人胚胎幹細胞方法與podxl表達的製作方法

2023-05-16 05:05:26 2

專利名稱：：人胚胎幹細胞方法與podxl表達的製作方法
技術領域：
：本發明涉及用於鑑定樣品中的未分化胚胎幹細胞並從樣品中分離它們的方法；以及用於去除樣品內這種細胞的方法。本發明還涉及在這種方法中有作用的組分試劑盒(kitofparts)。
背景技術：
：未分化的人胚胎幹細月包在醫學中具有多種用途，例如用於組織再生和修復，且人們相信其在今後將變得越發重要。目前，捐獻的器官和組織常常用來*#換患病或受損組織，^f旦對可移4直組織和器官的需求已大大超過了有效供給量。幹細胞尤其是人胚胎幹細胞可定向分化為特定的細胞類型，提供了可更新性^,換細胞和組織來源的可能性，用來治療帕金森和阿爾茨海默病、脊髓損傷、中風、燒傷、心臟病、津唐尿病、骨關節炎及類風溼'f生關節炎。目前，用來鑑定人胚胎幹細胞的試驗包括培育並再次培養所述幹細胞幾個月。這確保了細胞能夠長期自我更新。通過顯糹敬鏡觀察該培養物，以判斷細胞看上去健康且保持未分化。利用特殊技術來確定僅在未分化細胞上所發現的表面標誌物的存在。另一個重要的試驗是檢測通常由未分化細胞生成的稱為Oct-4蛋白的存在。Oct-4是一種轉錄因子，即其有助於基因在恰當的時間開啟或關閉，是細月包分化和胚胎發育過程中的重要部分。檢測人胚胎幹細胞是否為多能性，通過1)允許細胞在細胞培養基中自發分化；2)處理細胞使其分化形成特定細胞類型；或者3)將該細胞注射入免疫抑制的小鼠體內，4企測稱為畸胎瘤的良性腫瘤的形成。畸胎瘤通常包含多種分化或部分分化的細胞類型-表明胚胎幹細l包能夠分化為多種細月包類型。儘管未分4匕人胚胎幹細月包本身可用於細月包療法中，^f旦人們^人為，相比於人胚胎幹細力包，採用已開始分化或已經分4b的細胞比4交有好處。促進未分化人胚胎幹細胞分化為特殊細胞譜系的方法在本領域中為人熟知。一旦該分化過程已經開始或繼續，則去除或破壞未分化人胚胎幹細胞則比較有益，否則其可能形成不需要的畸胎瘤。因此，可以看出鑑定或分離未分化人胚胎幹細胞非常有利(因為其本身可用於治療中或經促進可分化為可用於治療中的特定細胞諳系)。從細胞混合物中去除或破壞未分化人胚胎幹細胞也非常有利，細胞混合物中的部分細胞已經開始分化或已分化，因為這些分化細胞在治療中比較有利。現在仍然需要其他鑑定未分化人胚胎千細力包的方法。本發明者已經發現足糖萼蛋白樣蛋白1前體是未分化人胚胎幹細胞的一個標誌物。本說明書中對之前所發表文獻的羅列和討論不必認為是承認該文獻為本領域現狀的一部分或是共有的常識。
發明內容本發明的第一方面提供鑑定樣品中未分化人胚胎幹細胞的方法，樣品可能包含這種細胞，該方法包括鑑定表達足糖萼蛋白樣蛋白l前體(PODXL)的才羊品內表面上細月包。該方法可用來評估特殊樣品是否包含未分化人胚胎幹細胞以及如果包含這種細胞，則評估包含多少這種細胞。因此，本發明包，括未分化人胚胎幹細力包的定量。本發明的第二方面提供從包含這種細胞的樣品中分離未分化人胚胎幹細胞的方法，該方法包括分離樣品內表達其表面上的PODXL的細胞。本方法用來^是供富集(enriched)的或基本分離的未分化人胚胎千細胞的組合物。這種組合物可用於多種方法中，例如其本身可用於細胞療法中，如下文將更詳細討論的，或者其可用作細胞來源，其經促進可分化為用於特定治療的特定細胞譜系，或者其可用來(體外或體內)研究可使人胚胎幹細胞分化為其他細胞的因素。通常，該人胚胎幹細力包的富集組合物所包含細力包的至少50%為未分化人胚胎幹細胞，優選至少70%或至少90%或至少95%。優選的，該組合物中的所有細胞均為所述未分化人胚胎幹細胞。本發明的第三方面提供從包含這種細胞的樣品中去除未分化人胚胎幹細月包的方法，該方法包括V人才羊品中去除表達其表面上的PODXL的糹田月包。所去除的細胞可能形成如本發明第二方面中人胚胎幹細胞的組合物。此外，已經從中去除人胚胎幹細胞的樣品在治療中可能非常有利，如下文將更詳細討i侖的。10本發明的第四個方面提供破壞包含這種細胞的樣品中未分化人胚胎幹細胞的方法，該方法包括破壞樣品內表達其表面上的PODXL的細月包。石皮壞或殺死樣品中的未分化人胚胎幹細胞非常有利，因為如下文所討論的，從未分化和分化細胞混合物中去除未分化人胚胎幹細胞有時非常有利。樣品可以為任何包含或懷疑包含一種或多種未分化人胚胎幹細胞的樣品。恰當的樣品包括人胚胎或人胚胎組織。其他恰當樣品包括體外培養的樣品。關於本發明的第三和第四方面，特別優選樣品中的未分化人胚胎幹細胞經促進已分化為特定細胞譜系，因此該樣品可包含未分化和分化細胞的混合物(因為目前分化不是一個高效的過程)。通常，在這種樣品中，所述未分化人胚胎幹細胞構成細胞總數的百分之幾。通常，樣品中的分化細胞可以為(通過分化)起源於人胚胎幹細胞的心月幾細J包、月夷島、神經元祖細月包或間質幹細胞。在臨床應用包含分化細胞的樣品之前，從該樣品中去除(或在其中石皮壞)未分化人胚胎幹細i包將非常有利，因為所述未分化細刀包可能形成不需要的畸胎瘤。通常，應去除或破壞未分化細胞的至少95%。優選的，去除或-皮壞所述全部細胞。相對於去除，更傾向於石皮壞或殺死才羊品中的未分化細月包，以將細胞處理或分離的額外步驟降到最少。此外，人們相信殺死可能是一種更"純粹"形式的細胞去除。足糖萼蛋白樣蛋白1前體的胺基酸序列在圖9B中給出(SEQIDNO:1),也可在通過EntrezPubMed在NCBI蛋白序列翁:據庫的登陸號No000592中查到(還可參見Kershaw"a/(1997)乂^o/.C77em.272，15708-15714)。也稱為PCLP1和PODXL。為了方1^更，下文3誇4爾為PODXL。應該理解，用在本發明所述方法中的標誌物是在未分化人胚胎幹細胞中天然存在的PODXL。因此，PODXL可能具有圖9B中給出的精確序列，還可以是其天然存在的變異體。例如，根據000592,R是殘基62處T的變異體，而S是殘基196處L的變異體。在本發明第一、第二和第三方面的特別優選實施例中，使樣品與結合部分4妄觸，該結合部分結合PODXL,通過其結合於該結合部分所述人胚胎幹細胞可在樣品中鑑定，或者從樣品中分離或去除。才艮據000592，PODXL是528殘基糖基化的細月包表面多肽，其殘基1-22是單肽，而殘基23-528代表成熟蛋白。人們認為殘基23-431是蛋白的胞外部分，而殘基432-452是3,膜區。殘基23-304代表Ser/Thr富集區。如果結合PODXL的結合部分結合PODXL的月包外區，例如在Ser/Thr富集區內部或該區域之外，則是優選的。合適的，該結合部分是抗體，該術語包括其片,殳或書f生物，或者合成的抗體或合成的抗體片段。結合PODXL的抗體已經為人所知。例如，特異於人足糖萼蛋白的山羊IgG(該多克隆4元血清結合到月包外i或)可從R&DSystems,Inc購得，目錄號是AF1658。此外，單克隆抗人足糖萼蛋白抗體(小鼠IgG2A)可乂人R&DSystems,Inc購4尋，目錄號是MAB1658。在<壬何情形下，通過目前與單克隆抗體技術相關的技術，可製備針對大多數抗原的抗體。抗原結合部分可為抗體的一部分(例如Fab片段)或者合成的抗體片段(例如單鏈Fv片段[ScFv])。針對選定抗原的恰當單克隆抗體可通過已知技術製備，例如那些在"Mo"oc/o"a/y^/6ot//esvj附朋i/a/fec/2m々wW,HZola(CRCPress,1988)和JGRHurrell(CRCPress，1982)中所4皮露的。