對檸檬酸鹽穩定的中性金屬蛋白酶的用途和生產的製作方法

2023-05-16 07:36:01 2

專利名稱：對檸檬酸鹽穩定的中性金屬蛋白酶的用途和生產的製作方法
技術領域：
本發明提供了包含至少一種中性金屬蛋白酶的方法和組合物，其中所述的中性金 屬蛋白酶在金屬螯合劑的存在下具有改良的穩定性。在一些實施方案中，該中性金屬蛋白 酶可用於清潔以及包含檸檬酸鹽的其它應用。在一些特別優選的實施方案中，本發明提供 了包含變體中性金屬蛋白酶的方法和組合物，其中所述的變體中性金屬蛋白酶已被改造以 對檸檬酸鹽誘導的自溶解具有抗性。
背景技術：
芽孢桿菌屬(Bacillus)的成員是革蘭氏陽性細菌，其分泌許多工業上有用的酶， 所述酶可通過發酵而大量廉價地產生。分泌的芽孢桿菌酶的實例是枯草桿菌蛋白酶絲氨 酸蛋白酶、含鋅的中性蛋白酶、a-澱粉酶以及纖維素酶。芽孢桿菌蛋白酶廣泛應用於紡織 品、洗衣店和家用工業中(Galante，Current Organic Chemistry，7 :1399_1422，2003 ；以 及 Showell, Handbookof Detergents, Part D Formulation, Hubbard (編輯),NY Taylor andFrancis Group, 2006) 0從被洗的東西中高效移除顏色和染色需要蛋白酶。然而，清潔 和洗滌劑的液體製備物通常含有增效助劑、表面活性劑和金屬螯合劑，其對大多數蛋白酶 具有去穩定效果。一般而言，變性劑誘導金屬蛋白酶通過自溶快速地降解。因此，已經研究了蛋白 酶自溶的分子機製作為產生穩定的金屬蛋白酶的途徑(Eijsink等，J Biotechnol,113 105-120, 2004) 0對自溶途徑的理解是很複雜的，因為(i)蛋白酶局部降解變性蛋白形態 的高效率，以及(ii)因為多種未摺疊形態很可能存在並遍布於蛋白質分子，導致多種和平 行的自溶途徑。已報導了嗜熱菌蛋白酶樣金屬蛋白酶自溶的分子機制(Eijsink等，Nat Struct Biol,2 374-379,1995；van den Burg 等，Biotechnol Appl Bioeng，30 :35_40， 1999 ；以及 Vriend，J Comput Aided Mol Des，7 :367_396，1993)。然而，在本領域仍然需要闡明其它工業有關的金屬蛋白酶的自溶機制。具體而言， 仍然需要了解檸檬酸鹽誘導的解澱粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)中性金屬 蛋白酶(NprE)的自溶作用，其可用於設計在鈣螯合劑的存在下具有改良的穩定性的NprE 變體。這在解澱粉芽胞桿菌NprE的情況下尤為重要，因為該酶的結構和功能依賴於鈣，使 其更易受到諸如檸檬酸鹽的鈣清除劑的影響。發明概述本發明提供了包含至少一種中性金屬蛋白酶的方法和組合物，其中所述的中性金 屬蛋白酶在金屬螯合劑的存在下具有改良的穩定性。在一些實施方案中，該中性金屬蛋白 酶可用於清潔以及包含檸檬酸鹽的其它應用。在一些特別優選的實施方案中，本發明提供 了包含變體中性金屬蛋白酶的方法和組合物，其中所述的變體中性金屬蛋白酶已被改造以對檸檬酸鹽誘導的自溶解具有抗性。本發明提供了分離的中性金屬蛋白酶變體，其對檸檬酸鹽誘導的自溶作用具有改 良的抗性。在一些優選的實施方案中，該中性金屬蛋白酶變體是具有以下胺基酸序列的芽 孢桿菌中性金屬蛋白酶變體，所述序列在選自等價於SEQ ID NO :3所示胺基酸序列的位置 129、130、138、190和220中的3個、4個或5個處包含替換。在一些優選的實施方案中，所 述替換包含選自 S129I/F130L/D220P、M138L/V190I/D220P 和 S129I/F130L/M138L/V190I/ D220P的多重突變。在優選的實施方案中，該芽孢桿菌是解澱粉芽胞桿菌。在一些實施方案 中，該中性金屬蛋白酶與包含SEQ ID NO :3所示胺基酸序列的中性金屬蛋白酶具有至少約 45 %、至少約50 %、至少約53 %、至少約55 %、至少約57 %、至少約60 %、至少約63 %、至少 約65 %、至少約67 %、至少約70 %、至少約73 %、至少約75 %、至少約77 %、至少約80 %、至 少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98 %或至少約99 % 的胺基酸同一性。本發明還提供了編碼本文所述中性金屬蛋白酶變體的分離的核酸，以及 包含該核酸的表達載體。此外，本發明還提供了包含該表達載體的宿主細胞。在另一實施 方案中，本發明提供了從所述包含該表達載體的宿主細胞中獲得的中性金屬蛋白酶變體。此外，本發明提供了分離的解澱粉芽胞桿菌中性金屬蛋白酶變體，其對檸檬酸鹽 誘導的自溶作用具有改良的抗性。在一些優選的實施方案中，該中性金屬蛋白酶變體具有 在選自等價於SEQ ID NO :3所示胺基酸序列的位置129、130、138、190和220中的3個、4個 或5個位置處包含替換的胺基酸序列。還提供了包含SEQ ID NO :3所示胺基酸序列的多重 突變的分離的解澱粉芽胞桿菌中性金屬蛋白酶變體，其中所述多重突變選自S129I/F130L/ D220P、M138L/V190I/D220P 和 S129I/F130L/M138L/V190I/D220P。在一些優選的實施方 案中，該分離的解澱粉芽胞桿菌中性金屬蛋白酶變體包含SEQ ID N0:18(S129I/F130L/ D220P)、SEQ ID NO 19 (M138L/V190I/D220P)或 SEQ IDN0 20 (S129I/F130L/M138L/V190I/ D220P)所示的胺基酸序列。本發明還提供了編碼本文所述中性金屬蛋白酶變體的分離的核 酸，以及包含該核酸的表達載體。此外，本發明還提供了包含該表達載體的宿主細胞。在另 一實施方案中，本發明提供了從所述包含該表達載體的宿主細胞中獲得的中性金屬蛋白酶 變體。此外，本發明提供了產生具有中性金屬蛋白酶活性的酶的方法，包括用包含編碼 中性金屬蛋白酶變體的核酸的表達載體轉化宿主細胞；以及在適於產生該中性金屬蛋白酶 的條件下培養該經轉化的宿主細胞。本發明的一些實施方案還包括收穫所產生的中性金屬 蛋白酶的步驟。在優選的實施方案中，宿主細胞是芽孢桿菌屬物種，而在尤其優選的實施方 案中，芽孢桿菌屬物種是枯草芽孢桿菌(B. subtilis)。本發明還提供了包含分離的中性金屬蛋白酶變體的組合物，其中所述的變體具有 對檸檬酸鹽誘導的自溶作用的經改良的抗性。在一些實施方案中，該組合物還包含至少一 種鈣離子和/或至少一種鋅離子。在其它的實施方案中，該組合物還包含檸檬酸鹽。在一 些優選的實施方案中，該組合物是清潔組合物(例如，洗滌劑)。在一些特別優選的實施方 案中，該組合物還包含至少一種選自蛋白酶、澱粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶(marmanase)、果 膠酶、角質酶(cutinase)、氧化還原酶、半纖維素酶和纖維素酶的的附加酶或酶衍生物。在 本發明的一些實施方案中，該組合物包含至少約0. 0001重量百分數的中性金屬蛋白酶變 體，或約0. 001至約0. 5重量百分數的中性金屬蛋白酶變體。本發明的一些組合物還包含至少一種附屬組分。在一些尤其優選的實施方案中，該組合物還包含足量的PH調節劑以給 該組合物提供約3至約5的淨pH，該組合物基本上沒有在約pH 3至約pH 5的pH水解的物 質。在一些實施方案中，在約pH 3至約pH 5的pH水解的物質包含至少一種表面活性劑。 在一些優選的實施方案中，該表面活性劑是包含環氧乙烷部分的烷基硫酸鈉表面活性劑。 在一些實施方案中，該組合物是液體。此外，本發明還提供了包含分離的中性金屬蛋白酶變體的動物飼料組合物，其中 所述變體對檸檬酸鹽誘導的自溶作用具有經改良的抗性。在其它實施方案中，還提供了包 含分離的中性金屬蛋白酶變體的織物加工組合物，其中所述變體對檸檬酸鹽誘導的自溶作 用具有經改良的抗性。在其它實施方案中，還提供了包含分離的中性金屬蛋白酶變體的皮 革加工組合物，其中所述變體對檸檬酸鹽誘導的自溶作用具有經改良的抗性。此外，本發明還提供了清潔方法，包括使表面和/或包含織物(例如，材料)的物 品與包含分離的中性金屬蛋白酶變體的清潔組合物接觸的步驟，其中所述變體對檸檬酸鹽 誘導的自溶作用具有經改良的抗性。在一些實施方案中，該方法還包括在使該表面或材料 與清潔組合物接觸後漂洗該表面和/或織物的步驟。附圖簡述

圖1顯示了檸檬酸鹽誘導的解澱粉芽胞桿菌中性蛋白酶(NprE)的自溶作用。圖 A提供了在0.1M Tris-HCl(pH 8.4)中作為檸檬酸鹽濃度(0_250mM)和鈣濃度(0-10mM) 的函數顯示0.4mg/ml蛋白酶失活的圖。應用琥珀醯化_酪蛋白/TNBSA測量剩餘的活 性，並且將剩餘的活性與在10mM氯化鈣的存在下測量的活性進行比較。圖B描述了 10% SDS-PAGE分析，其說明了檸檬酸鹽誘導的蛋白酶的自溶模式。在含有0-100mM檸檬酸鹽的 5mM HEPES(pH 8.0)中使約0. 4mg/ml蛋白質在冰上溫育100分鐘。在凝膠上樣之前，用 0. IN HC1失活蛋白酶以停止自溶。泳道1表示在不存在檸檬酸的情況下溫育的對照，泳道 2-7含有在增加的檸檬酸鹽的存在下的蛋白質，以及泳道8含有分子量標記。圖2提供了解澱粉芽胞桿菌中性蛋白酶(NprE)自溶片段的胺基酸序列片段 1(SEQ ID NO :13)、片段 2(SEQ ID NO 14)、片段 3 (SEQ IDN0 :15)、片段 4 (SEQ ID NO: 16) 以及片段5(SEQ ID N0:17)。自溶片段N端用粗體著重顯示。編號對應於NprE成熟形式 的位置。圖3提供了通過針對檸檬酸鹽敏感性篩選在NprE中3個位置上所有可能的氨基 酸替換而獲得的活性數據的代表圖。圖A提供了來自位置M138活性篩選的數據。圖B提 供了來自位置D220活性篩選的數據。圖C提供了來自位置V190活性篩選的數據。在25mM HEPES (pH 8. 0)中在存在或不存在50mM檸檬酸鹽的情況下在25°C篩選60分鐘。Y軸是任 意的並且表示相對於野生型蛋白質的增加。圖4提供了作為檸檬酸濃度和溫育時間的函數顯示中性蛋白酶變體活性的圖。圖 A 闡釋了野生型蛋白酶( )、V190I(〇M138L(T),D220P( A )、M138L-D220P ( ■) 和S129I-F130L-M138L-V190I-D220P ( )在室溫60分鐘後測量的活性的檸檬酸鹽濃 度依賴性。圖B描述了 10% SDS-PAGE分析，其顯示了檸檬酸鹽對野生型NprE和變體 S129I-F130L-M138L-V190I-D220P的作用。在4°C使約0. 4mg/ml蛋白與增加的檸檬酸鹽濃 度溫育100分鐘。泳道1-4作為檸檬酸鹽(0-75mM)的函數闡述野生型的自溶模式，以及泳 道6-10顯示了完整(未自溶)的S129I-F130L-M138L-V190I-D220P。泳道5表示標準分子量標記。圖5提供了顯示野生型和變體蛋白酶熱穩定性的圖。圖A提供了在130mM檸 檬酸鹽的存在下 0. 4mg/ml 蛋白酶變體 S129I、D220E、V190I-D220P、S129I-F130L-D220P 和 S129I-F130L-M138L-V190I-D220P 的量熱圖。應用 Auto-Cap VP-DSC(MicroCal, Northampton, MA, USA)以200°C /hr的掃描率從20_90°C收集數據。針對緩衝液基線校準 所有顯示的數據。緩衝液是5mM HEPES, pH 8.0。圖B提供了許多單、二重和三重蛋白酶變體的柱狀圖，其顯示了在130mM檸檬酸鹽 (pH 8.0)的存在下熱熔點(Tm)的增量升高。圖6提供了列出野生型NprE及其變體的活性和熱穩定性的表。圖7提供了本發明示範性的對檸檬酸鹽穩定的NprE變體的胺基酸序列。 圖A提供了 S129I-F130L-D220P NprE變體的胺基酸序列(SEQ IDN0 :18)。圖B提 供 了 M138L-V190I-D220P NprE 變體的胺基酸序列(SEQID NO :19)。圖 C 提供了 S129I-F130L-M138L-V190I-D220P NprE 變體的胺基酸序列(SEQ ID NO: 19)。圖8提供了 Kcat/Km對pH的圖，闡明了野生型NprE和五重NprE變體 (S129I-F130L-M138L-V190I-D220P)都在 pH 6. 5 對 AGLA 底物具有最佳活性。圖9提供了剩餘NprE活性對pH的圖，闡明了鈣的添加在低和高pH穩定了野生型 NprE 和五重 NprE 變體(S129I-F130L-M138L-V190I-D220P)。發明的一般描述本發明提供了包含至少一種中性金屬蛋白酶的方法和組合物，其中所述的中性金 屬蛋白酶在金屬螯合劑的存在下具有改良的穩定性。在一些實施方案中，該中性金屬蛋白 酶可用於清潔以及包含檸檬酸鹽的其它應用。在一些特別優選的實施方案中，本發明提供 了包含變體中性金屬蛋白酶的方法和組合物，其中所述的變體中性金屬蛋白酶已被改造以 對檸檬酸鹽誘導的自溶解具有抗性。除非另有指明，本發明的實踐涉及分子生物學、微生物學、以及重組DNA領域通常 所用的常規技術，它們在本領域技術範圍內。此類技術是本領域技術人員已知的，它們被描 述於大量的教材和參考文獻中(見，例如Sambrook等，「Molecular Cloning :A Laboratory Manual」，第二版(Cold SpringHarbor)，1989 和 Ausubel 等，「Current Protocols inMolecularBiologyM987) 本文中(包括上文和下文中)提到的所有專利、專利申請、 文章和出版物都通過引用明確併入本文。除非在本文中另外定義，本文中使用的所有技術和科學術語具有本發明所屬領域 技術人員通常理解的含義。例如，Singleton 和 Sainsbury，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology，第二版，John Wiley andSons, NY(1994)；以及 Hale 和 Marham， The Harper Collins Dictionary ofBiology,Harper Perennial,NY(1991)為本令頁域技術 人員提供了許多本文所用的術語的一般解釋。雖然與本文中描述的方法和材料相似或等同 的任何方法和材料都可以用於本文中所描述的本發明的實踐，但本文中描述了優選的方法 和材料。因此，通過作為一個整體參考該說明書更詳細的描述了以下即將定義的術語。同樣，如本文中所使用的，除非上下文明確另外指出，單數術語「一個」、「一種」和 「該」包括對複數的提及。數值範圍包括界定該範圍的數字。除非另外指出，分別地，核酸 以5』至3』方向從左至右書寫；胺基酸序列以從氨基至羧基的方向從左至右書寫。應當理解，本發明不局限於描述的特定的方法、方案和試劑，因為取決於本領域技術人員使用它們 的背景，它們可發生變化。此外，本文中提供的標題不是本發明多個方面或實施方案的限制，其中所述的方 面或實施方案可以通過參考作為一個整體的本說明書獲得。因此，下文馬上定義的術語通 過參考作為一個整體的本說明書進行更充分地描述。然而，為了促進理解本發明，下文定義 了眾多術語。定義除非在本文中另外定義，本文中使用的所有技術和科學術語具有本發明所屬領域 技術人員通常理解的含義。雖然與本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料 都可以用於本文中所描述的本發明的實踐，但本文中描述了優選的方法和材料。因此，通過 作為一個整體參考該說明書更詳細的描述了以下即將定義的術語。同樣，如本文中所使用 的，除非上下文明確另外指出，單數術語「一個」、「一種」和「該」包括對複數的提及。除非 另外指出，分別地，核酸以5』至3』方向從左至右書寫；胺基酸序列以從氨基至羧基的方向 從左至右書寫。應當理解，本發明不局限於描述的特定的方法、方案和試劑，因為取決於本 領域技術人員使用它們的背景，它們可發生變化。在本說明書通篇範圍內給出的每個最大數字界限意圖包括每個較小的數字界限， 如同在本文中明確地寫出此類較小的數字界限。在本說明書通篇範圍內給出的每個最小數 字界限將包括每個較高的數字界限，如同在本文中明確地寫出此類較高的數字界限。在本 說明書通篇範圍內給出的每個數字範圍將包括落入這種較寬泛數字範圍內的每個較窄的 數字範圍，如同在本文中明確地寫出此類較窄的數字範圍。在相關部分引用的所有文件通過參考併入本文；對於任何文件的引用不應當被理 解為承認其為本發明的現有技術。如本文中所用，術語「蛋白酶」和「蛋白酶解活性」指這樣的蛋白質或肽，其顯示 水解肽或具有肽鍵的底物的能力。存在用於測量蛋白酶解活性的眾多熟知方法(見例如 Kalisz, 「 Microbial Proteinases,「在Fiechter (編輯)，Advances in Biochemical EnRineerinR/BiotechnoloRY, 1988)。例如，蛋白酶解活性可以通過比較測定法確定，其 中所述比較測定法分析相應蛋白酶水解商品底物的能力。在這種分析蛋白酶或蛋白酶 解活性中有用的示例性底物包括但不限於二-甲基酪蛋白(Sigma C-9801)、牛膠原蛋白 (SigmaC-9879)、牛彈性蛋白(Sigma E-1625)和牛角蛋白(ICN Biomedical 902111)。使用 這些底物的比色測定法是本領域中熟知的(見例如W0 99/34011和美國專利號6，376，450， 兩篇均再此引入作為參考)。pNA測定法(見例如DelMar等人，Anal Biochem,99 =316-320, 1979)也發現用於確定梯度洗脫期間所收集級分的有效酶濃度。這種測定法測量酶水解可 溶性合成底物琥珀醯_丙氨酸_丙氨酸_脯氨酸_苯丙氨酸_對硝基苯胺(sAAPF-pNA)時 釋放對硝基苯胺的速率。從水解反應產生黃顏色的速率在分光光度計上於410nm處測量並 且與有效酶濃度成正比。此外，在280nm處的吸光度量值可以用來確定總蛋白濃度。有效 酶/總蛋白比產生了該酶純度。如本文所使用的，術語「NprE蛋白酶」和「NprE」指本文描述的中性金屬蛋白酶。 在一些優選的實施方案中，NprE蛋白酶是在本文中命名為純化的MULTIFECT 中性 或PMN的蛋白酶，其來自解澱粉芽胞桿菌。因此，在一些實施方案中，術語「PMN蛋白酶」指衍生自解澱粉芽胞桿菌的具有與SEQ ID NO :3所提供的基本上同一的胺基酸序列的天然存 在的成熟蛋白酶。在備選的實施方案中，本發明提供了 NprE蛋白酶的部分。術語「芽孢桿菌蛋白酶同源物」指與衍生自解澱粉芽胞桿菌的成熟蛋白酶具有基 本上同一的胺基酸序列的天然存在蛋白酶，或編碼此類天然存在蛋白酶的多核苷酸序列， 並且所述蛋白酶保留由此類核酸編碼的中性金屬蛋白酶的功能特徵。如本文中所用，使用術語「NprE變體，，和「NprE蛋白酶變體」指這樣的蛋白酶，所 述蛋白酶與野生型NprE相似、尤其在其功能上相似，但在其胺基酸序列中具有使它們在序 列上不同於野生型蛋白酶的突變。如本文中使用的，「芽孢桿菌屬物種」指所有在「芽孢桿菌」屬中的物種，其是革 蘭氏陽性細菌，並被歸類為桿菌(Bacilli)綱Bacillales目芽孢桿菌(Bacillaceae)科 的成員。「芽孢桿菌」屬包括本領域技術人員已知的「芽孢桿菌」屬中的所有種，其包括但 不限於，枯草芽孢桿菌(B. subtilis)、地衣芽孢桿菌(B. licheniformis)、遲緩芽孢桿菌 (B. lentus)、短芽孢桿菌(B. brevis)、嗜熱脂肪桿菌(B. stearothermophilus)、嗜鹼芽孢 桿菌(B. alkalophilus)、解澱粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌(B. clausii)、耐鹽芽孢桿菌 (B. halodurans)、巨大芽孢桿菌(B. megaterium)、凝固芽孢桿菌(B. coagulans)、環狀芽孢 桿菌(B. circulans)、燦爛芽孢桿菌(B. lautus)和蘇雲金芽孢桿菌(B. thuringiensis)。應 當認識到，芽孢桿菌屬還將繼續經歷分類重構。因此，該屬包括已經被重新分類的物種，這 包括但不限於嗜熱脂肪桿菌等生物，其現在被稱為「Geobacillus stearothermophilus」。 