所述胰腺組織塊形成包含胰島樣結構的胰腺的類器官。所述幹細胞優選是胰腺、胃、腸或結腸上皮幹細胞，其中最優選的幹細胞是小腸幹細胞。本發明的培養基允許長期培養條件的建立，在該條件下，單一隱窩經歷多次隱窩分裂事件，而同時產生存在所有分化的細胞類型的絨毛樣上皮結構。利用本發明的培養方法可允許至少7個月、至少8個月，至少9個月、至少10個月的培養期。培養的隱窩在培養之後，經歷顯著的形態改變。新鮮分離的隱窩的上部開口封閉， 並且該區域逐漸膨脹並充有凋亡細胞，很像凋亡細胞在絨毛頂部被剪斷。發現隱窩區經歷連續的出芽事件而產生其它隱窩，這是表明隱窩分裂的過程。隱窩樣擴展物包含所有分化的上皮細胞類型，包括增殖性細胞、帕內特細胞、腸上皮細胞和杯狀細胞。在任何階段的類器官中均未鑑定出成肌纖維細胞或其它非上皮細胞。出芽隱窩結構的擴增產生類器官，所述類器官在襯有絨毛樣上皮細胞並充有凋亡細胞體的中央腔周圍含有> 40個隱窩樣結構。隱窩-絨毛的類器官包含襯有絨毛樣上皮的中央腔。該腔在連續的時間間隔是開放的，從而將內容物釋放到培養基中。所述類器官可以傳代並且可以保持培養至少6個月，而不會喪失重要的特性。傳代優選涉及類器官的手動破碎。當培養單一上皮幹細胞時，形成相似的隱窩-絨毛的類器官結構。大約1周後，形成了十分類似於利用完整的隱窩所獲得的隱窩-絨毛的類器官結構的結構。這些類器官的組織學分析也表明保留了基本的隱窩-絨毛構造、存在所有分化的細胞類型和不存在非上皮成分。因此，一方面，本發明提供了隱窩-絨毛的類器官，包含襯有絨毛樣上皮細胞的中央腔，所述絨毛樣上皮細胞是通過在本發明的培養基中培養上皮幹細胞或分離的隱窩而產生的。優選地，所述隱窩-絨毛的類器官是利用本發明的方法獲得的。另一方面，本發明提供了按照本發明的方法培養胰腺組織塊所產生或所獲得的胰腺的類器官。在開始培養後7天，約20%的胰腺的類器官形成出芽結構。與僅非常緩慢生長的腺泡組織相反，胰管快速增殖。在胰腺的類器官傳代之後，觀察到分泌胰島素的胰島樣結構，其類似於健康胰腺組織中存在的郎格罕氏胰島。本發明還提供了包含中央腔的胃的類器官。優選地，所述胃的類器官是通過本發明的方法獲得的。可以向培養基中添加其它生長因子，例如用來增強類器官中胰島的存在或進一步支持諸如胃組織塊的分離組織塊的培養，所述其它生長因子包括環巴胺(Sonic-hedgehog 抑制劑；Tocris Bioscience)、激活素、GLP(胰高血糖素樣肽)及其衍生物(ExendiM ； California Peptide Research)、促胃液素(Genscript)、Notch 激雲力齊[J (Jagged 肽，Ana Spec)、煙醯胺和諸如Wnt-3a的Wnt激動劑。當以單細胞起始培養時，優選使用Wnt-3a。本發明還提供了隱窩-絨毛、胃或胰腺的類器官的集合體，每集合體包含多於10 個，優選多於20個、更優選多於40個類器官。隱窩-絨毛的類器官包圍襯有絨毛樣上皮的中央腔。該腔充有凋亡細胞體。隱窩-絨毛的類器官中的細胞是極化的，幹細胞定居在結構的基部。隱窩樣結構的頂部包含脫落進腔中的凋亡細胞。所述隱窩-絨毛的類器官集合體優選包含至少10%的活細胞、更優選至少20%的活細胞、更優選至少50%的活細胞、更優選至少60%的活細胞、更優選至少70%的活細胞、更優選至少80%的活細胞、更優選至少90%活細胞。可以在FACS中利用Hoechst染色或碘化丙啶染色評價細胞活力。另一方面，本發明提供了本發明的隱窩-絨毛的類器官、胃的類器官或胰腺的類器官在藥物開發篩選、毒性測定或再生醫學中的用途。為了高通量的目的，將所述隱窩-絨毛、胃或胰腺的類器官培養在多孔板中，例如，96孔板或384孔板。分子文庫用來鑑定影響所述類器官的分子。優選的文庫包括抗體片段文庫、肽噬菌體展示文庫、肽文庫(例如L0PAP ，Sigma Aldrich)、脂質文庫(BioMol)、 合成化合物文庫(例如LOP AC , Sigma Aldrich)或天然化合物文庫(Specs，TimTec)。此外，可以使用誘導或抑制腺瘤細胞後代中一個或多個基因的表達的基因文庫。這些基因文庫包括cDNA文庫、反義文庫和siRNA或其它非編碼RNA文庫。優選將細胞暴露於多個濃度的檢測試劑一段時間。在暴露時間結束時，評估培養物。術語「影響」用於包括細胞中的任何改變，包括但不限於，增殖降低或喪失、形態改變和細胞死亡。所述隱窩-絨毛、胃或胰腺的類器官還可以用來鑑定特異性地靶向於上皮癌細胞，但不靶向於所述隱窩-絨毛，胃或胰腺的類器官的藥物。所述隱窩-絨毛、胃或胰腺的類器官還可以替代諸如Caco-2細胞的細胞系在可能的新藥或現有的或新的食品補充劑的毒性測定中的用途。此外，所述隱窩-絨毛、胃或胰腺的類器官可以用於培養目前缺乏合適的組織培養物或動物模型的病原體，例如諾如病毒。包含隱窩-絨毛的類器官的培養物可用在再生醫學中，例如用在腸上皮的放射後和/或手術後修復、諸如克羅恩病和潰瘍性結腸炎的炎性腸病患者的腸上皮的修復、以及短腸症候群患者的腸上皮的修復。其它用途是小腸/結腸遺傳病患者的腸上皮的修復。包含胰腺的類器官的培養物也可用在再生醫學中，例如用作胰腺或部分胰腺切除後的植入物和用於治療諸如I型糖尿病和II型糖尿病的糖尿病。在可選的實施方案中，可以使擴增的上皮幹細胞成為相關的組織，例如，包括胰腺 β細胞在內的胰腺細胞和肝細胞。目前，從成體幹細胞再生胰腺細胞或肝細胞是不可能的。 本發明的培養方法能實現分析使密切相關的上皮幹細胞轉分化為包括胰腺β細胞在內的胰腺細胞和肝細胞的因子。對於本領域技術人員顯而易見的是，基因療法也可以用在基於修復受損或患病的組織的方法中。例如，可以利用腺病毒或逆轉錄病毒基因遞送媒介來將諸如DNA和/或RNA 的遺傳信息遞送至幹細胞。本領域技術人員能替換或修復基因療法中所靶向的特定基因。 例如，可以將正常基因插入基因組非特異的位置中，從而替換無功能的基因。在另一個實例中，可以通過同源重組用正常基因序列替換異常基因序列。可選地，選擇性回復突變可以將基因恢復至正常功能。另一個實例是改變特定基因的調控(激活或關閉基因的程度)。優選地，通過基因療法途徑離體處理幹細胞，隨後將其轉移至需要治療的哺乳動物，優選人。另一方面，本發明提供了培養上皮腺瘤細胞的方法，包括提供細胞外基質、使上皮腺瘤細胞附於所述細胞外基質、在存在細胞培養基的條件下培養所述細胞，所述細胞培養基含有動物人類細胞的基礎培養基，並且該基礎培養基中添加有骨形態發生蛋白(BMP)抑制劑和5-500ng/ml或至少5且不超過500ng/ml的、選自EGF、TGF_ α和KGF的有絲分裂生長因子。可以用FGF或FGFlO替代KGF。上皮結腸腺瘤細胞包含編碼APC蛋白的基因中的改變，這導致由包含APC的蛋白複合體導致的細胞內聯蛋白的低效降解。結腸腺瘤中常見的其它突變包括聯蛋白或Axin2中的突變。總結果是增強的TCF/LEF信號轉導，這是因為細胞核中β-聯蛋白的量增加。發現不含Wnt激動劑的培養基足以使腺瘤細胞增殖。可以通過本領域內已知的方法從上皮腺瘤分離所述腺瘤細胞，包括使用諸如EDTA 的解離劑。可選地，可以利用Lgr5結合化合物從腺瘤分離單一 Lgr5-或Lgr_6-陽性的腺瘤細胞，隨後利用磁珠或FACS分析。本發明還提供了在存在細胞培養基條件下培養的上皮腺瘤細胞的後代，所述細胞培養基包含動物或人類細胞的基礎培養基，並且該基礎培養基添加有骨形態發生蛋白 (BMP)抑制劑和5-500ng/ml或至少5且不超過500ng/ml的表皮生長因子(EGF)。培養的腺瘤細胞不能發育成諸如隱窩-絨毛樣構造的極化的三維結構。相反，腺瘤細胞形成氣球樣結構，其中細胞隨機朝向邊緣或中央腔。沒有分化成其它上皮細胞類型的跡象。該結果表明APC在隱窩-絨毛樣構造的三維組建中的作用。此外，本發明提供了腺瘤細胞的後代在靶向藥物開發篩選中的用途，用於鑑定與在相同培養基中進行培養的擴增的正常上皮細胞相比，特異性地影響腺瘤細胞的藥物。為了高通量的目的，將腺瘤細胞的後代培養在多孔板中，例如，96孔板或384孔板。使用分子文庫來鑑定影響所述後代的分子。優選的文庫包括抗體片段文庫、肽噬菌體展示文庫、肽文庫(例如LOPAP ，Sigma Aldrich)、脂質文庫(BioMol)，合成化合物文庫(例如L0PAC ， Sigma Aldrich)或天然化合物文庫(Specs，TimTec)。此外，可以使用誘導或抑制腺瘤細胞後代中一個或多個基因的表達的基因文庫。這些基因文庫包括cDNA文庫、反義文庫和 siRNA或其它非編碼RNA文庫。隨後或平行檢測影響腺瘤細胞的化合物對擴增的正常上皮細胞的影響。術語「影響」用於包括細胞中的任何改變，包括但不限於，增殖降低或喪失、形態改變和細胞死亡。所述後代也可以用來鑑定與上皮腺瘤細胞相比(包括逆轉的癌細胞)， 特異性地靶向於上皮癌細胞的藥物。顯而易見的是，所述後代也可以用在測定候選藥物的體外代謝穩定性和代謝譜的
高通量方法中。此外，本發明提供了本發明的腺瘤細胞後代、胰腺的類器官、胃的類器官和隱窩-絨毛的類器官在毒性測定中的用途。所述後代和隱窩-絨毛的類器官易於培養，並且比諸如當前用在毒性測定中的 Caco-2(ATCCHTB-37)、I-407(ATCC CCL6)和 XBF(ATCC CRL 8808)的上皮細胞系更類似於原代上皮細胞。預計的是，利用原代腺瘤培養物或隱窩-絨毛的類器官獲得的毒性結果更接近於患者中獲得的結果。基於細胞的毒性測定用於確定器官特異性細胞毒性。在所述測定中檢測的化合物包括癌症化學預防劑，環境化學品、食品補充劑和可能的有毒物。將細胞暴露於多個濃度的檢測試劑中一段時間。在利用5天暴露時間和從最高可溶濃度的對數稀釋的預實驗中確定測定中檢測試劑的濃度範圍。在暴露時間結束時，評估培養物的生長抑制。分析數據以確定抑制終點50%時的濃度(TC50)。在本文件及其權利要求書中，動詞「包括(to comprise)」及其變化詞以非限制性的含義使用，表示包括該詞後面的項，但是不排除未特定提到的項。此外，動詞「由……組成
(to consist) 」可以用「基本由......組成(to consist essentially of)」替代，表示本文
所限定的產物可以含有特定指出的成分之外的其它成分，但所述其它成分不會改變本發明的特有性質。此外，本文所限定的方法可以包括特定指出的步驟之外的其它步驟，但所述其它步驟不會改變本發明的特有性質。此外，由不定冠詞「a」或「an」修飾的元件不排除存在多於一個元件的可能性，除非文中明確指示有且只有一個元件。因此，不定冠詞「a」或「an」 通常表示「至少一個」。單詞「約(about)」或「約(approximately)」當與數值聯合使用時 (約10)，優選表示該值可以為10或大於或小於該值的1%。通過引用將本說明書中所列舉的所有專利和參考文獻全部整體併入本文。僅以示例提供以下實施例，而非意圖以任何方式限制本發明的範圍。


圖1.隱窩培養的生長因子需要a 用 EGF (E ；0_50ng/ml)和 R-spondin 1 (R :0_500ng/ml)接種 500 個隱窩，三個平行樣品；接種後7天對隱窩的類器官進行計數。b 用EGF(50ng/ml)和R-spondin 1 (500ng/ ml)和指定量的Noggin培養500個隱窩/隱窩的類器官，隨後進行3次傳代。每次傳代時對隱窩的類器官進行計數。實驗重複三次，得到類似的結果。圖2.腸隱窩培養體系的建立
