檢測鯉皰疹病毒3型指紋序列的物質及其在製備檢測試劑或試劑盒中的應用的製作方法

2023-05-16 14:27:06

本發明涉及生物技術，分子生物學領域特別是指一種檢測鯉皰疹病毒3型指紋序列的物質及其在製備基於焦磷酸測序的鯉皰疹病毒3型檢測試劑或試劑盒中的應用。

背景技術：

錦鯉皰疹病毒病，是被列為《中華人民共和國進境動物一、二類傳染病、寄生蟲病名錄》的二類動物疫病，同時也是世界衛生組織（oie）必須申報的疾病。

該病病原鯉皰疹病毒3型（cyprinidherpesvirus3,cyhv-3），又稱為錦鯉皰疹病毒（koiherpesvirus,khv），能引起鯉魚和錦鯉發生高度傳染性病毒病，並能感染多種鯉科魚類。在亞洲、歐洲、北美洲等多個國家流行，死亡率高達80%~100%。可通過魚體、水、糞便等途徑進行傳播，對鯉魚及錦鯉養殖業造成嚴重的打擊。

因細胞培養病毒分離技術操作本身的繁雜耗時及血清學方法靈敏度有限的缺陷，無法達到對cyhv-3快速診斷的目的。因此有必要建立一種適用於出入境口岸診斷的高通量、自動化、快速的cyhv-3檢測方法。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題是如何鑑定鯉皰疹病毒3型。

為解決上述技術問題，本發明首先提供了檢測鯉皰疹病毒3型指紋序列的物質，。

本發明所提供的檢測鯉皰疹病毒3型指紋序列的物質，所述鯉皰疹病毒3型指紋序列為序列表中seqidno.1的第2355-2389位核苷酸。

進一步，所述檢測鯉皰疹病毒3型指紋序列的物質包括鯉皰疹病毒3型指紋序列的測序引物和/或鯉皰疹病毒3型指紋序列的引物對。

進一步，所述測序引物為序列表中seqidno.4所示的單鏈dna，其名稱為cyhv-3-s；所述擴增鯉皰疹病毒3型指紋序列的引物對（cyhv-3-p）由序列表中seqidno.2所示的單鏈dna（cyhv-3-p-f）和seqidno.3所示的單鏈dna（cyhv-3-p-r）組成。

進一步，所述seqidno.2所示的單鏈dna和/或seqidno.3所示的單鏈dna用生物素標記。

在本發明的一個實施例中，seqidno.3所示的單鏈dna的5′端有生物素標記。

所述檢測鯉皰疹病毒3型指紋序列的物質可只由所述cyhv-3-s及所述cyhv-3-p組成，也可只由所述cyhv-3-p組成，也可只由所述cyhv-3-s組成。

上文中，所述檢測鯉皰疹病毒3型指紋序列的物質，還可包括檢測所述鯉皰疹病毒3型指紋序列所需要的其他試劑和/或儀器，如通過焦磷酸測序檢測所述鯉皰疹病毒3型指紋序列所需的試劑和儀器。

具體來說，進行焦磷酸測序所需要的其它試劑和儀器可為5×buffer、dntp和/或rtaq酶和/或變性緩衝液（pyromarkdenaturationsolution）和/或衝洗緩衝液（pyromarkwashbuffer）和/或鏈黴親和素包被的磁珠和/或pcr儀和/或pyromarkid儀器。