存在氧時產生抗性內生孢子被認為是芽孢桿菌屬的界定特徵，儘管該特徵也適用於新 近命名的脂環酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus)、雙芽孢桿菌屬(Amphibacillus)、硫 胺素芽孢桿菌屬(Aneurinibaci 1 lus)、厭氧芽孢桿菌屬(Anoxybaci 1 lus)、短芽孢桿菌 屬(Brevibacillus)、Filobacillus、薄壁芽孢桿菌屬(Gracilibacillus)、喜鹽芽孢杆 菌(Halobacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、需鹽芽孢桿菌屬(Salibacillus)、 耐熱芽孢桿菌屬(Thermobacillus)、解脲芽孢桿菌屬(Ureibacillus)和枝芽孢桿菌屬 (Virgibacillus)。相關的(和衍生的)蛋白質包含「變體蛋白質」。在一些優選的實施方案中，變體 蛋白質與親本蛋白質之間以及變體蛋白質彼此之間有少量胺基酸殘基不同。不同的胺基酸 殘基數目可以是一個或多個，優選1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或更多個胺基酸殘基。 在一些優選的實施方案中，變體之間不同的胺基酸數目是1至10。在一些特別優選的實施 方案中，相關蛋白質並且尤其是變體蛋白質包含至少35%、40%、45%、50%、55%、60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或 99%的胺基酸序列同一性。此外，本 文所使用的相關蛋白質或變體蛋白質是指在重要區域數目上與另一相關蛋白質或親本蛋 白質不同的蛋白質。例如，在一些實施方案中，變體蛋白質具有1、2、3、4、5或10個與親本 蛋白質不同的相應的重要區域。本領域已知數種方法適於產生本發明的酶的變體，包括但不限於位點飽和誘變、 掃描誘變、插入誘變、隨機誘變、定點誘變和定向進化以及多種其它重組方法。通過任何合適的方法或「測試」來表徵野生型和突變蛋白質，並且優選基於評估感 興趣的特性。例如，在本發明的一些實施方案中確定PH和/或溫度、以及洗滌劑和/或氧 化穩定性。實際上，預期在一個或多個這些特徵(PH、溫度、蛋白酶解穩定性、洗滌劑穩定性和/或氧化穩定性)中具有各種穩定性程度的酶將是有用的。本文中可相互交換使用的術語「多核苷酸」和「核酸」指任何長度的核苷酸的聚合 形式，無論是核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。這些術語包括但不限於單鏈、雙鏈或三鏈的 DNA、基因組DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA雜合體或包含嘌呤和嘧啶鹼基，或其他天然的、化學 的、生物化學修飾的、非天然或衍生的核苷酸鹼基的聚合物。以下是多核苷酸的非限制性例 子基因、基因片段、染色體片段、EST、外顯子、內含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重組 多核苷酸、支化多核苷酸、質粒、載體、任意序列的分離DNA、任意序列的分離RNA、核酸探針 和引物。在一些實施方案中，多核苷酸包含修飾的核苷酸(諸如甲基化核苷酸)和核苷酸 類似物、尿嘧啶、其他糖和連接基團諸如氟代核糖(fluororibose)與硫代酯(thioate)和 核苷酸分支(nucleotide branche)。在備選實施方案中，核苷酸的序列被非核苷酸組分間 斷。如本文中所用，術語「DNA構建體」和「轉化DNA」可互換地用來指用於將序列導入 宿主細胞或生物中所用的DNA。該DNA可以在體外通過PCR或本領域技術人員已知的任意 其他合適技術產生。在特別優選的實施方案中，DNA構建體包含目的序列(例如作為引入的 序列)。在一些實施方案中，該序列與額外元件諸如調控元件(例如啟動子等)有效連接。 該DNA構建體還可以包含選擇標記。它還可以包含在側翼分布有同源性盒的引入的序列。 在其他實施方案中，轉化DNA包含添加至末端的其他非同源序列(例如填充序列或側翼序 列)。在一些實施方案中，引入的序列的末端閉合，從而該轉化DNA形成閉合環。所述轉化 序列可以是野生型、突變或修飾的。在一些實施方案中，該DNA構建體包含與宿主細胞染色 體同源的序列。在其他實施方案中，該DNA構建體包含非同源序列。一旦該DNA構建體在 體外裝配起來，則它可以用來1)插入異源序列至宿主細胞的預期靶序列中；和/或2)誘 變宿主細胞染色體的區域(即用異源序列替換內源序列)，3)缺失靶基因；和/或導入複製 型質粒至宿主中。如本文中所用，術語「表達盒」和「表達載體」指重組或合成產生的核酸構建體，其 具有允許特定核酸在靶細胞中轉錄的一系列特定核酸元件。該重組表達盒可以摻入質粒、 染色體、線粒體DNA、質體DNA、病毒或核酸片段。一般地，表達載體的重組表達盒部分包括 待轉錄的核酸序列和啟動子，以及其他序列。在優選的實施方案中，表達載體具有摻入和在 宿主細胞中表達異源DNA片段的能力。眾多原核和真核表達載體是市售的。對合適表達載 體的選擇在本領域技術人員的知識範圍內。術語「表達盒」在本文中與「DNA構建體」以及它 們的語法等同物可互換地使用。對合適表達載體的選擇在本領域技術人員的知識範圍內。如本文中所用，術語「載體」指設計以將核酸導入至一個或多個細胞類型中的多核 苷酸構建體。載體包括克隆載體、表達載體、穿梭載體、質粒、盒等。在一些實施方案中，所 述多核苷酸構建體包含編碼蛋白酶(例如前體或成熟蛋白酶)的DNA序列，其中所述DNA 序列與能夠實現該DNA在合適宿主中表達的合適前導序列(例如分泌序列等)有效連接。如本文中所用，術語「質粒」指用作克隆載體並且在一些真核生物或原核生物中形 成染色體外自我複製性遺傳元件或整合至宿主染色體中的環狀雙鏈(ds)DNA構建體。如本文在導入核酸序列至細胞中的上下文中所用，術語「導入」指適合轉移核酸 序列至細胞中的任意方法。此類導入方法包括但不限於原生質體融合、轉染、轉化、接合 和轉導(見例如 Ferrari 等人，「Genetics」 在 Hardwood 等人(編輯)，Bacillus, PlenumPublishing CorD.，第 57-72 頁，1989 中)。如本文中所用，術語「轉化的」和「穩定轉化的」指具有整合至其基因組中或作為 維持至少兩個世代的游離型質粒的非天然(異源)多核苷酸序列的細胞。如本文中所用，術語「編碼選擇標記的核苷酸序列」指這樣的核苷酸序列，它能夠 在宿主細胞中表達並且其中該選擇標記的表達賦予含有所表達基因的細胞在相應選擇劑 存在下或缺少必需養分時生長的能力。如本文中所用，術語「選擇標記」和「選擇性標記」指允許易於選擇含有所述載體的 那些宿主的能夠在宿主細胞中表達的核酸(例如基因)。此類選擇標記的實例包括但不限 於抗微生物劑。因而，術語「選擇標記」指這樣的基因，它們提供了宿主細胞已經攝取外來目 的DNA或某種其他反應已經發生的指示。一般，選擇標記是這樣的基因，它們賦予宿主細胞 抗微生物抗性或代謝優勢以使得含有外源DNA的細胞區別於轉化期間沒有接受任何外源 序列的細胞。「原住選擇標記」是位於待轉化的微生物的染色體上的選擇標記。原住選擇標 記編碼與轉化DNA構建體上的選擇標記不同的基因。選擇標記是本領域技術人員熟知的。 如上文所述，標記優選地是抗微生物抗性標記(例如ampK ；phleoE ；specE ；kanE ；eryE ；tetE ； cmpK 禾口 neoK(見例如 Guerot-Fleury, Gene, 167 :335_337，1995 ；Palmeros 等人，Gene247 255-264，2000和Trieu-Cuot等人，Gene，23 :331_341，1983)。根據本發明有用的其他標記 包括但不限於營養缺陷型標記諸如色氨酸；和檢測標記，諸如半乳糖苷酶。如本文中所用，術語「啟動子」指發揮指導下遊基因轉錄的作用的核酸序列。在優 選的實施方案中，啟動子適於其中表達靶基因的宿主細胞。該啟動子，連同其他轉錄性和翻 譯性調節核酸序列(又稱作「調控序列」)對於表達給定基因是必需的。通常，該轉錄性和 翻譯性調節序列包括但不限於啟動子序列、核糖體結合位點、轉錄起始和終止序列、翻譯起 始和終止序列和增強子或激活子序列。當一種核酸與另一個核酸序列處於功能性關係中時，它是「有效連接的」。例如，如 果表達為參與多肽分泌的前蛋白，則編碼分泌性前導序列(即信號肽)的DNA與編碼多肽 的DNA有效連接；如果啟動子或增強子影響序列的轉錄，則啟動子或增強子與編碼序列有 效連接；或者，如果核糖體結合位點的放置促進翻譯，則核糖體結合位點與編碼序列有效連 接。通常，「有效連接」意指連接的DNA序列是連續的，並且在分泌性前導序列的情況下，是 連續且符合可讀相的(in reading phase) 0然而，增強子不必是連續的。連接通過在便利 的限制性位點處連接而完成。如果此類位點不存在，則根據常規實踐使用合成性寡核苷酸 銜接頭或接頭。如本文中所用，術語「基因」是指這樣的多核苷酸(例如，DNA區段)，該多核苷酸 編碼多肽並包括在編碼區之前和之後的區域，也包括在各個編碼區段(外顯子)之間的間 插序列(內含子)。如本文中所用，「同源基因」指來自不同但通常相關物種的基因對，它們相互對應 並且是彼此同一或極為相似的。該術語包括因物種形成(即新物種發展)而分離的基因 (例如直向同源基因)，以及因遺傳複製而分離的基因(例如旁系同源基因)。如本文中所用，「直向同源物」和「直向同源基因」指不同物種中因物種形成而已經 從共同先祖基因(即同源基因)進化的基因。一般地，直向同源物在進化期間仍保留相同 的功能。直向同源物的鑑定用於新測序基因組中可靠地預測基因功能。
如本文中所用，「旁系同源物」和「旁系同源基因」指因基因組內部複製而相關的基 因。儘管直向同源物在進化期間自始至終保留相同的功能，然而旁系同源物演化出新功能， 即便一些功能往往與初始功能相關。旁系同源基因的例子包括，但不限於編碼胰蛋白酶、糜 蛋白酶、彈性蛋白酶和凝血酶的基因，其中所述酶均為絲氨酸蛋白酶並在相同物種中共同 存在。如本文中所用，「同源性」指序列相似性或同一性，優選同一性。使用本領域已知的 標準技術(見例如 Smith 和 Waterman，Adv. App 1. Math.，2 :482，1981 ；Needleman 和 Wunsch， J. Mol. Biol. ,48 :443，1970 ；Pearson 禾口 Lipman，Proc. Natl. AcacL Sci. USA, 85 :2444，1988 ； 程序諸如 WisconsinGenetics 軟體包 Ge netics Computer Group, Madison, WI 中的 GAP、 BESTFIT、FASTA 和 TFASTA 以及 Devereux 等人，Nuc 1. Acid Res.，12 :387_395，1984]確定 這種同源性。如本文中所用，「類似序列」是這樣一種序列，其中所述基因的功能基本上與基於 解澱粉芽胞桿菌NprE蛋白酶的基因相同。另外，類似基因包括與解澱粉芽胞桿菌NprE蛋 白酶的序列至少約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約 85 %、約90 %、約95 %、約97 %、約98 %、約99 %或約100 %的序列同一性。在額外的實施 方案中，超過一種上述屬性適用於該序列。類似序列通過已知的序列比對方法確定。常見 使用的比對方法是BLAST，儘管如上文及下文所示，存在用於比對序列的其他方法。一個有用算法的實例是PILEUP。使用累進配對比對法，PILEUP從一組相關序 列產生多重序列比對結果。它也可以繪製顯示聚類關係的進化樹，其中所述聚類關係用 來產生該比對結果。PILEUP使用Feng和Doolittle累進比對方法(Feng和Doolittle, J. Mol. Evol. ,35 =351-360,1987)的簡化形式。該方法類似於Higgins和Sharp描述的方法 (Higgins 和 Sharp，CABI0S5 151-153，1989)。有用的 PILEUP 參數包括預設空位權重 3. 00、 預設空位長度權重0. 10和加權末端空位。有用算法的另一個實例是由Altschul等人(Altschul等人，J. Mol. Biol.，215 403-410，1990 和 Karlin 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. , USA，90 :5873_5787，1993)描述的 BLAST算法。一個特別有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(見，Altschul等人，Meth. Enzymol.，266 =460-480,1996)。WU-BLAST-2使用數個搜索參數，其中大部分設置為預設 值。設置具有以下值的可調節參數重疊覆蓋區=1，重疊分數=0. 125，字閾值(T) = 11。 HSP S和HSP S2參數是動態值並且根據具體序列的組成和具體資料庫的組成，由程序自身 建立，其中目的序列針對所述具體資料庫進行檢索。然而，可以調節所述值以提高靈敏度。 八％胺基酸序列同一性值由匹配的相同殘基數除以比對區域中「較長」序列的殘基總數確 定。「較長」序列是比對區域中具有最多實際殘基的序列(忽略由WU-Blast-2導入以使得 比對評分最大化的空位)。因而，「核酸序列同一性百分數(％)」定義為候選序列中與起始序列(即目的 序列)的核苷酸殘基相同的核苷酸殘基百分數。一個優選的方法使用設置成預設參數的 WU-BLAST-2的BLASTN模塊，重疊覆蓋區和重疊分數分別設置成1和0. 125。如本文中所用，術語「雜交」指核酸的一條鏈通過鹼基配對作用與互補鏈結合的過 程，如本領域已知的那樣。如果兩個序列在中至高嚴格雜交和洗滌條件下彼此特異地雜交，則將一個核酸序列視為與一個參考核酸序列「可選擇性雜交」。雜交條件基於核酸結合複合體或探針的解 鏈溫度(Tm)。例如，「最大嚴格性」一般在約Tm-5°C (比探針的Tm低5°C )上出現；「高嚴 格性」在低於該Tm約5-10°C上出現；「中等嚴格性」在低於探針Tm的10_20°C上出現並且 「低嚴格性」在低於該Tm約20-25°C上出現。在功能上，最大嚴格性條件可以用來鑑定與雜 交探針具有嚴格同一性或近乎嚴格同一性的序列；而中等或低嚴格雜交可以用來鑑定或檢 測多核苷酸序列同源物。
中等至高嚴格雜交是本領域熟知的。高嚴格性條件的實例包括在約42°C於50% 甲醯胺，5X SSC，5XDenhardt，s溶液，0.5% SDS和100 μ g/ml變性載體DNA中雜交，隨後 在室溫於2X SSC和0. 5% SDS中洗滌2次並且在42°C於0. 1 X SSC和0. 5% SDS中額外洗 滌2次。中等嚴格條件的例子包括在37°C於包含20%甲醯胺、5XSSC(150mM NaCl、15mM檸 檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH 7. 6) ,5XDenhardt' s溶液、10%硫酸葡聚糖和20mg/ml變性 剪切鮭精DNA的溶液中過夜溫育，隨後在約37-50°C於IXSSC中洗滌濾膜。本領域技術人 員知道如何按照需要調節溫度、離子強度等以適應諸如探針長度等的因素。如本文中所用，「重組體」包括對細胞或載體的稱謂，其中所述的細胞或載體已經 通過導入異源核酸序列被修飾或所述細胞從如此修飾的細胞衍生。因而，例如重組細胞表 達在該細胞的天然(非重組)形式中不以相同形式存在的基因或因人有意幹預而異常表 達、不足表達或根本不表達的天然基因。「重組」、「進行重組」和生成「重組的」核酸一般是 兩個或多個核酸片段的裝配，其中所述裝配產生嵌合基因。在一個優選的實施方案中，使用在至少一個密碼子中的位點飽和誘變法產生突變 DNA序列。在另一個優選的實施方案中，對2個或多個密碼子進行位點飽和誘變。在其他實 施方案中，突變DNA序列與野生型序列具有超過約50 %、超過約55 %、超過約60 %、超過約 65%、超過約70%、超過約75%、超過約80%、超過約85%、超過約90%、超過約於95%或 超過約98%的同源性。在備選實施方案中，使用任意的已知誘變方法例如，諸如輻射、亞硝 基胍等，在體內產生突變DNA。隨後分離期望的DNA序列並用於本文提供的方法中。如本文中所用，術語「靶序列，，指宿主細胞中編碼這樣序列的DNA序列，其中期望 在所述序列處將引入的序列插入宿主細胞基因組。在一些實施方案中，靶序列編碼有功能 的野生型基因或操縱子，而在其他實施方案中，靶序列編碼有功能的突變基因或操縱子，或 無功能的基因或操縱子。如本文中所用，「側翼序列」指位於所討論序列上遊或下遊的任意序列(例如，對 於基因A-B-C，基因B在側翼具有A和C基因序列)。在一個優選的實施方案中，該引入的 序列在每一側具有同源盒。在另一實施方案中，該引入的序列和同源盒包含在每一側具有 填充序列的單元。在一些實施方案中，側翼序列僅在單側(3』或5』)存在，但是在優選的實 施方案中，它在側翼相接的序列的每一側存在。在一些實施方案中，側翼序列僅在單側(3』 或5』 )存在，而在優選的實施方案中，它在側翼相接的序列的每一側存在。如本文中所用，術語「填充序列」指在同源盒側翼的任意額外DNA(—般是載體序 列)。然而，該術語包括任意非同源的DNA序列。不受任何理論限制，填充序列為細胞提供 了非關鍵靶以啟動DNA攝取。如本文中所用，術語「擴增」和「基因擴增」指這樣的過程，其中憑藉該過程不成比 例地複製特異的DNA序列，從而使得擴增的基因以比起初基因組中拷貝數更高的拷貝數存在。在一些實施方案中，通過在藥物(例如可抑制酶的抑制物)存在下生長而選擇細胞(這 導致編碼在該藥物存在下生長所需的基因產物的內源性基因擴增)，或通過擴增編碼這種 基因產物的外源(即輸入)序列或這兩種方式選擇細胞。「擴增」是涉及模板特異性的核酸複製的具體情形。它與非特異性模板複製(即具 有模板依賴性但不依賴於特異性模板的複製)形成對比。模板特異性這裡區別於複製忠實 性(即正確多核苷酸序列的合成)和核苷酸(核糖或脫氧核糖)特異性。 模板特異性往往 以術語「靶」特異性描述。靶序列是在尋求將其與其他核酸相區分開的意義上的「靶」。已 經設計擴增技術主要用於這種區分過程。如本文中所用，術語「共擴增」指將可擴增標記連同其他基因序列(即包含一個或 多個不可選擇性基因，諸如表達載體中所包含的那些基因)導入單個細胞並且施加適宜的 選擇壓力，從而使得該細胞擴增該可擴增標記和其它不可選擇性基因序列。這個可擴增標 記可以與其它基因序列物理地連接，或備選地，可將一個含有可擴增標記以及另一個含有 非選擇標記的兩個獨立DNA片段導入相同的細胞。如本文中所用，術語「可擴增標記」、「可擴增基因」和「擴增載體」指在適宜生長條 件下允許該基因擴增的基因或編碼基因的載體。「模板特異性」在大多數擴增技術中通過酶的選擇實現。擴增酶是在使用這些酶 的條件下僅會處理異質性核酸混合物中特定核酸序列的酶。例如在Q3複製酶的情況下， MDV-I RNA是該複製酶的特異性模板(見例如Kacian等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69 3038,1972)並且其他核酸不被這種擴增酶複製。類似地，在T7RNA聚合酶的情況下，這種 擴增酶具有對其自身啟動子的嚴格特異性(見Chamberlin等人，Nature 228 ,221,1970)。 在T4DNA連接酶的情況下，該酶不會連接其中寡核苷酸或多核苷酸底物與模板之間在連接 接合處存在錯配的兩個寡核苷酸或多核苷酸(見Wu和Wallace，Genomics 4 :560，1989)。 最後，由於Taq和Pfu聚合酶在高溫下發揮作用的能力，發現它們針對由弓丨物結合併且因而 限定的序列表現高度特異性；所述高溫產生促進引物與靶序列雜交而不與非靶序列雜交的 熱動力條件。如本文中所用，術語「可擴增的核酸」指可以由任意擴增方法擴增的核酸。考慮了 「可擴增的核酸」通常包含「樣品模板」。如本文中所用，術語「樣品模板」指源自樣品的核酸，其中對所述樣品分析「靶」(下 文定義的)的存在。相反，「背景模板」用來指代樣品模板之外的核酸，它可能存在或可能不 存在於樣品中。背景模板最經常地是偶然存在的。它可以是夾帶的結果，或它可以因試圖 從樣品中純化去除的核酸雜質的存在所致。例如，來自待檢測生物之外的生物的核酸可以 作為背景存在於試樣中。如本文中所用，術語「引物」指這樣的寡核苷酸，無論天然存在(如在純化的限制 性消化產物中)或合成地產生，其中當將所述寡核苷酸置於誘導互補於一條核酸鏈的引物 延伸產物合成的條件(即存在核苷酸和誘導劑(諸如DNA聚合酶)和在適宜的溫度和pH 上)下時，其能夠充當合成的起始點。為了擴增中的最大效率，引物優選地是單鏈的，但可 以備選地為雙鏈。若為雙鏈，首先處理該引物以在使用其製備延伸產物前分開其鏈。優選 地，該引物是寡脫氧核糖核苷酸。引物必須足夠長以在誘導劑存在下引發延伸產物合成。引 物的確切長度將取決於眾多因素，這包括溫度、引物來源和所用的方法。
