用於傳染病和癌症檢測的分子信標成像的方法和應用的製作方法

2023-05-16 09:57:26 1

專利名稱：：用於傳染病和癌症檢測的分子信標成像的方法和應用的製作方法
技術領域：
：本發明大體涉及^r測疾病標記物的分子信標，更特別是檢測疾病標記物的傳染和/或表達或突變的分子信標以及使用它們對生命體進行診斷和藥物基因組研究的方法。
背景技術：
：在美國癌症是第二大死亡原因。在美國近一半男人和稍多於三分之一的女人在他們一生中可能患有癌症。今天，上百萬人正在帶癌生活或已經患有癌症。增加患者存活率的一個重要因素是儘早診斷癌症。越早發現癌症並開始治療，存活多年的機會越大。現在並沒有有效診斷癌症的血清腫瘤標記物。例如在乳腺癌中，雖然用乳房X光攝影檢查術早期檢查降低了疾病的死亡率，仍有近20%乳腺癌病人被乳房X光攝影檢查術遺漏。此外，乳房X光#_影片異常的病人中，僅有10-20%活組織切片檢查確證患有乳腺癌。因此，開發癌症早期診斷的新方法對成功治療和增加病人存活率是十分重要的。開發癌細胞早期檢測的新方法和確定癌細胞對治療藥物的反應對增加癌症病人存活率有很大希望。正如癌症對人類是威脅一樣，傳染病也是一大死亡原因，在世界範圍內導致四分之一至三分之一的死亡。在未來20年中，新出現和再度出現的傳染病將形成上升的全球健康威脅和使全球安全複雜化。2003年中期開始於東南亞的高致病性禽流感的當前爆發是記栽中最大和最嚴重的一次。在這次疾病前，歷史上從未有過如此多的國家同時感染，而導致如此多的鳥死亡。病原體H5N1病毒已證明極為頑固。WHO及其它地方的專家相信世界現在比自1968年上世紀三次流行病大流行中的最後一次發生起任何時候都更接近另一次流行性感冒的廣泛流行。CDC推行強有力的措施來檢測(國內監測)、診斷和實驗室檢測H5N1以預防禽流感A(H5N1)病毒的傳播。由於H5N1禽流感在鳥中的廣泛流行和禽流感H5N1病毒可能的鳥至人傳染，迫切需要一種早期和敏感的診斷方法來檢測禽流感和人流感病毒。缺乏有效的早期藥物基因組學檢測常常導致難以治療許多有生命威脅的疾病。一種在疾病過程的早期階段快速、準確、特效和可負擔的診斷和/或藥物基因組學篩選可提供對改善病人結果和醫生給病人最佳治療的決策無法衡量的益處。分子信標(MB)是可用於在雜交檢測中不需要從過量探針中分離探針-靶標的雜交體即可檢測互補核苷酸靶點存在的雜交探針[15，16]。由於這種性質，MB已用於在活細胞內檢測RNAs[lO,13],在密封反應器中監測特異性核苷酸的合成[6,16],和構建自我報告寡核苷酸陣列[14]。MB可用於進行同種一管檢測來鑑定DNA中的單核苷酸變異[3，7-9]和才企測病原體[12,17〗。雖然以前研究表明用MB探針檢測互補核苷酸靶的存在是可行的方法，在其它事情中，如何將此新技術開發為可廣泛用於基礎研究和臨床實驗室的簡單方法成為問題。因此，在本領域需要解決前述未解決的問題以克服上述缺陷和不足。發明概述在其它事情中，本發明尋找解決使用分子信標作為診斷試劑檢測疾病細胞特別是檢測傳染病細胞和/或癌細胞的當前可用方法中存在的上述缺陷。一方面，本發明涉及檢測用於在生命體中診斷和藥物基因組研究的疾病標記物的傳染和/或表達或突變的方法。在一個實施方案中，本方法包含步驟a)獲得來自生命體的樣品，其中所述樣品含有一個或多個細胞；b)有機溶劑固定樣品；c)添加分子信標至所述樣品中；和d)觀察加入分子信標的結果以檢測疾病標記物的傳染和/或表達或突變，其中所述的分子信標與一個或多個細胞中的疾病標記物中疾病相關的rna或dna雜交，從而發射不需信號放大即可檢測的信號。此方法還包含觀察步驟前用染料染色一個或多個細胞中的至少一個細胞核的步驟。進行添加分子信標和觀察結果的步驟不超過2小時。染色結果可用包括顯微鏡、FACS掃描器、ELISA平板讀出器、閃爍計數器以及任何它們的組合中的一種工具來;f全測。分子信標可檢測傳染病細胞，其中所述的傳染病包含流行性感冒病毒引發的疾病。流行性感冒病毒包括流行性感冒病毒A,其中流行性感冒病毒A包括16H和9N抹中的一種，和任何它們的組合。流行性感冒病毒還可以選自包括流行性感冒病毒A、流行性感冒病毒AH5、流行性感冒病毒AN1、流行性感冒病毒B以及任何它們的組合組成的組。分子信標還可檢測癌細胞，其中所述的癌症選自包括肺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、皮膚癌、骨癌、子宮癌、子宮頸癌、腦癌、結腸癌、咽喉癌和動物中發生的任何癌組成的組。突變是疾病標記物的點突變和/或缺失，其中疾病標記物是靶向治療的生物學靶點。生物學靶點是EGFR基因和/或它的轉錄產品，其中EGFR基因在EGFR酪氨酸激酶結構域中含有缺失突變。在一個實施方案中，分子信標包含單鏈髮夾形結構的寡核香酸探針，其含有選自包括SEQIDNOs:1-11和任何它們的組合的組的核苷酸序列。在另一個實施方案中，分子信標能與EGFR的轉錄產品雜交。在另一個實施方案中，分子信標能檢測耐藥癌症和/或耐藥病原體。另一方面，本發明涉及從生命體中檢測癌細胞的方法。在一個實施方案中，此方法包含步驟a)從生命體中獲得含有一個或多個細胞的樣品；b)用有機溶劑固定樣品；c)添加分子信標至樣品中；和d)觀察添加了分子信標的結果以在樣品中檢測癌細胞，其中分子信標能與樣品中的一個或多個細胞內的癌細胞標記物相關RNA或DNA雜交，從而發射不需信號放大即可檢測的信號。此方法還包含在觀察步驟前用染料染色樣品中的一個或多個細胞中細胞核的步驟。有機溶劑是丙酮、乙醇、曱醇、曱眵、多聚曱醛、丁醇和它們的任何組合，其中固定樣品的有機溶劑在添加分子信標前用Triton處理。分子信標包含單鏈髮夾形結構的寡核苷酸探針，其含有選自SEQIDNOs:1-7以及任何它們的組合的組的核香酸序列。癌細胞選自包括肺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、皮膚癌、骨癌、子宮癌、子宮頸癌、腦癌、結腸癌、咽喉癌和動物中發生的任何癌症的組，其中癌細胞顯示了癌細胞的特異性標記物中至少一個點突變和/或缺失。樣品是組織切片、活組織4全查的抽吸液(aspirate)、血液和體液中的脫落細胞中的一種。另一方面，本發明涉及從生命體中檢測流行性感冒病毒感染的細胞的方法。在一個實施方案中，此方法包含步驟從生命體中獲得樣品，其中所述樣品含有一個或多個細胞；用有機溶劑固定樣品；添加分子信標至樣品中；觀察結果以檢測樣品中流行性感冒病毒感染的細胞，其中分子信標能與至少一個細胞中的流行性感冒病毒標記物相關的RNA或DNA雜交，從而發射不需信號放大即可檢測的信號。此方法還包含在觀察步驟前用染料染色一個或多個細胞中至少一個細胞核的步驟。在一個實施方案中，有機溶劑是丙酮、乙醇、甲醇、曱醛、多聚曱醛、丁醇和任何它們的組合中的一種，其中固定樣品的有機溶劑在添加分子信標前用Triton處理。在一個實施方案中，分子信標包含單鏈髮夾形結構的寡核苷酸探針，其含有選自包括SEQIDNOs:8-11及任何它們的組合的組的核芬酸序列。在一個實施方案中，流行性感冒病毒包含禽流感病毒，其中流感病毒是流感病毒A和流感病毒B。流感病毒A包括16H和9N株中的一種，以及任何它們的組合。在一個實施方案中，用同時加至樣品的一個或多於一個的探針實施本方法。另一方面，本發明涉及檢測疾病標記物的傳染和/或表達或突變以在生命體中進行診斷和藥物基因組研究的方法。在一個實施方案中，此方法包含步驟從生命體中獲得樣品，其中樣品含有一個或多個細胞；用有機溶劑固定樣品；添加分子信標至樣品中；觀察添加了分子信標的結果以檢測疾病標記物的感染和/或表達或突變，其中分子信標與細胞中的疾病標記物的疾病相關RNA或DNA雜交，從而發射不需信號放大即可檢測的信號，並且其中添加分子信標和觀察結果的時間不超過2小時。