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a 分離的單個隱窩長成類器官的時間過程。差分幹涉相差圖像顯示隱窩基部的含顆粒的帕內特細胞(箭頭)。b，c:單一分離的隱窩有效形成隱窩的類器官。通過重複的隱窩分裂，結構在第14天時產生多個章魚樣隱窩的類器官。d:培養3周之後，單個類器官的 3D重建共聚焦圖像。Lgr5-GFP+幹細胞(淺灰色)位於隱窩樣結構的頂部。DNA的對比染色ToPro-3(深灰色)。e:隱窩的類器官的圖示。類器官由襯有絨毛樣上皮的中央腔和多個周圍的隱窩樣結構組成。位於隱窩結構頂部的深灰色細胞指示存在於每個隱窩結構中的 Lgr5+幹細胞的位置。比例尺顯示50 μ m。圖3.基因表達譜的集群分析。利用新鮮分離的結腸和小腸隱窩以及小腸的類器官的表達水平的集群分析表明， 小腸的類器官和其來源的組織小腸隱窩之間具有高度的相似性。結腸隱窩集中在單獨的分支上，表明該密切相關的組織的不同的基因表達模式。值得注意的是，所有表達的基因中只有1.2%顯著富集在對應於小腸隱窩的類器官中，而反之有2%富集在小腸隱窩中。對這些差異性基因的hgenuity Pattway分析表明，新鮮分離的隱窩中特異性地存在淋巴細胞標誌，而在類器官富集的少量基因中沒有鑑定出明顯的通路(未顯示)。我們推斷，後一組代表生物學噪音，而來源於汙染的上皮內免疫細胞的淋巴細胞標誌在培養時丟失。圖4.隱窩的類器官保留基本的隱窩-絨毛特性。a-e:Wnt激活碼保留在隱窩結構中。a 細胞核β-聯蛋白(深灰色，箭頭)僅見於隱窩結構中。圖5中顯示更高解析度的圖像。星號代表基質膠；Lu代表腔。b:CBC細胞和TA細胞梯度表達EphB2(淺灰色)。觀察到用白箭頭指示的Lgr5-GFP+幹細胞。c 半胱天冬酶3+的凋亡細胞(深灰色，箭頭)脫落進襯有腸上皮細胞的中央腔中。d:來自>3月的隱窩培養物的細胞塗片的40條染色體。e-g :Lgr5+幹細胞的體外譜系追蹤。e 用他莫西芬體外刺激來自Lgr5-EGFP-ires-CreERT2/Rosa^-lacZ報告基因小鼠的隱窩12小時，並培養指定的天數。LacZ染色(深灰色)表明，分散的單LacZ+細胞(第1天)在體外產生整個LacZ+隱窩(第2-14天)。插圖顯示更高放大倍數的著色隱窩的類器官。f 組織學分析顯示整個LacZ+隱窩結構(深灰色/黑色)進入絨毛結構中。g 具有LacZ+細胞的隱窩的類器官的百分比隨時間保持穩定，表明Lgr5+細胞具有長期幹細胞活性。以三個平行樣品接種500個隱窩，並對LacZ+隱窩的類器官進行計數。誤差棒是三個平行樣品的標準差。 實驗重複3次，結果相似。圖5.圖4a、圖Ilm和Ilp的更高解析度的圖像。圖6.隱窩的類器官中沒有存在上皮下成纖維細胞的證據。a 平滑肌肌動蛋白(SMA ；深灰色，用黑色箭頭指示實例)的免疫染色表明上皮層下存在上皮下成纖維細胞。b:基質膠(星號)中不存在SMA+細胞表明培養體系中沒有上皮下成纖維細胞。比例尺50μπι。圖 7. a-c 用他莫西芬體外刺激來自 Lgr5-EGFP-ires_CreERT2/Rosa^-YFP 報告基因小鼠的隱窩12小時，並在指定的天數進行成像。Lgr5+細胞是淺灰色的且用白色箭頭指示。d 用他莫西芬體外刺激來自Lgr5-EGFP-ires-CreERT2/Rosa^-YFP隱窩的7天長類器官12小時，培養指定的天數並成像。YFP螢光(淺灰色)顯示分散的單YFP+細胞(第1 天)在隨後的5天內在體外產生多個後代。絨毛結構在第1-1. 5天內快速生長，隨後形成新的絨毛結構(白圈)。觀察到YFP+細胞向絨毛結構遷移。
圖8.單分選的Lgr5+幹細胞產生整個隱窩-絨毛結構。a 將從Lgr5-EGFP-ires-CreERT2腸製備的Lgr5_GFP+細胞(底圖)與野生型同窩細胞(Iittermate)進行比較(頂圖)。將GFP+細胞分成兩群:GFP髙和GFP低。b 對新鮮分離的隱窩的共聚焦顯微鏡分析顯示GFPs存在於CBC細胞中(黑色箭頭)，GFP 位於CBC 上(白色箭頭)。c:所分選的GFPs細胞。d:培養14天後分選的1000個GFPs細胞(左) 和GFPte細胞(右)。e-f:分選後14天，單一 GFPs細胞形成隱窩的類器官，Lgr5-GFP+細胞 (淺灰色細胞)和帕內特細胞(白色箭頭)位於隱窩底部。比例尺50 μ m。f 更高放大倍數的e中的隱窩基部。g 為了觀察增殖的細胞，將類器官與胸苷類似物EdU(淺灰色，用白色箭頭指示實例)一起培養1小時，培養之後將其固定。觀察到只有隱窩結構併入了 EdU。 復染劑DAPI (深灰色)。圖9. a 單個孔中分選的單細胞的集落形成效率。給出j個單獨實驗的平均值，其中每個實驗中肉眼檢查100個細胞，然後追蹤生長。b 單個胞成功生長的實例。C 每個單個類器官的細胞數，給出的是5個生長的類器官的平均值。d:將來自單細胞來源的類器官的單細胞懸液進行再接種，並生長2周。二圖10.單個孔中分選的單細胞的集落形成能力。單個胞成功生長的實例。 箭頭指向作為標誌的塵粒。比例尺50μπι.圖11.來源於單個幹細胞的類器官的組成。a-d為以下的三維重建共聚焦圖像a 淺灰色的絨毛蛋白(襯於中央腔的腸上皮細胞的頂部)，b:用白色箭頭指示Muc2染色(杯狀細胞)，c 淺灰色的溶菌酶(帕內特細胞)，d 淺灰色的嗜鉻粒蛋白A(腸內分泌細胞)。 用DAPI對細胞核進行復染。e_g 石蠟切片染色e 黑色的鹼性磷酸酶(襯於中央腔的腸上皮細胞的頂部)，f 深灰色的PAS (杯狀細胞)，g 深灰色的溶菌酶(帕內特細胞)，h 深灰色的突觸素(腸內分泌細胞)。i_P:隱窩的類器官的電子顯微鏡切片表明存在腸上皮細胞 (i)、杯狀細胞(j)、帕內特細胞(k)和腸內分泌細胞(1)。m/o 低倍鏡隱窩圖像表明不存在基質細胞。n-o 更高放大倍數的m。η 如微絨毛長度的差異所指示(黑色箭頭)，朝向類器官的腔室的刷邊緣的成熟。P:絨毛結構低倍鏡圖像。Lu 充有凋亡體並襯有極化的腸上皮細胞的隱窩的類器官的腔。G 杯狀細胞；EC 腸內分泌細胞；P 帕內特細胞；星號基質膠。 比 列尺5 μ m(m, ρ) , 1 μ m(n, ο)。圖12.體內隱窩和體外培養的隱窩之間的電子顯微鏡圖像比較。a、b 正常腸隱窩基部底面具有結締組織(箭頭)。為了比較，類器官的c_g圖像也在隱窩基部進行採集。d 頂膜的高放大倍數圖像；兩個相鄰細胞的膜之間具有細胞間裂縫(箭頭)。觀察到橋粒(箭頭頭部)，然後是細胞間裂縫。e:基部的高放大倍數圖，其中兩個相鄰細胞的膜之後可以為細胞間裂縫。這些圖像與來自正常小鼠腸的a和b相似。這些細胞間裂縫可能是由乙醛固定過程中的滲透衝擊引起的。f、g:組成類器官的所有細胞都處於健康的狀態，並且沒有大的空泡或其它脅迫跡象。可以觀察到有絲分裂圖(c)，在每個細胞中都有多個核孔(f，箭頭)和完整的線粒體。可以看到ER和高爾基體(g)，並沒有任何膨脹的跡象。沒有核破裂、核溶解或核固縮跡象。因此，沒有觀察到細胞裂解或凋亡的跡象。類器官腔中的細胞顯示預期的凋亡特徵，因為可在正常小鼠的腸中觀察到這個現象。f 顯示腸內分泌細胞的另一個實例。Mi 有絲分裂的細胞，Lu 腔，EC:腸內分泌細胞，G 高爾基體。
圖13.同樣可以維持培養結腸來源的隱窩。利用與小腸隱窩相同的培養條件，來源於結腸的單一分離的隱窩有效地形成隱窩的類器官。通過重複的隱窩分裂，在第14天時，該結構產生了許多章魚樣隱窩的類器官。圖14.添加BDNF提高培養效率。在存在EGF、Noggin、R-Spondin和BDNF的條件下培養單一分離的結腸隱窩。在起始培養後的第0、4和14天對結腸隱窩的類器官採集的圖像。圖15.添加Wnt3a進一步提高結腸隱窩的類器官的培養效率。在存在EGF、Noggin、 R-Spondin的條件下培養單一分離的結腸隱窩。與使用對照培養基(-Wnt3a)培養結腸的類器官相比，使用Wnt3a條件培養基(+Wnt3a)將培養效率提高高達30%。圖16.從APC-/-小鼠分離的腺瘤可以在體外生長。將來自APC-/-小鼠的單個分離的腺瘤解離，並用以上所述的條件進行培養，除了在培養基中不含R-spondin。a 此處所示的4天時的腺瘤的類器官通常長成簡單的包囊，其包含一個含有凋亡細胞的中央腔。b 更大放大倍數的一個腺瘤的類器官。c:用聯蛋白(深灰色)和蘇木精(腔中的淺灰色)對一個腺瘤的類器官進行染色。類器官的外層由具有細胞核聯蛋白染色的上皮細胞組成。內腔含有死細胞，死細胞已經攝取蘇木精並被染成深灰色。d:更大放大倍數的上皮細胞外層，其顯示出清楚的細胞核聯蛋白。二圖17.添加提高了類器官形成的效率。a 分選出Lgr5_GFPS細胞，並在正常單一細胞培養條件下(EGF、noggin、R-spondin、Notch配體和Y-27632，如上文所述的單一細胞培養條件)並且在含有或不含Wnt3a(100ng/ml)的情況下進行培養。在存在和不存在Wnt3a條件下，培養類器官的皿的這些圖像是有代表性的。b 以100個細胞/孔進行接種，類器官的數量是接種後14天時的數量。該圖表示每皿的類器官數。圖 18. R-spondinl 作用模型。當真正的Wnt配體與Frizzled結合併與LRP5/6受體相聯時，啟動Wnt/ β -聯蛋白信號轉導。在不存在R-spondin 1的條件下，Wnt信號轉導受細胞表面上的LRP6的量所限， 由於DKKl/Kremenl介導的內化而使LRP6的量保持低水平。R-spondin 1通過拮抗DKKl/ Kremenl介導的LRP6更新而增強Wnt信號轉導，導致細胞表面的LRP6水平提高。該圖來自 PNAS 104 14700，2007。圖19.在小腸中帕內特細胞與Lgr5+幹細胞鄰近。從Lgr5-EGFP-ires_CreERT2敲入小鼠的小腸分離隱窩。此處顯示代表性隱窩的實例。GFP+細胞是Lgr5+(淺灰色，用黑色箭頭指示)，並且其通常與帕內特細胞鄰近(用*指示)。圖20.在不存在活帕內特細胞的情況下，類器官形成效率降低。將分離的隱窩與ΙμΜ Newport Green-DCF (Molecular probe) 一起在 PBS+0. 1% Pluronic 127 (Sigma)中於室溫孵育3分鐘，隨後用PBS洗滌。在這之後，將隱窩包埋入基質膠中，並用上文所述的標準條件進行培養。圖21.胃的類器官培養的效率。(a)從Lgr5_GFP小鼠的胃幽門部分離的胃腺的GFP(箭頭，指示GFP陽性細胞)和DIC圖像。細胞核用DAPI染色。放大倍數63X; (b)用 EGF (E)、R-spondin 1 (R)、Noggin (N)、EGF+R-spondin 1 (ER)、EGF+Noggin (EN)、 EGF+R-spondin 1+Noggin (ERN) >EGF+R-spondin l+Noggin+ffnt3A (ERNW)或 EGF+R-spondin l+Noggin+ffnt3A+KGF (ERNWK)以100個胃腺/孔進行接種(兩個平行樣品)。在2、5和7天後對胃的類器官的數量進行計數。結果顯示為2個獨立實驗的平均值士標準誤。(b)用補充有a中所述的其它生長因子的Wnt3A重組蛋白(ENRWK)或Wnt3A條件培養基(ENRWCMK) 以100個胃腺/孔進行接種(兩個平行樣品)。在接種後第7天和第一次傳代後的第2天對出芽的類器官的數量進行計數。圖22.胃的類器官的體外形成。(a)分離的胃腺長成類器官。來自接種後第1、2、 5和7天的差分幹涉相差圖像。放大倍數10X(第1、2、5天)。第7天的放大倍數為4X， 插圖為IOX。(b)每4-7天通過機械解離對培養物進行傳代。培養物已生長至少1個月。 代表性的圖像顯示來自不同代的類器官的出芽結構。第1代(P1)、第2代(P2)和第4代 (P4)分別代表第8、11、20天。圖23.胃腺的標誌物(a)來自Lgrf-LacZ小鼠的胃培養物。接種後第5天，在胃出芽中檢測到LacZ表達(參見箭頭，指示LacZ陽性細胞(深灰色))，表明存在Lgr5陽性細胞。放大倍數為20X。(b)Ki67染色(黑色)顯示位於腺樣結構基部的陽性增殖細胞。 (c)存在於類器官的腔內的半胱天冬酶3 (深灰色)凋亡細胞(d)存在於胃的類器官中的胃粘蛋白5AC(深灰色)陽性細胞。Lu:類器官腔。放大倍數20X。圖24.胰管可在體外形成胰腺樣的類器官。在存在EGF、Noggin、R-spondin 1和 KGF的條件下培養新鮮分離的胰管。來自接種後第0、4和14天的差分幹涉相差圖像。圖25.在體外培養約3周後形成胰島樣結構。來自接種後第21天的差分幹涉相差圖像。圖26.用單獨的介質(A)或R-Spondin(B)注射Axin-LacZ小鼠。2天後，分離胰腺，並通過X-gal染色檢測LacZ表達的存在。B的中間的圖顯示更大放大倍數的導管，所述導管為LacZ陽性染色，表明Axin-LacZ沿胰管內襯表達。左圖顯示位於泡心細胞或閏管細胞中的小導管細胞表達AXin2-LaCZ(用黑色箭頭指示實例)。在每幅圖的角落顯示放大倍數。在野生型小鼠中進行胰管結紮。在PDL後的不同時間，分離胰腺，並將獲自PDL和非 PDL區域的組織切片進行H&E染色。顯示每個時間點的放大倍數(C)。在wt和AXin2-LaCZ 小鼠中進行胰管結紮。PDL後7天，分離胰腺，並通過對固定的組織切片(D)或整體固定的器官組織塊(E)進行X-gal染色來測定AXin2-LaCZ表達。白色圓圈指示胰腺的結紮部位。PDL後5天，胰腺組織切片中Ki67的表達(用箭頭指示實例)。顯示放大倍數。(F)用 R-spondin體內處理2天之後，胰腺組織中BrdU的併入(用箭頭指示實例)。顯示放大倍數。(G)在從經歷PDL或對照手術的小鼠獲得的胰腺組織中，利用Q-PCR測定Lgr5mRNA表達。在PDL胰腺中，對PDL區域和非PDL區域進行Q-PCR。(H)顯示了與TATA盒結合蛋白 (tbp)相比的Lgr5表達的倍數提高，TATA盒結合蛋白是一種管家基因。PDL後13天，分離胰腺，並用對固定的組織切片進行X-gal染色來測定Lgrf-LacZ表達。用黑色箭頭指示著色細胞的實例⑴。圖27.從野生型小鼠分離胰管組織塊之後，在不同時間點所採集的體外生長在EM 中的胰管組織塊的圖像(A，頂圖)。泡心細胞未生長超過7天，7天後泡心細胞破裂(A，底圖)。胰腺組織塊在存在或不存在 EGF (50ng/ml)、R-spondin (1 μ g/ml)、FGFlO (lOOng/ml) 或Noggin (lOOng/ml)的條件下生長。在用新鮮分離的胰腺組織塊起始培養後7和14天， 採集培養物圖像。無EGF的培養物不能存活超過10天(B)。從Axin2-LacZ小鼠分離的胰腺組織塊在不存在或存在R-spondin (1 μ g/ml)的條件下培養3天。