如本文中所用，術語「探針」指能夠與另一種目的寡核苷酸雜交的寡核苷酸(即核 苷酸序列)，無論它是天然存在的(如在純化的限制性消化產物中)或合成地、重組地或由 PCR擴增產生。探針可以是單鏈的或雙鏈的。探針用於檢測、鑑定和分離特定的基因序列。 考慮了在本發明中使用的任意探針將以任何「報告分子」標記，從而使得其可在任意檢測系 統中檢測，所述檢測系統包括，但不限於酶(例如ELISA以及基於酶的組織化學測定法)、熒 光、放射性和化學發光系統。不意圖將本發明限於任何具體檢測系統或標記物。 如本文中所用，當談及聚合酶鏈反應時，術語「靶」指由用於聚合酶鏈反應的引物 限定的核酸區域。因而，試圖將「靶」與其他核酸序列區別開。「區段」定義為靶序列內部的 核酸區域。如本文中所用，術語「聚合酶鏈反應」(「PCR」)指美國專利號4，683，195、 4，683，202和4，965，188 (其在此引入作為參考)的方法，所述方法包括用於在不進行克隆 或純化的情況下提高基因組DNA混合物中靶序列區段的濃度的方法。這一用於擴增靶序列 的方法由以下步驟組成將大量過量的兩種寡核苷酸引物引入到含有期望靶序列的DNA混 合物中，隨後在DNA聚合酶的存在下進行精確的熱循環順序。兩個引物與雙鏈靶序列中它 們各自的鏈互補。為實現擴增，變性該混合物並然後使引物退火至靶分子中它們的互補鏈。 退火後，應用聚合酶延伸引物，從而形成新的互補鏈對。可以多次重複變性、引物退火和聚 合酶延伸的步驟(即，變性、退火和延伸組成一個「循環」；可以有許多個「循環」)，以獲得期 望靶序列的高濃度擴增區段。期望靶序列擴增區段的長度由引物相對於彼此之間的相對位 置決定，並且因此這一長度是可控制的參數。由於該過程的重複方面，將該方法稱為「聚合 酶鏈式反應」(此後稱為「PCR」)。因為期望擴增的靶序列區段在該混合物中變成優勢序列 (就濃度而言)，所以稱它們是「PCR擴增」的。如本文中所用，術語「擴增試劑」指除引物、核酸模板和擴增酶之外的為擴增所需 的那些試劑(脫氧核糖核苷酸三磷酸、緩衝液等)。一般，將擴增試劑連同其他反應組分置 於並納入反應容器(試管、微孔等)中。採用PCR，有可能將基因組DNA中單拷貝的特異性靶序列擴增至通過幾種不同方 法(例如與標記探針雜交；摻入生物素化引物，隨後進行抗生物素蛋白_酶綴合物檢測；摻 入32P-標記的脫氧核苷酸三磷酸諸如dCTP或dATP至擴增的區段)可檢測的水平。除基因 組DNA之外，還可以用適宜的成套引物分子擴增任意的寡核苷酸或多核苷酸序列。特別地， 由PCR過程自身產生的擴增區段本身是後繼PCR擴增的高效模板。如本文中所用，術語「PCR產物」、「PCR片段」和「擴增產物」指兩輪或多輪變性、退 火和延伸的PCR步驟結束後所得的化合物混合物。這些術語包括其中已經擴增一個或多個 序列的一個或多個區段的情況。如本文中所用，術語「RT-PCR」指RNA序列的複製和擴增。在這個方法中，逆轉錄偶 聯於PCR，最經常地使用其中使用熱穩定性聚合酶的單一酶方法，如美國專利號5，322，770 中所述，所述專利在此引入本文作為參考。在RT-PCR中，RNA模板因聚合酶的逆轉錄酶活 性轉換成cDNA，並隨後使用聚合酶的聚合活性(即如同其他PCR方法中那樣)進行擴增。如本文中所用，術語「限制性核酸內切酶」和「限制性酶」指細菌酶，其每一個都在 特定核苷酸序列處或其附近切割雙鏈DNA。「限制性位點，，指由給定的限制性核酸內切酶識別和切割的核苷酸序列，並且其往往是用於插入DNA片段的位點。在本發明的某些實施方案中，將限制性位點改造入選擇標 記中和改造入DNA構建體的5，和3，末端。如本文中所用，術語「染色體整合」指引入的序列籍此導入宿主細胞染色體的過 程。轉化DNA的同源區域與染色體的同源區域整列。隨後，同源盒之間的序列在雙交換中 由引入的序列替換(即同源重組)。在本發明的一些實施方案中，DNA構建體的失活性染色 體區段的同源部分與芽孢桿菌染色體的固有染色體區域的側翼同源區整列。隨後，所述固 有染色體區域在雙交換中由該DNA構建體缺失(即同源重 組)。「同源重組」意指兩個DNA分子或配對染色體之間在同一或幾乎同一的核苷酸序列 位點處交換DNA片段。在一個優選的實施方案中，染色體整合是同源重組。如本文中所用的「同源序列，，意指為比較而最佳比對時，與另一個核酸或多肽序 列具有約100%、約99%、約98%、約97%、約96%、約95%、約94%、約93%、約92%、約 91 %、約90 %、約88 %、約85 %、約80 %、約75 %或約70 %序列同一性的核酸或多肽序列。 在一些實施方案中，同源序列具有約85%至約100%的序列同一性，而在其他實施方案中， 存在約90%至約100%的序列同一性，並且在更優選的實施方案中，存在約95%至約100% 的序列同一性。如本文中所用，「胺基酸」指肽或蛋白質序列或其部分。術語「蛋白質」、「肽」和「多 肽」可互換地使用。如本文中所用，術語「異源蛋白，，指不天然存在於宿主細胞中的蛋白質或多肽。異 源蛋白的實例包括酶，諸如水解酶，包括蛋白酶。在一些實施方案中，編碼蛋白質的基因是 天然存在的基因，而在其他實施方案中，使用突變基因和/或合成基因。如本文中所用，「同源蛋白」指細胞中本來或天然存在的蛋白質或多肽。在優選 的實施方案中，所述細胞是革蘭氏陽性細胞，而在特別優選的實施方案中，該細胞是芽孢杆 菌屬宿主細胞。在備選的實施方案中，同源蛋白是由其他生物產生的天然蛋白，所述其他 生物包括但不限於大腸桿菌、鏈黴菌屬(Str印tomyces)、木黴屬(Trichoderma)和麴黴屬 (Aspergillus)生物。本發明包括憑藉重組DNA技術產生同源蛋白的宿主細胞。如本文中所用，「操縱子區」包含作為單一轉錄單元從共同啟動子轉錄並因而經歷 共調節作用的一組連續基因。在一些實施方案中，操縱子包括調節基因。在最優選的實施 方案中，使用這樣的操縱子，其中該操縱子高度表達，如由RNA水平所測量的那樣，但具有 未知或不需要的功能。如本文中所用、「抗微生物區域」是含有編碼抗微生物蛋白的至少一個基因的區 域。如果某多核苷酸在其天然狀態下或由本領域技術人員已知的方法操作時，可以被 轉錄和/或翻譯以產生RNA、多肽或其片段，則稱該多核苷酸「編碼」 RNA或多肽。還稱此類 核酸的反義鏈編碼了該序列。如本領域已知，DNA可以被RNA聚合酶轉錄以產生RNA，但是RNA可以被逆轉錄酶 逆轉錄以產生DNA。因而DNA可以編碼RNA並且反之亦然。術語「調節區段」或「調節序列」或「表達調控序列」指DNA的多核苷酸序列，其中 所述多核苷酸序列與編碼多肽鏈的胺基酸序列的DNA的多核苷酸序列有效連接以實現所 編碼胺基酸序列的表達。調節序列可以抑制、阻遏或促進有效連接的編碼胺基酸的多核苷酸序列表達。「宿主株」或「宿主細胞」指對於包含本發明DNA的表達載體適合的宿主。 如果一種酶在所述細胞中以比相應野生型細胞中表達此酶的水平更高的水平表 達，則該酶在宿主細胞中「過量表達」。術語「蛋白質」和「多肽」在本文可互換地使用。在本公開內容中通篇使用如按照 IUPAC-IUB生物化學命名聯合委員會(JCBN)定義的胺基酸3字母代碼。也應當理解，由於 遺傳密碼子的簡併性，多肽可以由多於一個核苷酸序列編碼。「前序列(prosequence) 」是在信號序列與成熟蛋白酶之間對於該蛋白酶分泌為必 需的胺基酸序列。該前序列的切割會產生成熟的活性蛋白酶。術語「信號序列」或「信號肽」指參與成熟或前體形式的蛋白質分泌的任意核苷酸 序列和/或胺基酸序列。信號序列的這個定義是一個功能性定義，意指包括由該蛋白質基 因的N端部分編碼的、參與實現蛋白質分泌的全部那些胺基酸序列。它們通常但並非普遍 地與蛋白質的N端部分或與前體蛋白的N端部分結合。信號序列可以是內源或外源的。信 號序列可以是通常與該蛋白質(例如蛋白酶)連接的信號序列，或可以來自編碼另一種分 泌性蛋白的基因。一個示例性外源信號序列包含來自枯草芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶信號序 列的頭7個胺基酸殘基，所述的胺基酸殘基與來自緩慢芽孢桿菌(ATCC 21536)的枯草桿菌 蛋白酶的信號序列的剩餘部分融合。術語「雜合信號序列」指其中部分序列從表達宿主獲得的與待表達基因的信號序 列融合的信號序列。在一些實施方案中，使用合成性序列。術語「成熟」形式的蛋白質或肽指該蛋白質或肽的最終功能性形式，例如，成熟形 式的本發明NprE蛋白酶至少包括SEQ ID NO 3的胺基酸序列。術語「前體」形式的蛋白質或肽指這樣的成熟形式蛋白質，其具有與該蛋白質的氨 基端或羧基端有效連接的前序列。該前體也可以具有與該前序列的氨基端有效連接的「信 號」序列。該前體還可以具有參與翻譯後活性的額外多核苷酸(例如從中被切除以留下成 熟形式蛋白質或肽的多核苷酸)。「天然存在的酶」指具有與在自然界中發現的胺基酸序列同一的未修飾胺基酸序 列的酶。天然存在的酶包括天然酶，即天然表達的或在特定微生物中發現的那些酶。術語「從......衍生」和「從......獲得」不僅指由所討論生物的菌株產生或可
產生蛋白酶，還指由分離自此菌株的DNA序列編碼和在含有此DNA序列的宿主生物中產生 的蛋白酶。另外，該術語指由合成來源和/或cDNA來源的DNA序列編碼並且具有所討論蛋 白酶的鑑別特徵的蛋白酶。例如，「從芽孢桿菌屬物種衍生的蛋白酶」指那些具有蛋白水解 活性的、由芽孢桿菌屬物種天然產生的酶，以及還指類似於由芽孢桿菌屬物種來源產生的 那些、但通過應用基因工程技術由轉化有編碼所述中性金屬蛋白酶的核酸的非解澱粉芽胞 桿菌生物產生的中性金屬蛋白酶。「衍生物」在該定義的範圍內通常仍使在野生型、天然或親代形式中觀察到的特徵 性蛋白酶解活性保留至這樣的程度，即該衍生物用於與野生型、天然或親代形式相似的目 的。中性金屬蛋白酶的功能性衍生物包括具有本發明中性金屬蛋白酶一般特徵的天然存在 的、合成或重組產生的肽或肽片段。術語「功能性衍生物」指具有編碼中性金屬蛋白酶的核酸的功能特徵的核酸的衍生物。編碼本發明中性金屬蛋白酶的核酸的功能性衍生物包括天然存在的、合成或重組產 生的核酸或片段，並且編碼本發明的中性金屬蛋白酶特徵。基於本領域已知的遺傳密碼子 簡併性，編碼本發明中性金屬蛋白酶的野生型核酸包括天然存在的等位基因和同源物。在兩個核酸序列或多肽序列的上下文中的術語「同一的」指這兩個序列中為了最 大對應性而比對時是相同的殘基，其中所述最大對應性如使用以下序列比較或分析算法之 一測量的那樣。 術語「最佳比對」指產生最高同一性百分數評分的比對。「序列同一性百分數」、「胺基酸序列同一性百分數」、「基因序列同一性百分數」和/ 或「核酸/多核苷酸序列同一性百分數」就兩個胺基酸序列、多核苷酸序列和/或基因序列 (如適宜的話)而言，指當最佳比對所述序列時這兩個序列中相同的殘基的百分數。因而， 「80%胺基酸序列同一性」意指這兩個最佳比對的多肽序列中的80%胺基酸是同一的。短語「基本上同一的」在兩個核酸或多肽的上下文中因而指這樣的多核苷酸或多 肽，其中當使用程序或算法(例如81^1^1^10^140，使用標準參數，與參考序列相比 時，所述多核苷酸或多肽包含至少約70%序列同一性、優選至少約75%、優選至少約80%、 優選至少約85 %、優選至少約90 %、優選至少約95 %、優選至少約97 %、優選至少約98 %並 且優選至少約99%序列同一性。兩個多肽基本上同一的一個指示是第一多肽與第二多肽發 生免疫學交叉反應。一般地，因保守性胺基酸替換而不同的多肽是免疫學交叉反應的。因 此，例如，當兩個肽僅因保守性替換而不同時，一個多肽與第二多肽基本上同一。兩個核酸 序列基本上同一的另一個指示是這兩個分子在嚴格條件(例如在中等至高嚴格性範圍內) 下相互雜交。術語「分離的」或「純化的」指從其初始環境(例如天然環境，如果它是天然存在的 話)中取出的物質。例如，當該物質在特定組合物中以高於或低於天然存在生物或野生型 生物中的濃度存在或與從天然存在生物或野生型生物表達時通常不存在的組分聯合存在 時，稱該物質是「純化」的。例如，在活的動物中存在的天然存在多核苷酸或多肽不是分離 的，然而與該天然系統中一些或全部共存物質分開的該相同多核苷酸或多肽是分離的。此 類多核苷酸可以是載體的一部分和/或此類多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，並且 仍是分離的，因為這種載體或組合物不是其天然環境的一部分。在優選的實施方案中，例如 如果核酸或蛋白質在電泳凝膠或印跡中產生基本上一條帶，則稱它是純化的。當談及DNA序列使用時，術語「分離的，，指這樣的DNA序列，其中所述DNA序列已 經從天然遺傳環境中移除並且因而不含有其他外部或不想要的編碼序列，並且處於適合在 基因工程蛋白質生產系統中使用的形式。此類分離的分子是與其天然環境分開的那些分子 並且包括cDNA和基因組克隆。本發明的分離的DNA分子不含有通常與之連接的其他基因， 但可以包含天然存在的5』和3』非翻譯區，諸如啟動子和終止子。鑑定相關的區域對本領 域普通技術人員將是顯而易見的(見例如Dynan和Tijan，Nature316 =774-78,1985)。術 語「分離的DNA序列」備選地稱作「克隆的DNA序列」。當談及蛋白質使用時，術語「分離的」指在其天然環境之外的條件下存在的蛋白 質。在一個優選的形式中，分離的蛋白質基本上不含其他蛋白質，尤其其他同源蛋白。分離 的蛋白質具有超過約10%的純度、優選超過約20%的純度並且甚至更優選超過約30%的 純度，如SDS-PAGE所確定的那樣。本發明的其他方面包括高度純化形式(即超過約40%純度、超過約60%純度、超過約80%純度、超過約90%純度、超過約95%純度、超過約97%純 度並且甚至超過約99%純度)的蛋白質，如SDS-PAGE所確定的那樣。可應用以下盒式誘變法以幫助構建本發明的酶變體，儘管也可以使用其它方法。 首先，如本文所述，獲得編碼該酶的天然存在的基因並且全部或部分測序。然後，掃描該序 列以獲得這樣的位置，即在該位置上期望製造所編碼的酶的一個或多個胺基酸的突變(缺 失、插入或替換)。評估這一位置兩側的序列中限制性位點的存在，用於用寡核苷酸庫替換 該基因的短區段，其中當表達所述寡核苷酸庫時，其將 編碼變體突變。此類限制性位點優選 是該蛋白基因中獨特的位點，以易於置換該基因區段。然而，不在該酶基因中過度冗餘的任 何常規限制性位點都可以使用，只要由限制性消化產生的基因片段可以以適當的順序再組 裝。如果在離所選擇的位點方便的距離之內(10至15個核苷酸)的位置上不存在限制性 位點的話，通過在該基因中替換鹼基產生此類位點，其中以如下所述方式進行所述替換，即 所示方式使得最終的構建體中既沒有改變閱讀框，也沒有改變其編碼的胺基酸。根據本領 域公知的方法，通過M13引物延伸完成基因突變，以將其序列改變為與期望的序列一致。通 過遺傳密碼子的簡併性、基因的限制性酶圖譜以及大量不同的限制性酶按常規地完成定位 合適的側翼區段以及評估所需改變的任務，以得到兩個適當的限制性序列。注意到如果可 利用合適的側翼限制性位點的話，僅需與不含有位點的側翼區段相關地應用上述方法。一旦克隆了天然存在的DNA和/或合成的DNA，則用相關的限制性酶消化待突變位 置側翼的限制性位點，並將複數個末端互補的寡核苷酸盒與該基因連接。這一方法簡化了 誘變，因為可以合成所有的這些寡核苷酸以具有相同的限制性位點，並且不需要合成的接 頭以產生限制性位點。如本文所用，「相應於」指在蛋白質或多肽中所列舉出的位置上的殘基，或與在蛋 白質或多肽中所列舉出的殘基類似、同源或等價的殘基。如本文所用，「相應區域」 一般指沿著蛋白質或親本蛋白質相關的類似位置。如本文中所用，術語「組合誘變法」指其中產生起始序列的變體文庫的方法。在 這些文庫中，所述變體含有選自預定義突變集合的一個或幾個突變。此外，所述方法提供 了導入隨機突變的手段，其中所述隨機突變不是預定義突變集合的成員。在一些實施方案 中，所述方法包括在2000年10月26日提交的美國專利申請號09/699，250(其在此引入作 為參考)中描述的那些方法。在備選的實施方案中，組合誘變方法包括市售試劑盒(例如 QUIKCHANGE Multisite, Stratagene, San Diego, CA)。如本文中所用，術語「突變體文庫」指絕大部分基因組相同但包括一個或多個基因 的不同同源物的細胞群體。此類文庫可以用來例如鑑定具有改良性狀的基因或操縱子。如本文中所用，術語「起始基因」和「親本基因」指編碼目的蛋白的目的基因，其中 所述的目的蛋白待使用本發明進行改良和/或改變。如本文中所用，術語「多重序列比對」和「MSA」指使用算法(例如Clustal W)進 行比對的一個起始基因的多個同源物的序列。如本文中所用，術語「共有序列，，和「規範序列，，指具體目的蛋白質或目的序列的 全部變體與之進行比較的原型胺基酸序列。該術語也指顯示目的DNA序列中最經常存在的 核苷酸的序列。對於基因的每個位置，共有序列給出在MSA中該位置內最多見的胺基酸。如本文中所用，術語「共有突變」指起始基因序列和共有序列中的差異。共有突變通過比較起始基因的序列和從MSA獲得的共有序列進行鑑定。在一些實施方案中，將共有 突變導入起始基因，從而使得起始基因變得與共有序列更相似。共有突變也包括將起始基 因中的胺基酸改變成下述胺基酸的胺基酸變化，其中所述胺基酸相對於起始基因中該氨基 酸的頻率更頻繁地在該位置處出現於MSA中。因而，術語共有突變包含用比MSA中胺基酸 更豐富的胺基酸替換起始基因中胺基酸的全部單一胺基酸改變 。術語「修飾的序列」和「修飾的基因」在本文中可互換地用來指包括天然存在的核 酸序列中的缺失、插入或間斷的序列。在一些優選的實施方案中，修飾序列的表達產物是截 短的蛋白質(例如如果所述修飾是序列缺失或間斷的話)。在一些特別優選的實施方案中， 這種截短的蛋白質仍保留生物學活性。在備選的實施方案中，修飾序列的表達產物是延長 的蛋白質(例如，包含向核酸序列中插入的修飾)。在一些實施方案中，插入產生截短的蛋 白質(例如當該插入導致終止密碼子形成時)。因而，插入可以產生截短的蛋白質或延長的 蛋白質作為表達產物。如本文中所用，術語「突變序列」和「突變基因」可互換地使用並且指具有在宿主細 胞的野生型序列中出現的在至少一個密碼子中的改變的序列。該突變序列的表達產物是相 對於野生型具有已改變胺基酸序列的蛋白質。該表達產物可以具有改變的功能性能力(例 如增強的酶活性)。「誘變引物」或「誘變寡核苷酸」(在本文中可互換地使用)意圖指對應於模板序 列的一部分並能夠與之雜交的寡核苷酸組合物。就誘變引物而言，該引物不會精確地匹配 模板核酸，該引物中的一個錯配或多個錯配用於導入期望的突變至核酸文庫中。如本文中 所用，「非誘變引物」或「非誘變寡核苷酸」指與模板核酸精確匹配的寡核苷酸組合物。在本 發明的一個實施方案中，僅使用誘變引物。在本發明的另一個優選實施方案中，如此設計引 物從而使得其中已經包括誘變引物的至少一個區域，也存在包含於寡核苷酸混合物中的非 誘變引物。通過添加誘變引物和與所述誘變引物至少之一相對應的非誘變引物的混合物， 有可能產生其中提供了多種組合突變模式的結果核酸文庫。例如，如果期望突變核酸文庫 的一些成員仍在某些位置處保留其親代序列而其他成員在此類位點處突變，則所述非誘變 弓丨物提供了在該核酸文庫內部針對給定殘基獲得特定水平非突變成員的能力。本發明的方 法使用一般具有10-50個鹼基長度、更優選約15-45個鹼基長度的誘變和非誘變寡核苷酸。 然而，可能需要使用比10鹼基更短或比50鹼基更長的引物以獲得期望的誘變結果。就相 應的誘變和非誘變引物而言，不需要相應的寡核苷酸具有相同的長度，但僅需要在對應於 待添加突變的區域中存在重疊。可以以根據本發明的預定比率添加引物。例如，如果期望所得文庫在相同或不同 位點處具有顯著水平的某種特定突變和較少量的不同突變，則通過調整添加的引物數量， 有可能產生期望的偏態文庫。備選地，通過添加更少或更多數量的非誘變引物，有可能調節 突變核酸文庫中產生相應突變的頻率。術語「野生型序列」或「野生型基因」在本文中可互換地用來指宿主細胞中本來或 天然存在的序列。在一些實施方案中，野生型序列指作為蛋白質工程項目起點的目的序列。 該野生型序列可以編碼同源或異源蛋白。同源蛋白是宿主細胞在無幹預下產生的蛋白質。 異源蛋白是宿主細胞本不會產生但因幹預而產生的蛋白質。