在一個實施方案中，此方法還包含在觀察步驟前用染料染色樣品的一個或多個細胞中細胞核的步驟。在一個實施方案中，有機溶劑是丙酮、乙醇、甲醇、曱醛、多聚曱醛、丁醇和任何它們的組合中的一種。另一方面，本發明涉及包含單鏈髮夾形結構的寡核苷酸探針的分子信標，該探針含有與疾病細胞中疾病標記物的疾病相關RNA和/或DNA雜交的核苷酸序列，從而發射不需信號放大即可檢測的信號。在一個實施方案中，寡核苷酸探針含有選自包括SEQIDNOs:1-11的組的核苷酸序列。在另一個實施方案中，寡核苷酸探針具有能與癌細胞中編碼EGFR基因酪氨酸激酶結構域的RNA和/或DNA雜交的核普酸序列。在一個實施方案中，寡核苷S臾探針包含在5'端的螢光團和在3'端的猝滅劑，或在3，端的螢光團和在5'端的猝滅劑。在一個實施方案中，疾病細胞是癌細胞或傳染病細胞之一。在一個實施方案中，疾病細胞被流感病毒感染，其中流感病毒是流感病毒A或流感病毒B。在一個實施方案中，流感病毒A包括16H和9N林以及任何它們的組合中的一種。另一方面，本發明涉及用於檢測生命體中疾病標記物的傳染和/或表達或突變以進行診斷和藥物基因組研究的診斷試劑盒，包含包含單鏈髮夾形結構的寡核苷酸探針的分子信標，該探針含有能與疾病細胞中疾病標記物的疾病相關RNA和/或DNA雜交的核香酸序列，從而發射不需信號放大即可檢測的信號；和說明書。在一個實施方案中，寡核苷酸探針含有能與癌細胞中編碼EGFR基因酪氨酸激酶結構域的RNA和/或DNA雜交的核苷酸序列。在一個實施方案中，寡核苷酸探針含有選自包括SEQIDNOs:1-11的組的核苦酸序列。在一個實施方案中，試劑盒包含超過一個含有選自包括SEQIDNOs:1-7的組的核苷酸序列的寡核苷酸探針。在一個實施方案中，試劑盒包含超過一個含有選自包括SEQIDNOs:8-11的組的核香酸序列的寡核苦酸探針。診斷試劑盒允許進行從添加分子信標至樣品中至從中觀察到結果的診斷不超過兩小時。本發明提供的此方法具有以高敏感性的快速一步法診斷傳染病細胞和/或癌細胞，和/或能夠從生物樣品中同時檢測特異性治療靶點或標記物的突變以及表達的優點。這些和其它方面將在以下描述的優選實施方案和以下附圖中明確，雖然可能在不脫離本說明書的新概念的精神和範圍下對其有改變和修飾。了本發明的一個或多個實施方案，並且和文字說明書一起解釋了本發明的原理。在任何可能的地方，附圖中使用的相同的參考文獻編號涉及實施方案中的相同或類似元素。附圖簡述本專利或申請文件含有至少一個有色附圖。帶有彩圖的本專利或專利申請公開書的副本由專利和商標局根據需要和支付必須費用提供。圖1顯示了根據本發明的一個實施方案設計用來檢測癌症標記物和癌藥物基因組研究靶點的分子的螢光。圖2顯示了根據本發明的一個實施方案用ALV-1011檢測肺癌細胞系I和II中治療靶點的點突變的圖^^。圖3顯示了根據本發明的一個實施方案用ALV-1022檢測肺癌細胞系I和II中治療靶點的第二個點突變的圖像。圖4顯示了根據本發明的一個實施方案用ALV-1033檢測肺癌細胞系I和II中一個"通用"癌症標記物的表達。圖5顯示了根據本發明的一個實施方案用ALV-1044和ALV-1055檢測胰腺癌病人的活組織檢查中癌症標記物的點突變的圖像。圖6顯示了根據本發明的一個實施方案ALV-FluA、ALV-FluAH5、ALV-FluANl和ALV-FluB分子與它們各自的靶點的特異性結合。圖7顯示了才艮據本發明的一個實施方案在禽流感病毒感染中檢測的流感病毒A、流感病毒AH5和流感病毒AN1。圖8顯示了根據本發明的一個實施方案在人流感病毒感染中4企測的流感病毒A和流感病毒B。圖9顯示了根據本發明的一個實施方案在10-20分鐘內快速檢測的人流感病毒A和流感病毒B感染。圖IO顯示了根據本發明的一個實施方案用ALV-FluA和ALV-FluB分子檢測人流感病毒A和流感病毒B感染的FACS分析。圖11顯示了根據本發明的一個實施方案用ALV-FluA和ALV-FluB分子檢測人流感病毒A和流感病毒B感染的螢光顯微鏡分析。圖12顯示了ALV-FluA、ALV-FluB、ALV-FluAH5和ALV-FluANl分子的靶向結合。圖13顯示了根據本發明的一個實施方案人流感病毒A感染的ALV-FluA檢測。圖14顯示了根據本發明的一個實施方案人流感病毒B感染的ALV-FluB檢測。圖15顯示了根據本發明的一個實施方案人流感病毒H5感染的ALV-FluH5檢測。圖16顯示了根據本發明的一個實施方案禽流感病毒AN1感染的ALV-FluANl檢效'J。圖17顯示了根據本發明的一個實施方案禽流感病毒A感染的ALV-FluA檢測。圖18顯示了根據本發明的一個實施方案ALV-FluA檢測後流感病毒感染的FACS分析。圖19顯示了根據本發明的一個實施方案用螢光平板讀出器的人流感病毒感染的RFU分析。圖20顯示了根據本發明的一個實施方案檢測細胞培養基中的流感病毒感染。圖21顯示了根據本發明的一個實施方案檢測病人中的流感病毒感染。圖22顯示了根據本發明的一個實施方案檢測雞胚胎細胞中的禽流感流感病毒A(H5N3)感染。圖23顯示了4艮據本發明的一個實施方案^r測雞胚胎細胞中的禽流感流感病毒A(H6N1)感染。圖24顯示了根據本發明的一個實施方案檢測肺癌細胞系I中治療靶點的點突變。圖25顯示了根據本發明的一個實施方案檢測肺癌細胞系III中治療靶點的缺失。圖26顯示了根據本發明的一個實施方案檢測SMCLC病人的突變。圖27顯示了根據本發明的一個實施方案特異於流感病毒的流感病毒A和流感病毒B型，以及流感病毒AH5和流感病毒AN1抹的核苦酸序列，它顯示了EGFR點突變和缺失的位置，其中ALVEGFRMBs檢測此位置進行癌症藥物基因組研究。圖28顯示了生物信息學備定的特異於流感病毒的流感病毒A和流感病毒B型，以及流感病毒AH5和流感病毒AN1林的序列。優選實施方案詳述在下面的實施例中更具體的描述本發明，其中這些實施例僅用於說明，因為對本領域技術人員來說大量修飾和改變是很明顯的。本發明的多個實施方案會詳細描述。在本說明書和以下權利要求中所用的"一個"、"一個"和"這個"的含義包括複數指代除非上下文中明確指明。另外，在本說明書和以下權利要求中所用的"中"的含義包括"中"和"上"除非上下文中明確指明。此外，標題和副標題也可用在說明書中以方便讀者，而對本發明的範圍沒有影響。定義在本發明的上下文中和每個術語使用的具體上下文中，本說明書中使用的術語一般具有其本領域內的普通含義。用於描述本發明的特定術語在下面或說明書的別處討論以給從業者提供描述本發明的組合物和方法以及如何製造和使用它們的額外指導。為了方便，特定術語被突出顯示，例如使用斜體和/或引號。突出顯示的使用對術語的範圍和含義沒有影響；無論突出顯示與否，術語的範圍和含義在相同上下文中是一樣的。應當理解相同事物可以用超過一種方式講述。因此，可選文字和同義詞可用於本文討論的任何一個或多個術語，而沒有任何特殊含義，無論術語是否在本文中被詳細地說明或討論。提供了特定術語的同義詞。一個或多個同義詞的說明不排除其它同義詞的使用。本說明書中任何地方的實例的使用，包括本文討論的任何術語的實例，僅用作說明而決非限制本發明或任何例證的術語的範圍和含義。同樣地，本發明不限制此說明書中所給的多個實施方案。如本文所用的"大約"或"近似"一般表示在所給值或範圍的20%以內，優選10%以內，更優選5%以內。如非特別說明可推斷本文所給的數字量是近似的，意為術語"大約"或"近似"。如本文所用的"雜交"和"互補"涉及兩個核苷酸間精確配對的能力。