用於前列腺相關病症的診斷、預後和治療的基於微rna的方法和組合物的製作方法

2023-05-16 13:29:31 2

專利名稱：用於前列腺相關病症的診斷、預後和治療的基於微rna的方法和組合物的製作方法
用於前列腺相關病症的診斷、預後和治療的基於微RNA的方法和組合物
交叉參考相關申請
本申請要求2008年2月觀日提交的美國臨時申請61/067,518的權益，其全部公 開內容明確地通過引用合併入本文。
關於聯邦政府支助的研究的聲明
本發明是在NIH，National Cancer Institute, Center for Cancer Research 的內部研 究項目下由政府支助並且由National Institutes of Health基金CA081534和CAl28609支助進行的。政府在本發明中具有某些權利。
本發明的技術領域和工業適用性
本發明總地說來涉及分子生物學領域。本發明的某些方面包括在前列腺相關病 症的診斷、治療和預後中的應用。
發明背景
不承認本部分中公開的背景技術在法律上構成了現有技術。
來源於基因微陣列的表達特徵譜已為前列腺癌的生物學提供了新的認識。已使 前列腺腫瘤中的mRNA表達模式與Gleasan評分、侵襲性腫瘤亞型和疾病復發產生關聯 (1 ； 2)。此外，來源於原發性腫瘤的mRNA表達特徵(signature)已導致用於前列腺癌的 早期檢測的新型候選診斷標誌物例如a_甲基醯基-CoA消旋酶的發現(3)。此類發現證 明，已切除的腫瘤的基因表達特徵譜提供了鑑定前列腺癌的新型診斷和預後標誌物的可 能。
最近，已描述了稱為微RNA的新類型小RNA0)，發現其通過調控mRNA的 穩定性和mRNA至蛋白質的翻譯來調控mRNA功能(5 ； 6)。微RNA基因表達為稱為 pri-mRNA的大前體RNA，其可編碼以多順反子排列的多個微RNA(7)。此類前體通過細 胞核RNA酶III，Drosha以及細胞溶質RNA酶III，Dicer轉變成19至25個核苷酸的成 熟微RNA。這兩種酶和它們的輔因子例如DGCR8/:Pasha、TRBP和EIF2C2/argonaute_2 是微RNA加工活性的至關重要的組分。改變它們的表達水平可改變細胞功能和誘導細胞 轉化⑶。
已證明微RNA在癌症中的決定性作用(9)。它們的表達在實體人腫瘤中通常發 生改變(10-1 。微RNA表達特徵譜還通過發育譜系和分化狀態來分類腫瘤(10 ； 14)。 已顯示多個微RNA具有致癌性質(15-17)，或如腫瘤抑制基因一樣起作用(18 ； 19)。此 類微RNA稱為oncomiROO)。它們的表達的改變與癌症發生具有因果關聯。
儘管對治療此類疾病的療法進行了相當多的研究，但仍然難以有效地診斷和治 療它們，並且在患者中觀察到的死亡率表明，需要改進前列腺癌的診斷、治療和預防。
概述
在第一個廣泛的方面，本文中描述了診斷受試者是否具有前列腺相關病症或處 於發展前列腺相關病症的風險中，確定患有前列腺相關病症的受試者的預後和/或治療 患有前列腺相關病症的受試者的前列腺相關病症的方法，其包括測量來自受試者的測試樣品中至少一個生物標誌物的水平，其中相對於對照樣品中相應的生物標誌物的水 平，測試樣品中生物標誌物的水平的改變表示受試者患有所述病症或處於發展所述病症 的風險中。
在某些實施方案中，測試樣品中至少一個生物標誌物的水平低於對照樣品中相 應的生物標誌物的水平。
在某些實施方案中，測試樣品中至少一個生物標誌物的水平高於對照樣品中相 應的生物標誌物的水平。
在某些實施方案中，至少一個生物標誌物在腫瘤組織與非腫瘤組織之間差異表 達，並且為

圖11-表2中所列的一個或多個miR或其功能性變體。
在某些實施方案中，至少一個生物標誌物選自圖11-表2中所列的在前列 腺腫瘤中上調的一個或多個miR或其功能性變體miR-32、miR-182、miR_31、 miR-26a_l/2、miR_200c、miR-375、miR-196a_l/2、miR-370、miR-425、 miR-194-1/2、miR-181a_l/2、miR_34b、let_7i、miR-188, miR-25、miR_106b、 miR-449、miR_99b、miR-93、miR-92-1/2, miR_125a。
在某些實施方案中，至少一個生物標誌物選自圖11-表2中所列的在前列 腺癌中下調的一個或多個miR或其功能性變體miR_520h、miR-494、miR-490、 miR-133a_l、miR-1-2, miR-218-2、miR-220、miR_128a、miR-221、miR-499、 miR-329、miR-340、miR-345、miR-410、miR-126、miR-205、miR-7-1/2、 miR-145, miR_34a、miR-487、let_7b。
在某些實施方案中，至少一個生物標誌物與前列腺外疾病相關，並且選自 圖12-表3中所列的一個或多個miR或其功能性變體miR-101-1/2、miR_200a、 miR_200b、miR-196a-1/2, miR-30c_l/2、miR-484、miR_99b、miR-186, miR-195、 let-7f-2、miR_34c、miR-371、miR-373、miR-410 和 miR-491。
在某些實施方案中，至少一個生物標誌物顯示miR-1與前列腺腫瘤中靶基因轉 錄物水平之間的負相關，並且選自圖13A-表4A中所列的一個或多個基因或其功能性變 體。
在某些實施方案中，至少一個生物標誌物選自圖13B-表4B中所列的一個 或多個miR或其功能性變體miR-1、miR_31、miR-32、miR_128a、miR_133a、 miR_181a、miR-182、miR-194、miR_196a、miR_200c、miR-218-2, miR-220、 miR-329、miR-338、miR-369、miR-409_3p、miR-410、miR-448、miR-490、 miR-494、miR-499、miR_520h 和 let_7i。
在某些實施方案中，所述方法包括顯示與前列腺腫瘤中miR-181a呈負相關的探 針組，其中探針組包括圖14-表5中所列的一個或多個基因或其功能性變體。
在某些實施方案中，至少一個生物標誌物是雄激素應答生物標誌物，並且選 自圖15-表6中所列的一個或多個miR或其功能性變體miR-338、miR-126_5p、 mir-181b-l 簇、miR181c 簇、miR-219_5p 和 miR221 簇。
在某些實施方案中，至少一個生物標誌物選自圖16-表7中所列的一個或多個 miR 或其功能性變體miR-126、miR-146b> miR-146b> miR-18lb-1> miR-18lb-1> miR-181b_l、miR-181b_l、miR-181b_l、miR_181c、miR_181c、miR-219-1、miR-219-1、miR-219-1、miR-221、miR-221、miR-221、miR-221、miR-338、 miR-338。
在某些實施方案中，至少一個生物標誌物選自圖23-表9中所列的在前列 腺癌中在具有神經周浸潤(perineural invasion)的腫瘤中上調的一個或多個miR或其 功能性變體miR-224、miR-21、miR-10 (a/b) > miR_125b (-1/2)、miR_30a/b/ c-2/d、miR-100, miR-24 (-1/2)、miR-15a_2、miR-191、miR_99b、miR_27a/b、 miR-26a(_l/2)、miR-126, miR-145, miR-195、miR-181a_l、miR-199b> miR-151、 let_7g0
在某些實施方案中，至少一個生物標誌物在PNT腫瘤組織與非PNT腫瘤組織之 間差異表達，並且是圖24-表12中所列的一個或多個基因或其功能性變體。
在某些實施方案中，所述方法包括Dicer和DGCR8 (在前列腺腫瘤中)和/或 編碼argonuate-2的EIF2C2和Dicer(在具有高Gleason評分的腫瘤中)中的一個或多個的 增加的表達。
在某些實施方案中，樣品包括血液樣品。
在某些實施方案中，樣品包括血清或血漿血液樣品的一種或多種。
在另一個方面，本文中描述了生物標誌物，其包含至少一個在腫瘤組織與非腫 瘤組織之間差異表達的生物標誌物，並且是圖11-表2中所列的一個或多個miR或其功能 性變體。
在另一個方面，本文中描述了生物標誌物，其包含至少一個選自下列的生物標 志物圖11-表2中所列的在前列腺腫瘤中上調的一個或多個miR或其功能性變體 miR-32、miR-182、miR-31、miR-26a_l/2、miR_200c、miR-375、miR-196a-1/2, miR-370、miR-425、miR-194-1/2、miR-181a_l/2、miR_34b、let_7i、miR-188, miR-25、miR-106b> miR-449、miR_99b、miR-93、miR-92-1/2, miR_125a。
在另一個方面，本文中描述了生物標誌物，其包含至少一個選自下列的生物標 志物圖11-表2中所列的在前列腺腫瘤中下調的一個或多個miR或其功能性變體 miR_520h、miR-494、miR-490、miR-133a_l、miR-1-2, miR-218-2、miR-220、 miR_128a、miR-221、miR-499、miR-329、miR-340、miR-345、miR-410、miR-126, miR-205、miR-7-1/2, miR-145, miR_34a、miR-487、let_7b。
在另一個方面，本文中描述了生物標誌物，其包含至少一個與前列腺外疾病相 關且選自下列的生物標誌物圖12-表3中所列的一個或多個miR或其功能性變體 miR-101-1/2、miR_200a、miR_200b、miR-196a_l/2、miR-30c_l/2、miR-484、 miR_99b、miR-186, miR-195、let_7f_2、miR_34c、miR-371、miR-373、miR-410 和 miR-491。
在另一個方面，本文中描述了生物標誌物，其包含圖13A-表4A中所列的一個 或多個基因或其功能性變體。
在另一個方面，本文中描述了生物標誌物，其選自圖13B-表4B中所列的一 個或多個 miR 或其功能性變體miR-1、miR-31、miR-32、miR_128a、miR_133a、 miR_181a、miR-182、miR-194, miR_196a、miR_200c、miR-218-2, miR-220、 miR-329、miR-338、miR-369、miR-409_3p、miR-410、miR-448、miR-490、miR-494、miR-499、miR_520h 和 let_7i。
在另一個方面，本文中描述了生物標誌物，其包含在前列腺腫瘤中顯示與 miR-181a呈負相關的探針組，其中所述探針組包括圖14-表5中所列的一個或多個基因 或其功能性變體。
在另一個方面，本文中描述了生物標誌物，其包含至少一個為雄激素應答生物 標誌物並且選自下列的生物標誌物圖15-表6中所列的一個或多個miR或其功能性變 體miR-338、miR-126-5p, mir-181b_l 簇、miR181c 簇、miR-219_5p 和 miR221 簇。
在另一個方面，本文中描述了生物標誌物，其包含至少一個選自下列的生物標 志物圖16-表7中所列的一個或多個miR或其功能性變體miR-126、miR-146b> miR-146b> miR-18lb-l> miR-18lb-l> miR-18lb-l> miR-18lb-l> miR-18lb-l> miR_181c、miR_181c、miR-219-1、miR-219-1、miR-219-1、miR-221、miR-221、 miR-221、miR-221、miR-338、miR-338。
在另一個方面，本文中描述了生物標誌物，其包含至少一個選自下列的生物標 志物圖23-表9中所列的在前列腺癌中在具有神經周浸潤的腫瘤中上調的一個或多個 miR 或其功能性變體miR-224、miR-21、miR-10 (a/b) > miR_125b (-1/2)、miR_30a/ b/c-2/d、miR-100, miR-24 (-1/2)、miR-15a_2、miR-191、miR_99b、miR_27a/b、 miR-26a(_l/2)、miR-126、miR-145, miR-195、miR-181a_l、miR-199b> miR-151、 let_7g0
在另一個方面，本文中描述了生物標誌物，其包含至少一個在PNT腫瘤組織與 非PNT腫瘤組織之間差異表達並且是圖24-表12中所列的一個或多個基因或其功能性變 體的生物標誌物。
在另一個方面，本文中描述了生物標誌物，其包括Dicer和DGCR8(在前列腺腫 瘤中)和/或編碼argonuate-2的EIF2C2和Dicer (在具有高Gleason評分的腫瘤中)中的 一個或多個的增加的表達。
在另一個方面，本文中描述了前列腺腫瘤中獨特的微RNA表達特徵，其包括一 個或多個調控腫瘤微RNA加工的生物標誌物的表達的改變。
在另一個方面，本文中描述了影響前列腺中靶mRNA的轉錄物豐度和/或蛋白 質表達的方法，其包括使有此需要的受試者中一個或多個微RNA失調。
在某些實施方案中，所述方法括抑制癌症相關基因的蛋白質表達。
在某些實施方案中，所述方法包括改變miR-32和miR_106b中的一個或多個的 表達以抑制癌症相關基因的蛋白質表達。
在另一個方面，本文中描述了微RNA和編碼蛋白質的RNA的大規模基因表達特 徵譜分析用於鑑定在人前列腺腫瘤中發生的微RNA功能的改變的用途。
在另一個方面，本文中描述了前列腺相關病症的腫瘤基因特徵，包括下列 中的一個或多個上調的 miR-32，然後 miR-182，miR-31, miR-26a, miR_200c， miR-196a ；和miR-106b_25簇；和/或下列中的一個或多個顯著下調的miR_520h， miR-494, miR-490 和 miR-l_133a 簇。
在另一個方面，本文中描述了以低誤差邊際(margin of error)與前列腺外疾病擴 展相關的腫瘤特徵，其包括miR-101。
在某些實施方案中，生物標誌物包括在前列腺腫瘤中增加的前列腺中的宿主基 因表達。
在某些實施方案中，生物標誌物包括下列中的一個或多個被上調並且其表達 分別與內含子微RNA，miR-32和miR-106b_25簇的表達相關的C9orf5和MCM7。
在另一個方面，本文中描述了 miR-l(^b靶向前列腺癌細胞中E2F1和/或 CDKNlA基因和/或用於抑制E2F1和/或CDKNlA基因的蛋白質表達的用途。
在另一個方面，本文中描述了通過改變前列腺癌細胞中miR-1的表達進行的 XP06和PTK9中的一個或多個的調控。
在另一個方面，本文中描述了微RNA與3' UTR序列的結合導致哺乳動物細胞 中靶mRNA的降解和/或積累的用途。
在另一個方面，本文中描述了人組織中微RNA與mRNA之間的負相關和/或正 相關用於預測微RNA的靶基因的用途。
在另一個方面，本文中描述了用於鑑定受微RNA調控的mRNA的方法，其包括 進行人組織中的微RNA和mRNA表達的相關分析。
在另一個方面，本文中描述了包含miR-32和miR-l(^b中的一個或多個的miR 表達反義抑制劑。
在另一個方面，本文中描述了前列腺病症或疾病的oncomiR生物標誌物，其包 括miR-1、miR-32和mir-106b_25簇中的一個或多個。
在另一個方面，本文中描述了用於調控前列腺癌細胞中蛋白質表達的方法，其 包括調控前列腺癌細胞中的miR-1、miR-32和mir-106b_25簇中的一個或多個的表達。
在另一個方面，本文中描述了用於抑制前列腺癌細胞中輸出蛋白-6(eXp0rtin-6) 和PTK9中的一個或多個的表達的組合物，所述組合物包含miR-1或其功能性變體。
在另一個方面，本文中描述了用於調控有此需要的受試者中E2F1和p21/WAFl 蛋白水平的一個或多個的方法，其包括使用miR-l(^b或其功能性變體。
在另一個方面，本文中描述了包含反義miR_106b的組合物，其用於增加有此需 要的受試者中前列腺癌細胞中p21/WAFl和/或E2F1的蛋白水平。
在某些實施方案中，所述方法包括確定患有前列腺癌的受試者的預後，其包括 測量來自受試者的測試樣品中至少一個生物標誌物的水平，其中i)生物標誌物與前列 腺癌中不利的預後相關；和ii)相對於對照樣品中相應的生物標誌物的水平，前列腺測試 樣品中至少一個生物標誌物的水平的改變表示不利的預後。
在某些實施方案中，所述方法包括診斷受試者是否患有前列腺癌或處於發生前 列腺癌的風險中，包括(1)從獲自受試者的測試樣品反轉錄RNA以提供一組靶寡脫氧 核苷酸；( 將靶寡脫氧核苷酸與包含miRNA特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交以提供 測試樣品的雜交特徵譜；和C3)將測試樣品雜交特徵譜與從對照樣品產生的雜交特徵譜 相比較，其中至少一個miRNA的信號的改變表示受試者患有前列腺癌或處於發生前列腺 癌症的風險中。
在某些實施方案中，相對於從對照樣品產生的信號，至少一個miRNA的信號下 調，和/或其中相對於從對照樣品產生的信號，至少一個miRNA的信號上調。
在某些實施方案中，選自表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10中所列的組的至少一個生物標誌物的信號的改變表示受試者患有具有不利預後的前 列腺癌或處於發生所述癌症的風險中。
在另一個方面，本文中描述了治療患有前列腺癌的受試者的前列腺癌的方法， 在所述前列腺癌中至少一個生物標誌物在受試者的癌細胞中相對於對照細胞下調或上 調，所述方法包括(1)當至少一個生物標誌物在癌細胞中下調時，給受試者施用有效 量的至少一個分離的生物標誌物，或其分離的變體或生物學活性片段，以便受試者中癌 細胞的增殖被抑制；或O)當至少一個生物標誌物在癌細胞中上調時，給受試者施用有 效量的至少一種抑制至少一個生物標誌物的表達的化合物，以便受試者中癌細胞的增殖 被抑制。
在另一個方面，本文中描述了治療受試者的前列腺癌的方法，其包括(1)測 定相對於對照細胞，前列腺癌細胞中至少一個生物標誌物的量；和(2)通過ω如果癌 細胞中表達的生物標誌物的量低於對照細胞中表達的生物標誌物的量，給受試者施用有 效量的至少一個分離的生物標誌物；或(ω如果癌細胞中表達的生物標誌物的量高於對 照細胞中表達的生物標誌物的量，給受試者施用有效量的至少一種用於抑制至少一個生 物標誌物的表達的化合物來改變前列腺癌細胞中表達的生物標誌物的量。
在另一個方面，本文中描述了用於治療前列腺癌的藥物組合物，其包含至少一 個分離的生物標誌物和可藥用載體。
在某些實施方案中，藥物組合物包括其中至少一個分離的生物標誌物相應於相 對於對照細胞在前列腺癌細胞中下調的生物標誌物。
在某些實施方案中，藥物組合物包含至少一個miR表達抑制劑化合物和可藥用 載體。
在另一個方面，本文中描述了鑑定抗前列腺癌試劑的方法，其包括給細胞提供 測試試劑和測量與前列腺癌細胞中減少的表達水平相關的至少一個生物標誌物的水平， 其中相對於對照細胞，細胞中生物標誌物的水平的增加表示測試試劑是抗前列腺癌試 劑。
在另一個方面，本文中描述了鑑定抗前列腺癌試劑的方法，其包括給細胞提供 測試試劑和測量與前列腺癌細胞中增加的表達水平相關的至少一個生物標誌物的水平， 其中相對於對照細胞，細胞中生物標誌物的水平的減少表示測試試劑是抗前列腺癌試 劑。
在另一個方面，本文中描述了評估療法預防、診斷和/或治療前列腺癌相關疾 病的有效性的方法，其包括i)使動物經歷其有效性有待評估的療法，和ii)通過估計表 2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10的一個或多個中所列的至少一個 生物標誌物來測定測試的療法在治療或預防疾病中的有效性水平。
在某些實施方案中，候選治療劑包括藥物組合物、營養組合物(nutraceutical composition)和順勢療法組合物中的一種或多種。
在某些實施方案中，待評估的療法用於人受試者。
在另一個方面，本文中描述了製品，其包含至少一個結合前列腺癌相關疾病 的標誌物的捕獲試劑，所述標誌物包括表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表 9或表10的一個或多個中所列的至少一個生物標誌物。
在另一個方面，本文中描述了用於篩選治療前列腺癌相關疾病的治療劑的候選 化合物的試劑盒，其中試劑盒包括表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9 或表10的一個或多個中所列的至少一個生物標誌物的一個或多個試劑和表達至少一個生 物標誌物的細胞。
在某些實施方案中，使用包含特異性結合至少一個生物標誌物的抗體或抗體片 段的試劑檢測生物標誌物的存在。
在另一個方面，本文中描述了幹擾前列腺癌相關疾病應答信號轉導途徑的試劑 用於製造藥劑的用途，所述藥劑用於治療、預防、逆轉或限制個體中疾病併發症的嚴重 度，其中試劑包括表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10的一個或多 個中所列的至少一個生物標誌物。
在另一個方面，本文中描述了治療、預防、逆轉或限定有此需要的個體中前列 腺癌相關疾病併發症的嚴重度的方法，其包括給個體施用幹擾至少前列腺癌相關疾病 應答級聯的試劑，其中試劑包括表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表 10的一個或多個中所列的至少一個生物標誌物。
在另一個方面，本文中描述了幹擾至少前列腺癌相關疾病應答級聯的試劑用於 製造藥劑的用途，所述藥劑用於治療、預防、逆轉或限定個體中前列腺癌相關疾病並發 症的嚴重度，其中試劑包括表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10的 一個或多個中所列的至少一個生物標誌物。
在另一個方面，本文中描述了包含miR-1、miR_32和miR_106b中的一個或多 個的反義抑制劑的組合物。
在另一個方面，本文中描述了治療有此需要的受試者的前列腺病症的方法，其 包括給受試者施用治療有效量的組合物。
在某些實施方案中，預防性施用組合物。
在某些實施方案中，組合物的施用延遲病症的一個或多個症狀的發作。
在某些實施方案中，肽的施用抑制前列腺癌的發生。
在某些實施方案中，肽的施用抑制腫瘤生長。
