用於生物合成對甲苯甲酸和對苯二甲酸的微生物和方法

2023-05-16 06:02:46

專利名稱：用於生物合成對甲苯甲酸和對苯二甲酸的微生物和方法
用於生物合成對甲苯甲酸和對苯二甲酸的微生物和方法
背景技術：
本發明總的來講涉及生物合成過程，更具體地講，本發明涉及具有對甲苯甲酸(p-toluate)對苯二甲酸(terephthalate)或(2_輕基_3_甲基_4_氧代丁氧基)膦酸酯生物合成能力的生物體。對苯二甲酸(也稱為對苯二甲酸(terephthalic acid)和PTA)是聚對苯二甲酸乙二酯(polyethylene terepthalate, PET)的直接(immediate)前體,用於製造衣物、樹脂、塑料瓶，甚至用作禽飼料添加劑。幾乎所有的PTA都是在稱為中世紀工藝(the Mid CenturyProcess)的工藝中在空氣中氧化而由對二甲苯生產。這個氧化作用在高溫下、在乙酸溶劑中用由鈷和/或錳鹽組成的催化劑來進行。對二甲苯來源於石油化學來源並由石腦油的高苛刻度催化重整而形成。二甲苯也從石腦油蒸汽裂化器中的熱解汽油氣流和通過甲苯歧化獲得。
用於生產可再生PTA的成本-有效方法迄今尚未開發出來。PTA、甲苯和其它的芳族前體能被有些細菌自然地降解。然而，這些降解途徑通常包括以可降解方向不可逆操作的單加氧酶。因此，PTA的生物合成途徑受到迄今已知酶特性的嚴格限制。一種頗有前景的PTA前體是對甲苯甲酸，也稱為對甲基苯甲酸酯。對甲苯甲酸是在某些工業過程中將對二甲苯氧化成PTA的中間體。它也是聚合物穩定劑、殺蟲劑、光敏化合物、動物飼料補充劑和其它有機化學品的中間體。僅在水溶液中微溶，對甲苯甲酸在生理溫度下為固體，其熔點為275°C。用於從糖貯存物(feedstocks)合成該化合物的微生物催化劑迄今為止還沒有描述過。因此，存在有效生產商用量化合物例如對甲苯甲酸或對苯二甲酸的替代方法的需求。本發明滿足了這種需求，也提供了有關優勢。發明概述本發明提供具有(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑、對甲苯甲酸途徑和/或對苯二甲酸途徑的非天然存在的微生物。本發明另外還提供使用這類生物體來產生(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑、對甲苯甲酸途徑或對苯二甲酸途徑的方法。附圖簡述圖I顯示由3-磷酸甘油醛和丙酮酸生成(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯(2H3M40P)的示例性途徑的示意圖。G3P為3-磷酸甘油醛，DXP為1_脫氧-D-木酮糖-5-磷酸，和2ME4P為C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸。酶是(A) DXP合酶；(B) DXP還原異構酶(reductoisomerase);和(C)2ME4P 脫水酶。圖2顯示對甲苯甲酸的示例性替代莽草酸途徑的示意圖。酶是(A) 2-脫氫-3-脫氧磷酸庚糖酸合酶；(B) 3-脫氫奎尼酸合酶；(C) 3-脫氫奎尼酸脫水酶；(D)莽草酸脫氫酶；(E)莽草酸激酶；(F)3-磷酸莽草酸-2-羧基乙烯基轉移酶；(G)分支酸合酶；和(H)分支酸裂合酶。化合物是(I) (2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯；(2) 2，4- 二羥基-5-甲基-6-[(膦醯氧基)甲基]噁烷-2-羧酸酯；(3) 1，3- 二羥基-4-甲基-5-氧代環己烷-I-羧酸酯；⑷5-羥基-4-甲基-3-氧代環己-I-烯-I-羧酸酯；(5) 3，5- 二羥基-4-甲基環己-I-烯-I-羧酸酯；(6) 5-羥基-4-甲基-3-(膦醯氧基)環己-I-烯-I-羧酸酯；⑵5- [ (I-羧基乙-I-烯-I-基)氧基]-4-甲基-3-(膦醯氧基)環己-I-烯-I-羧酸酯；⑶3-[ (I-羧基乙-I-烯-I-基)氧基]-4-甲基環己-1，5- 二烯-I-羧酸酯；和(9)對甲苯甲酸。圖3顯示將對甲苯甲酸(p-toluate)轉變成對苯二甲酸(PTA)的示例性途徑。反應A、B和C分別由對甲苯甲酸甲基-單加氧酶還原酶、4-羧基苯甲醇脫氫酶和4-羧基苯甲醛脫氫酶催化。所示化合物是(I)對甲苯甲酸(p-toluic acid) ; (2)4-羧基苯甲醇；
(3)4-羧基苯甲醛；和⑷對苯二甲酸。發明詳述本發明涉及具有對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的生物合成生產能力的細胞和生物體的設計和生產。本文所述結果表明代謝途徑可以進行設計和重組工程以實現對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯在大腸桿菌(Escherichia coli)及其它細胞或生物體中的生物合成。對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的生物合成性生產可以通過構建具有設計的代謝基因型的菌株來證實。這些代謝工程改造的細胞或生物體也可以經受適應性進化以進一步增強對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的生物合成，包括在接近理論最大生長的條件下。大腸桿菌中的莽草酸生物合成途徑將赤蘚糖-4-磷酸轉變成分支酸，一種重要中間體，導致生物合成許多必需代謝物，包括4-羥基苯甲酸酯。4-羥基苯甲酸酯在結構上類似於對甲苯甲酸，即對苯二甲酸的一種工業前體。正如本文所公開的，莽草酸途徑酶可用於接受替代底物(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯(2H3M40P)並將其轉化成對甲苯 甲酸。另外，利用來自類異戊二烯(isoprenoid)生物合成的非甲羥戊酸途徑的酶，該途徑用於合成2H3M40P前體。本文公開的是對微生物進行工程改造以從碳水化合物貯存物生產可再生對甲苯甲酸或對苯二甲酸(PTA)的策略。首先，在三個酶促步驟中，將3-磷酸甘油醛(G3P)和丙酮酸轉變成2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯(2H3M40P)(參見實施例I和圖I)。隨後，2H3M40P中間體通過莽草酸途徑中的酶轉化成對甲苯甲酸(參見實施例II和圖2)。對甲苯甲酸可以通過微生物進一步轉變成PTA(參見實施例III和圖3)。G3P轉變成對甲苯甲酸需要一個ATP、兩個還原當量的(NAD(P)H)和兩分子磷酸烯醇丙酮酸，按照以下的淨反應式。G3P+2PEP+ATP+2NAD (P) H+2H+ —對甲苯甲酸 +4Pi+ADP+2NAD (P)++C02+H20從葡萄糖合成G3P需要額外的ATP。最大理論對甲苯甲酸產量為0. 67mol/mol (0. 51g/g)(從葡萄糖中減去碳需要能量)。在假定每合成I分子對甲苯甲酸要消耗掉2個ATP的情況下,從葡萄糖到對甲苯甲酸的產量預計為0. 62mol/mol (0. 46g/g)對甲苯甲酸。如果對甲苯甲酸被實施例III中描述的酶進一步轉變成PTA，那麼從葡萄糖到PTA的產量預計為0. 64mol/mol (0. 58g/g)。在這種情形下,對甲苯甲酸氧化成PTA產生額外的淨還原當量，按照以下的淨反應式
對甲苯甲酸 +02+NAD+ — PTA+NADH+2H+以下各小節描述了用於催化建議途徑各步驟的候選酶。本文所用的術語「非天然存在的」當用於涉及本發明的微生物時，意指該微生物具有至少一個遺傳改變，該遺傳改變在正常情況下在參考菌種的天然存在的菌株(包括參考菌種的野生型菌株)中不存在。遺傳改變包括例如微生物遺傳材料的修飾，該修飾引入編碼代謝多肽的可表達核酸、其它核酸添加、核酸缺失和/或其它功能破壞。這樣的修飾包括例如參考菌種的異源多肽、同源多肽或者異源多肽和同源多肽二者的編碼區及其功能片段。另外的修飾包括例如非編碼調節區，其中該修飾改變了基因或操縱子的表達。示例性的代謝多肽包括對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯生物合成途徑內的酶或蛋白質。代謝修飾是指自其天然存在的狀態被改變的生物化學反應。因此，非天然存在的微生物可具有代謝多肽編碼核酸或其功能片段的遺傳修飾。在本文中公開了示例性的代謝修飾。本文所用的術語「分離的」當用於涉及微生物時，意指基本上不含隨該參考微生物在自然界中發現的至少一種組分的生物體。該術語包括去除了隨該微生物在天然環境中被發現的某些或所有組分的微生物。該術語也包括去除了隨該微生物在非天然存在的環境中被發現的某些或所有組分的微生物。因此，分離的微生物與隨其在自然界中被發現或者隨其在非天然存在的環境中生長、貯存或生存時被發現的其它物質部分或完全分離開。分離的微生物的具體實例包括部分純的微生物、相當純的微生物和在培養基即非天然存在的環境中培養的微生物。本文所用的術語「微生物」意指作為用顯微鏡可看見的細胞存在的任何生物體，它被包括在古細菌(archaea)、細菌(bacteria)或真核微生物(eukarya)的範圍內。因此,該術語預計包括具有用顯微鏡可看見的大小的原核或真核細胞或者原核或真核生物體，並且 包括所有菌種的細菌、古細菌和真細菌以及真核微生物(例如酵母和真菌)。該術語也包括可以進行培養以用於生物化學品生產的任何菌種的細胞培養物。本文所用的術語「CoA」或「輔酶A」意指形成有活性的酶系統的有機輔因子或輔基(prosthetic group)(酶的非蛋白質部分)，其存在對於許多酶(脫輔基酶)的活性是必需的。輔酶A在某些縮合酶中發揮功能，在乙醯基或其它醯基轉移中和在脂肪酸合成和氧化、丙酮酸氧化中和在其它乙醯化中起作用。本文所用的術語「(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯」，在本文中縮寫為2H3M40P，具有圖I所示的化學結構式。這樣一種化合物也可描述為3-羥基-2-甲基丁醛-4-磷酸。本文所用的術語「對甲苯甲酸(p-toluate) 」，分子式為C8H702_(參見圖2，化合物9) (IUPAC命名為4-甲基苯甲酸酯)，是對甲苯甲酸(p-toluic acid)的離子化形式。應當理解，對甲苯甲酸(p-toluate)和對甲苯甲酸(p-toluic acid)在涉及化合物呈其中性或離子化形式的任何一種(包括其任何鹽形式)時可互換使用。技術人員全都知道，具體的形式將取決於pH。本文所用的術語「對苯二甲酸(ter印hthalate) 」，分子式為C8H4O4I參見圖3，化合物4) (IUPAC命名為對苯二甲酸)，是對苯二甲酸(terephthalic acid)，也稱為對-苯二甲酸(p_phthalic acid)或PTA的離子化形式。應當理解,對苯二甲酸(terephthalate)和對苯二甲酸(p-phthalic acid)在涉及化合物呈其中性或離子化形式的任何一種(包括其任何鹽形式)時可互換使用。技術人員全都知道，具體的形式將取決於pH。本文所用的術語「基本上厭氧的」當用於涉及培養或生長條件時，意指氧的量低於液體培養基中溶解氧飽和度的約10%。該術語也預計包括用小於約1%氧的氣氛維持的液體或固體培養基的密閉室。本文所用的「外源的」意指參考分子或參考活性被引入到宿主微生物中。該分子可以例如通過將編碼核酸引入到宿主遺傳材料中，例如通過整合到宿主染色體或作為非染色體遺傳材料例如質粒而引入。因此，該術語當用於涉及編碼核酸的表達時，是指將編碼核酸以可表達·形式引入到微生物中。當用於涉及生物合成活性時，該術語是指被引入到宿主參比生物體中的活性。活性來源可以是例如在引入到宿主微生物之後表達參考活性的同源或異源編碼核酸。因此，術語「內源的」是指宿主體內存在的參考分子或活性。同樣地，該術語當用於涉及編碼核酸的表達時，是指微生物內含有的編碼核酸的表達。術語「異源的」是指從不是參考物種的來源獲得的分子或活性，而「同源的」是指來源於宿主微生物的分子或活性。因此，本發明的編碼核酸的外源表達可以利用異源或同源編碼核酸中的任何一個或二者。應當理解，當在微生物中包括超過一種外源核酸時，超過一種外源核酸是指如上所論述的參考編碼核酸或生物合成活性。還應當理解，正如本文所公開的，這樣的超過一種外源核酸可以在獨立的核酸分子上、在多順反子核酸分子或其組合上引入到宿主微生物中，並且仍然被視為超過一種外源核酸。例如，本文所公開的微生物可以經過工程改造以表達兩種或更多種編碼所需途徑酶或蛋白質的外源核酸。在將編碼所需活性的兩種外源核酸引入到宿主微生物的情況下，應當理解，這兩種外源核酸可以作為一種核酸(例如在單個質粒上、在獨立的質粒上)被引入，可以整合到宿主染色體的單個位點或多個位點上，並且仍然被視為兩種外源核酸。同樣地，應當理解，超過兩種外源核酸可以以任何所需組合(例如在單個質粒上、在獨立的質粒上)引入到宿主生物中，可以整合到宿主染色體的單個位點或多個位點上，並且仍然被視為兩種或更多種外源核酸，例如三種外源核酸。因此，參考外源核酸或生物合成活性的數目是指編碼核酸的數目或生物合成活性的數目，而不是被引入到宿主生物中的獨立核酸的數目。本發明的非天然存在的微生物可含有穩定的遺傳改變，它是指可培養5代以上而沒有遺傳改變損失的微生物。一般而言，穩定的遺傳改變包括持續10代以上的修飾，具體地說，穩定的修飾將持續約25代以上，和更具體地說，穩定的遺傳修飾將是多於50代，包括無限期地。本領域技術人員應當理解，遺傳改變，包括本文例舉的代謝修飾，可參照合適的宿主生物(例如大腸桿菌)和它們的相應代謝反應或者所需遺傳材料的合適來源生物體(例如所需代謝途徑的基因)進行描述。然而，考慮到各種生物體的完全基因組測序和基因組學領域中技巧的高水平，本領域技術人員將能夠容易地將本文提供的教導和指導應用到基本所有的其它生物體。例如，本文例舉的大腸桿菌代謝改變可以容易地應用到其它物種，即通過摻入來自參考物種以外的其它物種的相同或類似編碼核酸。這樣的遺傳改變一般包括例如物種同系物(species homologs))的遺傳改變，和具體包括例如直系同源物(orthologs)、旁系同源物(paralogs)或非直系同源基因置換(nonorthologous genedisplacements)的遺傳改變。直系同源物是有垂直親緣(vertical descent)關係的並且在不同生物體中負責基本相同功能或相同功能的一個或多個基因。例如，小鼠環氧化物水解酶和人環氧化物水解酶可以因為環氧化物水解的生物功能而被視為直系同源物。當某些基因共享足夠數量的序列相似性以表明它們是同源的，或者是從共同的祖先進化而相關時，它們有垂直親緣關係。如果某些基因共享三維結構但不一定共享足夠數量的序列相似性以表明它們是從共同的祖先進化到一級序列相似性是不可辨識的程度，那麼它們也可被視為直系同源物。作為直系同源的基因可以編碼具有約25%至100%胺基酸序列同一性的序列相似性的蛋白質。編碼共享胺基酸相似性小於(less that) 25%的蛋白質的基因也可被視為因有垂直親緣關係而提升，如果它們的三維結構也顯示很高相似性的話。酶的絲氨酸蛋白酶家族成員，包括組織纖溶酶原激活物和彈性蛋白酶，都被視為因來自共同的祖先而有垂直親緣關係而提升。 直系同源物包括通過例如進化而在結構或總體活性上趨異的基因或它們的編碼基因產物。例如，當一個物種編碼表現出兩種功能的基因產物並且當這樣的功能已經在第二個物種中分離到截然不同的基因上時，這三個基因及其相應的產物被視為直系同源物。為了生物化學產品的生產，本領域技術人員應當理解，為了構建非天然存在的微生物，必須對帶有代謝活性的要被引入或破壞的直系同源基因進行選擇。表現出可分離活性的直系同源物的一個實例是當截然不同的活性已經在兩個或更多個物種之間或者在單一物種內分離到截然不同的基因產物上。一個具體的例子是彈性蛋白酶蛋白水解和纖溶酶原蛋白水解(絲氨酸蛋白酶活性的兩種類型)已經作為纖溶酶原激活物和彈性蛋白酶分離成為兩個截然不同的分子。第二個例子是支原體5』 -3』外切核酸酶和果蠅(Drosophila)DNA聚合酶III活性的分離。來自第一個物種的DNA聚合酶可被視為來自第二個物種的外切核酸酶或聚合酶中任一個或二者的直系同源物，反之亦然。相比之下，旁系同源物是因為例如進化趨異後再複製而有親緣關係的同系物並且具有相似或共同的但不相同的功能。旁系同源物可起源於或來源於例如相同的物種或來自不同的物種。例如，微粒體環氧化物水解酶(環氧化物水解酶I)和可溶性環氧化物水解酶(環氧化物水解酶II)可被視為旁系同源物，因為它們代表了兩種獨特的酶，從共同的祖先共進化而來，它們催化不同的反應且在相同的物種中具有不同的功能。旁系同源物是來自相同的物種並且彼此具有顯著序列相似性的蛋白質，提示它們是同源的，或者通過從共同的祖先共進化而有親緣關係。旁系同源蛋白質家族的組包括HipA同系物、螢光素酶基因、妝酶等。非直系同源基因置換是來自一個物種的非直系同源基因，它可以在不同的物種中取代參考基因功能。取代包括例如，與在不同的物種中的參考功能相比，能夠在原始的物種中執行基本上相同或相似的功能。雖然一般而言，非直系同源基因置換將根據與編碼參考功能的已知基因在結構上相關性進行鑑別，但是儘管如此，結構上相關性較少但功能上相似的基因及其相應基因產物將仍然落入該術語的含義之內，正如本文中使用的。與編碼待取代的功能的基因相比，在非直系同源基因產物的活性位點或結合區中，功能相似性需要例如至少某些結構相似性。因此，非直系同源基因包括例如旁系同源物(paralog)或無親緣關係的基因(unrelated gene)。