例如，如果一個寡核苷酸上特定位置的一個核苷酸能夠與一個DNA或RNA分子上相同位置的一個核苦酸氬鍵結合，那麼這個寡核苷酸和這個DNA或RNA被認為在那個位置是互補的或相互間可雜交的。當每個分子內的足夠量的的相應位置被能彼此以氫鍵結合的核苷酸佔據時，則該寡核苷酸與該DNA或RNA雜交。在本領域內可理解反義寡核苷酸的序列不需100%互補於與其雜交的靶核苷酸的序列。寡核苷酸是特異雜交的是指在進行檢測的條件下，該寡核苷酸化合物與靶DNA或RNA分子結合，並且具有足夠互補度來避免反義寡核苷酸與非靶序列在預計特異性結合的條件下非特異性結合，例如在體內檢測或治療的生理條件下，或在進行體外^r測的條件下。在本發明的上下文中，術語"寡核苷酸"涉及核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)或其模擬物的寡聚物或多聚物。此術語包括但是不限於自然產生和/或合成的核酸鹼基、糖和共價內核酸鹼基(骨架)連接臂組成的寡核苷酸。由於令人想要的性質例如增強的細胞攝取、增強的與核苷酸靶的親合力、和/或增強的在核酸酶存在下的穩定性，這些修飾或取代寡核苷酸常常比天然形式優選。如本文所用的術語"分子信標"或其首字母縮略詞"MBs"是形成莖環結構的單鏈寡核苷酸雜交探針。它的環含有與靶序列互補的探針序列，而莖由位於探針序列任一側的互補臂序列退火形成。一個螢光基團共價連接於一臂末端而一個猝滅物共價連接於另一臂末端。當分子信標在溶液中游離時，它不發出螢光。但是，當它與含有靶序列的核苷酸鏈雜交時，它的構象發生變化從而能夠明顯發出螢光。靶不存在時探針是暗的，因為莖使螢光基團與非螢光猝滅物非常接近以致它們短暫地分享電子而失去了螢光基團發出螢光的能力。當探針遭遇靶分子時，它形成比莖雜交物更長和更穩定的探針-靶雜交物。探針-靶雜交物的穩定性和長度杜絕了莖雜交物的同時存在。因此，分子信標進行了自發的使莖雜交物分解和螢光基團和猝滅物互相分開、發出螢光的構象重組。當MB遭遇靶mRNA分子時，環和部分莖與靶mRNA雜交，引起了自發的使莖分開的構象變化。猝滅物離開螢光基團，導致螢光的恢復。莖環探針的一個主要優點是它們能夠比線性寡核苦酸探針以更高的特異性識別靶。適當設計的MBs可鑑別差別微小如僅有單個核苷酸不同的靶。MBs已有多種應用包括DNA突變檢測、蛋白質-DNA相互作用、PCR實時監測、活細胞中的基因分型和mRNA檢測。如本文所用的"轉染"涉及插入核苷酸至宿主的過程。本領域技術人員眾所周知許多種技術來促進核苦酸轉染至原核或真核生物中。這些方法包括許多種技術，例如用高濃度鹽例如但是不僅是鈣或鎂鹽處理細胞、電場、去汙劑或脂質體介導的轉染，從而使宿主細胞成為能夠攝取核苷酸分子的感受態細胞。如本文所用的術語"基因"或"基因們'，涉及編碼遺傳信息以合成全長RNA、全長蛋白質或任意部分這些全長RNA或全長蛋白質的核苷酸序列(包括RNA和DNA兩者)。如本文所用的術語"表達的"或"表達"涉及從基因轉錄獲得至少與該基因的兩條核苷酸鏈中的一條的部分區域互補的RNA核苷酸分子。如本文所用的術語"表達的"或"表達"還可涉及從所述RNA核苷酸分子翻譯獲得蛋白質或多肽或它們的一部分。如本文所用的術語"藥物基因組研究"涉及檢查表明藥物反應的基因的遺傳變異和探索這些變異可用來預測病人對一個藥物是lde反應、不lA應還是完全沒反應的方法的-恃。USMD，即"超敏感分子檢測"的縮寫，是本發明的平臺技術的商品名。發明概述本發明的一方面涉及使用MB通過直接添加MB至樣品和獲得不需信號放大即可抬，測的信號來檢測疾病標記物的感染和表達或突變以診斷和藥物基因組研究。市場上沒有產品可以以本發明達到的敏感性和特異性程度如此快速的工作。在本領域中，分子信標已與信號放大一起使用。本發明提供的分子信標和方法可不需信號放大而檢測信號。此外，本發明進行診斷所費時間不超過2小時，而WHO推薦的流感當前標準分子檢測花費6小時。此外，本發明的用於癌症和流感的MBs序列還未使用，特別是流感序列。本發明提供了在樣品細胞中檢測癌症和傳染病的方法。特別是本文提供了檢測、鑑別或定量在細胞樣品中的癌症標記物序列或病毒標記物序列的存在或改變的方法。本發明的一方面涉及檢測直接來自組織樣品而不需擴增的疾病特異性標記物的表達改變和/或突變。此平臺技術具有敏感、特異和同時檢測多種疾病相關標記物的優點。將含有本發明的試劑的MB輸送到與疾病相關的細胞中會導致信號的改變。當檢測試劑檢測到疾病的分子標記物的變化時，例如表達異常或突變、疾病細胞(亮色)可區別於正常細胞(暗色)。因此，將這種突破性技術與近年來發展的功能基因組學知識結合起來後，最初的目標是開發產品用於l)急性和慢性疾病兩者的早期檢測；2)對病人進行藥物基因組學篩選以提高治療效率；3)病人的預後和治療後過程。此平臺技術具有快速、敏感、特異和成本低且有效檢測疾病相關標記物的優點。本發明的一方面涉及檢測疾病標記物的感染和/或表達或突變的方法以對生命體進行診斷和藥物基因組研究，其中此方法包括(a)從生命體中獲得樣品，其中所述樣品含有一個或多個細胞；(b)用有機溶劑固定所述樣品；(d)將分子信標加入到樣品中；和(c)觀察結果以檢測疾病標記物的感染和/或表達或突變。含有目標細胞的樣品可以是組織切片、活組織檢查的抽吸液(aspirate)、血液、或體液中的脫落細胞。樣品在加入MB前用有機溶劑固定。用來固定樣品的有機溶劑包括丙酮、乙醇、曱醇、曱醛、多聚曱醛、丁醇和任何它們的組合之一。在一個實施方案中，有機溶劑固定的樣品在加入分子信標前用Triton處理。任選地，觀察添加了分子信標的結果前，此方法還可包括用染料對樣品中的一個或多個細胞的至少一個細胞核染色的步驟。樣品中細胞的細胞核染色使得確定細胞在載玻片上的位置非常容易。添加了分子信標的結果可用本領域技術人員公知的適當的儀器包括顯微鏡、FACS掃描器、ELISA平板讀出器、閃爍計數器和任意它們的組合之一來檢測。此外，進行從添加分子信標至觀察結果的步驟花費不超過2小時。本發明的另一方面涉及檢測具有傳染病的細胞例如檢測流感病毒感染的細胞的方法。流感病毒包括禽流感病毒，例如流感病毒A和流感病毒B。流感病毒A可以是16H和9N林以及任意它們的組合之一。例如，本發明的方法檢測的細胞可以被流感病毒A、流感病毒AH5、流感病毒AN1以及任意它們的組合之一的流感病毒感染。本發明的另一個實施方案是在含有一個或多個細胞的樣品中檢測癌細胞的方法。癌細胞可以是肺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、皮膚癌、骨癌、子宮癌、子宮頸癌、腦癌或結腸癌。本發明的另一個實施方案是檢測癌細胞的特異性標記物中至少一個點突變和/或缺失的方法。本發明的另一個實施方案是檢測疾病標記物的突變，既可以是點突變也可以是和/或缺失的方法。疾病標記物包括靶向治療的生物靶。生物靶包括EGFR基因。本發明的一個實施方案是在樣品中檢測癌細胞標記物的方法，其中癌細胞標記物含有在EGFR酪氨酸激酶結構域具有缺失突變。本發明的另一個實施方案是一種方法，^法中將一個或多個探針加入細胞樣品中。本發明的另一方面提供了單鏈髮夾形結構的寡核苷酸探針的分子信標，該探針含有選自包括SEQIDNOs:1-11以及任何它們的組合的組的核苷酸序列。分子信標能與來自生命體的樣品的至少一個細胞中的疾病標記物的疾病相關的RNA或DNA雜交，從而發射不需信號放大即可檢測的信號。本發明的一個實施方案是含有能與編碼通用癌症標記物的RNA和/或DNA雜交的核苦酸序列的MB。在本發明的一個實施方案中，分子標記能與EGFR的轉錄產物雜交。