Neuberger等人討論了嵌合抗體(1988，8,//w^"a"o加/5/c^ec/2wo/ogy5y^2/os7'm柳Part2,792-799)。多克隆抗體在本發明所述方法中非常有利。優選單特異性多克隆抗體。恰當的多克隆抗體可利用本領域中熟知的方法進4亍製備。抗體片段例如Fab和Fab2片段還可應用作為一般的基因工程抗體和抗體片l史。在抗體識別中涉及抗體的重《連可變區(VH)和輕鏈可變區(VL),該事實最初是通過早期的蛋白酶消化試驗而認識到的，並通過嚙齒類抗體的"人源化"而得到進一步確認。齧齒動物源抗體的可變區可融合於人源抗體的恆定區，使得所得到的抗體保留齧齒動物源抗體的抗原特異性(MorrisonW"/(1984)屍rac.A^"81，6851-6855)。該抗原特異性由可變區賦予，且依賴於恆定區，這一點是從涉及抗體片段的細菌表達的實驗而得知的，所述抗體片段均包含一個或多個可變區。這些分子包4舌Fab才羊分子(Better""/(1998)5Wewce240，1041);Fv分子(Skerraetal(1988)5W潔e240,1038);單鏈Fv(ScFv)分子，其中Vh和VL的伴侶結構域通過柔性寡肽而連4妄(Bird"a/(1998)242，423;Huston"c/(1988)胸/.JcadSc/.6^485,5879)並且包含獨立V區的單鏈抗體(dAbs)(Ward"a/(1989)A^w"341，544)。對保留其特異結合位點的抗體片段合成中所涉及才支術的綜述可在Winter&Milstein(1991)A^fwre349，293-299中查到。13通過"ScFv分子"表示其中Vh和VL的伴侶結構域通過柔性寡肽連4妄的分子。Fab、Fv、ScFv和dAb抗體片,殳均可在co//中表達並乂人其中分泌出來，^v而易於生成大量所述片l殳。全抗體和F(ab，)2片l殳為"二^介"。通過"二fT表示所述抗體和F(ab，)2片段具有兩個抗原結合位點。相反，Fab、Fv、ScFv和dAb片段為單價，僅具有一個抗原結合位點。結合PODXL的合成抗體還可利用噬菌體顯示技術製備，如本^頁i或中為人熟^口的。特別優選用於本發明所述方法和試劑盒中的抗PODXL抗體在下文i舉細4苗述。通常，在鑑定未分化人胚胎幹細胞的方法中，結合部分進行可檢測性標記或者可以檢測。例如，結合部分用放射性原子或有色分子或螢光分子或易於以NO:2)i0OTSMAS(,B>NO:3)鄉QQ，SYFYT(S1QIDNO:4》的IfTWMN,ID藍5)v)BIRLKSNNYATHyABSVKG(SEQIDNO:6)WERA卿麗0:7)或其變異體，其中所述序列i)至Vi)的一個或多個中的一個或兩個或三個胺基酸用另一種胺基酸取^。優選的，抗體包含已給出的特殊胺基酸序列。通常，如果所給出的胺基酸序列存在變異，則該變異是所述序列i)至Vi)中一個或兩個或三個或四個中一個或兩個胺基酸的取^。通常，變異體在所述序列i)至vi)中一個或兩個中具有一個或兩個胺基酸取^。方i"更的，在所述序列i)至vi)中一個或兩個中存在一個胺基酸取代。在任何情形下，抗體均保留結合PODXL的能力。優選的，抗體選才奪性結合PODXL的胞夕卜區域，所述與PODXL的選擇性結合由這些胺基酸序列的存在而賦予。伊G選的，^L體具有至少一個結合下列CDR的輕鏈可變區CDR1:SASSSVKYM1f(SBQIDNO:2)ODE2:DTS>ttAS,fl>NO:3》OTE3:QQ鄉SYPYT卿H>M>:4)專交優選的，抗體具有至少一個包含圖ii中所示出胺基酸序列(SEQIDNO:8)的45鏈可變區。優選的，抗體具有至少一個結合下列CDR的重鏈可變區CDRl:MYWMN(SEQID:N0:5)ODR2:E10XSHNYMHY細VK:G卿IB微6)CDR3:BRA(犯QBDNO:7)專交優選的，抗體具有至少一個包含圖12中所示出胺基酸序列(SEQIDNO:IO)的重鏈可變區。更加優選的，抗體具有如上文所確定defined的至少一種輕鏈可變區以及力o上文所確定defined的至少一種重鏈可變區。最優選的，抗體具有至少一個包含如圖11中所示出胺基酸序列(SEQIDNO:8)的輕《連可變區和至少一個包含如圖12中所示出氨基f復序列(SEQIDNO:IO)的重鏈可變區。然而，應該理解上文所列出mAb84的輕《連和重鏈CDRsl-3與除圖11和12中所示之外的才匡架區結合也可能特別有利。因此，在一種實施方式中，上文所列出mAb84的具有CDRsl-3的輕《連或重鏈可具有替代性框架區。恰當的框架區在本領域中為人熟知，且可在例如M.Lefranc&G.Lefranc(2001)"TheImmunoglobulinFactsBook"，AcademicPress,結合於此供參考。抗體可進行可檢測性標記或者其可利用如上文所述細胞毒性部分進行標記。抗體可用於本發明第一、第二、第三或第四方面所述方法中的任何一種，且其可用於組分試劑盒中。應該理解，CDR序列可用於生成如上文所討i侖的合成抗體和抗體片段。本發明的另一方面4是供編碼上文所4是及抗體或包含這種抗體Vl或VH鏈其中之一(或二者均包含)的分子的多核苷酸。編碼mAb84輕鏈和重鏈的多核普酸分別在圖11(SEQIDNO:9)和圖12(SEQIDNO:ll)中示出。本發明包4舌包含表達抗體所需的一種或多種多核苷酸的宿主細胞。通常，該宿主細胞是細菌、酵母或哺乳動物細胞。中華倉鼠卵巢(CHO)細月包特別適於4元體生成。現在，將參照下列圖形和實施例而進行描述，其中恩丄柳」A與末^y麼^E^C^9應系^"合的就式^9應;^^f。HES-3細胞的單細胞懸液用抗hESC上細胞表面抗原製備的不同mAb克隆或抗Tra-1-60的mAb進4亍染色。結合於細月包的抗體則用輒合FITC的抗小鼠抗體進行檢測。陰影直方圖表示利用隱性對照進行染色，空白直方圖則表示利用第一抗體進行染色。激2^/^A瘦鈿應化夢為、浙/i"A與/^E^C^虔丄鈿應表面拔j的潛合。在飼養細胞上培養的HES-3克隆用抗hESC上細胞表面抗原製備的不同mAb克隆進行免疫染色。隨後克隆用輒合FITC(mAb5、14、63和95)或PE(mAb84和mAb85)的抗小鼠才企測抗體進行染色。陰性染色利用同種型對照SSEA-1進行觀察(數據未示出)。圖像以40倍》丈大進行拍才聶，比例條表示200jum。激義對以不/^7的A^^C錄合附JA;^拔Ocf的附J6染悉的好ES-3進^f"雙悉滅^C勿應為、^f。hESC的單細胞懸液依次用不同的hESC結合mAb克隆染色，隨後用抗Oct-4的mAb染色。結合於細胞的抗體同時用抗小鼠IgG特異性抗體(軛合FITC)和抗小鼠IgM抗體(軛合PE)進行4企測。定位該plot的標誌物以表示左下象限中恰當的FITC或PE軛合的同種型對照中>95%的螢光。激4附^W對^E"51(7和五C細應的^9應毒性^t應。細月包懸液(2x105)與5jugmAb84或mAb85(同種型只於照)在4。C一起孵育45min。其後，收集細胞用於在流式細胞儀上進行PI排除分析。散點圖中的門區表示存活細胞群。激5.^M微^"^^f與附^W—趟/承f的/^ESC和五C細應。細月包懸'液(2x105)在24孑14反中與5jugmAb84或mAb85(同種型只於21照)在4。C一起孵育45min,並在顯微鏡下進行分析。圖像以100倍放大進行拍攝，比例條表示100jum。激6.附」W^f^S^A五SC殺務64和醜j時/^^^^^f^:的在在。