術語「氧化穩定的」指在本發明的蛋白酶解、水解、清潔或其他過程期間佔優勢的條件下，例如當暴露於或與漂白劑或氧化劑接觸時，經過給定時間段後仍保留特定量酶活 性的本發明蛋白酶。在一些實施方案中，與漂白劑或氧化劑接觸後經過給定時間段，例如至 少1分鐘、3分鐘、5分鐘、8分鐘、12分鐘、16分鐘、20分鐘等之後，所述蛋白酶仍保留至少 約 50%、約 60%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 92%、約 95%、約 96%、約 97%、約98%或約99%的蛋白酶解活性。術語「螯合劑穩定的，，指在本發明的蛋白酶解、水解、清潔或其他過程期間佔優勢 的條件下，例如當暴露於或與螯合劑接觸時，經過給定時間段後仍保留特定量酶活性的本 發明蛋白酶。在一些實施方案中，與螯合劑接觸後經過給定時間段，例如至 少10分鐘、20分 鍾、40分鐘、60分鐘、100分鐘等之後，所述蛋白酶仍保留至少約50%、約60%、約70%、約 75%、約80%、約85%、約90%、約92%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%的蛋白 酶解活性。術語「熱穩定的」和「熱穩定性」指在暴露於確定的溫度後，在本發明的蛋白酶解、 水解、清潔或其他過程期間佔優勢的條件下，例如當暴露於改變的溫度時，經過給定時間段 後仍保留特定量酶活性的本發明蛋白酶。改變的溫度包括提高或降低的溫度。在一些實施 方案中，在暴露於改變的溫度後經過給定時間段，例如至少60分鐘、120分鐘、180分鐘、240 分鐘、300分鐘等之後，所述蛋白酶仍保留至少約50 %、約60 %、約70 %、約75 %、約80 %、 約85%、約90%、約92%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%蛋白酶解活性。如本文所用，術語「化學穩定性」是指蛋白質(例如，酶)針對對其活性有不利影響 的化學物質的穩定性。在一些實施方案中，此類化學物質包括但不限於過氧化氫、高酸、陰 離子去汙劑、陽離子去汙劑、非離子去汙劑、螯合試劑等。然而，不打算將本發明限於任何具 體的化學穩定性水平，也不限於化學穩定性的範圍。具體地，術語「去汙劑穩定的」和「LAS 穩定的」是指在本發明的蛋白酶解、水解、清潔或其他過程期間佔優勢的條件下，暴露於去 汙劑組合物給定時間段後仍保留特定量酶活性的本發明蛋白酶。在一些實施方案中，在暴 露於去汙劑經過給定時間段，例如至少60分鐘、120分鐘、180分鐘、240分鐘、300分鐘等之 後，所述蛋白酶仍保留至少約50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約 92%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%蛋白酶解活性。術語「增強的穩定性」在氧化作用、螯合劑、熱和/或pH穩定的蛋白酶的上下文中 指隨時間流逝，與其它中性金屬蛋白酶和/或野生型酶相比保留的更高的蛋白酶解活性。術語「削減的穩定性」在氧化作用、螯合劑、熱和/或pH穩定的蛋白酶的上下文中 指隨時間流逝，與其它中性金屬蛋白酶和/或野生型酶相比保留的更低的蛋白酶解活性。如本文中所用，除非另外指出，術語「清潔組合物」包括顆粒形式或粉末形式的 通用或「重役(heavy-duty)」洗滌劑，尤其是清潔洗滌劑；液體劑、凝膠劑或糊劑形式的 通用洗滌劑，尤其所謂重役液體型洗滌劑；液體精細_織物洗滌劑；盤碟手洗洗滌劑或輕 垢盤碟洗滌劑，尤其那些泡沫豐富類型的盤碟洗滌劑；盤碟機洗洗滌劑，包括居家和機構 用途的多種片狀、顆粒、液體和漂洗輔助型盤碟機洗洗滌劑；液體清潔與消毒劑，包括抗菌 性洗手液型、清潔棒、漱口液、口腔清潔劑、轎車或毛毯香波、浴室清潔劑；發用香波和洗髮 劑；沐浴凝膠和泡沫浴清潔劑和金屬清潔劑；以及清潔助劑，諸如漂白添加劑和「粘汙漬劑 (stain-stick) 」、預處理類型添加劑。除非另外說明，全部組分或組合物水平指均就該組分或組合物的有效水平而言，並且不包括雜質，例如可能存在於市售來源中的殘餘溶劑或副產物。
酶組分重量基於總活性蛋白質。全部百分數和比率由重量計算，除非另外說明。基 於總組成計算所有百分數和比率，除非另外說明。術語「清潔活性」指由所述蛋白酶在本發明的蛋白酶解、水解、清潔或其他過程期 間佔優勢的條件下實現的清潔性能。在一些實施方案中，清潔性能通過應用涉及酶敏感性 汙漬例如草、血液、乳或卵蛋白的多種測定法確定，如在所述汙漬經歷標準洗滌條件作用 後，通過多種色譜、分光光度或其他定量方法學所確定的那樣。示例性測定法包括，但不限 於W099/34011和美國專利號6，605，458(兩個均在此引入作為參考)中描述的那些測定法 以及實施例中所包括的那些方法。術語蛋白酶的「清潔有效量」指本文中前述的蛋白酶量，所述的蛋白酶量在特定清 潔組合物中實現期望的酶活性水平。此類有效量由本領域技術人員輕易地確定並且基於許 多因素，諸如所用的具體蛋白酶、清潔用途、該清潔組合物的具體組成和是否需要液態或幹 態(例如顆粒狀、棒狀)組合物等。如本文中所用的術語「清潔輔助物質」意指為所期望的清潔組合物的特定類型或 產品形式(例如液體劑、顆粒劑、粉劑、棒劑、糊劑、噴撒劑、片劑、凝膠劑或泡沫劑組合物) 所選擇的任何液體、固體或氣態物質，所述物質也優選地與該組合物中使用的蛋白酶相容。 在一些實施方案中，顆粒劑組合物是「密實」形式，而在其他實施方案中，液體劑組合物是 「濃縮」形式。如本文中所用，「低洗滌劑濃度」系統包括其中小於約SOOppm洗滌劑組分存在於洗 滌水中的洗滌劑。一般認為日本洗滌劑是低洗滌劑濃度系統，因為它們通常具有存在於洗 滌水中的大約667ppm洗滌劑組分。如本文中所用，「中等洗滌劑濃度」系統包括其中約SOOppm至約2000ppm洗滌劑組 分存在於洗滌水中的洗滌劑。通常認為北美洗滌劑是中等洗滌劑濃度系統，因為它們通常 具有存在於洗滌水中的大約975ppm洗滌劑組分。巴西洗滌劑一般具有存在於洗滌水中的 大約1500ppm洗滌劑組分。如本文中所用，「高洗滌劑濃度」系統包括大於約2000ppm洗滌劑組分存在於洗滌 水中的洗滌劑。通常認為歐洲洗滌劑是高洗滌劑濃度系統，因為它們通常具有洗滌水中大 約3000-8000ppm的洗滌劑組分。如本文中所用，「織物清潔組合物」包括手工和機器衣物洗滌劑組合物，其包括衣 物添加組合物和適用於浸泡和/或預處理汙漬織物(例如衣物、亞麻布和其他紡織材料) 的組合物。如本文中所用，「非織物清潔組合物」包括非紡織物(即織物)表面清潔組合物，其 包括但不限於洗滌餐具的洗滌劑組合物、口腔清潔組合物、義齒清潔組合物和個人清潔組 合物。本文中清潔組合物的「密實」形式最好由密度反映，並且就組合物而言，由無機填 充鹽的量反映。無機填充鹽是粉末形式的洗滌劑組合物常規成分。在常規洗滌劑組合物中， 填充鹽以相當大的量存在，一般佔總組合物重量的17-35%。相反，在密實組合物中，填充鹽 以不超過總組合物15%的量存在。在一些實施方案中，填充鹽以不超過組合物重量10%、 更優選5%的量存在。在一些實施方案中，無機填充鹽選自硫酸鹼金屬鹽和鹼土金屬鹽以及氯化鹼金屬鹽和鹼土金屬鹽。優選的填充鹽是硫酸鈉。發明詳述中性金屬內肽酶(S卩，中性金屬蛋白酶)(EC 3.4.24.4)屬於絕對需要鋅離子用於 催化 活性的蛋白酶類。這些酶在中性PH及在30至40kDa大小範圍內具最佳活性。中性金 屬蛋白酶結合2至4個鈣離子，所述鈣離子有助於該蛋白的結構穩定性。在金屬蛋白酶活 性部位結合的金屬離子是關鍵特點，其允許水分子的活化。該水分子隨後作為親核試劑起 作用並且切割肽鍵的羰基。中性鋅結合金屬蛋白酶家族包括細菌酶嗜熱菌蛋白酶、和類嗜熱菌蛋白酶 (「TLPs」)，以及羧肽酶A(消化酶)，以及催化參與組織重建和降解的反應的基質金屬蛋 白酶。就穩定性和功能而言，這些蛋白酶中僅有的最佳表徵的是嗜熱菌蛋白酶及其變體 (TLP) 0實際上，許多研究集中於工程化枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)中性金屬蛋 白酶，以增加這些酶的熱穩定性(例如，參見Vriend等，在Tweel等(編輯)的Stability and Stabilization ofEnzymes 一書中，Elsevier, pp. 93-99[1993])。大多數努力集中於通過改變可阻止局部解摺疊過程的結構決定因素(通過分子 建模確定)來增加蛋白酶的穩定性，所述的局部解摺疊過程將導致蛋白質的自溶以及在高 溫下導致該中性蛋白酶變性。(例如，參見van denBurg等，在Hopsu-Havu等，(編輯)， Proteolysis in Cell FunctionsManipulatinR the Autolvtic Pathway of a Bacillus Protease. Biomedical andHealth Research,卷 13, IOS Press [1997]p.576.)。本文中提供了用於改造具有改良特性的中性金屬蛋白酶的組合物和方法。如本文 所述，已報導鈣離子能夠幫助阻止其它蛋白酶(諸如嗜熱菌蛋白酶)自溶。已通過添加鈣 穩定了嗜熱脂肪芽孢桿菌(B. stearothermophiIus)中性蛋白酶對抗自溶和蛋白酶解降解 (參見 DUrrschmidt 等，FEBS J.，272 1523-1534 [2005])。實際上，本發明提供了適於改造不依賴鈣來維持其結構穩定性的中性金屬蛋白酶 的組合物和方法。在一些實施方案中，改造防止了特定二級結構元件中的局部解摺疊，其可 能可防止蛋白水解。天然和經改造的蛋白酶(諸如枯草桿菌蛋白酶)通常在枯草芽孢桿菌中表達，並 且數種所述蛋白酶已應用於洗滌劑組合物中，用於移除蛋白質汙漬。其它例如已用於烘烤 業(例如，來自熱溶蛋白芽孢桿菌(Bacillusthermoproteolyticus)的嗜熱菌蛋白酶，例如 參見 Galante 和 Formantici，Curr. Organic Chem.，7，1399-1422 [2003])。一般地，絲氨酸 蛋白酶已更廣泛地應用於洗滌劑中，至少部分是因為這些蛋白酶相對容易穩定。實際上，由於許多原因，金屬蛋白酶更少用於工業，尤其是更少用於洗滌劑工業。 這些酶涉及更複雜的蛋白質系統，因為這些酶的穩定和功能分別絕對地需要鈣離子和鋅離 子。此外，洗滌劑溶液以及用於洗衣過程的水往往含有通常幹擾該酶與所述離子結合、或螯 合這些離子的組分，導致蛋白酶蛋白水解功能的降低或喪失以及使蛋白酶不穩定。如在本發明的開發期間所確定的那樣，NprE在檸檬酸鹽的存在下的自溶模式可通
過等式表示 其中N是天然形式，I表示部分摺疊的中間體，以及Ap是自溶的蛋白酶。對於NprE而言，檸檬酸鹽最可能通過移除鈣離子使蛋白結構不穩定，所述鈣離子的移除產生部分解 摺疊的中間體(I)狀態，使得環和表面殘基易於自溶。自溶蛋白片段的產生將是快速的並 且是高序的。在這些區域中或鄰近這些區域的穩定化替換產生不那麼易於自溶的NprE變 體。變體的模式與野生型的模式最可能類似，但是自溶蛋白(Ap)的產生實質性地減緩了。在 檸檬酸鹽存在或不存在下的熱解摺疊是強調表示活性和完整變體在檸檬酸鹽的情況下具 有摺疊結構的關鍵。這一數據表明對檸檬酸鹽穩定的替換最可能增加了鈣-脅迫的蛋白質 的穩定性，因為所發現的突變中沒有一個直接參與鈣結合。因此，如本文所述，可通過改進 鈣脅迫的蛋白質的穩定性間接地矯正NprE由於喪失鈣導致的檸檬酸鹽誘導的不穩定性。
具體地，應用活性測定法和SDS-PAGE所研究的野生型解澱粉芽胞桿菌NprE蛋白 酶的對檸檬酸鹽誘導的失活和自溶是迅速且不可逆的。通過Edman降解鑑定的初始自溶位 點的N端位於環區並且在分子的表面。單位點飽和誘變和隨後的組合誘變產生了示範性的 對檸檬酸鹽穩定的蛋白質，其在S129、F130、M138、V190和D220具有5個胺基酸替換，所述 位點分布在環和表面位點區域。當在室溫溫育過夜時，S129I-F130L-M138L-V190I-D220P分 子在IOOmM檸檬酸鹽的存在下完全有活性且結構完整。在檸檬酸鹽存在下對單和多重組合 變體的熱熔點的熱測定顯示出加成性，並且表觀八徹是+101。認為這一穩定效果是由於 產生了不會經歷不可逆失活及自溶過程的穩定的天然狀態。由於工業洗滌劑通常含有檸檬 酸鹽，本發明為在生產和開發含有NprE變體的工業洗滌劑中的應用提供了極其有益的機石。本發明清潔製劑和洗滌製劑的詳細描述除非另外說明，本文提供的所有組分或組合物水平指均就該組分或組合物的有效 水平而言，並且不包括雜質，例如可能存在於市售來源中的殘餘溶劑或副產物。酶組分重量 基於總活性蛋白質。全部百分數和比率由重量計算，除非另外說明。基於總組成計算所有 百分數和比率，除非另外說明。在示範性的洗滌劑組合物中，將酶水平表達為純酶佔總組合物的重量，並且除非 另外明確說明，按照佔總組合物的重量表達洗滌劑成分。包含中性金屬蛋白酶的清潔組合物本發明的中性金屬蛋白酶可用於配製各種洗滌組合物。本發明的清潔組合物可有 利地用於例如，洗衣店應用、硬表面清潔、自動碟洗應用、以及化妝品應用，諸如假牙、牙齒、 頭髮和皮膚。然而，由於本發明的酶在較低溫度的溶液中升高的效果以及較高的顏色安全 特徵，本發明的酶理想地適於洗衣店應用，諸如漂白織物。此外，本發明的酶還可用於顆粒 和液體組合物中。本發明的酶還可用於清潔添加產品。當期望附加的漂白效果時，包括至少一種本 發明的酶的清潔添加產品理想地適於包括在洗滌過程中。此類情況包括但不限於低溫溶液 清潔應用。該添加產品以其最簡單的形式可以是本發明提供的一種或多種中性金屬蛋白 酶。在一些實施方案中，以劑量形式包裝該添加物用於添加至清潔程序中，其中應用了過氧 化物源並且期望增加的漂白效果。在一些實施方案中，所述的單劑量形式包含丸劑、片劑、 軟膠囊或其它單劑量形式(包括預計量的粉末和/或液體)。在一些實施方案中，包括填 充劑和/或載體材料，以增加此類組合物的體積。合適的填充劑或載體材料包括但不限於 各種硫酸鹽、碳酸鹽和矽酸鹽以及滑石粉、粘土等。在一些實施方案中，用於液體組合物的填充劑和/或載體材料包括水和/或低分子量伯醇或仲醇，包括多元醇和二醇。此類醇的 實例包括但不限於甲醇、乙醇、丙醇和異丙醇。在一些實施方案中，組合物包含約5%至約 90%的此類材料。在其它的實施方案中，應用酸性填充劑以降低組合物的pH。在一些備選 的實施方案中，所述清潔添加物包括至少一種如下所描述的活化的過氧化物(peroxygen) 源和/或如下面更詳細描述的輔助劑組分。本發明的清潔組合物和清潔添加物需要有效量的本發明提供的中性金屬蛋白酶。 在 一些實施方案中，通過添加一種或多種本發明提供的中性金屬蛋白酶達到酶的所需水 平。一般地，本發明的清潔組合物包含至少0. 0001重量百分數、約0. 0001-約1重量百分 數、約0. 001-約0. 5重量百分數、或甚至約0. 01-約0. 1重量百分數的至少一種本發明提 供的中性金屬蛋白酶。在一些優選的實施方案中，一般地如此配製本文提供的清潔組合物，使得在水性 清潔操作中使用時，洗滌水具有約5. 0至約11. 5的pH，或在備選的實施方案中，甚至是約 6. 0至約10. 5。在一些優選的實施方案中，一般地配製液體產品製劑以具有約3. 0至約9. 0 的淨pH，而在一些備選的實施方案中，該製劑具有約3至約5的淨pH。在一些優選的實施 方案中，一般地配製顆粒洗衣店產品以具有約8至約11的pH。將pH控制在推薦使用水平 的技術包括應用緩衝劑、鹼和酸等，並且是本領域公知的。在一些特別優選的實施方案中，當至少一種中性金屬蛋白酶應用於顆粒組合物或 液體中時，該中性金屬蛋白酶以包封的顆粒的形式以在儲存期間保護其不與該顆粒組合物 中的其它組分接觸。此外，包封還提供了在清潔過程期間控制中性金屬蛋白酶利用率的方 式，並且可以增強中性金屬蛋白酶的功效。預期本發明的包封的中性金屬蛋白酶可用於各 種環境。還預期可應用本領域已知的任何合適的包封材料和方法包封該中性金屬蛋白酶。在一些優選的實施方案中，包封材料一般地至少包封一部分中性金屬蛋白酶催化 齊U。在一些實施方案中，包封材料是水可溶的和/或水可分散的。在一些額外的實施方案 中，包封材料具有o°c或更高的玻璃化轉變溫度(Tg)(更多有關玻璃化轉變溫度的信息例 如參見，WO 97/11151，尤其是從第6頁25行至第7頁第2行)。在一些實施方案中，包封材料選自碳水化合物、天然或合成樹膠、幾丁質和脫乙 醯殼多糖、纖維素和纖維素衍生物、矽酸鹽、磷酸鹽、硼酸鹽、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蠟和它 們的組合物。在包封材料是碳水化合物的一些實施方案中，其選自單糖、寡糖、多糖和它們 的組合。在一些優選的實施方案中，包封材料是澱粉(對於一些示範性的合適澱粉的描述 例如參見 EP 0922499、US 4，977，252、US 5，354，559 和 US 5，935，826)。在其它實施方案中，包封材料包含製備自塑料的微球體(例如，熱塑料、丙烯腈、 甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈和它們的混合物；可用的商業可獲得的微球體包括 但不限於EXPANCEL [Casco Products, Stockholm, Sweden]、PM 6545、PM 6550、 PM 7220,PM 7228、EXTENDOSPHERES 和Q-CEL [PQ Corp. ,Valley Forge, PA]、LUXSIL 和 SPHERICEL1 [Potters Industries, Inc. , Carlstadt, NJ andValley Forge, PA])。製備和應用本申請人的清潔組合物的方法在一些優選的實施方案中，可通過配製者選擇的任意方法將本發明的組合物配製 為任何合適的形式，(對於一些非限制性實例，例如參見U. S. 5，879，584、U. S. 5，691，297、U. S. 5，574，005、U. S. 5，569，645、U. S. 5，565，422、U. S. 5，516，448、U. S. 5，489，392 和 U. S. 5，486，303)。在一些期望低pH清潔組合物的實施方案中，通過添加諸如HCl的酸性材 料調節此類組合物的pH。輔助材料
儘管對本發明的目的不重要，但在一些實施方案中，本文描述的輔助劑的非限制 性列表適用於本發明的清潔組合物中。實際上，在一些實施方案中，將輔助劑整合到本發明 的清潔組合物中。在一些實施方案中，輔助材料協助和/或增強清潔功效、處理待清潔的底 物、和/或修飾清潔組合物的美觀(例如，香料、著色劑、染料等)。應當理解，將此類輔助 劑添加至本發明的中性金屬蛋白酶中。這些額外組分的確切性質、其摻入水平取決於組合 物的物理形式和待應用其的清潔操作性質。合適的輔助材料包括但不限於表面活性劑、 增效助劑、螯合劑、染料轉移抑制劑、沉澱助劑、分散劑、額外的酶、和酶穩定劑、催化材料、 漂白活化劑、漂白增效劑、過氧化氫、過氧化氫源、預先形成的過酸、聚合分散劑、粘土移除/ 抗再沉積劑、光亮劑、抑泡劑、染料、芳香劑、結構伸縮劑、織物柔軟劑、載體、水溶增溶劑、力口 工助劑和/或顏料。除了本文明確提供的那些之外，其它的輔助材料是本領域公知的(例 如參見，美國專利號5，576，282,6, 306，812B1和6，326，348B1)。在一些實施方案中，前述的 輔助劑成分構成了本發明清潔組合物的平衡。表面活件劑-在一㈣實施方案中，本發明的清潔組合物包含至少一種表面活件劑 或表面活性劑系統，其中所述的表面活性劑選自非離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、 陽離子表面活性劑、兩性表面活性劑、兩性離子表面活性劑、半極性非離子表面活性劑、和 它們的混合物。在一些低PH清潔組合物實施方案(例如，具有約3至約5的淨pH的組合 物)中，該組合物一般不含有烷基乙氧基化的硫酸鹽，因為據信這一類表面活性劑可被該 組合物的酸性組分水解。在一些實施方案中，表面活性劑以清潔組合物重量的約0. 至約60%重量的水 平存在，而在備選的實施方案中，該水平是約至約50%，在其它實施方案中，該水平是 約5%至約40%。遭 在一些實施方案中，本發明的清潔組合物包含一種或多種洗滌劑增效 助劑或增效助劑系統。在一些摻入至少一種增效助劑的實施方案中，該清潔組合物包含清 潔組合物重量的至少約1%、約3%至約60%，或者甚至約5%至約40%的增效助劑。增效助劑包括但不限於多磷酸的鹼金屬鹽、銨鹽和烷醇銨鹽、鹼金屬矽酸鹽、鹼 土金屬和鹼金屬碳酸鹽、鋁矽酸鹽增效助劑聚羧酸酯化合物、醚羥基聚羧酸酯、馬來酐和乙 烯或乙烯基甲醚的共聚物、1，3，5_三羥基苯-2，4，6-三磺酸、和羧甲氧琥珀酸，聚乙酸的各 種鹼金屬鹽、銨鹽和取代的銨鹽，諸如乙二胺四乙酸和氨三乙酸、和聚羧酸酯，諸如苯六甲 酸、琥珀酸、檸檬酸、氧聯二琥珀酸、聚蘋果酸、苯1，3，5_三羧酸、羧甲氧基琥珀酸及其可溶 鹽。實際上，預期任意適合的增效助劑都可應用在本發明不同的實施方案中。MML-在一些實施方案中，本發明的清潔組合物含有至少一種螯合劑。適當的 螯合劑包括但不限於銅、鐵和/或錳螯合劑、和它們的混合物。在應用了至少一種螯合 劑的實施方案中，本發明的清潔組合物包含目標清潔組合物的約0. 至約15%或甚至約 3. 0%至約10%重量的螯合劑。沉澱助劑-在一些實施方案中，本發明的清潔組合物含有至少一種沉澱助劑。合適的沉澱助劑包括但不限於聚乙二醇、聚丙二醇、聚羧酸酯、土壤釋放聚合物諸如聚對苯 二甲酸、粘土諸如高嶺石、蒙脫石、活性白土、伊利石、斑脫土、埃洛石、和它們的混合物。染料轉移抑制劑-在一㈣實施方案中，本發明的清潔組合物包括一種或多種染 料轉移抑制劑。合適的聚合染料轉移抑制劑包括但不限於聚乙烯吡咯烷酮聚合物、聚胺 N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮和N-乙烯咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮和聚乙烯咪唑 或其混合物。