本發明的另一個實施方案是含有能與編碼癌細胞中的EGFR基因酪氨酸激酶結構域的RNA和/或DNA雜交的核苷酸序列的MB。這種MB包含5'端的螢光基團和3'端的猝滅物，或3'端的螢光基團和5，端的猝滅物。本發明的另一個實施方案是能檢測耐藥癌症和/或耐藥病原體的分子信標。本發明的另一方面是4企測疾病標記物的感染和/或表達或突變以對生命體進行診斷和藥物基因組研究的診斷試劑盒，其中診斷試劑盒含有本發明的分子信標和說明書。在一個實施方案中，診斷試劑盒包括含有選自包括SEQIDNOs:1-11的組的核苦酸序列的MB。此MB和診斷試劑盒內的說明書描述的此檢測方法使得從添加分子信標至樣品至觀察其結果的診斷過程花費不超過2小時。了本發明的一個或多個實施方案，並且和文字說明書一起解釋了本發明的原理。無論哪裡，貫穿在附圖裡使用的相同參考編號是指實施方案的相同或類似成分。實施例根據本發明的實施方案的範例儀器、裝置、方法和它們的相關結果在下面給出而不限制本發明的範圍。注意標題或副標題可為了方便讀者而用在實施例中，但不應限制本發明的範圍。此外，本文提出和公開了某些理論；但是無論對錯，不用考慮任何作用的特殊理論或方案，這些理論不應以任何方式限制本發明的範圍只要本發明是根據本發明實踐的。實施例1分子信標-靶DNA螢光檢測用來測量分子信標和DNA模板的結合(測量MB特異性)的方法如下描述材料包括Opti-MEM轉染溶液(Invitrogen)、Costar96孔黑板(eBioscience目錄號44-2504-21)、1.7mLEppendorf管(Denville目錄號C-2170)、標準PCR管、分子信標(MWG-BiotechAG)和把DNA(MWG-BiotechAG)。方法力n下(1)稀釋分子信標和靶DNA:基於MWG寡聚合成報告，根據指定的"至100pmol4tl的體積"轉染溶液量稀釋分子信標和靶DNA。渦旋和旋轉。分出相同量的寡聚溶液且避光置於-20。C冰箱中。(2)螢光檢測的準備以l:10稀釋每種分子信標(lpl分子信標溶液加9ixl轉染溶液)。使用lnlDNA、2pl分子信標l:10稀釋液和97pl轉染溶液，對每種分子信標製備兩份螢光混合物把DNA混合物和對照混合物。避光37。C孵育一小時。(3)進行檢測和獲得結果。每份混合物取95^1至％孔黑板的孔中。在SpectraMAXGeminiXS(來自MolecularDevices)螢光儀和SoftMAXPro4.3.1LS軟體使用以下設置檢測平板點擊"setup"。設置設為"Endpoint"和讀取類型是"Fluorescence(RFU，s)"。改變'Numberofwavelengths"為3，然後按照下表:表1:螢光和MB-靶DNA螢光檢測的波長tableseeoriginaldocumentpage19進入"Sensitivity"JU乾動讀數至8。進入"WellstoRead"且選4奪你想讀耳又的孔。點擊"Read"。進入"File"和"Import/Export"。在軟盤驅動器上以文本文件輸出結果。結果用MICROSOFTExcel從軟盤驅動器上讀取。實施例2如表2所示，用來檢測FluA、FluB、FluAH5和FluANl的分子信標(MBs)是基於生物信息學鑑別的特異性的DNA序列被分別設計的。髮夾環的形成設計為具有5或6(大多時候為5)個鹼基對。製備MB的常用方法由Peng等人(18)公開。然後由位於NorthCarolina的承包商MWGBiotech,Inc.合成MBs。5'端(或3'端)螢光基團可以是任何螢光蛋白質，而3'端(或5'端)猝滅物可以是任何能夠淬滅相應螢光基團的猝滅物。圖28顯示了生物信息學鑑別的特異於流感病毒FluA和FluB型以及FluAH5和FluANl抹的保守序列。如表3所示，由生物信息學鑑別的序列特異於流感病毒FluA和FluB型以及FluAH5和FluANl抹。表2:分子信標和SEQIDNOstableseeoriginaldocumentpage19實施例3傳染病檢測本發明的流感檢測分子顯示了與靶的特異性結合。分子例如ALV-FluA、ALV-FluAH5、ALV-FluANl和ALV-FluB設計為分別特異性地衝企測FluA、FluAH5、FluANI和FIuB。如圖6所示，這些分子以非常低的背景特異的與其各自的靶結合。實施例4快速檢測細胞培養中流感病毒感染的方法材料包括細胞培養玻片25x75xlmm(VWR目錄號48312-400);滑動蓋玻片22x50mmNo11/2(VWR目錄號48383194);Dako筆(目錄號S2002);細胞培養基(RPMI-1640);Opti-MEM轉染溶液(Invitrogen);0.25%胰蛋白酶EDTA溶液(Invitrogen);Gel/Mount(BiomedaCorp.目錄號M01);Hoechst33342(Cambrex,目錄號PA陽3014);TritonX-100(Merck);和用於FluA、FluB、FluAH5和FluANl的分子信標試劑的100uMOpti-MEM儲備液。方法如下(1)在載玻片上固定細胞由於丙酮會溶解黑色墨水，因此用鉛筆標記載玻片。然後用無血清培養基衝洗栽玻片一次，和無菌PBS衝洗一次。然後，將載玻片在冰浴的100%丙酮中浸泡8-10分鐘。空氣晾乾載玻片。如果載玻片不馬上使用，置於-80。C中保存(2)Triton處理用水浴的無血清培養基衝洗載玻片一次，和冰浴無菌PBS衝洗一次。然後在0.2%Triton溶液的PBS溶液中37'C浸泡20分鐘，和用冰浴的PBS衝洗兩遍。(3)加入本發明的MB4企測試劑在載玻片上用Dako筆沿孔畫圏。然後用分子信標試劑的100uMOpti-MEM儲備液製備適當的濃度，例如300nM。然後添加100|al(25-35ul用於8孔載玻片)本發明的MB試劑至細胞載玻片上適當的圈內，37。C培養箱中緩和放置20分鐘。(4)染色細胞的細胞核孵育20分鐘後，移去載玻片上的溶液。為了用螢光顯微鏡觀察，添加Hoechst33342(10mg/ml的PBS儲備液1/1000稀釋)至每個細胞圈。在37'C培養箱中放置不超過2-4分鐘。(5)完成從培養箱中移出載玻片。然後用冰浴的無菌PBS衝洗載玻片兩遍。如果用於焚光顯微鏡檢測，添加一滴栽玻片gel/mount至每個細胞圈。在載玻片上放置一個蓋玻片。(6)在螢光顯微鏡(01ympusDP70)下觀察結果在顯微鏡左側，打開螢光電源。在顯微鏡右側，打開顯微鏡電源。在顯微鏡下放置載玻片且用對Hoechst33342的DAPI濾光片對準細胞。一旦對準一些細胞，在不同螢光燈間旋轉以尋找適當的標誌焚光。當準備好照相時，到計算機前並雙擊"DPControlIers"圖標。對每個螢光燈使用以下設置:表4:檢測數據表tableseeoriginaldocumentpage21首先，點擊"Snap"來捕捉計算機上的圖像。然後點擊"Saveas"來保存計算機上的圖像至適當的文件夾。在適當的螢光燈以及DAPI下給細胞照相以確保細胞存在於圖像中。完成後，關閉螢光電源、螢光顯微鏡和計算機。實施例5在細胞培養液中檢測流感病毒感染的臨床前實驗簡要地，狗腎上皮細胞MDCK的細胞培養液，感染流感病毒的A或B亞型兩至三天後，分別用特異於流感病毒A(ALV-FluA)和流感病毒B(ALV-FluB)的分子信標染色。20分鐘染色完成後，載玻片上的細胞用螢光顯微鏡分析。如圖20所示，流感病毒A感染的細胞用流感病毒A檢測產品ALV-FluA特異性檢測(A圖中紅色)，而流感病毒B感染的細胞用流感病毒B感染的產品ALV-FluB檢測(C圖中綠色)。