其中，所述5×buffer、dntp和所述rrtaq酶均可為寶生物工程(大連)有限公司產品，貨號為dr001b；

所述鏈黴親和素包被的磁珠可為美國gehealthcare的產品，貨號為17-5113-01。

所述變性緩衝液（pyromarkdenaturationsolution）可為為德國qiagen產品，貨號為979007。

所述衝洗緩衝液（pyromarkwashbuffer）可為德國qiagen產品，貨號為979008。

所述退火緩衝液（pyromarkannealingbuffer）可為德國qiagen產品，貨號為979009。

上述檢測鯉皰疹病毒3型指紋序列的物質均可獨立包裝。

為解決上述技術問題，本發明還提出了所述檢測鯉皰疹病毒3型指紋序列的物質在製備基於焦磷酸測序的鯉皰疹病毒3型檢測試劑或試劑盒中的應用。

更進一步的，本發明還提供了基於焦磷酸測序的鯉皰疹病毒3型檢測試劑或試劑盒。

本發明所提供的基於焦磷酸測序的鯉皰疹病毒3型檢測試劑或試劑盒，包括了所述檢測鯉皰疹病毒3型指紋序列的物質

為解決上述技術問題，本發明還提供了基於焦磷酸測序的鯉皰疹病毒3型檢測試劑或試劑盒的製備方法。

所述基於焦磷酸測序的鯉皰疹病毒3型檢測試劑或試劑盒的製備方法，包括將所述測序引物和/或所述引物對的兩條單鏈dna獨立包裝的步驟。

為解決上述技術問題，本發明還提供了鯉皰疹病毒3型的檢測方法1。

本發明所提供的鯉皰疹病毒3型的檢測方法1，包括下述h1）和h2）的步驟：

h1）以待測生物樣品的核酸（rna或dna）為模板，選用58℃的退火溫度，用所述cyhv-3-p進行pcr擴增得到pcr產物；

h2）檢測步驟h1）得到的pcr產物的大小，如果所述pcr產物中含有254bp的dna片段，所述待測樣品含有鯉皰疹病毒3型或候選含有鯉皰疹病毒3型；如果所述pcr產物中不含254bp的dna片段，所述待測樣品不含鯉皰疹病毒3型或候選不含鯉皰疹病毒3型。

為解決上述技術問題，本發明還提供了鯉皰疹病毒3型的檢測方法2。

本發明所提供的鯉皰疹病毒3型的檢測方法2，包括下述h3）和h4）的步驟：

h3）以待測生物樣品的核酸（rna或dna）為模板，選用58℃的退火溫度，用所述cyhv-3-p進行pcr擴增得到pcr產物；

h4）檢測步驟h3）得到的pcr產物，如果所述pcr產物中含有所述鯉皰疹病毒3型指紋序列，所述待測樣品含有鯉皰疹病毒3型或候選含有鯉皰疹病毒3型；如果所述pcr產物中不含所述鯉皰疹病毒3型指紋序列，所述待測樣品不含鯉皰疹病毒3型或候選不含鯉皰疹病毒3型。

上述鯉皰疹病毒3型的檢測方法2中，所述檢測步驟h3）得到的pcr產物為以所述cyhv-3-s為測序引物進行焦磷酸測序。

上文中，

實驗證明，鯉皰疹病毒3型（cyhv-3）指紋序列，可利用本發明的檢測鯉皰疹病毒3型（cyhv-3）指紋序列的物質通過焦磷酸測序法對鯉皰疹病毒3型進行鑑定，其中cyhv-3-p可擴增出含有cyhv-3指紋序列的dna片段，cyhv-3-s可通過焦磷酸測序法測定cyhv-3指紋序列的序列；本發明的cyhv-3-p和cyhv-3-s可特異識別鯉皰疹病毒3型的核酸序列；本發明的cyhv-3-p具有較高的靈敏度，可識別濃度為100拷貝/μl的鯉皰疹病毒3型，說明cyhv-3-p最低能檢測到濃度為100個cyhv-3基因組拷貝數/μl（即0.8fgcyhv-3基因組/μl）。常規的dna測序技術對大片段的dna進行序列測定速度慢、消耗大，更不易於進行大規模樣本的檢測，而依賴於本發明的cyhv-3-p與cyhv-3-s的鑑定cyhv-3的焦磷酸測序法則可克服這一缺點，可快速檢測大規模樣本，在4小時內即可完成檢測過程。實驗證明，與普通pcr鑑定cyhv-3相比，依賴於本發明的cyhv-3指紋序列及cyhv-3-p與cyhv-3-s的鑑定cyhv-3的焦磷酸測序法具有高通量、自動化程度高、準確性高、靈敏度高、可靠性好、重複性好、穩定性好、方便快捷等特點。

附圖說明

圖1為pcr產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，泳道m為dl1000marker；泳道1和泳道2為用cyhv-3-p以cyhv-3的dna為模板的pcr擴增產物的電泳圖；