X_gal染色顯示，僅在存在R-spondin的條件下，3和14天之後的導管細胞中表達Wnt響應性Axin-LacZ (用白色箭頭指示實例)。在腺泡或小島細胞中沒有檢測到X-gal染色(C)。從Lgrf-LacZ小鼠分離導管組織塊，並在不存在或存在R-spondin的條件下培養3天。如X-gal染色所示， Lgr5-LacZ的表達顯示芽的頂部上的Lgr5+細胞，這與其在PDL後的表達相似(D)。對獲自胰腺組織塊並在存在Wnt激動劑R-spondin的條件下進行培養的細胞進行FACS染色。對細胞進行EpCAM(廣譜上皮細胞標誌物)和LacZ染色(螢光素二吡喃半乳糖苷，FDG)。當在存在Wnt信號的條件下培養胰腺組織塊時，Lgr5+細胞的百分比顯著增加(E)。圖28.從PDL處理後7天的小鼠分離胰腺，並用EpCAM_APC和LacZ的螢光底物 (FluoroReporter試劑盒)對胰腺細胞進行染色，分選，並在含有50% Wnt3A條件培養基和 IOmM Y-27632的EM中培養4天。4天之後，將培養基換成無Wnt和Y-27632的EM培養基。 在指定的天數採集圖像，並顯示為40X的放大倍數。圖29.將胰腺的類器官從EM轉移至DM。從擴增培養基去除FGFlO (即得到DM)的效應誘導分化成為小島。在DM中培養胰腺的類器官10天，之後可在體外檢測到小島樣結構。顯示存在和不存在FGFlO的條件下的培養物的圖像(A)，並且通過PCR檢測，顯示某些分化標誌物(Ngn3和生長抑制素)的表達提高。Hprt是管家基因(B)。在轉移至DM之後的幾個時間點，利用PCR評估多個標誌物的表達(C)。從胰腺包囊至β細胞樣結構(D)的形態改變伴隨某些β細胞標誌物的出現，例如通過免疫螢光所檢測的胰島素和C-肽(E)。 正如Ngn3的陽性免疫螢光染色所示，DM中存在R-spondin是β細胞祖細胞再生所必需的 (白色箭頭指示實例)(F)。圖30.人胰腺組織塊是新鮮分離的，並培養在EM中。在起始培養之後指定的時間點採集培養物的圖像。圖31.體外隱窩培養物產生Wnt配體(A) Wnt通路的圖示。當Wnt配體被分泌時，其可以自分泌或旁分泌激活Wnt信號通路。Porcupine對於適當的Wnt配體分泌至關重要。IWP抑制劑抑制Wnt配體分泌。(B)在如實施例1中所示的正常條件下培養的小鼠的類器官。(C)小鼠的類器官培養物與1 μ M IWP —起孵育導致類器官培養物的細胞死亡。(D)添加Wnt3a條件培養基增強小鼠的類器官培養物。(E)通過添加Wnt3a條件培養基挽救IWP誘導的類器官死亡。(B-E)所示的放大倍數為IOX。圖32.人腸隱窩培養的建立在補充有EGF、Noggin和Rspondin並且含有Wnt3a條件培養基(A，B, E，F)和不含Wnt3a條件培養基(C，D，G，H)的培養基中3天(A、C、E、G)和5天(B、D、F、H)之後，從小腸(A-D)和結腸(E-H)培養出的人的類器官。圖33.胃的類器官培養的建立(A)用 EGF (E) 、 R-spondin 1 (R) 、No g g i η (N) 、EGF + R-s ρ ο η d i η 1 (ER)、EGF+Noggin(ΕΝ)、EGF + R-spondin 1+Noggin(ERN)、EGF + R-spondin l+Noggin+ffnt3A (ERNW)、EGF+R-spondin l+Noggin+ffnt3A+FGF10 (ERNWF)、EGF+R-spondin 1+Noggin+對照條件培養基+FGFlO (ERNCCMF)或 EGF+R-spondin l+Noggin+Wnt3A 條件培養基+FGFlO (ERNWCMF)以總共100個胃腺/孔進行接種(兩個平行樣品)。在2、5和7天之後，對胃的類器官的數量進行計數。將結果顯示為2次獨立實驗的平均值士標準誤。(B)用Wnt3A條件培養基(ENRWCM)或補充有FGFlO的Wnt3A條件培養基 (ENRffCMF)以總共100個胃腺/孔進行接種(兩個平行樣品)。培養7、15 (第2代)和60 天(第10代)之後，對出芽的類器官的數量進行計數。(C)在補充有 FGF7/KGF(K)或 FGFlO(F)的 Wnt3A 條件培養基(WCM) +EGF+Noggin 和R-spondin中以總共100個胃腺/孔進行接種，使用的FGF7/KGF (K)或FGFlO (F)的濃度為100和lOOOng/ml。培養4天(第7代)之後，對出芽的類器官的數量進行計數。顯示了代表性的實驗。(D)分離的胃腺發育成為類器官。接種後1、2、3、4、7天的差分幹涉相差圖像。1 周后，培養物需要以1 5或1 6進行傳代。按補充材料和方法部分所描述進行傳代培養和維持。培養15天、3個月、4. 5個月和6個月之後的培養物的代表性圖像(放大倍數為 10X)。(E)在對照條件培養基中生長5天的培養物的實例。觀察到該培養物沒有生長，並且未能形成腺體結構。在這些條件下，所述培養物存活不超過7天。(F)在培養3個月的胃的類器官的全標本包埋E-鈣粘附蛋白染色。圖34.單個Lgr5ratt細胞在體外成為長期存活的胃的類器官。(A)從Lgr5-EGFP-ireS-CreERT2小鼠的胃中新鮮分離的幽門胃單元的共聚焦分析。箭頭指示GFPs (灰色)、GFP (黑色)和GFp_re(白色)的不同群。(B)根據GFP表達水平，Lgr5-EGFP ,^細胞可與GFPte和GFP_ve群相區分。FSC 前向散射。(C)從單個!^!^,^細胞長成類器官的代表實例。箭頭指示第7天時腺樣結構的芽的形成。初始放大倍數第1-4天為40X放大倍數，第5-6天為20X放大倍數，第7_8天為10X放大倍數和第9天為5X放大倍數。(D)將來源於單一 Lgr5ratt細胞的類器官解離，並每5-7天進行傳代。3個月的培養物的代表圖像。初始放二大倍數左圖為4X放大倍數，右圖為10X放大倍數。(E)從單個GFPs細胞長出的14天的胃培養物中的表達Lgr5 EGFP的細胞的共聚焦分析。觀察到Lgr5-GFPratt細胞位於腺體結構的基部(白色箭頭；10X放大倍數)。(F)用胸苷類似物EdU(紅色)培養類器官1. 5小時。只有腺結構能併入EdU(白色箭頭；20 X放大倍數)。復染劑4，6_ 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI ；細胞核)。(G)用他莫西芬體外刺激來自Lgr5-EGFP-ires-CreERT2/Rosa^_YFP報告基因小鼠的單細胞培養物的2周長的培養物20小時，並在指定天數進行成像。YFP螢光(黃色) 顯示分散的單個黃色細胞(第1.5天)在體外產生多個後代。觀察到YFPratt細胞向中央腔遷移(白色虛線的圓)。(H)來自！^沖&^單細胞的2月長的培養物的胃特異性基因的表達分析。培養物保持在高Wnt3A培養基中(左圖)或低Wnt3A培養基中(中圖)。觀察到胃來源的培養物對腸特異性基因是陰性的(右圖)。(I)培養物在低Wnt3A培養基中保持至少10天。上圖ECad染色的共聚焦圖像 (紅色，上皮來源的類器官)。復染劑=Hoescht 33345(藍色)。下圖用Tff2 (褐色，頸粘液細胞)、高碘酸-雪夫(紅色，小凹細胞)、MUC5AC(褐色，小凹細胞)和嗜鉻粒蛋白A (褐色，腸內分泌細胞)進行染色的石蠟切片。 實施例實施例1 小腸隱窩和絨毛的體外培養材料和方法小鼠使用6-12周齡的遠交系小鼠。之前描述了 Lgr5-EGFP-Ires-CreERT2等位基因1的產生和基因型分型^ Rosa^-IacZ或YFP Cre報告基因小鼠獲自Jackson Labs。隱窩分離、細胞解離和培養通過在4°C下在2mM EDTA/PBS中孵育30分鐘使隱窩從鼠小腸釋放。對分離的隱窩進行計數並離心。將500個隱窩與50μ1基質膠 (BD Bioscience)混合，並接種於M孔板中。基質膠聚合之後，添加500 μ 1隱窩培養基(具有生長因子(10-50ng/ml EGF(Peprotech) ,500ng/ml R-spondin I11 和 100ng/ml Noggin(Peprotech)的改進DMEM/F12)。對於分選實驗，將分離的隱窩於37°C在培養基中孵育45分鐘，隨後用玻璃移液管重懸。使解離的細胞通過20-μ m的細胞過濾器。通過流式細胞儀(MoFlo，Dako)分選GFPS、GFPte或GFP細胞。通過前向散射、側向散射和脈衝寬度參數以及碘化丙啶的負染來為單一活上皮細胞畫門。將分選的細胞收集在隱窩培養基中， 並以1細胞/孔埋入含有Jagged-I肽(Ana Spec, 1 μ Μ)的基質膠(96孔板，5 μ 1基質膠) 中。用含有Υ_27632(10μΜ)的隱窩培養基(48孔板為250 μ 1，96孔板為100 μ 1)覆蓋。每隔一天添加生長因子，並且每4天更換全部培養基。為了傳代，將類器官從基質膠移出，機械解離成單隱窩結構，並轉移至新的基質膠中。每1-2周以1 5的比例進行傳代。試劑鼠重組EGF 和 Noggin 購自 P印rotech。人重組 R-spondin I11、 Y-27632 (Sigma)、4_羥基他莫西芬(Sigma)和Edu (Invitrogen)用於培養實驗。以下抗體用於免疫染色抗溶菌酶(Dako)、抗突觸素(Dako)、抗BrdU(Roche)、抗β-聯蛋白(BD Bioscience)、抗E-鈣粘附蛋白(BD Bioscience)、抗平滑肌肌動蛋白(Sigma)、抗EphB2 和B3 (R&D)、抗絨毛蛋白、抗Muc2、抗嗜鉻粒蛋白A (Santa Cruz)、抗半胱天冬酶-3 (Ce 11 Signaling)。隱窩分離將分離的小腸縱向剖開，用冷PBS洗滌。將組織切成約5mm的小塊， 再用冷PBS洗滌。將組織塊在含2mM EDTA的PBS中冰上孵育30分鐘。去除EDTA介質之後，用冷PBS和IOml移液管用力懸浮組織塊。上清是絨毛部分，將其棄去；用PBS重懸沉澱。再一次用力懸浮和離心之後，上清富集了隱窩。將該部分通過70 μ m的細胞過濾器(BD bioscience)，以去除殘留的絨毛。將分離的隱窩於300rpm離心3分鐘，以使隱窩與單細胞分離。最終的部分由基本上純的隱窩組成，並用於培養或單細胞解離。他莫西芬誘導和X-gal染色為了活化CreERT2，將隱窩與低劑量的4_羥基他莫西芬(IOOnM) —起孵育12小時，並在隱窩培養基中培養。按之前的描述1進行X-gal染色。 在未經4-羥基他莫西芬處理時未觀察到染色。電子顯微鏡分析按之前的描述S將包含隱窩的類器官的基質膠於室溫在 Karnovsky' s固定劑O %多聚甲醛、2. 5 %戊二醛、0. IM 二甲砷酸鈉、2. 5mM CaCl2和5mM MgCl2, pH 7.4)中固定5小時。將樣品包埋入Epon樹脂中，用Phillips CMlO顯微鏡 (Eindhoven, The Netherlands)進行檢查。微陣列分析結腸隱窩、小腸隱窩和類器官的基因表達分析。將從兩隻小鼠新鮮分離的小腸隱窩分成兩部分。從一部分直接分離RNA(RNeasy微型試劑盒，Qiagen)，將另一部分培養一周，之後進行RNA分離。我們按照生產商的說明書製備了標記的cRNA(Agilent Technologies)。在兩染料互換實驗中，將來自兩隻小鼠的小腸隱窩和類器官的差異標記的 cRNA分別與4X44k Agilent全小鼠基因組雙色微陣列(G4122F)雜交，得到四個分別的陣列。此外，在兩染料互換實驗中，將分離的結腸隱窩與差異標記的小腸隱窩雜交，得到四個分別的陣列。用 Feature Extraction(V. 9. 5. 3，Agilent Technologies)檢測微陣列信號禾口本底信息。用 ArrayAssist (5. 5. 1, Stratagene Inc.)禾口 Microsoft Excel (Microsoft Corporation)對所有的數據進行分析。通過扣除局部本底校正原始信號強度。為了允許計算僅存在於一個通道(小腸隱窩或類器官)或(小腸隱窩或結腸隱窩)中的特徵強度之間的比值，將負值轉變為接近0的正值(局部本底的標準差)。通過應用Lowess算法進行標準化，並且如果兩種(小腸隱窩或類器官)或(小腸隱窩或結腸隱窩)強度均改變或如果兩種強度均小於本底信號的2倍，則濾掉個體特徵。此外，濾掉不一致的特徵。數據可在 GEO (Gene Expression Omnibus (基因表達彙編)，號碼 GSE14594)公布時獲得。用 Cluster 3(距離城市街，相關性平均連鎖)對小腸/結腸隱窩和類器官的標準化的強度(Feature Extraction中處理過的信號)進行無監督分級集群，並用TreeView可視化。如果基因在所有陣列中都一致地表現出在類器官或隱窩中提高大於3倍，則認為所述基因顯著改變。成像分析用共聚焦顯微鏡(Leica，SP5)、倒置顯微鏡(Nikon DM-IL)或立體顯微鏡(Leica，MZ16-FA)採集隱窩的類器官的圖像。對於免疫組化，用4%多聚甲醛(PFA)於室溫將樣品固定1小時，並用標準技術1加工石蠟切片。按之前的描述1進行免疫組化。對於全包埋免疫染色，用分散酶(Irwitrogen)從基質膠分離隱窩的類器官，並用4% PFA固定， 隨後用0. Triton-X進行透化。按生產商的方案進行EdU染色(Click-IT，Invitrogen)。 利用DAPI或ToftO-3 (Molecular Probe)對DNA進行染色。用共聚焦顯微鏡(Leica，SP5) 獲取3D圖像，並用Volocity軟體(Improvision)重建。結果在成年哺乳動物中，腸上皮是自我更新最快的組織。我們最近證實，在小腸隱窩基部存在大約6循環Lgr5+幹細胞^我們目前已經建立了長期培養條件，在該條件下單個隱窩經歷多次隱窩分裂事件，並同時產生絨毛樣上皮結構，在所述絨毛樣上皮結構中存在所有分化的細胞類型。單分選的Lgr5+幹細胞也能起始這些隱窩-絨毛的類器官。追蹤實驗表明，Lgr5+幹細胞的分級保持在類器官中。我們推斷，腸隱窩-絨毛單元是自組織結構，其可以在不存在非上皮細胞龕的條件下從單個幹細胞進行組建。自我更新的小腸上皮排列成隱窩和絨毛2。細胞在隱窩中新生成，並在絨毛頂部通過凋亡而喪失，導致小鼠中的更新時間為5天。一直以來都認為自我更新的幹細胞定居在隱窩底部附近，並且產生快速增殖的過渡放大(TA)細胞。估計每個隱窩的幹細胞數量為 4-6個。腸上皮細胞、杯狀細胞和腸內分泌細胞由TA細胞發育而來，並且這些細胞繼續沿著隱窩-絨毛軸在結合帶中遷移。第四種主要的分化細胞類型是帕內特細胞，其定居在隱窩底部。我們最近鑑定出了基因Lgr5，其在散布於帕內特細胞之間的循環隱窩基部柱狀細胞中特異性地表達\利用將GFP/他莫西芬誘導型Cre重組酶盒整合入Lgr5基因座中的小鼠，我們通過譜系追蹤顯示，Lgr5+細胞構成產生所有上皮細胞類型的多能幹細胞S甚至在 Cre誘導14個月後評估時也是如此3。