在某些實施方案中，肽的施用抑制感染。
在另一個方面，本文中描述了用於檢測生物學樣品中前列腺癌的存在的方法， 該方法包括a)將懷疑包含前列腺癌的生物學樣品暴露於為此的標誌物；和b)如果有的 話，檢測樣品中標誌物的存在或不存在。
在某些實施方案中，標誌物包括可檢測標記。
在某些實施方案中，所述方法還包括將來自受試者的生物學樣品中標誌物的量 與來自正常受試者的相應生物學樣品中標誌物的量相比。
在某些實施方案中，所述方法還包括在不同時間點從受試者收集多個生物學樣 品和比較各生物學樣品中標誌物的量以確定標誌物的量在一段時間內在受試者中是增加 還是減少。
在另一個方面，本文中描述了治療受試者中的前列腺癌的方法，該方法包括 給有此需要的受試者施用治療有效量的前列腺受體激動劑。
在某些實施方案中，受體激動劑是miRl、miR_21和miR_106b中的一個或多個的反義抑制劑。
在另一個方面，本文中描述了製造用於治療前列腺癌的藥物的用途，其由選自 表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10中顯示的miR、來源於其的序 列、來自此類miR的互補序列和來源於這樣的互補序列的序列的核酸分子組成。
在某些實施方案中，所述用途包括其中藥物包含存在選自表2中所列的miR、 來源於此類miR的序列、此類miR的互補序列和來源於這樣的互補序列的序列的序列的 核酸分子。
在另一個方面，本文中描述了鑑定誘導前列腺癌細胞的分化的有效治療劑或治 療劑的組合的體外方法，該方法包括步驟i)培養來源於前列腺腫瘤的細胞，ii)向細胞 系的培養基中加入至少一種化合物，iii)分析步驟G)與Gi)之間至少一個miR的表達水 平的變化和iv)鑑定誘導步驟ω與(ii)之間miR的表達水平的改變的化合物或化合物的組合。
在某些實施方案中，步驟(iii)包括分析至少一個miR的表達水平。
在某些實施方案中，步驟(iv)包括鑑定調控至少一個miR的表達水平的化合物 或化合物的組合。
在某些實施方案中，步驟(iv)包括鑑定減少至少一個miR的表達水平的化合物 或化合物的組合。
在某些實施方案中，化合物是治療癌症的治療劑。
在另一個方面，本文中描述了用於分類來自受試者的前列腺組織的方法，其包 括a)測量測試細胞群體中選自表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表 10中所列的組的一個或多個核酸序列的表達，其中所述測試細胞群體中至少一個細胞能 夠表達選自表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10中所列的組的一 個或多個核酸序列；b)將核酸序列的表達與包含至少一個已知其前列腺癌分類的細胞的 參照細胞群體中核酸序列的表達相比較；和c)如果存在，鑑定測試細胞群體和參照細胞 群體中選自所述組的一個或多個核酸序列的表達水平的差異，從而分類受試者的前列腺 癌。
在某些實施方案中，與參照細胞群體相比較，測試細胞群體中核酸的表達的差 異表示測試細胞群體具有與來自參照細胞群體的細胞不同的分類。
在某些實施方案中，與參照細胞群體相比較，測試細胞群體中核酸的相似表達 模式表示測試細胞群體具有與來自參照細胞群體的細胞相同的分類。
在某些實施方案中，參照細胞群體是多個細胞或資料庫。
在某些實施方案中，參照細胞群體選自分類為來自正常前列腺組織的細胞群 體的參照細胞群體、分類為來自良性前列腺組織的細胞群體的參照細胞群體和分類為來 自惡性前列腺組織的細胞群體的參照細胞群體。
當根據附圖進行閱讀時，根據下列優選實施方案的詳細描述，本發明的各種目 的和有利方面對於本領域技術人員將變得顯然。
附圖概述
本專利或申請文件可包括一個或多個以彩色製成的圖和/或一個或多個照片。 具有彩色附圖和/或照片的本專利或專利申請公開案的拷貝將應請求且支付必要的費用後由專利局(PatentOffice)提供。
圖1A-1B:前列腺組織中微RNA與它們各自的靶mRNA的轉錄物豐度之間的關 系的分析。顯示了 mRNA與miR-106b之間(圖1A)以及mRNA與miR_181a之間(圖 1B)的Pearson相關係數的全局分布。黑色曲線顯示所有mRNA的相關係數的分布。紅 色曲線只顯示為miR-l(^b或miR_181a的預測的靶的mRNA的相關係數分布。紅色曲 線具有表示其轉錄物水平與微RNA的轉錄物水平呈負相關的靶mRNA的富集的額外的肩 (箭頭)。
圖2A-2B miR-1和miR_106b對蛋白質表達的抑制。用微RNA前體(miR-1 和miR_106b)或反義微RNA (反義miR-1和反義miR_106b)或它們各自的載體對照、亂 序的前體微RNA (亂序的-P)和亂序的反義微RNA (亂序的-A)轉染LNCaP和PC_3人 前列腺癌細胞。在轉染後48小時製備蛋白質提取物，通過Western印跡分析檢查蛋白質 表達。上樣50 μ g蛋白質/泳道。
圖3A-3B miR-106b通過3' UTR介導的機制抑制E2F1蛋白質表達。
圖3A 用微RNA前體(miR_106b)或反義微RNA(反義miR_106b)或它們各 自的載體對照、亂序的前體微RNA(亂序的-P)和亂序的反義微RNA(亂序的-A)轉染 LNCaP和PC-3人前列腺癌細胞。在轉染後48小時製備蛋白質提取物，通過Western印 跡分析檢查蛋白質表達。為了獲得相對強度值，將E2F1表達相對於β-肌動蛋白進行標 準化。
圖3Β:將包含E2F1基因中的miR_106b的野生型或突變體3' UTR靶序列的 pGL3螢光素酶報告基因構建體與前體微RNA陰性對照或miR-l(^b前體共轉染入LNCaP 細胞(各自n = 3)。為了比較，還用不包含3' UTR的pGL3對照載體轉染細胞。M 小時後，測定細胞提取物中螢光素酶的活性。在野生型E2F13' UTR存在的情況下， 使用前體miR-l(^b的轉染導致螢光素酶報告基因的顯著抑制(與載體對照相比較)(P = 0.045，雙側t檢驗)。
圖3C-3D miR-32通過3' UTR介導的機制抑制Bim蛋白的表達。
圖3C 用微RNA前體(miR-32)或反義微RNA (反義miR_32)或它們各自的載 體對照、亂序的前體微RNA(亂序的-P)和亂序的反義微RNA(亂序的-A)轉染LNCaP 和PC-3人前列腺癌細胞。在轉染後48小時製備蛋白質提取物，通過Western印跡分析檢 查蛋白質表達。為了獲得相對強度值，將Bim的表達相對於β-肌動蛋白進行標準化。
圖3D 將包含BCL2L11 (Bim)基因中的miR-32的野生型或突變體3 『 UTR靶 序列的pGL3螢光素酶報告基因構建體與前體微RNA陰性對照或miR-32前體共轉染入 LNCaP細胞(各自η = 3)。為了比較，還用不包含3 『 UTR的pGL3對照載體轉染細 胞。對小時後，測定細胞提取物中螢光素酶的活性。在野生型BCL2L113' UTR存在 的情況下，使用miR-32的轉染導致螢光素酶報告基因的顯著抑制(與載體對照相比較) (P = 0.003,雙側t檢驗)。如果報告基因構建體包含miR的突變體3' UTR靶序列， 抑制被減弱。
圖 4A-4B DICER (圖 4A)禾Π DGCR8 (圖 4Β)的定量 RT-PCR 表達分析。
圖5A-5D:來自前列腺癌患者的非腫瘤前列腺組織(正常)和腫瘤(腫瘤) 中 miR-32 (圖 5A)、miR_106b(圖 IB)、miR_106a(圖 5C)禾Π miR-1 (圖 5D)的定量RT-PCR表達分析。將單個樣品的相對微RNA表達值和樣品組的平均值作圖。MiR-32、 miR-106b和miR-l(^a在腫瘤中的表達顯著高於在非腫瘤組織中的表達P = 0.037(雙 側 t 檢驗)(對於 miR-32) ； P = 0.009 (雙側 t 檢驗)(對於 miR_106b) ； P = 0.015(雙側 t 檢驗)(對於 miR-106a)。
圖6 前列腺腫瘤中XP06與miR-1轉錄物水平之間的關係。
圖7 miR-106b通過CDKNlA (p21/WAFl) 3' UTR-介導的機制抑制螢光素酶報告基因的活性。
圖8A-8B 抗癌藥物處理的細胞中miR簇對胱天蛋白酶-3/胱天蛋白酶_7活化 的顯著抑制。
圖9A9B:成熟miR-338和miR-221的qRT-PCR分析顯示它們的表達水平受雄激素調控。
圖10 表1研究群體的臨床特徵。
圖11 表2在腫瘤與非腫瘤組織之間差異表達的微RNA。
圖12 表3與前列腺外疾病相關的微RNA。
圖13Α表4Α 前列腺腫瘤中miR-1與靶基因轉錄物水平之間的負相關。
圖13Β表4Β :前列腺腫瘤的37-探針組PAM預測物。
圖14 表5在前列腺腫瘤中與miR_181a呈負相關的miR_181a的靶基因。
圖15 表6雄激素應答性微RNA。
圖16 表7微RNA的側翼序列中假定的雄激素受體結合位點。
圖17-17Β 基於235個微RNA的表達的57個前列腺腫瘤的無監督層次聚類分析。
圖17A 微RNA表達產生具有不同微RNA特徵譜的兩個主要簇，簇#1包含所 有非PNI腫瘤。
圖17B 根據兩個簇間的PNI狀態產生的腫瘤的非隨機分布(P = 0.002 ；雙側 Fisher' s精確檢驗)。
圖18 富集差異表達的基因(比較PNI腫瘤與非PNI腫瘤)的基因本體論生物 過程(Gene Ontology :Biological Process)的聚類分析。聚類分析的結果顯示於熱圖中，為 了進行特定的比較例如PNI腫瘤對非PN I腫瘤(「神經周浸潤」)，用紅色標示生物過 程例如類花生酸代謝中差異表達的基因的富集。熱圖還顯示關於高(7-9)Gleasan評分對 低(5-6) Gleason評分比較(「Gleason總評分」)、pT3對pT2比較(「病理分期」)和 陽性對陰性前列腺外擴展比較(「前列腺外擴展」)的聚類分析。分析顯示，基因表達 差異是非隨機的並且產生關於4個比較的頻繁受影響的生物過程的獨特模式。放大的聚 類顯示，獨特地富集差異表達的基因(比較PNI腫瘤與非PNI腫瘤)的生物過程。類花 生酸代謝、脂質代謝和軸突生成也富集差異表達的基因(比較ρΤ3與ρΤ2)。
圖19A-19D:通過免疫組織化學顯示的前列腺腫瘤中金屬硫蛋白的表達。小圖 顯示腫瘤上皮中金屬硫蛋白表達的實例。相同腫瘤中，遠離神經元的癌細胞中金屬硫蛋 白的細胞質表達顯著(圖19Α)，神經周圍的癌細胞中該表達不存在(圖19Β)。當腫瘤 細胞靠近神經時，金屬硫蛋白的表達減少(圖19C，19D)。箭頭和「N」標示褐色染色 的神經幹的位置。復染甲基綠。
圖20A-20D 通過免疫組織化學顯示的前列腺腫瘤中柯薩奇腺病毒受體的表 達。小圖顯示腫瘤上皮中受體表達的實例。在相同腫瘤中，遠離神經元的癌細胞中(圖 20A)和神經周圍的癌細胞中(圖20B)受體的細胞膜和細胞質染色。在神經周圍的癌細 胞中(圖20C，20D)柯薩奇腺病毒受體的表達減少。N:神經幹。復染甲基綠。
圖21A-21D 通過原位雜交顯示的前列腺腫瘤中的miR-224。顯示了腫瘤上皮 中miR-224的細胞質表達的代表性實例。粒狀褐色染色顯示miR-224的存在。大多數 腫瘤對於miR_2M顯示微弱的標記(圖21A)。在腫瘤的亞組中，在神經周圍癌細胞中觀 察到中等至強的miR_2M標記(圖21B，21C，21D)。N =神經幹。復染蘇木精。
圖22 表8 神經周浸潤(PNI)研究群體的臨床特徵。
圖23-表9 在具有PNI的腫瘤中上調的微RNA (FDR^lO % )。
圖24-表10 在PNI與非PNI腫瘤之間具有差異表達的編碼蛋白質的RNA。
圖25-表11 通過qRT-PCR進行的對選擇的基因的微陣列結果的驗證。
圖26-表12 最顯著富集差異表達的基因(比較PNI腫瘤與非PNI腫瘤)的生 物過程。
發明詳述
在整個本公開內容中，通過標識引用來引用各種公開物、專利和公開的專利說 明書。這些公開物、專利和公開的專利說明書的公開內容通過引用合併入本公開內容以 更全面地描述本發明涉及的現有技術。
在詳細地描述本發明之前，應理解本發明不限定於特定的製劑或過程參數，因 為它們當然可以變化。還應理解，本文中使用的術語只是為了描述本發明的特定實施方 案，而不期望是限定性的。
雖然在本發明的實施中可使用與本文中描述的方法和材料相似或等價的許多方 法和材料，但優選的材料和方法描述於本文中。
微RNA是調控蛋白質編碼基因的表達的小非編碼RNA。為了估計前列腺癌中 微RNA的參與，我們測定60個原發性前列腺腫瘤和16個非腫瘤前列腺組織中微RNA和 mRNA的基因組範圍的表達。
微RNA表達隨前列腺癌的發生和進展而變化。一些此類微RNA在前列腺癌細 胞中調控癌症相關基因的表達。
如在本文中可互換使用的，「miR基因產物」、「微RNA」、「miR」或 「miRNA」是指來自miR基因的未加工的或已加工的RNA轉錄物。
如本文中所使用的，「生物標誌物」可包括一個或多個「miR基因產物」、 「微RNA」、「miR」或「miRNA」或編碼蛋白質的RNA。
可通過天然加工途徑(例如使用完整的細胞或細胞裂解物)或通過合成加工途徑 (例如使用分離的加工酶，例如分離的Dicer、Argonaut或RNA酶III)從miR前體獲得 具有活性的19-25個核苷酸的RNA分子。應理解，還可通過生物或化學合成(而不用從 miR前體加工)直接產生具有活性的19-25個核苷酸的RNA分子。當在本文中通過名稱 提及微RNA時，除非另外指出，否則所述名稱相應於前體和成熟形式。
本發明包括診斷受試者是否患有前列腺相關病症或處於發生前列腺相關病症的 風險中的方法。如本文中使用的，「受試者」可以是患有或懷疑患有前列腺癌的任何哺乳動物。
mRNA分析顯示，微RNA加工的至關重要的組分和數個微RNA宿主基因例如 MCM7和C9orf5在前列腺腫瘤中顯著上調。與這些發現一致，腫瘤以比非腫瘤前列腺顯 著更高的水平表達定位至MCM7的內含子13的miR-106b_25簇和定位至C9orS的內含 子 14 的 miR-32。
其他微RNA包括miR-106b_25簇同源物和miR-l_133a簇的表達水平在前列腺腫瘤中也發生改變。
在器官局限性腫瘤與具有前列腺外疾病擴展的腫瘤之間發現另外的微RNA豐度 的差異。
此外，我們還發現，微RNA的失調影響前列腺中編碼蛋白質的靶基因的轉錄物豐度。
在細胞培養物中，E2F 1和p21/WAF 1被鑑定為miR_106b的靶，Bim為miR-32 的靶，以及輸出蛋白-6和PTK9為miR-1的靶。
基於基因的分類器是提高疾病診斷和用於預測臨床行為的強有力的診斷和預後 工具。我們使用PAM應用來鑑定區分腫瘤與非腫瘤組織的微RNA特徵。PAM鑑定了 由7-探針組和37-探針組組成的兩個微RNA特徵，其最佳地區分腫瘤與非腫瘤組織(圖 13B-表4B，其中7-探針組特徵用*標示)。
7-探針組特徵獲得了 16個非腫瘤組織中的14個(88%)和60個腫瘤中的49 個(82%)的正確分類。該特徵僅基於4個微RNA，miR-32、miR-218_2、miR-490和 miR-520h的表達模式。
使用代表23個微RNA的37-探針組特徵(圖11[表5])獲得了總體預測準確度 的進一步提高。該特徵與7-探針組特徵完全重疊。通過使用37-探針組特徵，PAM獲 得了 16個非腫瘤組織中的16個(100% )和60個腫瘤中的48個(80% )的正確分類.
在下列實施例中進一步解釋本發明，其中，除非另有說明，所有部分和百分比 以重量計並且溫度是攝氏度。應理解，表示本發明的優選實施方案的這些實施例僅通過 舉例說明的方式給出。根據上述討論和這些實施例，本領域技術人員可以確定本發明的 本質特徵，並且無需背離其精神和範圍，可以對本發明進行多種變化和改進以使其適應 不同的用法和條件。本說明書中涉及的所有公開物，包括專利和非專利文獻明確地通過 引用併入本文。
實施例I
臨床樣品
從 NCI Cooperative Prostate Cancer Tissue Resource (CPCTR)禾口 Universityof Maryland(UMD)的病理系接收60個新鮮冷凍的前列腺腫瘤。從所有供體獲得書面知情同 意。腫瘤是在前列腺切除術前未接受任何治療的切除的腺癌。由病理學家再檢查宏觀解 剖的(macro-dissected)腫瘤樣品，其確認腫瘤存在於冷凍樣品中。從16個前列腺癌患者 收集周圍非腫瘤前列腺組織。所有組織在2002至2004年收集。根據醫療記錄(CPCTR) 取得或通過流行病學問卷調查(UMD)獲得關於人種/族裔的信息。從CPCTR獲得患者 的臨床病理學特徵，包括前列腺切除術時的年齡、組織學、Gleasan評分、病理分期、診 斷時的PSA、腫瘤大小、前列腺外擴展、邊緣受累(margin involvement)和精囊浸潤。對於UMD病例，該信息獲自醫療和病理記錄，如果可獲得的話。研究由參與單位的制度 評審委員會(institutional review boards)批准。
RNA 提取
按照製造商的說明書(Invitrogen，Carlsbad, CA)使用TRIZOL試劑分離總 RNA。用 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto，CA)確認各樣品的RNA完整性。然後將各RNA樣品分成兩等分，其經處理用於微RNA微陣列或mRNA微 陣列。
基因微陣列
定製微RNA寡核苷酸晶片。如之前所述進行微RNA標記和雜交。微 RNA 微陣列(Ohio State University Comprehensive Cancer Center, Version 3.0)含有以一式 四份點印的針對3 個人微RNA和249個小鼠微RNA的探針。關於陣列平臺的更多信 息可見於登錄號分別為A-MEXP-620和GSE8U6的ArrayExpress和GEO資料庫。
Affymetrix GeneChip
按照Affymetrix標準方案Manta Clara, CA)進行RNA標記和雜交。簡而言之， 用在5'末端具有T7RNA聚合酶啟動子的寡(dT)引物逆轉錄5yg總RNA。第二鏈合 成後，通過使用來自 Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY)的 BioArray High Yield RNA Transcript Labeling Kit T3整合生物素化的核糖核苷酸來產生cRNA。將標記的cRNA片段 化，然後與Affymetrix GeneChip HG-U133A 2.0陣列雜交。該陣列包含代表大約13,000個 人蛋白質編碼基因的22,283個探針組。用藻紅蛋白綴合的鏈黴抗生物素蛋白(Invitrogen) 顯現雜交信號，並且使用GeneChip Scanner 3000 7G (Affymetrix)進行掃描。根據關於微 陣列實驗的最小信息(Minimum Information About a Microarray Experiment) (MIAME)指 南，我們將額外的患者信息和微陣列數據的CEL文件保存在GEO庫(ncbi.nlm.nih.zov/ aeo/)。微RNA和mRNA特徵譜數據的GEO提交登錄號分別是GSE8U6和GSE6956。
微陣列的數據標準化和統計分析
使用魯棒多晶片分析(robust multichip analysis, RMA)方法02)標準化 Affymetrix晶片。將中值-中心標準化(Median-centric normalization)用於定製的微RNA寡核苷酸晶片。為了產生顯著差異表達的基因的清單，將所得的數據組經歷微陣列顯著 性分析(significance analysis of microarray, SAM)方法O3)。我們基於來自雙側t檢驗的 P值和期望的錯誤發現率(FDR)產生基因清單。FDR計算遵從Storey和Tibshinmi描述 的方法04)。微陣列預測分析(Prediction analysis for microarray, PAM) (25)用於將組織 分類為期望的分類，例如腫瘤或非腫瘤組織。在該分析中，基於訓練誤差率和變異係數 (CV)誤差率的最佳補償選擇閾值δ。通過遺漏10%的樣品進行交叉驗證，以確定PAM 中合適的閾值參數。
微RNA的靶的預測
我們使用TargetkanS (http://genes.mit.edu/tscan/taraetscanS.html)進行微RNA 的靶的預測。在我們的研究中只考慮位於3' UTR內並且在種間保守的微RNA的預測的 結合部位。為了分析和數據輸出，將數據格式化入WholepathwayScope資料庫06)。為 了鑑定在人前列腺組織中調控它們的靶mRNA的轉錄物豐度的微RNA，進行關聯分析。 為此，計算Pearson相關係數。利用雙側t檢驗確定:Pearson相關係數的統計學顯著性。
定量實時PCR
按照公開的方案、2 )使用莖環T^aqMan MicroRNA Assays試劑盒(Applied Biosystems, Foster City, CA)測量成熟微RNA的豐度。簡而言之，使用來自T^aqMan MicroRNA Assays試劑盒的特異性微RNA引物和來自TaqMan MicroRNA Reverse Transcription試劑盒(Applied Biosystems)的試劑，按照製造商的指導從IOng總RNA逆 轉錄 cDNA。使用 Applied Biosystems Tagman 2X Universal PCR Master Mix 和合適的 5X Taqman MicroRNA Assay Mix就各目的微RNA對cDNA進行實時PCR。在96孔板 中，將一式三份反應物在Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR系統中於95°C下溫育10 分鐘，然後進行40個循環的在95°C下15秒和在60°C下1分鐘。對於各樣品，利用ABI 7500 Sequence Detection System軟體計算循環閾值(CO。使用標準曲線測定樣品中微RNA 的濃度，然後將其相對於U6 RNA進行標準化。
微RNA對蛋白質表達的調控