實施例6病人中檢測流感病毒感染的臨床研究在2005-2006的冬季流感季節裡，根據IRB指南和亞洲主要大學醫院的合作下，設計了一項臨床研究來評價使用本發明的分子信標快速檢測流感病毒感染的可行性。作為標準程序，塗抹病人的咽喉拭子作為顯微鏡載玻片上收集的樣品。單獨的拭子樣品也收集用於RT-PCR分析的病毒培養和RNA提取。載玻片用含有分別特異於流感病毒A和B的ALV-FluA和ALV-FluB的混合物，或用於紅色和綠色螢光的相應對照試劑ALV-RanRed和ALV-RanGreen的分子信標流感病毒產品檢測。從盲軸(blindpivotal)臨床研究得到的結果是非常成功的，分子信標產品檢測的結果與RT-PCR獲得結果超過90%都是一致的。如圖21所示的代表結果中，RT-PCR確認的感染流感病毒A的病人用含有分別特異於流感病毒A和流感病毒B的ALV-FluA和ALV-FluB混合試劑的產品檢測。如圖21所示，病人檢測為流感病毒A感染陽性(圖A中紅色)而流感病毒B感染不是陽性(圖B中綠色)。另一個沒有被流感病毒感染的病人用ALV-FluA(圖D中紅色)和ALV-FluB(圖E中綠色)檢測陰性。圖C和F中的藍色螢光是相應細胞的染色細胞核。實施例7開發了檢測禽流感病毒感染的試劑。開發了使用所設計的特異於FluA、FluAH5、FluANl和FluB的流感病毒檢測分子的檢測方法來快速和敏感地檢測FluA(H5N1和HH6N1)感染。一旦感染，用本發明的檢測試劑快速檢測被感染的宿主。如圖7所示，禽流感病毒A(H6N1)感染的宿主用本發明的分子信標ALV-FIuA(用於FluA，紅色)和ALV-FluANl(用於Nl，綠色)分別鑑別。同樣，感染禽流感病毒A(H5N3)的宿主用本發明的分子信標ALV-FluA(用於FluA,紅色)和ALV-FluAH5(用於FluAH5)分別鑑別。實施例8開發可用於檢測人和禽流感病毒感染的檢測試劑。檢測分子ALV-FluA和ALV-FluB是分別特異於流感病毒A和B的。它們能夠檢測流感病毒A和B抹引起的人類感染。如圖8所示，結果說明ALV-FluA和ALV-FluB分別特異檢測FluA和FuB病毒感染。實施例9禽流感病毒H5和N1感染的檢測除了檢測用於禽流感病毒A感染的產品ALV-FluA，ALV-FluAH5和ALV-FluANl產品分別特異於流感病毒A(H5)和流感病毒A(N1)抹。在ALV-FluA，ALV-FluAH5和ALV-FluANl試劑的組合下，使用這些產品的檢測方法應當是特異檢測流感病毒A(H5N1)的感染。但是，由於流感病毒A(H5N1)感染的人或動物樣品的獲得受到限制和存在潛在的嚴重危害，使用ALV-FluAH5和ALV-FluANl來檢測流感病毒A(H5)和流感病毒A(N1)感染的可行性評價用流感病毒A(H5N3)和流感病毒A(H6N1)感染的雞胚胎細胞來進行。流感病毒A(H5N3)感染的細胞作為流感病毒A(H5)檢測的模型和流感病毒A(H6N1)感染的細胞作為流感病毒A(N1)檢測的模型。雞胚胎細胞在模型系統下感染禽流感病毒A(H5N3)或禽流感病毒A(H6N1)，感染的宿主細胞用本發明的分子信標產品檢測。如圖22所示，感染禽流感病毒A(H5N3)的宿主細胞分別用ALV-FluA(用於流感病毒A,圖A中紅色)和ALV-FluAH5(用於流感病毒A(H5),圖B中紅色)來鑑別。同樣，如圖23顯示，感染禽流感病毒A(H6N1)的宿主細胞分別用本發明的分子信標，ALV-FluA(用於流感病毒A，圖D中紅色)和ALV-FluANl(用於流感病毒A(N1)，圖F中綠色)來鑑別。藍色螢光是每個相應細胞培養液中的染色細胞核。超敏感分子檢測(USDM)平臺技術的主要特徵包括(l)一種檢測目的基因的表達和突變的快速和有效技術的創新；(2)適合於疾病過程和藥物基因組研究的早期檢測；(3)10-20分鐘最終信號讀出的一步檢測法。本發明的分子信標產品對於檢測禽流感病毒感染是敏感的。本發明提供了特異於FluA、FluB、FluAH5和FluANl的檢測分子。檢測禽流感感染的分子包括ALV-FluA-紅色、ALV-FluB-綠色、ALV-FluAH5-紅色和ALV-FluANl-綠色。細胞的Hoechst33342-DNA染色顯示為藍色。本發明的這些分子信標產品設計為從多種樣品中檢測流感病毒感染。可檢測出禽流感病毒的動物包括鳥、雞、鴨、鵝、鴿、豬、人等等。實施例10本發明的檢測方法已證實為高保真度的快速一步檢測法。根據本發明的一個實施方案的基於MB的流感病毒感染檢測是簡單的一步檢測法。全部過程僅花費10-20分鐘。如圖9所示，此檢測法在檢測人FluA或FluB病毒感染時在10或20分鐘間的背景很低或沒有。實施例11使用本發明的分子信標的檢測結果可容易地處理。例如，本發明用於流感病毒感染的檢測法得到的結果可用臨床中常用的儀器測量。除了前示結果中應用的焚光顯微鏡，此檢測法還可用焚光活化細胞分揀器(FACS),這是一種常規使用的儀器來測量HIV感染病人的白細胞計數。圖10是顯示ALV-FluA和ALV-FluB檢測人FluA和FluB病毒感染的常用的定量柱狀圖。FACS結果與如圖11所示的使用螢光顯微鏡獲得的結果非常一致。讀出檢測結果的其它常用方法還在評價過程中。本發明的檢測分子顯示了對耐藥性菌抹爆發的快速反應。如在癌症藥物基因組研究中，本發明的流感病毒檢測分子能夠檢測包括點突變和缺失的突變。如果發生藥物例如Tamilflu耐受的禽流感病毒菌抹的爆發，一旦鑑別了突變序列，本發明的檢測分子的分子設計和產品需要的周期時間範圍是2-3周。這與基於抗體開發的檢測法是不能比較的。本發明的檢測分子可擴大至覆蓋廣譜禽流感菌林包括16H和9N抹；和快速識別對出現耐藥菌林爆發的響應。圖13-19顯示了本發明的檢測分子ALV-FluA檢測人FluA病毒感染(圖13)、ALV-FluB檢測人FluB病毒感染(圖14)、ALV-FluH5檢測人FluH5病毒感染(圖15)、ALV-FluANl檢測禽FluANl病毒感染(圖16)、ALV-FluA檢測禽FluA病毒感染(圖n)、ALV-FluA檢測後FACS分析流感病毒感染(圖18)、用螢光平板讀出器RFU分析人流感病毒感染(圖19)。表5:使用臨床實驗室常用的儀器讀出本發明的MBs信號的簡便性tableseeoriginaldocumentpage24總之，本發明的4全測分子是檢測流感病毒感染包括禽流感感染的高敏感試劑。例如，ALV-FluA和ALV-FluB對區別人流感病毒A和B亞型敏感，ALV-FluAH5和ALV-FluANl對檢測流感病毒A(H5)和流感病毒A(N1)禽流感病毒林敏感。此外，與ALV-FluAH5組合，ALV-FluANl和ALV-FluA具有快速檢測流感病毒A(H5N1)林的潛能。此外，本發明的檢測分子是快速一步檢測法，檢測過程僅花費10、20或30分鐘或更少。檢測信號的分析可靈活和簡單讀出。本發明的這些檢測分子具有擴展至檢測廣傳流感病毒抹包括16H和9N家族中可能致死抹的可能性。實施例12癌症標記物檢測表6顯示了檢測EGFR點突變和缺失的分子信標和檢測陽性對照存活和隨機的陰性對照的MB。5'(或3')端的螢光基團和3'(或5')端的猝滅物可以是任何其它螢光基團或猝滅物，只要它們可被淬滅。對於ALV-EGFR101-105,它們在EGFR基因上的相應位置在圖27中顯示。表6:核香酸序列tableseeoriginaldocumentpage24實施例13使用分子信標試劑進行肺癌細胞檢測以下是用於檢測EGFR點突變和/或缺失以進行癌症藥物基因組學研究的方法。EGFR是表皮生長因子受體的縮寫，它是在細胞表面上發現的與表皮生長因子(EGF)結合的一種蛋白質。