因此，在鑑定和構建本發明的具有對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯生物合成能力的非天然存在的微生物中，本領域技術人員應當知道將本文提供的教導和指導應用到某個具體的物種時，代謝修飾的鑑定可包括直系同源物的鑑定和納入(inclusion)或失活。達到這種程度以致在編碼催化相似或基本上相似代謝反應的酶的參考微生物中存在旁系同源物和/或非直系同源基因置換，本領域技術人員也可利用這些進化上相關的基因。直系同源物、旁系同源物和非直系同源基因置換可以通過本領域技術人員熟知的方法進行測定。例如，對於兩種多肽，核酸或胺基酸序列的檢查將揭示出比較序列之間的序列同一性和相似性。基於這樣的相似性，本領域技術人員可以確定相似性是否足夠高以表明蛋白質是來自共同的祖先通過進化相關的。本領域技術人員熟知的算法，例如Align、BLAST、Clustal W等算法比較並測定原序列的相似性或同一性，並且也測定可比對權重或評分的序列中空位(gaps)的存在或顯著性。這樣的算法也是本領域已知的並且可同樣用於測定核苷酸序列相似性或同一丨I"生。具有足夠的相似性以確定親緣關係(relatedness)的參數可基於熟知的方法輸入計算機以計算統計相似性，或者在隨機多肽中找到相似匹配的機會，並且測定匹配的顯著性。兩個或更多個序列的計算機比較也可以(如果需要)由本 領域技術人員用肉眼最優化。預期有親緣關係的基因產物或蛋白質可具有高度相似性，例如25%至100%序列同一性。無親緣關係的蛋白質可具有與預期偶然發生基本上相同的同一性，如果對足夠大小的資料庫掃描(約5%)的話。佔5%和24%之間的序列可以代表或不代表足夠的同源性以得出結論是被比較序列是相關的。可以進行另外的統計分析以確定給出數據集大小的這類匹配的顯著性，從而確定這些序列的關係。運用BLAST算法來測定兩個或更多個序列的親緣關係(relatedness)的示例性參數可以是如下所示的。簡而言之，胺基酸序列比對可以使用BLASTP 2. 0.8版本(1999年I月5日)和以下參數進行矩陣(matrix) 0BL0SUM62 ;空位開放(gap open) :11 ;空位延伸(gap extension) :1 ；x_dropoff :50 ;期望值(expect) :10.0 ;字大小(wordsize) :3 ;過濾器(filter):開(on)。核酸序列比對可以使用BLASTN 2. 0. 6版本(1998年9月16日)和以下參數進行匹配(match) 1 ;錯配(mismatch) :_2 ;空位開放(gap open) :5 ;空位延伸(gap extension) :2 ；x_dropoff :50 ;期望值(expect) 10. 0 ;字大小(wordsize) :11 ;過濾器(filter):關(off)。本領域技術人員將會知道對以上參數可以做出什麼修改以或者增加或者減少例如比較的嚴格性和測定兩個或更多個序列的親緣關係。本發明提供一種非天然存在的微生物，包括一種具有(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑的微生物，該微生物包含至少一種編碼以足以產生(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的量表達的(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑酶的外源核酸，所述(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑包含2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸脫水酶(參見實施例I和

圖1，步驟C)。一種包含(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑的非天然存在的微生物還可包含I-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶或I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶(參見實施例I和圖1，步驟A和B)。因此，(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯可包含52-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸脫水酶、I-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶和I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶。本發明也提供一種非天然存在的微生物，包括一種具有對甲苯甲酸途徑的微生物，該微生物包含至少一種編碼以足夠產生對甲苯甲酸的量表達的對甲苯甲酸途徑酶的外源核酸，所述對甲苯甲酸途徑包含2-脫氫-3-脫氧磷酸庚糖酸合酶、3-脫氫奎尼酸合酶、3-脫氫奎尼酸脫水酶、莽草酸脫氫酶、莽草酸激酶、3-磷酸莽草酸-2-羧基乙烯基轉移酶、分支酸合酶或分支酸裂合酶(參見實施例II和圖2，步驟A-H)。一種具有對甲苯甲酸途徑的非天然存在的微生物還可包含(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑(圖I)。(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑可包含例如2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸脫水酶、I-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶或I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶(圖I)。本發明另外還提供一種非天然存在的微生物，包括一種具有對苯二甲酸途徑的微生物，該微生物包含至少一種編碼以足夠產生對苯二甲酸的量表達的對苯二甲酸途徑酶的外源核酸，所述對苯二甲酸途徑包含對甲苯甲酸甲基-單加氧酶還原酶、4-羧基苯甲醇脫氫酶或4-羧基苯甲醛脫氫酶(參見實施例III和圖3)。這樣一種含有對苯二甲酸途徑的生物體可另外包含對甲苯甲酸途徑，其中所述對甲苯甲酸途徑包含2-脫氫-3-脫氧磷酸庚糖酸合酶、3-脫氫奎尼酸合酶、3-脫氫奎尼酸脫水酶、莽草酸脫氫酶、莽草酸激酶、3-磷酸 莽草酸-2-羧基乙烯基轉移酶、分支酸合酶或分支酸裂合酶(參見實施例II和III及圖2 和圖3)。這樣一種具有對苯二甲酸途徑和對甲苯甲酸途徑的非天然存在的微生物還可包含(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑(參見實施例I和圖I)。(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑可包含例如2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸脫水酶、I-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶或I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶(參見實施例I和圖I)。在一個另外的實施方案中，本發明提供一種具有對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑的非天然存在的微生物，其中所述非天然存在的微生物包含至少一種編碼將底物轉變成產物的酶或蛋白質的外源核酸。例如，在(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑中，底物和產物可以選自3-磷酸甘油醛和丙酮酸與I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸；I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸與C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸；和C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸與(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯(參見實施例I和圖I)。在另一個實施方案中，對甲苯甲酸途徑可包含選自以下的底物和產物(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯與2，4- 二羥基-5-甲基-6-[(膦醯氧基)甲基]噁烷-2-羧酸酯；2，4- 二羥基-5-甲基-6-[(膦醯氧基)甲基]噁烷-2-羧酸酯與1，3- 二羥基-4-甲基-5-氧代環己烷-I-羧酸酯；1，3- 二羥基-4-甲基-5-氧代環己烷-I-羧酸酯與5-羥基-4-甲基-3-氧代環己-I-烯-I-羧酸；5_羥基-4-甲基-3-氧代環己-I-烯-I-羧酸與3，5- 二羥基-4-甲基環己-I-烯-I-羧酸酯；3，5- 二羥基-4-甲基環己-I-烯-I-羧酸酯與5-羥基-4-甲基-3-(膦醯氧基)環己-I-烯-I-羧酸酯；5-羥基-4-甲基-3-(膦醯氧基)環己-I-烯-I-羧酸酯與5-[ (I-羧基乙-I-烯-I-基)氧基]-4-甲基-3-(膦醯氧基)環己-I-烯-I-羧酸酯；5-[ (I-羧基乙-I-烯-I-基)氧基]-4-甲基-3-(膦醯氧基)環己-I-烯-I-羧酸酯與3-[(1_羧基乙-I-烯-I-基)氧基]-4-甲基環己-1，5- 二烯-I-羧酸酯；和3-[ (I-羧基乙-I-烯-I-基)氧基]-4-甲基環己-1，5-二烯-I-羧酸酯與對甲苯甲酸(參見實施例II和圖2)。在又一個實施方案中，對苯二甲酸途徑可包含選自以下的底物和產物對甲苯甲酸與4-羧基苯甲醇；4-羧基苯甲醇與4-羧基苯甲醛；和4-羧基苯甲醛與對苯二甲酸(參見實施例III和圖3)。本領域技術人員應當理解，這些都只是示例性的並且本文公開的適合於產生所需產物的和為此適宜活性可用於將底物轉變成產物的任何底物-產物對都可以根據本文公開的內容由本領域技術人員容易地確定。因此，本發明提供一種含有至少一種編碼酶或蛋白質的外源核酸的非天然 存在的微生物，其中所述酶或蛋白質能轉變對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑的底物和產物，如圖1-3所示的。儘管在本文中一般描述為含有對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑的微生物，但是應當理解，本發明另外還提供一種非天然存在的微生物，該微生物包含至少一種編碼對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑酶的外源核酸，其表達量足以產生對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑的中間體。例如，正如本文所公開的，(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑見圖I (參見實施例I)。因此，除了含有產生(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑的微生物以外，本發明另外還提供一種非天然存在的微生物，該微生物包含至少一種編碼(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑酶的外源核酸，其中所述微生物產生(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑中間體，例如I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸或C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸。同樣地，本發明也提供一種非天然存在的微生物，該微生物含有產生對甲苯甲酸的對甲苯甲酸途徑，其中所述非天然存在的微生物包含至少一種編碼對甲苯甲酸途徑酶的外源核酸，其中所述微生物產生對甲苯甲酸途徑中間體，例如2，4-二羥基-5-甲基-6-[(膦醯氧基)甲基]噁烷-2-羧酸酯、1，3- 二羥基-4-甲基-5-氧代環己烷-I-羧酸酯、5-羥基-4-甲基-3-氧代環己-I-烯-I-羧酸酯、3，5- 二羥基-4-甲基環己-I-烯-I-羧酸酯、5-羥基-4-甲基-3-(膦醯氧基)環己-I-烯-I-羧酸酯、5-[ (I-羧基乙-I-烯-I-基)氧基]-4-甲基-3-(膦醯氧基)環己-I-烯-I-羧酸酯或3-[ (I-羧基乙-I-烯-I-基)氧基]-4-甲基環己-1，5- 二烯-I-羧酸酯。此外，本發明另外還提供一種非天然存在的微生物，該微生物含有對苯二甲酸途徑酶，其中所述微生物產生對苯二甲酸途徑中間體，例如4-羧基苯甲醇或4-羧基苯甲醛。應當理解，本文公開的任何途徑，如在實施例中描述的和在附圖中例舉的，包括圖1-3的途徑，都可以用於產生非天然存在的微生物，該微生物按需要產生任何途徑中間體或產物。正如本文所公開的，這樣一種產中間體微生物可以與表達下遊途徑酶以產生所需產物的其它微生物聯合使用。然而，應當理解，產對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑中間體的非天然存在的微生物可以用於生產作為所需產物的中間體。本文中一般參照代謝反應、其反應物或產物,或具體參照編碼與參考代謝反應、反應物或產物相關的酶、或催化參考代謝反應、反應物或產物的酶、或與參考代謝反應、反應物或產物相關的蛋白質的一種或多種核酸或基因，對本發明進行了描述。除非本文另有明確的表述，否則本領域技術人員應當理解，參照反應也構成參照反應的反應物和產物。類似地，除非本文另有明確的表述，否則本領域技術人員應當理解，參照反應物或產物也參照反應，和參照這些代謝中的任何一個也參照編碼參與參考反應、反應物或產物的酶或蛋白質的一個或多個基因。同樣地，考慮到代謝生物化學、酶學和基因組學的公知領域，本文參照基因或編碼核酸也構成參照相應的編碼酶和它所催化的反應或與反應相關的蛋白質以及反應的反應物和產物。