圖2為cyhv-3測序結果。

圖3為cyhv-3-p的特異性檢測結果。其中，泳道m為dl1000marker；泳道1的模板為cyhv-3；泳道2的模板為陰性對照；泳道3的模板為cyhv-2；泳道4的模板為svcv；泳道5的模板為lmbv；泳道6的模板為gcrv；泳道7的模板為isknv；

圖4為cyhv-3-p的靈敏度實驗結果。其中，泳道m為dl1000marker；泳道1的模板為107拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3；泳道2的模板為106拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3；泳道3的模板為105拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3；泳道4的模板為104拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3；泳道5的模板為103拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3；泳道6的模板為102拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3；泳道7的模板為10拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3；泳道8的模板為1拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3；泳道9為陰性對照。

具體實施方式

下面結合具體實施方式對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的範圍。

下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

下述實施例中的鯉皰疹病毒3型（cyhv-3)（李瑩瑩,王慶,曾偉偉,等.錦鯉皰疹病毒gz1301株的分離與鑑定[j].水產學報,2014,38(8):1159-1166.）公眾可從中華人民共和國中國水產科學研究院珠江水產研究所獲得，該生物材料只為重複本發明的相關實驗所用，不可作為其它用途使用。

下述實施例中的鯉皰疹病毒2型（cyhv-2）（徐進,曾令兵,楊德國,等.鯉皰疹病毒2型武漢株的分離與鑑定[j].中國水產科學,2013,20(6):1303-1309.）公眾可從中華人民共和國中國水產科學研究院珠江水產研究所獲得，該生物材料只為重複本發明的相關實驗所用，不可作為其它用途使用。

下述實施例中的大口黑鱸虹彩病毒（lmbv）（王慶,曾偉偉,劉春,等.大口黑鱸虹彩病毒雙重pcr檢測方法的建立[j].華中農業大學學報,2013(4):106-110.）公眾可從中華人民共和國中國水產科學研究院珠江水產研究所獲得，該生物材料只為重複本發明的相關實驗所用，不可作為其它用途使用。

下述實施例中的傳染性脾腎壞死病毒（isknv）（付小哲,李寧求,林強,等.鱖傳染性脾腎壞死病毒主衣殼蛋白單克隆抗體的製備及鑑定[j].水產學報,2016(3):363-370.）公眾可從中華人民共和國中國水產科學研究院珠江水產研究所獲得，該生物材料只為重複本發明的相關實驗所用，不可作為其它用途使用。

下述實施例中的大口黑鱸虹彩病毒（lmbv）（王慶,曾偉偉,劉春,等.大口黑鱸虹彩病毒雙重pcr檢測方法的建立[j].華中農業大學學報,2013(4):106-110.）公眾可從中華人民共和國中國水產科學研究院珠江水產研究所獲得，該生物材料只為重複本發明的相關實驗所用，不可作為其它用途使用。

下述實施例中的鯉春病毒血症病毒(svcv)（徐進,周勇,陳倩,等.鯉春病毒血症病毒糖蛋白的截短表達及其免疫原性分析[j].中國水產科學,2016,23(2):352-358.）公眾可從中華人民共和國中國水產科學研究院珠江水產研究所獲得，該生物材料只為重複本發明的相關實驗所用，不可作為其它用途使用。

下述實施例中的pmd18-t載體為寶生物工程(大連)有限公司產品，貨號d101a。

下述實施例中的鏈黴親和素包被的磁珠為streptavidinsepharose®highperformance為gehealthcare產品，貨號為17-5113-01。