在其中應用了至少一種染料轉移抑制劑的實施方案中，本發明的清潔組合物包含 該清潔劑組合物的約0. 0001 %至約10 %、約0. 01 %至約5 %、或甚至約0. 1 %至約3 %重量 的染料轉移抑制劑。iMH-在一些實施方案中，本發明的清潔組合物含有至少一種分散劑。合適的 水溶性有機材料包括但不限於同-或共-聚合酸或它們的鹽，其中多聚羧酸包含至少兩個 被不超過兩個碳原子彼此隔開的羧基。直-在一些實施方案中，本發明的清潔組合物包含一種或多種洗滌劑酶，其提供 清潔功效和/或織物護理益處。合適的酶的實例包括但不限於半纖維素酶、過氧化物酶、 蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角質酶、果膠酶、角蛋白酶、還原酶、氧 化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木質酶、支鏈澱粉酶、單寧分解酶、戊聚糖酶、malanases, β -葡 聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質酸酶、軟骨素酶、漆酶和澱粉酶，或其混合物。在一些實施方 案中，應用酶的組合(即「雞尾酒」混合物)，其包含與澱粉酶聯合應用通常可應用的酶，例 如蛋白酶、脂肪酶、角質酶和/或纖維素酶。SII^lL-在本發明的一些實施方案中，穩定本發明的洗滌劑製劑中使用的酶。 預期各種酶穩定技術均可用於本發明。例如，在一些實施方案中，通過在提供此類離子給酶 的已完成的組合物中存在的鋅(II)、鈣(II)和/或鎂(II)離子的水溶性源穩定本文應用 的酶，以及其它金屬離子(例如，鋇(II)、鈧(II)、鐵(II)、錳(II)、鋁(III)、錫(II)、鈷 (II)、銅(II)、鎳(II)和氧釩(IV))。催化金屬ff合物-在一些實施方案中，本發明的清潔組合物含有一種或多種催化 金屬複合物。在一些實施方案中，應用含有金屬的漂白催化劑。在一些優選的實施方案中， 所述金屬漂白催化劑包含這樣的催化系統，所述催化系統包含確定漂白催化活性的過渡金 屬陽離子(例如，銅、鐵、鈦、釕、鎢、鉬或錳陽離子)、幾乎不具有或不具有漂白催化活性的 輔助金屬陽離子(例如，鋅或鋁陽離子)以及具有用於催化和輔助金屬陽離子的明確的穩 定常數的隔離物，尤其是乙二胺四乙酸、乙二胺四(亞甲基膦酸)和其可水溶鹽(例如參見 U. S. 4，430，243)。在一些實施方案中，通過錳化合物的方式催化本發明的清潔組合物。此類化合物 和使用水平是本領域公知的(例如參見U. S. 5，576，282)。在其它的實施方案中，在本發明的清潔組合物中使用鈷漂白催化劑。各種鈷漂白 催化劑是本領域公知的(例如參見U. S. 5，597，936和U. S. 5，595，967)。通過已知方法能很 容易地製備此類鈷催化劑(例如參見=U. S. 5，597，936和U. S. 5，595，967)。在其它實施方案中，本發明的清潔組合物包括大的多環剛性配體(「MRL」)的過渡 金屬複合物。作為實用物質，並且不以限制性的方式，在一些實施方案中，調節本發明提供 的組合物和清潔過程以在水性洗滌介質中提供約至少一億分之一份的活性MRL物質，並且在一些優選的實施方案中，在洗滌水溶液中提供約0. 005ppm至約25ppm、更優選約0. 05ppm 至約lOppm、以及最優選約0. Ippm至約5ppm的MRL。在瞬時過渡金屬漂白催化劑中優選的過渡金屬包括但不限於錳、鐵和鉻。優選 的MRL還包括但不限於橋聯的特殊極端剛性配體(例如，5，12_ 二乙基-1，5，8，12-四氮雜 二環[6.6.2]十六烷)。通過已知方法可很容易地製備合適的過渡金屬MRL(例如，參見WO 00/32601 和 U. S. 6，225，464)。製備和應用清潔組合物的方法 可通過配製者選擇的任意合適的方法將本發明的清潔組合物配製為任何合適 的形式，(例如，參見 U. S. 5，879，584、U. S. 5，691，297、U. S. 5，574，005、U. S. 5，569，645、 U. S. 5，565，422、U. S. 5，516，448、U. S. 5，489，392、U. S. 5，486，303、U. S. 4，515，705、 U. S. 4，537，706、U. S. 4，515，707、U. S. 4，550，862、U. S. 4，561，998、U. S. 4，597，898、 U. S. 4，968，451、U. S. 5，565，145、U. S. 5，929，022、U. S. 6，294，514 和 U. S. 6，376，445，對於 一些非限制性實施例每一個均在此引入作為參考)。使用方法在優選的實施方案中，本發明的清潔組合物可用於清潔表面和/或織物。在一些 實施方案中，所述表面和/或織物的至少一部分與本發明至少一個實施方案的清潔組合物 (以淨形式或稀釋於洗滌溶液中)接觸，並且然後任選地洗滌和/或漂洗該表面和/或織 物。為本發明的目的，「洗滌」包括但不限於擦洗和機械攪拌。在一些實施方案中，織物 包含能夠在普通消費者使用條件下洗滌的任何織物。在優選的實施方案中，以在溶液中約 500ppm至約15，OOOppm的濃度使用本發明的清潔組合物。在其中洗滌溶劑是水的一些實施 方案中，水溫一般為約5°C至約90°C。在一些用於織物清潔的實施方案中，水與織物的質量 比一般為約1 1至約30 1。實驗提供了以下實施例旨在展示和進一步說明本發明的某些優選實施方案和方面，並 且不應解釋為限制本發明的範圍。在隨後的實驗公開內容中，使用以下縮寫V (攝氏度)；rpm(轉/分鐘)； H20(水)；HCl(鹽酸)；aa和AA(胺基酸)；bp(鹼基)；kb(千鹼基)；kD(千道爾頓)； gm(克)；μ g和ug(微克)；mg(毫克)；ng(納克)；μ 1禾Π ul (微升)；ml (毫升)；mm(毫 升)；nm (納米)；ym和um (微米)；M (摩爾)；mM (毫摩爾)；μ M和uM (微摩爾)；U (單位)； V(伏特)；麗(分子量)；sec (秒)；min (分鐘)；hr (小時)；MgCl2 (氯化鎂)；NaCl (氯化 鈉)；OD280 (在28Onm的光密度)；OD4os (在405nm的光密度)；OD600 (在600nm的光密度)； PAGE (聚丙烯醯胺凝膠電泳)；EtOH (乙醇)；PBS (磷酸鹽緩衝鹽水[150mM NaCl，10mM磷酸 鈉緩衝液，PH 7. 2]) ；LAS (十二烷基磺酸鈉)；SDS (十二烷基硫酸鈉)；Tris (H (羥甲基) 氨基甲烷)；TAED(N，N，N，N，_ 四乙醯乙二胺)；BES(聚醚碸(polyethersulfone)) ；MES( — 水合2-嗎啉乙磺酸；分子量195. 24 ；Sigma#M-3671) ；CaCl2 (無水氯化鈣；分子量110. 99 ； Sigma#C-4901) ；DMF (N, N-二 甲基甲醯胺，分子量 73. 09，d = 0. 95) ；Abζ-AGLA-Nba (2-氨 基苯甲醯-L-丙氨醯甘氨醯-L-亮氨醯-L-丙氨醯-4-硝基苄醯胺，分子量583. 65 ； Bachem#H-6675, VffR目錄號#100040-598) ；SBG 1 % (具葡萄糖的超級肉湯；6g大豆腖 [Difco]、3g酵母提取物、6gNaCl、6g葡萄糖)；在使用本領域已知的方法消毒前，用NaOH調節PH至7. l;w/v(重量比體積)；ν/ν(體積比體積)；Npr和npr (中性金屬蛋白酶)； SEQUEST (SEQUEST資料庫搜索程序，華盛頓大學)；MS (質譜)；BMI (血液、乳、墨 汁)；SRI (汙漬去除指數)；Npr和npr (中性金屬蛋白酶基因)；NprE和nprE(解澱粉芽孢 桿菌中性金屬蛋白酶)；P麗(純化的MULTIFECT 金屬蛋白酶)；以及Quint (S129I-F130L-M138L-V190I-D220P 五重 NprE 變體)。 應用以下縮寫用於公司，其中在示範性實施例中提及了所述公司的產 品或服務TIGR(基因 組研究所，Rockville, MD) ；AATCC(美國紡織化學師與印 染 師 協 會)；Amersham(Amersham Life Science，Inc.ArlingtonHeights, IL)； Corning(Corning International， Corning， NY) ；ICN(ICNPharmaceuticals, Inc.， Costa Mesa，CA) ；Pierce (Pierce Biotechnology, Rockford，IL) ；Equest (Equest， Warwick International Group， Inc. ， Flintshire， UK) ；EMPA(Eidgenossische Material Prufungs und VersuchAnstalt, St.Gallen, 瑞士)；CFT(試 驗 材 料 ΦVlaardingen, # 生)；Amicon(Amicon, Inc. ， Beverly, ΜΑ) ；ATCC( _ _
^ M ^ ^ U M ^ Manassas, VA) ；Becton Dickinson(Becton Dickinson Labware, LincolnPark，NJ) ；Perkin-EImer (Perkin-Elmer, Wellesley, MA)； Rainin(Raininlnstrument，LLC，Woburn, MA) ；Eppendorf (德國漢堡 Eppendorf AG)； Waters (Waters, Inc. ， Milford, MA) ；Geneart ( ^M H mWJiM GeneartGmbH) ；Perseptive Biosystems (Perseptive Biosystems, Ramsey, MN) ；Molecular Probes(Molecular Probes， Eugene， OR) ；BioRad(BioRad， Richmond， CA) ；Clontech(CLONTECH 實驗室， Palo Alto, CA) ；Cargill (Cargill, Inc.，Minneapolis，MN) ；Difco (Difco 實驗室， Detroit，MI) ；GIBCOBRL 或 Gibco BRL (Life Technologies，Inc.，Gaithersburg， MD) ； NewBrunswick (New Brunswick Scientific Company, Inc.，Edison，NJ)； Thermoelectron (Thermoelectron Corp.，Waltham，MA) ；BMG(德國奧芬堡 BMG Labtech， GmbH，) ；Greiner(Greiner Bio-One, Kremsmuenster, 奧 地 禾丨J ) ；Novagen(Novagen, Inc. ， Madison， WI) ；Novex(Novex, San Diego, CA) ；Finnzymes(Finnzymes ΟΥ,芬蘭)； Qiagen (Qiagen，Inc.，Valencia, CA) ；Invitrogen (Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)； Sigma(Sigma ChemicalCo.，St.Louis, MO) ；DuPont Instruments (Asheville，NY)； Global MedicalInstrumentation 或 GMI(Global Medical Instrumentation ；Ramsey, MN) ；MJ Research (MJ Research，Waltham，MA) ；Infors(Infors AG，Bottmingen，瑞 士 ) ；Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla，CA) ；Roche (Hoffmann La Roche，Inc.，Nut ley, NJ) ；Agi lent(AgiIentTechnologies, Palo Alto, CA)； S-Matrix (S-Matrix Corp.，Eureka，CA) ；USTesting (United States Testing Co.， Hoboken， NY) ；West Coast AnalyticalServices(West Coast Analytical Services, Inc. , Smta Fe Springs, CA)；離子束分析實驗室(薩裡大學離子束中心離子束分析 實驗室(Guildford，UK) ；TOM(Terg-o-Meter) ；BaChem(BaChem AG，Bubendorf，瑞士)； Molecular Devices (Molecular Devices, Inc.，Sunnyvale, CA) ；Corning (Corning International，Corning，NY) ；MicroCal(Microcal，Inc.，Northhampton, MA) ；Chemical Computing (Chemical Computing Corp.，Montreal，加拿大)；NCBI (美國國家生物技術 信息中心)；ArgoBioanalytica(Argo Bioanalytica. Inc, New Jersey) ；Vydac(GraceVydac，Hesperia，CA) ；Minolta(Konica Minolta,Ramsey,NJ)；禾口 Zeiss (CarlZeiss，Inc.， Thornwood, NY)。本發明提供並用到了以下序列SEQ ID NO 1 (NprE) GTGGGTTTAGGTAAGAAATTGTCTGTTGCTGTCGCCGCTTCCTTTATGAGTTTAACCATCAGTCTGCCG GGTGTTCAGGCCGCTGAGAATCCTCAGCTTAAAGAAAACCTGACGAATTTTGTACCGAAGCATTCTTTGGTGCAATC AGAATTGCCTTCTGTCAGTGACAAAGCTATCAAGCAATACTTGAAACAAAACGGCAAAGTCTTTAAAGGCAATCCTT CTGAAAGATTGAAGCTGATTGACCAAACGACCGATGATCTCGGCTACAAGCACTTCCGTTATGTGCCTGTCGTAAAC GGTGTGCCTGTGAAAGACTCTCAAGTCATTATTCACGTCGATAAATCCAACAACGTCTATGCGATTAACGGTGAATT AAACAACGATGTTTCCGCCAAAACGGCAAACAGCAAAAAATTATCTGCAAATCAGGCGCTGGATCATGCTTATAAAG CGATCGGCAAATCACCTGAAGCCGTTTCTAACGGAACCGTTGCAAACAAAAACAAAGCCGAGCTGAAAGCAGCAGCC ACAAAAGACGGCAAATACCGCCTCGCCTATGATGTAACCATCCGCTACATCGAACCGGAACCTGCAAACTGGGAAGT AACCGTTGATGCGGAAACAGGAAAAATCCTGAAAAAGCAAAACAAAGTGGAGCATGCCGCCACAACCGGAACAGGTA CGACTCTTAAAGGAAAAACGGTCTCATTAAATATTTCTTCTGAAAGCGGCAAATATGTGCTGCGCGATCTTTCTAAA CCTACCGGAACACAAATTATTACGTACGATCTGCAAAACCGCGAGTATAACCTGCCGGGCACACTCGTATCCAGCAC CACAAACCAGTTTACAACTTCTTCTCAGCGCGCTGCCGTTGATGCGCATTACAACCTCGGCAAAGTGTATGATTATT TCTATCAGAAGTTTAATCGCAACAGCTACGACAATAAAGGCGGCAAGATCGTATCCTCCGTTCATTACGGCAGCAGA TACAATAACGCAGCCTGGATCGGCGACCAAATGATTTACGGTGACGGCGACGGTTCATTCTTCTCACCTCTTTCCGG TTCAATGGACGTAACCGCTCATGAAATGACACATGGCGTTACACAGGAAACAGCCAACCTGAACTACGAAAATCAGC CGGGCGCTTTAAACGAATCCTTCTCTGATGTATTCGGGTACTTCAACGATACTGAGGACTGGGATATCGGTGAAGAT ATTACGGTCAGCCAGCCGGCTCTCCGCAGCTTATCCAATCCGACAAAATACGGACAGCCTGATAATTTCAAAAATTA CAAAAACCTTCCGAACACTGATGCCGGCGACTACGGCGGCGTGCATACAAACAGCGGAATCCCGAACAAAGCCGCTT ACAATACGATTACAAAAATCGGCGTGAACAAAGCGGAGCAGATTTACTATCGTGCTCTGACGGTATACCTCACTCCG TCATCAACTTTTAAAGATGCAAAAGCCGCTTTGATTCAATCTGCGCGGGACCTTTACGGCTCTCAAGATGCTGCAAG CGTAGAAGCTGCCTGGAATGCAGTCGGATTGTAASEQ ID NO 2 (NprE 前體)MGLGKKLSVAVAASFMSLTISLPGVQAAENPQLKENLTNFVPKHSLVQSELPSVSDKAIKQYLKQNGKV FKGNPSERLKLIDQTTDDLGYKHFRYVPVVNGVPVKDSQVIIHVDKSNNVYAINGELNNDVSAKTANSKKLSANQAL DHAYKAIGKSPEAVSNGTVANKNKAELKAAATKDGKYRLAYDVTIRYIEPEPANffEVTVDAETGKILKKQNKVEHAA TTGTGTTLKGKTVSLNISSESGKYVLRDLSKPTGTQIITYDLQNREYNLPGTLVSSTTNQFTTSSQRAAVDAHYNLG KVYDYFYQKFNRNSYDNKGGKIVSSVHYGSRYNNAAWIGDQMIY ⑶⑶ GSFFSPLSGSMDVTAHEMTHGVTQETANL NYENQPGALNESFSDVFGYFNDTEDWDIGEDITVSQPALRSLSNPTKYGQPDNFKNYKNLPNTDAGDYGGVHTNSGI PNKAAYNTITKIGVNKAEQIYYRALTVYLTPSSTFKDAKAALIQSARDLYGSQDAASVEAAWNAVGLSEQ ID NO 3 (NprE 成熟體)AATTGTGTTLKGKTVSLNISSESGKYVLRDLSKPTGTQIITYDLQNREYNLPGTLVSSTTNQFTTSSQR AAVDAHYNLGKVYDYFYQKFNRNSYDNKGGKIVSSVHYGSRYNNAAWIGDQMIY ⑶⑶ GSFFSPLSGSMDVTAHEMT HGVTQETANLNYENQPGALNESFSDVFGYFNDTEDWDIGEDITVSQPALRSLSNPTKYGQPDNFKNYKNLPNTDAGD YGGVHTNSGIPNKAAYNTITKIGVNKAEQIYYRALTVYLTPSSTFKDAKAALIQSARDLYGSQDAASVEAAWNAVGLSEQ ID NO 4(NprE 引物)