儘管已經描述了多種培養體系4_7，但是還沒有建立能維持基本隱窩-絨毛生理機能的長期培養體系2。將小鼠隱窩製備物懸浮於基質膠中。隱窩生長需要EGF和R-spondin 1 (圖la)。 傳代需要Noggin (圖lb)。培養的隱窩表現出定式(圖加)。上面的開口迅速閉合，腔充有凋亡細胞。隱窩區經歷連續的出芽事件，暗示隱窩分裂17。帕內特細胞總是存在於出芽位點。大部分的隱窩是可以培養的(圖2b)。進一步的擴增產生了包含>40個隱窩結構的類器官，所述隱窩結構位於襯有絨毛樣上皮(「絨毛結構」)的中央腔的周圍(圖2c-e)。E-鈣粘附蛋白染色顯示出單細胞層(數據未顯示)。每周將類器官機械解離，並以1/5的預接種密度進行重新接種。培養>6個月的類器官沒有喪失以下描述的特徵。利用微陣列的表達分析表明，例如當與新的結腸隱窩比較時，類器官與新鮮分離的小腸隱窩高度相似(圖3)。Lgr5-EGFP-ires-CreERT2隱窩的培養表明，Lgr5_GFP+幹細胞與帕內特細胞在隱窩基部混雜在一起。通過細胞核β -聯蛋白(圖如，圖5)和Wnt靶基因Lgr5(圖2d)和 EphB218(圖4b)的表達所證實的Wnt激活限於隱窩。凋亡的細胞脫落進中央腔，這是表明體內凋亡的細胞在絨毛頂部脫落的過程(圖4c)。培養超過3個月的類器官的中期染色體塗片(Metaphase spread) 一致地顯示40個染色體/細胞(n = 20)(圖4d)。意外地，我們沒有發現存在成肌纖維細胞或其它非上皮細胞的證據(圖6)。我們將來自與Cre-可激活的R0Sd6-LaCZ報告基因小鼠雜交的 Lgr5-EGFP-ires-CreERT2小鼠的隱窩進行培養，以允許譜系追蹤。用低劑量的他莫西芬誘導之後，我們立即觀察到單一標記的細胞(圖4e，g)。這些細胞中大於90%產生了完全藍色的隱窩(圖4e-g)，這表明Lgr5-GFP+細胞確實保留了幹細胞特性。來自Cre-可激活的 Rosde-YFP報告基因19小鼠的隱窩允許通過共聚焦分析進行譜系追蹤。他莫西芬處理之後，我們立即觀察到單一標記的細胞，這些細胞在隨著接下來數天內誘導譜系追蹤，在新鮮分離的隱窩(圖7a-c)和建立的類器官(圖7d)中都觀察到該現象。二最近，在體外從單一幹細胞建立了乳腺上皮結構21。當分選單一 Lgr5_GFPS細胞時，這些細胞立即死亡。Mio激酶抑制劑Y-27632顯著降低了這種細胞死亡。發現Notch激動肽u能支持增殖性隱窩η。在這些條件下，大量的Lgr5-GFPS細胞存活並且形成大的隱窩的類器官。當接種GFPte後代細胞時，很少形成類器官(圖8d)。多個Lgr5-GFPS細胞與帕內特細胞在隱窩基部混雜在一起(圖8e-f)。EdU(胸苷類似物)的併入表明隱窩中存在 S期細胞(圖8g)。我們以1個細胞/孔分選細胞，肉眼檢查單細胞的存在，並追蹤隨後的生長。在4 個單獨實驗的每一個中，我們鑑定出並追蹤到100個單細胞。平均大約6%的
胞長成類器官，而其餘的細胞通常在最初的12個小時內死亡，據推測是由分離程序所固有的物理和/或生物脅迫所致。GFPte細胞幾乎不能長成類器官(圖9a)。圖9b和圖10顯示從單個Lgr5-GFPS細胞長成的類器官。在培養4天時，結構由大約100個細胞組成，這符合增殖性隱窩細胞的12小時的細胞周期^(圖9c)。2周後，將類器官解離成單細胞，並進行再接種來形成新的類器官(圖9d)。按照每兩周一次，該程序可重複至少四次，而不會明顯丟失再接種效率。似乎難以將單一幹細胞來源的類器官與來自整個隱窩的類器官區分開來。帕內特細胞和幹細胞位於隱窩底部(圖8e、f、圖11c，g)。通過絨毛蛋白+成熟的刷邊緣和頂部鹼性磷酸酶所證實的完全極化的腸上皮細胞襯於中央腔(圖11a、e、i)。杯狀細胞(Muc2+，圖 lib ；PAS+,圖Ilf)和腸內分泌細胞(嗜鉻粒蛋白A+，圖Ild ；突觸素+，圖Ilh)分散於類器官結構中。利用電子顯微鏡識別出4種成熟細胞(圖lli-Ι)。不存在非上皮(基質/間充質)細胞，通過EM成像進行證實(圖lli-p，圖12c-g)。隱窩(圖llm，o)和中央腔上皮 (圖lip)兩者均由單層極化上皮細胞組成，所述細胞直接位於在基質膠載體上。這些EM圖片的高解析度圖像呈現在圖5中。具有紅色E-鈣粘附蛋白染色和藍色細胞核復染的類器官表明類器官上皮的單層性質(數據未顯示)。公知的是，上皮隱窩與上皮下的成肌纖維細胞密切接觸％_28，並且通常認為後一種細胞在隱窩基部產生了特化的細胞龕27~29~3°。這種龕會產生特有的環境來錨定和支持腸幹細胞。目前，我們證實，利用限定組的一致存在的生長信號可以建立自我更新的上皮。儘管如此，分離的幹細胞會以高度定式自發產生不對稱性。這迅速導致隱窩樣結構的形成，重新產生的幹細胞和帕內特細胞位於其基部，並充有TA細胞。這些隱窩樣結構進入由有絲分裂後的腸上皮細胞組成的絨毛樣腔結構中，其中凋亡細胞被夾斷入腔中，這表明細胞在絨毛頂部丟失。意外觀察到暴露於均勻促生長環境中的單細胞能產生不對稱的結構，這在Wnt 通路的研究上是非常明顯的。儘管所有的細胞均暴露於R-spondin 1，但是只有隱窩中的細胞表現出激活的Wnt信號轉導的特徵，即細胞核聯蛋白和Wnt靶基因的表達。顯然， 對Wnt信號轉導的差異性響應才是隱窩絨毛軸形成的核心，而不是對細胞外Wnt信號的差異性暴露。總之，我們推斷，單個!^沖&^腸幹細胞能獨立於來自其環境的位置信號而運作， 並且其可以產生連續擴增的，自組織的、類似正常的腸道的上皮結構。所述的培養體系會簡化幹細胞驅動的隱窩-絨毛生物學研究。此外，它會為再生醫學和基因療法開闢新的途經。實施例2結腸隱窩和絨毛的體外培養材料和方法Wnt3a條件培養基將表達Wnt3a配體的細胞系和無Wnt3a配體的相同細胞系(對照培養基)培養 3-4周的時間。一旦細胞達到匯合停止生長時，它們就會產生Wnt3a。收穫培養基，並在 TOPflash測定中進行檢測、TOPflash測定是利用TCF反應元件-Iuc構建體(TOP)和在TCF 反應元件中具有突變的相同構建體(FOP)的螢光素酶測定。對於用於培養的培養基，TOP/ FOP的比應該大於20。當用於培養來再生組織時，將所述培養基稀釋成25-50%。剖開新鮮分離的結腸，用PBS或DMEM洗滌，並將其切成小塊。將組織塊與2mM EDTA/PBS—起在4°C下輕輕搖動孵育1小時。去除EDTA溶液之後，用IOml移液管用力將組織塊懸浮於IOml冷PBS中。棄去含有殘渣的第一上清液，並用10-15ml PBS懸浮沉澱物。再一次用力懸浮組織塊之後，上清液富集結腸隱窩。將組織塊離心沉澱，與基質膠混合，並按小腸的類器官培養體系進行培養。將基質膠於37°C孵育5-10分鐘。基質膠聚合之後，添加500 μ 1組織培養基(50%改進DMEM/F12/50% Wnt-3a條件培養基，補充了 200ng/ml N-乙醯半胱氨酸、50ng/ml EGFU μ g/ml R-spondinl、100ng/ml Noggin、IOOng/ ml BDNF(P^rotech))。每2-3天更新全部培養基。對於傳代，用1000 μ 1移液管從基質膠取出類器官，機械解離成小組織塊，並轉移至新鮮的基質膠。至少每兩周一次以1 4的分種率(split ratio)進行傳代。在這些條件下，使培養物維持至少3個月。
結果與小腸的類器官相比，結腸的類器官生長較慢且效率較低。在與小腸相同的生長因子條件下，從遠端結腸分離的結腸隱窩中小於5%生長並形成類器官結構(圖13K從結腸的近端部分長出結腸隱窩是困難的。由於我們在微陣列分析(結腸Lgr5-GFPS細胞與結腸Lgr5-GFP 細胞相比)中發現BDNF(腦源性神經營養因子)的受體trkB的上調， 我們確定了 BDNF對結腸的類器官的作用。我們一直能觀察到，BDNF+培養中的培養效率高於BDNF-培養大約2倍。通常，一個結腸的類器官含有大約10個隱窩結構(圖14)。沒有檢測到帕內特細胞，這符合它們的來源。與小腸的類器官相比，結腸隱窩在隱窩基部沒有產 Wnt-3a的帕內特細胞，因此補充Wnt-3能提高結腸隱窩的培養效率，但是對小腸隱窩沒有作用。通常，當添加Wnt-3a條件培養基時，我們獲得了高達30%的培養效率(圖15)。總之，利用上述條件，可以在體外保持和增殖來源於小腸和結腸的隱窩，使得該所述的第一培養方法能在人工體系中產生腸上皮。實施例3腺瘤的體外培養材料和方法(參見實施例1)結果一直以來都難以在體外培養腺瘤。由於上述條件從小腸和結腸成功地培養出健康的隱窩，因此意圖確定相似的條件是否能在體外維持腺瘤。使用2.5mM EDTA從APC-/-小鼠分離出腺瘤之後，在與上述相似的條件下培養單個腺瘤。重要的是，這些條件足以維持腺瘤的體外生長，而R-spondin已變得多餘。通過以下事實可以容易解釋這點不再需要誘導 Wnt信號通路，因為這些細胞中不存在APC，所以它們會自動產生細胞核β-聯蛋白。這使得Wnt激動劑R-spondin在腺瘤的體外培養中是多餘的。圖16a和更大放大倍數的圖16b 顯示，在正常的隱窩的類器官中可以看到隱窩發芽帶有中央腔，但與此相反，腺瘤的類器官只生長為包囊。死細胞脫落進腔中，這可以從腔中存在的大量的死細胞推斷出。在正常的隱窩的類器官中，細胞核β-聯蛋白僅見於隱窩-結構的基部(參見圖如)。在腺瘤的類器官(圖16c和更大放大倍數的圖16d)中，細胞核β-聯蛋白可見於每個上皮細胞中，這符合APC基因突變。這些類器官可以無期傳代。還檢測了利用前述的培養條件(無R-spondin)來源於Lgr5-EGFP-Ires_CreERT2/ APCflox/flox小鼠中的腺瘤的單一 Lgr5+分選細胞是否能在體外形成相似的腺瘤的類器官。事實上，情況正是如此，所獲得的類器官與利用完整腺瘤作為體外培養起始材料所獲得的類器官在結構上高度相似(數據未顯示)。實施例4檢測其它Wnt激動劑的效果為了確定其它Wnt激動劑是否與R-spondin具有相同的效果，即促進隱窩_絨毛的類器官的體外形成，將可溶性Wnt3a添加到Lgr5+分選的單細胞中，並評價其對體外隱窩-絨毛形成的效果。材料和方法分選出Lgr5_GFPS細胞，並在正常單細胞培養條件(如上文所述的用於單細胞的 EGF、noggin、R-spondin、Notch 配體和 Y-27632)之外，添加或不添加 Wnt3a (100ng/ml)進行培養。我們接種100個細胞/孔，並在接種後14天，對類器官的數量進行計數。