下述實施例中的變性緩衝液（pyromarkdenaturationsolution）為德國qiagen產品，貨號為979007。

下述實施例中的衝洗緩衝液（pyromarkwashbuffer）為德國qiagen產品，貨號為979008。

下述實施例中的退火緩衝液（pyromarkannealingbuffer）可為德國qiagen產品，貨號為979009。

實施例1、用於檢測鯉皰疹病毒3型引物的製備

檢測鯉皰疹病毒3型（cyhv-3）指紋序列的物質包括鯉皰疹病毒3型指紋序列的測序引物cyhv-3-s和擴增鯉皰疹病毒3型指紋序列的引物對cyhv-3-p。鯉皰疹病毒3型指紋序列為序列表中seqidno.1的第2355-2389位核苷酸。cyhv-3-s為序列表中seqidno.4所示的單鏈dna；cyhv-3-p為由序列表中seqidno.2所示的單鏈dna（cyhv-3-p-f）和seqidno.3所示的單鏈dna（cyhv-3-p-r）組成的引物對，cyhv-3-p-r的5′端有生物素標記，cyhv-3-p的擴增產物為序列表中seqidno.1的第2265-2518位核苷酸所示的dna分子，擴增產物為254bp。其中，seqidno.1為鯉皰疹病毒3型dna聚合酶基因的dna序列（ncbi中的登錄號為dq657948.1）。

表1、cyhv-3的指紋序列和引物

實施例2、cyhv-3-p擴增條件的優化

1、重組載體的構建

將pmd18-t載體與seqidno.1的第2265-2518位核苷酸所示的dna分子所示的核苷酸序列進行連接，保持pmd18-t載體的其他序列不變，得到重組載體，將該重載載體命名為pmd18-t-cyhv-3。

2、cyhv-3-p擴增條件的優化

以下述pcr擴增體系對cyhv-3-p的擴增條件進行優化：濃度為50ng/µl的pmd18-t-cyhv-3載體4µl，5×buffer5µl，2.5mmdntp4ul，5u/µlrtaq酶0.5µl，濃度為10mmol/l的cyhv-3-p-f2µl，濃度為10mmol/l的cyhv-3-p-r2µl，depc水補足體積至50µl。

優化的cyhv-3-p擴增條件為：94℃預變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，50次循環；72℃延伸7min，4℃結束。

實施例3、焦磷酸測序法鑑定cyhv-3

提取cyhv-3的dna，分別得到濃度均為50ng/µl的cyhv-3dna。

1、焦磷酸測序法鑑定cyhv-3

1.1pcr擴增

50µlpcr擴增體系：濃度為50ng/µl的的cyhv-3dna4µl，5×buffer5µl，2.5mmdntp4ul，5u/µlrtaq酶0.5µl，濃度為10mmol/l的cyhv-3-p-f2µl，濃度為10mmol/l的cyhv-3-p-r2µl，depc水補足體積至50µl。

擴增條件為：94℃預變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，50次循環；72℃延伸7min，4℃結束。

將得到的pcr產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳（圖1），結果表明，pcr擴增得到了254bp的pcr產物。

1.2焦磷酸測序

將50µl步驟1.1的pcr產物與2µl的鏈黴親和素包被的磁珠混合後，在室溫充分混勻10分鐘。，開啟真空泵吸取結合珠及pcr產物混懸液，然後依次在70%乙醇、變性緩衝液（pyromarkdenaturationsolution）和衝洗緩衝液（pyromarkwashbuffer）中清洗5s。關閉真空泵，後將探頭上結合珠及pcr產物置入40ul退火緩衝液（pyromarkannealingbuffer）(含測序引物10umol/l1.5ul)，85℃變性2min，冷卻至室溫，使引物與模板退火雜交。

根據pyrosequencing軟體序列設計信息所計算出劑量，在試劑艙中依次加入底物混合物、酶混合物及四種dntp(qiagen)，將試劑艙及96孔反應板放入pyrosequencing檢測儀(pyromarkq96id，qiagen)進行反應，讀取dna序列，所測序列包含cyhv-3指紋序列「ccgcttcgagacctacacggcgtctagcctcaacc」，結果表明，cyhv-3指紋序列、cyhv-3-p及cyhv-3-s可用來鑑定cyhv-3。

實施例4、cyhv-3-p與cyhv-3-s的特異性實驗

提取鯉皰疹病毒2型（cyhv-2）、大口黑鱸虹彩病毒（lmbv）和傳染性脾腎壞死病毒（isknv）的dna，得到濃度均為50ng/µl的cyhv-2、lmbv和isknv的總dna；提取草魚呼腸孤病毒（gcrv）和鯉春病毒血症病毒（svcv）的rna，分別得到濃度均為50ng/µl的gcrv和svcv的總rna，反轉錄合成cdna第一鏈。