CTGCAGGAATTCAGATCTTAACATTTTTCCCCTATCATTTTTCCCGSEQ ID NO 5 (NprE 引物)GGATCCAAGCTTCCCGGGAAAAGACATATATGATCATGGTGAAGCC SEQ ID NO :6 (pUB-Bglll-FW)GTCAGTCAGATCTTCCTTCAGGTTATGACCSEQ ID NO :7 (pUB-Bglll-RV)GTCTCGAAGATCTGATTGCTTAACTGCTTCSEQ ID NO 8 (NprE)AATTGTGTTLSEQ ID NO 9 (NprE)DA ⑶ YGGVHTSEQ ID NO : 10 (NPrE)A ⑶ YGGVHTNSEQ ID NO : 11 (NprE)GDYGGVHTNSEQ ID NO 12 (NprE)LSNPTKYGQPSEQ ID NO : 13 (NprE 片段 1)AATTGTGTTLTVSLNISSESGKYVLRDLSKPTGTQIITYDLQNREYNLPGTLVSSTTNQFTTSSQRAAV DAHYNLGKVYDYFYQKFNIVSSVHYGSRSLSNPTKYGQPDNFKSEQ ID NO : 14 (NprE 片段 2)DA⑶YGGVHTAAYNTITKAEQIYYRALTVYLTPSSTFKDAKAALIQSARDLYGSQDAASVEAAWNAVGLSEQ ID NO : 15 (NprE 片段 3)AATTGTGTTLTVSLNISSESGKDLSKPTGTQIITYDLQNREYNLPGTLVSSTTNQFTTSSQRAAVDAHY NLGKNSYDNKIVSSVHYGSRYNNAAWIGDQMIY ⑶⑶ GSFFSPLSGSMDSEQ ID NO 16 (NprE 片段 4)AATTGTGTTLTVSLNISSESGKDLSKPTGTQIITYDLQNREYNLPGTLVSSTTNQFTTSSQRAAVDAHY NLGKNSYDNKIVSSVHYGSRMDVSEQ ID NO : 17 (NprE 片段 5)LSNPTKYGQPKNYKNLPNTDAGDYGGVHTNSGIPNKAEQIYYRALTVTFKDAKAALIQSARDLYGSQDA ASVEAAffNAVGLSEQ ID NO 18 (NprE S129I/F130L/D220P)AATTGTGTTLKGKTVSLNISSESGKYVLRDLSKPTGTQIITYDLQNREYNLPGTLVSSTTNQFTTSSQR AAVDAHYNLGKVYDYFYQKFNRNSYDNKGGKIVSSVHYGSRYNNAAWIGDQMIY ⑶⑶ GILFSPLSGSMDVTAHEMT HGVTQETANLNYENQPGALNESFSDVFGYFNDTEDffDIGEDITVSQPALRSLSNPTKYGQPDNFKNYKNLPNTPAGD YGGVHTNSGIPNKAAYNTITKIGVNKAEQIYYRALTVYLTPSSTFKDAKAALIQSARDLYGSQDAASVEAAWNAVGLSEQ ID NO 19 (NprE M138L/V190I/D220P)AATTGTGTTLKGKTVSLNISSESGKYVLRDLSKPTGTQIITYDLQNREYNLPGTLVSSTTNQFTTSSQR AAVDAHYNLGKVYDYFYQKFNRNSYDNKGGKIVSSVHYGSRYNNAAWIGDQMIYGDGDGSFFSPLSGSLDVTAHEMTHGVTQETANLNYENQPGALNESFSDVFGYFNDTEDWDIGEDITISQPALRSLSNPTKYGQPDNFKNYKNLPNTPAGD YGGVHTNSGIPNKAAYNTITKIGVNKAEQIYYRALTVYLTPSSTFKDAKAALIQSARDLYGSQDAASVEAAWNAVGLSEQ ID NO 20 (NprE S129I/F130L/M138L/V190I/D220P)AATTGTGTTLKGKTVSLNISSESGKYVLRDLSKPTGTQIITYDLQNREYNLPGTLVSSTTNQFTTSSQR AAVDAHYNLGKVYDYFYQKFNRNSYDNKGGKIVSSVHYGSRYNNAAWI ⑶ QMIY ⑶⑶ GILFSPLSGSLDVTAHEMT HGVTQETANLNYENQPGALNESFSDVFGYFNDTEDffDIGEDITISQPALRSLSNPTKYGQPDNFKNYKNLPNTPAGD
yggvhtn sgipnkaayntitkigvnkaeqiyyraltvyltpsstfkdakaaliqsardlygsqdaasveaawnavg實施例1測定法在下文描述的實施例中使用以下測定法。在實施例中指出對下文所提供方案的任 意偏離。在這些實驗中，使用分光光度計來測量反應結束後形成的產物的吸光度。使用反 射計來測量樣品的反射度。A.蛋白質含量測定1.在96孔微量滴定板(MTP)中測定蛋白質含量的BCA(bicinchoninicacid)測定 法在這些測定法中，使用BCA(Pierce)測定法在MTP規格上確定蛋白酶樣品中的蛋 白質濃度。在這個測定系統中，使用的化學品和試劑溶液是BCA蛋白質測定試劑和Pierce 稀釋緩衝液(50mM MES，pH 6. 5，2mMCaCl2，0. 005 % TWEEN -80)。使用的設備是 SpectraMAX(340 型)MTP 讀數儀。MTP 從 Costar 獲得(9017 型)。在本試驗中，將200μ1 BCA試劑移入每一孔，隨後移入20 μ 1稀釋的蛋白質。徹 底混合後，MTP在37°C溫育30分鐘。除去可能的氣泡，並且在562nm處讀取孔內溶液的光 密度(OD)。為測定蛋白質濃度，從樣品讀數中扣除背景讀數。對蛋白質標準品(純化的蛋 白酶)標出OD562值以產生標準曲線。從該標準曲線外推出樣品的蛋白質濃度。2.用於在96孔微量滴定板(MTP)中測定蛋白質含量的Bradford測定法在這些測定法中，使用Bradford染料試劑(Quick Start)測定法在MTP規格上確 定蛋白酶樣品中的蛋白質濃度。在這個測定系統中，使用的化學品和試劑溶液是快速啟動Bradford染料試劑 (BIO-RAD 目錄號 500-0205)、稀釋緩衝液(IOmM NaCI,0. ImMCaCI2,0.005 %TWEEN -80)。使用的設備是 Biomek FX Robot (Beckman)和 SpectraMAX(340 型)MTP 讀數儀。MTP 來自 Costar (9017 型)。在本試驗中，將200 μ 1 Bradford染料試劑移入每一孔，隨後移入15 μ 1稀釋緩衝 液。最後，添加10μ1濾過的培養肉湯至諸孔。徹底混合後，MTP在室溫溫育至少10分鐘。 吹去可能的氣泡並且在595nm處讀取孔的0D。為測定蛋白質濃度，從樣品讀數中扣除背景 讀數(即來自非溫育孔的讀數)。所得OD595值提供了樣品中蛋白質含量的相對量值。B.對於g白 解掛件的檸船I定j牛測丨定法在mM檸檬酸鹽存在下溫育野生型NprE和變體後測量檸檬酸鹽穩定性。應用DMC 水解測定法確定起始和殘餘活性。在這個測定系統中，使用的化學品和試劑溶液是一水合檸檬酸Merck 1.00244CN 10842481 A說 明 書 30/44頁
在這一測定法系統中，應用了以下化學物質和試劑二甲基酪蛋白(DMC) Sigma C-9801WEEN "80Sigma P—8074PIPES 緩衝液(無酸)Sigma P-1851 ；15. 1 溶解於約 960ml 水中；用 4N NaOH 將 pH 調節至 6. 0，加入 1ml 5%TWEEN -80，並使體積升為 1000ml。PIPES 和TWEEN -80的終濃度分別為50mM和0. 005%。間三硝苯基磺酸(TNBS) Sigma P-2297 (5%水溶液)試劑A 將 45. 4g Na2B407. 10H20 (Merck 6308)禾口15ml 4N NaOH—起溶解至 1000ml 終體積(如果需要的話通過加熱)試劑B 將 35. 2g NaH2P04. 1H20 (Merck 6346)和 0. 6g Na2S03(Merck 6657) 一起溶解至 1000ml 的終體積。^^為製備底物，將4g 二甲基酪蛋白溶解於400ml PIPES緩衝液中。將濾過的培養 物上清液稀釋於PIPES緩衝液中。然後，將10 yl每一稀釋的上清液添加到MTP孔中的 200 yl底物中。用帶子覆蓋MTP，振蕩數秒並且置於25°C的溫箱中30分鐘，無需攪拌。在 從該溫箱中移除第一個板之前約15分鐘，通過使每50ml試劑A混合1ml TNBS製備TNBS 試劑。使MTP的每一孔裝入60 yl TNBS試劑A。振蕩經溫育的板數秒，然後將10 yl轉移 至具有TNBS試劑A的MTP中。用帶子覆蓋該板，並在室溫及500轉/分鐘在臺式搖床(BMG Thermostar)中振蕩20分鐘。最後，往每一孔加入200 u 1試劑B，在搖床上混合1分鐘，並 應用MTP讀數儀確定在405nm處的吸光度。針對空白值(即，沒有酶的底物)校正得到的吸光度值。得到的吸光度是水解活 性的測量。通過將吸光度除以確定的蛋白質濃度計算樣本的(任意的)比活性。D. 2-氨基苯甲醯-L-丙氨醯甘氨醯-L-亮氨醯丙氨醯硝基苄醯胺蛋白酶 測定法(Abz-AGLA-Nba)下文所提供的方法提供了某種程度的技術細節，其中所述技術細節產生獨立於時 間和地點的可重複性蛋白酶測定數據。儘管該測定法可適應於給定的實驗條件，然而必須 使通過改良方法獲得的任意數據與通過原始方法產生的結果相一致。中性金屬蛋白酶切割 2-氨基苯甲醯-L-丙氨醯甘氨醯-L-亮氨醯-L-丙氨醯-4-硝基苄醯胺(Abz-AGLA-Nba) 的甘氨酸與亮氨酸之間的肽鍵。溶液中游離的2-氨基苯甲醯-L-丙氨醯甘氨酸(Abz-AG) 在340nm處最大激發時在415nm處具有最大螢光發射。Abz-AG的螢光被完整Abz-AGLA-Nba 分子中的硝基苄醯胺猝滅。在這些實驗中，通過螢光光譜(激發340/發射415)監測由蛋白酶切割 Abz-AGLA-Nba引起的Abz-AG釋放。Abz-AG的出現率是蛋白酶解活性的度量值。測定法在 非底物限制性初始速度條件下進行。對於可重複性測定結果，需要帶溫度控制的微量板混合器(例如Eppendorf Thermomixer)。在添加酶之前，測試溶液在微量板混合器中溫育至期望的溫度(例如 25°C )。添加酶溶液至該混合器中的板，劇烈混合併迅速轉移至板讀數儀。需要具有連續數據記錄、線性回歸分析和溫度控制能力的螢光分光光度計(例如SpectraMax M5、Gemini EM、Molecular Devices)。讀數儀總是維持在期望的溫度(例如 25V )。設置該讀數儀用於頂部讀數螢光檢測並且將激發設置到350nm並將發射設置到 415nm，不使用截止濾光鏡。將PMT設置成中等靈敏度並且每孔5個讀數。打開自動校準， 但僅在第一次讀數前校準。該測定法測量3分鐘，同時根據待監測的孔數，使讀數間隔最小 化。將讀數儀設置成計算milli-RFU/分鐘的速率(千個相對螢光單位/分鐘)。用來計算 速率的讀數數目(Vmax點)設置成等同於2分鐘的數目，如通過讀數間隔確定的那樣(例 如每隔10秒的讀數將使用12個點來計算速率)。最大RFU設置成50，000。酶和底物貯存液的所有吸取均用正壓可調節移液器(RaininMicroman)進行。緩 衝液、測試液和酶工作溶液由單通道或多通道空氣排量移液器(Rainin LTS)從試管、試劑 儲庫或貯存微量板吸取。僅當使用少數孔時，連續移液器(Eppendorf)才用於轉移測試溶 液至微量板孔，以使試劑損失最小化。自動移液儀諸如Beckman FX或Cybio Cybi-well也 用於從工作貯存微量板轉移酶溶液至分析微量板以便立刻起始整個微量板。試劑和溶液52. 6mM MES/NaOH, 2. 6mM CaCl2, pH 6. 5-MES 緩衝液將MES酸(10. 28g)和292mg無水CaCl2溶解於大約900mL純化水中。溶液用NaOH 滴定至pH 6.5(在25°C或用溫度調節pH探頭)。調節過pH的緩衝液補足至1L總體積。最 終溶液經過0. 22 y m無菌濾器過濾並保持在室溫。在DMF 中的 48mM Abz-AGLA-Nba-Abz-AGLA-Nba 貯存液將大約28mg Abz-AGLA-Nba置於一支小管內。使其溶解於DMF(體積根據聚結的 Abz-AGLA-Nba變化)並且渦旋混合幾分鐘。該溶液在室溫避光貯存。50mM MES, 2. 5mM CaCl2,5% DMF, 2. 4mM Abz-AGLA-NbapH 6. 5-測試溶液lmL Abz-AGLA-Nba貯存液添加至19mL MES緩衝液中並渦旋混合。該溶液在室溫 避光貯存。50mM MES, 2. 5mM CaCl2, pH 6. 5_ 酶稀釋緩衝液通過添加5mL純化水至95mL MES緩衝液產生這種緩衝液。50mM MES, 2. 5mM CaCl2,, 5% DMF,pH 6. 5-底物稀釋緩衝液5mL純DMF添加至95mL MES緩衝液。該緩衝液用來確定動力學參數。酶溶液酶貯存溶液用酶稀釋緩衝液稀釋成大約lppm(l u g/mL)濃度。將 MULTIFECT 中性蛋白酶(野生型NprE)稀釋至濃度低於6ppm(6i! g/mL)。優選連 續稀釋物。溶液在室溫穩定1小時，不過對於較長的貯存時間，在冰上保持所述溶液。方法首先，製備全部緩衝液、貯存液和工作溶液。除非另有說明，每種酶稀釋液一式三 份進行測試。當未完全佔滿時，酶工作溶液貯存微量板以自板左邊開始的全部垂直列排列 (以適應板讀數儀)。類似地設置相應的測試板。微量板螢光分光光度計如前述設置。首先，將200 y L等份的測試溶液置於96孔微量板的孔內。該板在25°C於溫控微 量板混合器中避光溫育10分鐘。通過從貯存微量板轉移10uL酶工作溶液至混合器中的測 試微量板啟動該測定法。最佳地，使用96孔移液吸頭，或在一些實驗中，使用8孔多通道移 液器首先從最左邊列轉移。劇烈混合該溶液15秒(在Eppendorf Thermomixer中900轉/分鐘)。將測試微量板立即轉移至微量板螢光分光光度計並且開始記錄在350nm激發和 415nm發射的螢光量值。螢光分光光度計軟體計算每孔螢光增加對milli-RFU/分鐘的線性 回歸的反應速率。在一些實驗中，當第一板正在讀數時，將第二塊板置於微量板混合器用於 溫度平衡。初始速率與產物濃度(即釋放的2-氨基苯甲醯基螢光)成線性關係，直到0. 3mM 產物，這與具有大約22，000RFU背景螢光的始自2. 3mMAbz-AGLA-Nba的溶液中的大約 50，000RFU相對應。Abz-AGLA-Nba溶解於DMF中並且在製備當日使用。實施例2在枯草芽孢桿菌中的NprE蛋白酶產生在該實施例中，描述了在枯草芽孢桿菌中產生NprE蛋白酶所開展的實驗。特別 地，提供了在將質粒pUBnprE轉化至枯草芽孢桿菌中所使用的方法。轉化如本領域已知那 樣(見，例如W0 02/14490和W02007/044993，兩個均在此引入作為參考)進行。下文提供 的DNA序列(來自解澱粉芽孢桿菌的nprE前導序列、nprE pro和nprE成熟DNA序列)編 碼NprE前體蛋白。GTGGGTTTAGGTAAGAAATTGTCTGTTGCTGTCGCCGCTTCCTTTATGAGTTTAACCATCAGTCTGCCG GGTGTTCAGGCCGCTGAGAATCCTCAGCTTAAAGAAAACCTGACGAATTTTGTACCGAAGCATTCTTTGGTGCAATC AGAATTGCCTTCTGTCAGTGACAAAGCTATCAAGCAATACTTGAAACAAAACGGCAAAGTCTTTAAAGGCAATCCTT CTGAAAGATTGAAGCTGATTGACCAAACGACCGATGATCTCGGCTACAAGCACTTCCGTTATGTGCCTGTCGTAAAC GGTGTGCCTGTGAAAGACTCTCAAGTCATTATTCACGTCGATAAATCCAACAACGTCTATGCGATTAACGGTGAATT AAACAACGATGTTTCCGCCAAAACGGCAAACAGCAAAAAATTATCTGCAAATCAGGCGCTGGATCATGCTTATAAAG CGATCGGCAAATCACCTGAAGCCGTTTCTAACGGAACCGTTGCAAACAAAAACAAAGCCGAGCTGAAAGCAGCAGCC ACAAAAGACGGCAAATACCGCCTCGCCTATGATGTAACCATCCGCTACATCGAACCGGAACCTGCAAACTGGGAAGT AACCGTTGATGCGGAAACAGGAAAAATCCTGAAAAAGCAAAACAAAGTGGAGCATGCCGCCACAACCGGAACAGGTA CGACTCTTAAAGGAAAAACGGTCTCATTAAATATTTCTTCTGAAAGCGGCAAATATGTGCTGCGCGATCTTTCTAAA CCTACCGGAACACAAATTATTACGTACGATCTGCAAAACCGCGAGTATAACCTGCCGGGCACACTCGTATCCAGCAC CACAAACCAGTTTACAACTTCTTCTCAGCGCGCTGCCGTTGATGCGCATTACAACCTCGGCAAAGTGTATGATTATT TCTATCAGAAGTTTAATCGCAACAGCTACGACAATAAAGGCGGCAAGATCGTATCCTCCGTTCATTACGGCAGCAGA TACAATAACGCAGCCTGGATCGGCGACCAAATGATTTACGGTGACGGCGACGGTFCATTCTTCTCACCTCTTTCCGG TTCAATGGACGTAACCGCTCATGAAATGACACATGGCGTTACACAGGAAACAGCCAACCTGAACTACGAAAATCAGC CGGGCGCTTTAAACGAATCCTTCTCTGATGTATTCGGGTACTTCAACGATACTGAGGACTGGGATATCGGTGAAGAT ATTACGGTCAGCCAGCCGGCTCTCCGCAGCTTATCCAATCCGACAAAATACGGACAGCCTGATAATTTCAAAAATTA CAAAAACCTTCCGAACACTGATGCCGGCGACTACGGCGGCGTGCATACAAACAGCGGAATCCCGAACAAAGCCGCTT ACAATACGATTACAAAAATCGGCGTGAACAAAGCGGAGCAGATTTACTATCGTGCTCTGACGGTATACCTCACTCCG TCATCAACTTTTAAAGATGCAAAAGCCGCTTTGATTCAATCTGCGCGGGACCTTTACGGCTCTCAAGATGCTGCAAG CGTAGAAGCTGCCTGGAATGCAGTCGGATTGTAA(SEQ ID NO 1)在以上序列中，粗體表示編碼成熟NprE蛋白酶的DNA，標準字體表示前導序列 (nprE前導序列)，且下劃線部分表示前序列(nprE pro)。下文提供的胺基酸序列(NprE前 導序列、NprE pro和NprE成熟DNA序列)(SEQ ID NO 2)與全長NprE前體蛋白相對應。在 這個序列中，下劃線部分表示前序列並且粗體表示成熟NprE蛋白酶。
MGLGKKLSVAVAASFMSLTISLPGVQAAENPQLKENLTNFVPKHSLVQSELPSVSDKAIKQYLKQNGKV FKGNPSERLKLIDQTTDDLGYKHFRYVPVVNGVPVKDSQVIIHVDKSNNVYAINGELNNDVSAKTANSKKLSANQAL DHAYKAIGKSPEAVSNGTVANKNKAELKAAATKDGKYRLAYDVTIRYIEPEPANffEVTVDAETGKILKKQNKVEHAA TTGTGTTLKGKTVSLNISSESGKYVLRDLSKPTGTQIITYDLQNREYNLPGTLVSSTTNQFTTSSQRAAVDAHYNL GKVYDYFYQKFNRNSYDNKGGKIVSSVHYGSRYNNAAWIGDQMIYGDGDGSFFSPLSGSMDVTAHEMTHGVTQETA NLNYENQPGALNESFSDVFGYFNDTEDWDIGEDITVSQPALRSLSNPTKYGQPDNFKNYKNLPNTDA⑶YGGVHTNS GIPNKAAYNTITKIGVNKAEQIYYRALTVYLTPSSTFKDAKAALIQSARDLYGSQDAASVEAAWNAVGL(SEQ ID NO 2)成熟NprE序列如SEQ ID N0:3所示。使用該序列作為製備本文所述變體文庫的