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分離的隱窩與ΙμΜ Newport Green-DCF(MolecularProbes) —起在 PBS+0. 1 % Pluronic 127 (Sigma)中於室溫下孵育3分鐘，隨後用PBS洗滌。洗滌之後，將隱窩包埋入基質膠中，並使用上文所述的標準條件進行培養。結果在不存在R-spondin的條件下添加對集落形成沒有任何效果在不存在 R-spondin的條件下形成很少集落，甚至沒有形成集落。然而，在存在R-spondin的條件下， 僅在存在Wnt3a時觀察到類器官形成的效率提高(圖17)。這表明，兩種因子彼此支持它們的能力，從而刺激並支持幹細胞分化為完整的上皮細胞層形成所必需的所有細胞。目前的假說是在信號轉導通過Frizzled之前，R-spondin負責抑制Frizzled的共受體LRP6的內化。一旦Wnt因子與Frizzled和共受體LRP6結合，Wnt信號通路被激活31。當細胞表面存在LRP6時，將發生Wnt激活(圖18)。因此，如果培養基中不存在R-spondin，Wnt3a將不能激活Wnt通路，因為LRP6被內化，並且不能與Wnt因子聯合用於信號轉導，從而阻止了 Wnt通路的激活。Wnt3a是一種可溶性因子，在生理條件下，其由帕內特細胞產生。這些細胞通常鄰近於幹細胞(圖19)，假設的是這些細胞支持腸上皮細胞層的不斷分化。同樣由帕內特細胞分泌的其它Wnt因子是Wnt6、9b和11。據推測，Wnt6與Wnt3a對幹細胞分化具有相同的效應。這些發現支持這樣的看法，帕內特細胞對幹細胞龕的形成至關重要。這些數據是出人意料的，因為對於幹細胞龕已有很多推測，但是目前還沒有實驗數據支持存在這樣的龕。對存在幹細胞龕的其它支持來自帕內特細胞被選擇性殺死的實驗。從小鼠小腸分離隱窩，並在存在特異性地去除帕內特細胞的鋅螯合劑32的條件下進行體外培養。以非常低的濃度使用鋅螯合劑並持續很短的時間，使得其僅影響隱窩中的帕內特細胞而不影響其它細胞。用鋅螯合劑處理之後，對類器官形成進行評價。當在初始隱窩中不再存在帕內特細胞時，觀察到類器官形成顯著降低(圖20)。在存在Wnt3a的條件下，該降低被部分地恢復(數據未顯示)。這支持了帕內特細胞在維持幹細胞龕中的作用，其支持隱窩中Lgr5+幹細胞的分化。實施例5培養條件同樣支持胃的類器官的生長胃由3個局部解剖區域(胃底部，胃體部和胃竇)和2個功能性腺區(泌酸的和幽門的)。泌酸腺區包括該器官的80%，而幽門部包括該器官的20%。哺乳動物胃上皮被組織成由平面狀表面上皮、短的小凹和長的腺體組成的胃單元。小凹襯有粘液分泌細胞，而腺體由分散於以下三個區域中的分泌細胞組成峽部、頸部和基部。胃上皮不斷地更新。我們實驗室進行的追蹤研究表明，位於腺體基部的LGR5陽性細胞滿足幹細胞性的定義(Barker et al.準備中)。迄今而至，胃單層培養物不能覆蓋胃單元的特徵，胃單元是由數種分化的胃細胞形成。此外，3-D培養法體系僅報導了重建高度分化的胃表面粘液細胞，而沒有出現任何內分泌細胞。而且，這些培養僅進行了 7天的時間，因此表現出缺乏自我更新的能力 (Ootani A, Toda S, Fujimoto K, Sugihara H.Am J Pathol. 2003 Jun ； 162 (6) :1905-12)。 這裡我們開發出一種從鼠胃的幽門部分離胃單元的方法，並且已開發出一種能表現出更長保持時間的3D-培養體系。材料和方法胃單元分離將分離的胃縱向剖開，並用冷的改進DMEM/F12(InVitr0gen)洗滌。在體視鏡下，切下幽門部，並與胃體和前胃分離，用鑷子小心地將幽門黏膜與肌肉層分離。然後，將組織切成大約5mm的小塊，並再一次用冷的分離緩衝液(Na2HPO4 28mM+KH2P04 40mM+NaCl 480mM+KCl 8mM+蔗糖220mM+D-山梨醇274mM+DL_ 二硫蘇糖醇2. 6mM)洗滌。將組織塊與分離緩衝液一起在5mM EDTA中於4°C下輕輕搖動孵育2小時。去除EDTA溶液之後，用IOml 移液管將組織塊用力地懸浮於IOml冷的分離緩衝液中。棄掉含有死細胞的第一上清液，並用10-15ml冷的分離緩衝液懸浮沉澱物。再一次用力懸浮組織塊之後，上清液富集胃單元。 每10-20次懸浮，新鮮的冷的分離緩衝液替換上清液，並將上清液保存在冰上，檢測胃單元的存在。重複該步驟直到胃單元完全釋放，通常為4-5次。將富集胃單元的懸液以600rpm 離心2-3分鐘，以使分離的胃單元與單細胞分離，並將沉澱物用來培養。胃培養按以前部分的描述，通過與5mM EDTA 一起於4°C下孵育2小時而使含有腺體、峽部和凹區的整個胃單元與鼠胃的幽門部分離。對分離的胃單元進行計數並沉澱。將100個胃單元與25μ 1基質膠(BD Bioscience)混合，接種到48孔組織培養板上，並於37°C孵育 5-10分鐘，直到基質膠完全聚合。聚合之後，添加250 μ 1組織培養基(改進DMEM/F12，並補充有 Β27、N2、200ng/ml N-乙醯半胱氨酸、50ng/ml EGFU μ g/ml R-spondin UlOOng/ ml Noggin、lOOng/ml Wnt3A、50或lOOng/ml KGF)。每2天更換全部培養基。為了傳代，用 1000 μ 1移液管將類器官從基質膠移出，機械解離成小組織塊，並轉移至新鮮的基質膠。以 1 4的分種率每周1次或2次進行傳代。在這些條件下，培養物維持了至少1個月。試劑改進DMEM/F12和補充物Ν2和Β-27無血清補充劑購自Invitrogen，N-乙醯半胱氨酸購自Sigma。鼠重組EGF、Noggin和人KGF購自P印rotech，Wnt3A重組蛋白購自Mem Cell Research。對於提到的生長因子，僅檢測了不同濃度的R-Spondin 1和KGF。在50ng/ ml時，R-Spondin 1抑制培養物生長。可以以50或100ng/ml使用KGF，但是濃度為IOOng/ ml時，出芽效率較高。按之前所述，製備Wnt3A 條件培養基(Willert K, Brown JD, Danenberg E, Duncan AW, Weissman IL, Reya Τ, Yates JR 3rd, Nusse R. Nature. 2003May 22 ；423 (6938) 448-52)。免疫組化和成像分析對於X-gal染色，用配製在IOOmM MgCl2 PBS溶液中的0. 25%戊二醛(Sigma)， 將類器官於室溫下直接固定於基質膠中1-2小時。之後，用洗滌溶液(配製在PBS中的 0. 01% 脫氧膽酸鈉+0. 02% NP40+5mM MgCl2)洗 3 次，並在存在 0. 21 % K/e (CN) 6 和 0. 16% K3Fe(CN)6 的條件下，與 lmg/ml X-Gal (Invitrogen) 一起於 37°C下孵育 16 小時。在 PBS 中洗滌之後，用含2% PFA的PBS在室溫下對培養物進行後固定15分鐘。所有的試劑均獲自 Sigma。對於免疫組化，用胰酶(Tryple Select, Invitrogen)從基質膠分離類器官，用 4%的PFA於室溫下將分離的類器官固定1小時，並包埋入石蠟中。用標準技術加工石蠟切片，並按以前所述進行免疫組化。使用以下抗體抗小鼠Ki67(克隆匪1，Monosan) (1 200)、抗兔切割的半胱天冬酶-3 (Cell Signaling Technology) (1 400)和抗人胃粘蛋白5AC(N0V0Castra clone 45M1) (1 200)。在所有情況下都進行檸檬酸鹽緩衝液抗原回收。用Mayer氏蘇木素復染切片。用倒置顯微鏡(Nikon DM-IL)或共聚焦顯微鏡(Leica SP5)來採集胃的類器官和分離的胃腺的圖像。結果目前，胃培養物都是單層生長。然而，單層培養物缺乏覆蓋整個胃單元的特徵的能力，胃單元由數種分化的胃細胞(小凹粘液細胞、腸內分泌細胞和增殖性無粘液細胞)形成。最近我們實驗室通過體內譜系追蹤表明，存在於腸隱窩基部的Lgr5陽性細胞是真正的腸幹細胞(Barker N, van Es JH, Kuipers J, Kujala P, van den Born M, Cozijnsen M, Haegebarth A,Korving J,Begthel H,Peters PJ, Clevers H. Nature. 2007 ;449 :1003-7)。 與腸上皮一樣，胃上皮不斷更新。在幽門胃腺單元底部發現Lgr5陽性細胞，追蹤研究表明， 這些LGR5陽性細胞能表現出自我更新能力和多潛能能力而滿足幹細胞性的定義(Barker et al.準備中)。由於我們已經能從單個Lgr5+細胞培養出3-D結構的腸隱窩，因此意圖確定相似的條件是否能維持幽門胃單元的體外生長。用5mM EDTA分離胃腺單元之後，將胃腺(圖21a)懸浮於基質膠中。胃培養物生長需要 EGF (50ng/ml) ,Noggin (100ng/ml)、R_spondin 1 (1 μ g/ml)和 Wnt3A (lOOng/ml)(圖 21b)。KGF(50或lOOng/ml)對於出芽事件的形成的是必需的，並且因此對培養物的擴增是必需的。因此，培養的幽門單元表現同腸隱窩的類器官一樣。單元開放的上部分是封閉的， 並且腔充有凋亡細胞。新形成的胃的類器官經歷連續的出芽事件(表明腺體分裂)，同時維持它們的極性，胃腺在中央腔出芽。當使用Wnt3A條件培養基時，檢測到出芽形成的效率顯著提高(圖21c)，這表明出芽形成和形態發生的Wnt劑量依賴性，所述Wnt3A條件培養基表現出的Wnt活性高於重組Wnt3A重組蛋白10-100倍。類器官培養至少1個月，而沒有喪失所述特性。每周通過機械解離將類器官以 1 4進行傳代(圖22)。Lgrf-LacZ幽門胃單元的培養表明，胃的類器官中存在Lgr5陽性幹細胞(圖23a)。如Ki67染色所證明，增殖性細胞位於腺樣結構的基部(圖23b)，而發現凋亡的半胱天冬酶3陽性細胞被擠進腔中(圖23c)。胃粘蛋白5AC(MUC5AC)是胃小凹細胞 (也稱為小凹細胞)的特異標誌物。在類器官中發現MUC5AC陽性細胞，這表明至少一種分化的胃細胞譜系的存在(圖23d)。然而，沒有檢測到內分泌腺來源的細胞。因此，需要其它因子。所述因子包括促胃液素釋放肽、Hedgehog和Notch家族的激活劑或抑制劑、Wnt通路的其它激活劑和BMP家族的其它抑制劑、TGF家族的激活劑。實施例6a胰腺的類器官可在體外生長材料和方法將新鮮分離的胰腺切成小塊，並在定軌搖床(80rpm，37 °C )中，在 DMEM(Invitrogen)中與消化酶混合物(300U/ml XI型膠原酶(Sigma)、0. Olmg分散酶 I (Roche)和0. Img DNA酶)一起孵育10分鐘。孵育之後，通過機械吹打使組織塊溫和地解離。使未消化的組織塊以正常重力沉降1分鐘，並將上清液轉移至新管中。使上清液通過 70 μ m的細胞過濾器，並用DMEM洗滌殘留物。用DMEM衝洗倒轉的細胞過濾器來收集細胞過濾器上殘餘的組織塊，並將其離心沉澱。這些組織塊主要由胰腺腺泡組織組成，並且包含胰管。將沉澱與基質膠混合，並按照小腸的類器官培養體系(參見實施例1的材料和方法) 進行培養。將基質膠於37°C孵育5-10分鐘。在基質膠聚合之後，添加500 μ 1組織培養基(補充有 B27、N2、200ng/ml N-乙醯半胱氨酸、50ng/ml EGFU μ g/ml R-spondin UlOOng/ ml Noggin、50 或 lOOng/ml KGF (Peprotech)的改進 DMEM/F12)。每 2 天添加生長因子。每 4-6天更換全部培養基。對於傳代，用1000 μ 1移液管將類器官從基質膠移出，機械解離成小組織塊，並轉移至新鮮的基質膠中。以1 4的分種率每周1次或2次進行傳代。在這些條件下，培養物維持至少2個月。結果在EGF存在下培養3-4天之後，胰腺組織形成了簡單的包囊結構。Noggin和 R-spondin協同增加了包囊結構的大小，但是不影響類器官的形態發生。KGF顯著提高出芽形成和培養效率。利用最佳的生長因子組合(EGF、N0ggin、R-Sp0ndin 1和KGF)，在生長因子的最佳組合中，大於80%的胰管生長。一旦取出培養物中的胰管，胰管立即密封結構的兩端，形成簡單的結構。在起始培養之後7天，大約20%的類器官開始形成出芽結構(圖M)。胰管快速增殖，這與腺泡組織相反，腺泡組織生長非常緩慢。有趣的是，在類器官傳代之後，起始培養之後大約2-3周，觀察到胰島樣結構(圖 25)。在傳代之前通常沒有觀察到這些小島樣結構。這些小島存活至少7天，但增殖非常緩慢或根本不增殖。這些小島樣結構與存在於健康胰腺組織中的郎格罕氏胰島類似。這類小島含有分別產生胰高血糖素和胰島素的α細胞和β細胞等。所觀察到的小島樣結構含有表達胰島素、神經發生素3和Pdx-I的細胞。檢測數種生長因子，以確定它們是否能增加來源於胰腺組織的類器官中胰腺β細胞的存在。候選生長因子包括環巴胺(Sonic-hedgehog 抑制劑)、激活素、GLP (胰高血糖素樣肽)及其衍生物(ExendiM)、促胃液素和煙醯胺。實施例6b胰腺的類器官可在體外生長材料和方法將新鮮分離的胰腺切成小塊，並在定軌搖床(80rpm，37 °C )中，在 DMEM(Invitrogen)中與消化酶混合物(300U/ml XI型膠原酶(Sigma)、0. 01mg/ml分散酶 I (Roche)和0. lmg/ml DNA酶)一起孵育10分鐘。孵育之後，通過機械吹打使組織塊溫和地解離。使未消化的組織塊以正常重力沉降1分鐘。用消化酶混合物對未消化的組織塊再消化10分鐘。重複該消化步驟直到未消化的組織塊主要由胰管組成。在顯微鏡下從未消化的組織塊手動挑出胰管結構。將該胰管與基質膠混合，並按照小腸的類器官培養體系(參見實施例1的材料和方法)進行培養。將基質膠於37°C孵育5-10分鐘。在基質膠聚合之後， 添加500 μ 1組織培養基(補充有1\611^311^1、青黴素/鏈黴素、101111 H印es、B27、N2、IOmM N-乙醯半胱氨酸、10nM[Leu15]-促胃液素 IUOOnM Exendin4、IOmM 煙醯胺、50ng/ml EGF、 1 μ g/ml R-spondin UlOOng/ml Noggin、50■lOOng/ml FGF7(KGF) FGF10(Peprotech) 的改進DMEM/FU)。每2天更換培養基。對於傳代，用1000 μ 1移液管將類器官從基質膠移出，機械解離成小組織塊，並轉移至新鮮的基質膠中。以1 4的分種率每周1次或2次進行傳代。在這些條件下，培養物維持至少10個月。結果在EGF存在下培養3-4天之後，胰腺組織形成了簡單的包囊結構。Noggin和 R-spondin協同增加了包囊結構的大小，但是不影響類器官的形態發生。FGF7 (KGF)/FGF10 顯著提高出芽形成和培養效率。利用最佳的生長因子組合(EGF、Noggin、R-spondin 1和