材料包括細胞培養載玻片25x75xlmm(VWR目錄號48312-400)、Dako筆(目錄號S2002)、細胞培養基(RPMI-1640)、Opti-MEM轉染溶液(Invitrogen)、0.25%胰蛋白酶EDTA溶液、Gel/Mount(BiomedaCorp.目錄號M01)和Hoechst33342。方法力口下沖洗和包被載玻片(僅在細胞不貼孔時進行)在70%乙醇中室溫下浸泡載玻片30分鐘。(螢光抗體位點微載玻片，一端覆蓋，2個刻蝕環，大小3xl，，厚度0.93-1.05mm，~0.5Gross，金封閉，目錄號#3032)。從乙醇中移出載玻片且風乾。用無菌(高壓滅菌)1%凝膠(在H20中)在室溫中1小時包被載玻片的一側。除去凝膠溶液且風乾載玻片。在載玻片上固定細胞林在載玻片上畫兩個大圏(用DAKO筆)以區別細胞林放置的位置。(DakoPen，目錄號然2002)。旋轉從癌症病人收集的肺液樣品中的細胞。在無血清細胞培養基中重懸細胞至密度為-106細胞/ml。將2到3滴的細胞培養基滴到適當的載玻片上。將載玻片置於支架上以方便操作。將支架置於培養室放入37。C和2。/。C02的培養箱中2-4小時或直至大部分細胞貼上。用無血清培養基衝洗載玻片1次，無菌PBS衝洗1次。在冰浴的100%丙酮中浸泡平板8-10分鐘。用鉛筆標記載玻片因為丙酮會溶解黑色墨水。風乾載玻片。如果載玻片不馬上使用，在-80。C保存載玻片。加入MB試劑用無血清培養基衝洗載玻片1次，無菌PBS衝洗1次。從MB試劑的100uM儲備液中按需要製備適當濃度的無血清培養基溶液，如200nM和50nM。在細胞載玻片的適當的圏中加入100^1的MB試劑溶液。37'C培養箱中放置大約1小時。細胞染色培養1小時後，用無菌PBS沖洗栽玻片2次。加入Hoechst33342(10mg/ml的PBS儲備液的1/1000稀釋液)至每個細胞圈。37。C培養箱中放置不超過2-3分鐘。完成從培養箱中移出栽玻片。用無菌PBS衝洗載玻片2次。加入一滴載玻片gel/mount至每個細胞圏。每個圈上放置一個蓋玻片。(VWR微蓋玻片22x55mm,編號11/2,VWR目錄號#48393194)。螢光顯微鏡(ZeissAxioplan2)下螢光檢測向顯微鏡右邊，打開焚光電源。在顯微鏡右側，打開顯微鏡電源。連接黑電線至顯微鏡頂部的藍色AxioCamHRc的背面。在螢光顯微鏡下放置載玻片並且用白光濾光片定位細胞。一旦定位一些細胞，就可以切換不同螢光來尋找適當的標誌螢光。當準備好拍照時，至計算機上雙擊"AxioVision4"圖標。在側邊工具欄上，打開AxioCamHRControl。對每個螢光使用以下設置照射百分比應設為80%。表7:檢測數據表tableseeoriginaldocumentpage26打開顯微鏡右側的相機窗口。點擊"Live"在計算機上觀看載玻片的現場圖片。點擊"Snap"在計算機上捕捉圖片。點擊"Export"在計算機上保存圖片。確保在適當的螢光和白光下給細胞照相以確保細胞在圖片中出現。一旦完成，確保關閉螢光顯樣吏鏡。實施例14在肺癌中檢測EGFR突變大約40。/。非小細胞肺癌(NSCLC)的病人發現具有表皮生長因子受體(EGFR)基因的特異性突變。EGFR的突變和/或缺失認為與酪氨酸激酶抑制劑例如gefitinib(Irressa)和erlotinib(Tarceva)的臨床反應性有關。這些突變導致了生長因子信號的增加和對抑制劑治療的敏感性。篩選肺癌中的這些突變可以鑑別出對靶向治療會具有更好應答率的病人。癌症病人的早期篩選的新方法的開發對成功治療和增加病人存活率是極為重要的。癌症的最初焦點是開發和商品化基於MB技術的診斷和藥物基因組研究產品以提高輩巴向EGFR的藥物的治療效果-影響下遊信號轉導的EGFR突變對靶向EGFR治療的癌症病人的反應和存活具有直接影響。本發明的產品覆蓋超過80%的通常發現影響EGFR靶向藥物反應的EGFR突變。實施例15人肺癌細胞系的EGFR突變檢測設計的癌症藥物基因組研究的第一個產品是來檢測肺癌中的EGFR點突變和/或缺失。靶向標記物的特異性突變已知與進行EGFR靶向治療的病人的臨床反應相關。如圖4所示，與沒有突變的野生型細胞系I比較，臨床前試驗得到的結果，顯示了本發明的產品檢測肺癌細胞系I中的點突變(圖A),。本發明的產品還檢測了EGFR標記物基因的特異性缺失。如圖5所示，與目標靶區域沒有缺失的野生型細胞系III比較，產品檢測了肺癌細胞系III中的缺失(圖A)。實施例16肺癌病人的EGFR突變4全測使用本發明的產品檢測收集自NSCLC病人的胸膜液中存在的癌細胞的EGFR突變的可行性研究可用來評價臨床應用中產品的癌症檢測進行EGFR耙向治療藥物基因組研究的可能性。圖6中的代表數據顯示癌症產品檢測了在收集自NSCLC病人的胸膜液癌細胞中的EGFR酪氨酸激酶區域的缺失(紅色，圖A)。圖B中顯示了EGFR點突變陰性的病人。藍色螢光是染色的胸膜液細胞細胞核。總之，本發明用於癌症藥物基因組研究的檢測分子是(l)能夠同時檢測特異性突變和表達；(2)來自生物樣品的治療靶或標記物；(3)設計用於用特異性標記物表達的癌症基因組研究和早期癌症檢測；和(4)屬於使用癌細胞系的臨床前試驗的概念證據式說明。可使用的樣品包括SMCLC肺癌病人的胸膜液。實施例17癌症檢測本發明的一方面涉及開發特異於檢測癌症標記物和藥物基因組研究靶的分子。一系列癌症檢測分子設計用於檢測癌症標記物表達和癌症藥物基因組研究的靶。如圖1所示，ALV-1011和ALV-1022設計用於肺癌藥物基因組研究。ALV-1033特異於一個通用癌症標記物的表達。ALV-1066和ALV-1077設計用來檢測胰腺癌的特異性標記物的點突變。ALV-1011和ALV-1022設計用來檢測靶向肺癌的標記物的單突變和/或缺失。此革巴向標記物的特異性突變已知與進行治療的病人的臨床反應相關。臨床前試驗得到的結果，如圖2和3所示，顯示了肺癌細胞系I中的點突變可以分別用ALV-1011和ALV-2022完整檢測(圖A)，與沒有突變的細胞系III比較。ALV-1033設計用來檢測肺瘤生成早期的"通用"癌症標記物的表達。這個"通用"癌症標記物的表達在超過80%的幾乎所有種類腫瘤中發現並且其表達水平與病人疾病過程的預後有關。這個"通用"癌症標記物的表達在正常組織中通常無法檢測。如圖4所示，ALV-1033檢測肺癌細胞系I(高)和II(低)中的特異性標記物的表達。ALV-1033在診斷乳腺癌和肺癌中特別有用。ALV-1033的應用可用於診斷其它癌症標記，包括結腸和前列腺癌。ALV-1044和ALV-1055設計用於胰腺癌的早期檢測。標記物的突變在胰腺癌剛剛發展的早期。這個標記物的點突變發現於>90%的胰腺癌中。這些突變的大多數集中於特異性部位。圖5中的結果顯示了ALV-1044和ALV-1055在三個胰腺癌病人個體的活組織檢查的特異性癌症標記物中檢測了它們的特異性靶向突變。多種腫瘤標記物基因的表達的檢測同時提供了一種鑑別和分類臨床樣品例如組織切片、細針活組織4企查的aspirates、血液和體液中剝脫細胞中的癌細胞的特異和敏感的方法。根據本發明的一個實施方案，用本發明的產品和方法來鑑定了其表達與腫瘤轉移有關的一組基因。在其它方面中，本發明公開了使用分子信標成像檢測和/或鑑別生命體的細胞和組織中的多種癌症和病毒標記物的基因表達的點突變和/或改變存在的方法，以及它的應用。根據本發明，分子信標設計為當分子信標之一在一個或多個細胞中靶向疾病特異性標記物序列時，分子信標的螢光基團發出螢光從而產生相應螢光信號。螢光信號不需信號放大即可檢測。根據本發明，使用MBs檢測疾病標記物的感染和表達或突變來診斷和藥物基因組研究通過直接加入MBs(試劑)至樣品(細胞樣品)來進行，不需要進行信號放大。