■石出。AATTGTGTTLKGKTVSLNISSESGKYVLRDLSKPTGTQIITYDLQNREYNLPGTLVSSTTNQFTTSSQ RAAVDAHYNLGKVYDYFYQKFNRNSYDNKGGKIVSSVHYGSRYNNAAWIGDQMIY ⑶⑶ GSFFSPLSGSMDVTAHE MTHGVTQETANLNYENQPGALNESFSDVFGYFNDTEDWDIGEDITVSQPALRSLSNPTKYGQPDNFKNYKNLPNT DA⑶YGGVHTNSGIPNKAAYNTITKIGVNKAEQIYYRALTVYLTPSSTFKDAKAALIQSARDLYGSQDAASVEAA WNAVGL(SEQ ID NO 3)使用兩條特異性引物01igoAB1740 :CTGCAGGAATTCAGATCTTAACATTTTTCCCCTATC ATTTTTCCCG(SEQ ID NO 4)和 01igoAB1741 :GGATCCAAGCTTCCCGGGAAAAGACATATATGATCAT GGTGAAGCC (SEQ ID NO :5)，通過PCR從解澱粉芽孢桿菌染色體DNA擴增nprE基因而構建 pUBnprE表達載體。在熱循環儀中用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes)進行PCR。PCR混合物含 有 10 ill 5 X 緩衝液(Finnzymes Phusion) ,1 U 1 10mM dNTPsU. 5u 1 DMS0、1 ii 1 每種弓丨 物、liil Finnzymes Phusion DNA 聚合酶、1 ii 1 染色體 DNA 溶液 50ng/ii 1，34. 5 ii 1 MilliQ 水。使用以下PCR方案PCR 方案1)98°C30 秒；2) 98 °C 10 秒；3) 55 °C 20 秒；4)72°C1 分鐘;5)步驟2至4進行25個循環；和6) 72 °C 5 分鐘。該PCR產生1. 9kb DNA片段，該片段用Bglll和Bell DNA限制性酶消化。多拷貝 芽孢桿菌載體 pUB110(見例如 Gryczan, J Bacterid, 134 =318-329,1978)用 BamHl 消化。 隨後在pUBllOxBamHI載體中連接PCR片段xBglllxBclI以形成pUBnprE表達載體。將 pUBnprE 轉化至枯草芽孢桿菌(A aprE，A nprE, oppA, AspoIIE, degUHy32, AamyE: : (xylR, pxylA-comK)菌株。如W0 02/14490 (其在此引入作為參考)描述進行枯 草芽孢桿菌轉化。在含有具20mg/L新黴素的25mlMBD培養基(基於M0PS的確定成分培養 基)的搖瓶中使攜帶PUBnprE載體的枯草芽孢桿菌轉化體進行選擇性生長。基本上如本領 域已知那樣(見Neidhardt等人，J Bacterid, 119 :736_747，1974)製備MBD培養基，但是 基礎培養基不含NH4Cl2、FeS04和CaCl2，使用3mM K2HP04並且該基礎培養基補充有60mM脲、75g/L葡萄糖和大豆腖。另外，將該微營養物製備為1升中含有400mg FeSO4. 7H20、IOOmg MnSO4. H2O> IOOmgZnSO4. 7H20、50mg CuCl2. 2H20、IOOmg CoCl2. 6H20、IOOmgNaMoO4. 2H20、IOOmg Na2B4O7. IOH2OUOml IM CaCl2和IOml 0. 5M檸檬酸鈉的100X貯存液。培養物在37°C於溫箱 /搖床(Infors)中孵育3日。該培養導致具有蛋白酶解活性的分泌性NprE蛋白酶的產生， 如通過蛋白酶測定法證實的那樣。使用NuPage Novex 10% Bis-Tris凝膠(Invitrogen， 目錄號NP0301B0X)進行凝膠分析。為製備分析用樣品，2體積上清液與1體積IM HC1、1體 積4XLDS樣品緩衝液(Invitrogen，目錄號NP0007)和1 % PMSF(20mg/ml)混合。隨後在 70°C加熱該樣本10分鐘。然後，將25 μ L每份樣 品連同IOyL SeeBlue plus 2預染蛋白 質標準品(Invitrogen，目錄號LC5925) —起上樣到凝膠上。結果清晰地證明本實施例中描 述的nprE克隆策略適合在枯草芽孢桿菌中產生有活性的NprE。實施例3位點評價文庫(SEL)的產生在本實施例中，描述了用於構建nprE SEL的方法。nprE SEL的產牛-方法I 含有上文所述nprE表達盒的pUBnprE載體充當模板DNA。該載體含有在位點評價 文庫構建中使用的獨特的BglII限制性位點。簡而言之，為構建nprE位點評價文庫，進行 3個PCR反應，包括在成熟nprE DNA序列中導入目的突變密碼子的2個誘變PCR和用來融 合這兩個誘變PCR以構建pUBnprE表達載體的第三PCR，其中所述pUBnprE表達載體在成熟 nprE序列中包括期望的突變密碼子。誘變的方法基於密碼子特異的突變方法，其中使用包含專門設計的三聯體DNA序 列NNS(N = A、C、T或G ；並且S = C或G)的長度25至45個核苷酸的正向和反向寡核苷 酸引物進行在特定DNA三聯體中一次產生全部可能的突變，其中所述NNS與待突變密碼子 的序列相對應，並且確保在這個特定nprE成熟密碼子處隨機摻入核苷酸。引物名稱中列出 的數字對應於特定nprE成熟密碼子位置。包括評價的多重位點。示例性引物序列表在WO 2007/044993中描述，其在此引入作為參考。用來構建位點評價文庫的兩條額外引物含有BglII限制性位點連同兩側有BglII 限制性位點的一部分pUBnprE DNA序列。這些引物由Invitrogen生產(50nmole規格，脫 鹽)pUB-BglII-FWGTCAGTCAGATCTTCCTTCAGGTTATGACC(SEQ ID NO 6)；和 pUB-Bglll-RV G TCTCGAAGATCTGATTGCTTAACTGCTTC(SEQ IDNO 7)。每個SEL的構建始於使用pUB-BglII-FW引物和特異性nprE反向誘變引物的兩個 初級PCR擴增。對於第二 PCR，使用pUB-BglII-RV引物和特異性nprE正向誘變引物(對於 正向和反向誘變引物，nprE成熟密碼子位置相同)。所述突變在成熟nprE序列中的導入使用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes ； 目錄號F-530L)進行。全部PCR根據隨同該聚合酶提供的Firmzymes方案進行。對於初級 PCR的PCR條件是對於初級PCR 1 pUB-Bglll-FW引物和特異性NPRE反向誘變引物-兩者均1 μ L(10 μ M)；對於初級PCR 2 pUB-Bglll-RV引物和特異性NPRE正向誘變引物-兩者均1 μ L(10 μ M)；
以及5 XPhusion HF 緩衝液 IOyLIOmM dNTP 混合物1 μ L Phusion DNA 聚合酶 0. 75 μ L (2 單位 / μ L)DMSO, 100%1 μ LpUBnprE 模板 DNA1 μ L (0. I-Ing/ μ L)高壓滅菌蒸餾水直至50 μ LPCR 程序是98°C 30 秒，30x (98°C 10 秒，55°C 20 秒，72°C 1. 5 分鐘)和 72°C 5 分 鍾，在PTC-200Peltier熱循環儀(MJ Research)中進行。所述PCR實驗產生大約2至3kB 的2個片段，其具有目的NprE成熟密碼子周圍約30個核苷酸鹼基的重疊。在第三PCR反 應中使用前述這兩個片段以及正向和反向BglII引物來融合所述片段。該融合PCR反應在 以下溶液中實施pUB-Bglll-正向引物和 pUB-Bglll-反向引物-均 1 μ L(10 μ Μ)，以及5 XPhusion HF 緩衝液 IOyLIOmM dNTP 混合物1 μ LPhusion DNA 聚合酶 0. 75 μ L (2 單位 / μ L)DMSO, 100%1 μ L初級PCR 1反應混合物 1 μ L初級PCR 2反應混合物 1 μ L高壓滅菌蒸餾水直至50 μ LPCR 融合程序如下98 V 30 秒，30χ (98 °C 10 秒，55 V 20 秒，72 °C 2:40 分鐘)禾口 72°C 5 分鐘，在 PTC-200Peltier 熱循環儀(MJ Research)中進行。擴增的線性6. 5Kb片段使用Qiaquick PCR純化試劑盒(Qiagen，目錄號28106)進 行純化並用BgIII限制酶消化以在該融合片段的兩側產生粘性末端-35 μ L純化的線性DNA片段-4 μ L REACT 3 緩衝液(Invitrogen)-1 μ L BglII，10 單位 /ml (Invitrogen)反應條件1小時，30°C。連接經BglII消化並使用Qiaquick PCR純化試劑盒(Qiagen，目錄號28106)純化 的片段產生了含有所期望突變的環狀和多聚DNA -30 μ L純化的BglII消化的DNA片段-8 μ L T4DNA 連接酶緩衝液(Invitrogen 目錄號 46300_018)-IyL T4DNA 連接酶，1 單位/μ L(Invitrogen 目錄號 15224-017)反應條件16_20小時，在16°C。隨後，將連接混合物轉化到枯草芽孢桿菌(AaprE，AnprE, ορρΑ, Δ spoIIE， degUHy32, Δ amyE: : (xylR，pxylA-comK)菌株中。如 W002/14490 (在此引入作為參考)描 述的那樣進行枯草芽孢桿菌轉化。對於每個文庫，挑取96個單克隆並在含新黴素和1. 25g/ L酵母提取物的MOPS培養基中培養用於序列分析(BaseClear)和篩選目的。每個文庫包括 最多19個nprE位點特異性變體。
通過在37°C在96孔MTP中的含20mg/L新黴素和1. 25g/L酵母提取物的MBD培養 基中培育枯草芽孢桿菌SEL轉化體68小時，產生了所述變體。nprE SEL 的產牛-方法 II還描述了產生nprE SEL的備選方法。這些方法適合產生其他目的酶的SEL。如上 所述，含有nprE表達盒的pUBnprE載體充當用於產生nprESEL和NprE變體的模板DNA來 源。這兩種方法之間的主要不同在於本方法需要使用互補性定點誘變引物進行 完整載體的 擴增。MM含有pUBnprE載體的芽孢桿菌菌株Qiagen Plasmid Midi Kit(Qiagen 目錄號 12143)即用型-Lyse溶菌酶(Epicentre 目錄號 R 1802M)dam 甲基化酶試劑盒(New England Biolabs 目錄號 M0222L)Zymoclean 凝膠 DNA 回收試劑盒(Zymo Research 目錄號 D4001)nprE定點誘變引物，IOOnmole規格，5，磷酸化的，PAGE純化的(Integrated DNA Technologies)QUIKCHANGE 多位點定點誘變試劑盒(Stratagene目錄號200514)MJ Research PTC-200 Peltier WM^iX (Bio-Rad Laboratories)1. 2%瓊脂糖 E-凝膠(Invitrogen 目錄號 G5018-01)TempliPhi 擴增試劑盒(GE Healthcare 目錄號 25-6400-10)枯草芽孢桿菌感受態細胞(AaprE，AnprE,ορρΑ，Δ spoIIE, degUHy32, Δ amyE(xylR, pxylA-comK)方法為獲得含有一個突變的pUBnprE質粒(通過如上文實施例3中和W02007/044993 中所述的nprE SEL篩選法鑑定的，所述專利申請在此引入本文作為參考)，使用每種目的 芽孢桿菌菌株的單克隆來接種5ml LB+10ppm新黴素試管(例如起子培養物)。該培養物 在37°C培育，以225轉/分鐘振搖6小時。然後，IOOml新鮮LB+10ppm新黴素用Iml起子 培養物接種。該培養物在37°C培育過夜，以225轉/分鐘振搖。在這次孵育後，通過充分離 心以提供細胞沉澱來收集細胞沉澱。該細胞沉澱重懸於IOml緩衝液Pl (Qiagen Plasmid Midi試劑盒)中。隨後，添加10 μ 1即用型-Lyse溶菌酶至重懸的細胞沉澱並在37°C溫育 30分鐘。使用造成細胞培養物容積增加的IOml緩衝液P2和P3繼續進行QiagenPlasmid Midi試劑盒方案。從芽孢桿菌分離含有單一 nprE突變的每種pUBnprE質粒後，測定每種 質粒的濃度。所述質粒隨後使用dam甲基化酶試劑盒(New England Biolabs)按照製造商 的說明書進行dam甲基化，以甲基化每管大約2 μ g的每種pUBnprE質粒。使用Zymoclean 凝膠DNA回收試劑盒來純化和濃縮dam-甲基化的pUBnprE質粒。隨後定量dam-甲基化 pUBnprE質粒並將其稀釋成每種質粒的50ng/μ 1工作濃度。分別為每個反應製備混合的 定點誘變引物。例如，使用PUBnprE T14R質粒作為模板來源，混合的定點誘變引物管將含 有 10 μ 1 的 nprE-S23R、10 μ 1 nprE_G24R、10 μ 1 nprE-N46K 和 10 μ 1 nprE_T54R(全部引 物均為10 μ Μ)。使用QuikChange多位點定向誘變試劑盒(Stratagene)按照照製造商的 說明書進行PCR反應(例如，1 μ 1含有一個突變的dam甲基化pUBnprE質粒(50ng/ μ 1)、2μ 1 nprE 定點誘變引物(10μΜ)、2·5μ1 IOXQuikChange Multi 反應緩衝液、1 μ 1 dNTP 混合物、1 μ 1 QuikChange Multi酶混合物(2. 5U/ μ 1)和17. 5μ 1高壓滅菌的蒸餾水以產 生總計25 μ 1反應混合物。使用以下條件擴增nprE變體文庫95°C，1分鐘(僅第1循環)， 隨後95°C 1分鐘，55°C 1分鐘，65°C 13. 5分鐘並且重複循環29次。反應產物在4°C貯存過 夜。隨後，該反應混合物進行Dpni消化處理(由QUIKCHANGE 多位點定向誘變試 劑盒供應)以使用製造商方案(即1.5μ1 DpnI限制性酶添加至每個管並在37°C溫育3小 時；2 μ 1經DpnI消化的PCR反應物隨後在1. 2% E-凝膠上分析以確保PCR反應運行和親 代模板被降解)消化親代pUB-nprE質粒。隨後使用製造商方案(即對於約Ilyl總反應， 1 μ 1經DpnI處理的QuikChange多位點定向誘變PCR,5 μ 1 TempliPhi樣品緩衝液、5 μ 1 TempliPhi反應緩衝液和0. 2μ 1 TempliPhi酶混合物；在30°C溫育3小時；該TempliPhi反 應通過添加200 μ 1高壓滅菌的蒸餾水進行稀釋並短暫渦旋混合)進行TempliPhi滾環擴 增來產生大量的DNA，以增加nprE多重變體文庫的大小。隨後，將1. 5 μ 1稀釋的TempliPhi 物質轉化到枯草芽孢桿菌感受態細胞中，並且使用LA+10ppm新黴素+1. 6%脫脂乳板選擇 nprE多重變體。挑取菌落並隨後對其測序以鑑定不同的nprE變體文庫組合。集成的DNA技術(Integrated DNA Technologies)合成全部用於誘變的引物 (IOOnmole規格，5，-磷酸化和PAGE純化)。評價的位點包括:4、12、13、23、45、49、50、54、 59、60、65、82、90、110、119、128、129、130、135、136、137、138、139、140、151、152、155、179、 190、197、198、199、204、205、214、216、217、218、219、220、221、222、224、243、244、260、261、 263、265、269、273、282、285、286、289、293、296、297 和 299。示範性的誘變引物描述於 WO 2007/044993，其在此引入作為參考。實施例4變體蛋白酶的表達、發酵和純化本實施例描述了用來表達、發酵和純化前述實施例的經轉化枯草芽孢桿菌的蛋白 酶的方法。中性金屬蛋白酶重組枯草芽孢桿菌通過常規分批發酵法在營養培養基中培養。使用一個甘油小管 的枯草芽孢桿菌培養物(含有解澱粉芽孢桿菌中性金屬蛋白酶或其變體)來接種600ml含 有200mg/L氯黴素的SBG 培養基。所述培養物在37°C培育36-48小時。所應用的備選 方法包括在35°C在確定組分的培養基中培養重組枯草芽孢桿菌60小時。隨後，如本領域已 知，通過在12，000轉/分鐘離心回收培養液(SORVALL 離心機型號RC5B)。從培養 液分離所述分泌性中性金屬蛋白酶並使用具有BES (聚醚碸)IOkDa截斷值的Amicon過濾 系統8400濃縮大約10倍。濃縮的上清液在4°C對含有ImM CaCl2的pH 5. 4的25mM MES緩衝液透析過夜。透 析物隨後加載到陽離子交換柱Poros HS20 (總體積約83mL的Applied Biosystems柱；結 合容量約4. 5g蛋白質/mL柱；水)上。該柱用含有ImM CaCl2的pH 5. 4的25mM MES緩衝 液預先平衡。應用從 25mM MES、pH 5. 4、lmM CaCl2 至 50mM MES、pH 6. 2、2mM CaCljP IOOmM NaCl的pH和鹽梯度洗脫結合的 蛋白質。蛋白質洗脫在pH 5. 8和6. 0之間進行。將純化 的蛋白質濃縮並緩衝液交換至含有2mM CaCl2和40%丙二醇的pH5. 8的25mM MES緩衝液 中。通過測量蛋白酶解活性和通過10% (w/v) NU-PAGE Novex SDS-PAGE(InvitrogenCorp.)評估製備物的純度，並且發現純度大於95%。實施例5鑑定NprE蛋白酶的檸檬酸鹽誘導的自溶位點在這一實施例中，描述了用於評估檸檬酸鹽誘導的野生型和重組變體NprE自溶 的方法。在這些實驗中，應用檸檬酸納(Sigma)誘導來自解澱粉芽胞桿菌的中性金屬蛋白 酶(在枯草芽胞桿菌中表達的天然和重組變體)的自溶作用。通過在(i)在25mM MES，pH 6. 5中4°C，或(ii)5mM HEPES pH8. 0中室溫進行反應從而控制自溶過程。在這些實驗中， 通過使(a)在IOmM檸檬酸鹽中的溫育時間(0-120分鐘)，或(b)歷時100分鐘的檸檬酸鹽 濃度(IO-IOOmM)不同而優化0.4mg/ml NprE的自溶作用。在相似的條件下溫育僅稀釋於 緩衝液(即，沒有檸檬酸鹽)的中性金屬蛋白酶對照。應用合成肽(Abz-AGLA-Nba)測量剩 餘的蛋白酶活性，並相對於其本身無檸檬酸鹽的對照進行計算。如圖IA所示，中性金屬蛋白酶NprE在檸檬酸鹽的存在下失活，其中所述的檸檬酸 鹽是弱的鈣螯合劑。在100-250mM檸檬酸鹽的存在下，以及在不存在鈣的情況下，當在室溫 溫育5分鐘時，野生型中性金屬蛋白酶的活性降低到少於30%。這一通過檸檬酸鹽對蛋白 酶的失活通過滴加氯化鈣而克服。此外，在2mM氯化鈣的存在下，野生型中性金屬蛋白酶完 全穩定並具酶活性。這一結果證實鈣而非鋅的減損是導致NprE在檸檬酸鹽的存在下不穩 定的原因。在4°C進行的自溶反應通過添加等體積的IN HCl而終止。應用TCA沉澱樣本，洗 滌沉澱，並應用丙酮乾燥。將得到的沉澱重懸於20 μ L緩衝液(pH 6.5)和4XLDS樣本緩 衝液(NuPage，Invitrogen)。通過10% (w/v) SDS-PAGE分開自溶片段並電印跡至PVDF膜。 通過Edman降解(ArgoBioanalytica)測序前10個胺基酸殘基，並顯示於表5_1。應用胰 蛋白酶凝膠內消化確定自溶片段的部分胺基酸序列，並應用LCQ-MS(Agilent)分析。凝膠 內消化過程包括浸軟含有蛋白質的凝膠塊，移除考馬斯藍染色，隨後在含有2M尿素的25mM NH4CO3中再水合凝膠塊。加入胰蛋白酶至經再水合的凝膠塊中，在37°C歷時約6小時。消 化後，應用乙腈和TCA提取肽。應用乙腈-水梯度在C4-疏水柱(Vydac)分離肽。應用 SEQUEST 資料庫檢索程序針對含有Genencor酶的資料庫檢索得到的肽圖譜。將每一 片段前10個胺基酸的胺基酸序列與已知的解澱粉芽胞桿菌NprE胺基酸序列進行比較。這 使得能夠鑑定N端的胺基酸序列，並因此鑑定NprE中的切割位點。在4°C在增加濃度的檸檬酸鹽的存在下研究檸檬酸鹽對野生型中性蛋白酶的自溶 作用，如圖IB所示。在用IOmM檸檬酸鹽溫育90分鐘後，觀察到除剩餘完整NprE之外的兩 個初級自溶片段(泳道1)。完整NprE的分子量為約32kDa，而初級自溶片段為約24kDa及 9kDa大小。檸檬酸鹽增加至IOOmM濃度導致進一步的自溶以及產生其它的次級自溶片段 (泳道4-7)。對增加的檸檬酸鹽特異性地，24kDa的自溶片段進一步水解，產生3個更小的 21kDa、15kDa 及 IlkDa 的片段。通過Edman降解鑑定片段的N端 (圖2)。片段1、3和4都具有天然的N端序列， 而片段2和5具有獨特的N端。片段2是有爭議的，N端的開始處是在或接近D220、A221 和G222。基於15kDa片段的大小推導其C端，並且其在或接近位置L198。凝膠內胰蛋白酶 消化和LCQ-MS證實了這些自溶片段的身份。基於NprE切割片段的N端和LCQ-MS分析，初 級切割位點被鑑定為在胺基酸位置M138、L198、D220、A221和G222處。