本發明的非天然存在的微生物可以通過導入編碼參與一種或多種對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯生物合成途徑的酶或蛋白質中的一種或多種的可表達核酸來產生。根據生物合成所選出的宿主微生物，可以表達具體的對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯生物合成途徑中的某些或全部的核酸。例如，如果所選宿主在所需生物合成途徑的一種或多種酶或蛋白質中是有缺陷的，那麼可以將這種有缺陷的酶或蛋白質的可表達核酸導入宿主中用於後續的外源表達。或者，如果所選宿主表現出某些途徑基因的內源表達，但是其它的是有缺陷的，那麼對於這種有缺陷的酶或蛋白質來說，需要編碼核酸才能實現對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯生物合成。因此，本發明的非天然存在的微生物可以通過引入外源酶或蛋白質活性以獲得所需生物合成途徑來產生，或者所需生物合成途徑可以通過引入一種或多種外源酶或蛋白質活性來獲得，連同一種或多種內源的酶或蛋白質，產生所需產物，例如對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯。可以從例如細菌、酵母、真菌或可應用於發酵過程中的各種各樣的其它微 生物中的任何一種中選出宿主微生物，和在它們當中產生非天然存在的微生物。示例性的細菌包括選自以下的菌種大腸桿菌(Escherichia coli)、產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、產玻拍酸厭氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、玻拍酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)、產玻拍酸曼氏桿菌(Mannheimiasucciniciproducens)、豆根瘤菌(Rhizobium etli)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)、穀氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)、運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis)、乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、天藍色鏈黴菌(Streptomyces coelicolor)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、突光假單胞菌(Pseudomonas fIuorescens)和惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)。示例性的酵母或真菌包括選自以下的菌種釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces Iactis)、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)、土麴黴(Aspergillus terreus)、黑麴黴(Aspergillus niger)、巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)、少根根黴(Rhizopus arrhizus)、米根黴(Rhizobus oryzae)等。大腸桿菌是一種特別有用的宿主生物，因為它是一種經過充分表徵的微生物，適用於遺傳工程。其它特別有用的宿主生物包括酵母，例如釀酒酵母。應當理解，任何合適的微生物宿主生物體都可以用於引入代謝和/或遺傳修飾以產生所需產物。根據所選宿主微生物的對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯生物合成途徑組分，本發明的非天然存在的微生物將包括一種或多種對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯生物合成途徑的至少一種外源表達的對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑編碼核酸和多達所有的編碼核酸。例如，可以在途徑酶或蛋白質中有缺陷的宿主中通過相應編碼核酸的外源表達來建立對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯生物合成。在對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑的所有酶或蛋白質中有缺陷的宿主中，可以包括所有酶或蛋白質在該途徑中的外源表達，雖然應當理解，某一途徑的所有酶或蛋白質可以表達，即使該宿主含有途徑酶或蛋白質中的至少一個。例如，可以包括所有酶或蛋白質在產生對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的途徑中的外源表達。例如，可以包括對甲苯甲酸途徑中的所有酶，例如2-脫氫-3-脫氧磷酸庚糖酸合酶、3-脫氫奎尼酸合酶、3-脫氫奎尼酸脫水酶、莽草酸脫氫酶、莽草酸激酶、3-磷酸莽草酸-2-羧基乙烯基轉移酶、分支酸合酶和分支酸裂合酶。另外，可以包括對苯二甲酸途徑中的所有酶，例如對甲苯甲酸甲基-單加氧酶還原酶、4-羧基苯甲醇脫氫酶和4-羧基苯甲醛脫氫酶。而且，可以包括(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑中的所有酶，例如2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸脫水酶、I-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶和I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶。考慮到本文提供的教導和指導，本領域技術人員應當理解，以可表達形式引入的編碼核酸的數目將至少平行於所選宿主微生物的對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥 基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑缺陷。因此，根據所述的具體途徑，本發明的非天然存在的微生物可具有一、二、三、四、五、六、七或八種，乃至多達所有編碼本文公開的構成對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯生物合成途徑的酶或蛋白質的核酸。在有些實施方案中，非天然存在的微生物也可包括其它遺傳修飾，該遺傳修飾促進或優化對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯生物合成或者賦予宿主微生物其它有用的功能。一種這樣的其它功能性可包括例如加強對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑前體中的一種或多種例如3-磷酸甘油醛、丙酮酸、(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯或對甲苯甲酸的合成。此外，正如本文所公開的,在單個生物體中可以包括多個途徑,例如產生對甲苯甲酸(圖2)、對苯二甲酸(圖3)和(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯(圖I)的途徑(按需要)。一般而言，對宿主微生物進行選擇使得它產生對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑的前體，該前體或者作為天然產生的分子或者作為工程產物，以或者提供所需前體的從頭(de novo)產生或使由宿主微生物天然產生的前體的產生增加。例如，3-磷酸甘油醛和磷酸烯醇丙酮酸是在宿主生物(例如大腸桿菌)中天然產生的。宿主生物可以經工程改造以增加前體的產生，正如本文所公開的。另外，經過了工程改造以產生所需前體的微生物可以用作宿主生物並且經過進一步工程改造以表達對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑的酶或蛋白質。在有些實施方案中，本發明的非天然存在的微生物從含有合成對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的酶促能力的宿主中產生。在這個具體的實施方案中，它可用於增加對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑產物的合成或累積以例如驅動對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑反應朝向對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯產生。可以通過例如編碼上述對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑酶或蛋白質中的一種或多種的核酸的過量表達來完成增加的合成或累積。例如，通過一個或多個內源基因的外源表達，或者通過一個或多個異源基因的外源表達，可以發生對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑的一種或多種酶和/或一種或多種蛋白質的過量表達。因此，天然存在的生物體可以容易地產生出本發明的非天然存在的微生物，例如產生對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯，即通過一、二、三、四、五種……，乃至多達所有編碼對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯生物合成途徑酶或蛋白質的核酸的過量表達。另外，非天然存在的生物體可以通過內源基因的誘變導致對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯生物合成途徑中酶的活性增加來產生。在特別有用的實施方案中，採用了編碼核酸的外源表達。外源表達賦予宿主定製表達和/或調節元件的能力並且用於達到由使用者控制的所需表達水平。然而，內源表達也可以用於其它的實施方案中，例如通過去除負調節效應子或者當與誘導型啟動子或其它調節元件連接時誘導基因的啟動子。因此，具有天然存在的誘導型啟動子的內源基因可以通過提供適宜的誘導劑而上調，或者內源基因的調節區可以經工程改造以摻入誘導型調節元件，從而允許內源基因在所需時間的表達增加予以調節。類似地，可以包括誘導型啟動子作為調節元件以將外源基因引入到非天然存在的微生物中。·應當理解，在本發明的方法中，可以將任何一種或多種外源核酸引入到某種微生物中以產生本發明的非天然存在的微生物。所述核酸可以被引入以例如賦予所述微生物對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯生物合成途徑。或者，為了賦予對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯生物合成能力，編碼核酸可以被引入以產生具有生物合成能力以催化某些所需反應的中間微生物。例如，具有對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯生物合成途徑的非天然存在的微生物可包含至少兩種編碼所需酶或蛋白質的外源核酸。例如，在(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑中，已表達酶的組合可以是2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸脫水酶和I-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶的組合，或者2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸脫水酶和I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶的組合。在對甲苯甲酸途徑中，已表達酶的組合可以是2-脫氫-3-脫氧磷酸庚糖酸合酶和3-脫氫奎尼酸脫水酶的組合；莽草酸激酶和3-磷酸莽草酸-2-羧基乙烯基轉移酶的組合；莽草酸激酶和莽草酸脫氫酶的組合；等等。同樣地，在對苯二甲酸途徑中，已表達酶的組合可以是對甲苯甲酸甲基-單加氧酶還原酶和4-羧基苯甲醇脫氫酶的組合；或4-羧基苯甲醇脫氫酶和4-羧基苯甲醛脫氫酶的組合；等等。因此，應當理解，本發明的非天然存在的微生物中可包括生物合成途徑的兩種或更多種酶或蛋白質的任何組合。同樣地，應當理解，本發明的非天然存在的微生物中根據需要可包括生物合成途徑的三種或更多種酶或蛋白質的任何組合，例如，3-脫氫奎尼酸合酶、莽草酸脫氫酶和莽草酸激酶的組合；莽草酸激酶、分支酸合酶和分支酸裂合酶的組合；3-脫氫奎尼酸脫水酶、分支酸合酶和分支酸裂合酶的組合等等，只要所需生物合成途徑的酶和/或蛋白質的組合可以導致產生相應的所需產物即可。同樣地，本發明的非天然存在的微生物中根據需要可包括生物合成途徑的四、五、六、七種或更多種酶或蛋白質的任何組合(取決於本文所公開的途徑)，只要所需生物合成途徑的酶和/或蛋白質的組合可以導致產生相應的所需產物即可。