HES-3細月包與5jugmAb84(A)或mAb85禪，同種型對照)在4。C一起孵育。加入mAb後15、30和45min收集細J包，並通過PI排除或臺盼藍排除試-驗分析存活性。(C)mAb84劑量對hESC的殺傷歲丈應。HES-3細月包與5mgmAb84(血)或mAb85(翻)在4。C一起孵育。45min後，收集細胞，並通過PI排除試驗分析存活性。(D):HES-3細胞與純化或未純化(培養液上清)(■)mAb84在37。C一起孵育45min,隨後收集細胞用於在流式細胞儀上通過PI排除試驗進行分析。與mAb85—起孵育作為同種型對照《0。慰7.時河對/MJW^V^^^E^C殺仿的影詢。HES-3細胞與純化mAb84或mAb84的培養液上清在4。C和37°C—起粹育45min。隨後收集細胞用於在流式細胞儀上通過PI排除試驗進行分析。與mAb85—起將育作為同種型只於照。戽&A五5^,潛維'勝與wJ6W殺i^炎羋之河的^殺。未分化和分化HES-3細月包的單細胞懸液為(A):用抗Tra-1-60的mAb染色。結合於細胞的抗體用軛合FITC的抗小鼠抗體進行檢測。陰影直方圖表示利用隱性對照進行染色，空白直方圖則表示利用抗Tra-1-60的mAb進4亍染色。(B):與5jugmAb84在4。C一起孵育45min。其後，收集細胞用於在流式細胞儀上進行PI排除分析。散點圖中的門區表示存活細胞群。激9.屍(9Z)JVX為附J6^/在A五SC丄的乾^f;jo(A)對利用mAb84免疫沉澱的草巴抗原進4亍蛋白印跡分析。利用PhyTip柱乂人包含mAb84的hESC裂解物中親和純4b的革巴:沆原在SDS-PAGE上分離，進4亍蛋白印跡並用mAb84(泳道1)、抗人PODXL的mAb(泳道2)和抗人PODXL的pAb(泳道3)才全測。(B)利用LC-MS/MS鑑定PODXL。從蛋白資料庫搜索獲得的人PODXL(SEQIDNO:l)胺基酸序列以及從MS分析中對應於PODXL的6個胰蛋白酶肽(下劃線及並H體)。激/汰^"耆戎屍ODAX拔體;^化:f附^A^/對的^9應毒#。HES-3細月包與5ygmAb84、mAb-PODXL、pAb-PODXL或mAb85(同種型對照)在4。C一起孵育45min。在某些實-驗中，hESC進一步與羊抗鼠(GAM)抗體發生超高交聯。其後，收集細胞用於在流式細胞儀上進行PI排除分析。散點圖中的門區表示存活細胞群(A)。結果也以表^^各形式示出(B)。Ki鏈的^j^^f(/f^^核茅^/^y義未加下劃線的胺基酸對應於衝匡架區。力口下劃線的胺基酸則只寸應於互#卜決定區(CDRs)。胺基酸序列是SEQIDNO:8，核普酸序列是SEQIDNO:9。^//鏈的^^^^^/f^^核夯^^,i/義未加下劃線的胺基酸對應於框架區。力口下劃線的胺基酸則對應於互補決定區(CDRs)。胺基酸序列是SEQIDNO:IO，核苦酸序列是SEQIDNO:ll。具體實施例方式實施例i:抗;ut萼蛋白樣蛋白的單克隆抗體結合併殺傷未分化>^胎幹細胞引言人胚胎幹細胞(hESC)起源於胚泡內細胞團，是多潛能幹細胞，具有以未分化狀態在體外無限增殖的能力。在恰當條件下，hESC還可在體外和體內分化為代表所有三種胚層(中胚層、內胚層和外胚層)的細胞類型。形態上，該細胞具有較高的核/質比，且作為不同的克隆而生長。它們還表達高水平的鹼性磷酸酶、端粒酶和轉錄因子Oct-4和Nanog[l-4]。hESC常^見通過細胞表面標誌物的表達進行表徵，包括特殊期胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4、肺瘤排斥抗原(Tra)-l-60和Tra-l-81。然而，這些表面抗原並非hESC特有的，之前曾在人胚胎性癌(EC)細胞中表徵過[5，6]。此外，針對這些抗原的單克隆抗體(mAb)均抗人EC細胞和小鼠胚胎而製備。迄今為止，僅Son和同事描述過利用hESC作為免疫原生成抗細月包表面標誌物的mAb[7]。生成特異於hESC表面4示志物的mAb很重要，因為其能用來鑑定表達限於未分化hESC的新抗原。闡明這些不同的細胞表面抗原在發育和多潛能性中的作用/機制將有助於理解幹細胞調節。具有hESC表面特異性mAb的另一個好處將是能夠在治療前將其結合入細胞分離過程中。hESC分化為特殊i普系的細胞後，將殘存未分化hESC從細胞群中消除非常關鍵，因為這些細胞可能在移植後f1起體內畸胎瘤的形成[8,9]。在本研究中，用活hESC免疫BALB/C小鼠後生成了一《且共10個mAb。這些mAb對未分化hESC細胞系表現出強烈的反應性，然而，在hESC起源的擬胚體、小鼠胚胎幹細胞、小鼠飼養細胞、人EC細胞和其他人細胞系中，反應性減弱或消失。有趣的是，所述克隆的其中之一mAb84，其可與足糖萼蛋白樣蛋白1(PODXL)發生反應，不僅結合且能在15-30分鐘的孵育期內以濃度依賴及補體不依賴性方式殺傷未分化hESC。細胞毒性限於未分化表型，而hESC分化引起該mAb殺傷效率的下降。由於對未分化hESC的選擇性，mAb84可用來在移植分化的細胞類型之前去除或殺傷殘餘hESC。據我們所知，這是首份關於特異性針對未分化hESC的細胞毒性mAb的報導。材料&方法人胚月臺幹細月包系HES-2(46，X，X)、HES畫3(46，X,X)和HES誦4(46，X，Y),人ESCellInternational獲4尋。細月包於37°C/5%C02在明膠塗布器官培養皿內的絲裂黴素-C滅活的飼養細胞(~7xio4細胞/cm2)上(共同培養)或者在補充了來自永生化小鼠飼養細胞的條件培養基E-MEF(無祠養細胞培養基)的基質"交塗布器官培養亞上培養[l]。用於培養HES細胞的培養基是HES培養基或KNOCKOUT(KO)培養基。HES培養基包含80%高#唐DMEM和20%FBS(Hyclone)、10ml月夷島素-轉4失蛋白-石西溶液/L培養基、25U/ml青黴素、25jug/ml鏈黴素、2mML-穀氨醯胺、0.1mM非必需胺基酸(NEAA)和O.lmM2-巰基乙醇；而KO培養基包含85%KO-DMEM和15。/。KO血清^齊^物、lmML-穀氨醯胺、0.1mMNEAA以及0.1mM2-巰基乙醇和4ng/ml石鹹性成纖維生長因子(Invitrogen)。對於共同培養，hESC克隆通過機械剝離利用手拉玻璃毛細管而傳代[2];對於無飼養細胞培養，hESC按照之前描述的酶處理而傳代[2]。小鼠胚月臺幹細月包系(mESC)、CS-1和E14分別為DrChyuan-ShengLin(CollegeofPhysiciansandSurgeons,ColumbiaUniversity[3])和DrBingLim(GenomeInstituteofSingapore[4]惠贈，並按之前所述進行培養[5]。人胚胎性癌(EC)細胞系2102Ep為ProfPeterAndrews(UniversityofSheffield)惠贈，並4要之前所述進4亍i告養[6]。人EC禾口癌細月包系NTERA-2cL.Dl(CRL-1973)、NCCIT(CRL-2073)和Hela(CCL-2)從美國標準培養收集所購買並按25照ATCCi兌明書進4亍培養。人胚腎細月包系293-HEK(GibcoBRL,LifeTechnologies)按照所提供的方案進行培養。為了乂人HES-3細胞i秀導形成擬胚體(EB)(即在體外從HES-3細胞誘導hESC分化)，以團塊形式收集hESC,並在非黏附性懸浮培養亞(Corning)中以聚集體(即作為擬胚體)形式於EB培養基(80%KO-DMEM、20%FCS、25U/ml青黴素、25jug/ml《連黴素、2mML-穀氨醯胺、0.1mMNEAA和O.lmM2-巰基乙醇)中培養8天。