已顯示基於USMD技術的檢測法是對特異性分子靶的一種快速、特異、敏感、易使用和花費低的檢測法。比較本發明與當前市場上可商業獲得的診斷產品，例如RT-PCR和基於免疫的檢測法，如圖8中描述，顯示了本發明的優越性。tableseeoriginaldocumentpage28在其它方面中，本發明具有臨床和經濟利益，總結如下*敏感、特異、易使用和花費低的快速一步檢測法流感病毒感染和癌症的基於USMD的檢測是一種快速和簡單的一步檢測法。與花費超過6小時用於流感檢測和數天用於肺癌中EGFR檢測的當前標準RT-PCR檢測法比較，全過程可僅花費30分鐘或更少來完成。檢測結果的簡單處理不需昂貴儀器，基於USMD的檢測法得到的結果用臨床和研究實驗室中常用儀器檢測。除了螢光顯微鏡，結果還可用螢光活化細胞分揀器(FACS),一種常規用於監測HIV感染病人的白細胞計數的儀器、和萸光平板讀出器，這是一種用於免疫螢光^T測的標準儀器。*開發用於多種流感病毒抹的感染檢測的多種產品如以上公開，本發明在檢測流感病毒A和B亞型以及流感病毒A(H5)和A(N1)林中具有許多優點。在ALV-FluA、ALV-FluAH5和ALV-FluANl組合下，最近爆發於東南亞的傳染性禽流感可被檢測。USMD平臺技術可應用於其它亞型和其它株特異性流感病毒。對耐藥突變爆發的快速反應無論對癌症或流感傳染，本發明用於檢測突變包括缺失和點突變。如果出現耐藥突變的爆發，例如禽流感病毒Tamiflu耐藥抹或耐藥癌症出現，一旦鑑別出突變序列，用來設計和製造基於USMD的產品的周期時間範圍是2-3周。識別新產品的快速周期時間是基於抗體的檢測法開發的時間無法比較的。*早期診斷^r測和藥物基因組研究的應用本發明用來不僅;險測與疾病過程例如癌症和傳染病相關的標記物基因的表達，還檢測與靶向治療的藥物基因組研究相關的缺失或點突變。早期診斷和藥物基因組研究兩者均可對及早開始有效治療的病人有益。本發明的範例實施方案的上述說明僅用於例證和說明目的而不是詳盡的或限制本發明為公開的精確形式。在以上指導下的許多修飾和改變是可能的。選擇和描述實施方案以解釋本發明的原理和它們的實際應用以使本領域技術人員能夠使用本發明和多個實施方案的多種修飾以適用於特殊需要的用途。對本領域技術人員來說改變的實施方案很明顯屬於本發明不偏離其精神和範圍。因此，本發明的範圍是由附加的權利要求而不是上述說明書和如本文描述的範例實施方案定義的。參考文獻BaselgaJ,NortonLFocusonbreastcancer.CancerCell2002年；l(4):319-322.[2]BelsheRB.TheOriginsofPandemicInfluenza-Lessonsfromthe1918Virus.NEnglJMed2005年；353(21):2209-2211。KostrikisLG,TyagiS,MhlangaMM,HoDD,KramerFR.Spectralgenotypingofhumanalleles.Science1998年；279:1228-1229。KostrikisLGetal.AchemokinereceptorCCR2alleledelaysHIV-IdiseaseprogressionandisassociatedwithaCCR5promotermutation.NatMed1998年；4:350-353。10]Matsuo,T.InsituvisualizationofmessengerRNAforbasicfibroblastgrowthfactorinlivingcells.BiochimBiophysActa1998年；1379:178-184。MinamotoT,MaiM,RonaiZ.K-rasmutation:earlydetectioninmoleculardiagnosisandriskassessmentofcolorectal,pancreas,andlungcancers-areview.CancerDetectPrev2000年；24(1):1-12。PiatekASetal.MolecularbeaconsequenceanalysisfordetectingdrugresistanceinMycobacteriumtuberculosis.NatBiotechnol1998年；16:359-363。SokolDL，ZhangX，LuP,GewirtzAM.RealtimedetectionofDNA隱RNAhybridizationinlivingcells.ProcNatlAcadSciUSA1998年;95:11538-11543。TyagiS，KramerFR.Molecularbeacons:probesthatfluoresceuponhybridization.Nat.Biotechnol196;14:303-308。TyagiS,BratuDP，KramerFR.Multicolormolecularbeaconsforallelediscrimination.Nat.Biotechnol1998年；16:49-53。VetJAMetal.Multiplexdetectionoffourpathogenicretrovirusesusingmolecularbeacons.ProcNatlAcadSciUSA1999年；96:6394-6399。Xiang-HongPeng,Ze-HongCao，Jin-TangXia,GrantW.Carlson,MelindaM.Lewis,W川iamC.Wood,andUlyYang.CabcerRes2005年；65:(5),1909-1917。權利要求1.檢測疾病標記物的感染和/或表達或突變以對生命體進行診斷和藥物基因組研究的方法，包含以下步驟:a)從所述生命體中獲得樣品，其中所述樣品含有一個或多個細胞；b)用有機溶劑固定所述樣品；c)將分子信標加入到所述樣品中；和d)觀察添加了分子信標的結果以檢測疾病標記物的感染和/或表達或突變，其中所述的分子信標與一個或多個細胞中的疾病標記物的疾病相關RNA或DNA雜交，從而發射不需信號放大即可檢測到的信號。2.根據權利要求1所述的方法，還包含在所述觀察步驟前用染料對一個或多個細胞中的至少一個細胞核進行染色的步驟。3.根據權利要求1所述的方法，其中實施所述的添加分子信標和觀察結果的步驟的時間不超過2小時。4.根據權利要求1所述的方法，其中染色的結果用包括顯微鏡、FACS掃描儀、ELISA平板讀出器、閃爍計數器和任意它們的組合中的一種的儀器;^測。5.根據權利要求1所述的方法，其中所述的分子信標檢測傳染病細胞。6.根據權利要求5所述的方法，其中所述的傳染病包括流感病毒疾病。7.根據權利要求6所述的方法，其中所述的流感病毒包括流感病毒A。8.根據權利要求7所述的方法，其中所述的流感病毒A包括16H或9N林中的一種，和它們的任何組合。9.根據權利要求6所述的方法，其中所述的流感病毒選自包括流感病毒A、流感病毒AH5、流感病毒AN1、流感病毒B和任何它們的組合的組。10.根據權利要求1所述的方法，其中所述的分子信標檢測癌細胞。11.根據權利要求10所述的方法，其中所迷的癌症選自包括肺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、皮膚癌、骨癌、子宮癌、子宮頸癌、腦癌、結腸癌、咽喉癌和任何在動物體內產生的癌的組。12.根據權利要求1所述的方法，其中所述的突變是疾病標記物的點突變和/或缺失。13.