除了本文所述的對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的生物合成以外，本發明的非天然存在的微生物和方法還可以彼此和與本領域熟知的其它微生物和方法以各種組合使用以達到產物通過其它路徑的生物合成。例如，不使用對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯生產者來產生對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的一種替代方法是通過加入另一種能夠將對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑中間體轉變成對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的微生物。一種這樣的程序包括例如產生對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑中間體的微生物的發酵。然後，對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑中間體可以用作第二種微生物的底物，從而將對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑中間體轉變成對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯。可以將對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑中間體直接加入到第二種生物體的另一種培養物中，或者對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑中間體生產者的原始培養物可以通過例如細胞分離來清除掉這些微生物，然後可以向發酵肉湯中後續添加第二種生物體用於生產最終產物而無需中間純化步驟。在其它實施方案中，本發明的非天然存在的微生物和方法可以按各種各樣的亞途徑裝配以實現例如對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯 的生物合成。在這些實施方案中，本發明所需產物的生物合成途徑分離在不同的微生物中，並且這些不同的微生物可以共培養以產生最終產物。在這樣一種生物合成方案中，一種微生物的產物是第二種微生物的底物直到最終產物被合成。例如，對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的生物合成可以通過構建含有將一種途徑中間體轉變成另一種途徑中間體或產物的生物合成途徑的微生物來完成。或者，對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯也可以通過在同一容器中使用兩種生物體的共培養或共發酵由微生物經生物合成生產，其中第一種微生物生產對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯中間體，而第二種微生物將此中間體轉變成對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯。考慮到本文提供的教導和指導，本領域技術人員將會理解，存在著本發明的非天然存在的微生物和方法與其它微生物、與具有亞途徑的其它非天然存在的微生物的共培養物和與本領域熟知的生產對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的其它化學和/或生物化學方法步驟的組合一起的各種組合和排列。對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑酶或蛋白質的編碼核酸來源可包括例如其中所編碼的基因產物能夠催化參考反應的任何物種。這樣的物種既包括原核生物又包括真核生物，包括但不限於細菌，包括古細菌(archaea)和真細菌(eubacteria);和真核生物，包括酵母、植物、昆蟲、動物和哺乳動物，包括人。這些來源的示例性物種包括例如大腸桿菌(Escherichia coli)、結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)、根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)、枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)、集胞藻(Synechocystis sp.)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis)、產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)、丘狀菌落乳桿菌(Lactobacullus collinoides)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、巴氏梭菌(Clostridium pasteuranum)、弗氏朽1 樣酸桿菌(Citrobacter freundii)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、Roseburia inulinivorans、硫石黃礦硫化葉菌(Sulfolobussolfataricus)、粗糖鏈抱黴(Neurospora crassa)、費氏中華根瘤菌(Sinorhizobiumfredii)、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)、激烈熱球菌(Pyrococcus furiosus) >流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、菊歐文氏菌(Erwinia chrysanthemi)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、構巢麴黴(Aspergillus nidulans)、卡氏月市囊蟲(Pneumocystis carinii)、天藍色鏈黴菌(Streptomyces coelicolor),來自伯克氏菌屬(Burkholderia)、產喊菌屬(Alcaligenes)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鞘氨醇單胞菌屬(Shingomonas)和叢毛單胞菌屬(Comamonas)(例如睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni))的菌種，以及本文公開的或可作為相應基因的來源生物體獲得的其它示例性物種。然而，關於從現在起超過550個種可獲得的完全基因組序列(其中超過一半可在公共資料庫例如NCBI上獲得)，包括395種微生物基因組和各種各樣的酵母、真菌、植物和哺乳動物基因組，在近緣或遠緣物種中的一個或多個基因中，包括例如已知基因的同系物(homologue)、直系同源物、旁系同源物和非直系同源基因置換，編碼所必需的對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯生物合成活性的基因的鑑定，以及生物體間遺傳改變的交換在本領域是常規的和眾 所周知的。因此，對於某一特定的生物體例如大腸桿菌來說，允許本文所述的對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的生物合成的代謝改變可同樣容易地適用於其它微生物，包括原核生物和真核生物。考慮到本文提供的教導和指導，本領域技術人員將會知道，一種生物體中例舉的代謝改變可同等地應用於其它生物體。在有些情況下，例如當無親緣關係的物種中存在對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯生物合成替代途徑時，通過例如來自催化相似、但非相同的代謝反應以代替參考反應的無親緣關係的物種的一種或多種旁系同源物的外源表達，可以在宿主物種上賦予對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯生物合成。因為不同的生物體之間在代謝網絡中存在著某些差異，所以，本領域技術人員應當理解，在不同的生物體之間實際基因使用可能有差異。然而，考慮到本文提供的教導和指導，本領域技術人員也應當理解，採用本文例舉的那些的關聯(cognate)代謝改變以在目標物種中構建將合成對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的微生物，本發明的教導和方法可適用於所有的微生物。用於構建非天然存在的產對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯宿主並測試其表達水平的方法可以通過例如本領域眾所周知的重組和檢測方法來實施。這樣的方法可以在例如以下文獻中找到Sambrook等人，MolecularCloning A Laboratory Manual,第三版,Cold Spring Harbor Laboratory, NewYork(2001);和 Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology, John Wileyand Sons, Baltimore, MD(1999) 採用本領域眾所周知的技術，包括但不限於接合、電穿孔、化學轉化、轉導、轉染和超聲轉化，可以將參與產生對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的途徑的外源核酸序列穩定地或瞬時地導入宿主細胞中。對於在大腸桿菌或其它原核細胞中的外源表達，真核生物核酸的基因或cDNA中的某些核酸序列可以編碼靶向信號，例如N-端線粒體靶向信號或其它靶向信號，這些靶向信號可以在轉化到原核宿主細胞之前去除掉(如果需要的話)。例如，線粒體前導序列的去除導致在大腸桿菌中的表達增加(Hoffmeister 等人，J. Biol. Chem. 280:4329-4338 (2005))。對於在酵母或其它真核細胞中的外源表達，基因可以在胞質溶膠中表達而無需添加前導序列，或者可以靶向線粒體或其它細胞器，或者通過添加合適的靶向序列例如適合宿主細胞的線粒體靶向信號或分泌信號而靶向分泌。因此，應當理解，為了去除或包括靶向序列而對核酸序列的適宜修飾可以被摻入到外源核酸序列中以帶來所需要的特性。此外，基因可以用本領域眾所周知的技術進行密碼子優化以達到蛋白質的最佳表達。正如本文例舉的,可以構建一種或多種表達載體以包括一種或多種對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯生物合成途徑編碼核酸，該編碼核酸與宿主生物中有功能的表達調控序列操作性連接。適用於本發明的微生物宿主生物的表達載體包括例如質粒、噬菌體載體、病毒載體、附加體(episomes)和人工染色體，包括能夠穩定地整合到宿主染色體中的載體和選擇序列或標記。另外，表達載體可包括一個或多 個選擇標記基因和適宜的表達調控序列。也可包括例如提供對抗生素或毒素的抗性、代償營養缺陷或者供給培養基中沒有的關健營養物的選擇標記基因。表達調控序列可包括組成型和誘導型啟動子、轉錄增強子、轉錄終止子等，這些都是本領域眾所周知的。當兩種或更多種外源編碼核酸必須共表達時，可以將兩種核酸例如插入到一個表達載體中或者插入到獨立的表達載體中。對於單個載體表達，編碼核酸可以與一個共同的表達調控序列操作性連接或者與不同的表達調控序列(例如一個誘導型啟動子和一個組成型啟動子)操作性連接。參與代謝或合成途徑的外源核酸序列的轉化可以使用本領域眾所周知的方法來證實。這樣的方法包括例如核酸分析法，例如mRNA的RNA印跡法或聚合酶鏈式反應(PCR)擴增法，或用於基因產物表達的免疫印跡法，或測試引入的核酸序列或其相應基因產物表達的其它合適分析方法。本領域技術人員應當理解，外源核酸以足以產生所需產物的量進行表達，本領域技術人員還應當理解，可以採用本領域眾所周知的和本文公開的方法對表達水平進行優化以獲得足夠的表達。本發明另外還提供一種用於生產(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的方法，包括將含有(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑的非天然存在的微生物在足以產生(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的條件下培養足夠的時間周期。這樣一種微生物可具有(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑，該途徑包含至少一種編碼以足以產生(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的量表達的(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑酶的外源核酸，所述(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑包含2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸脫水酶(參見實施例I和圖1，步驟C)。(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑可任選還包含I-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶和/或I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶(參見實施例I和圖1，步驟A和B)。在另一個實施方案中，本發明提供一種用於生產對甲苯甲酸的方法，包括將包含對甲苯甲酸途徑的非天然存在的微生物在足以產生對甲苯甲酸的條件下培養足夠的時間周期。對甲苯甲酸途徑可包含至少一種編碼以足以產生對甲苯甲酸的量表達的對甲苯甲酸途徑酶的外源核酸，所述對甲苯甲酸途徑包含2-脫氫-3-脫氧磷酸庚糖酸合酶、3-脫氫奎尼酸合酶、3-脫氫奎尼酸脫水酶、莽草酸脫氫酶、莽草酸激酶、3-磷酸莽草酸-2-羧基乙烯基轉移酶、分支酸合酶和/或分支酸裂合酶(參見實施例II和圖2，步驟A-H)。在另一個實施方案中，本發明的方法可以使用一種還包含(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑的非天然存在的微生物(參見實施例I和圖I)。