31FGF7 (KGF) /FGF10)，在生長因子的最佳組合中，大於80%的胰管生長。一旦從培養物中取出胰管，胰管快速密封結構的兩端，形成簡單的結構。在起始培養7天之後，大約80%的類器官開始形成出芽結構(圖M)。胰管快速增殖，這與腺泡組織相反，腺泡組織的生長非常緩慢。有趣的是，類器官在傳代之後，起始培養大約2-3周之後，觀察到胰島樣結構(圖 25)。在傳代之前通常沒有觀察到這些小島樣結構。這些小島存活至少14天，但增殖非常緩慢或根本不增殖。這些小島樣結構與存在於健康胰腺組織中的郎格罕氏胰島類似。這類小島含有分別產生胰高血糖素和胰島素的α細胞和β細胞等。所觀察到的小島樣結構含有表達胰島素、神經發生素3和Pdx-I的細胞。檢測數種生長因子，以確定它們是否能增加來源於胰腺組織的類器官中胰腺β細胞的存在。候選生長因子包括環巴胺(Sonic-hedgehog 抑制劑)、激活素、GLP (胰高血糖素樣肽)及其衍生物(ExendiM)、促胃液素和煙醯胺。實施例7通過驅動Wnt/Lgr5再生響應而進行的成體胰腺祖細胞的體外無阻礙擴增材料和方法小鼠、試劑和組織從以下小鼠獲得胰腺組織=Axin-LacZ敲入小鼠(Lustig et al. Mol. Cell. Biol. 2002)、Lgr5-LacZ 敲入小鼠(Barker et al，2007)、Lgr5_GFP 小鼠(Barker et al, 2007)。用 100 μ g 純化的人 R-spondin 1 (由 A. Abo, Nuvelo Inc, CA, USA 惠贈)腹腔注射 Axin-LacZ小鼠，並在48小時以後處死，用於胰腺中LacZ的表達分析。胰管結紮按照(Wang et al. , 1995)所述的在大鼠中進行結紮的方法並進行某些較小的修改。PDL的實驗步驟如下用氟阿尼酮芬太尼咪達唑侖的混合物分別以 3. 3mg/Kg,0. 105mg/Kg和1. 25mg/Kg的劑量進行腹膜內注射來麻醉動物。以仰臥的姿勢放置動物，將腹部表面去毛，並用抗菌溶液(碘液)清潔。然後，從劍突開始在上前部腹壁製造正中切口，暴露胰腺。在解剖顯微鏡下，定位胰的脾葉，並用7-0聚丙烯縫線單絲在距胃葉管的接點遠端約Imm處結紮胰管。手術後，皮下給予劑量為0. 01-0. 05mg/Kg的止痛劑丁丙諾啡。然後，用5-0絲線縫合腹壁和皮膚。按實施例6所述處理新鮮分離的胰腺，將得到的胰腺組織塊在以下所述的條件下培養。機械分離出主胰管和胰管的第一分支。將組織塊切成小塊，並在定軌搖床(80rpm， 37 °C )中，在DMEM (Invitrogen)中與消化酶混合物(300U/ml XI型膠原酶(Sigma)、 0. 01mg/ml分散酶I (Roche)和0. lmg/ml DNA酶)一起孵育30分鐘。消化後，大多數腺泡細胞從組織塊釋放。使主要由胰管細胞組成的未消化的組織塊以正常重力沉降1分鐘，棄掉上清液。在用PBS洗滌三次之後，將未消化的組織塊在室溫下與2mM EDTA/PBS —起孵育 30分鐘。用力吹打組織塊，並以正常重力沉降1分鐘。將富集導管細胞的上清液轉移到新管中，並用PBS洗滌三次。將導管細胞離心沉澱，並與基質膠混合。將基質膠於37°C孵育5-10 分鐘。在基質膠聚合之後，添加500μ 1擴增培養基(補充有lXGlutamax、青黴素/鏈黴素、 IOmM Hepes,B27,N2UmM N-乙醯半胱氨酸、10nM[Leu15]-促胃液素 I、IOOnM Exendin4、IOmM 煙醯胺、50ng/ml EGFU μ g/ml R-spondin UlOOng/ml Noggin、50或 lOOng/ml FGF7 (KGF) 或的改進DMEM/FU)。每2天更換全部培養基。對於傳代，用1000 μ 1移液管將類器官從基質膠移出，機械解離成小組織塊，並轉移至新鮮的基質膠中。以1 4的分種率每周1次進行傳代。在這些條件下，培養物維持至少2個月。對於分化，將擴增培養基換成分化培養基(補充有Glutamax、青黴素/鏈黴素、IOmM H印es、B27、N2、200ng/ml N-乙醯半胱氨酸、10nM[Leu15]-促胃液素 I、100nM Exendin4、50ng/mlEGF、1 μ g/ml R-spondin UlOOng/ml Noggin 的改進 DMEM/F12)。FGFlO 獲自 P印rotech。BrdU 獲自 Sigma。Q-PCR利用RNA小型試劑盒(Quiagen)分離RNA，並用莫洛尼鼠白血病病毒逆轉錄酶 (Promega)進行逆轉錄。在熱循環儀中擴增cDNA。以下列出所用的引物。mmTBP(正向)TATTGTATCTACCGTGAATCTTGGmmTBP(反向)CAGTTGTCCGTGGCTCTCLgr5 (正向)TCCAACCTCAGCGTCTTCLgr5 (反向)TGGGAATGTGTGTCAAAG (Tm = 57 °C )PCR為了區分基因組DNA，將所有的引物設計成位於內含子序列側翼或跨越內含子序列。 Hprt(F)AAGTTTGTTGTTGGATATGC(R)CATCTTAGGCTTTGTATTTGG(Tm)57 °C，106bpNgn3(F)TCCTCGGAGCTTTTCTACGA(R) TGTGTCTCTGGGGACACTTG (Tm) 60 °C，239bp/373bp (基因組條帶)Pax6 (F)AACAACCTGCCTATGCAACC(R) ACTTGGACGGGAACTGACAC TM 60°C，206bp葡萄糖激酶(F)AAGATCATTGGCGGAAAG(R)GAGTGCTCAGGATGTTAAG(Tm)57 °C 193bp嗜鉻粒蛋白A (F) GCTGACAGCAGAGAAGCGGCT(R) GACAGGCTCTCTAGCTCCTGG (Tm) 60 °C 23 Ibp
Glut2(slc2a2)(F)AAGTTGGAAGAGGAAGTCAG(R)AGACCTTCTGCTCAGTCG(Tm)57 °C 124bp胰島素(F)TTTGTCAAGCAGCACCTTTG(R)TCTACAATGCCACGCTTCTG(Tm)57 °C，214bp生長抑制素(F)GAGGCAAGGAAGATGCTGTC(R)GGGCATCATTCTCTGTCTGG(Tm)57 °C，214bp胰高血糖素(F)TTACTTTGTGGCTGGATTGCTT(R)AGTGGCGTTTGTCTTCATTCA(Tm)57 °C，149bp圖像分析。利用Leica SP5共聚焦顯微鏡、倒置顯微鏡(Nikon DM-IL)或立體顯微鏡(Leica， MZ16-FA)採集隱窩的類器官的圖像。對於免疫組化，在室溫下用4%多聚甲醛(PFA)對樣品固定1小時，並用標準技術(Barker et al，Nature 2007)加工石蠟切片。按以前所述(Barker et al, Nature 2007)進行免疫組化。對於全包埋免疫染色，用分散酶(Invitrogen)從基質膠分離胰腺的類器官，並用4% PFA固定，隨後用0. 1% Triton X-100 進行透化處理。以下抗體用於免疫組化抗BrdU (Amersham)、抗Ki67 (Dako)、抗胰島素 (Sigma)、Jjt C—月太(Cell signaling) Ngn3 (Developmental hybridoma studies bank)。用DAPI或ToftO-3 (Molecular Probes)對DNA進行染色。用共聚焦顯微鏡獲得三維圖像。按實施例5中的免疫組化和成像分析進行X-gal染色。FACS在存在或不存在R-Spondind U g/ml)的條件下所培養的胰腺的類器官，並通過機械方式或酶學方式(TrypLE)從基質膠取出胰腺的類器官。用TrypLE在37°C下對分離的類器官再消化10分鐘。使解離的細胞通過40 μ m細胞過濾器(BD bioscience)，並用APC 偶聯的抗EpCAM(eBioscience)進行染色。利用FluoR印orter試劑盒Qnvitrogen)，按照生廠商的方案對LacZ進行染色。用脈衝寬度、側向散射參數和碘化丙啶染色對單一活細胞進行畫門。單一 Axin2-LaCZ陽性胰腺細胞的體外擴增PDL處理之後7天，從小鼠分離胰腺，並按上述分離胰管。分離的胰管與TrypLE Express(Invitrogen) 一起於37 °C孵育20分鐘，隨後使其通過40 μ m細胞過濾器(BD bioscience)。按實施例7中所述用EpCAM-APC和LacZ的螢光底物(FluoroR印orter試劑盒)對細胞進行染色。分析細胞，並用流式細胞儀(MoFlo ;Dako Cytomation)分選單個活的上皮細胞，並將其收集在EM培養基中。離心沉澱分選的細胞，使其與基質膠混合，並用含有50% Wnt條件培養基和IOmM Y-27632的EM培養基培養4天。4天之後，將培養基換成無Wnt和Y-27632的EM培養基。結果可以培養來源於小腸的單個Wnt依賴性的Lgr5+幹細胞，從而形成連續擴增的腸樣的類器官(Sato et &1，2009)。在健康的成體胰腺中，1壯通路是無活性的，並且因此1^1~5 是不表達的。當通過部分導管結紮(PDL)造成損傷時，我們發現Wnt通路變得十分活躍，同時在再生導管的出芽處出現Lgr5表達。在改良腸培養體系的條件下，新鮮分離的成體導管組織塊起始Lgr5的表達，並形成出芽包囊，其每周擴增10倍，持續> 30周。生長刺激物的去除將這些包囊轉化成具有不成熟小島形態的結構，該結構表達內分泌腺和β細胞標誌物。來自受損胰腺的單個Wnt刺激的細胞也可以起始這些長期的培養。我們推斷，當在優化條件下培養時，海弗利克限制(Hayflick limit)不適用成熟祖細胞。因此，有利於器官特異性成體幹細胞擴增的培養方法可以提供基於ES或iPS的組織再生的備選方案。儘管很詳細地了解胚胎胰腺的外分泌區室和內分泌區室的發育(jensen，2004)， 但是關於出生後胰腺中小島細胞的產生卻知之甚少(Bormer-Weir and Weir, 2005 ； Bouwens and ROOman，20(^)。遺傳譜系追蹤提供了以下證據在正常的生理條件下和部分胰切除以後，成年小鼠中先存的β細胞產生了新的β細胞，而不是由幹細胞/祖細胞產生新的β細胞(Dor et al. ,2004 ；Teta et al.，2007)。最近描述了成年小鼠胰腺的管膜中存在多能祖細胞，在受損的胰腺中該細胞可被活化，從而增加功能性β細胞的量(Xu et al. 2008) 0通過在攜帶Ngn3啟動子報告基因的成年小鼠的胰腺上進行PDL來獲得受控損傷，Ngn3編碼胚胎小島細胞祖細胞的主要開關(Apelqvist et al. , 1999 ；Gradwohl et al. ,2000 ；Gu et al. ,2002 ；Schwitzgebel et al.，2000)，並且其在正常出生後的胰腺中是沉默的(Gu et al.，2002)。這些β細胞祖細胞的分化是Ngn3依賴性的，並且產生所有的小島細胞類型，包括葡萄糖響應β細胞(Xu et al，2008)。目前還不了解是哪些信號驅動損傷時出現這些祖細胞。這樣的觀點似乎是重要的，因為其可以指導設計祖細胞擴增的體外方法。為了確定Wnt信號轉導是否在β細胞祖細胞的誘導中起作用，在成體胰腺中追蹤 Axin2-LacZ等位基因的表達。Axin2-LacZ等位基因已被證實為Wnt信號轉導提供可靠的、 通常的報告基因(Lustig et al. ,Mol. Cell. Biol. 2002) 0如同預期，該報告基因在成體胰腺中是沒有活性的(圖^A)。然而，當我們將Wnt激動劑Rspol (Kim et al,2005)注射入 Axin2-LacZ小鼠中來激活Wnt信號通路時，我們觀察到沿著導管出現Wnt響應細胞，但是在胰腺泡或胰島中卻沒有(圖^B)。