隨後，利用胰蛋白酶分離EB並鋪種於明膠化培養亞內，在EB培養基中再培養14天[16]。卓^謦我沐的蘭成兩隻6周大的雌性Balb/C小鼠接受連續5周的腹膜腔內接種，每次均4妄種懸浮於PBS+或MPL+TDM佐劑(Sigma)中的5x106HES-3細胞/小鼠。利用ClonaCellTM-HY雜交瘤克隆試劑盒(StemCellTechnologiesInc)4吏小鼠脾細胞與SP2/0小鼠骨髓瘤細胞融合。簡單而言，利用試劑盒提供的聚乙二醇(PEG)和介質B使脾細胞的單細月包懸液(1x108細月包)與2x107SP2/0細月包發生融合。37。C過夜孵育後，利用甲基纖維素基介質D鋪種雜交瘤。鋪種10-14天後分離雜交瘤的單克隆並在含介質E的96孔^反隨後在24孔組織i咅養板中培養。收集來自每一個雜交瘤的培養液上清，並通過流式細胞儀評估對hESC的反應性。利用ClonaCellTM-InstantCHEKIsotypingKit(StemCellTechnologies)進4亍抗體的分型。諒式勿y^為^^f利用流式細月包4義通過免疫螢光評估與不同細月包群上表面標誌物的抗體反應性。利用胰蛋白酶以單細胞懸液的形式收集細胞，按2x105/10|u1體積的密度重懸於1%BSA/PBS中，並與每一種mAb克隆(150ju1i咅養'液上清或5iug純化的mAb/200ju11%BSA/PBS)或針對SSEA國4(neat，DevelopmentalStudiesHybridomasBank)、Tra誦l-60、Tra-1國81(2.5jag/200ju11%BSA/PBS,Chemicon,MAB4360/4381)、人足糖萼蛋白(PODXL,R&Dsystems,MAB1658)和抗人足淨唐萼蛋白的多克隆4元體(pAb)(5jug/200ju11%BSA/PBS:R&Dsystems)—起孵育45min。隨後用冷1%BSA/PBS洗滌細月包，且進一步用1:500稀釋的羊抗鼠FITC軛合抗體(DAKO)孵育15分鐘。脬育後，再次洗滌細l包並重懸於1。/。BSA/PBS和1.25jug/ml石典4匕丙卩定(PI)中，用於在FACScan(BectonDickinsonFACSCalibur)上進行分析。除非另有指明，所有的孵育均在4。C進行。細胞用恰當的同種型對照染色作為陰性對照。為了共表達研究，用第一抗體孵育hESC，並如上所述用1%BSA/PBS洗滌。其後，將細月包固定、透4匕(CaltagLaboratories)並用抗Oct-4的小鼠mAb(SantaCruzsc-5279)以1:20的稀釋度進4亍孵育。隨後用1%BSA/PBS洗滌細胞，並在暗處用1:500稀釋的FITC軛合的羊抗鼠IgG(K鏈特異性)抗體(Sigma)和PE輒合的兔抗鼠IgM抗體(OpenBiosystems)孵育。孵育後，再次洗滌細月包並重懸於1%BSA/PBS中進行分析。除第一抗體外，所有的孵育均在室溫下進行，各15min。細胞用恰當的同種型對照染色作為陰性對照。名瘦細/S化學3尋細月包在4%多聚甲醛中室溫固定45min，並用每一種mAb的培養液上清室溫孵育lh。用輒合異石克氰酸螢光素(FITC)或藻紅蛋白(PE)(1:500稀釋；DAKO)的羊抗鼠抗體顯示抗體的定位。細應毒'/4試驗細胞上mAb84的細胞毒性利用PI排除試驗和流式細胞儀進行評估。如上所述，1%BSA/PBS中的單細胞懸液(2x10Vl0jul體禾口、)與mAb84(150ju1i備養液上;青或5jug糹屯^f匕的mAb/200ju11%BSA/PBS)、抗人PODXL的mAb或抗人PODXL的pAb(5|ug/200iul1%BSA/PBS，R&Dsystems)於4。C一起孵育45min。其後，洗滌細胞並重懸於1。/oBSA/PBS和1.25jug/ml石典化丙啶(PI)中，用於通過FACS進行分析。為了劑量研究，將HES-3細胞與0.1、0.5、1、5和15jug純化的mAb84/200ju11%BSA/PBS—起孵育。為了時間進程研究，將HES-3細胞與5jug純化的mAb84/200ju11%BSA/PBS一起孵育，並在加入mAb後15、30和45min後收集細月包進4亍分牙斤。為了超高交耳關實-驗，洗滌第一mAb孵育後的HES-3細月包並用羊抗鼠第二抗體(5jug/200ji11%BSA/PBS，DAKO)孵育45min。細月包用同種型對照mAb85孵育作為陰性對照。除非另有指明，所有的孵育均在4匸進行。為了—瞼證利用PI排除試—驗得到的結果，還利用臺盼藍排除法確定每一個樣品的生存能力。為了鑑定mAb84的革巴抗原，將hESC的無飼養細胞培養物在6cmPetri皿(Falcon)中i咅養至融合、用PBS+洗滌並通過在20/0Triton/PBS+中刮除而裂解。通過離心而4吏細月包裂解物澄清並立即用於免疫^^定(IP)。抗原的IP利用自動化MEA系統(PhynexusInc)而實施。簡單而言，通過直接捕獲於ProteinAPhyTip柱(5p1樹脂床，Phynexus,Inc)上而/人雜交瘤i咅養液上清中分離mAb84(~100|ug)。用洗滌糹爰沖液I(10mMNaH2PO4/140mMNaClpH7.4)洗去上清中的未結合蛋白後，使來自約5x106細胞的澄清細胞裂解物通過由捕獲的mAb84功能化的柱子。將柱子進一步用洗滌緩沖液II(140mMNaClpH7.4)洗滌，並在低pH下將結合的蛋白用洗脫緩衝液(200mMNaH2PO4/140mMNaClpH2.5)乂人柱子上洗脫下來並立即28用1mMTris-ClpH9.0中和。將洗脫物4呆存於4。C用於進一步的分析。SDS-PAGE和蛋白印跡分鬥斤SDS-PAGE和蛋白印跡分析基本上分別4安照Laemmli[7]和Towbin[8]的方法實施。筒單而言，在還原性條件下通過SDS-PAGE(NuPAGE4-12%gradientgel，Invitrogen)分離來自IP的;先脫4勿，隨後進行蛋白印跡或凝膠的銀染色。對於蛋白印跡，將分離的蛋白通過100V電泳2h轉移至PVDF月莫(Millipore)上。隨後將月莫用mAb84培養液上清(用1%BSA/PBS/0.1%Tween-201:1稀釋)、抗人PODXL的小鼠mAb或抗人PODXL的羊pAb(200ng/ml，R&Dsystems)隨後用HRP輒合的羊抗鼠或兔抗羊抗體(1:10000稀釋，分別為DAKO和Pierce)進4亍免疫印跡。HRP專厄合的第二抗體的結合通過ECL4企觀'J(AmershamBiosciences)顯影。4艮染色利用SilverQuest4艮染色試劑盒(Invitrogen)4安照生產商的步驟而實施，並手工切割對應於蛋白印跡上條帶的蛋白條帶。l漆縱還j、處差化和蛋冷術席將切割下來的凝膠在洗滌液(2.5mM碳酸氫銨/50%含水乙腈)中4。C浸泡過夜，隨後更換洗滌緩衝液再於37。C孵育20min。隨後將凝月交乾燥並還原和烷基化。簡單而言，將20ju110mMDTT/100mM石友酸氫4妄加至每一個凝力交斑點並於56。C孵育lh。其後，加入20jul55mM石典乙醯胺LAA/100mM碳酸氬銨並於暗處室溫孵育45min。隨後洗滌凝月交斑點並分別在100mM碳酸氫銨和100%乙腈中洗滌兩次。