將LNCaP和PC3人前列腺癌細胞(ATCC，Manassas, VA)培養至5O %匯 合，然後使用Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen)，用IOOnM終濃度的微RNA前體或 反義微RNA抑制劑(兩者都來自Ambion，Austin, TX)進行轉染。在48小時後， 通過刮取收穫細胞，然後使用RIPA緩衝液(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)提 取蛋白質。進行 Bradford 測定(BioRad Laboratories，Hercules, CA #500-0006)以 測定蛋白質的濃度，將50ug蛋白質裝載在凝膠上以進行Western印跡分析。使用 下列微 RNA 前體前-微 RNA 陰性對照(AM17110) ； hsa-miR-l (cat# AM17100 Product ID PM10617) ； hsa-miR-32 (cat#AM17100 Product ID PM12584)； 禾口 hsa-miR-l06b (cat#AM17100 Product ID PM10067)。使用下列微 RNA 抑制劑(反義) 反義微 RNA 陰性對照(AM 17010) ； hsa-miR-l (cat#AM 17000 Product ID AM 10617)； hsa-miR-32 (cat#AMI7000 Product ID AM12584)； 禾Π hsa-miR-l06b (cat#AM 17000 Product ID AM10067)。使用下列一抗通過Western印跡分析顯現蛋白質表達多克隆 免抗輸出蛋白-6 抗體，1 200 (ProteinTech Group, Chicago, IL: 11408-1-AP)；單克 隆鼠抗 PTK9 抗體，1 500 (Abnova Corp.，Taipei, Taiwan clone 1E2)；單克隆鼠抗 E2F1 抗體，1 20(KSanta Craz Biotechnology，Santa Craz, CA: sc-251)；單克隆鼠抗 p21/WAFl 抗體，1 20(KSanta Cruz Biotechnology sc-6246)；和多克隆兔抗 BIM 抗 體，1 1000 (Cell Signaling/Santa Craz Biotechnology #沘19)。用 AIDA Biopacbige， 2D-光密度測定法(raytest Isotopenmessgeraete GmbH, Straubenhardt，Germany)獲得蛋白 質表達的定量。
包含E2FI和BCL2L11的3' UTR的報告基因構建體的螢光素酶測定
從基因組DNAQ93T細胞)克隆分別包含預測的miR_106b和miR_32的靶序列的 E2FI和BCL2L11 (編碼Bim)的3' UTR,然後將其在緊接螢光素酶報告基因下遊的Xbal 限制性位點克隆入pGL3螢火蟲螢光素酶對照載體(Promega，Madison, WI)。為了產生 具有突變體靶序列的3' UTR,使用QuikChange定點誘變試劑盒Mtratagene，La Jolla, CA)將前3個核苷酸的缺失插入miR_106b和miR_32的種子區域互補位點。在LNCaP 細胞中測定miR-l(^b或miR-32對螢光素酶報告基因的翻譯抑制。簡而言之，將1.&105 個LNCaP細胞/孔接種在M孔板中。第二天，按照製造商的說明書(Invitrogen)使用Iipofectamine 2000試劑用500ng報告基因質粒、2ng Renilla報告基因和IOOnM終濃度的微 RNA陰性對照或前體微RNA轉染細胞。以一式三份重複進行轉染。用前-微RNA陰 性對照(AM17110)、hsa-miR-106b(cat#AM 17IOOProduct ID PM10067)或 hsa-miR-32 前體(cat#AM 17100 Product ID PM12584)轉染細胞。M小時後，按照Promega標準方 案裂解細胞，並且使用DYNEX Technologies MLX光度計測定相對螢光素酶活性。將報 告基因活性相對於細胞提取物中蛋白質的濃度進行標準化。
用雄激素受體激動劑處理前列腺癌細胞
將DU-145 (IxlO6)和LNCaP (2xl06)人前列腺癌細胞(ATCC)塗板在75cm2培養 瓶中，用補充有10%PBS、100yg/ml鏈黴素、100單位/ml青黴素和0.25 μ g/ml兩性 黴素B的RPMI 1640培養M小時。然後，將細胞置於不含酚紅的、具有5%的葡聚糖 包被的炭處理的PBS(Invitrogen)的RPMI 1640中，進行48小時以耗盡激素。然後，用 IOnMRl88K 甲基三烯甘油酯酮，PerkinElmer Life Sciences，Waltham, ΜΑ)或溶劑(乙 醇)處理細胞。24小時後，收穫細胞，使用mirVana PARIS試劑盒(Ambion，he.)分 離總RNA。重複本實驗5次。如之前所述進行微RNA標記和雜交，在Ohio State University Comprehensive Cancer Center 微陣列(版本 4.0)上測定微 RNA 的全局表達。
實施例I的結果
前列腺腫瘤中Dicer的上調
從患有局部疾病(localized disease)的非洲裔美國患者和歐洲裔美國患者收集前 列腺腫瘤(圖10-表1)。
在從這些腫瘤和16個非腫瘤組織分離總RNA後，使用微陣列測定大約13,000個 蛋白質編碼基因和3 個獨特的人微RNA的表達。
首先，就已顯示調控微RNA的加工的mRNA(例如編碼，特別地，Drosha或 DicerWmRNA)的表達的癌症相關的變化搜索這些樣品的基因表達特徵譜。我們的分 析顯示，當與非腫瘤組織相比較時Dicer在前列腺腫瘤中的表達顯著更高(1.6-倍；FDR <1%)0編碼Drosha的基本輔因子的DGCR8在腫瘤中也上調，但當與非腫瘤組織相比 較時程度低於Dicer (1.2倍；FDR < 1 % )。編碼Drosha的基本輔因子的DGCR8也在腫 瘤中上調(1.2倍，FDR < 1% ) ο 通過qRT-PCR來驗證腫瘤中Dicer和DGCR8的增加 的表達，結果顯示更大的倍數差異(與微陣列顯示的結果相比較)(圖4A-4B)。
進一步的分析顯示，Dicer和EIF2C2(兩者都為RISC複合物的組分)在具有高 Gleason總評分(評分7-9)的腫瘤中比在具有低Gleason總評分(評分5-6)的腫瘤中更 高地表達。然而，這些表達差異相當適度(Dicer 1.2倍；EIF2C2 1.3倍)。因為在人 細胞中已發現宿主基因和內含子微RNA的頻繁共表達08)，因此我們還研究了前列腺腫 瘤中微RNA宿主基因的表達。
在微RNA的宿主基因當中29),發現5個的表達在前列腺癌中發生改變 (所有FDR<1%)。在這些基因當中，作為miR-32的宿主的倍上調)和 作為miR-25簇(miR-25/miR-93/miR_106b)的宿主的MCM7 (1.7倍上調)在腫瘤中最 高地過表達。NFYC (miR-30c-l 的宿主)、SMC4L1 (miR_15b 和 miR-16-2 的宿主)和 PTPRN2(miR-153-2的宿主)，當與非腫瘤組織相比較時，在腫瘤中顯示更適度的30%至 40%的增加的表達。
前列腺癌的微RNA基因特徵
我們首先搜索在腫瘤與非腫瘤組織之間顯示差異表達的微RNA。如圖11-表2 中所示的，多個微RNA的表達在前列腺腫瘤中發生改變。
在腫瘤中具有比非腫瘤組織更低的轉錄物水平的微RNA當中，miR_520h、 miR-494和miR-490減少最多。該清單中兩個值得注意的其他的微RNA是miR-1 (_2) 和miR-133a(_l)。這兩個微RNA由相同的pri_mRNA編碼。miR_32是最顯著上調的 腫瘤微RNA，其次是miR-182、miR-31和miR16a。最高表達的腫瘤微RNA的清單還 包括miR-106b_25簇(miR-106b/miR-93/miR_25)的所有成員和miR_99b簇的兩個成員 miR-99b和miR_125a。miR-32和miR-106b_25簇的上調與它們各自的宿主基因C9orS 和MCM7在前列腺腫瘤中的增加的表達相一致。
微陣列數據的統計學分析確認，C9orf5與miR-32的組織轉錄物水平在統計學 上顯著相關(P = 0.0003)。Pearson係數表明，該關聯在所有樣品間是適度強的(0.39 ； 95%置信區間0.18至0.57 ； η = 76)。對於MCM7與miR-106b_25簇轉錄物水平之間 的關聯獲得相似的數據(miR_106b 0.37 (Pearson 係數)，P = 0.001 ； miR-93 0.35，P =0.002 ； miR-25 0.23，P = 0.04)。
我們通過在腫瘤和非腫瘤組織的隨機亞組中選擇的微RNA的qRT-PCR分析確證 了微陣列數據。與微陣列相一致，我們發現，成熟！^！^？⑶？倍^卩！！^-^^！^刀倍) 在腫瘤中比在非腫瘤組織中更高地表達(圖5A-5D)。我們還發現，當與非腫瘤組織相比 較時，在腫瘤中成熟miR-1下調(平均0.44倍)以及miR-106a(miR-106b同源物)過 表達(平均3.7倍)。
我們還在我們的研究中進行10個腫瘤(其周圍的非腫瘤組織是可獲得的)的微 陣列數據的成對分析。成對分析確證了我們之前的發現。在FDR miR 181a、fiR-182、miR_196a、 miR_200c、miR-375和miR-106b_25簇的所有微RNA在腫瘤中上調(1.5倍至2.5倍)。最 顯著下調的腫瘤微RNA是miR-494 (0.4倍)和miR_U6 (0.6倍)。然而，未發現miR_133a 簇在該腫瘤亞組中顯著地差異地表達。
微RNA與前列腺外擴展和Gleason評分的關聯
我們接著就與腫瘤的前列腺外擴展相關的微RNA表達的差異分析我們的數據 組。前列腺外擴展是前列腺癌患者的不利預後因素。在FDR <20%的情況下，我們發 現15個在顯示疾病的前列腺外擴展的腫瘤(η = 17)與不顯示疾病的前列腺外擴展的腫瘤 (n = 35)之間的表達上具有差異的微RNA (圖12-表3)。
miR-101是擴散出前列腺的局限性前列腺腫瘤中最始終如一地過表達的微 RNA(FDR<1%)。前列腺外擴展與腫瘤特徵共有一部分其微RNA特徵(圖11-表2)。
兩個微RNA，miR_99b和miR_l%a對於兩個特徵是共同的。前列腺外擴展特 徵的兩個其他的微RNA，miR_200a和miR_200b，與腫瘤特徵中的miR_200c具有充分的 同源性。我們還研究了微RNA與精囊浸潤的關聯，雖然本研究中少數腫瘤經診斷具有該 特徵。在FDR < 20%的情況下，只有一個微RNA在具有精囊浸潤的腫瘤(n = 9)與不 具有浸潤的腫瘤(n = 43)之間差異表達。該微RNA是miR-199a-l，當與其他腫瘤相比 較時，其在具有精囊浸潤的腫瘤中增加2.3倍。
微RNA表達特徵譜對於Gleason評分未顯示魯棒特徵。在FDR <20%的情況下 只發現極少數微RNA差異表達。當與具有低Gleasan總評分(評分5-6，η= 15)的腫瘤 相比較時，在具有高Gleason總評分(評分7-9，η = 45)的腫瘤中顯著上調的微RNA(P < 0.01)是 miR-92-2 (1.3 倍)(miR_25 和 miR_32 的同源物)以及 miR_3;35 (1.2 倍)，顯 著下調的微 RNA(P < 0.01)是 miR-l-133a 簇(0.7 倍)和 miR-130 (0.8 倍)。
因為我們的研究中的腫瘤是從在臨床病理學參數上良好匹配的非洲裔美國患者 和歐洲裔美國患者收集的(圖10-表1)，所以我們比較非洲裔美國患者(n = 30)和歐洲 裔美國患者(η = 30)之間的腫瘤微RNA特徵。少數微RNA差異表達(P < 0.01)。在 FDR < 20%的情況下，發現miR-129、miR_196b和miR-342在非洲裔美國人的腫瘤中 的豐度比在歐洲裔美國人的腫瘤中的更低(低20%至30%)。根據該分析，腫瘤微RNA 似乎不因人種/族裔而極差異地表達。
使用微RNA進行的腫瘤和非腫瘤組織的分類。
基於基因的分類器是提高疾病診斷和用於預測臨床行為的強有力的診斷和預後 工具。我們使用PAM應用來鑑定區分腫瘤與非腫瘤組織、區分器官局限性腫瘤與具有前 列腺外擴展的腫瘤以及區分具有高Gleasan總評分的腫瘤與具有低Gleasan總評分的腫瘤 的微RNA特徵。PAM鑑定了由7-探針組和37-探針組組成的兩個微RNA特徵，其最佳 地區分腫瘤與非腫瘤組織。7-探針組特徵獲得了 16個非腫瘤組織中的14個(88% )和60 個腫瘤中的49個(82%)的正確分類。該特徵僅基於4個微RNA，miR_32、miR-218_2、 miR-490和miR_520h的表達模式(圖13B-表4B)，所述微RNA全都是最顯著上調或下 調的腫瘤微RNA(圖11-表2)。使用代表23個微RNA的37-探針組特徵(圖14-表5) 獲得了總體預測準確度的進一步提高。
該特徵與7-探針組特徵完全重疊。通過使用37-探針組特徵，PAM獲得16個 非腫瘤組織中的16個(100%和60個腫瘤中的48個(80% )的正確分類。PAM不能鑑 定用於前列腺外擴展和Gleasan評分的良好分類器。對於Gleasan評分，弱至適度的分類 器需要149個探針組(數據未顯示)。
前列腺組織中微RNA與它們的靶mRNA的轉錄物豐度之間的關係
微RNA利用靶特異性翻譯抑制(4)來調控蛋白質編碼基因的表達。然而，最近 顯示，一些微RNA例如miR-1可在哺乳動物細胞中下調許多靶基因的轉錄物水平。因為 miR-1是前列腺腫瘤中最顯著下調的微RNA，因此我們在這些腫瘤中進行miR-1的表達 水平與預測的miR-1的靶基因的表達水平之間的關聯分析。進行該測試以鑑定由於減少 的miR-1表達而在前列腺腫瘤中變得過表達的候選miR-1的靶基因。分析產生假定的靶 mRNA,發現其在前列腺腫瘤中上調(FDR < 1%)並且與miR-1表達負相關(圖13-表 4))。
其中，WDR6、XP06和SMARCA4的轉錄物顯示與腫瘤miR-1的表達呈最顯著 的負相關(各P < IxlO-10)。前列腺腫瘤中XP06與miR-1轉錄物水平之間的關係描繪 於圖6中。
我們還發現，腫瘤中XP06蛋白水平與miR-1呈負相關(U9，Spearman相關係數；η = 8)。然而，並非所有預測的miR-1的靶都顯示與腫瘤中miR-1轉錄物水平呈 負相關。例如，TWFl (也稱為PTK9)與miR-1呈正相關，這表明微RNA與其靶序列的結合有時可導致mRNA扣留(sequestration)和被抑制的mRNA的細胞積累(30)。
將我們的分析擴展至在前列腺腫瘤中顯著上調或下調的其他微RNA。此處，我 們首先確定目的微RNA與通過HG-U133A 2.0陣列探測的所有mRNA或僅為微RNA的 預測的靶的mRNA之間的Pearson相關係數的全局分布。對於兩個微RNA，miR-106b 和miR_181a，相關係數的分布在所有mRNA與為miR_l(^b和miR_181a的預測的靶的 mRNA之間顯著不同(圖1A-1B)。
miR-106b和miR_181a的預測的靶mRNA的分布曲線顯示向負Pearson相關係數延伸的顯著的肩。該模式偏離正態分布，表明miR-l(^b和miR_181a降低在3' UTR 中具有預測的微RNA的靶序列的mRNA的亞組的組織轉錄物水平。在腫瘤中顯著下調 (FDR < 1%)並且其轉錄物水平與miR-181a表達呈負相關的靶基因的清單示於圖14-表 5中。
此類靶基因與白血病樣品(31)中一列和mir-181a轉錄物水平相關的基因的比較 顯示，幾個基因例如SLC9A6、RIN2、KLHL2和GHITM在兩個清單中都與mir_181a呈負相關。
前列腺癌細胞中候選oncomiR對蛋白質表達的抑制
我們的來自腫瘤研究的結果表明，miR-1、miR_32和mir-106b_25簇在前列腺 癌中是oncomiR，miR_32和miR_25共有高度的同源性，並且它們的預測的靶基因相同 (targetscan.org)。此外，mir-106b_25 簇與已知的 oncomiR，miR-17-92 簇(15 ； 32)高度 同源，並且miR-17-5p和miR_106b的預測的靶相同。miR-17-92簇的靶是E2F1 (32)。
我們用前體和反義微RNA轉染人前列腺癌細胞系以檢查miR-1、miR_32和 mir-106b是否調節癌相關基因在此類細胞中的蛋白質表達。
通過qRT-PCR，此類微RNA在細胞系中的內源性表達是miR_106 > miR-32 > miR-1。miR-1處於檢測極限。對於miR-1，我們測試腫瘤組織中微RNA與它們的靶 mRNA的轉錄物豐度之間的關係是否可用於鑑定微RNA靶，檢查輸出蛋白_6 (XP06)和 蛋白質酪氨酸激酶9 (TWFl)的蛋白質表達是否受miR-1調控。使用miR-1對前列腺癌細 胞的轉染確認，其在兩個前列腺癌細胞系中在蛋白質水平上抑制輸出蛋白-6和PTK9(圖 2Α)。miR-32和mir_106b都不改變這些蛋白質的表達(數據未顯示)。
我們接著研究miR-l(^b對E2F1和p21/WAFl蛋白水平的調控。兩種蛋白質都 由在它們的3' UTR中具有miR_106b的預測的靶序列的mRNA編碼。雖然在前列腺腫 瘤中E2F1在轉錄物水平上與miR_106b不相關，但在這些腫瘤中在CDKNlA(編碼p21/ WAF1)與miR_106b的表達之間存在顯著的負相關(-0.34 ； 95% CI ； -0.9至-0.55 ； P = 0.003)。
如圖2B中所示，在兩種細胞系中，轉染的前體miR-l(^b降低p21/WAFl蛋白 水平，反義miR-l(^b增加p21/WAFl蛋白水平。在用前體和反義miR_l(^b轉染前列腺 癌細胞後，對於E2F1，我們獲得相同的結果(圖3A)。
我們還研究了 miR-32對Bim蛋白表達的影響。Bim由BCL2L11編碼並且是 miR-32的預測的靶。用前體miR-32轉染前列腺癌細胞降低了 Bim蛋白水平，然而反義 miR-32增加Bim蛋白水平(圖3C)。Bim由BCL2L11編碼並且是miR-32的預測的靶。 BCL2L11和miR-32轉錄物水平在組織樣品中不相關，這表明miR-32可能主要通過翻譯抑制調控該靶。
在此類細胞系中，E2F1和p21/WAFl的蛋白質表達不受miR_32影響，Bim的 蛋白質表達也不受miR_106b影響(數據未顯示)。
E2FI 和 Bim 是 miR_106b 和 miR_32 的直接靶
為了進一步確證我們的發現和提供此類蛋白質是miR-I(^b和miR-32的直接靶 的證據，用前體微RNA和pGL3螢光素酶報告基因構建體(分別含有兩個基因E2F1和 BCL2L11 (編碼Bim)的野生型或突變體3' UTR)共轉染LNCaP細胞。突變體3' UTR 包含miR_106b和miR-32種子區域互補位點中的前3個核苷酸的缺失。將3' UTR置於 當微RNA結合靶序列時可導致螢光素酶報告基因的翻譯抑制的位點。
如圖3B和圖3D中所示，當與前體微RNA陰性對照相比較時，miR_106b與包含 E2F1的野生型3' UTR的報告基因構建體或miR-32與包含BCL2L11的野生型3' UTR 的報告基因構建體的共轉染導致螢光素酶報告基因的顯著抑制。在3' UTR不存在的情 況下，微RNA對報告基因的抑制不存在。突變體3' UTR的存在消除或減弱微RNA的 作用。結果與微RNA通過結合它們的3' UTR靶序列產生的對蛋白質翻譯的直接作用 相一致。已建立了 miR_106b在人結腸癌和胃癌細胞中對p21/WAFl進行調控的這樣的 機制(13，14)。因此，我們觀察到，miR-106b在LNCaP細胞中通過CDKNlA 3S UTR 介導的機制抑制螢光素酶報告基因(圖7)。
miR-106b-25簇在22Rvl入前列腺癌細胞中對胱天蛋白酶活化的抑制。
我們之前的數據表明，miR-32、miR_106b和它們的同源物(例如，miR_25)可 用作癌基因，因為它們靶向Bim和E2F1的促凋亡功能。為了估計miR-106b_25簇對由 多柔比星和依託泊苷誘導的細胞凋亡的作用，我們用編碼miR-106b_25簇的慢病毒表達 載體感染22RV1細胞(非轉移性人前列腺癌細胞系)。通過使用胱天蛋白酶-Glo細胞凋 亡測定，我們觀察到抗癌藥物處理的細胞中該簇對胱天蛋白酶-3/胱天蛋白酶-7活化的 顯著抑制(圖8A-8B)。該數據與miR-106b_25簇在前列腺癌細胞中的抗細胞凋亡功能 一致。
受雄激素調控的微RNA的鑑定
雄激素在前列腺的生理和腫瘤生物學中起著至關重要的作用。我們檢查DU145 和LNCaP細胞中雄激素對微RNA的調控。使用R1881對DU145細胞的處理不產生任何 顯著的微RNA表達的變化。相反地，許多微RNA的表達在R1881處理後在LNCaP細 胞中顯著改變(FDR < 5% )(圖15-表6)。
一個微RNA，miR-338，顯著上調。其他微RNA下調，包括miR-126_5、 miR_146b、miR-219_5p 以及 miR181b_l、miR_181c 和 miR-221 簇的所有成員。培養的 DU145和LNCaP細胞中基線微RNA表達的分析顯示，這三個微RNA簇的所有成員在雄 激素不敏感性DU145細胞中比在雄激素應答性LNCaP細胞中具有顯著更高的表達(FDR < 5% )。