1、cyhv-3-p與cyhv-3-s的特異性

1.1pcr擴增

50µlpcr擴增體系：實施例3的cyhv-3總dna4µl，濃度為50ng/µl的pmd18-t-cyhv-3載體4µl，5×buffer5µl，2.5mmdntp4ul，5u/µlrtaq酶0.5µl，濃度為10mmol/l的cyhv-3-p-f2µl，濃度為10mmol/l的cyhv-3-p-r2µl，depc水補足體積至50µl。

擴增條件為：94℃預變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，50次循環；72℃延伸7min，4℃結束。pcr擴增結束後得到cyhv-3的pcr產物。

按照上述方法，將實施例3的cyhv-3總rna分別替換為上述cyhv-2總dna、lmbv總dna和isknv總dna，gcrvcdna和svcvcdna，其他步驟均不變，分別得到cyhv-2的pcr產物、lmbv的pcr產物、isknv的pcr產物、gcrv的pcr產物和svcv的pcr產物。

將上述pcr產物分別進行瓊脂糖凝膠電泳（圖3），結果表明，只有cyhv-3的pcr產物中有254bp的條帶，表明cyhv-3-p只有以cyhv-3的dna為模板才能擴出目的條帶。

1.2焦磷酸測序

按照實施例3步驟1中1.2的焦磷酸測序的方法，分別以cyhv-3-s為測序引物對本實施例步驟1的1.1得到的cyhv-3的pcr產物、cyhv-2的pcr產物、lmbv的pcr產物、isknv的pcr產物、gcrv的pcr產物和gcrv的pcr產物進行測序。結果顯示，只有cyhv-3的pcr產物的測序結果有如圖2所示的測序峰型，其餘的pcr產物均沒有圖2所示的測序峰型，表明只有cyhv-3的pcr產物含有cyhv-3指紋序列，其餘的pcr產物均不含cyhv-3指紋序列。

結果表明，cyhv-3-p及cyhv-3-s可特異識別cyhv-3。

實施例5、cyhv-3-p的靈敏度實驗

1、cyhv-3-p的靈敏度

將實施例2步驟1的重載載體pmd18-t-cyhv-3用depc水進行稀釋，分別得到

107拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3、106拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3、105拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3、104拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3、103拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3、102拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3、10拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3和1拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3。。

50µlpcr擴增體系：107拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-34µl，5×buffer5µl，2.5mmdntp4ul，5u/µlrtaq酶0.5µl，濃度為10mmol/l的cyhv-3-p-f2µl，濃度為10mmol/l的cyhv-3-p-r2µl，depc水補足體積至50µl。

擴增條件為：94℃預變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，50次循環；72℃延伸7min，4℃結束。pcr擴增結束後得到cyhv-3的107拷貝pcr產物。

按照上述方法，將107拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3分別替換為106拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3、105拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3、104拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3、103拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3、102拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3、10拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3、1拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3和depc水，其他步驟均不變，分別得到cyhv-3的106拷貝pcr產物、cyhv-3的105拷貝pcr產物、cyhv-3的104拷貝pcr產物、cyhv-3的103拷貝pcr產物、cyhv-3的102拷貝pcr產物、cyhv-3的10拷貝pcr產物、cyhv-3的1拷貝pcr產物和陰性對照pcr產物。

將上述pcr產物分別進行瓊脂糖凝膠電泳（圖4），結果顯示，cyhv-3的107拷貝pcr產物、cyhv-3的106拷貝pcr產物、cyhv-3的105拷貝pcr產物、cyhv-3的104拷貝pcr產物、cyhv-3的103拷貝pcr產物、cyhv-3的102拷貝pcr產物均有254bp的條帶，陰性對照pcr產物中無該條帶，表明，cyhv-3-p最低能檢測到濃度為102拷貝/50μl的cyhv-3，說明cyhv-3-p最低能檢測到濃度為100個cyhv-3基因組拷貝數/μl（即0.8fgcyhv-3基因組/μl（請指明病毒核酸濃度））。