為了蛋白水解，每一個凝膠斑點內的蛋白用改良胰蛋白酶(0.02jug/jul,溶於25mM石灰酸氫銨中，Promega)於37。C才展蕩消化過夜。胰蛋白酶消化後，向樣品中加入1%曱酸和2%曱醇至終體積9/al，用於LCMS/MS分析。將已消化的樣品利用納米級流速(Nano-flow)高效液相色譜(HPLC)系統(LCPackings)分離。將每份9ju1的樣品以25ju1/min注射並;農縮至處於0.1%曱&臾/7&中的Trapcartridge(|uPrecolumn,300jumx5mm，C18PepMap勵，LCPackings)上。洗滌5min後，將液流調為流線型至含10cmC18反相填塞材料(ColumnEngineering)分離4i(內《聖75|um的PicotipEmitter,NewObjective),流速減為100nl/mim。在60min內梯度乂人0發展為60%乙腈/0.1%曱酸。利用柱子遠端的液體連^妻引入2300v的電壓，以在柱子尖端形成噴霧，尖端則指向四極-飛行時間(Qq-tof)混合串聯質譜儀(QSTAR-XL，AppliedBiosystems)的進氣孑L。以InformationDependentAcquisition(IDA)才莫式運4亍質"i普4義，以4甫獲並自動斷裂帶雙電荷和三電荷的聚集離子(massion)。分離最^/[言號8個/sec的選定聚集離子，並用氮氣將其斷裂。所採用的碰撞能量與肽的質量成比例，在分才斤過禾呈中利用Analyst-QS庫欠4牛(AppliedBiosystems)進4亍計算。通過利用MASCOT(MatrixScience)4叟索引擎乂於照UniProt(EBI)蛋白資料庫搜索MS艇S譜圖文件而鑑定蛋白。結果為了製備一組抗未分化hESC上細胞表面標誌物的mAb，在無佐劑的PBS或在MPL+TDM佐劑中，用存活HES-3細月包免疫Balb/C小鼠。共從融合物中分離114個雜交瘤。首次利用流式細胞儀篩選其對HES-3細胞的反應性後，發現一組共10個抗體可結合hESC表面標誌物(圖1)。此外，mAb與HES-3克隆的結合通過免疫細胞化學而確定(圖2)。通過分型，發現其中9個mAb是IgM，而剩餘的一個則為IgM2a(mAb8)。用其他hESC細胞系HES-2和HES-4篩選，發現反應性不仫f又限於免疫原HES-3(表1)。此外，當細胞經-秀導形成擬胚體(EB)後，抗體結合減弱，表明在分化過禾呈中抗原表達下調。對這IO種克隆進行第二次篩選，以確定mAb與其他細胞系的交叉反應性，所述其他細胞系即小鼠飼養細胞(E-MEF)、小鼠胚胎幹細胞(mESC)、人胚胎性癌細胞(EC)和混雜人細胞系(HEK-293、HeLa)(表I)。結果觀察到mAb與小鼠飼養細胞無反應性，而hESC在免疫接種前在小鼠飼養細胞上培養。另外，mAb的反應性(即靶抗原表達)限於hESC細胞系，在所4企測的2種mESC細胞系則未才企測到反應性(除了CS-1上的mAb14)。當我們比專交Tra-l-60、Tra-1-81和SSEA-4與我們的mAb組在人EC細月包上的反應性時，如所預期的，在所衝企測的EC細月包繫上，所有三種抗體(Tra-1-60/81和SSEA-4)均觀察到強反應性。相反，我們的mAb組中大多數與三種EC細月包系中至少2種無反應性或l又有孩i弱反應性。有趣的是，mAb84、95、375、432和529與NTERA、2102Ep或NCCIT無反應性或4又有糹效弱反應性。該結果表明在hESC與EC之間甚至不同的EC細胞系之間抗體譜/表達存在差異。此外，當篩選對其他人類細月包系的抗性時，mAb克隆中的7個(包4舌mAb84、95、14和85)不結合HEK-293或HeLa細月包。然而，對於mAb5和mAb63，與這兩種細胞系的反應性相比hESC有所增加，暗示隨著細胞終末分化出現抗原表達上調。為了進一步表徵mAb組，我們比較了hESC多潛能標誌物Oct-4與該組中IgMmAb所4f"^j"抗原的共表達情況。圖3示出了HES-3細胞系的2色流式細胞分析。從散點圖，超過95%的mAb陽性HES-3細胞對Oct-4卩曰性，表明靶抗原表達與Oct-4表達之間的強相關性。細應毒遂我沐附^,的衷在在對抗體組的篩選過程中，發現相比於與其^也IgMmAb(例如mAb85)—起孵育的細月包，與mAb84—起孵育的HES-3細月包在生存能力方面有顯著增強(圖4,柱1)。才艮據PI排除試-瞼，相比於mAb85,在與mAb84—起孵育(4°C，45min)後<又7%細月包4呆持存活。與mAb84—起卵孚育後，在2種其他hESC細胞系、HES-2和HES-4以及EC細月包系NCCIT(圖4，4主2-4)上也乂見察到了mAb84對hESC的細胞毒性效應，分別存活8%、40%和9%。相反，另一種EC細胞系2102Ep在孵育後保持94%存活(圖4,柱5)。當在相差顯微鏡下觀察細胞時，很明顯，相比與mAb84—起孵育的NTERA和2102Ep細月包或者與mAb85—起孵育的NCCIT細月包，與mAb84—起孵育的HES-3和NCCIT細胞表現出顯著凝集(圖5)。才艮據這些結合和細胞毒性數據，可理解為mAb84的細胞毒性效應依賴於該mAb與細月包系的結合(表I)。mAb只於不結合該mAb的細胞未表現出細胞毒性效應。在時間進禾呈研究中，HES-3細月包與5mgmAb84或mAb85—起孵育，且每隔15分鐘收集一次細胞，用於通過PI排除和臺盼藍排除試-驗進4亍分析(圖6A和B)。在PI^卜除試-驗中，mAb84對HES-3細月包的細月包毒性歲文應快至在與該mAb—起孵育15min後即可7見察到，生存能力降到33%。這些結果通過臺盼藍排除試驗得以確認。有趣的是，才艮據該試-驗，生存能力的下降發生在孵育後15-30min之間，然而，孵育45min後的最鄉冬生存能力也相當於~20%。當mAb84的濃度在0.1-15jug的範圍內逐步增加時，發現mAb84對HES-3細胞的細胞毒性效應呈劑量依賴性(圖6C)。大約ljug(lpmol)的純化mAb84即能夠導致hESC生存能力降到30%以下(即生存能力下降70%)。直至該階段，細胞毒性試驗一直在4。C進行，以將抗原-抗體複合物內化入細胞內的效應降到最低。為了研究溫度對細胞毒性的影響，將hESC與純化和未純化(培養液上清)mAb84在4。C和37°C一起孵育(圖6D)。通過PI排除試驗，發現溫度未影響mAb對hESC的細胞毒性(用未純化mAb84可殺傷75%以上的hESC細胞)。此外，圖7表明在37。C時mAb84也對hESC具有細月包毒性。從散點圖可^見察到對於純化的mAb84和mAb84i咅養液上清，4。C和37°C時mAb84介導的HES-3細力包殺傷不存在差異。此外，在通過蛋白A純化後，mAb84對hESC具有同等細胞毒性(4。C孵育後，純化和未純化mAb84均，見察到77%以上的殺傷)。該結果表明mAb84誘導的對hESC的毒性不是補體介導的，因為在培養基中存在或不存在胎牛血清時，細胞殺傷效率是同等的。之前我們已經7見察到mAb84與hESC的結合在8天大的擬胚體內下調(表1)。為了確定mAb84的細胞毒性是否特異於未分化表型，通過去除培養基中的FGF2或通過EB形成而誘導hESC分化(圖8A)。才艮據多潛能標誌物Tra-l-60的表達評估分化。4敬消FGF2後12天，觀察到hESC的部分分化，相比未分化hESC培養物(〉95%Tm-l-60+ve),細月包群中^f叉49%仍然表達Tra-l-60。通過EB途徑的分化得到〉99。/。