通過使用Genomatix轉錄因子結合位點資料庫中的基序搜索，我們發現，前面提 及的微RNA在它們的側翼區域具有假定的雄激素受體結合位點(圖16-表7)。我們進 一步用LNCaP細胞(其用1或10nmol/LR1881處理12、24和48小時)在實驗中確證了 微陣列結果。成熟miR-338和miR-221的qRT_PCR分析顯示，它們的表達水平受雄激27素調 控(圖9A-9B)。實施例I的討論我們現已發現前列腺腫瘤中獨特的微RNA表達特徵和調控腫瘤微RNA加工的基 因表達的變化。此外，我們還發現，微RNA的失調影響前列腺中靶mRNA的轉錄物豐 度和蛋白質表達。在細胞培養物中，我們顯示，前列腺癌中的候選oncomiR例如miR-32 和miR_106b抑制癌症相關基因的蛋白質表達。該結果與改變的微RNA表達在人前列腺 癌發生中的致病性作用一致。這是使用微RNA和編碼蛋白質的RNA的大規模基因表達特徵譜分析鑑定在人前 列腺腫瘤中發生的微RNA功能的改變的首個研究。本研究的其他有力方面是，樣品數量 大，並且包括非洲裔美國患者和歐洲裔美國患者。因此，該發現代表在美國具有最高前 列腺癌負荷的兩個人種/族裔群體(34)。我們發現Dicer和DGCR8在前列腺腫瘤中的增加的表達，以及Dicer和編碼 argonuate-2的EIF2C2在具有高Gleason評分的腫瘤中的增加的表達。Dicer在前列腺癌 中上調的觀察結果與最近的報導(35)相符並且表明前列腺腫瘤在將微RNA前體加工成成 熟微RNA中比正常前列腺組織更有效。最近已顯示受損的微RNA加工增加小鼠的腫瘤 發生(8)，其他研究人員已假設微RNA加工在癌細胞中普遍下調(36)。然而，在前列腺腫瘤中，增強的微RNA加工的相反作用可能發生，如由我們的 數據和前面提及的研究所描述的，所述數據和研究顯示前列腺癌細胞中Dicer的增加的蛋 白質表達和轉移性疾病中Dicer和EIF2C2的過表達(35)。微RNA表達特徵譜分類人癌症(10; 14)。已報導了幾種上皮癌包括乳腺、結 腸、肺和胰腺癌的獨特特徵(11; 12; 37; 38)。兩個其他研究調查了前列腺癌中的微 RNA表達(39 ； 40)。與Baylor前列腺數據(40) —致，我們還觀察到，miR-145在前列 腺腫瘤中顯著下調。然而，當與我們的研究相比較時，這兩個公開的研究規模相當小並 且只檢查了少數幾個腫瘤。我們鑑定了包括上調和下調的微RNA的腫瘤基因特徵。最高上調的微RNA 是miR-32，其次是miR_182、miR_31、miR_26a、miR_200c 和miR_196a。過表達的腫瘤微RNA的清單也包括miR-106b_25簇，這與觀察到的 mir-25，mir-93和mir_106b的拷貝數在數個人惡性腫瘤中增加一致(41)。最顯著下調的微RNA 包括 miR_520h、miR_494、miR-490 和 miR-l_133a 簇。已在許多研究中觀察到人癌症中微RNA的改變的表達。腫瘤中微RNA的上調 是很常見的(5，6，8)，並且其與許多微RNA的已知的致癌活性一致(22-25)。上調的 機制包括轉錄激活和基因拷貝數目的增加。成熟微RNA的豐度的減少可由改變的加工引 起，如最近所顯示的(26)，所述改變的加工可導致成熟微RNA的無差別的更低的表達。 我們在本研究中未觀察到該現象。備選地，微RNA的表達可以由於突變或基因組改變 (21)或微RNA基因座的表觀遺傳沉默(27，28)而喪失。表觀遺傳沉默是前列腺癌的重要 機制(29)，必須進行另外的研究來闡明該機制是否阻礙微RNA在前列腺腫瘤中的表達。關於大多數此類微RNA的功能知之甚少。miR-32是miR-25，miR_92、 miR-363和miR-367的同源物。幾個此類微RNA在前列腺腫瘤中也上調。miR-32在結 腸和前列腺癌中增加(10)，並且是人細胞的抗病毒防禦的介體(mediator) (42)。miR-32的該功能可能是其改變的表達與前列腺癌發生之間的聯繫，因為幾個已知的前列腺癌易 感基因(susceptibility gene)也參與宿主防禦(43)。如對於其他微RNA所顯示的，miR_32 應當調控靶基因的蛋白質表達。 我們獲得了新觀察結果，miR-32抑制Bim(BCL_2家族的促凋亡成員)的表達 (44)。Bim是單倍不足的(haploinsufficient)，一個等位基因的失活足以加速Myc誘導的 腫瘤發生(45)。Bim在上皮腫瘤的細胞凋亡中具有至關重要的作用並且介導化學療法的 抗腫瘤效應(46)。因此，miR-32對Bim的下調可在腫瘤環境中促成腫瘤細胞對細胞凋 亡刺激的抗性。其他值得注意的具有已知功能的微RNA包括miR-1、miR_133a和mirR_196a。 miR-l_133a簇優先在肌細胞中表達並且經顯示調控細胞分化(47 ； 48)。miR-1是 miR-206的同源物，其在乳腺癌中為轉移的抑制劑(34)。本發明者發現miR-1在前列腺 腫瘤中下調，這與其同源物的腫瘤抑制劑功能一致。我們檢查miR-1並且觀察到，在前列腺腫瘤和培養的前列腺癌細胞中該微RNA 的表達與輸出蛋白_6和蛋白質酪氨酸激酶9(也稱為A6/tWinfilin)的表達呈負相關。關 於這兩個基因的功能知之甚少，但最近的數據顯示，兩者都調控細胞肌動蛋白動力學 (49-51)。MiR_196a被鑑定為HOXB8的抑制物(52)，並且miR_196a的提高的表達預示 胰腺癌的較低的存活(38)。在我們的研究中，該微RNA對於腫瘤特徵和前列腺外擴展 特徵是共同的，這表明前列腺癌中miR_196a的上調可以是疾病進展的因素。已顯示微RNA特徵在人癌症中具有診斷和預後價值(13 ； 38 ； 53 ； 54)。我們通過研究微RNA與腫瘤診斷、前列腺外擴展、Gleasan評分和患者的人種/ 族裔的關聯確定了前列腺癌中微RNA表達的診斷和預後意義。比較非洲裔美國患者與歐 洲裔美國患者的腫瘤微RNA特徵，因為最新證據表明，這兩個患者群體之間可能存在腫 瘤生物學中的差異(55)。雖然在前列腺的腫瘤與非腫瘤組織之間發現微RNA表達的巨 大差異，但相對少數的微RNA在擴散出前列腺的腫瘤與未擴散出前列腺的腫瘤之間，在 Gleasan評分大於7的腫瘤與評分小於7的腫瘤之間以及在來自非洲裔美國患者與歐洲裔 美國患者的腫瘤之間差異表達。此外，利用PAM鑑定了可區分腫瘤與非腫瘤前列腺組織的由四(4)個微RNA組 成的七(7)探針組特徵。然而，PAM分析不能產生用於前列腺外擴展、Gleasan評分或 人種/族裔的良好分類器。我們鑑定了以低邊際誤差與前列腺外疾病擴展相關的一個微RNA，miR-101o 該微RNA的功能未知。我們認為，前列腺腫瘤的內在異質性妨礙我們發現更多的與前列 腺癌中不利的預後因素相關的微RNA。微RNA的基因組定位的分析可提供關於它們的假定的功能和在腫瘤中引起改變 的微RNA表達的機制的線索(56)。最近的研究已顯示，微RNA通常位於蛋白質編碼基 因的內含子中並且與此類宿主基因共表達(28; 29)。我們研究前列腺腫瘤中宿主基因的 表達並且發現它們中的幾個在前列腺腫瘤中增加。C9orf5和MCM7是兩個最高上調的 宿主基因，並且它們的表達分別與內含子微RNA，miR-32和miR-1 06b_25簇的表達相 關。該數據暗示了導致前列腺腫瘤中宿主基因和共轉錄的微RNA的上調的共同機制。雖然C9orf5在癌症中的作用未知，但之前發現MCM7擴增與前列腺癌相關聯。發現MCM7基因座在88%的癌症復發的病例中擴增(57)。MCM7過表達不限於前列腺 癌，已在其他惡性腫瘤包括宮頸癌中觀察到MCM7過表達(58)。我們 檢查miR_106b在前列腺癌細胞中是否靶向E2F1和CDKNlA(編碼p21/ WAF1)並且發現此類基因的蛋白質表達被miR_106b抑制。miR-106b_25簇與兩個其 他的微RNA簇廣泛同源，所述兩個其他的微RNA簇是候選人癌基因miR-17-92簇和 miR-106a-363 簇(15 ； 59 ； 60)。E2F1 也是 miR-17-92 簇中的 miR-17_5p 和 miR_20a 的靶(32)，並且其具有癌基因和腫瘤抑制功能(61 ； 62)。與Bim—樣，翻譯的E2F1是 促細胞凋亡的並且與腫瘤抑制基因p53協作以介導細胞凋亡(63)。其過表達誘導LNCaP 細胞的細胞凋亡(64)，這表明miR_106b對E2F1翻譯的抑制可在腫瘤環境中保護前列腺 癌細胞免受細胞凋亡。p21/WAFl是p53腫瘤抑制的介體(65)。 已顯示p21/WAFl在前列腺癌中的生 長抑制作用(66)，其在前列腺癌細胞中響應抗癌劑而介導細胞周期停滯(67; 68)。我們 檢測miR-106b_25簇是否具有抗細胞凋亡活性並且發現其在22Rvl細胞中抑制由多柔比 星和依託泊苷產生的胱天蛋白酶活化。這些數據與前列腺癌中miR_106b的致癌功能一致，部分因為其抑制E2F1和 p21/WAFl蛋白表達的能力。miR-1、miR_32和miR-106b_25簇都不受LNCaP細胞的雄激素刺激調控。然 而，我們鑑定了受雄激素處理而上調或下調的幾個其他的微RNA。此類微RNA包括， 特別地，miR-338 和 miR-126 以及 miR-181b_l、miR_181c、miR-221 簇。基序搜索顯
示，此類微RNA在它們的側翼區域具有假定的雄激素受體結合位點。MiR-338是唯一顯著上調的微RNA。沒有關於該微RNA的功能的報導，但其 在三種上皮癌中位於拷貝數目頻繁增加的區域。MiR-181家族成員影響造血譜系分化(69)，並且它們的表達在白血病和幾種實 體瘤中發生改變(10 ； 31)。已發現miR-221簇調控ρ27Κιρ1腫瘤抑制基因並且在前列腺癌 中可能具有致癌特性(70 ； 71)。然而，該簇也抑制癌基因C-Kit和血管生成(72)。已證明受特定微RNA調控的蛋白質編碼基因的鑑定非常困難，儘管預測微RNA 的靶的計算機方法獲得了發展(73 ； 74)。發現靶mRNA的能力還牽涉微RNA的靶選擇 性可能依賴於細胞微環境的事實。我們使用探測方法和進行前列腺組織中微RNA表達與mRNA表達之間的關聯分 析。然而不希望受理論束縛，在本文中本發明者現相信，如果目的微RNA影響靶mRNA 的轉錄物豐度，則該方法是成功的，但如果靶基因只受翻譯抑制調控，則其是失敗的。我們發現，在前列腺腫瘤中miR-1的表達與許多計算機預測的靶基因例如XP06 呈負相關。然而，我們還發現，腫瘤miR-1的表達與預測的靶例如PTK9的轉錄物水平 呈正相關。在細胞培養物中對這些觀察結果的隨後驗證確認，XP06和PTK9在前列腺癌 細胞中受miR-1調控。該數據提供了微RNA與3' UTR序列的結合可導致哺乳動物細胞中被靶向的 mRNA的降解和積累以及人組織中微RNA與mRNA之間的負相關和正相關可預示微RNA 的靶基因的新證據。因此，可證明人組織中微RNA和mRNA表達的關聯分析在鑑定受 微RNA調控的mRNA中是有用的。
我們現已鑑定了在人前列腺腫瘤中發生並且與這些組織中蛋白質編碼基因的表達變化相關的微RNA表達的變化。細胞培養物中的實驗顯示，腫瘤微RNA可在人前列 腺癌細胞中調控癌症相關基因的表達。這些結果顯示微RNA在前列腺癌生物學中的致病 性作用。實施例II引言前列腺癌是最頻繁診斷的惡性腫瘤並且是美國男性癌症死亡率的第二大原因 [1]0死亡率可歸因於癌細胞在前列腺外的擴散。神經周浸潤(PNI)是前列腺癌中局部浸 潤的主要途徑並且也是疾病的前列腺外擴散的機制[2]。然而，PNI的預後意義仍然存在 爭議[3-5]。幾個研究已觀察到PNI與不良結果的標誌物的關聯[2，6-8]，但其他研究未 發現其為前列腺癌的預後因素[9-12]。PNI的發生是臨床疾病的發展中相對早期的事件，並且大多數來自根治性前列腺 切除術的腫瘤樣品是PNI陽性的[2]。正是臨床樣品中PNI的高發生率(85%至100% ) 和其生物學知識的不足限制了我們對PNi在前列腺癌進展和疾病結果中的作用的理解。PNI是其中癌細胞附著至和環繞神經的過程[13，14]。其在許多其他類型的癌 症包括胰腺癌和頭頸癌中發生[15，16]。具有神經周圍定位的前列腺癌細胞獲得了存活 和生長優勢並且當與遠離神經的細胞相比較時，展示減少的細胞凋亡和增加的增殖[17， 18]。已在PNI中觀察到粘著分子在前列腺癌細胞和相鄰神經中的表達發生改變，已假設 此類分子的改變的表達允許癌細胞在神經的附近旺盛生長[14，19]。然而，導致PNI的分子機制仍然知之甚少。在實施例II中，本發明者將微RNA和蛋白質編碼基因的基因表達特徵譜分析用 於鑑定在人前列腺癌中與PNI相關的基因表達的變化。本發明者研究，區別PNI與非PNI 腫瘤的基因表達特徵是否將顯示在從非侵襲性腫瘤轉變成具有PNI的腫瘤時發生的分子 改變。我們測定了微RNA，因為已證明它們在癌症中的至關重要的作用[20，21]。已顯 示它們的表達特徵譜根據發育譜系和分化狀態分類腫瘤[22，23]。用於實施例II的材料和方法組織樣品。從NCI Cooperative Prostate Cancer Tissue Resource (CPCTR)獲得冷凍的腫瘤樣
品。腫瘤是在前列腺切除術前未接受任何治療的切除的腺癌。由病理學家再檢查宏觀解 剖的腫瘤樣品，其確認冷凍樣品中存在腫瘤。在2002至2004年收集所有組織。組織收 集由參與單位的制度評審委員會批准。RNA 提取。按照製造商的說明書(Invitrogen，Carlsbad, CA)使用TRIZOL試劑分離總 RNA。使用 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies，Palo Alto, CA)驗證各樣品
的RNA完整性。然後將各RNA樣品分成兩等分，其經處理用於微RNA微陣列或mRNA 微陣列。基因微陣列如之前所述[24]進行微RNA的標記和雜交。微RNA微陣列(Ohio State University Comprehensive Cancer Center, Version 2.0)含有以一式四份點印的針對235個人和222個小鼠微RNA的探針[24]。按照Affymetrix標準方案(Santa Clara, CA)進行mRNA標記和 雜交。簡而言之，用在5'末端具有T7RNA聚合酶啟動子的寡聚(dT)引物反轉錄5yg總 RNA。在第二鏈合成後，通過使用來自 Enzo Life Sciences (Farmingdale，NY)的 BioArray High Yield RNA Transcript Labeling Kit T3整合生物素化的核糖核苷酸來產生cRNA。將標 記的cRNA片段化，然後與Affymetrix GeneChip HG-U133A 2.0陣列雜交。該陣列包含 代表大約13,000個人蛋白質編碼基因的22,283個探針組。使用藻紅蛋白綴合的鏈黴抗生 物素蛋白(Invitrogen)顯現雜交信號，並且使用GeneChip Scanner 3000 7G (Affymetrix)進 行掃描。根據關於微陣列實驗的最小信息(MIAME)指南，我們將額外的患者信息和微 陣列數據的CEL文件保存在GEO庫(.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。微RNA和mRNA特徵譜 數據的GEO提交登錄號都是GSE7055。可在ArrayExpress登錄號A-MEXP-258下找 到關於定製的微RNA微陣列(版本2.0)的其他信息。數據的標準化和統計分析。 將中值-中心標準化用於定製的微RNA寡核苷酸晶片。使用魯棒多晶片分析 (RMA)方法[25]標準化Affymetrix晶片。為了產生顯著差異表達的基因的清單，將所 得的數據組經歷微陣列顯著性分析(SAM)方法[26]。我們基於來自雙側t檢驗的P值和 期望的錯誤發現率(FDR)產生基因清單。FDR計算按照Storey和Tibshinmi描述的方法 [27]進行。按照Eisen等人描述的原理[28]進行無監督層次聚類。微RNA和mRNA的定量實時PCR分析。按照公開的方案[29]使用莖環TaqMan MicroRNA Assays試劑盒(Applied Biosystems, Foster City, CA)測量成熟微 RNA 的豐度。使用來自 TaqMan MicroRNA Assays試劑盒的成熟微RNA特異性環狀RT引物和來自TaqMan MicroRNA Reverse Transcription試劑盒(AppliedBiosystems)的試劑，按照製造商的指導使用IOng總RNA， 將成熟微RNA逆轉錄成5'-延伸的cDNA。 使用Applied Biosystems Taqman 2X Universal PCR Master Mix 和合適的 5X Taqman MicroRNA Assay Mix 就各目的微 RNA 對cDNA進行實時PCR。在96孔板中，將一式三份反應物在Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR系統中於95°C下溫育10分鐘，然後進行40個循環的在95°C下15秒和 在60°C下1分鐘。對於各樣品，利用ABI 7500 Sequence Detection System軟體計算循 環閾值(Ct)。使用標準曲線測定樣品中微RNA的濃度，然後將其相對於U6 RNA進行 標準化。按照之前描述的定量實時(qRT)PCR法[30]測定mRNA的豐度。因此，使用 High—Capacity cDNA Archive 試齊Ll盒(Applied Biosystems, Foster City, CA)逆轉錄 IOOng 總 RNA。然後使用 TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems)(其包括特異於 待驗證的基因的預先最優化的探針和引物組)以一式三份進行qRT-PCR。驗證的基因的 測定ID號如下Hs00744661_sH(對於金屬硫蛋白1F)和Hs00828387_gl (對於金屬硫蛋 白 1M)。使用 ABI PRISM 7500 Sequence Detection System 收集數據。將 18s RNA 用作 內部標準參照。使用如所描述的比較Ct法計算標準化的表達，倍數變化來源於各基因的 2_ΔΔΟ 值[30]。免疫組織化學在福馬林固定的、石蠟包埋的腫瘤切片上對神經周圍和非神經周圍癌細胞 中的蛋白質表達進行免疫組織化學評估。腫瘤(η = 30)來自Baltimore VA Hospital和University of Maryland Medical Center的通過根治性前列腺切除術治療的前列腺患者。就 SlOO (神經幹的標誌物)對5微米切片進行免疫組織化學染色以顯現具有PNI的區域。 發現來自14個腫瘤的切片包含具有神經周圍和非神經周圍癌細胞的代表性區域。為了 進行抗原恢復，將脫蠟的切片在&01^緩衝液(8丨0^6116^ San Ramon, CA)中進行微 波處理。用 Dako Envision 系統(DakoCytomation，Carpinteria, CA)進行免疫組織化學 染色。使用下列一抗1 500稀釋的兔多克隆抗體(對於S100) (Ventana，Tucson, AR) ； 1 1000稀釋的小鼠單克隆抗體(對於柯薩奇腺病毒受體(CXADR)) (Atlas Antibodies, Stockholm, Sweden)；和1 500稀釋的小鼠單克隆抗體(對於金屬硫蛋白) (DakoCytomation)。該抗體(E9)識別金屬硫蛋白_1和_2家族成員(#M0639)。 陽性 對照腸(CXADR)和肝(金屬硫蛋白)。一抗的省略用作陰性對照。對微陣列結果不 知情的病理學家評估神經周圍和非神經周圍癌細胞的免疫染色的強度，將神經周圍癌細 胞中的免疫染色分類為更低 的強度、相同強度或更高的強度(與非神經周圍癌細胞相比 較)。獲取代表性區域的圖像以記錄表達差異。原位雜交。按照製造商的方案，使用GenPoint Catalyzed SignalAmplification System(DakoCytomation)進行原位雜交(ISH)。簡而言之，將載玻片在60°C下溫育30分 鍾，並且如所描述的進行脫蠟。切片用蛋白酶K(Dak0Cytomatian)在室溫下處理30分 鍾，用dH20漂洗數次，然後在風乾前於95%乙醇中浸漬10秒鐘。在以50nM的終濃度 含有 5 『-生物素標記的 miR-224 miRCURY LNA 檢測探針(Exiqon，Woburn, ΜΑ) 或亂序的陰性對照探針(Exiqon)的緩衝液中於54°C下溫育過夜之前，將載玻片在54°C下 用原位雜交緩衝液(Enzo Life Sciences，Inc.Farmingdale, NY)預雜交1小時。將載玻片 在TBST和GenPoint 嚴格清洗液中進行清洗(在54°C下進行30分鐘)。然後將載玻片 暴露於H2O2封閉溶液(DakoCytomation) 20分鐘，然後在封閉緩衝液(DakoCytomation， X0909)中進一步封閉30分鐘，然後按照製造商的方案將其暴露於第一鏈黴抗生物 素-HRP抗體、生物素基酪胺(biotinyl tyramide)、第二鏈黴抗生物素-HRP抗體和DAB 色原體溶液。然後將載玻片於蘇木精中進行短暫復染，在封片之前用TBST和水漂洗。 病理學家使用相同的用於免疫組織化學的標準評估神經周圍和非神經周圍癌細胞中的 miR-224 的 ISH 強度。途徑分析。使用內部WPS軟體[31]進行該分析。按照基因本體論生物過程(GOBP) (Gene Ontology Consortium geneontology.org)注釋途徑。我們的資料庫具有1δ,762個針對 GOBP進行注釋的人基因。基於微陣列上它們的相應探針組的FDR(《30% )將基因包括 入途徑分析。如果幾個探針組編碼相同基因，那麼軟體可識別該現象並且確保在途徑水 平上只對該基因進行一次顯著性測試。將單側Fisher' s精確檢驗用於確定具有統計學上 顯著的差異表達的基因的富集(P <0.05)的生物過程。我們匯集Fisher' s精確檢驗的 結果以進行聚類分析，並且以顏色編碼的熱圖展示結果以揭示顯著改變的生物過程的模 式。熱圖的顏色編碼與生物過程中基因的富集相關(基於-Log(P值))，紅色表示更高 的富集。實施例II的結果
臨床樣品 和基因表達分析。我們從57位前列腺癌患者的根除性前列腺切除術收集了宏觀解剖的腫瘤樣品 (圖22-表8)。7個腫瘤(12% )對於PNI是陰性的。與文獻一致，這些腫瘤與PNI陽 性腫瘤相比具有更小的大小和更低的Gleasan評分。此外，所有PNI陰性腫瘤局限於前 列腺。我們研究了具有PNI的腫瘤與對於PNI是陰性的腫瘤之間的基因表達差異。使用 代表235個人微RNA的定製的微RNA微陣列和代表大約13,000個人蛋白質編碼基因的 Affymetrix GeneChip HG-U133A 2.0陣列產生來自這些腫瘤的基因表達特徵譜。在我們的數據組的初步分析中，我們將無監督層次聚類用於檢查微RNA和 mRNA的表達是否可區分具有PNI的腫瘤和不具有PN I的腫瘤。基於mRNA的全局性 表達的層次聚類不能區分PNI病例與非PN I病例(數據未顯示)。然而，這些樣品的微 RNA的表達模式產生了具有不同微RNA特徵譜的兩個主要簇(圖17A-17B)。簇#1包括 所有非PNI腫瘤和具有PNI的腫瘤的亞組。簇#2包括比簇#1中的腫瘤明顯更可能具有高 Gleason評分(之7)和前列腺外疾病擴展的PNI腫瘤(分別地，P < 0.05 ；雙側Fisher' s 精確檢驗)。微陣列數據的顯著性分析顯示，在FDR《10%的情況下，19個微RNA和34個蛋 白質編碼基因在PNI與非PNI腫瘤之間顯著地差異表達。在該閾值上，所有微RNA在 具有PNI的腫瘤中上調(圖23-表9)，而所有mRNA在PNI腫瘤中具有比在非PNI腫瘤 中更低的表達(圖24-表10)。差異表達的微RNA的該清單在我們的數據組中對於PNI與非PNI腫瘤之間 的比較是獨特的。此類微RNA中沒有一個因腫瘤分級或分期而顯著地差異表達(FDR < 30% )0 與PNI對非PNI的比較相反，只有極少數微RNA在高(總評分7-9)和低 (總評分5-6) Gleason評分之間(例如，miR-1在具有高Gleason評分的腫瘤中下調)以及 在器官局限性腫瘤與具有前列腺外擴展的腫瘤之間顯著地差異表達。在PNI與非PNI腫 瘤之間差異表達的蛋白質編碼基因中，許多基因編碼金屬硫蛋白(金屬硫蛋白IF、1G、 1H、1M、IX、2A)或具有線粒體定位的蛋白質(4-氨基丁酸轉氨酶、亞鐵螯合酶和長鏈 醯基輔酶A脫氫酶、線粒體核糖體蛋白L39/S1)。當與低Gleasan評分腫瘤相比較時， 此類基因的亞組也在具有高Gleasan評分的腫瘤中下調(圖19A-19D)。與因腫瘤分期而 差異表達的基因不存在重疊。通過qRT-PCR進行的對微陣列數據的驗證。選擇5個微RNA和2個mRNA用於通過qRT_PCR進行驗證(圖25-表11)。 與微陣列數據一致，我們發現，當與非PNI腫瘤相比較時，成熟miR-224、miR-10、 miR_125b、miR_30c和miR-100在PNI腫瘤中的表達顯著更高。當與非PNI腫瘤相比較 時，金屬硫蛋白IM和IF的轉錄物水平在PNI腫瘤中顯著更低，這也與我們的微陣列數