這樣一種(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑可包含2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸脫水酶、I-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶和/或I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶(參見實施例I和圖I)。本發明還提供一種用於生產對苯二甲酸的方法，包括將含有對苯二甲酸途徑的非天然存在的微生物在足以產生對苯二甲酸的條件下培養足夠的時間周期。這樣一種對苯二甲酸途徑可包含至少一種編碼以足以產生對苯二甲酸的量表達的對苯二甲酸途徑酶的外源核酸，所述對苯二甲酸途徑包含對甲苯甲酸甲基-單加氧酶還原酶、4-羧基苯甲醇脫氫酶和/或4-羧基苯甲醛脫氫酶。這樣一種微生物還可包含對甲苯甲酸途徑，其中所述對甲苯甲酸途徑包含2-脫氫-3-脫氧磷酸庚糖酸合酶、3-脫氫奎尼酸合酶、3-脫氫奎尼酸脫水酶、莽草酸脫氫酶、莽草酸激酶、3-磷酸莽草酸-2-羧基乙烯基轉移酶、分支酸合酶和/或分支酸裂合酶(參見實施例2和實施例3及圖2和圖3)。在另一個實施方案中，所述非天然存在的微生物還可包含(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑(參見實施例I和圖I)。因此，在一個具體的實施方案中，本發明提供一種非天然存在的微生物及其使用方 法，其中所述微生物含有對甲苯甲酸途徑、對苯二甲酸途徑和(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑。可以採用眾所周知的方法進行合適的純化和/或測定以測試對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的產生。對於每個待測的工程菌株，可以讓合適的重複例如一式三份的培養物生長。例如，可以監測工程生產宿主中產物和副產物的形成。通過諸如HPLC(高效液相層析)、GC-MS (氣相層析-質譜法)、LC-MS (液相層析-質譜法)和UV-可見光譜法的方法或者採用本領域眾所周知的常規程序的其它合適分析方法，可以對最終的產物和中間體、和其它有機化合物進行分析。發酵肉湯中產物的釋放也可以用培養物上清液進行測試。採用例如折射率檢測器(對於葡萄糖和醇)和UV檢測器(對於有機酸)(Lin等人，Biotechnol. Bioeng. 90:775-779(2005))或本領域眾所周知的其它合適的測定和檢測方法，副產物和殘留葡萄糖可以通過HPLC進行定量。來自外源DNA序列的個體酶或蛋白質活性也可以用本領域眾所周知的方法進行測定。例如，對甲苯甲酸甲基-單加氧酶活性可以通過以下方法進行測定將純化的酶與NADH、FeS04和對甲苯甲酸底物一起在水浴中孵育，通過蛋白質的沉澱使反應終止，和通過HPLC分析上清液中的產物(Locher 等人，J. Bacteriol. 173:3741-3748 (1991))。採用本領域眾所周知的各種方法，可以將對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯與培養物中的其它組分分離開來。這樣的分離方法包括例如萃取程序以及方法，包括連續的液液萃取、全蒸發、膜過濾、膜分離、反滲透、電滲析、蒸餾、結晶、離心、萃取過濾、離子交換層析、大小排阻層析、吸附層析和超濾。所有的上述方法都是本領域眾所周知的。本文所述的任何非天然存在的微生物可以進行培養以產生和/或分泌本發明的生物合成產物。例如，對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯生產者可以進行培養以經生物合成生產對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯。
為了生產對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯，將重組菌株在含碳源和其它必需營養物的培養基中進行培養。有時較為理想的是在發酵罐中維持厭氧條件以降低總過程的成本。這樣的條件可以用下述方法獲得例如，首先在培養基中充入氮氣，然後將帶有隔片和皇冠蓋的燒瓶密封。對於其中在厭氧條件下未觀察到生長的菌株來說，可以採用微好氧條件，即在隔片上鑽小洞供有限通氣。示例性的厭氧條件先前已有描述並且是本領域眾所周知的。示例性的好氧和厭氧條件描述於例如於2007年8月10日申請的美國專利公布2009/0047719。發酵可按本文公開的分批方式、補料-分批方式或連續方式進行。如有需要，可以將培養基的pH維持在所需要的pH，特別是中性pH，例如pH約為7，即通過按需要加入鹼(例如NaOH或其它鹼)或酸以將培養基維持在所需要的pH。生長速率可以通過使用分光光度計^OOnm)測量光密度來測定，葡萄糖攝取速率可以通過監測碳源隨時間的消耗量來測定。生長培養基可包括例如可以給所述非天然存在的微生物供應碳源的任何碳水化合物來源。這樣的來源包括例如糖，例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖、蔗糖和澱粉。碳水化合物的其它來源包括例如可再生忙存物(renewable feedstocks)和生物質。在本發明的方法中可用作貯存物的示例性生物質類型包括纖維素類生物質、半纖維素類生物質和木質素貯存物或貯存物部分。這樣的生物質類貯存物含有例如可用作碳源的碳水化合物底物例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖和澱粉。考慮到本文提供的教導和指導，本領域技術人員將會理解，除了以上例舉的那些以外的可再生貯存物和生物質也可以用來培養本發明的微生物以生產對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯。除了可再生貯存物例如以上例舉的那些以外，本發明的對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯微生物也可以進行修飾以在作為其碳源的合成氣上進行生長。在這個具體的實施方案中，使一種或多種蛋白質或酶在產對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的生物體中進行表達以提供利用合成氣或其它氣體碳源的代謝途徑。合成氣體(synthesis gas),也稱為合成氣(syngas)或發生爐煤氣(producergas)，是煤的氣化和含碳材料例如生物質材料(包括農作物和殘留物)的氣化的主要產物。合成氣是主要為H2和CO的混合物並且可以得自任何有機貯存物，包括但不限於煤、煤油、天然氣、生物質和廢有機物質的氣化。氣化一般在在高燃料/氧比率下進行。儘管主要是H2和CO，但是合成氣也可包括少量的CO2和其它氣體。因此，合成氣體提供了一種成本有效的氣體碳源例如CO，另外還有CO2。Wood-Ljungdahl途徑催化CO和H2轉變成乙醯-CoA和其它產物(例如乙酸鹽(酯)(acetate))。能夠利用CO和合成氣的生物體一般也具有通過Wood-Ljungdahl途徑所包括的一組相同的基礎酶和轉化作用來利用CO2和C02/H2混合物的能力。由微生物將CO2經H2依賴性轉變成乙酸酯在揭示出CO也可以被相同的生物體所利用並且涉及相同的途徑之前不久就被認識到。許多產乙酸菌(acetogen)已顯示能在CO2存在下生長並產生諸如乙酸鹽的化合物，只要有氫存在以供給必需的還原當量 即可(參見例如，Drake, Acetogenesis, pp. 3-60 Chapman and Hall, New York, (1994))。這可以用以下反應式概述2C02+4H2+nADP+nPi — CH3C00H+2H20+nATP因此，具備Wood-Ljungdahl途徑的非天然存在的微生物也可以利用CO2和H2混合物來產生乙醯-CoA和其它所需產物。Wood-Ljungdahl途徑是本領域眾所周知的並且由12個反應組成,這12個反應可分成兩支(I)甲基支和(2)羰基支。甲基支將合成氣轉變成甲基-四氫葉酸(甲基-THF)，而羰基支將甲基-THF轉變成乙醯-CoA。甲基支中的反應由以下酶或蛋白質按順序催化鐵氧還蛋白氧化還原酶、甲酸脫氫酶、甲醯基四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環化脫水酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶。羰基支中的反應由以下酶或蛋白質按順序催化甲基四氫葉酸類咕啉(corrinoid)蛋白甲基轉移酶(例如AcsE)、類咕啉鐵-硫蛋白、鎳蛋白裝配蛋白(例如AcsF)、鐵氧還蛋白、乙醯-CoA合酶、一氧化碳脫氫酶和鎳蛋白裝配蛋白(例如CooC)。根據本文提供的用於引入足夠數目的編碼核酸以產生對甲苯甲酸途徑、對苯二甲酸途徑或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑的教導和指導， 本領域技術人員應當理解，就至少導入在宿主生物中不存在的編碼Wood-Ljungdahl酶或蛋白質的核酸而論，也可以進行相同的工程設計。因此，將一種或多種編碼核酸導入到本發明的微生物中使得經修飾的生物體含有完全Wood-Ljungdahl途徑將會賦予合成氣利用能力。還原性三羧酸循環結合一氧化碳脫氫酶和/或加氫酶活性也可以允許CO、CO2和/或H2轉變成乙醯-CoA和其它產物(例如乙酸鹽(酯))。通過還原性TCA途徑能夠固定碳的生物體可以利用下列酶中的一種或多種ATP檸檬酸-裂合酶、檸檬酸裂合酶、順烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶、a-酮戊二酸鐵氧還蛋白氧化還原酶、琥珀醯-CoA合成酶、琥珀醯-CoA轉移酶、延胡索酸還原酶、延胡索酸酶、蘋果酸脫氫酶、NAD(P)H:鐵氧還蛋白氧化還原酶、一氧化碳脫氫酶和加氫酶。具體地講，通過一氧化碳脫氫酶和加氫酶從CO和/或H2萃取的還原性當量(reducing equivalents)用於通過還原性TCA循環將CO2固定成為乙醯-CoA或乙酸鹽(酯)。乙酸鹽(酯)可通過例如乙醯-CoA轉移酶、乙酸激酶/磷酸轉乙醯酶和乙醯-Cok合成酶等酶轉變成乙醯-CoA。乙醯-Cok可通過丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶和糖異生作用(gluconeogenesis)的酶轉變成對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯前體、3-磷酸甘油醛、磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸。根據本文提供的用於引入足夠數目的編碼核酸以產生對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑的教導和指導，本領域技術人員應當理解，就至少導入在宿主生物中不存在的編碼還原性TCA途徑酶或蛋白質的核酸而論，也可以進行相類似的工程設計。因此，將一種或多種編碼核酸導入到本發明的微生物中使得經修飾的生物體含有完全還原性TCA途徑將會賦予合成氣利用能力。因此，考慮到本文提供的教導和指導，本領域技術人員應當理解，非天然存在的微生物當在碳源(例如碳水化合物)上生長時就可以產生並分泌本發明的生物合成化合物。這樣的化合物包括例如對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯和任何在對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑中的中間代謝物。在所需酶或蛋白質活性中的一個或多個中，全都需要進行工程改造以達到所需化合物或中間體，包括例如對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯生物合成途徑中的某些或全部的生物合成。因此，本發明提供一種非天然存在的微生物，當在碳水化合物或其它碳源上生長時能產生和/或分泌對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯並且當在碳水化合物或其它碳源上生長時能產生和/或分泌對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑中所示的中間代謝物的任何一個。本發明的產對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯微生物可以從中間體開始合成。例如，(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑中間體可以是I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸或C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(參見實施例I和圖I)。對甲苯甲酸途徑中間體可以是例如2，4-二羥基-5-甲基-6-[(膦醯氧基)甲基]噁烷-2-羧酸酯、1，3- 二羥基-4-甲基-5-氧代環己烷-I-羧酸酯、5-羥基-4-甲基-3-氧代環己-I-烯-I-羧酸酯、3，5- 二羥基-4-甲基環己-I-烯-I-羧酸酯、5-羥基-4-甲基-3-(膦醯氧基)環己-I-烯-I-羧酸酯、5-[ (I-羧基乙-I-烯-I-基)氧基]-4-甲基-3-(膦醯氧基)環己-I-烯-I-羧酸酯或3-[(1_羧基乙-I-烯-I-基)氧基]-4-甲基環己-1，5-二烯-I-羧酸酯(參見實施例II和圖2)。對苯二甲酸中間體可以是例如4-羧基苯甲醇或4-羧基苯甲醛(參見實施例III和圖3)。 使用本領域眾所周知的方法(如本文例舉的方法)構建本發明的非天然存在的微生物以外源性表達至少一種編碼對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑酶或蛋白質的核酸，其表達量足以產生對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯。應當理解，本發明的微生物在足以產生對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的條件下進行培養。根據本文提供的教導和指導，本發明的非天然存在的微生物可以實現生物合成對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯，導致胞內濃度在約0. l-200mM之間或更高。一般而言，對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的胞內濃度是在約3-150mM之間，特別是在約5-125mM之間，和更特別是在約8_100mM之間，包括約10mM、20mM、50mM、80mM或更高。在這些示例性範圍中的每一個範圍內或者高於它們的胞內濃度也可以由本發明的非天然存在的微生物實現。在有些實施方案中，培養條件包括厭氧或基本上厭氧的生長或維持條件。示例性的厭氧條件先前已有描述並且是本領域眾所周知的。用於發酵過程的示例性厭氧條件在本文中有描述並且描述於2007年8月10日申請的美國專利公布2009/0047719。