__表5-1. NprE自溶片段的N-端序列_ 實施例6對檸檬酸鹽誘導的自溶具抗性的NprE變體的產生這一實施例描述了篩選在鈣螯合劑的存在下具有改善的穩定性的NprE變體。應 用實施例3以及在WO 2007/044993(在此全文引入作為參考)中描述的基因構建體和 測序方法針對初級切割位點M138、L198、D220、A221和G222，以及鄰近這些位點和/或 在酶表面的胺基酸進行誘變。製備了 S129、F130、M138、V190和D220的位點評價文庫， 其中在該文庫中由19種備選胺基酸殘基之一分別地替換天然存在的胺基酸殘基。同 樣，構建 了二重(M138L-D220P ；F130L-D220P、S129I-D220P、V190I-D220P、S129I-V190I、 S129V-V190I、S129V-D220P)、三重(M138L-V190I-D220P、S129I-F130L-D220P)和五重 (S129I-F130L-M138L-V190I-D220P)胺基酸替換變體。在50mM檸檬酸鈉的存在或不存在下篩選NprE SEL成員。所使用的緩衝 液是含有0. ImM CaCl2的25mM HEPES, pH 8. 0。應用琥珀醯化-酪蛋白/TNBSA方 法(Pierce, Inc. Rockford, IL)或螢光標記的 Abz-AGLA-Nba 肽測定法(Vriend 等， J Biol Chem, 255 =3482-3486,1980)測量蛋白酶活性。所應用的分光光度計是 SpectraMax M2e(MolecularDevices)，並且所有的測定法都是在介質蛋白酶結合的96孔板 (CorningInternational)中進行的。在室溫溫育60分鐘後對4個重複計算殘餘蛋白酶活 性。相對於野生型NprE的觀察結果歸一化這些值。選擇對檸檬酸鹽顯示出增加的穩定性 (相對於野生型)的各個變體蛋白質，用於進一步分析特徵。應用DMC/TNBSA端點測定法針 對NprE SEL 138 (自溶位點)、190 (表面暴露位點)和220 (自溶位點)的代表性檸檬酸鹽 篩選數據顯示於表3。類似地，通過針對合成的肽測量蛋白酶活性以及通過SDS-PAGE分 析評估單(S129I/L、F130L、M138I/L、V190I、D220P/E)、二 重(S129I-V190I、 S129V V190I、M138L-D220P、S129I-D220P、F130L-D220P、V190I-D220P 禾Π S129V-D220P)、三重(S129I-F130L-D220P 和 M138L-V190I-D220P)以及五重 (S129I-F130L-M138L-V190I-D220P)NprE變體的檸檬酸鹽穩定性。檸檬酸鹽篩選數據表明通過Leu替換M138、通過Pro或Glu替換D220、通過Ile或Leu替換S129、通過Leu替換 F130以及通過Leu或Ile替換V190產生對檸檬酸鹽誘導的自溶較不敏感的蛋白酶。選擇的中性蛋白酶變體對檸檬酸鹽濃度依賴的穩定性顯示於圖4A。當在室溫在 IOOmM檸檬酸鹽的存在下溫育時，單胺基酸替換變體S129I/V、M1381/L和D220E/P產生比 野生型蛋白高20-30%的剩餘活性。在室溫在IOOmM檸檬酸鹽中溫育60分鐘後，V190I 顯示出最高的剩餘活性( 60%)。這些突變的組合證實了加成性。最對檸檬酸鹽穩 定的變體是5個單個突變的組合，即S129I-F130L-M138L-V190I-D220P。這一五重變體 S129I-F130L-M138L-V190I-D220P在IOOmM的檸檬酸鹽中150分鐘後保留其所有的活性， 並且其改進的穩定性得到了不存在自溶片段的證實，如通過SDS-PAGE所觀察到的那樣。具 體而言，將在增加濃度的檸檬酸鹽的存在下野生型NprE的自溶模式特徵(泳道1-4)與 S129I-F130L-M138L-V190I-D220P不存在自溶(泳道6_10)相比較，如圖4B所示。在IOOmM 檸檬酸鹽的存在下在室溫溫育60分鐘後，野生型NprE和變體中性金屬蛋白酶的剩餘活性 百分數顯示於圖6，清楚地表明了單個替換對自溶抗性的加成性。實施例7差異掃描量熱法(DSC)應用超靈敏高通量微熱量計VP-Cap DSC (MicroCal，Inc.，Northampton, ΜΑ)測量 過量熱容曲線。需要約50(^1^ 200-至-400 111蛋白質。一般地，在20至100°C的溫度範 圍內掃描400ppm NprE和變體金屬蛋白酶(在存在和不存在130mM檸檬酸鹽的情況下)。 然後再掃描相同的樣本，以檢查該過程的可逆性。對於中性蛋白酶，熱解摺疊過程是不可逆 的。所應用的緩衝液是5mM HEPES，pH 8. 0。以25至200°C /小時的掃描率評估NprE熱熔 點的掃描率依賴數據。最終選擇200°C /小時的掃描率以最小化可產生自聚集或自溶的任 何人工現象。將DSC曲線的熱中點(Tm)用作熱穩定性的指標。440-ppm野生型中性蛋白酶 展示69.2 士 0.5°C的熱熔點(Tm)。野生型和NprE變體的熱熔點顯示於圖6，其顯示在不存 在檸檬酸鹽的情況下，突變對熱熔點僅有極微的影響。相反，突變體NprE在檸檬酸鹽存在下的熱解摺疊顯示出與野生型NprE很大的不 同(圖6)。在130mM檸檬酸鹽(pH 8.0)的存在下，對野生型蛋白質沒有獲得熱解摺疊樣 式。這與其快速和完全的檸檬酸鹽誘導的自溶和失活相一致。相比之下，所有對檸檬酸鹽 穩定的變體顯示出熱解摺疊樣式。野生型NprE和變體的熱解摺疊中點顯示於圖5B。在 130mM檸檬酸鹽的存在下，應用DSC表徵的檸檬酸鹽最不穩定的變體具有48°C的熱熔點，以 及最穩定的單變體具有52°C的熱熔點(圖6)。對檸檬酸鹽穩定的替換顯示出加成性，並且 在S129I-F130L-M138L-V190I-D220P變體的蛋白酶骨架上5個點突變的組合具有59. 2°C的 Tm。因此，5個改進突變的組合導致Tm增加了 10°C (圖5和6)。匯總這些結果，表明在檸 檬酸鹽的存在下，對檸檬酸鹽誘導的自溶的抗性和熱穩定性之間存在聯繫。實施例8NprE的同源性建模
這一實施例描述了基於蠟樣芽孢桿菌(B. cereus)NprE的已知結構，對解澱粉芽 胞桿菌NprE的結構進行建模，其中解澱粉芽胞桿菌NprE與所述的蠟樣芽孢桿菌NprE是 45%同一的。此外，還應用微PIXES分析確認NprE的化學計量和鋅及鈣結合。應用這一模 型鑑定NprE可能暴露於溶劑的胺基酸。
用於序列分析、比對和建模的結構的坐標從PDB中下載。解澱粉芽胞桿菌NprE的 蛋白質序列在Swissprot No. P06832中找到，並且成熟形式的序列如SEQ ID NO 3所示。 應用程式組MOE(Chemieal ComputingCorp Montreal,Canada)根據該程序提供的手冊進行 比對計算和手工再校正、分析和建模。選擇Charmm27參數設置用於能量最小化計算。
來自蠟樣芽孢桿菌(B. cereus) (INPC)、熱溶蛋白芽孢桿菌 (B. thermoproteolyticus) (PDB ID 1KEI)、銅綠假單胞菌(P. aeruginosa) (IEZM)和金黃色 葡萄球菌(S. aureus) (IBQB)的鋅中性蛋白酶的結構是可獲得的。這些結構中與解澱粉芽 胞桿菌NprE的成熟蛋白酶結構域最密切同源的是蠟樣芽孢桿菌NprE，其用作用於建模的 模板結構。結構上對它們進行比對。序列比對的比較揭示了在解澱粉芽胞桿菌NprE序列 和蠟樣芽孢桿菌NprE序列之間的許多插入和缺失。對比對的檢查揭示了在兩者中很可能 的錯誤，並且手工調整比對。與模板INPC結構相比，解澱粉芽胞桿菌NprE在環上具有4個 殘基的缺失，其中預測兩個Ca2+與蛋白質結合。這導致了對這一非常重要區域的建模的最 初的困難。幸運地是，與解澱粉芽胞桿菌NprE具有相同的金屬結合化學計量的金黃色葡萄 球菌NprE在這一環中具有同一的缺失。這允許使用金黃色葡萄球菌NprE結構以引導在這 一區域的手工重建，以更精確地建模Ca2+與該酶的結合。儘管試圖能量最小化該模型，但對 於鋅和鈣結合位點得到很差的結果。因此，在能量最小化過程中使金屬離子以及它們的配 體保持固定。沒有將水分子添加到這一模型中。解澱粉芽胞桿菌NprE同源性模型含有成熟酶的300個殘基。最終模型的 Ramachandron標繪圖揭示了三個外露胺基酸。它們是S23、N61和S191。暴露於表面的殘基 的分析顯示在表面的8個脂肪族或芳香族殘基。它們是Y49、L55、1117、F130、V190、L216、 V260和L282。這些殘基在表面暴露環中，其中所述環通常是應用同源性建模方法最不精確 建模的區域，並且可能表明該模型中最不可靠的區域。解澱粉芽胞桿菌NprE酶的N端部分含有8個鏈混合的β片層，其圍住了長螺旋 約75%的表面。該酶C端部分主要由6個螺旋束和2個反向平行β-片層短鏈組成。發現 該酶的活性部位在這兩個亞結構域之間的界面上。底物結合裂口非常大並且是開放的，其 與所觀察到的內蛋白酶活性相一致。在底物裂口的中間發現了催化中很重要的Zn2+離子。模型預測Η143、Η147和Ε167 結合這一 Zn2+離子，其具有四面體幾何形狀。在嗜熱菌蛋白酶中，第四種配體是水，但是沒 有將水添加到解澱粉芽胞桿菌NprE同源性模型中。殘基D139、D178、Ε180、D181、Ε186和 D197形成了雙鈣位點。該模型的CA351與D139、D178、D181和Ε186的側鏈、以及D183主 鏈羰基複合。該模型的CA352與D178、Ε180、D181和Ε187的側鏈複合。D178的側鏈也與 CA352接近，但是從該模型不清楚其是否與這一離子配位。為測試解澱粉芽胞桿菌NprE的金屬離子化學計量預測，進行微顆粒誘導的X光發 射(微-ΡΙΧΕ)光譜學以經驗地確定鋅和鈣含量。僱用University of Surrey Ion Bean Centre (Guildford, United Kingdom)進行 PIXES 分析。如表 8-1 所示，Zn2+ 的觀察化學計 量是1. 02，以及Ca2+的是1. 62。如果假設兩個預測的Ca2+離子中的一個或兩個是部分地佔 用，則該分析與預測的一致。Zn2+和Ca2+結合親和力的確定顯示Zn2+比Ca2+的結合更緊密 10倍，這與在PIXE樣本中觀察到的Ca2+的輕微損失相一致。_表8-1.解澱粉芽胞桿菌NprE的微PIXE分析_ 實施例9 pH依賴的活性和穩定性評估A.野生型NprE和變體NprE的pH依賴的活性應用MES —水合物、Trizma鹼和醋酸鈉(全來自Sigma)的組合製備不同的pH緩 衝液。在緩衝液中各組分的終濃度是25mM醋酸鹽、50mMMES和25mM Tris0應用氫氧化鈉或 氯化氫將該緩衝液的pH調節至9. 40,8. 69,8. 36,7. 70,7. 45,6. 52,6. 00,5. 45,4. 78和 4. 27 的最終PH值。將AGLA底物(American Peptide Company)溶解於DMF中，濃度是4. 8mM。 製備在每一緩衝液中不同濃度的AGLA底物，使得最終的AGLA濃度是0. 096mM、0. 048mM、 0. 024mM、0. 012mM 和 0. 006mM。將200 μ 1每一底物濃度的每一 pH緩衝液加入到一個96孔板中，往每一孔加入 10 μ 1 0. 94 μ g/ml純化的NprE或變體，然後振蕩該板15秒。在350nm的激發和415的發 射處應用板讀數器(Molecular dynamics)監測來自每一孔的螢光，每11秒讀數一次，歷時 5分鐘。記錄每一曲線的Vmax (最大線性斜率)。Vmax對AGLA底物濃度的繪圖產生Kcat/ Km，基於曲線斜率和在底物中的最終酶濃度計算所述Kcat/Km。如圖8所示，野生型NprE和 五重 NprE 變體(S129I-F130L-M138L-V190I-D220P)均在 pH 6. 5 具有對 AGLA 底物的最佳 活性。B.野生型NprE和變體NprE的pH依賴的穩定性在不存在和存在2mM氯化鈣的情況下測試野生型NprE和五重NprE變體 (S129I-F130L-M138L-V190I-D220P ="Quint")在不同pH值時的穩定性。應用與如上所述 相同的不同PH值的緩衝液組，但還往每一緩衝液中加入0. 005% Tween 80以避免蛋白質與 96孔板結合。往一組緩衝液中加入2mM氯化鈣。加入純化的蛋白質，終濃度為10μ g/ml。 在96孔板中的總體積是200 μ 1/孔。在室溫(例如，23°C )溫育該板3小時。應用AGLA 測定法測量在不同PH時的每一蛋白質的活性。野生型NprE在pH 6.5最穩定，在低於或高 於6. 5的pH都觀察到穩定性的下降。在pH 4. 3，NprE喪失100%的活性。Quint在pH 5.5 至PH 9. 4的寬pH範圍內非常穩定。儘管在低於4. 7的pH時Quint的穩定性下降。然而， 添加2mM的氯化鈣在低pH和高pH時均穩定了 NprE和Quint變體這兩者。在本說明書中提到的所有專利和申請指示本發明所屬領域的普通技術人員的水 平。所有專利和申請均在此引入作為參考，就如同具體地指出每一申請並且個別地表明引 入作為參考的同樣的程度。然而，對任何出版物的引用都不能理解為承認其是關於本發明的現有技術。儘管描述了本發明的示範性實施方案，然而本領域技術人員顯而易見地是，可以 對公開的實施方案進行各種修飾，並且預期此類修飾在發明的範圍之內。
本領域技術人員輕易地認識到本發明充分地適應於實施所述目的並且獲得所提 及以及其中固有的結果和優勢。本文所述的組合物和方法是代表性的，並且不意圖作為對 本發明範圍的限制。本領域技術人員輕易地知道可以對本文公開的本發明進行各種替換和 修改而不脫離本發明的範圍和精神。本文中示範性描述的本發明可以在本文未具體公開的任意要素或諸要素、限制或 諸限制不存在的情況下實施。已經使用的術語和表述作為描述性而非限制性術語使用，並 且在使用此類術語和表述時不意圖排除所示或所述特徵或其部分的任意等同物，不而是承 認在要求保護的本發明範圍內可能存在多種修飾。因此，應當理解儘管本發明已經通過例 證性的實施方案和任選特徵具體地公開，但本領域技術人員可採取本文中公開的概念的修 飾和變化形式，此類修飾和變化被認為落入所附權利要求界定的本發明的範圍內。本發明已在本文中進行了廣泛和一般性地描述。屬於一般性公開內容的每個更小 種類和次級類屬組也形成本發明的部分。這包括用限制條款或否定性限制條件對本發明的 一般性描繪，其中所述的限制條款或否定性限制條件從所述類中排除任意主題物，無論所 排除的材料是否在本文中具體提及。
權利要求
分離的中性金屬蛋白酶變體，所述變體在金屬螯合劑的存在下與野生型中性金屬蛋白酶在所述金屬螯合劑的存在下相比具有改良的抗性。
2.權利要求1的分離的中性金屬蛋白酶變體，與野生型中性金屬蛋白酶的抗性相比， 其對檸檬酸鹽誘導的自溶具有改良的抗性。
3.權利要求1的分離的中性金屬蛋白酶變體，其中所述的變體是芽孢桿菌屬 (Bacillus)中性金屬蛋白酶變體。
4.權利要求3的分離的芽孢桿菌屬中性金屬蛋白酶變體，其中所述的變體具有在選自 等價於SEQ ID NO :3所示胺基酸序列的位置129、130、138、190和220中的3個、4個或5個 位置處包含替換的胺基酸序列。
5.權利要求4的分離的芽孢桿菌屬中性金屬蛋白酶變體，其中所述的替換包含選自 S129I/F130L/D220P、M138L/V190I/D220P 和 S129I/F130L/M138L/V190I/D220P 的多重突 變。
6.權利要求3的分離的芽孢桿菌屬中性金屬蛋白酶變體，其中所述的芽孢桿菌屬是解 澱粉芽胞桿菌(B. amyloliquefaciens)。
7.權利要求1的分離的中性金屬蛋白酶變體，其中所述的分離的中性金屬蛋白酶與包 含SEQ ID NO :3所示胺基酸序列的中性金屬蛋白酶具有至少約45%的胺基酸同一性。
8.編碼權利要求1的中性金屬蛋白酶變體的分離的核酸序列。
9.包含權利要求8的核酸序列的表達載體。
10.包含權利要求9的表達載體的宿主細胞。
11.權利要求1的分離的中性金屬蛋白酶變體，其中所述的變體包含SEQID NO 18(S129I/F130L/D220P)、SEQ ID NO 19 (M138L/V190I/D220P)禾Π / 或 SEQ ID NO: 20(S129I/F130L/M138L/V190I/D220P)所示的胺基酸序列。
12.包含權利要求1的分離的中性金屬蛋白酶變體的組合物。
13.權利要求12的組合物，還包含至少一種鈣離子和/或至少一種鋅離子。
14.權利要求13的組合物，還包含檸檬酸鹽。
15.權利要求12的組合物，其中所述的組合物是清潔組合物。
16.權利要求15的組合物，其中所述的組合物還包含至少一種選自蛋白酶、澱粉酶、月旨 肪酶、甘露聚糖酶、果膠酶、角質酶、氧化還原酶、半纖維素酶和纖維素酶的其它酶或酶衍生 物。
17.權利要求12的組合物，其中所述組合物包含至少約0.0001重量百分數的中性金 屬蛋白酶變體；或約0. 001至約0. 5重量百分數的中性金屬蛋白酶變體。
18.權利要求12的組合物，還包含至少一種附屬成分。
19.權利要求12的組合物，還包含足量的pH調節劑以給所述組合物提供約3至約5的 淨PH，所述組合物基本上沒有在約pH 3至約pH 5的pH水解的物質。
20.權利要求19的組合物，還包含至少一種表面活性劑。
21.權利要求20的組合物，其中所述表面活性劑是包含環氧乙烷部分的烷基硫酸鈉表 面活性劑。
22.權利要求1的組合物，其中所述組合物是液體。
23.權利要求12的組合物，其中所述組合物是動物飼料。
24.權利要求12的組合物，其中所述組合物是織物加工組合物和/或皮革加工組合物。
25.清潔方法，包括使表面和/或包含織物的物品與權利要求15的清潔組合物接觸的步驟。
26.權利要求25的清潔方法，還包括漂洗該表面和/或包含織物的物品的步驟。
27.產生中性金屬蛋白酶變體的方法，包括用包含編碼所述中性金屬蛋白酶變體的 核酸的表達載體轉化宿主細胞以產生轉化的宿主細胞；在適於產生所述中性金屬蛋白酶變 體的條件下培養所述經轉化的宿主細胞；和產生所述中性金屬蛋白酶變體。
28.權利要求27的方法，還包括收穫所述產生的中性金屬蛋白酶變體的步驟。
29.權利要求27的方法，其中所述的宿主細胞是芽孢桿菌屬物種。
30.權利要求29的方法，其中所述的芽孢桿菌屬物種是枯草芽孢桿菌(B.subtilis)。
全文摘要
本發明提供了包含至少一種中性金屬蛋白酶的方法和組合物，其中所述的中性金屬蛋白酶在金屬螯合劑的存在下具有改良的穩定性。在一些實施方案中，該中性金屬蛋白酶可用於清潔以及包含檸檬酸鹽的其它應用。在一些特別優選的實施方案中，本發明提供了包含變體中性金屬蛋白酶的方法和組合物，其中所述的變體中性金屬蛋白酶為經改造的以對檸檬酸鹽誘導的自溶具有抗性。
文檔編號C12N9/54GK101842481SQ200880114393
公開日2010年9月22日 申請日期2008年10月23日 優先權日2007年10月31日
發明者A·劉, A·肖, L·華萊士, R·W·J·奧姆斯 申請人:丹尼斯科美國公司