根據權利要求1所述的方法，其中所述的疾病標記物是靶向治療的生物靶。14.根據權利要求13所述的方法，其中所述的生物靶是表皮生長因子受體基因和/或其轉錄產物。15.根據權利要求14所述的方法，其中所迷的表皮生長因子受體基因包含表皮生長因子受體酪氨酸激酶結構域的缺失突變。16.根據權利要求1所述的方法，其中所述的分子信標含有單鏈髮夾形結構的寡核苦酸探針，所述探針含有選自包括SEQIDNOs:l-ll和任何它們的組合的組的核苷酸序列。17.檢測生命體中的癌細胞的方法，包含以下步驟a)從生命體中獲得含有一個或多個細胞的樣品；b)用有機溶劑固定所述樣品；c)將分子信標添加到所述樣品中；和d)觀察添加了分子信標的結果以檢測所述樣品中的癌細胞，其中所述分子信標與樣品中一個或多個細胞中的癌細胞標記物相關的RNA或DNA雜交，從而發射不需信號放大即可檢測的信號。18.根據權利要求17所述的方法，還包括在所述觀察步驟前用染料對樣品中的一個或多個細胞中的細胞核進行染色的步驟。19.根據權利要求17所述的方法，其中所述的有機溶劑是丙酮、乙醇、曱醇、曱醛、多聚曱醛、丁醇和任何它們的組合中的一種。20.根據權利要求17所述的方法，其中所述的有機溶劑固定的樣品在所述添加所述分子信標前用Triton處理。21.根據權利要求17所述的方法，其中所述分子信標包含單鏈髮夾形結構的寡核香酸探針，所述探針含有選自包括SEQIDNOs:1-7和任何它們的組合的組的核苦酸序列。22.根據權利要求17所述的方法，其中所述的癌細胞選自包括肺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、皮膚癌、骨癌、子宮癌、子宮頸癌、腦癌、結腸癌、咽喉癌和任何在動物體內產生的癌的組。23.根據權利要求17所述的方法，其中所述的癌細胞顯示了癌細胞的特異性標記物中至少一個點突變和/或缺失。24.根據權利要求17所述的方法，其中所述的樣品是組織切片、活組織檢查的抽吸液、血液和體液中的剝脫細胞中的一種。25.檢測生命體中流感病毒感染的細胞的方法，包含以下步驟a)從所述生命體中獲得樣品，其中所述樣品含有一個或多個細胞；b)用有機溶劑固定所述樣品；c)將分子信標加入到所迷樣品中；d)觀察結果以;險測所述樣品中的流感病毒感染的細胞，其中所述的分子信標與至少一個細胞中的流感病毒標記物相關的RNA或DNA雜交，從而發射不需信號放大即可檢測的信號。26.根據權利要求25所述的方法，還包含在所述的觀察步驟前用染料對一個或多個細胞中的至少一個細胞核進行染色的步驟。27.根據權利要求25所述的方法，其中所述的有機溶劑是丙酮、乙醇、甲醇、曱醛、多聚曱醛、丁醇和任何它們的組合中的一種。28.根據權利要求25所述的方法，其中所述的有機溶劑固定的樣品在添加所述分子信標前用Triton處理。29.根據權利要求25所述的方法，其中所述分子信標含有單鏈髮夾形結構的寡核苦酸探針，所迷探針含有選自包括SEQIDNOs:8-l1和任何它們的組合的組的核苷酸序列。30.根據權利要求25所述的方法，其中所述的流感病毒包含禽流感病毒。31.根據權利要求25所述的方法，其中所述的流感病毒是流感病毒A或流感病毒B。32.根據權利要求31所述的方法，其中所述的流感病毒A包括16H和9N抹中的一種，和它們的任何組合。33.根據權利要求25所述的方法，其中一個或超過一個的探針同時添加到所述樣品中。34.檢測疾病標記物的感染和/或表達或突變以對生命體進行診斷和藥物基因組研究的方法，包含以下步驟a)從所述生命體中獲得樣品，其中所述樣品含有一個或多個細胞；b)用有機溶劑固定所述樣品；c)將分子信標添加至所述樣品中；d)觀察添加了分子信標的結果以;險測疾病標記物的感染和/或表達或突變，其中所述分子信標與細胞中疾病標記物的疾病相關的RNA或DNA雜交，從而發射不需信號放大即可檢測的信號。35.根據權利要求34所述的方法，還包含在所述觀察步驟前用染料對樣品中一個或多個細胞中的細胞核進行染色的步驟。36.根據權利要求34所述的方法，其中進行添加分子信標和觀察所述結果的時間不超過2小時。37.根據權利要求34所述的方法，其中所述的有機溶劑是丙酮、乙醇、曱醇、曱醛、多聚曱酪、丁醇和任何它們的組合中的一種。38.分子信標，所述分子信標包含單鏈髮夾形結構的寡核苷酸探針，所述探針含有與疾病細胞中的疾病標記物的疾病相關RNA和/或DNA雜交的核苷酸序列，從而發射不需信號放大即可檢測的信號。39.根據權利要求38所述的分子信標，其中所述的寡核苷酸探針含有選自包括SEQIDNOs:1-11的組的核苦酸序列。40.根據權利要求38所述的分子信標，其中所述的寡核苷酸探針具有能與癌細胞中編碼表皮生長因子受體基因酪氨酸激酶結構域的RNA和/或DNA雜交的核苷酸序列。41.根據權利要求38所述的分子信標，其中所述的寡核苷酸探針包含5'端的螢光基團和3'端的猝滅物，或3'端的螢光基團和5'端的猝滅物。42.根據權利要求38所述的分子信標，其中所述的疾病細胞是癌細胞或傳染病細胞中的一種。43.根據權利要求38所述的分子信標，其中所述的疾病細胞感染流感病毒。44.根據權利要求38所述的分子信標，其中所述的流感病毒是流感病毒A或流感病毒B。45.根據權利要求44所述的分子信標，其中所述的流感病毒A包括16H和9N抹中的一種，和任何它們的組合。46.根據權利要求38所述的分子信標，其中所述的疾病細胞是癌細胞。47.檢測疾病標記物的感染和/或表達或突變以對生命體進行診斷和藥物基因組研究的診斷試劑盒，包含a)權利要求38所述的分子信標；和b)說明書。48.根據權利要求47所述的診斷試劑盒，其中所述的寡核苷酸探針含有能與癌細胞中編碼表皮生長因子受體基因酪氨酸激酶結構域的RNA和/或DNA雜交的核苷酸序列。49.根據權利要求47所述的診斷試劑盒，其中所述的寡核苷酸探針含有選自包括SEQIDNOs:1-11的組的核芬酸序列。50.根據權利要求47所述的診斷試劑盒，其中所述的試劑盒包含超過一個的寡核苦酸探針，所述探針含有選自包括SEQIDNOs:1-7的組的核苦酸序列。51.根據權利要求47所述的診斷試劑盒，其中所述的試劑盒包含超過一個的寡核苦酸探針，所述探針含有選自包括SEQIDNOs:8-11的組的核苷酸序列。52.根據權利要求47所述的診斷試劑盒，其中從將所述分子信標添加到樣品中至從中觀察到結果所進行的診斷過程的時間不超過2小時。53.根據權利要求38所述的分子信標，其中所述的寡核苷酸探針含有能與編碼通用癌症標"^己物的RNA和/或DNA雜交的核苷酸序列。54.根據權利要求1所述的方法，其中所述的分子信標能與表皮生長因子受體的轉錄產物雜交。55.根據權利要求1所述的方法，其中所述的分子信標能檢測耐藥癌症和/或耐藥病原體。全文摘要本發明公開了用於檢測疾病標記物的感染和/或表達或突變以進行診斷和藥物基因組研究的分子信標。所述分子信標能與從生命體獲得的樣品中的疾病標記物的疾病相關RNA或DNA雜交，從而發射不需信號放大即可檢測的信號。疾病標記物包括特異於病原體包括流感病毒、癌細胞標記物和對耐藥癌症和傳染病原體的耐藥性相關的基因突變標記物的基因序列。為了檢測疾病細胞，從生命體獲得含有一個或多個細胞的樣品，並用有機溶劑固定。然後將分子信標加入到樣品中，隨後對樣品中細胞的細胞核進行染色。信號用顯微鏡、FACS掃描儀、ELISA平板讀出器、閃爍計數器或任何它們的組合進行檢測。文檔編號C12Q1/68GK101384730SQ200680053274公開日2009年3月11日申請日期2006年12月22日優先權日2005年12月23日發明者周成春,奧古斯丁·林,楊泮池申請人:阿爾維德醫藥技術公司