這些條件中的任何一個都可以與所述非天然存在的微生物以及本領域眾所周知的其它厭氧條件一起使用。對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯生產者可以在基本上厭氧的條件下合成對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯，達到胞內濃度為5-10mM或更高以及本文例舉的所有其它濃度。應當理解，即使上述描述指的是胞內濃度，但是產對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯微生物可以在細胞內產生對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯和/或將該產物分泌到培養基中。除了本文公開的培養和發酵條件以外，用於實現對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯生物合成的生長條件還可包括往培養條件中添加滲透保護劑。在某些實施方案中，本發明的非天然存在的微生物可以在滲透保護劑存在下按本文所述方法進行保持、培養或發酵。簡而言之，滲透保護劑是指起到滲透質的作用的並且有助於本文所述微生物在滲透脅迫下存活的化合物。滲透保護劑包括但不限於甜菜鹼、胺基酸和糖(如海藻糖)。這類滲透保護劑的非限制性實例有甘氨酸甜菜鹼、果仁糖甜菜鹼、二甲基噻亭、二甲基磺酸基(slfonio)丙酸鹽、3-二甲基磺酸基(sulfonio)-2-甲基丙酸鹽、哌可酸、二甲基磺酸基乙酸鹽、膽鹼、L-肉毒鹼和(S)-2-甲基-1，4，5，6-四氫甲基嘧啶-4-羧酸(ectoine)。在一個方面，所述滲透保護劑是甘氨酸甜菜鹼。本領域普通技術人員應當理解，適合保護本文所述微生物免於滲透脅迫的滲透保護劑的含量和類型將取決於所使用的微生物。滲透保護劑在培養條件下的含量可以例如為不超過約0. ImM、不超過約0. 5mM、不超過約I. OmM、不超過約I. 5mM、不超過約2. OmM、不超過約2. 5mM、不超過約3. OmM>不超過約5. OmM、不超過約7. OmM、不超過約10mM、不超過約50mM、不超過約IOOmM或不超過約 500mM。培養條件可包括例如液體培養程序以及發酵和其它大規模培養程序。如本文所述的，本發明的生物合成產物的特別有用的產能可以在厭氧或基本上厭氧培養條件下獲得。如本文所述的，用於實現生物合成對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的一種示例性生長條件包括厭氧培養或發酵條件。在某些實施 方案中，本發明的非天然存在的微生物可以在厭氧或基本上厭氧的條件下進行保持、培養或發酵。簡而言之，厭氧條件是指無氧的環境。基本上厭氧的條件包括例如培養、分批發酵或連續發酵使得培養基中的溶解氧濃度保持在0和10%飽和之間。基本上厭氧的條件也包括密封室裡面的液體培養基中或固體瓊脂上的生長細胞或靜止細胞維持在小於1%氧的氣氛下。氧的百分比可以通過例如在培養物中通入乂/0)2混合物或其它合適的一種或多種非氧氣體來維持。為了製備對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯，可以將本文所述的培養條件連續放大和生長。示例性生長程序包括例如補料-分批發酵和分批分離；補料-分批發酵和連續分離；或連續發酵和連續分離。所有的這些過程都是本領域眾所周知的。發酵程序特別用於經生物合成生產商業數量的對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯。一般而言，並根據非連續培養程序，對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的連續和/或接近連續生產包括將本發明的非天然存在的產對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯生物體在足夠的營養物和培養基中進行培養以保持和/或幾乎保持其以指數期生長。在這樣的條件下連續培養可以包括例如生長I天，2、3、4、5、6或7天或更長時間。另外，連續培養可包括I周、2、3、4或5周或更多周，甚至達到數月的較長時間周期。或者，本發明的生物體可以培養數小時，如果適合具體應用的話。應當理解，連續和/或接近連續培養條件也可包括在這些示例性周期之間以內的所有時間間隔。還應當理解，本發明微生物的培養時間是產生足夠量的產物用於所需目的的足夠時間周期。發酵程序是本領域眾所周知的。簡而言之，用於生物合成性生產對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的發酵可用於例如補料-分批發酵和分批分離；補料-分批發酵和連續分離；或連續發酵和連續分離。分批和連續發酵程序的實例是本領域眾所周知的。除了使用本發明的對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯生產者來連續生產相當大量的對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的上述發酵程序以外，所述對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯生產者也可以例如同時經歷化學合成程序以將產物轉變成其它化合物，或者產物可以從發酵培養物中分離出來後再經歷化學轉變以將產物轉變成其它化合物，如果需要的話。為了產生更好的生產者，可以採用代謝建模來使生長條件最優化。建模也可用來設計另外最優化途徑利用的基因敲除(gene knockout)(參見例如，美國專利公布US2002/0012939,US 2003/0224363、US 2004/0029149,US 2004/0072723、US 2003/0059792、US 2002/0168654和US 2004/0009466和美國專利第7，127，379號)。建模分析允許可靠
地預測對代謝朝著更有效產生對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯轉換的細胞生長的影響。用於鑑定和設計代謝改變有利於生物合成所需產物的一種計算方法是OptKnock·計算框架(framework) (Burgard 等人，Biotechnol. Bioeng. 84:647-657 (2003))。OptKnock是一種代謝建模和模擬程序，它給出基因缺失或破壞策略的建議，導致產生遺傳上穩定的微生物，從而過量產生靶產物。具體地講，該框架檢查微生物的完全代謝和/或生物化學網絡，以便給出遺傳操作建議，從而迫使所需生物化學品變成細胞生長的專性(obligatory)副產物。通過生物化學生產與細胞生長通過策略性置入的基因缺失或其它功能性基因破壞相結合，在生物反應器中長時間周期之後施加在工程菌株上的生長選擇壓力導致生產性能的改進，這種改進是強制生長偶聯的生物化學生產所致的結果。最後，當構建基因缺失時，經設計的菌株回復成它們的野生型狀態的可能性可忽略不計，因為通過OptKnock選出的基因已從基因組中完全取出。因此，這種計算方法可以用於或者鑑定導致生物合成所需產物的替代途徑或者結合所述非天然存在的微生物使用以進一步最優化所需產物的生物合成。簡而言之，OptKnock是在本文中使用的一個術語，指的是用於細胞代謝建模的一種計算方法和系統。OptKnock程序與將特殊約束(constraint)摻入到流量平衡分析(FBA)模型的模型和方法的框架相關。這些約束包括例如定性動態信息、定性調節信息和/或DNA微陣列實驗數據。OptKnock也計算各種代謝問題的解決方案,例如通過收緊通過流量平衡模型獲得的流量邊界，並隨後探測在基因添加或缺失存在下代謝網絡的性能限制。OptKnock計算框架允許構建模型格式，模型格式允許有效查詢代謝網絡的性能限制並提供解決所得混合整數線性編程問題的方法。本文稱為OptKnock的代謝建模和模擬方法描述於例如美國專利公布2002/0168654(申請日為2002年I月10日)、國際專利申請第PCT/US02/00660號(申請日為2002年I月10日)和美國專利公布2009/0047719(申請日為2007年8月10日)。用於鑑定和設計代謝改變有利於生物合成性生產產物的另一種計算方法是一種稱為SimPheny⑩的代謝建模和模擬系統。這種計算方法和系統描述於例如美國專利公布2003/0233218(申請日為2002年6月14日)和國際專利申請第PCT/US03/18838號(申請日為2002年6月13日)。SimPheny⑩是一種計算系統，其可用於產生計算機模似(insilico)網絡模型並且模擬質量、能量或電荷通過生物系統的化學反應的流通量(flux)，以定義在該系統中含有化學反應的任何和所有可能功能性的解空間(solution space)，從而確定生物系統的允許活性範圍。這種方法被稱為基於約束的建模，因為解空間由約束例如所包括反應的已知化學計量以及與通過反應的最大流通量相關的反應熱力學和容量約束限定。由這些約束限定的空間可以進行詢問以確定生物系統或其生化組分的表型能力和行為。這些計算方法與生物的真實性相一致，因為生物系統是靈活多變的並且能夠以許多不同的方式達到相同的結果。通過進化機制設計出生物系統一直都受到所有有生命的系統必須面對的基礎約束的限制。因此，基於約束的建模策略包括這些普遍(general)真實性。此外，通過約束收緊而將進一步限制連續施加到網絡模型上的能力導致解空間大小的縮小，從而提高可預測生理性能或表型的精確度。考慮到本文提供的教導和指導，本領域技術人員將能夠應用各種計算框架進行代謝建模和模擬以設計並實施所需化合物在宿主微生物中的生物合成。這樣的代謝建模和模擬方法包括例如以上例舉的計算系統，如SimPheny 和OptKnock0為了舉例說明本發明，本文參照OptKnock的建模和模擬計算框架描述了一些方法。本領域技術人員將會知道該如何使用OptKnock將代謝改變的鑑定、設計和實施應用到本領域眾所周知的任何這類其 它代謝建模和模擬計算框架和方法中。上述方法將提供一組代謝反應予以破壞。該組代謝反應或代謝修飾內各反應的消除可導致產生所需產物，該所需產物在生物體的生長階段期間作為專性產物。因為反應都是已知的，所以解決bilevel OptKnock問題的方案也將提供編碼催化該組反應內各反應的一種或多種酶的一個或多個相關基因。一組反應及其編碼參與各反應的酶的相應基因的鑑定一般都是自動化過程，通過找出反應與具有在酶和編碼基因之間的關係的反應資料庫的聯繫來完成。一旦被鑑定出來，就在靶細胞或靶生物體中，通過功能性破壞至少一個編碼該組內各代謝反應的基因來進行已被破壞的該組反應，以達到產生所需產物。一種特別有用的達到功能性破壞反應組的手段是通過剔除各編碼基因。然而，在有些情況下，通過其它遺傳畸變(包括例如調節區(例如啟動子)或調節因子的順式結合位點的突變、缺失)，或者通過在任何數目的位置上編碼序列的截短，來破壞反應可能是有益的。導致基因組小於總缺失的這些後來遺傳畸變，都可用於例如當需要產物偶聯的快速評價時，或者當遺傳回復(reversion)幾乎不可能發生時。為了確認上述bilevel OptKnock問題的額外生產方案，可以執行一種稱為integer cut的最優化方法,上述bilevel OptKnock問題可導致更多組反應要破壞或代謝修飾從而生物合成(包括生長偶聯的生物合成)所需產物。該方法向前進行以迭代解決以上例舉的OptKnock問題並在各次迭代上摻入稱為integer cut的額外約束。integercut約束有效地阻止求解過程(solution procedure),避免挑選出在將產物生物合成與生長強制偶聯的任何之前迭代中鑑定的切實相同的反應組。例如，如果先前鑑定的生長偶聯的代謝修飾對於破壞具體到反應1、2和3，那麼以下約束阻止相同反應以避免在後續求解中同時考慮。integer cut方法是本領域眾所周知的並且可以在例如Burgard等人，Biotechnol. Prog. 17:791-797(2001)中找到。關於本文所述的所有方法及其結合代謝建模和模擬的OptKnock計算框架的應用，在迭代計算分析中降低冗餘度的integer cut方法也可以結合本領域熟知的其它計算框架(包括例如SimPheny⑩)使用。本文例舉的方法允許構建經生物合成生產所需產物的細胞和生物體，包括將靶生物化學產物的生產與經工程改造以包含已鑑定的遺傳改變的細胞或生物體的生長專性相偶聯。因此，本文所述的計算方法允許鑑定和實施通過選自OptKnock或SimPheny⑩的計算機模似方法鑑定的代謝修飾。該組代謝修飾可包括例如添加一種或多種生物合成途徑酶和/或功能性破壞一個或多個代謝反應，包括例如通過基因缺失來破壞。正如上所論述的，OptKnock方法在突變型微生物網絡當經歷長時期的生長選擇時可以朝向其計算預測的最大生長表型進化的前提下開發出來。換句話說，該方法促使生物體在選擇壓力下自身最優化的能力發生改變。OptKnock框架允許基因缺失組合的窮盡性列舉，迫使在生物化學生產和基於網絡化學計量的細胞生長之間有偶聯。最佳基因/反應敲除的鑑定需要bilevel最優化問題的方案，從而挑選出主動反應組使得所得網絡的最佳生長方案過量生產目標生物化學產物(Burgard等人，Biotechnol.Bioeng. 84:647-657(2003))。大腸桿菌代謝的計算機模似化學計量模型可用於鑑定代謝途徑中的必需基因，如先前例舉的和描述於例如美國專利公布US 2002/0012939、US 2003/0224363、US 2004/0029149、 US 2004/0072723、 US 2003/0059792、 US 2002/0168654 和 US 2004/0009466 ;和美國專利第7，127，379號。正如本文所公開的，OptKnock數學框架可用於準確地點出導致所需產物的生長偶聯生產的基因缺失。此外，bilevel OptKnock問題的方案提供了唯一的一組缺失。為了列舉出所有有意義的方案，也就是說，所有導致生長偶聯生產形成的敲除組，可以執行一項稱為integer cut的最優化技術。這項技術需要在各次迭代上摻入稱為integer cut的額外約束來迭代解決所述OptKnock問題,正如以上所討論的。正如本文所公開的，可以將編碼對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑所需活性的核酸導入宿主生物中。在有些情況下，可能理想的是改變對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑酶或蛋白質的活性以增加對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的產量。例如，可以將增加蛋白質或酶活性的已知突變引入到編碼核酸分子中。另外，最優化方法可以用來增加酶或蛋白質的活性和/或減少抑制活性，例如減少負調節物的活性。—種這樣的最優化方法是定向進化(directed evolution)。定向進化是一種十分有效的方法，包括引入靶向特定基因的突變以便改進和/或改變酶的特性。