Tra-l-60+ve細月包。當來自3種條件的細月包與mAb84一起孵育時，細力包殺傷效率幾乎相當於Tra-l-60+ve細胞的百分比(圖8B)。對於未分化hESC，4又~1%的細月包在與mAb84—起孵育後保持存活。對於FGF2々幾餓的培養物和EB培養物，該百分比分另'J增力口至69%和99%。乂,/z五SCJ:m^M4拔^乾4^的蔞定和-驗證為了鑑定hESC上與mAb84細胞毒性效應有關的靶抗原，實施了免疫沉澱實驗。使細胞總裂解物通過包含蛋白A樹脂和mAb84的PhyTip柱。通過親和相互作用而捕獲的蛋白在蛋白凝膠上分離並用mAb84檢測。根據分子重量標誌物，^r測到〈190kDa的抗原條帶(圖9A,泳道1)。由第二抗體在~25kDa處才全測到的4交j氐條帶已鑑定為還原後的mAb84輕鏈。分離銀染色凝膠上的相應條帶並通過質鐠法進行鑑定。對所獲得的肽進行蛋白資料庫搜索，將該蛋白條帶鑑定為足糖萼蛋白樣蛋白1前體(PCLP1或PODXL;登陸號000592)。PODXL和相應肽匹配的胺基酸序列在圖9B中示出。為了馬全證該抗原靶標是PODXL,重複進行與mAb84的免疫沉澱，並用抗PODXL的市售抗體4會測來自柱子的洗脫物(圖9A;永道2和3)。從蛋白印跡的3個泳道中均檢測到了同等分子量的條帶，從而確認了PODXL的身份。利用RT-PCR，發現在hESC內有兩種PODXL的變異體(變異體1和2的登陸號分別為NP—001018121和000592)發生轉錄(凝:據未示出)。鑑定了mAb84的抗原靶標，我們繼續研究抗PODXL的市售抗體是否對hESC表現出類似的細胞毒性效應。從圖10A和B,很明顯，雖然3種來源的抗體(mAb和pAb)均特異於人PODXL,僅mAb84觀察到了細胞毒性，而兩種商品化來源的抗PODXL抗體則未觀察到。之前已經報導了結合於細胞上抗原(例如細胞上的CD19、20和22)的第一抗體的超高交聯可誘導凋亡[19,20]。由於mAb84是IgM(五聚體)而mAb-PODXL和pAb-PODXL均為IgG(二<介)，我們研究了mAb-PODXL或pAb-PODXL與羊抗鼠(GAM)抗體的超高交聯是否類似mAb84介導的hESC殺傷。將hESC與第一抗體隨後與GAM抗體一起孵育，未能誘導與mAb84類似的細胞毒性效應(圖IOB)。討論鑑定細胞表面抗原對於hESC研究非常重要，因為hESC是一種在分化過程中監測多潛能性和特殊細胞種群發育的非常有價值的工具。此外，因為其為非4曼入性，因此特異於細月包表面抗原的抗常規用來表徵多潛能hESC的幾種這樣的細胞表面抗原是SSEA-3、SSEA-4、Tra-l-60和Tra-l-81。遺憾的是，這些抗原也存在於人EC細胞上，DraperWa/.[21]近期的研究發現分化過程中hESC內這些抗原表達的變化非常類似於人EC細J包。因此，為了更好的理解hESC內自我更新和多潛能性的調節，需要鑑定在hESC上獨特表達的新型細胞表面抗原，其將能夠區分hESC與人EC細胞。在本文描述的研究中，活hESC用於免疫小鼠，首次篩選雜交瘤中結合hESC表面標誌物的mAb後，鑑定出了一組共10個mAb。與SSEA-4和Tra-1-60/81(其與hESC和人EC細月包均強烈反應)不同的是，我冇]的4元體中有5種(mAb84、95、375、432、529)僅與hESC發生強烈反應，而對人EC細胞則為陰性或有孩支弱反應。此夕卜，抗體結合與Oct-4表達相關，且當hESC分化形成EB時結合下調。這些數據強烈支持存在某些獨特存在於未分化hESC上的抗原。而且，當篩查整個組mAb對HlhESC細胞系的抗性時(數據未示出)，我們發現其反應譜類似於HES-2、3和4的反應譜，表明該mAb結合在不同hESC細月包系之間4呆守的4元原。獨特的，mAb84不4又結合hESC，且在15-30min孵育期內即對細胞會有細胞毒性。與其他細胞毒性mAb(其需要活化補體或超高交聯而誘導細胞死亡[20,22])不同的是，mAb84介導的hESC殺傷不依賴於這兩種機制。通過IP和MS分析，我們鑑定足糖萼蛋白樣蛋白1(PODXL)為mAb84在hESC上的耙抗原。PODXL是屬於CD34唾液粘蛋白家族的高度糖基化I型《爭膜蛋白，該家族包4舌CD34和Endoglycan[23,24]。PODXL最初描述為腎小球足細胞上的大唾液蛋白[25],後來發現其在血管內皮細胞和早期造血祖細胞上表達[26,27]。最近，研究顯示PODXL在乳腺癌、肺癌和前列腺癌中是腫瘤侵襲力的指示劑[28-30]。人PODXL定位35於染色體7q32-q33上，編碼528個胺基酸的成熟蛋白[31]。然而，由於PODXL的胞外區利用唾液酸化O連接的糖類而廣泛糖基化以及5個可能的N-連接糖基化，因此PODXL的恰當分子量是160-162kDa[32]。功能方面，已經報導PODXL依賴於其在其中表達的細胞類型而具有極為不同的作用。在足細胞內，PODXL作為抗黏附分子而保持在利用電荷排斥的足細胞足突之間開放的過濾位點[33]。然而，在高內皮樣i靜脈內，PODXL作為黏附分子結合L-選擇素且介導淋巴細胞的圈合與滾動[23]。在hESC中，PODXL在轉錄水平鑑定為在未分化hESC中高表達的基因之一[34，35]。通過EST頻度分析，PODXL的表達水平在第7-8天的EB中下調幾乎2.5倍，在神經外胚層樣細胞和幹細胞樣細胞內分別下調約7和12倍[34]。該結果得到hESC和第8天EB的免疫組化的支持，染色在後者中顯著減弱[36]。在一個獨立研究中，Wei""/.比4交了hESC與mESC的轉錄譜，且觀察到相比於hESC,利用MPSS未能在mESC細胞系E-14中檢測到PODXL的表達[37]。總之，這些關於PODXL在ESC中表達的報導與我們利用流式細胞儀得到的mAb84觀察結果相一致，其中相比於未分化hESC，結合反應性在第8天的EB中有所下降，而在mESC中反應性缺失。同時，在FGF2飢餓的hESC和第22天的EB中mAb84介導的殺傷性下降或缺失可歸因於由於分化引起的PODXL表達下調。然而，儘管已有這些關於PODXL在未分化hESC中表達的報導，其功能尚未闡明。與mAb84結合PODXL後殺傷hESC的機制也4艮吸引人。在Zhang"a/.[38]的淨艮道中，4十對細月包表面受體Porimin(i秀導細月包月莫損傷的前力長亡受體)的IgMmAb，可通過稱為"長亡的過程而i秀導Jurkat糹田月包內的細月包死亡[39]。Porimin例如PODXL是粘蛋白家力矣的成員，因為其在蛋白胞外區上具有多個O-和N-連接的糖基化位點[40]。Jurkat細月包與抗Porimin—起孵育引起懸液中的快速細胞聚集，且在孵育僅20分鐘後即引起75%以上的細胞的膜通透性增加。細胞殺傷也不依賴於補體和溫度。區別於凋亡的是，與mAb—起孵育後未觀察到DNA斷裂或凋亡小體。通過電子顯孩i鏡掃描，發現抗Porimin所處理細胞的膜孔隙、空泡和表面鈹縮增加。將該結果與我們的悽t據進行比H令人吃驚的是mAb84與抗Porimin共有多個類似的細胞殺傷標誌物。此外，我們研究組的初步結果發現mAb84處理的細胞未表現出caspases水平上升(凋亡的特徵)。因此，我們-假設但不限於理i侖mAb84介導的hESC殺傷是由於與月長亡類似的才幾制。將hESC用作分化為體內任何細胞類型的初始材料來源，對於再生醫學具有顯著的優勢。然而，分化後最大的關心之一是在移柏:前消除殘留的未分化hESC，因為這些細胞具有致瘤性。