據一致。因PNI狀態而差異表達的蛋白質編碼基因的途徑關聯。我們基於GOBP注釋的基因(η = 62)進行途徑分析，所述基因的mRNA在 FDR^30%時在PNI與非PNI腫瘤之間差異表達。分析顯示了富集差異表達的基因(比較 PNI腫瘤與非PNI腫瘤)的許多生物過程。最顯著改變的生物過程包括有機酸(羧酸)/ 脂肪酸、胺基酸和(聚)胺的轉運和代謝(圖26-表12)。它們還包括「神經發生」的生物過程，這與PNI中腫瘤細胞與神經之間的已知的相互作用一致。進行聚類分析以鑑定富集因腫瘤PNI狀態(PNI陽性對PNI陰性)而非因Gleason 評分(高對低Gleasan評分)、病理分期(pT3對pT2)、或因前列腺外擴展的存在(存在 對不存在)而差異表達的基因的生物過程。如通過熱圖顯示的，分析鑑定了獨特地富集 比較PNI陽性與PNI陰性腫瘤而產生的差異表達的基因的許多生物過程(圖18)。這些 生物過程包括有機酸(羧酸)/脂肪酸、胺基酸和(聚)胺的代謝和轉運，如之前所描述 的，還包括與程序化細胞死亡的負調控相關的過程。神經周圍癌細胞中金屬硫蛋白、柯薩奇腺病毒受體和miR-224的表達。 儘管我們的基於微陣列的分析表明，PNI與非PNI腫瘤在它們的基因表達模式上 不同，但該方法未提供關於此類基因在神經周圍和非神經周圍癌細胞中的表達的信息。 我們使用免疫組織化學和原位雜交來研究兩種蛋白質編碼基因，金屬硫蛋白(金屬硫蛋 白-1和-2)和柯薩奇腺病毒受體(CXADR)以及miR-224在神經周圍和非神經周圍癌細 胞中的相對表達。對來自14個腫瘤的切片進行免疫組織化學，所述切片包含神經周圍和 非神經周圍癌細胞的代表性區域。對來自11個腫瘤的切片進行原位雜交。已發現金屬硫蛋白、CXADR和miR-224在腫瘤上皮中表達(圖19A-19D，圖 20A-20D和圖21A-21D)。金屬硫蛋白(上皮、細胞質、細胞核)和CXADR(上皮、 膜、細胞質)的標記模式與其他研究人員描述的一致[32，33]。當與相同組織中的非神 經周圍癌細胞相比較時，分別在6個腫瘤(43%)和7個腫瘤(50%)的神經周圍癌細胞 中觀察到金屬硫蛋白和CXADR的更低的表達(圖19A-19D，圖20A-20D)。除了一個 腫瘤(7%)外(其中金屬硫蛋白的表達在神經周圍癌細胞中的評分比非神經周圍癌細胞更 高)，在其他腫瘤中未檢測到差異。在4個腫瘤(36%)中觀察到，miR-224在神經周圍 癌細胞中的表達顯著增加(圖21A-21D)。在其他7個腫瘤(其中miR-224的表達在腫 瘤上皮中大部分低至不可檢測)中未看到這樣的差異。實施例II的討論我們研究了 PNI與非PNI腫瘤的基因表達特徵譜並且發現它們之間的微RNA與 mRNA的表達的顯著差異。最令人驚訝的是，基於235個微RNA的表達的無監督層次聚 類分析產生兩個主要的腫瘤簇，其中一個包括所有非PNI腫瘤。基於13,000個蛋白質編 碼轉錄物的表達，我們不能獲得這樣的分類，這與不能發現前列腺癌中與局部侵襲相關 的mRNA表達特徵的其他研究一致[34]。我們的發現顯示，當與非PNI腫瘤相比較時，微RNA的表達可以是比mRNA表 達更獨特的PNI腫瘤特徵。這些發現與之前的報導一致，所述報導顯示微RNA表達特徵 譜在根據發育譜系和分化狀態分類腫瘤中可優於mRNA表達特徵譜[22，23]。發現19個微RNA在PNI腫瘤中比在非PNI腫瘤中更高地表達。其中，miR-10、 miR-21和miR_125b是候選癌基因[35-37]。此外，miR_21和miR-224位於惡性腫瘤相 關染色體區域，已發現該區域在人前列腺癌中具有增加的基因表達[38]。已描述了對於 幾種人實體癌包括前列腺癌是共同的微RNA表達特徵[23]。該研究與我們的PNI特徵之 間的共有微RNA是miR-21、miR_24和miR_30c。然而，最值得注意的是，PNI特徵與 在實驗條件下發現的其他微RNA特徵的重疊。已發現缺氧誘導 miR-24、miR_26、miR_27 和 miR_181[39]。此類微 RNA 也在PNI腫瘤中上調。甚至更顯著的是PNI特徵與LPS處理的小鼠的肺中炎症誘導的微RNA 特徵之間的相似性。此處，LPS誘導，除幾種其他的微RNA以外，miR-21，miR_27b， miR-100和miR_224[40]。因此，觀察到的PNI微RNA特徵可能部分地是癌性前列腺中
促炎環境和缺氧的結果。 為了估計PNI特徵中由腫瘤分級和分期產生混雜效應的可能性，我們將在PNI與 非PNI腫瘤之間差異表達的微RNA的清單與比較高Gleason評分的腫瘤與低Gleason評 分的腫瘤以及比較器官局限性腫瘤與顯示前列腺外擴展的腫瘤得到的相同清單相比較。 該額外的分析顯示，這兩個對比不共有PNI特徵。相反地，只發現極少數微RNA因腫 瘤分級和分期而顯著差異地表達。前列腺腫瘤的異質性可能已限制我們發現與這兩個預 後因素相關的微RNA特徵的能力。備選地，PNI特徵對於非PNI至PNI的轉換可以是 顯著不同和獨特的並且可能特異性地參與神經與癌細胞之間的相互作用。該特徵還可以 是癌細胞的瞬時現象，當這些細胞從它們的神經周圍定位擴散時，該特徵消失。我們分 析miR_224(因PNI狀態而最差異地表達的微RNA)在神經周圍和非神經周圍癌細胞中 的表達並且發現其在腫瘤亞組的神經周圍癌細胞中表達增加。雖然並非所有腫瘤都顯示 miR-224在神經周圍癌細胞中上調，但觀察顯示，癌細胞籍以附著至神經的機制可牽涉 miR-224的誘導。mRNA表達特徵譜的分析顯示，在FDR閾值時34個基因在PN I腫瘤中 下調。即使我們觀察到在PNI腫瘤中比在非PNI腫瘤中更高表達的基因例如CRISP3， PSCA, BMP7或BCL2，它們的高FDR也將它們排除出我們的顯著差異表達的基因的清 單。只有兩個其他的研究(使用DU-145前列腺癌細胞與神經元細胞的共培養模型)檢查 了與PNI相關的mRNA的表達特徵譜[18，19]。這些研究發現編碼bystin和Pim_2的基 因在PNI中上調。我們在PNI腫瘤中未檢測到相應的mRNA的增加。不同的方法可解 釋不同研究中產生的基因清單之間的一些差異。此外，我們的晶片不包括針對編碼bystin 的基因的探針組。34個差異表達的基因中的幾個基因是金屬硫蛋白基因家族的成員。這些基因位 於染色體16ql3上的基因簇中[41]並且已發現這些基因通過啟動子超甲基化和減少的鋅可 用性在前列腺癌中下調[32，42，43]。通過免疫組織化學，我們確認，當與前列腺腫瘤 亞組中非神經周圍癌細胞相比較時，金屬硫蛋白的表達在神經周圍癌細胞中顯著更低。 在從非PNI腫瘤至PNI腫瘤的轉換時的下調可顯示在該疾病期發生的癌細胞金屬代謝的重 要變化。我們的差異表達的基因的清單中幾個其他基因編碼具有線粒體定位的蛋白質， 例如，特別地，4-氨基丁酸轉氨酶、亞鐵螯合酶和長鏈醯基輔酶A脫氫酶。氨基丁酸轉 氨酶和長鏈醯基輔酶A脫氫酶是細胞的有機酸(羧酸)代謝(例如酮體，脂肪酸)中的至 關重要的基因，而亞鐵螯合酶參與血紅素的生物合成[44]。線粒體的代謝和基因組的改 變是前列腺癌發生中的常見事件[45-47]。我們的數據顯示，一些此類改變可在至PNI-陽 性腫瘤的轉換中發生。發現其在PNI腫瘤中下調的其他基因是編碼精胺合酶、ν-MAF癌基因同源物 (MAF)和CXADR的基因。精胺合酶是催化亞精胺轉化為精胺的多胺合成途徑的至關重 要的酶。已觀察到多胺合成途徑在前列腺癌中轉錄失調[48]。精胺是前列腺癌細胞生長 的內源抑制劑[49]。因此，精胺合酶的下調可允許前列腺癌細胞在神經周圍環境中增加生長和存活。MAF是淋巴瘤和骨髓瘤的癌基因，但發現其為前列腺癌的候選腫瘤抑制基 因[50]。CXADR在腺病毒至人細胞內的攝取中具有至關重要的功能[51]。已發現當與 正常前列腺相 比較時，該受體在局部晚期前列腺癌中下調[33]。因為單基因效應不可能引起PNI，所以我們進行在PNI腫瘤與非PNI腫瘤之間差 異表達的蛋白質編碼基因的途徑分析。該分析顯示，當與非PNI腫瘤相比較時，PNI腫 瘤中最顯著改變的生物過程是調控細胞和能量代謝的生物過程。其他改變的生物過程與 神經元功能例如神經發生和神經衝動的傳遞以及與細胞死亡的負調控相關。後者與之前 的發現(即，神經周圍定位的前列腺癌細胞顯示減少的細胞凋亡和增加的存活)[17，18] 一致。我們觀察到在從非PNI腫瘤轉換成PNI腫瘤時微RNA和mRNA表達發生顯著改 變。無監督層次聚類顯示，非PNI腫瘤與PNI腫瘤在它們的微RNA表達特徵譜上的差 異大於在它們的mRNA表達特徵譜上的差異。我們還鑑定了與線粒體功能和細胞代謝相 關的許多基因和生物過程，其在PNI中可以是功能上顯著的。其用途和定義的實例除非另外指出，否則本發明的實施將使用在本領域技術人員的能力之內的藥物 學、化學、生物化學、重組DNA技術和免疫學的常規方法。此類技術在文獻中得到詳盡 的解釋。參見，例如，Handbook of Experimental Immunology，第 I-IV 卷(D.M.Weir 禾口 C.C.Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications) ； A.L.Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition) ； Sambrook 等人，Molecular Cloning A Laboratory Manual (第 2 版，1989) ； Methods In Enzymology (S.Colowick 禾口 N.Kaplan eds., Academic Press, Inc.)。因此，本文中提供了用於進一步解釋的定義，所述定義不應解釋為限定性的。冠詞「a」和「an」在本文中是指一個或多於一個(即，至少一個)冠詞的語 法對象。例如，「an element」是指一個元素或多於一個的元素。「標誌物」和「生物標誌物」是與其在正常或健康組織或細胞中的表達水平相 比，其在組織或細胞中改變的表達水平與病症和/或疾病狀態相關的基因和/或蛋白質和 /或其功能性變體。標誌物的「正常」的表達水平是標誌物在未患病症和/或疾病狀態的人受試者 或患者的細胞中的表達水平。標誌物的「過表達」或「顯著更高的表達水平」是指測試樣品中的表達水平， 所述表達水平高於用於估量表達的測定的標準誤，在某些實施方案中，至少2倍，在其 他實施方案中，3、4、5或10倍於對照樣品(例如，來自未患有標誌物相關病症和/或疾 病狀態的健康受試者的樣品)中的標誌物的表達水平和在某些實施方案中幾個對照樣品 中的標誌物的平均表達水平。標誌物的「顯著更低的表達水平」是指測試樣品中的表達水平，所述表達水平 比對照樣品(例如，來自未患有標誌物相關病症和/或疾病狀態的健康受試者的樣品)中 的標誌物的表達水平和在某些實施方案中幾個對照樣品中的標誌物的平均表達水平低至 少2倍，在其他實施方案中低3、4、5或10倍。試劑盒是包含至少一種試劑，例如用於特異性檢測標誌物的表達的探針的任何產品(例如，包裝或容器)。可以以用於進行本發明的方法的單位的形式推銷 (promote) >分配或銷售試劑盒。「蛋白質」包括標誌物蛋白和它們的片段；變異標誌物蛋白和它們的片段；包 含標誌物或變異標誌物蛋白的至少15個胺基酸的區段的肽和多肽；以及包含標誌物或變 異標誌物蛋白，或標誌物或變異標誌物蛋白的至少15個胺基酸的區段的融合蛋白。本文中所述的組合物、試劑盒和方法特別地具有下列非限定性用途1)評估受試者是否患有病症和/或疾病狀態；2)評估受試者的病症和/或疾病狀態的分期；3)評估受試者的病症和/或疾病狀態的分級； 4)評估受試者的病症和/或疾病狀態的性質；5)評估受試者發生病症和/或疾病狀態的可能性；6)評估與受試者的病症和/或疾病狀態相關的細胞的組織學類型；7)製備可用於治療受試者的病症和/或疾病狀態的抗體、抗體片段或抗體衍生 物；8)評估病症和/或疾病狀態在受試者的細胞中的存在；9)評估一種或多種測試化合物抑制受試者的病症和/或疾病狀態的功效；10)評估療法抑制受試者的病症和/或疾病狀態的功效；11)監控受試者的病症和/或疾病狀態的進展；12)選擇抑制受試者的病症和/或疾病狀態的組合物或療法；13)治療患有病症和/或疾病狀態的受試者；14)抑制受試者的病症和/或疾病狀態；15)評估測試化合物的有害潛能；和16)預防處於發生病症和/或疾病狀態的風險中的受試者的病症和/或疾病狀態 的發作。篩選方法可產生動物模型以使能夠篩選可用於治療或預防受試者的病症和/或疾病狀態 的治療劑。因此，該方法可用於鑑定用於治療或預防受試者的病症和/或疾病狀態的治 療劑。該方法包括對由本文所述的方法產生的動物模型施用候選試劑，評估與未施用候 選試劑的對照動物模型相比動物模型中的至少一種應答。如果至少一種應答在症狀上減 輕或在發作上延遲，則候選試劑是用於治療或預防疾病的試劑。候選試劑可以是本領域已知的藥理學試劑(pharmacologic agent)或可以是之前未
知具有任何藥理活性的試劑。試劑可以是天然產生的或實驗室中設計的。它們可從微 生物、動物或植物分離，或可重組產生或通過任何適當的化學方法合成。它們可以是小 分子、核酸、蛋白質、肽或模擬肽(peptidomimetics)。在某些實施方案中，候選試劑是 具有大於50且小於大約2,500道爾頓的分子量的小有機化合物。候選試劑包含與蛋白質 結構性相互作用所必需的官能團。還在生物分子中發現候選試劑，包括但不限於肽、 糖、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶、其衍生物、結構類似物或組合。可從多種來源(包括合成的或天然化合物的文庫)獲得候選試劑。存在例如許多 可獲得用於隨機和定向合成多種有機化合物和生物分子的方法，包括隨機化寡核苷酸和寡肽的表達。備選地，以細菌、真菌、植物和動物提取物的形式存在的天然化合物的文 庫是可獲得的或可容易地產生。此外，天然或合成產生的文庫和化合物可容易地通過常 規化學、物理和生物學方法進行修飾，並且可用於產生組合文庫。在某些實施方案中， 候選試劑可使用組合文庫方法領域中的許多方法中的任一方法來獲得，所述方法包括非 限定性實例生物文庫法；空間可定位平行固相或溶液相文庫法(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries)；需要角軍卷禾只(deconvolution)的合成文庫法； 「 一珠一化合物(one-bead one-compound)」文庫法；和使用親和層析選擇的合成文庫 法。 在某些其他實施方案中，可將某些藥理學藥劑經歷定向或隨機化學修飾，例如 醯化、烷化、酯化、醯胺化(amidification)等以產生結構類似物。用於鑑定治療受試者的病症和/或疾病狀態的治療劑的相同方法還可用於驗證 體外研究產生的前導化合物(lead compound) /試劑。候選試劑可以是上調或下調受試者中一個或多個病症和/或疾病狀態應答途徑 的試劑。在某些實施方案中，候選試劑可以是影響這樣的途徑的拮抗劑。用於治療病症和/或疾病狀態的方法本文提供了用於治療、抑制、減輕或逆轉病症和/或疾病狀態應答的方法。在 本文所述的方法中，對有此需要的個體施用幹擾信號級聯的試劑，所述個體例如但不限 於其中這樣的併發症還不明顯的受試者和已具有至少一種這樣的應答的受試者。在前一種情況下，這樣的治療用於預防此類應答的發生和/或減輕它們發生的 程度。在後一種情況下，這樣的治療用於減輕此類應答發生的程度，阻止它們進一步發 展或逆轉所述應答。在某些實施方案中，幹擾應答級聯的試劑可以是對此類應答特異的抗體。生物標誌物的表達可以以許多方式抑制標誌物的表達，所述方式包括非限定性實例可對疾病細 胞提供反義寡核苷酸以抑制標誌物的轉錄、翻譯或兩者。備選地，可對細胞提供編碼特 異性結合標誌物蛋白的抗體、抗體衍生物或抗體片段並且與適當的啟動子/調節子區域 有效連接的多核苷酸，以產生抑制所述蛋白的功能或活性的細胞內抗體。標誌物的表達 和/或功能還可通過用特異性結合標誌物蛋白的抗體、抗體衍生物或抗體片段處理疾病 細胞來抑制。通過使用本文中描述的方法，可篩選多種分子，特別地包括足夠小以使它 們能夠穿過細胞膜的分子，以鑑定抑制標誌物的表達或抑制標誌物蛋白的功能的分子。 可對受試者提供如此鑑定的化合物以抑制受試者的疾病細胞。任何標誌物或標誌物的組合，以及與所述標誌物組合的任何特定標誌物可用於 本文中描述的組合物、試劑盒和方法中。一般地，期望使用這樣的標誌物，對於所述標 志物，疾病細胞中該標誌物的表達水平與正常系統細胞中相同標誌物的表達水平之間的 差異儘可能大。雖然該差異可以小至用於評估標誌物的表達的方法的檢測極限，但期望 差異至少大於評估方法的標準誤，在一些實施方案中，與正常組織中相同標誌物的表達 水平相比，至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、100、500、1000 倍或更大的差
已已公認，某些標誌物蛋白被分泌至圍繞細胞的細胞外空間。由於此類標誌物蛋白可在體液樣品中檢測，因此將這些標誌物用於組合物、試劑盒和方法的某些實施方案，所述體液樣品可以比組織活檢樣品更容易地從人受試者收集。此外，用於檢測標誌 物蛋白的體內技術包括將抗所述蛋白的標記抗體引入受試者。例如，抗體可用其在受試 者中的存在和定位可利用標準成像技術來檢測的放射性標記物進行標記。為了確定任何特定的標誌物蛋白是否是分泌蛋白，在例如哺乳動物細胞例如人 細胞系中表達標誌物蛋白，收集細胞外液體，評估蛋白質在細胞外液體中的存在或不存 在(例如，使用特異性結合所述蛋白的標記抗體)。應理解，含有此類細胞的受試者樣品可用於本文中所述的方法。在這些實施方 案中，標誌物的表達水平可通過評估樣品中標誌物的量(例如，絕對量或濃度)來評估。 當然，可在評估樣品中標誌物的量之前將細胞樣品經歷多種收集後製備和貯藏技術(例 如，核酸和/或蛋白質提取、固定、貯藏、冷凍、超濾、濃縮、蒸發、離心等)。還應理解，可使標誌物流出細胞進入例如呼吸系統、消化系統、血流和/或間 質間隙。可以例如通過檢查痰、BAL、血清、血漿、尿、糞便等來檢測流出的標誌物。組合物、試劑盒和方法可用於檢測標誌物蛋白的表達，所述標誌物蛋白具有至 少一個展示於表達其的細胞的表面上的部分。例如，可將免疫學方法用於檢測完整細胞 上的此類蛋白，或可將基於計算機的序列分析法用於預測至少一個細胞外結構域(即， 包括分泌蛋白和具有至少一個細胞表面結構域的蛋白質)的存在。可檢測標誌物蛋白的 表達而無需裂解細胞(例如，使用特異性結合蛋白的細胞表面結構域的標記抗體)，所述 標誌物蛋白具有至少一個展示於表達其的細胞的表面上的部分。標誌物的表達可通過多種用於檢測轉錄的核酸或蛋白質的表達的方法中的任一 種來評估。此類方法的非限定性實例包括用於檢測分泌蛋白、細胞表面蛋白、細胞質蛋 白或核蛋白的免疫學方法、蛋白質純化法、蛋白質功能或活性測定法、核酸雜交法、核 酸逆轉錄法以及核酸擴增法。在特定的實施方案中，標誌物的表達可使用特異性結合標誌物蛋白或其片段 (包括已經歷所有或部分其正常翻譯後修飾的標誌物蛋白)的抗體(例如，放射性標記 的、發色團標記的、螢光團標記的或酶標記的抗體)、抗體衍生物(例如，綴合有底物或 蛋白質或蛋白質-配體對的配體的抗體)或抗體片段(例如，單鏈抗體、分離的抗體高變 結構域等)來評估。在另一個特定的實施方案中，標誌物的表達通過下述來評估從受試者樣品的 細胞製備mRNA/cDNA(即，轉錄的多核苷酸)，然後將mRNA/cDNA與為標誌物核酸的 互補序列的參照多核苷酸或其片段雜交。任選地，可在與參照多核苷酸雜交前使用多種 聚合酶鏈式反應方法中的任一種來擴增cDNA ；優選，其不進行擴增。同樣可使用定量 PCR檢測一個或多個標誌物的表達以評估標誌物的表達水平。備選地，可使用檢測標誌 物的突變或變體(例如，單核苷酸多態性、缺失等)的許多方法中的任一種來檢測受試者 中標誌物的存在。在相關實施方案中，將獲自樣品的轉錄的多核苷酸的混合物與在其上固定有多 核苷酸(其與標誌物核酸的至少一部分(例如，至少7、10、15、20、25、30、40、50、 100、500或更多個核苷酸殘基)互補或同源)的基質接觸。如果可在基質上差異地檢測 到互補或同源的多核苷酸(例如，可使用不同的發色團或螢光團檢測或固定至不同的選擇的位置)，那麼可使用單個基質(例如，固定在所選擇的位置上的多核苷酸的「基因晶片」微陣列)同時評估多個標誌物的表達水平。當使用包括將一個核酸與另一個核酸雜 交的評估標誌物表達的方法時，期望在嚴格雜交條件下進行雜交。在某些實施方案中，可使用質譜法或表面等離子共振術進行生物標誌物測定 (biomarker assay)。在不同的實施方案中，鑑定活性抗受試者的病症和/或疾病狀態的 試劑的方法可包括一個或多個下列步驟a)提供含有一個或多個標誌物或其衍生物的細 胞的樣品；b)從此類細胞製備提取物；c)將所述提取物與含有標誌物結合位點的標記 核酸探針混合；和，d)在測試試劑存在或不存在的情況下測定標誌物與核酸探針之間的 複合物的形成。測定步驟可包括將所述提取物/核酸探針混合物經歷電泳遷移率試驗 (electrophoretic mobility shift assay)。在某些實施方案中，測定步驟包括選自酶聯免疫吸附測定(ELISA)、基於螢光 的測定和超高通量測定，例如，表面等離子共振術(SPR)或螢光相關光譜(FCS)測定的 測定。在此類實施方案中，SPR傳感器用於指導生物分子相互作用的實時觀察，因為 SPR對金屬-電介質表面上的微小折射率改變非常敏感。SPR是對大約200nm的SPR傳 感器/樣品介面內的IO5至10_6折射率(RI)單位的改變敏感的表面技術。因此，SPR光 譜法用於監控沉積在傳感層上的薄有機薄膜的生長。因為組合物、試劑盒和方法依賴於一種或多種標誌物的表達水平的差異的檢 測，因此期望標誌物的表達水平顯著大於用於評估至少一種正常細胞和受癌症影響的細 胞中的表達的方法的最小檢測極限。