經改進和/或改變的酶可以通過靈敏的高通量篩選測定的開發和實施來進行鑑定，該測定允許許多酶變異體(例如，>104)的自動化篩選。通常要進行多輪重複的誘變和篩選才能獲得具有最優化特性的酶。能夠有助於鑑定誘變用基因的區域的計算算法也已經開發出來並且可以明顯地減少需要產生和篩選的酶變異體數目。已開發出多項定向進化技術(關於綜述參見 Hibbert 等人,Biomol. Eng 22:11-19 (2005) ; Huisman 和 Lalonde, Biocatalysisin the pharmaceutical and Biotechnology industries (製藥和生物化學工業中的生物催化)，第 717-742 頁(2007)，Patel (編著)，CRC Press; Otten 和 Quax. Biomol. Eng22:1-9(2005);和 Sen 等人，Appl Biochem. Biotechnol 143:212-223(2007))以在產生多樣性變異體文庫上有效，並且這些方法已經成功地應用於橫跨許多酶類別的多個特性的改進。已通過定向進化技術改進和/或改變的酶特徵包括例如選擇性/專一性，用於非天然底物的轉變；溫度穩定性，用於嚴酷高溫加工處理；PH穩定性，用於在較低或較高pH條件下的生物加工過程；底物或產物耐受性，使得可以達到高的產物效價；結合(KJ，包括拓寬底物結合以包括非天然底物；抑制(Ki),以去除被產物、底物或關鍵中間體抑制；活性(kcat)，以提高酶促反應速率從而達到所需流通量；表達水平，以增加蛋白質收率和總體途徑流通量；氧穩定性，用於在好氧條件下空氣敏感酶的操作；和厭氧活性，用於在氧不存在時需氧酶的操作。許多示例性的方法已經開發出來用於靶向特定酶所需特性的基因的誘變和多樣化。這樣的方法都是本領域技術人員眾所周知的。這些方法中的任何一個都可以用於改變和/或最優化對甲苯甲酸、對苯二甲酸或(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑酶或蛋白質的活性。這樣的方法包括但不限於EpPCR，EpPCR通過在PCR反應中降低DNA聚合酶的保真度而引入隨機點突變(Pritchard等人，J Theor. Biol. 234:497-509 (2005))；易錯滾環擴增(Error-prone Rolling Circle Amplification, epRCA), epRCA 類似於 epPCR,只是用完全環狀質粒作為模板，並且用在最後2個核苷酸上具有外切核酸酶抗性硫代磷酸酯鍵的隨機六聚體來擴增質粒，然後將其轉化到細胞中，在轉化的細胞中，質粒在串聯重複上被重新環化(Fujii 等人，Nucleic Acids Res. 32: el45 (2004) JPFujii 等人，Nat. Protoc. 1:2493-2497 (2006)) ;DNA 或家族改組(Family Shuffling)，其通常包括用核酸酶(例如Dnase I或EndoV)消化兩種或更多種變異基因以產生隨機片段庫，該隨機片段可在DNA聚合酶存在下通過退火和延伸的多次循環進行重新裝配以產生嵌合基因文庫(Stemmer, Proc Natl Acad Sci USA 91:10747-10751 (1994);和 Stemmer, Nature370:389-391(1994));交錯延伸(Staggered Extension, StEP)，其需要模板引導，然後經過2步PCR的重複循環，並且經變性和非常短持續時間的退火/延伸(短至5秒)(Zhao 等人,Nat. Biotechnol. 16:258-261 (1998))；隨機引導重組(Random PrimingRecombination, RPR),其中用隨機序列引物來產生大量互補於模板不同區段(segment)的短 DNA 片段(Shao 等人，Nucleic Acids Res. 26:681-683 (1998))。另外的方法包括異源雙鏈體重組，其中用線性化質粒DNA來形成被錯配修復所修復的異源雙鏈體(Volkov 等人,Nucleic Acids Res. 27: el8 (1999)；和 Volkov等人，Methods Enzymo I. 328:456-463 (2000));過渡模板隨機嵌合生長(RandomChimeragenesis on Transient Templates, RACHITT), RACHITT 使用單鏈 DNA(ssDNA)的 Dnase I 片段化和大小分級分離(Coco 等人，Nat. Biotechnol. 19:354-359 (2001))；截短模板重組延伸(Recombined Extension on Truncated templates, RETT), RETT 需要在用作模板庫的單向ssDNA片段存在下模板轉換來自引物的單向生長鏈(Lee等人，J. Molec. Catalysis 26:119-129 (2003));簡併寡核昔酸基因改組(DegenerateOligonucleotide Gene Shuffling, DOGS),其中用簡併引物來控制分子間的重組(Bergquist 和 Gibbs, Methods Mol. Biol 352:191-204 (2007) ; Bergquist 等人,Biomol.Eng 22:63-72(2005) ; Gibbs 等人，Gene 271:13-20 (2001));用漸增截短法產生雜合酶(Incremental Truncation for the Creation of Hybrid Enzymes, ITCHY),ITCHY是用目標基因或基因片段的I個鹼基對缺失來產生組合文庫(Ostermeier等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3562-3567(1999)；和 Ostermeier 等人，Nat.Biotechnol. 17:1205-1209(1999));用硫代漸增截短法產生雜合酶(Thio-IncrementalTruncation for the Creation of Hybrid Enzymes, THIO-ITCHY), THIO-ITCHY類似於ITCHY,只是用硫代磷酸dNTPs產生截短物(Lutz等人，Nucleic AcidsRes. 29:E16(2001)) ;SCRATCHY，它將ITCHY和DNA改組這兩種重組基因的方法結合起來(Lutz 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:11248-11253(2001));隨機漂移誘變(RandomDrift Mutagenesis, RNDM)，其中通過印PCR產生的突變再進行篩選/選擇並將有可利用活性的那些保留下來(Bergquist等人 ,Biomol. Eng. 22:63-72(2005));序列飽和誘變(Sequence Saturation Mutagenesis, SeSaM), 一種使用隨機摻入硫代磷酸核苷酸並裂解來產生隨機長度片段庫的隨機誘變方法，其用作模板以在「通用」鹼基(例如肌苷)存在下延伸，並且含肌苷互補序列的複製得到隨機鹼基摻入，因此誘變(Wong等人，Biotechnol.J. 3:74-82 (2008) ; Wong 等人，Nucleic Acids Res. 32: e26 (2004)；和 Wong 等人，Anal.Biochem. 341:187-189 (2005));合成改組(Synthetic Shuffling),其使用設計的重疊寡核苷酸來編碼「靶標中的所有遺傳多樣性」並且允許經改組的子代的非常高多樣性(Ness等人,Nat. Biotechnol. 20:1251-1255(2002));核苷酸交換和切除技術(NucleotideExchange and Excision Technology, NexT),它利用 dUTP 慘入後再用尿卩密唳 DNA 糖基化酶處理後用哌唳處理以進行終點DNA片段化的組合(Muller等人，Nucleic AcidsRes. 33:el17(2005))o更多的方法包括不依賴序列同源性的蛋白質重組(SequenceHomology-Independent Protein Recombination, SHIPREC),其中使用接頭(linker)來促進兩個遠緣基因或無親緣關係的基因之間的融合，並且在這兩種基因之間產生許多嵌合體，導致產生單交換雜合體文庫(Sieber等人，Nat. Biotechnol. 19:456-460 (2001));基因位點飽和誘變 (Gene Site Saturation Mutagenesis , GSSM ),其中起始材料包括含有插入片段的超螺旋雙鏈DNA(dsDNA)質粒和在突變的所需位點上發生簡併的兩種引物(Kretz等人，Methods Enzymol. 388:3-11 (2004));組合盒式誘變(Combinatorial CassetteMutagenesis, CCM)，其包括使用短寡核苷酸盒以替代具有大量可能胺基酸序列改變的限制區(Reidhaar-Olson 等人，Methods Enzymol. 208:564-586 (1991);和 Reidhaar-Olson 等人，Science 241:53-57 (1988));組合多重盒式誘變(Combinatorial Multiple CassetteMutagenesis, CMCM)，CMCM基本上類似於CCM並以高突變率使用印PCR以鑑定熱點和熱區，然後通過CMCM延伸以覆蓋蛋白質序列空間的限定區(Reetz等人，Angew. Chem. Int.Ed Engl. 40:3589-3591 (2001));致突變菌株技術(Mutator Strains technique),該技術中使用條件ts致突變質粒(利用mutD5基因，編碼DNA聚合酶III的突變亞單位)，以在選擇期間使隨機和天然突變頻率增加20-4000倍，而當不需要選擇時阻斷缺失突變的累積(Selifonova 等人,Appl. Environ. Microbiol. 67:3645-3649 (2001)) ；Low 等人，J. Mol.Biol.260:359-3680(1996))。另外的示例性方法包括精細誘變(Look-through Mutagenesis, LTM),它是一種多維誘變方法，用於評價和最優化所選胺基酸的組合突變(Rajpal等人，Proc. Natl.Acad. Sci. USA 102:8466-8471 (2005));基因重新裝配(Gene Reassembly)，它是一種DNA改組方法，可一度應用到多基因或用來產生單個基因的嵌合體(多點突變)的大文庫(由 Verenium Corporation 公司供應的 TGR (Tunable GeneReassembly )技術)；計算機模似蛋白質設計自動化(in Silico Protein Design Automation, PDA),它是一種最優化算法，可錨定具有特殊摺疊的結構確定的蛋白質骨架，並檢索可以穩定摺疊和總體蛋白質動能學的用於胺基酸取代的序列空間，而且一般來說對具有已知三維結構的蛋白質最有效地工作(Hayes 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:15926-15931(2002))；和迭代飽和誘變(Iterative Saturation Mutagenesis, ISM), ISM 包括利用結構/功能知識來挑選用於酶改進的最可能位點，使用誘變方法例如StratageneQuikChange (Stratagene; San Diego CA)在所選位點上進行飽和誘變，再根據所需特性進行篩選/選擇，和使用改進的克隆，在另一位點上重新開始並繼續重複直到達到所需要的活性(Reetz 等人,Nat. Protoc. 2:891-903 (2007)；和 Reetz 等人,Angew. Chem. Int. EdEngl. 45:7745-7751(2006))。任何上述用於誘變的方法可以單獨或者以任何組合使用。另外，定向進化方法的任何一個或組合可以結合本文所述的適應性進化技術使用。應當理解，基本上不影響本發明各種實施方案的活性的修改也在本文提供的本發明定義內提供。因此，以下實施例意在說明而不是限制本發明。 實施例I用於生產(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的示例性途徑本實施例描述了一種用於生產對苯二甲酸(PTA)前體(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯(2H3M40P)的示例性途徑。對甲苯甲酸和PTA途徑的前體是2H3M40P。這種化學物質可衍生自中心代謝物
3-磷酸甘油醛(G3P)和丙酮酸(在三個酶促步驟中)，如圖I所示。前兩個步驟對於大腸桿菌和利用甲基赤蘚糖醇磷酸(非甲羥戊酸)途徑進行類異戊二烯(isoprenoid)生物合成的其它生物體來說是天然的。丙酮酸和G3P首先通過DXP合酶縮合生成I-脫氧-D-木酮糖5-磷酸(DXP)。接下來，碳骨架的還原和重排由DXP還原異構酶催化。最後，一種新的二醇脫水酶將2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸轉化成對甲苯甲酸前體2H3M40P。A. I-脫氧木酮糖-5-磷酸(DXP)合酶。丙酮酸和G3P通過DXP合酶(EC2. 2.1.7)縮合生成DXP。該酶催化類異戊二烯生物合成的非甲羥戊酸途徑中的第一步。該酶需要二磷酸硫胺素作為輔因子，並且還需要還原型FAD，儘管沒有淨的氧化還原變化。大腸桿菌酶的晶體結構是可獲得的(Xiang等人，J. Biol. Chem. 282:2676-2682 (2007)(doi:M610235200, pii; 10. 1074/jbc. M610235200doi)。其它的酶已在結核分枝桿菌(M. tuberculosis) (Bailey 等人,Glycobiology 12:813-820 (2002)和根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens) (Lee 等人，J. Biotechnol. 128:555-566 (2007) (doi : S0168-1656 (06) 00966-7，pii; 10. 1016/j. jbiotec. 2006. 11. 009, doi)中進行了克隆和表徵。來自枯草芽孢桿菌(B. subtilis)和集胞藻(Synechocystis sp. )PCC6803的DXP合酶已被克隆到大腸桿菌中(Harker 和&'amley, FEBS Lett. 448:115-119 (1999) (doi : S0014-5793 (99)00360-9, pii)。
基因 GenBank登錄號 GI No.生物體
dxsAAC73523. I1786622 大腸桿菌
權利要求