前期工作表明少至2個ESC植入棵鼠體內可引起畸胎瘤的形成，而移植體外分化的ES細胞也未能緩解疾病[41，42]。此外，CookeW"/.報導移才直入hESC的位置影響所形成畸胎瘤的結局。在肝移才直物中，表達多潛能標誌物SSEA-3的未成熟細胞的較大腫瘤佔優勢，而在皮下植入物中則以分化組織的較小腫瘤佔優勢[9]。已經開發了幾種不同的策略以克服該問題。在兩個獨立的研究中，ChungWa/.[8]和FukudaWa/.[43]證實攜帶soxl-GFP才艮告子基因的重組小鼠ESC細胞系可用來通過螢光活化細胞分選(FACS)從ESC中純化soxlVGFP+的分^匕神經前體細胞。移才直純4匕出來的細月包未引起畸胎瘤形成，而移植soxlVGFP+細胞則引起了畸胎瘤形成。在hESC中，Hewitt"a/.設計了在hTert啟動子控制下表達a1，3半乳糖基轉移酶(GalT)的細胞系[44]。未分化hESC將表達GalT,其隨後催化並在細胞表面上提呈cc-gal表位。該表位的存在將使細胞易感於人血清內的循環抗體，引起體外細胞死亡。雖然這些策略取得了成功，但它們均需要生成攜帶可選擇性基因的重組ESC細胞系。相反，我後迅速清除。目前，體內研究正在進行中，以證實mAb處理後由hESC引起的腫瘤形成消失或耗盡。此外，我們還建議將我們組內的幾種其他hESC特異性mAb與mAb84聯合應用，以確保徹底去除在m,總之，本發明是首份關於選擇性結合併殺傷未分化hESC的細月包毒性mAb的淨艮道。可以在細胞移才直前應用mAb84，以消除殘存hESC,從而增加移植的成功率和安全性。參考文獻1.ThomsonJA^Itsfcovitz-邁dorJ,ShqiiroSSetaiEmbryonicstemcdllinesderivedftomhumanblastocysts.Sci咖el卿;282:ll45-1147.2.ReubiaoffBE,P鄉MF,'FongCYetal.:fe^biyoidcst咖cdlUn切fi:啤hom姐blastocysts:soma(io碰erentiatiocLinvitro.Nal3iotecibnol-,2000;18:3效<404.3'..Chamb敏IColbyD,RobatsoaM祐al.Functionalexpr坊咖ac)o血g:ofltoio&'apluripotetiGy.sustainingfectorinembryonicst咖cells.Cell2003;113:643-655,4,MitsiriKjTokuzawaY，ItoltHetal.HiehomeoprotdnN咖gisrequired&r:ma^aianceofpluripotaicyin咖鵬epibkstandES鄰Us,Cell2003;"3:631-642.5.■■KannagiR>CochranNA^IsMgaMFetal.Steg&"Spec迅cembryonicantigens(SSEA-3and-4)areepitopesofauniquegciboseriesgan^Uosideisolatedftomh咖anteratocarciao咖cells,EMBOJ,1983;2:2355-2361.6.AndrewsPW,BantingG，Damj咖vIetal.Threemonoclonalantibodiesdefiningdistinctdifferentiationantigensassociated鄰ithdifferent,hi^hmolecularwei扭tpolypeptideson(hesurfaceofhumanembryonal咖cino邊acells,Hybridoma1984;3:347-361.7.SonYS,Park取KangYKetal.HeatShock70-kDaProtein8Isofoim1isex|iressedonthesiafaceofhumanembryoniostemcellsand.downregulated邵ondifferaitiati(瓜StemCells加05;23:1502-1513,8.ChungS,ShinBS,Hedl加dEetal.GeneticselectionofsoxlGFP-eqaressingneuralprecursorsremovesresidualtumorigenicpluripotentstemcellsandattenuatestumorfotmationaftertransplantation.J^Neurochem,2006;97:1467-1480,9.CookeMJ，StojkovicM,PrzjborskiSA,Gro她ofteratomasderivedfiomhumanpluripot節tstemcellsiinfl卿cedbythegraftsite.StemCellsDev.2006;15:254-259.!0.ChooA3PadmanabhanJT，ChinAetal.immorializedfeed鄉forthesoale~upoflmman咖kyonicstoncellsinfeeder抑dfeeder-fi:eeconditions.J.Biotedhnol.加06;122:13(M41.■11,ChooAB，Padm咖bhanJ>ChinACetal.Expansionofpluripotenthumanembryonicst鵬cellsonhumanfeeders..Biotechnol.Bioeng.2004;88:321-331.12,YiaY,timYK;Salto-Tell抵Metal.AFP(+),ESOderivedcellsengraftanddifferentiateintoh鄰atocyt切invivo.StemCdls2002;20:338-346.13*Doetschm姐T,GreggRG，MaedaNal.TaigettedcoireclionofamutantHPRTgeneinmouseembryonicstemcells.Nature1987;330:576-578,14:OhSKFong^WJ,TeoYetal.Hi扭densityculturesofembryonicstemcells.Biotechnol,Bio加g.2005;91:523-533.15.AndrewsFW，BronsonD3L，BenhamFetal.Acomparativestudyofei-tcelllinesderivedfi:omhumantesticularteratocarcinoma^.Int丄Cancerl卿鄰2砂2肌16..HeinsN,LindahlAKadssonUetal.Clonalderivationandcharacterizationofh咖姐embryonicstemcelllines*J.Biotedmol,2006;122:511-520.17,LaemmliUKCleavageofstructuralp加teins'tiuringtheassemblyoftheheadofbacteriopliageT4.Nature1970;227:咖-685.■18.TcwbiiiH,StaehelinT,GordonJ.Electrophoretictransferofproteins'frompolyacrylamidegelstodtrocelMosesheets:procedureandsomeapplications.