由於以前僅在胰腺損傷時檢測β細胞祖細胞，因此我們隨後檢驗了在進行PDL造成損傷時，這些細胞中的Wnt響應是否被生理激活。圖26C 顯示從PDL區域和非PDL區域分離的胰腺組織切片的Η&Ε染色。如之前所報導的(Abe et al. 1995)，5天之後腺泡細胞凋亡，並通過未完全了解的機制被新形成的導管結構所替代。 7天之後，還觀察到小島數量(小島再生)和小島大小的增加(如星號指示)。這表明PDL 是成功的。AXin2-LaCZ報告基因特定地沿著胰腺的結紮部位的導管被激活，而未結紮部位沒有表現出該響應(圖26D和E)。而且，通過Ki67染色所測定的增殖響應主要局限於結紮部位的導管，而在未結紮部位的導管中，沒有檢測到細胞核Ki67(圖^F)。這類似於在用 R-Spondin處理之後的胰腺中檢測到增殖性的BrdU陽性細胞(圖^G)。我們已經證實，在腸中某些Wnt響應細胞群是幹細胞(Barker et al,2007)。該細胞群的標誌物是Lgr5。Lgr5基因與Axin2類似，是Wnt響應基因。而在腸和皮膚中，Lgr5 基因僅在Wnt刺激的幹細胞中表達，但不在過渡放大細胞中表達(Barker et al,2007 Jaks et al，2008)。因此，Lgr5基被認為是真正的幹細胞標誌物。我們猜測，與腸中的Lgr5+細胞相似，正如損傷後所檢測到的，胰腺中的Lgr5+細胞也可能是β細胞祖細胞的起源。為了檢驗該猜測，我們在Axin-LacZ和Lgr5-LacZ小鼠的胰腺中進行PDL，並測定Lgr5 mRNA 表達和LacZ染色。有趣的是，在PDL後的時間過程中利用qPCR可容易地檢測到Lgr5 (圖 ^H)。此外，如X-gal染色所示，Lgrf-LacZ敲入小鼠中的PDL導致再生導管的芽中報告基因的特異活性(星號指示)(圖261)。活性再生位點處Lgr5表達的出現提示Lgr5可能不僅標誌生理上自我更新的幹細胞(例如在腸、胃或毛囊中)，而且其表達還可能預示損傷時通過再生的幹細胞/祖細胞的Wnt的激活。鑑於Wnt依賴的Lgr5幹細胞標誌物的出現，我們推斷，成體胰腺祖細胞可以在以前所定義的腸的類器官培養條件下擴增(Sato et al，2009)。之前已經建立胰腺細胞異種群體的培養，並且該培養中通常包含生長因子和血清補充劑，所述生長因子例如 EGF (Githens et al. In Vitro Cell Dev Biol. 1989)、FGFlO (Miralles et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999)禾口HGF(Lefebvre et al. Diabetes. 1998，Suzuki et al. ,Diabetes 53，2004)，所述血清補充劑例如促胃液素(Rooman et al. Gastroenterology 2001)、煙醯胺(Rooman et al. Diabetologia. 2000)等。多種這樣的培養導致體外產生具有β細胞樣表型的細胞(Bonner-ffeir et al.，2000 ；Seaberg et al.，2004 ；Suzuki et al.，2004)，當將所述細胞移植入糖尿病小鼠中時，在某些條件下其能逆轉高血糖症(Hao et al. ,2006； Ramiya et al.，2000)。這些方法中的大多數以混合的細胞群開始，所述細胞群隨時間衰老。似乎可以公平地說，目前還不存在能維持限定的非轉化的成體胰腺祖細胞在很長的一段時間內保持沿內分泌譜系分化的能力的穩定擴增的完善長期培養體系。我們首先試圖在擴增培養基(EM)中接種純化的導管組織塊。如圖27A所示，小的導管組織塊立即經歷連續出芽而擴增成為包囊樣結構，同時小島(數據未顯示)和腺泡 (底圖)逐漸解體。培養物每周擴增10倍(並且每周進行傳代)，持續超過30周。檢測了多種生長因子，以確定胰腺細胞體外最佳擴增所需的信號(圖27B)。顯然，在不存在EGF的條件下，培養物在7天之後解體。同樣在不存在R-spondin或FGFlO的條件下，培養物的活力在14天以後下降。相反，BMP抑制劑Noggin對胰腺組織塊的持續生長沒有任何影響。向擴增培養基添加煙醯胺、ExendiM、促胃液素不是必需的，但是可以導致培養效率提高(數據未顯示)。由於我們已經證實，Wnt信號轉導在PDL時被激活，因此希望能確定向新鮮分離的胰腺組織塊體外添加Wnt激動劑對持續生長的效果。當自Axin2-LacZ小鼠分離導管時，整個出芽包囊僅在Wnt激動劑Rspondin 1存在的條件下被染成藍色(圖27C)，這與PDL後的體內情況相似(圖26D和E)。在從AXin2-LaCZ胰腺新鮮分離的小島或腺泡中沒有觀察到藍色染色。與PDL時的體內現象一致，只有Lgr5-LacZ包囊的芽被染成藍色(圖27D)。此外，在存在R-spondin的條件下培養胰腺Lgr5-LacZ類器官14天顯著增加Lgr5+細胞的百分比(圖27E)。重要的是，當在不存在R-Spondin的EM中培養胰腺組織塊時，類器官在1個月內停止增殖，而在存在R-spondin的條件下，它們可以無限期擴增。這些觀察結果提示， 位於導管附近的Wnt響應祖細胞激發出芽包囊的生長，所述出芽的生長包囊隨後由具有幹細胞樣特性的表達Lgr5的細胞來維持。為了直接檢驗這個觀點，我們從PDL後7天的小鼠分選出AXin2-LaCZ陽性細胞， 並且發現這些細胞有效地起始出芽包囊，這些出芽包囊與導管起始的包囊是無法區分的 (圖觀)。單細胞需要培養基中存在Wnt3a。對單細胞解離之後存在或不存在Wnt3A條件下的培養效率的比較顯示，在不存在Wnt3A條件下培養的單細胞最初長成小包囊結構，但是在2-4天之後停止增殖。這與從分離的胰腺組織塊起始胰腺培養的情況不同。有趣的是， 可以在4天之後去除Wnt3A，這表明刺激生長不再必需該信號，或者來源於起始培養的單分選細胞的細胞啟動了 Wnt3A的產生。然後我們試圖評價出芽包囊產生內分泌腺譜系細胞的潛能。為了這個目的，我們檢驗了對EM的多種改變，以確定分化培養基(DM)。檢驗了一系列因子對分化成為內分泌腺譜系的效應。去除FGF10似乎對分化誘導是至關重要的。只有在不存在FGF10的條件下，才會出現小島樣結構(圖29A)，這與β細胞祖細胞(Ngn3)的數種分化標誌物的表達相符，出現β細胞(胰島素)、胰高血糖素(α細胞)和生長抑制素(S細胞)(圖29Β和 C)。此外，從暴露於DM培養基後10天開始，諸如葡萄糖激酶、Pax6和嗜鉻粒蛋白A的分化標誌物上調。因此，DM最好由至少EGF和R-Spondin組成，並且不含FGF7或10。在分化條件下，幹細胞標誌物Lgr5的持續表達可以通過DM中存在Wnt激動劑R-spondin來解釋，因為Lgr5是Wnt響應基因。當在存在煙醯胺的EM中培養細胞時，從該培養基去除煙醯胺也是重要的，以便獲得完全分化。當將培養任何時間之後的出芽包囊從EM轉移至DM時，該包囊經歷定式「內卷」過程壁不斷向內摺疊導致包囊被壓緊成為更小的在形態上類似於小島的緻密體(圖^D)。通過諸如胰島素和C-肽的β細胞小島的標誌物證實小島樣形態(圖
3629E)。為了證實該再生過程步驟對Wnt信號轉導的依賴，在存在或不存在R-spondin的DM 中培養胰腺組織塊。重要的是，如Ngn3的表達所證實，在存在R-spondin的條件下僅可以檢測到β細胞祖細胞(圖^F)。實施例8人胰腺組織塊的體外擴增在胚胎胰腺發育過程中，在胰管網絡中觀察到表達神經發生素3+或胰島素的細胞，這提示胰管細胞產生內分泌腺祖細胞，並因此產生成熟的內分泌細胞。已經證實，人胰管細胞在體外分化為葡萄糖響應的產胰島素細胞(Bormer-Weir，S et al 2000PNAS)，並且該發現使得胰管細胞成為β細胞替代療法的有吸引力的來源。然而，擴增導管細胞同時不喪失內分泌腺分化能力是困難的。在之前所報導的培養體系中，人胰管細胞喪失上皮特性或在2周直到5周之後經歷衰老(Trautmann B et al,Pancreas vol. 8 248-254) 因此， 沒有完善的培養體系來擴增保留內分泌腺分化能力的人胰管細胞。利用建立的小鼠胰腺的類器官培養體系，我們試圖建立人胰腺的類器官培養體系。人胰腺祖細胞的體外生長人胰腺獲自荷蘭的萊頓大學醫學中心(Leiden University Medical Center)。重要的是，在與上述的小鼠胰腺組織塊相同的條件下(實施例7)，人的新鮮分離的胰腺組織塊也可以體外生長(圖30)。在這些擴增條件下，胰腺組織塊的培養效率為大約80%，即新鮮分離的胰腺組織塊中的80%可在體外較長時間有效擴增。與小鼠胰腺相比，腺泡組織更容易形成包囊結構， 然而，這些結構在4周內停止增殖。來自較大導管網絡的胰管細胞能更有效地產生包囊結構，並最終形成具有芽的類器官。以1 5的比率每周1次對胰腺的類器官進行分種，並在體外維持至少5周而不喪失增殖能力。總之，我們建立了人胰腺的類器官培養體系，並成功地將胰管細胞從初始體積擴增至少3000倍。我們正在優化人胰管細胞的內分泌腺分化培養條件，並且該體外方法一旦經過優化，則可能對使β細胞替代療法可用於1型和2型糖尿病的大量人群具有重要的含義。參考文獻Abe K,Watanabe S. 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41
按照他人所述的方案(Willertet al.，2003，Nature. May 22 ；423 (6938) 448-52)製備 Wnt3a 培養基。如 van de Wetering 及其同事所描述(van de Wetering et al. ,2001 Cancer Res. Jan 1 ；61(1) :278-84)，用 T0P/F0P測定來檢測 Wnt3a條件培養基和對照條件培養基中的Wnt活性。T0P/F0P比> 50被認為是高Wnt培養基，並將其與胃的類器官培養基以1 1進行稀釋。該高Wnt3a培養基的1 10稀釋液(T0P/F0P比約為5) 被認為是低Wnt培養基並將其用於分化目的。胃的類器官免疫組化對於免疫組化，用PBS將胃的類器官洗滌一次，並立即用4%多聚甲醛在室溫下固定15-20分鐘。將胃的類器官包埋入石蠟中，並用標準技術進行加工。對於全包埋染色，用PBS 0. 5% Triton-XlOO-I % BSA對樣品進行透化處理，並將其與一抗孵育。在PBS 0. 3% Triton XlOO中洗滌數次之後，將樣品與二抗孵育。按照生產商的說明書(Click-IT ； Invitrogen)進行EdU染色。用T0PR03碘或Hoescht33342對細胞核進行染色。用共聚焦顯微鏡(Leica, SP5)獲得胃腺和胃的類器官的圖像。用Volocity軟體(Improvision)進行三維重建。RT-PCR用RNeasy Mini RNA提取試劑盒Oliagen)從胃細胞培養物或新鮮分離的組織提取RNA，並用莫洛尼鼠白血病病毒反轉錄酶(!Iomega)進行逆轉錄。按之前所描述(Huch et al. ,2009) ^tWM^iX (GeneAmp PCR System 9700 ；Applied Biosystems, London, UK)中擴增cDNA。所用的引物顯示如下(基因符號後為正向(5』 -3』 )和反向(5』 -3』 )引物)。Lgr5 GGAAATGCTTTGACACACATTC,GGAAGTCATCAAGGTTATTATAAGif TGAATCCTCGGCCTTCTATG,CAGTTAAAGTTGGTGGCACTTCPgc CCAACCTGTGGGTGTCTTCT,TTAGGGACCTGGATGCTTTGMuc6 TGCATGCTCAATGGTATGGT,TGTGGGCTCTGGAGAAGAGTMuc5ac CCATGAAGTGGGAGTGTGTG,TTGGGATAGCATCCTTCCAGGhrl GCCCAGCAGAGAAAGGAATCCA,GCGCCTCTTTGACCTCTTCCGast GCCAACTATTCCCCAGCTCT,GGCTCTGGAAGAGTGTTGCTStt GAGGCAAGGAAGATGCTGTC,GGGCATCATTCTCTGTCTGGMuc2 GAACGGGGCCATGGTCAGCA,CATAATTGGTCTTGCATGCCCdx2 :CTTGCTGCAGACGCTCAAC,TCTGTGTACACCACCCGGTA