應理解，通過使用一種或多種標誌物對另外的受試者樣品進行常規篩選，將了 解某些標誌物在不同類型的細胞，包括受試者的特定病症和/或疾病狀態細胞中過表 達。此外，通過就標誌物的表達評估更大數量的受試者樣品，並且使從其獲得樣品 的個體受試者的結果相互關聯，還將確認某些標誌物的改變的表達與受試者的病症和/ 或疾病狀態強相關以及其他標誌物的改變的表達與其他疾病強相關。從而組合物、試劑 盒和方法可用於表徵受試者的病症和/或疾病狀態的分期、分級、組織學類型和性質中 的一種或多種。當組合物、試劑盒和方法用於表徵受試者的病症和/或疾病狀態的分期、分 級、組織學類型和性質中的一種或多種時，期望選擇標誌物或標誌物組以使在至少大約 20%,在某些實施方案中，至少大約40%、60%或80%和基本上所有受試者(其患有相 應分期、分級、組織學類型或性質的病症和/或疾病狀態)中獲得陽性結果。可選擇本 發明的標誌物或標誌物組以使對於一般群體可獲得大於大約10%的陽性預測值(在非限 定性的實例中，外加大於80%的測定特異性)。當多個標誌物用於組合物、試劑盒和方法時，可在單個反應混合物(即，使用 針對各個標誌物的試劑，例如不同的螢光探針)或在相應於一個或多個標誌物的單獨的 反應混合物中，將受試者樣品中各標誌物的表達水平與相同類型的非病症和/或非疾病 樣品中多個標誌物中的每一個的正常表達水平相比較。在一個實施方案中，相對於相應 的正常水平，樣品中一個以上的標誌物的顯著增加的表達水平表示受試者患有病症和/ 或疾病狀態。當使用多個標誌物時，可使用2、3、4、5、8、10、12、15、20、30或50或更多個單獨的標誌物；在某些實施方案中，可能期望使用更少的標誌物。為了使組合物、試劑盒和方法的靈敏性最大化(即在幹擾可歸因於受試者樣品 中系統來源的細胞的情況下)，期望本文中所使用的標誌物是具有受限制的組織分布(例 如通常不在非系統組織中表達)的標誌物。應認識到，組合物、試劑盒和方法對於具有增加的發生受試者的病症和/或疾 病狀態的風險的受試者和他們的醫學顧問將是特別有用的。被認為具有增加的發生病症 和/或疾病的風險的受試者包括例如具有此類病症或疾病的家族史的受試者。可以以多種方法評估正常人系統組織中標誌物的表達水平。在一個實施方案 中，該正常表達水平通過下述來評估評估一部分表現正常的系統細胞中標誌物的表達 水平且將該正常表達水平與一部分懷疑為異常的系統細胞中的表達水平相比較。備選 地，特別是當由於常規進行本文中所述的方法而可獲得進一步的信息時，可使用標誌物 的正常表達的群體平均值。在其他實施方案中，標誌物的"正常"表達水平可通過評 估標誌物在從未受影響的受試者獲得的受試者樣品、在懷疑病症和/或疾病狀態在受試 者中發作之前從受試者獲得的受試者樣品、編檔保存的受試者樣品等中的表達來進行測 定。本文中還提供了用於評估病症和/或疾病狀態細胞在樣品(例如編檔保存的組織 樣品或從受試者獲得的樣品)中的存在的組合物、試劑盒和方法。這些組合物、試劑盒 和方法基本上與上述的相同，除了必要時，使組合物、試劑盒和方法適用於除了受試者 樣品外的樣品。例如，當待使用的樣品是石蠟包埋的(parafinized)編檔保存的人組織樣 品時，可能必需在用於評估樣品中標誌物表達水平的組合物、試劑盒或方法中調整化合 物的比例。試劑盒和試劑試劑盒可用於評估疾病細胞的存在(例如在樣品例如受試者樣品中)。試劑盒包 括多種試劑，其各自能夠特異性結合標誌物核酸或蛋白質。用於與標誌物蛋白結合的合 適的試劑包括抗體、抗體衍生物、抗體片段等。用於與標誌物核酸(例如基因組DNA、 MRNA、剪接的MRNA、cDNA等)結合的合適的試劑包括互補核酸。例如，核酸試劑 可包括固定至基質的寡核苷酸(標記的或未標記的)、不與基質結合的標記的寡核苷酸、 PCR引物對、分子信標探針等。試劑盒可任選地包含用於進行本文中所述的方法的另外的成分。例如，試劑盒 可包含適合於使互補核酸退火或適合於使抗體與其特異性結合的蛋白質結合的液體(例 如SSC緩衝液)、一個或多個樣品隔室、描述方法的進行的說明書、正常系統細胞樣品、 癌症相關疾病細胞樣品等。 產生抗體的方法本文中還提供了製備產生用於評估受試者是否患有病症和/或疾病狀態的抗體 的分離的雜交瘤的方法。在該方法中，合成或分離(例如通過從表達其的細胞純化或通 過體內或體外轉錄和翻譯編碼蛋白質或肽的核酸)含有完整標誌物蛋白或其區段的蛋白 質或肽。使用蛋白質或肽免疫脊椎動物例如哺乳動物例如小鼠、大鼠、兔或綿羊。任選 地(和優選地)可用蛋白質或肽免疫脊椎動物至少另外一次，從而使脊椎動物呈現強烈的 針對蛋白質或肽的免疫應答。從免疫的脊椎動物分離脾細胞，使用多種方法中的任一種將其與永生化的細胞系融合從而形成雜交瘤。然後使用標準方法篩選以該方式形成的雜 交瘤，從而鑑定一個或多個產生特異性結合標誌物蛋白或其片段的抗體的雜交瘤。本文 還提供了通過該方法製備的雜交瘤和使用這樣的雜交瘤製備的抗體。評估有效性的方法本文還提供了評估測試化合物抑制疾病細胞的有效性的方法。如上所述，標誌 物的表達水平的差異與受試者的細胞的異常狀態相關。雖然公認，某些標誌物的表達水 平的變化可能由此類細胞的異常狀態引起，但同樣公認，其他標誌物的表達水平的變化 誘導、維持和促進此類細胞的異常狀態。因此，抑制受試者的病症和/或疾病狀態的化 合物將使一個或多個標誌物的表達水平改變至更接近該標誌物的正常表達水平(即，所 述標誌物在正常細胞中的表達水平)的水平。因此本方法包括將在測試化合物存在的情況下維持的第一細胞樣品中的標誌物 的表達與在測試化合物不存在的情況下維持的第二細胞樣品中的標誌物的表達相比較。 在測試化合物存在的情況下，標誌物的顯著減少的表達表示該測試化合物抑制相關疾 病。細胞樣品可以例如是獲自受試者的正常細胞的單個樣品的等分、獲自受試者的正常 細胞的混合樣品、正常細胞系的細胞、獲自受試者的相關疾病細胞的單個樣品的等分、 獲自受試者的相關疾病細胞的混合樣品、相關疾病細胞系的細胞等。在一個實施方案中，樣品是獲自受試者的癌症相關疾病細胞，並且檢測多種據 認為對於抑 制各種癌症相關疾病是有效的化合物，以鑑定可能最佳地抑制受試者的癌症 相關疾病的化合物。同樣可將該方法用於評估療法抑制受試者的相關疾病的有效性。在該方法中， 評估一個或多個標誌物在樣品對(一個樣品經歷療法，另一個不經歷療法)中的表達水 平。與評估測試化合物的有效性的方法一樣，如果療法誘導顯著更低的標誌物表達水 平，則療法對於抑制癌症相關疾病是有效的。如上，如果來自選擇的受試者的樣品用於 本方法，那麼可在體外評估備選療法以選擇對於抑制受試者的癌症相關疾病最可能有效 的療法。如本文中所描述的，人細胞的異常狀態與標誌物的表達水平的變化相關。還提 供了用於評估測試化合物的有害潛能的方法。該方法包括在測試化合物存在和不存的情 況下維持分開的人細胞等分。比較各等分中標誌物的表達。在測試化合物存在的情況下 維持的等分中標誌物的顯著更高的表達水平(相對於在測試化合物不存在的情況下維持 的等分)表示測試化合物具有有害的潛能。各種測試化合物的相對有害潛能可通過比較 相關標誌物的表達水平的增強或抑制的程度，通過比較其表達水平被增強或抑制的標誌 物的數目，或通過比較兩者來評估。在下列部分更詳細地描述了各個方面。分離的蛋白質和抗體一個方面涉及分離的標誌物蛋白和其生物活性部分，以及適合用作免疫原以產 生抗標誌物蛋白或其片段的抗體的多肽片段。在一個實施方案中，天然標誌物蛋白可使 用標準蛋白質純化技術通過適當的純化方案從細胞或組織來源分離。在另一個實施方案 中，含有完整的標誌物蛋白或其區段的蛋白質或肽通過重組DNA技術產生。除重組表達 夕卜，可使用標準肽合成技術化學合成此類蛋白質或肽。「分離的」或「純化的」蛋白質或其生物活性部分基本上不含細胞材料或來自細胞或組織來源(所述蛋白質源自於其)的其他汙染性蛋白，或當化學合成時基本上不含 化學前體或其他化學藥品。術語「基本上不含細胞材料」包括其中將蛋白質與從其分離 或重組產生所述蛋白質的細胞的細胞組分分離的蛋白質製劑。因此，基本上不含細胞材 料的蛋白質包括具有低於大約30%、20%, 10%或5% (按乾重計算)的異種蛋白質(在 本文中也稱為「汙染性蛋白」)的蛋白質製劑。 當重組產生蛋白質或其生物活性部分時，其也優選基本上不含培養基，即，培 養基佔據低於大約20%、10%或5%的蛋白質製劑的體積。當通過化學合成產生蛋白質 時，其優選基本上不含化學前體或其他化學藥品，即，其與參與蛋白質合成的化學前體 或其他化學藥品分離。因此，此類蛋白質製劑具有低於大約30%、20%, 10%, 5% (按 乾重計算)的化學前體或除了目的多肽外的化合物。標誌物蛋白的生物活性部分包括含有與標誌物蛋白的胺基酸序列充分同一或源 自於其的胺基酸序列的多肽，其包含比全長蛋白質更少的胺基酸，並且展示相應的全長 蛋白質的至少一種活性。通常，生物活性部分包含具有相應的全長蛋白質的至少一種活 性的結構域或基序。標誌物蛋白的生物活性部分可以是其長度為例如10、25、50、100 或更多個胺基酸的多肽。此外，其中標誌物蛋白的其他區域被缺失的其他生物活性部分 可通過重組技術來製備，並且可就標誌物蛋白的天然形式的一種或多種功能活性對其進 行評估。在某些實施方案中，有用的蛋白質與此類序列之一基本上同一(例如，至少大 約40%，在某些實施方案中，50%、60%, 70%, 80%, 90%, 95%或99%同一)並且 保持相應的天然發生的標誌物蛋白的功能活性但因天然等位基因變異或誘變而在胺基酸 序列上不同。此外，標誌物蛋白的區段文庫可用於產生用於篩選和隨後選擇變異標誌物蛋白 或其區段的多肽的多樣化(variegated)群體。預測醫學本文中還提供了動物模型和標誌物在預測醫學領域中的用途，其中診斷測定、 預後測定、藥物基因組學和監控臨床試驗用於預後(預測)目的，從而預防性治療個體。 因此，本文中還提供了用於測定一個或多個標誌物蛋白或核酸的表達水平以確定個體是 否處於發生特定病症和/或疾病的風險中的診斷測定。此類測定可用於預後或預測目 的，從而在病症和/或疾病發作之前預防性治療個體。在另一個方面，方法可用於相同個體的至少周期性篩查以觀察該個體是否已暴 露於改變他/她的表達模式的化學藥品或毒素。另一方面涉及監控被施用以抑制病症和/或疾病或治療或預防任何其他病症的 試劑(例如，藥物或其他化合物)在臨床試驗中對標誌物的表達或活性的影響(例如，以 了解這樣的治療可能具有的任何系統性作用)。藥物組合物化合物可進行配製以用於在合適的藥物載體中局部(topically)、局域(locally) 或全身性施用。Remington 『 s Pharmaceutical Sciences,第 15 版，E.W.Martin (Mark Publishing Company, 1975)，公開了常用載體和製備方法。化合物還可以封裝在用於靶 向細胞的合適的生物相容性微膠囊、微粒或微球體(由生物可降解或非生物可降解聚合 物或蛋白質或脂質體形成)。此類系統對於本領域技術人員來說是熟知的並且可進行最優化以與合適的核酸一起使用。 在例如 Sambrook 等人，1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York ；禾口 Ausubel 等人，1994, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons，New York中描述了用於核酸遞送的各種方法。此
類核酸遞送系統包括期望的核酸，例如但不限於，其以「裸露的」形式作為「裸露的」 核酸，或配製於適合於遞送的媒介物中例如與陽離子分子或形成脂質體的脂質的複合物 中，或作為載體的成分或藥物組合物的成分。可將核酸遞送系統直接(例如通過將其與 細胞接觸)或間接(例如通過任何生物過程的作用)提供給細胞。用於局部施用的製劑可包括軟膏、洗劑、乳膏劑、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧 齊U、液體和粉劑。需要時可使用常規藥物載體(水性的、粉狀的或基於油的)或增稠劑。適合用於胃腸外施用例如通過關節內(關節中)、靜脈內、肌內、真皮內、腹 膜內和皮下途徑施用的製劑包括水性和非水性的等滲無菌注射液，其可包含抗氧化劑、 緩衝劑、抑菌劑和使製劑與期望的受者的血液等滲的溶質，以及水性和非水性無菌懸浮 液、溶液或乳劑，其可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、分散劑、穩定劑和防腐劑。用於 注射的製劑可以以單位劑型、與加入的防腐劑一起存在，例如存在於安瓿中或存在於多 劑量容器中。本領域技術人員可容易地確定製備和配製組合物的各種參數而無需過度的 實驗。可單獨地或與其他合適的成分組合來使用化合物。一般地，施用化合物(包括核酸)的方法在本領域內是熟知的。特別地，已用 於核酸治療劑的施用途徑，和目前使用的製劑一起，為選擇的核酸提供了優選的施用和 配製途徑，當然這將取決於因素例如特定的製劑、待治療的受試者的狀態的嚴重度和治 療功效所需的劑量。如本文中通常使用的，「有效量」是指在對其施用了製劑的受試者 (與未接受所述化合物的匹配的受試者相比較)中能夠治療病症的一個或多個症狀，逆轉 病症的一個或多個症狀的進展，終止病症的一個或多個症狀的進展或預防病症的一個或 多個症狀的發生的量。化合物的實際有效量可根據待使用的特定化合物或其組合、配製 的特定組合物、施用模式，和個體的年齡、體重、狀況，和待治療的症狀或病況的嚴重 度而變化。本領域技術人員已知的任何可接受的方法可用於給受試者施用製劑。取決於待 治療的病況，施用可以是局部的(即，至特定區域、生理系統、組織、器官或細胞類型) 或全身性的。藥物基因組學標誌物還可用作藥物基因組學標誌物。如本文中所用的，「藥物基因組學標誌 物」是其表達水平與受試者中特定臨床藥物應答或易感性相關的目的生物化學標誌物。 藥物基因組學標誌物表達的存在或量與預測的受試者應答和更特別地受試者的腫瘤對用 特定藥物或藥物種類的療法的應答相關。通過評估受試者中一個或多個藥物基因組學標 志物的表達的存在或量，可選擇最適合於受試者的或預測具有更大的成功程度的藥物療 法。監控臨床試驗監控試劑(例如，藥物化合物)對標誌物的表達水平的影響不僅可用於基礎藥物 篩選，而且還可用於臨床試驗。例如，可在接受癌症相關疾病治療的受試者的臨床試驗中監控試劑影響標誌 物表達的有效性。在一個非限定性實施方案中，本發明提供了用於監控利用試劑(例如，激動 齊U、拮抗劑、模擬肽、蛋白質、肽、核酸、小分子或其他藥物候選物)治療受試者的有 效性的方法，該方法包括步驟i)在施用試劑之前從受試者獲得施用前的樣品； )檢測一個或多個選擇的標誌物在施用前的樣品中的表達水平；iii)從受試者獲得一個或多個施用後的樣品；iv)檢測標誌物在施用後的樣品中的表達水平；ν)將施用前的樣品中標誌物的表達水平與施用後的樣品中標誌物的表達水平相 比較；和vi)相應地改變試劑至受試者的施用。例如，在治療過程中增加的標誌物基因的表達可表明無效劑量，從而需要增加 劑量。相反地，減少的標誌基因的表達可表明有效治療，從而不需要改變劑量。電子設備可讀介質、系統、陣列和使用其的方法如本文中所使用的，「電子設備可讀介質」是指用於存儲、保存或包含可用電 子設備直接閱讀和存取的數據或信息的任何適當介質。此類介質可包括但不限於磁性 存儲介質，例如軟盤、硬碟存儲介質以及磁帶；光學存儲介質例如光碟；電子存儲介質 例如RAM、ROM、EPROM> EEPROM等；以及普通硬碟和這些類別的混合體例如磁性 /光學存儲介質。可對介質進行改造或設定以用於在其上記錄本文中所述的標誌物。如本文中所用的，術語「電子設備」旨在包括任何適當的計算或處理設備或其 他經改造或設定用於存儲數據或信息的裝置。適合用於本發明的電子設備的實例包括 獨立的計算設備；網絡，包括區域網(LAN)、廣域網絡(WAN)網際網路、內聯網和外聯 網；電子器具例如個人數字助理(PDA)、手機、尋呼機(pager)等；以及局域和分布式 處理系統。如本文中所使用的，「記錄」是指在電子設備可讀介質上存儲或編碼信息的過 程。本領域技術人員可容易地採用任何用於在介質上記錄信息的方法來產生包含本文中 所述的標誌物的材料。許多軟體程序和格式可用於在電子設備可讀介質上存儲本發明的標誌物信息。 為了獲得或產生在其上記錄了標誌物的介質，可使用許多數據處理程序構建格式(data processor structuring format)(例如，文本文件或資料庫)。通過以可讀形式提供標誌物， 可常規存取用於多種目的的標誌物序列信息。例如，本領域技術人員可使用可讀形式的 核苷酸或胺基酸序列來將靶序列或靶結構基序與存儲在數據存儲工具中的序列相比較。 搜索工具用於鑑定匹配特定靶序列或靶基序的序列的片段或區域。因此，本文中還提供了用於保存進行確定受試者是否具有癌症相關疾病或對 癌症相關疾病的易感性的方法的說明書的介質，其中所述方法包括步驟確定標誌物 的存在或不存在，並且基於標誌物的存在或不存在來確定受試者是否具有癌症相關疾 病或對癌症相關疾病的易感性，和/或推薦用於癌症相關疾病或癌症相關疾病前狀況 (pre-cancer-related disease condition)的特定治療。本文中還提供了電子系統和/或在網絡中提供了用於確定受試者是否患有癌症相關疾病或具有對與標誌物相關的癌症相關疾病的易感性的方法，其中所述方法包括步 驟確定標誌物的存在或不存在，並且基於標誌物的存在或不存在來確定受試者是否患 有特定病症和/或疾病或具有對此類病症和/或疾病的易感性，和/或推薦用於此類疾病 或疾病和/或這樣的癌症相關疾病前狀況的特定治療。該方法還可包括接收與受試者相 關的表型信息和/或從網絡獲取與受試者相關的表型信息的步驟。本文中還提供了網絡，用於確定受試者是否患有病症和/或疾病或具有對與標 志物相關的病症和/或疾病的易感性的方法，所述方法包括步驟接收與標誌物相關的 信息，接收與受試者相關的表型信息，從網絡獲取相應於標誌物和/或病症和/或疾病的 信息，並且基於表型信息、標誌物和獲取的信息中的一個或多個，確定受試者是否患有 病症和/或疾病或具有對其的易感性。所述方法還包括推薦用於病症和/或疾病或對其 的易感性的特定治療的步驟。 本文中還提供了用於確定受試者是否患有病症和/或疾病或具有對其的易感性 的商業方法，所述方法包括步驟接收與標誌物相關的信息，接收與受試者相關的表型 信息，從網絡獲取相應於標誌物和/或病症和/或疾病的信息，並且基於表型信息、標誌 物和獲得的信息中的一個或多個，確定受試者是否患有病症和/或疾病或具有對其的易 感性。所述方法還可包括推薦用於其的特定治療的步驟。本文中還提供了可用於測定陣列中一個或多個基因的表達的陣列。在一個實施 方案中，陣列可用於測定組織中基因的表達，從而確定陣列中基因的組織特異性。這 樣，可就表達同時測定直至大約7000或更多個基因。這使得能夠產生顯示在一個或多個 組織中特異性表達的一組基因的特徵譜。除了此類定性測定外，本文中還提供了基因表達的定量。因此，不僅組織特異 性而且一組基因在組織中的表達水平也是可確定的。因此，可基於基因本身的組織表達 和在該組織中的表達水平來對基因進行分類。這可用於例如確定組織間基因表達的關 系。因此，可幹擾一個組織，然後可測定對第二組織中的基因表達的影響。在本說明書 中，可測定一種細胞類型對另一種細胞類型(響應生物刺激)的影響。此類測定可用於例如在基因表達的水平上了解細胞間相互作用的效果。如果試 劑被治療性施用以治療一種細胞類型但其對另一種細胞類型具有不期望的作用，則所述 方法提供了確定不期望的作用的分子基礎的測定，從而提供共施用中和劑(counteracting agent)或另外治療不期望的作用的機會。類似地，即使在單個細胞類型中，可在分子水 平上測定不期望的生物學效應。因此，可確定和中和試劑對非靶基因的表達的作用。在另一個實施方案中，陣列可用於監控陣列中一個或多個基因的表達的時程。 如本文中所公開的，這可發生在各種生物學背景(例如病症和/或疾病的發生，其進展) 和過程(例如與其相關的細胞轉化)中。陣列還可用於確定基因的表達或其他基因的表達在相同細胞或不同細胞中的作 用。如果不能調控最終或下遊靶，那麼這提供了例如用於治療性幹預的備選分子靶的選 擇。陣列還可用於確定一個或多個基因在正常和異常細胞中的差異表達模式。這提 供了可用作診斷或治療性幹預的分子靶的一組基因。替代標誌物(SurrogateMarker)
標誌物可用作一種或多種病症或疾病狀態或導致其的狀況的替代標誌物。如本 文中所使用的，「替代標誌物」是與疾病或病症的不存在或存在，或與疾病或病症的進 展相關 的目的生物化學標誌物。此類標誌物的存在或量不依賴於疾病。因此，此類標誌 物可用於指示特定的療程在減輕疾病狀態或病症中是否有效。當疾病狀態或病症的存在 或程度難以通過標準方法來評估，或當在達到潛在危險的臨床終點之前期望評估疾病進 展時，替代標誌物是特別有用的。標誌物還可用作藥效標誌物(pharmacodynamic marker)。如本文中所使用的，