1.非天然存在的微生物，包括一種具有(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑的微生物，該微生物包含至少一種編碼以足以產生(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的量表達的(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑酶的外源核酸，所述(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑包含2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸脫水酶。
2.權利要求I的非天然存在的微生物，其中所述(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑還包含I-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶或I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶。
3.權利要求I的非天然存在的微生物，其中所述(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑還包含I-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶和I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶。
4.權利要求I的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含三種外源核酸，各自編碼(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑酶。
5.權利要求4的非天然存在的微生物，其中所述三種外源核酸編碼2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸脫水酶、I-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶和I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶。
6.權利要求I的非天然存在的微生物，其中所述至少一種外源核酸是異源核酸。
7.權利要求I的非天然存在的微生物，其中所述非天然存在的微生物是在基本上厭氧的培養基中。
8.用於生產(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的方法，包括將權利要求I的非天然存在的微生物在足以產生(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯的條件下培養足夠的時間周期。
9.權利要求8的方法，其中所述非天然存在的微生物是在基本上厭氧的培養基中。
10.權利要求8的方法，其中所述微生物包含三種外源核酸，各自編碼(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑酶。
11.權利要求10的方法，其中所述三種外源核酸編碼2-c-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸脫水酶、I-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶和I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶。
12.權利要求8的方法，其中所述至少一種外源核酸是異源核酸。
13.非天然存在的微生物，包括一種具有對甲苯甲酸途徑的微生物，該微生物包含至少一種編碼以足以產生對甲苯甲酸的量表達的對甲苯甲酸途徑酶的外源核酸，所述對甲苯甲酸途徑包含2-脫氫-3-脫氧磷酸庚糖酸合酶、3-脫氫奎尼酸合酶、3-脫氫奎尼酸脫水酶、莽草酸脫氫酶、莽草酸激酶、3-磷酸莽草酸-2-羧基乙烯基轉移酶、分支酸合酶或分支酸裂合酶。
14.權利要求13的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含兩種外源核酸，各自編碼對甲苯甲酸途徑酶。
15.權利要求13的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含三種外源核酸，各自編碼對甲苯甲酸途徑酶。
16.權利要求13的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含四種外源核酸，各自編碼對甲苯甲酸途徑酶。
17.權利要求13的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含五種外源核酸，各自編碼對甲苯甲酸途徑酶。
18.權利要求13的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含六種外源核酸，各自編碼對甲苯甲酸途徑酶。
19.權利要求13的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含七種外源核酸，各自編碼對甲苯甲酸途徑酶。
20.權利要求13的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含七種外源核酸，各自編碼對甲苯甲酸途徑酶。
21.權利要求19的非天然存在的微生物，其中所述八種外源核酸編碼2-脫氫-3-脫氧磷酸庚糖酸合酶、3-脫氫奎尼酸合酶、3-脫氫奎尼酸脫水酶、莽草酸脫氫酶、莽草酸激酶、3-磷酸莽草酸-2-羧基乙烯基轉移酶、分支酸合酶和分支酸裂合酶。
22.權利要求13的非天然存在的微生物，其中所述微生物還包含(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑。
23.權利要求22的非天然存在的微生物，其中所述(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑包含2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸脫水酶、I-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶或I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶。
24.權利要求23的非天然存在的微生物，其中所述(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑包含2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸脫水酶、I-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶和I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶。
25.權利要求13的非天然存在的微生物，其中至少一種外源核酸是異源核酸。
26.權利要求13的非天然存在的微生物，其中所述非天然存在的微生物是在基本上厭氧的培養基中。
27.用於生產對甲苯甲酸的方法，包括將權利要求13的非天然存在的微生物在足以產生對甲苯甲酸的條件下培養足夠的時間周期。
28.權利要求27的方法，其中所述非天然存在的微生物是在基本上厭氧的培養基中。
29.權利要求27的方法，其中所述微生物包含七種外源核酸，各自編碼對甲苯甲酸途徑酶。
30.權利要求29的方法，其中所述七種外源核酸編碼2-脫氫-3-脫氧磷酸庚糖酸合酶、3-脫氫奎尼酸合酶、3-脫氫奎尼酸脫水酶、莽草酸脫氫酶、莽草酸激酶、3-磷酸莽草酸-2-羧基乙烯基轉移酶、分支酸合酶和分支酸裂合酶。
31.權利要求27的方法，其中所述微生物還包含(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑。
32.權利要求31的方法，其中所述(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑包含2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸脫水酶、I-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶或I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶。
33.權利要求32的方法，其中所述(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑包含2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸脫水酶、I-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶和I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶。
34.權利要求27的方法，其中所述至少一種外源核酸是異源核酸。
35.非天然存在的微生物，包括一種具有對苯二甲酸途徑的微生物，該微生物包含至少一種編碼以足以產生對苯二甲酸的量表達的對苯二甲酸途徑酶的外源核酸，所述對苯二甲酸途徑包含對甲苯甲酸甲基-單加氧酶還原酶、4-羧基苯甲醇脫氫酶或4-羧基苯甲醛脫氫酶；和其中所述微生物還包含對甲苯甲酸途徑，其中所述對甲苯甲酸途徑包含2-脫氫-3-脫氧磷酸庚糖酸合酶、3-脫氫奎尼酸合酶、3-脫氫奎尼酸脫水酶、莽草酸脫氫酶、莽草酸激酶、3-磷酸莽草酸-2-羧基乙烯基轉移酶、分支酸合酶或分支酸裂合酶。
36.權利要求35的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含兩種外源核酸，各自編碼對苯二甲酸途徑酶。
37.權利要求35的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含三種外源核酸，各自編碼對苯二甲酸途徑酶。
38.權利要求37的非天然存在的微生物，其中所述三種外源核酸編碼對甲苯甲酸甲基-單加氧酶還原酶、4-羧基苯甲醇脫氫酶和4-羧基苯甲醛脫氫酶。
39.權利要求35的非天然存在的微生物，其中所述對甲苯甲酸途徑包含2-脫氫-3-脫氧磷酸庚糖酸合酶、3-脫氫奎尼酸合酶、3-脫氫奎尼酸脫水酶、莽草酸脫氫酶、莽草酸激酶、3-磷酸莽草酸-2-羧基乙烯基轉移酶、分支酸合酶和分支酸裂合酶。
40.權利要求35的非天然存在的微生物，其中所述微生物還包含(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑。
41.權利要求40的非天然存在的微生物，其中所述(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑包含2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸脫水酶、I-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶或I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶。
42.權利要求41的非天然存在的微生物，其中所述(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑包含2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸脫水酶、I-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶和I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶。
43.權利要求35的非天然存在的微生物，其中所述至少一種外源核酸是異源核酸。
44.權利要求35的非天然存在的微生物，其中所述非天然存在的微生物是在基本上厭氧的培養基中。
45.用於生產對苯二甲酸的方法，包括將權利要求35的非天然存在的微生物在足以產生對苯二甲酸的條件下培養足夠的時間周期。
46.權利要求45的方法，其中所述非天然存在的微生物是在基本上厭氧的培養基中。
47.權利要求45的方法，其中所述微生物包含三種外源核酸，各自編碼對苯二甲酸途徑酶。
48.權利要求47的方法，其中所述三種外源核酸編碼對甲苯甲酸甲基-單加氧酶還原酶、4-羧基苯甲醇脫氫酶或4-羧基苯甲醛脫氫酶。
49.權利要求45的方法，其中所述對甲苯甲酸途徑包含2-脫氫-3-脫氧磷酸庚糖酸合酶、3-脫氫奎尼酸合酶、3-脫氫奎尼酸脫水酶、莽草酸脫氫酶、莽草酸激酶、3-磷酸莽草酸-2-羧基乙烯基轉移酶、分支酸合酶和分支酸裂合酶。
50.權利要求45的方法，其中所述微生物還包含(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑。
51.權利要求50的方法，其中所述(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑包含2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸脫水酶、I-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶或I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶。
52.權利要求51的方法，其中所述(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑包含2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸脫水酶、I-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶和I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶。
53.權利要求45的方法，其中所述至少一種外源核酸是異源核酸。
全文摘要
本發明提供具有(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑、對甲苯甲酸途徑和/或對苯二甲酸途徑的非天然存在的微生物。本發明另外還提供使用這類生物體來產生(2-羥基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯途徑、對甲苯甲酸途徑或對苯二甲酸途徑的方法。
文檔編號C12N9/00GK102834508SQ201180016104
公開日2012年12月19日 申請日期2011年1月21日 優先權日2010年1月29日
發明者羅賓·E·奧斯特豪特 申請人:基因組股份公司