Hprt :AAGCTTGCTGGTGAAAAGGA，TTGCGCTCATCTTAGGCTTT結果為了確定胃單元在體外的最佳生長，我們分離出胃腺單元，並將其懸浮於基質膠中並在不同的條件下進行培養。胃培養物的生長條件與小腸培養物的生長條件(包含EGF、 Noggin和R-spondin 1)相似，但是嚴格依賴條件培養基形式的Wnt3A。利用純化的Wnt3a 蛋白來證實這個需求(圖33A)。此外，FGFlO被證明是驅動出芽事件和將培養物擴增成為多單元的類器官所必需的成分(圖33B)。FGFlO可用於替代在實施例5中使用的FGF7(KGF)， 並且替代後甚至能導致起始培養4天之後出芽的類器官的百分比增加2倍(圖33C)。新形成的胃的類器官經歷連續的出芽事件，同時保持其極性，使得胃腺結構芽分布在中央腔周圍(圖33D)。在不存在Wnt3A條件培養基的條件下，胃的類器官快速惡化(圖33E)。每周將類器官機械解離，並分種為之前接種密度的1/5。如E-Cad染色所證實，培養的幽門單元是單層上皮結構(圖33F)。我們已經成功地將胃的類器官培養了至少8個月，而沒有檢測到喪失任何上文所述的特徵。為了確定胃Lgr5ratt細胞(圖34A)是否能在體外產生和維持幽門胃腺單元，我們分選出Lgr5-EGFPS細胞(圖34B)。當分選出單一 Lgr5_EGFPs細胞時，平均8%的細胞長成類器官，而其它細胞在前M小時內死亡。所分選的Lgr5-EGFPS細胞快速開始分裂，並且 5天之後就可以看見小的包囊樣結構。在接下來的時間，新形成的(包囊樣)結構開始產生腺樣結構(圖34C)。培養9-11天之後，將胃的類器官手動解離，並分種以產生新的類器官。已成功地將來自單細胞的胃的類器官每周進行重新接種，持續至少3個月，而沒有喪失所述的特徵(圖34D)。從第7天開始，Lgr5-EGFP表達局限於腺樣結構的基部(圖34E)。 如EdU染色所證實，增殖性細胞位於這些腺樣結構的基部(圖34F)，同時發現凋亡的半胱天冬酶3陽性細胞被擠入腔中(數據未顯示)。在從Lgr5-EGFP-ires-CreERT2/Rosa^-YFP 報告基因小鼠分離的單個Lgr5ratt細胞所建立的類器官中研究譜系追蹤。他莫西芬誘導之後，腺樣結構中單個1^5_細胞中的YFPp^t告基因被迅速激活。在接下來的幾天內，生長的類器官中的YFP表達結構大量擴增，這證明Lgr5ratt幹細胞有助於類器官的體外生長 (圖34G)。如E-鈣粘附蛋白染色所證實，來源於單細胞培養物的類器官是單層上皮結構 (圖341)。除了 Lgr5之外，培養物還表達胃上皮標誌物胃固有因子、粘蛋白6和胃蛋白酶原C。在這些培養條件下沒有觀察到分化為小凹或腸內分泌細胞譜系(這與實施例5不同，在實施例5中觀察到小凹細胞譜系。但是在那個實施例中，使用了 Wnt3a蛋白而不是活性較差的Wnt條件培養基。降低Wnt條件培養基的濃度導致分化為小凹細胞譜系，參見以下)。培養基中Wnt3A濃度的降低導致形成具有極化的小凹細胞的相似的胃結構，這正如胃粘蛋白5AC(MUC5AC)的表達和高碘酸-雪夫(PAQ、以及Tff2表達所證明的頸粘液細胞和某些分散的不成熟腸內分泌細胞(嗜鉻粒蛋白A)所證實(圖34H，I)。添加諸如RA、IGF 和ExendiM的其它生長因子可以導致胃培養物向不同細胞譜系的更成熟的分化。總之，這些體內和體外觀察結果表明，Lgr5是胃幽門中以前未受關注的自我更新的多能成體幹細胞群的標誌物。參考文獻1.Barker, N. et al.Identification of stem cells in small intestine andcolon by marker gene Lgr5 (通過標誌基因Lgr5在小腸和結腸中鑑定幹細胞).Nature 449，1003-7(2007).2. Bjerknes, Μ· & Cheng, H. Intestinal epithelial stem cells and progenitors (腸上皮幹細胞和祖細胞).Methods Enzymol 419，337-83 (2006).3. Barker, N. , van de Wetering,M.& Clevers, H. The intestinal stem cell(腸幹細胞).Genes Dev 22,1856-64(2008).4. Evans,G. S.，Flint,N. , Somers,A. S.，Eyden,B. & Potten, C. S. The development of a method for the preparation of rat intestinal epithelial cell primary cultures (用於製備大鼠腸上皮細胞初級培養物的方法的幵發).J Cell ScilOl (Pt 1)， 219-31(1992).5. Whitehead, R. H.，Demmler, K.，Rockman, S. P. & Watson, N. K. Clonogenic growth of epithelial cells from normal colonic mucosa from both mice and humanS(來自小鼠和人的正常結腸黏膜的上皮細胞的族群性生長).(Gastroenterology 117,858-65(1999).6.Fukamachi, H.Proliferation and differentiation of fetal rat intestinal epithelial cells in primary serum-free culture (初級無血清培養中大鼠胎兒腸上皮細胞的增殖和分化).J Cell Sci 103 (Pt 2)，511-9 (1992) ·7.Perreault, N. & Jean-Francois, B.Use of the dissociating enzyme thermolysin to generate viable human normal intestinal epithelial cell cultures (使用解離酶嗜熱菌蛋白酶來產生活的人正常腸上皮細胞培養物).Exp Cell Res 224,354-64(1996).8.Korinek,V. et al.Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf_4 (在缺失Tcf_4的小鼠小腸中刪除上皮幹細胞池).Nat Genet 19，379-83 (1998) ·9. Pinto, D. , Gregorieff, A. , Begthel, H. & Clevers, H. Canonical Wnt signals are essential for homeostasis of the intestinal epithelium(公認的 Wnt 信號是腸上皮穩定所必需的).Genes Dev 17，1709-13 (2003).10. Kuhnert, F. et al. Essential requirement for Wnt signaling in proliferation of adult small intestine and colon revealed by adenoviral expression of Dickkopf-1 (利用Dickkopf-1的腺病毒表達表明成體小腸和結腸增殖必需 Wnt 信號轉導)· Proc Natl Acad Sci U S A 101，266-71 (2004) ·11. Kim, K. A. et al. Mitogenic influence of human R-spondinl on the intestinal epithelium(人 R-spondinl 對腸上皮的促分裂影響)· Science 309， 1256-9(2005).12. Dignass, A. U. & Sturm, A. Peptide growth factors in the intestine (腸中的月太生長因子).Eur J Gastroenterol Hepatol 13,763-70(2001).13. Haramis,Α. P. et al. De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine (從頭隱窩形成和青年性多發性息肉症在小鼠腸中的 BMP 抑制).Science 303，1684-6 (2004).
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權利要求
1.隱窩-絨毛的類器官或結腸隱窩的類器官，所述隱窩-絨毛的類器官包含襯有絨毛樣上皮的中央腔。
2.培養上皮幹細胞、包含所述上皮幹細胞的分離的組織塊、或腺瘤細胞的方法，所述方法包括提供細胞外基質；將上皮幹細胞、包含所述上皮幹細胞的分離的組織塊、或腺瘤細胞與所述細胞外基質一起孵育；在存在細胞培養基的條件下，培養所述幹細胞、分離的組織塊或腺瘤細胞，所述細胞培養基包含用於動物或人類細胞的基礎培養基，並且所述基礎培養基中添加了骨形態發生蛋白(BMP)抑制劑和5-500ng/ml的有絲分裂生長因子，如果培養上皮幹細胞和分離的組織塊，還要添加Wnt激動劑。
3.如權利要求2所述的方法，其中所述BMP抑制劑是Noggin，所述有絲分裂生長因子是表皮生長因子和角質化細胞生長因子，並且所述Wnt激動劑是R-spondin 1。
4.如權利要求2所述的方法，其中所述BMP抑制劑選自Noggin、DAN和包括Cerberus 和Greml in在內的DAN樣蛋白。
5.如權利要求2或4所述的方法，其中所述Wnt激動劑選自Wnt、R-spondin1_4、 Norrin和GSK抑制劑中的一種或多種。
6.如權利要求2和3-5所述的方法，其中所述Wnt激動劑包含R-spondin1和Wnt-3a 和/或所述有絲分裂生長因子是EGF。
7.如權利要求2-6中任一項所述的方法，其中所述培養基還包含Rock(Rho激酶)抑制劑，所述Rock抑制劑選自Y-27632、法舒地爾和H-1152。
8.如權利要求2-7中任一項所述的方法，其中所述培養基還包含notch激動劑。
9.優選根據權利要求2-8中任一項所述的方法獲得和/或培養結腸隱窩的方法，其中-將上皮幹細胞、包含所述上皮幹細胞的分離的組織塊、或腺瘤細胞與細胞外基質在培養基中接觸培養，所述培養基含有Noggin、EGF和作為Wnt激動劑的R-spondin 1和/或 Wnt-3,並補充有B27、N2和N-乙醯半胱氨酸。
10.優選根據權利要求2-8中任一項所述的方法獲得和/或培養胰腺的類器官的方法， 其中-在第一步中，將上皮幹細胞、包含所述上皮幹細胞的分離的組織塊、或腺瘤細胞與細胞外基質在培養基中接觸培養，所述培養基含有EGF、KGF或FGF和作為Wnt激動劑的 R-spondin 1，並補充有B27、N2和N-乙醯半胱氨酸；-隨後第二步的培養在含有EGF和作為Wnt激動劑的R-spondin 1並補充有B27、N2和 N-乙醯半胱氨酸的培養基中進行。
11.優選根據權利要求2-8中任一項所述的方法獲得和/或培養胃組織塊的方法，其中-在第一步中，將上皮幹細胞、包含所述上皮幹細胞的分離的組織塊、或腺瘤細胞與細胞外基質在培養基中接觸培養，所述培養基含有作為BMP抑制劑的Noggin、作為有絲分裂生長因子的表皮生長因子和FGFlOdtS Wnt激動劑的R-spondin 1和Wnt-3a，並且還含有B27、N2、N-乙醯半胱氨酸。-隨後第二步的培養在含有表皮生長因子和作為Wnt激動劑的R-spondin 1和Wnt-3a 並補充有B27、N2和N-乙醯半胱氨酸的培養基中進行，其中第二步中Wnt-3的濃度低於第一步中Wnt-3a的濃度。
12.細胞培養基，包含用於動物或人類細胞的基礎培養基，並且所述基礎培養基中添加了骨形態發生蛋白(BMP)抑制劑、Wnt激動劑和5-500ng/ml的表皮生長因子(EGF)。
13.權利要求12所述的培養基在細胞外基質上培養上皮幹細胞或分離的組織塊的用途。
14.通過權利要求2-9中所述的方法獲得的隱窩-絨毛的類器官或結腸隱窩的類器官， 所述隱窩-絨毛的類器官包含襯有絨毛樣上皮的中央腔。
15.優選通過權利要求2-8或10中所述的方法獲得的包含小島樣結構的胰腺的類器官。
16.優選通過權利要求2-8或11中所述的方法獲得的包含中央腔的胃的類器官。
17.權利要求1或14所述的隱窩-絨毛的類器官或結腸隱窩、權利要求15所述的胰腺的類器官或權利要求16所述的胃的類器官在藥物開發篩選、毒性測定或再生醫學中的用途。
18.細胞培養基在腺瘤細胞培養中的用途，所述細胞培養基包含用於動物或人類細胞的基礎培養基，並且所述基礎培養基中添加了骨形態發生蛋白(BMP)抑制劑和5-500ng/ml 的表皮生長因子(EGF)。
全文摘要
本發明涉及培養上皮幹細胞、培養包含所述上皮幹細胞的分離的組織塊、或腺瘤細胞的方法，以及在培養上皮幹細胞和分離的組織塊時存在骨形態發生蛋白(BMP)抑制劑、有絲分裂生長因子和Wnt激動劑的條件下培養所述細胞或組織塊的方法。本發明還涉及含有BMP抑制劑、有絲分裂生長因子和Wnt激動劑的細胞培養基、所述培養基的用途以及在所述培養基中形成的隱窩絨毛的類器官、胃的類器官和胰腺的類器官。
文檔編號C12N5/073GK102439135SQ201080013109
公開日2012年5月2日 申請日期2010年2月3日 優先權日2009年2月3日
發明者佐藤·俊朗, 梅裡特克賽爾·胡克·奧爾特加, 約翰尼斯·卡洛魯斯·克萊威爾斯 申請人:荷蘭皇家科學院