「藥效標誌物」是與藥物作用特異性相關的目的生物化學標誌物。藥效標誌物的存在或 量與將對其施用藥物的疾病狀態或病症無關；因此，標誌物的存在或量表示藥物在受試 者中的存在或活性。例如，藥效標誌物可表示藥物在生物組織中的濃度，因為標誌物在 該組織中表達或轉錄，或者不表達或轉錄與藥物的水平相關。這樣，藥物的分布或吸收 可通過藥效標誌物來監控。類似地，藥效標誌物的存在或量可與藥物的代謝產物的存在 或量相關，這樣標誌物的存在或量表示藥物在體內的相對分解速率。藥效標誌物在增加藥物作用的檢測的靈敏性中特別有用，特別是當以低劑量施 用藥物時。由於即使少量的藥物也可足以激活多輪的標誌物轉錄或表達，因此擴增的標 志物可以以比藥物本身更容易檢測的量存在。同樣，標誌物由於其本身的性質而可以更 容易地進行檢測；例如，通過使用本文中描述的方法，可將抗體用於針對蛋白標誌物的 基於免疫的檢測系統，或可使用標誌物特異性放射性標記探針來檢測mRNA標誌物。此 夕卜，藥效標誌物的使用可提供由於藥物治療超出可直接觀察的範圍而產生的風險的基於 機制的預測。用於檢測的方案檢測病症和/或疾病的方法可包括例如在一段時間內測量各標誌物基因在來自 受試者的生物學樣品中的表達水平和將該水平與對照生物學樣品中標誌物基因的水平相 比較。當標誌物基因是本文中描述的基因之一併且表達水平差異表達(例如，比對照 中的表達水平更高或更低)時，受試者被判斷為患有病症和/或疾病。當標誌物基因的 表達水平落在容許的範圍內時，受試者不可能患有所述病症和/或疾病。可通過測量對照中標誌物基因的表達水平來預先測定對照的標準值，以比較表 達水平。例如，可基於上述標誌物基因在對照中的表達水平來測定標準值。例如，在某 些實施方案中，容許的範圍基於標準值採用士2S.D.。在測定標準值後，可通過只測量來 自受試者的生物學樣品中的表達水平並將該值與測定的對照的標準值相比較來進行檢測 方法。標誌物基因的表達水平包括標誌物基因至mRNA的轉錄和至蛋白質的翻譯。因 此，基於相應於標誌物基因的mRNA的表達強度或由標誌物基因編碼的蛋白質的表達水 平的比較，進行檢測病症和/或疾病的一個方法。可根據各種基因分析方法在病症和/或疾病的檢測中測量標誌物基因的表達水 平。具體地，可使用例如利用與此類基因雜交的核酸作為探針的雜交技術，或利用與標 志物基因雜交的DNA作為引物的基因擴增技術。可基於標誌物基因的核苷酸序列設計用於檢測的探針或引物。本文中描述了各標誌物基因的核苷酸序列的標識號。此外，應理解，高等動物的基因通常伴有高頻率的多態性。也存在許多在剪接過程中產生含有相互不同的胺基酸序列的同種型的分子。與癌症相關疾病相關的、具有 與標誌物基因的活性相似的活性的任何基因包括在標誌物基因中，即使其由於多態性或 為同種型而具有核苷酸序列差異。也應理解，標誌物基因可包括除了人外的其他物種的同源物。因此，除非明確 指出，否則表述「標誌物基因」是指對於物種獨特的標誌物基因的同源物或已被導入個 體的外源標誌物基因。同樣，應理解，「標誌物基因的同源物」是指來源於除了人以外的物種的基 因，其在嚴格條件下可作為探針與人標誌物基因雜交。這樣的嚴格條件對於本領域技術 人員(其可通過實驗或憑經驗選擇適當的條件來產生相同嚴格性)來說是已知的。含有標誌物基因的核苷酸序列或與標誌物基因的核苷酸序列的互補鏈互補並且 具有至少15個核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸可用作引物或探針。因此，「互補鏈」是 指由A:T (對於RNA為U)和G:C鹼基對組成的雙鏈DNA中相對於另一條鏈的一條鏈。此外，「互補」不僅意指與至少15個連續核苷酸的區域完全互補的序列，而且 還指具有在某些情況下至少40%，在某些情況下50%，在某些情況下60%，在某些情況 下70%，在某些情況下80%、在某些情況下90%和在某些情況下95%或更高的核苷酸序 列同源性的序列。核苷酸序列之間的同源性的程度可利用算法BLAST等來測定。此類多核苷酸可用作檢測標誌物基因的探針，或用作擴增標誌物基因的引物。 當用作引物時，多核苷酸通常包含15bp至lOObp，在某些實施方案中15bp至35bp的核苷 酸。當用作探針時，DNA包含標誌物基因的整個核苷酸序列(或其互補鏈)，或具有至 少15bp核苷酸的其部分序列。當用作引物時，3'區域必須與標誌物基因互補，而5'區 域可連接至限制性內切酶識別序列或標籤(tag)。「多核苷酸」可以是DNA或RNA。此類多核苷酸可以是合成的或天然發生的。 同樣，通常也標記用作雜交探針的DNA。本領域技術人員易於理解此類標記方法。在 本文中，術語「寡核苷酸」意指具有相對低的聚合程度的多核苷酸。寡核苷酸也包括在 多核苷酸內。可使用例如Northern雜交、斑點印跡雜交或DNA微陣列技術進行利用雜交技術 的病症和/或疾病的檢測。此外，可使用基因擴增技術例如RT-PCR法。通過在RT-PCR 的基因擴增步驟中使用PCR擴增監控法，可更加定量地分析標誌物基因的表達。在PCR基因擴增監控法中，將檢測靶(DNA或RNA的反轉錄物)與用螢光染料 和吸收螢光的猝滅劑標記的探針雜交。當PCR進行並且Taq聚合酶以其5' -3'外切核 酸酶活性降解探針時，螢光染料與猝滅劑彼此分離，從而檢測到螢光。實時檢測螢光。 通過同時測量其中靶的拷貝數是已知的標準樣品，可利用循環數(其中PCR擴增是線性 的)測定受試者樣品中靶的拷貝數。同樣，本領域技術人員公認PCR擴增監控法可使用 任何適當的方法來進行。還可通過檢測標誌物基因編碼的蛋白質來進行檢測癌症相關疾病的方法。在下 文中，標誌物基因編碼的蛋白質被描述為「標誌物蛋白」。對於此類檢測方法，可通過 使用結合各標誌物蛋白的抗體來應用例如，Western印跡法、免疫沉澱法和ELISA法。
用於檢測的結合標誌物蛋白的抗體可通過任何適當的技術來產生。同樣，為了 檢測標誌物蛋白，可適當地標記這樣的抗體。備選地，可不標記抗體，而是標記特異性 結合抗體的物質例如蛋白A或蛋白G以間接檢測標誌物蛋白。更特別地，此類檢測方法 可包括ELISA法。 可以例如通過將標誌物基因或其部分插入表達載體，將構建體導入適當的宿主 細胞來產生轉化株，培養所述轉化株以表達重組蛋白，然後從培養物或培養上清液純化 表達的重組蛋白來獲得用作抗原的蛋白質或其部分肽。備選地，可化學合成由基因編碼 的胺基酸序列或含有由全長CDNA編碼的胺基酸序列的一部分的寡肽，以用作免疫原。此外，可通過將不僅生物學樣品中標誌物基因的表達水平而且標誌物蛋白的活 性用作指標來進行癌症相關疾病的檢測。標誌物蛋白的活性意指蛋白本身固有的生物學 活性。可使用各種方法測量每一種蛋白的活性。即使在常規檢測中受試者未被診斷為患有病症和/或疾病(儘管症狀暗示此類疾 病)，這樣的受試者是否患有病症和/或疾病也可通過按照本文中所述的方法進行檢測來 容易地確定。更特別地，在某些實施方案中，當標誌物基因是本文描述的基因之一時，其症 狀至少暗示對病症和/或疾病的易感性的受試者中，標誌物基因的表達水平的增加或減 少表明症狀主要由所述病症和/或疾病引起。此外，檢測可用於確定病症和/或疾病是否在受試者中得到改善。換句話說， 本文中描述的方法可用於判斷用於所述病症和/或疾病的治療的治療效果。此外，當標 志物基因是本文描述的基因之一時，已被診斷為患有所述病症和/或疾病的受試者中， 標誌物基因的表達水平的增加或減少意味著疾病已向前發展。還可基於表達水平的差異測定病症和/或疾病的嚴重度和/或對其的易感性。例 如，當標誌物基因是本文描述的基因之一時，標誌物基因的表達水平的增加程度與病症 和/或疾病的存在和/或嚴重度相關。動物模型還可產生病症和/或疾病的動物模型，其中一個或多個標誌物基因或功能上與 標誌物基因等同的基因的表達水平在所述動物模型中已被提高。如本文中所用的，「功 能上等同的基因」通常是編碼具有與標誌物基因編碼的蛋白質的已知活性相似的活性的 蛋白質的基因。功能上等同的基因的代表性實例包括受試動物的標誌物基因對應物，其 是動物本身固有的。動物模型可用於檢測由於病症和/或疾病而引起的生理學變化。在某些實施方 案中，動物模型可用於揭示標誌物基因的另外的功能和評估其靶為標誌物基因的藥物。動物模型可通過控制對應物基因的表達水平或施用對應物基因來產生。方法可 包括通過控制選自本文中所述的基因的基因的表達水平來產生動物模型。在另一個實施 方案中，方法可包括通過施用由本文中所描述的基因編碼的蛋白質或施用抗所述蛋白的 抗體來產生動物模型。還應理解，在某些其他實施方案中，可過表達標誌物，以便可使 用適當的方法測量標誌物。在另一個實施方案中，動物模型可通過導入選自此類基因的 基因，或通過施用由這樣的基因編碼的蛋白質來產生。在另一個實施方案中，病症和/ 或疾病可通過抑制選自此類基因的基因的表達或由這樣的基因編碼的蛋白質的活性來誘導。反義核酸、核酶或RNAi可用於抑制表達。蛋白質的活性可通過施用抑制所述活性 的物質例如抗體來有效地控制。
動物模型可用於闡明病症和/或疾病背後的機制，還可用於檢測通過篩選獲得 的化合物的安全性。例如，當動物模型產生特定病症和/或疾病的症狀時，或當牽涉某 種病症和/或疾病的測量值在動物中改變時，可構建篩選系統以探測具有減輕疾病的活 性的化合物。
如本文中所使用的，表述「表達水平的增加」是指下列情況的任一種人工表 達作為外源基因導入的標誌物基因；受試動物本身固有的標誌物基因的轉錄和其至蛋白 質的翻譯得到增強；或作為翻譯產物的蛋白質的水解被抑制。
如本文中所用的，表述「表達水平的減少」是指其中受試動物的標誌物基因的 轉錄和其至蛋白質的翻譯被抑制的情況，或其中作為翻譯產物的蛋白質的水解被增強的 情況。基因的表達水平可以例如通過DNA晶片上信號強度的差異來測定。此外，翻譯 產物(蛋白質)的活性可通過與正常情況中的活性相比較來測定。
也在預期的範圍內的是動物模型可包括轉基因動物，包括例如其中已人工導 入並且表達標誌物基因的動物；標誌物基因敲除動物；和其中已用另一個基因置換標誌 物基因的基因敲入動物。已向其中導入了標誌物基因的反義核酸、核酶、具有RNAi作 用的多核苷酸或用作誘餌核酸的DNA等的轉基因動物可用作轉基因動物。此類轉基因動 物還包括例如這樣的動物，在所述動物中標誌物蛋白的活性已通過將突變導入基因的編 碼區而得到增強或抑制，或胺基酸序列已被修飾而變得抗水解或對水解敏感。胺基酸序 列中的突變包括置換、缺失、插入和添加。
表達的實例
此外，標誌物基因本身的表達可通過向基因的轉錄調控區導入突變來控制。本 領域技術人員理解此類胺基酸置換。同樣，被突變的胺基酸的數目不受特別限制，只要 活性得到保持即可。通常，其在50個胺基酸以內，在某些非限定性實施方案中，在30個 胺基酸以內，在10個胺基酸以內，或在3個胺基酸以內。突變的位點可以是任何位點， 只要活性得到保持即可。
在另一個方面，本文中提供了治療特定病症和/或疾病的治療劑的候選化合物 的篩選方法。一個或多個標誌物基因選自本文中描述的基因。可通過選擇能夠增加或減 少標誌物基因的表達水平的化合物來獲得癌症相關疾病的治療劑。
應理解，表述「增加基因的表達水平的化合物」是指促進基因轉錄、基因翻譯 或蛋白質活性的表達的步驟中的任一步驟的化合物。另一方面，表述「減少基因的表達 水平的化合物」，如本文中所用的，是指抑制這些步驟中的任一步驟的化合物。
在特定的方面，可在體內或體外進行篩選用於病症和/或疾病的治療劑的方 法。該篩選方法可以例如通過下列步驟來進行
1)對動物受試者施用候選化合物；
2)測量動物受試者的生物學樣品中標誌物基因的表達水平；或
3)選擇與對照(其未與候選化合物接觸)中標誌物基因的表達水平相比較增加或 減少標誌物基因的表達水平的化合物。
在另一個方面，本文中提供了這樣的方法，其通過將動物受試者與候選化合物接觸，然後監控化合物對來源於動物受試者的生物學樣品中標誌物基因的表達水平的作 用來評估藥劑的候選化合物對標誌物基因的表達水平的功效。來源於動物受試者的生物 學樣品中標誌物基因的表達水平的變化可使用與上述檢測方法中所用的相同的技術來監 控。此外，基於評估，可通過篩選來選擇藥劑的候選化合物。
本文中所引用的所有專利、專利申請和參考文獻以其全文通過引用合併入本 文。雖然對於製備和使用其的本領域技術人員來說已十分詳盡地描述和例示了本發明， 但各種改變、修飾和改進是顯然的，且不背離本發明的精神和範圍。本領域技術人員易 於理解，本發明可進行適當地改變以適合於實現目的和獲得提及的目標和有利方面以及 其中固有的那些。
某些核鹼基(Nucleobase)序列
本文中描述的成熟miRNA和它們的相應的莖-環序列的核鹼基序列是見於 miRBase (見於http://microrna.sanger.ac.uk/的miRNA序列和注釋的在線可搜索資料庫) 中的序列。miRBase序列資料庫中的條目(entry)代表預測的miRNA轉錄物的髮夾部分 (莖-環)和關於成熟miRNA序列的定位和序列的信息。資料庫中miRNA的莖-環序 列嚴格說來不是前體miRNA (pre-miRNA)，並且在一些情況下可包括pre_miRNA和來自 假定的初級轉錄物的一些側翼序列。本文中描述的miRNA核鹼基序列包括miRNA的任 何形式，包括miRBase序列資料庫的Release 10.0中描述的序列和miRBase序列資料庫的 任何更早的Release中描述的序列。序列資料庫釋放可導致某些miRNA的重新命名。序 列資料庫釋放可導致成熟miRNA序列的變化。可包括此類修飾的寡核苷酸的化合物可與 本文中描述的miRNA的任何核鹼基序列形式互補。
應理解，本文中所示的任何核鹼基序列不依賴於對糖部分、核苷間連接或核鹼 基的任何修飾。還應理解，包含U的核鹼基序列也包括其中在一個或多個具有『U』的 位點上『U』被『T』置換的相同核鹼基序列。反過來，應理解，包含T的核鹼基序列 也包括其中在一個或多個具有『T』的位點上『T』被『U』置換的相同核鹼基序列。
在某些實施方案中，修飾的寡核苷酸具有與miRNA或其前體互補的核鹼基序 列，這意味著修飾的寡核苷酸的核鹼基序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 30、 35、 40、 45、 50、 55、 60、 65、 70、 75、 80、85、90、95、100或更多個核鹼基的區域中與miRNA或其前體的互補序列至少 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%或 99% 同一，或兩個 序列在嚴格雜交條件下雜交。因此，在某些實施方案中，修飾的寡核苷酸的核鹼基序列 相對於其靶miRNA或靶miRNA前體序列可具有一個或多個錯配的鹼基對，並且能夠與 其靶序列雜交。在某些實施方案中，修飾的寡核苷酸具有與miRNA或其前體100%互補 的核鹼基序列。在某些實施方案中，修飾的寡核苷酸的核鹼基序列具有對miRNA的全長 互補性。
miRNA (miR)療法
在一些實施方案中，本發明提供了抑制受試者的一個或多個基因的表達的微 RNA。微RNA表達特徵譜可用作新型癌症生物標誌物。
本文中包括使用一個或多個Mi R抑制基因表達和/或活性的方法。在一些實施 方案中，miR抑制蛋白質的表達。在其他實施方案中，miRNA抑制基因活性(例如，細胞侵襲活性)。
可通過本領域技術人員熟知的許多種技術從細胞或組織分離，重組產生或體外 合成miRNA。在一個實施方案中，從細胞或組織分離miRNA。用於從細胞或組織分 離miRNA的技術對於本領域技術人員來說是熟知的。例如，可使用來自Ambion，Inc. 的mirVana miRNA分離試劑盒從總RNA分離miRNA。另一種技術利用flashlPAGE FractionatorSystem(Ambion, Inc.)來進行小核酸的 PAGE 純化。
關於miRNA治療劑的使用，本領域技術人員理解，體內施用的核酸被吸收和分 配至細胞和組織。
可以以合適的方式遞送核酸，所述方式使得能夠組織特異性地吸收試劑和/或 核酸遞送系統。本文中描述的試劑可通過任何已知的常規療法來補充治療狀況，所述療 法包括但不限於抗體施用、疫苗施用、細胞毒性劑、天然胺基酸多肽、核酸、核苷酸類 似物和生物應答調節劑的施用。可一起或相繼使用兩個或多個組合的化合物。
本發明的某些實施方案提供了包含(a) —種或多種核酸或小分子化合物以及(b) 一種或多種其他化學治療劑的藥物組合物。
另外的有用的定義
「受試者」是指經選擇接受治療或療法的人或非人動物。「懷疑患有……的受 試者」是指展示病症、疾病或病況的一個或多個臨床指標的受試者。
「預防」或「防止」是指延遲或阻止病況或疾病的發作、發展或進展，持續一 段時間，包括數周、數月或數年。「治療」或「醫治」是指一種或多種用於治癒或改善 病症和/或疾病的特定方法的應用。在某些實施方案中，特定方法是一種或多種藥劑的 施用。
「改善」是指減輕病況或疾病的至少一個指標的嚴重度。在某些實施方案中， 改善包括病況或疾病的一個或多個指標的進展的延遲或減緩。指標的嚴重度可通過對於 本領域技術人員來說是已知的主觀或客觀量度來測定。
「有此需要的受試者」是指確定為需要治療或療法的受試者。
「施用」是指給受試者提供藥劑或組合物，包括但不限於由醫學專業人員施用 和自我施用。
「胃腸外施用」是指通過注射或輸注進行的施用。胃腸外施用包括但不限於皮 下施用、靜脈內施用、肌內施用、動脈內施用和顱內施用。「皮下施用」是指緊在皮膚 下方施用。
「改善功能」是指使功能向正常參數改變。在某些實施方案中，通過測量在受 試者的體液中發現的分子評估功能。「藥物組合物」是指適合於給個體施用的物質的混 合物，其包括藥劑。例如，藥物組合物可包含修飾的寡核苷酸和無菌水性溶液。
「靶核酸」、「靴RNA」、「靶RNA轉錄物」和「核酸靶」都是指能夠被反 義化合物靶向的核酸。「靶向」是指與靶核酸雜交並且誘導期望的作用的核鹼基序列的 設計和選擇的過程。「被靶向」是指具有核鹼基序列，所述序列允許與靶核酸雜交以誘 導期望的作用。在某些實施方案中，期望的作用是靶核酸的減少。
「調控」是指對功能或活性的幹擾。在某些實施方案中，調控是指基因表達的 增加。在某些實施方案中，調控是指基因表達的減少。
「表達」是指藉以將基因的編碼信息轉變成存在於細胞中和在細胞中運轉的結 構的任何功能和步驟。
「區域」是指核酸內一部分連接的核苷。在某些實施方案中，修飾的寡核苷酸 具有與靶核酸的區域互補的核鹼基序列。例如，在某些此類實施方案中，修飾的寡核苷 酸與miRNA莖-環序列的區域互補。在某些此類實施方案中，修飾的寡核苷酸與miRNA 序列的區域100%同一。
「區段」是指更小的區域或區域的亞部分。
「核鹼基序列」是指以5'至3'方向，不依賴於任何糖、連接和/或核鹼基修 飾的連續核鹼基的順序。
「連續核鹼基」是指核酸中彼此緊密相鄰的核鹼基。
「核鹼基互補性」是指兩個核鹼基通過氫鍵非共價配對的能力。「互補」是 指第一核鹼基序列在 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100 或更多個核鹼基的區域內與第二核鹼基序列的互補序列至少60%、65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%或99%同一，或100%同一，或兩個序列在嚴格雜交條 件下雜交。在某些實施方案中，具有與miRNA或其前體100%互補的核鹼基序列的修飾 的寡核苷酸可以在修飾的寡核苷酸的整個長度上不與miRNA或其前體100%互補。
「互補性」是指第一核酸與第二核酸之間的核鹼基配對能力。「全長互補性」 是指第一核酸的各核鹼基能夠與第二核酸中相應的位點上的各核鹼基配對。例如，在 某些實施方案中，其中各核鹼基與miRNA中的核鹼基具有互補性的修飾的寡核苷酸與 miRNA具有全長互補性。
「百分比互補性」是指核酸中互補核鹼基的數目除以核酸的長度。在某些實 施方案中，修飾的寡核苷酸的百分比互補性是指與靶核酸互補的核鹼基的數目除以修飾 的寡核苷酸的核鹼基數目。在某些實施方案中，修飾的寡核苷酸的百分比互補性是指與 miRNA互補的核鹼基的數目除以修飾的寡核苷酸的核鹼基的數目。
「百分比結合的區域」是指與寡核苷酸區域互補的區域的百分比。通過將與寡 核苷酸互補的靶區域的核鹼基的數目除以靶區域的長度來計算百分比結合的區域。在某 些實施方案中，百分比結合的區域是至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少 96%,至少97%，至少98%，至少99%或100%。
「百分比同一性」是指第一核酸中與第二核酸相應的位點上的核鹼基相同的核 鹼基的數目除以第一核酸中的核鹼基的總數。
本文中使用的「大體上同一的」可以指第一與第二核鹼基序列在8、9、10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 30、 35、 40、 45、 50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多個核鹼基的區域上至少60 %、 65%, 70%, 75%、80%, 85%, 90%, 95%、97%, 98% 或 99% 同一，或 100 % 同ο
「雜交」是指通過核鹼基的互補性發生的互補核酸的退火。
「錯配」是指不能夠與第二核酸的相應的位點上的核鹼基配對的第一核酸的核鹼基。
「非互補核鹼基」是指不能夠通過氫鍵配對的兩個核鹼基。
「同一的」是指具有相同核鹼基序列。
「miRNA」或「miR」是指長度在18至25個核鹼基之間的非編碼RNA，其 與編碼RNA雜交並且調控編碼RNA的表達。在某些實施方案中，miRNA是Dicer切割 pre-miRNA 的產物。miRNA 的實例見於稱為 miRBase 的 miRNA 資料庫(http://microma. sanger.ac.uk/)。
"Pre-miRNA"或〃 pre_miR」是指具有髮夾結構的非編碼RNA，其包含 miRNA。在某些實施方案中，pre-miRNA是稱為Drosha的雙鏈RNA特異性核糖核酸酶 切割pri-miR的產物。
「莖-環序列」是指具有髮夾結構並且包含成熟miRNA序列的RNA。 Pre-miRNA序列和莖-環序列可重疊。莖-環序列的實例可見於稱為miRBase的miRNA 資料庫(microrna.sanger.ac.uk/)。
"miRNA前體」是指源自基因組DNA並且包含含有一個或多個miRNA序列的 非編碼性結構化RNA的轉錄物。例如，在某些實施方案中，miRNA前體是pre-miRNA。 在某些實施方案中，miRNA前體是pri-miRNA。
「反義化合物」是指具有允許與靶核酸雜交的核鹼基序列的化合物。在某些實 施方案中，反義化合物是具有與靶核酸互補的核鹼基序列的寡核苷酸。
「寡核苷酸」是指連接的核苷的聚合物，各核苷可以彼此獨立地被修飾或不被 修飾。「天然發生的核苷間連接」是指核苷之間的3'至5'磷酸二酯連接。「天然核 鹼基」是指相對於其天然發生的形式未被修飾的核鹼基。「miR拮抗劑」是指經設計用 於幹擾或抑制miRNA的活性的試劑。在某些實施方案中，miR拮抗劑包括靶向miRNA 的反義化合物。在某些實施方案中，miR拮抗劑包括具有與miRNA或其前體的核鹼基序 列互補的核鹼基序列的修飾的寡核苷酸。在某些實施方案中，miR拮抗劑包括幹擾或抑 制miRNA的活性的小分子等。
本文中所描述的方法和試劑代表優選實施方案，是示例性的，並且不意欲限制 本發明的範圍。其中的改進和其他用途對於本領域技術人員來說顯然的。這些改進包括 在本發明的精神內並且由權利要求的範圍界定。對於本領域技術人員來說，同樣極顯然 的是可對本文中公開的發明進行各種替代和改進而不背離本發明的範圍和精神。
應理解，雖然本發明已通過優選實施方案和任選特徵明確地公開，但本領域技 術人員可採用本文中公開的概念的改進和變化，並且此類改進和變化被認為在由所附權 利要求界定的本發明的範圍內。
雖然通過參考各種和優選實施方案描述了本發明，但本領域技術人員應當理 解，可進行各種變化並且可用等同物替代其元素而不背離本發明的基本範圍。此外，可 進行許多改進以使特定的情況或材料適合於本發明的教導而不背離本發明的基本範圍。
參考文獻
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本文中引用的任何文獻的引用不意欲作為任何前述內容是相關現有技術的承 認。關於日期的所有聲明和關於這些文獻的內容的所有陳述基於申請人可獲得的信息，並且不構成關於這些文獻的日期或內容的正確性的任何承認。
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權利要求
1.一種方法，所述方法診斷受試者是否患有前列腺相關病症或處於發生前列腺相關 病症的風險中，確定患有前列腺相關病症的受試者的預後和/或治療患有前列腺相關病 症的受試者的前列腺相關病症，所述方法包括測量來自受試者的測試樣品中至少一個生物標誌物的水平，其中相對於對照樣品中相應的生物標誌物的水平，測試樣品中生物標誌物的水平的 改變表示受試者患有所述病症或處於發生所述病症的風險中。
2.權利要求1的方法，其中測試樣品中所述至少一個生物標誌物的水平低於對照樣品 中相應的生物標誌物的水平。
3.權利要求1的方法，其中測試樣品中所述至少一個生物標誌物的水平高於對照樣品 中相應的生物標誌物的水平。
4.權利要求1的方法，其中所述至少一個生物標誌物在腫瘤組織和非腫瘤組織之間差 異表達，並且是圖11-表2中所列的一種或多種miR或其功能性變體。
5.權利要求4的方法，其中所述至少一個生物標誌物選自圖11-表2中所列 的在前列腺腫瘤中上調的一種或多種miR或其功能性變體miR-32，miR-182， miR-31, miR-26a-l/2, miR_200c，miR-375，miR-196a-1/2, miR-370，miR-425， miR-194-1/2, miR-181a_l/2，miR_34b，let_7i，miR-188, miR-25，miR-106b, miR-449, miR_99b，miR-93，miR-92-1/2, miR_125a。
6.權利要求4的方法，其中所述至少一個生物標誌物選自圖11-表2中所列的在前 列腺腫瘤中下調的一種或多種miR或其功能性變體miR_520h、miR-494、miR-490、 miR-133a_l、miR-1-2, miR-218-2、miR-220、miR-128a> miR-221、miR-499、 miR-329、miR-340、miR-345、miR-410、miR-126、miR-205、miR-7-1/2、 miR-145, miR_34a、miR-487、let_7b。
7.權利要求1的方法，其中所述至少一個生物標誌物與前列腺外疾病相關，並且選 自圖12-表3中所列的一個或多個miR或其功能性變體miR-101-1/2、miR_200a、 miR_200b、miR-196a_l/2、miR-30c_l/2、miR-484、miR_99b、miR-186, miR-195、 let-7f-2、miR_34c、miR-371、miR-373、miR-410 和 miR-491。
8.權利要求1的方法，其中至少一個生物標誌物顯示前列腺腫瘤中miR-1與靶基因轉 錄物水平之間的負相關，並且選自圖13A-表4A中所列的一個或多個基因或其功能性變 體。
9.權利要求1的方法，其中所述至少一個生物標誌物選自圖13B-表4B中所列的一 個或多個 miR 或其功能性變體miR-1、miR-31、miR-32、miR_128a、miR_133a、 miR_181a、miR-182、miR-194, miR_196a、miR_200c、miR-218-2, miR-220、 miR-329、miR-338、miR-369、miR-409_3p、miR-410、miR-448、miR-490、 miR-494、miR-499、miR_520h 和 let_7i。
10.權利要求1的方法，其中所述至少一個生物標誌物選自圖13B-表4B中所列的一 個或多個miR或其功能性變體miR-32、miR-282-2, miR490和miR_520h。
11.權利要求1的方法，其包括在前列腺腫瘤中顯示與miR-181a的負相關的探針組， 其中所述探針組包括圖14-表5中所列的一個或多個基因或其功能性變體。
12.權利要求1的方法，其中所述至少一個生物標誌物是雄激素應答性生物標誌物，並且選自圖15-表6中所列的一個或多個miR或其功能性變體miR-338、miR-126_5p、 mir-181b-l 簇、miR181c 簇、miR-219_5p 和 miR221 簇。
13.權利要求1的方法，其中所述至少一個生物標誌物是圖16-表7中所列的一個或 多個雄激素受體結合位點。
14.權利要求1的方法，其中所述至少一個生物標誌物選自圖23-表9中所列的 在前列腺癌中在具有神經周浸潤的腫瘤中上調的一個或多個miR或其功能性變體 miR-224、miR-21、miR_10(a/b)、miR_125b(-1/2)、miR-30a/b/c_2/d、miR-100, miR-24(-l/2)、miR-15a_2、miR-191、miR_99b、miR_27a/b、miR_26a(-1/2)、 miR-126, miR-145, miR-195、miR-181a_l、miR-199b> miR-151、let_7g。
15.權利要求1的方法，其中所述至少一個生物標誌物在PNT腫瘤組織與非PNT腫 瘤組織之間差異表達，並且是圖24-表10中所列的一個或多個基因或其功能性變體。
16.權利要求1的方法，其包括下列中的一個或多個的增加的表達前列腺腫瘤中的 Dicer和DGCR8，和/或具有高Gleason評分的腫瘤中的Dicer和編碼argonuate-2的EI F2C2。
17.權利要求1的方法，其中所述樣品包括血液樣品。
18.權利要求15的方法，其中所述樣品包括血清或血漿血液樣品中的一種或多種。
19.生物標誌物，其包含至少一個在腫瘤組織與非腫瘤組織之間差異表達的生物標誌 物，並且其是圖11-表2中所列的一個或多個miR或其功能性變體。
20.生物標誌物，其包含至少一個選自下列的生物標誌物圖11-表2中所列 的在前列腺腫瘤中上調的一個或多個miR或其功能性變體miR-32、miR-182、 miR-31、miR-26a_l/2、miR-200c> miR-375、miR-196a-1/2, miR-370、miR-425、 miR-194-1/2、miR-181a_l/2、miR_34b、let_7i、miR-188, miR-25、miR-106b> miR-449、miR_99b、miR-93、miR-92-1/2, miR_125a。
21.生物標誌物，其包含至少一個選自下列的生物標誌物圖11-表2中所列的在前 列腺腫瘤中下調的一個或多個miR或其功能性變體miR_520h、miR-494、miR-490、 miR-133a_l、miR-1-2, miR-218-2，miR-220、miR_128a、miR-221、miR-499、 miR-329、miR-340、miR-345、miR-410、miR-126、miR-205、miR-7-1/2、 miR-145, miR_34a、miR-487、let_7b。
22.生物標誌物，其包含至少一個與前列腺外疾病相關並且選自下列的生物標誌 物圖12-表3中所列的一個或多個miR或其功能性變體miR-101-1/2、miR_200a、 miR_200b、miR-196a-1/2, miR-30c_l/2、miR-484、miR_99b、miR-186, miR-195、 let-7f-2、miR_34c、miR-371、miR-373、miR-410 和 miR-491。
23.生物標誌物，其包含至少一個顯示miR-1與前列腺腫瘤中靶基因轉錄物水平之間 的負相關並且選自下列的生物標誌物圖13A-表4A中所列的一個或多個基因或其功能 性變體。
24.生物標誌物，其選自圖13B-表4B中所列的一個或多個miR或其功能性變體 miR-1、miR-31、miR-32、miR_128a、miR_133a、miR_181a、miR-182、miR-194, miR_196a、miR_200c、miR-218-2、miR-220、miR-329、miR-338、miR-369、 miR-409-3p、miR-410、miR-448、miR-490、miR-494、miR-499、miR_520h 和 let_7i。
25.生物標誌物，其選自圖13B-表4B中所列的一個或多個miR或其功能性變體 miR-32、miR-282-2、miR490 和 miR_520h。
26.生物標誌物，其包含在前列腺腫瘤中顯示與miR-181a的負相關的探針組，其中 所述探針組包括圖14-表5中所列的一個或多個基因或其功能性變體。
27.生物標誌物，其包含至少一個為雄激素應答性生物標誌物並且選自下列的生物標 志物圖15-表6中所列的一個或多個miR或其功能性變體miR-338、miR-126_5p、 mir-181b-l 簇、miR181c 簇、miR-219_5p 和 miR221 簇。
28.生物標誌物，其包含圖16-表7中所列的一個或多個雄激素受體結合位點或其功 能性變體。
29.生物標誌物，其包含至少一個選自下列的生物標誌物圖23-表9中所列的 在前列腺癌中在具有神經周浸潤的腫瘤中上調的一個或多個miR或其功能性變體 miR-224、miR-21、miR-10 (a/b)、miR-125b (-1/2), miR-30a/b/c_2/d、miR-100, miR-24(-l/2)、miR-15a_2、miR-191、miR_99b、miR_27a/b、miR_26a(-1/2)、 miR-126, miR-145, miR-195、miR-181a_l、miR-199b> miR-151、let_7g。
30.生物標誌物，其包含至少一個在PNT腫瘤組織與非PNT腫瘤組織之間差異表達 的生物標誌物，並且其是圖24-表10中所列的一個或多個基因或其功能性變體。
31.生物標誌物，其包括下列中的一個或多個的增加的表達前列腺腫瘤中的Dicer 和DGCR8，和/或具有高Gleason評分的腫瘤中的Dicer和編碼argonuate-2的EIF2C2。
32.前列腺腫瘤中獨特的微RNA表達特徵，其包括一個或多個調控腫瘤微RNA加工 的生物標誌物的表達的改變。
33.影響前列腺中靶mRNA的轉錄物豐度和/或蛋白質表達的方法，其包括使有此需 要的受試者中一個或多個微RNA失調。
34.前述權利要求的方法，其包括抑制癌症相關基因的蛋白質表達。
35.前述權利要求的方法，其包括改變miR-32和miR_106b中的一個或多個的表達以 抑制癌症相關基因的蛋白質表達。
36.微RNA和編碼蛋白質的RNA的大規模基因表達特徵譜分析的用途，其用於鑑定 人前列腺腫瘤中發生的微RNA功能的改變。
37.前列腺相關病症的腫瘤基因特徵，其包括下列中的一個或多個上調的 miR-32,其次 miR-182、miR-31、miR_26a、miR_200c、miR-196a ；和 miR-106b_25 簇；和/或顯著下調的miR_520h、miR-494、miR-490和miR-l_133a簇中的一個或多 個。
38.以低誤差邊際與前列腺外疾病擴展相關的腫瘤特徵，其包括miR-101。
39.權利要求1的方法，其中所述生物標誌物包括在前列腺腫瘤中增加的前列腺腫瘤 中的宿主基因表達。
40.前述權利要求的方法，其中所述生物標誌物包括下列中的一個或多個其表達分 別與內含子微RNA，miR-32和miR-106b_25簇的表達相關的上調的C9orf5和MCM7。
41.miR-106b的用途，其作為前列腺癌細胞中E2F1和/或CDKNlA基因的靶和/或 用於抑制E2F1和/或CDKNlA基因的蛋白質表達。
42.通過改變前列腺癌細胞中miR-1的表達進行的XP06和PTK9中的一個或多個的調控。
43.微RNA與3'UTR序列的結合的用途，其用於導致哺乳動物細胞中靶mRNA的 降解和/或積累。
44.人組織中微RNA與mRNA之間的負相關和/或正相關的用途，其用於預測微 RNA的靶基因。
45.用於鑑定受微RNA調控的mRNA的方法，其包括進行人組織中的微RNA和 mRNA的表達的關聯分析。
46.miR表達反義抑制劑，其包括miR-32和miR_106b中的一個或多個。
47.前列腺病症或疾病的oncomiR生物標誌物，其包括下列中的一個或多個 miR-1、miR-32 和 mir-106b_25 簇。
48.用於調控前列腺癌細胞中的蛋白質表達的方法，其包括在前列腺癌細胞中調控 miR-1、miR-32和mir-106b_25簇中的一個或多個的表達。
49.用於抑制前列腺癌細胞中輸出蛋白-6和PTK9中的一個或多個的表達的組合物， 所述組合物包含miR-1或其功能性變體。
50.用於調控有此需要的受試者中E2F1和p21/WAFl中的一個或多個的蛋白水平的方 法，其包括使用miR-l(^b或其功能性變體。
51.一種組合物，其包含用於增加有此需要的受試者的前列腺癌細胞中p21/WAFl和 /或E2F1的蛋白水平的反義miR_106b。
52.權利要求1的方法，其包括確定患有前列腺癌的受試者的預後，包括測量來自受 試者的測試樣品中至少一個生物標誌物的水平，其中i)生物標誌物與前列腺癌中不利 的預後相關；和ii)相對於對照樣品中相應的生物標誌物的水平，前列腺測試樣品中所述 至少一個生物標誌物的水平的改變表示不利的預後。
53.權利要求1的方法，其包括診斷受試者是否患有前列腺癌或處於發生前列腺癌的 風險中，所述方法包括(1)從獲自受試者的測試樣品逆轉錄RNA以提供一組靶寡脫氧 核苷酸；( 將靶寡脫氧核苷酸與包含miRNA特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交以提供 測試樣品的雜交特徵譜；和C3)將測試樣品雜交特徵譜與從對照樣品產生的雜交特徵譜 相比較，其中至少一個miRNA的信號的改變表示受試者患有前列腺癌或處於發生前列腺 癌症的風險中。
54.前述權利要求的方法，其中相對於從對照樣品產生的信號，至少一個miRNA的 信號下調，和/或其中相對於從對照樣品產生的信號，至少一個miRNA的信號上調。
55.前述權利要求的方法，其中選自表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表 9或表10中所列的組的至少一個生物標誌物的信號的改變表示受試者患有具有不利預後 的前列腺癌或處於發生所述癌症的風險中。
56.治療患有前列腺癌的受試者的前列腺癌的方法，在所述前列腺癌中至少一個生物 標誌物在受試者的癌細胞中相對於對照細胞下調或上調，所述方法包括(1)當所述至 少一個生物標誌物在癌細胞中下調時，給受試者施用有效量的至少一個分離的生物標誌 物，或其分離的變體或生物學活性片段，以便受試者中癌細胞的增殖被抑制；或0)當 所述至少一個生物標誌物在癌細胞中上調時，給受試者施用有效量的至少一種抑制所述 至少一個生物標誌物表達的化合物，以便受試者中癌細胞的增殖被抑制。
57.治療受試者的前列腺癌的方法，其包括(1)測定相對於對照細胞，前列腺癌細 胞中至少一個生物標誌物的量；和( 通過下列來改變前列腺癌細胞中表達的生物標誌 物的量ω如果癌細胞中表達的生物標誌物的量低於對照細胞中表達的生物標誌物的 量，給受試者施用有效量的至少一個分離的生物標誌物；或(ii)如果癌細胞中表達的生 物標誌物的量高於對照細胞中表達的生物標誌物的量，給受試者施用有效量的至少一種 用於抑制所述至少一個生物標誌物表達的化合物。
58.用於治療前列腺癌的藥物組合物，其包含至少一個分離的生物標誌物和可藥用載體。
59.前述權利要求的藥物組合物，其中所述至少一個分離的生物標誌物相應於相對於 對照細胞在前列腺癌細胞中下調的生物標誌物。
60.前述權利要求的藥物組合物，其包含至少一個miR表達抑制劑化合物和可藥用載體。
61.鑑定抗前列腺癌試劑的方法，其包括給細胞提供測試試劑和測量與前列腺癌細胞 中減少的表達水平相關的至少一個生物標誌物的水平，其中相對於對照細胞，細胞中生 物標誌物的水平的增加表示測試試劑是抗前列腺癌試劑。
62.鑑定抗前列腺癌試劑的方法，其包括給細胞提供測試試劑和測量與前列腺癌細胞 中增加的表達水平相關的至少一個生物標誌物的水平，其中相對於對照細胞，細胞中生 物標誌物的水平的減少表示測試試劑是抗前列腺癌試劑。
63.評估療法預防、診斷和/或治療前列腺癌相關疾病的有效性的方法，其包括i) 使動物經歷其有效性待評估的療法，和ii)通過評估表2、表3、表4A、表4B、表5、表 6、表7、表9或表10的一個或多個中所列的至少一個生物標誌物來測定被測試的療法在 治療或預防疾病中的有效性的水平。
64.前述權利要求的方法，其中候選治療劑包括藥物組合物、營養組合物和順勢療 法組合物中的一種或多種。
65.前述權利要求的方法，其中被評估的療法用於人受試者。
66.—種製品，其包含至少一種結合前列腺癌相關疾病的標誌物的捕獲試劑，所述 標誌物包括表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10的一個或多個中所 列的至少一個生物標誌物。
67.用於篩選治療前列腺癌相關疾病的治療劑的候選化合物的試劑盒，其中所述試劑 盒包括表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10的一個或多個中所列 的至少一個生物標誌物的一個或多個試劑，和表達至少一個生物標誌物的細胞。
68.前述權利要求的試劑盒，其中使用包含特異性結合至少一個生物標誌物的抗體或 抗體片段的試劑檢測生物標誌物的存在。
69.幹擾前列腺癌相關疾病應答信號轉導途徑的試劑用於製造藥劑的用途，所述藥劑 用於治療、預防、逆轉或或限制個體中疾病併發症的嚴重度，其中所述試劑包含表2、表 3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10的一個或多個中所列的至少一個生物標 志物。
70.治療、預防、逆轉或限制有此需要的個體的前列腺癌相關疾病併發症的嚴重度的 方法，其包括給個體施用幹擾至少前列腺癌相關疾病應答級聯的試劑，其中所述試劑 6包含表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10的一個或多個中所列的至 少一個生物標誌物。
71.幹擾至少前列腺癌相關疾病應答級聯的試劑用於製造藥劑的用途，所述藥劑用於 治療、預防、逆轉或限制個體的前列腺癌相關疾病併發症的嚴重度，其中所述試劑包含 表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10的一個或多個中所列的至少一 個生物標誌物。
72.包含miR-1、miR-32和miR_106b中的一個或多個的反義抑制劑的組合物。
73.治療有此需要的受試者中的前列腺病症的方法，其包括給受試者施用治療有效量 的前述權利要求的組合物。
74.前述權利要求的方法，其中預防性施用所述組合物。
75.前述權利要求的方法，其中所述組合物的施用延遲病症的一個或多個症狀的發作。
76.前述權利要求的方法，其中肽的施用抑制前列腺癌的發生。
77.前述權利要求的方法，其中肽的施用抑制腫瘤生長。
78.前述權利要求的方法，其中肽的施用抑制感染。
79.用於檢測生物學樣品中前列腺癌的存在的方法，該方法包括a)將懷疑包含前列 腺癌的生物學樣品暴露於用於其的標誌物；和b)如果有的話，檢測樣品中所述標誌物的 存在或不存在。
80.前述權利要求的方法，其中所述標誌物包括可檢測的標記。
81.前述權利要求的方法，其還包括將來自受試者的生物學樣品中標誌物的量與來自 正常受試者的相應的生物學樣品中標誌物的量相比較。
82.前述權利要求的方法，其還包括在不同時間點從受試者收集多個生物學樣品和比 較各生物學樣品中標誌物的量以確定標誌物的量在受試者中是隨時間增加還是減少。
83.治療受試者的前列腺癌的方法，該方法包括給有此需要的受試者施用治療有效 量的前列腺受體激動劑。
84.前述權利要求的方法，其中所述受體激動劑是miRl、miR-21和miR-l(^b中的 一個或多個的反義抑制劑。
85.製造用於治療前列腺癌的藥物的用途，所述藥物包含選自表2、表3、表4A、表 4B、表5、表6、表7、表9或表10中顯示的miR、來源於其的序列、此類miR的互補序 列和來源於這樣的互補序列的序列的核酸分子。
86.前述權利要求的用途，其中所述藥物包含核酸分子，所述核酸分子提供選自下列 的序列表2中所列的miR、來源於此類miR的序列、此類miR的互補序列和來源於這 樣的互補序列的序列。
87.鑑定誘導前列腺癌細胞分化的有效治療劑或治療劑的組合的體外方法，該方法包 括步驟i)培養來源於前列腺腫瘤的細胞，ii)向細胞系的培養基中加入至少一種化合 物，iii)分析步驟G)與(ii)之間至少一個miR的表達水平的變化和iv)鑑定誘導步驟(i) 與(ii)之間miR的表達水平的變化的化合物或化合物的組合。
88.前述權利要求的方法，其中步驟(iii)包括分析至少一個miR的表達水平。
89.前述權利要求的方法，其中步驟(iv)包括鑑定調控至少一個miR的表達水平的化合物或化合物的組合。
90.前述權利要求的方法，其中步驟(iv)包括鑑定減少至少一個miR的表達水平的化 合物或化合物的組合。
91.前述權利要求的方法，其中所述化合物是治療癌症的治療劑。
92.用於分類受試者的前列腺組織的方法，其包括a)測量測試細胞群體中選自表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表 10中所列的組的一個或多個核酸序列的表達，其中所述測試細胞群體中至少一個細胞能 夠表達選自表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9或表10中所列的組的一個 或多個核酸序列；b)將所述核酸序列的表達與參照細胞群體中核酸序列的表達相比較，所述參照細胞 群體包含至少一個已知其前列腺癌分類的細胞；和c)如果存在，鑑定測試細胞群體和參照細胞群體中選擇的一個或多個核酸序列的表 達水平的差異，從而分類受試者的前列腺癌。
93.權利要求86的方法，其中與參照細胞群體相比，測試細胞群體中核酸的表達的差 異表示測試細胞群體具有與來自參照細胞群體的細胞不同的分類。
94.權利要求86的方法，其中與參照細胞群體相比，測試細胞群體中核酸的相似表達 模式表示測試細胞群體具有與來自參照細胞群體的細胞相同的分類。
95.權利要求86的方法，其中所述參照細胞群體是多個細胞或資料庫。
96.前述權利要求的方法，其中所述參照細胞群體選自分類為來自正常前列腺組織 的細胞群體的參照細胞群體、分類為來自良性前列腺組織的細胞群體的參照細胞群體和 分類為來自惡性前列腺組織的細胞群體的參照細胞群體。
全文摘要
公開了用於前列腺相關病症的診斷、預後和/或治療的方法和組合物。
文檔編號C12Q1/68GK102027129SQ200980111708
公開日2011年4月20日 申請日期2009年2月27日 優先權日2008年2月28日
發明者C·M·克羅斯, S·阿姆布斯 申請人:俄亥俄州立大學研究基金會, 由衛生與公眾服務部代表的美利堅合眾國政府