卩^(;^汰11厶0348GalanaudPe*aLBcellantigeareceptor-mediatedapoptosis.ImportanceofaccessorymoleculesCD19andCD22,ando《surfaceIgMcross-!iiaking.J,Imm加ol.1995;154:3096-3104.20.ShanD，LedbetterJAPressOW,Apoptosisof邊aUgoanthumanBcellsby狂闢tionofCD20滿咖加clonalantibodies.Bloodl卿;91:1644-1652.21.Dt^erJS,Pigo擾C，ThomscmJAetal.Sutfaceantigensofb咖aneoibryonic'stemcells:changesupond近ereatiationinculture.J,Anat.2002;200:249-258,22.BallED，KadusHnJM，ScihacterBetal.Studiesonthe必ililyofmo加olonalantibodiestoselectivelymediatecomplemeat"d鄰etidaitcytotoxicityofhumanmyebgenousleukemiaMastcells.JJimmmol.1982;128:1476-1481,23.SassettiC，T旭g鄉咖KSingerMSetal.Identificationofpodocalyxin-likeprotdnasahi^iendothelialvetraleligandforL-selectiiuparallelstoCD34.J.Exp.Med19卵;187:1965-197,5.24.SassetiiC,VanZanteRosenSD,Identificationofendo浙can，amemberoftheCD34/podo.calyxinfamiiyofsialomudns-J,Biol.Cii加，2000;275:9001-卯10.25.KeijaschkiD，SharkeyDJ，FarqtiliarMG,Identification旭iicharacterizationofpodooalyxln—majordabproteinoftherenalj^omeralarepithelialcell.J.CellBioL1984;98:1591-1596.26*K^rsha鄰DB,ThomasPE，Wharr咖BLetal.Molecularcloning,expressioDjandcharactorizatiottofpodocalyxin-likeprotein1ftomrabbitasatransmembraneproteinofglomerularpodocytesandvasculareiidotheli咖.J.BioLChem.1柳;270:29439-29446.27.DoyoimasP、，Nielsen*TS,ChelHahSetalodocalyxiaisaCD34-relatedmarkerofmurinehetmtopoieticstemcellsandembiyonicetythroidcells.Blood2005;105:417(H178,28.CaseyG,NevillePJ,liuXetal.Podocalyxinvariantsandriskofprostatec咖erandtumor;aggressiveaess.H咖.Mol,G加汰2006;15:735-741.29,Ch姐&扭g^nsJ，CheungSTetNovel成do也elialcellmarkersinhe|)aloceiyarcarcinoma.ModPa也ol,2004;17:11訴'1210.■30.SomasiriA/Niels姐JS，MakretsovNe*al.Ov^xpressionoftheaati-adhesinpodocalyxiiiisanindepeod幼tjxredictarofbreast'cancerprogresskm,Canc級Res.2004;64:5068-5073.31.KeraihaivDB，"WigginsJE，WharrametAssigomeiitoffhlramanpodocalydtt孤eprotein(PODXL)geneto7q32>q33,<3eatonic&諸;45:239-240.32.DB，BeclcSG,WharraraBLetal，Molecularcloningandcliaracterizatkmofhran姐podocalyxia-l汰eprotein.OrihologousrelationsMptorabbitPCLP1andratpodocalyxin.J.Biol.Chein,麗;272:15708-織4,33.TakedaT，GoWY，OrlandoRAetaLExpressionofpodocalyxininhibitscell-celladiiesionandmodifiesj加ctionalpropertiesinMadin-DarbycanineMdneycells.Mol,Biol.Cell2000;11:3219-3232.34.Biandenbergei:WeiH，ZhangSetal."Transcriptome'dharacterizaticmelucidatessigoaKngnetworksthatcontrolhomanEScellgrowtiianddifferentiatioiLNat3iotechnoL2004;22:707-716.35.CdJ，ChenJ，LiuYetal.Assessingself-renewal'加ddifferentiationinhumanembryonicstemcelllines.StemCells2006;24:516-530,36..CaiJ，OlsonJM,RaoMSetal.Developmentofantibodiestohumanembryonicstemcellantigens.BMC.Dev.Biol,2005;5:26..37.WeiCL,MumT，RobsonP'etal.Transcripto咖profilingofhumanandmurineBSCsidentifiesdivergentpaflisrequiredtomaintainthestemcellstate.StemCells2005;23:166485,4238,ZhangC，XuY，GuJfetal.AcellsurfacerecQ)t(WdefinedbyamAbmediatesauniquetypeofcelldeafhsimilartooncosis.Proc皿AcaiSci'U.S.A1卿;妙62飼295.■39.Maj加'G，JorisI.Ap鄰tosis，oncosis,.姐d.加crosis^.Anoverviewofcell40.MaF，ZhangC,PrasadKVetal.MolecularcloningofPorimin^anovelcellsurfacereceptormediatingoncotic.celldeatkP100.NatlAca4lSdLU.SjV2001;卯:9778-卿，41.HatkanyT，AndangMKingmaHJetal,Regkm鄰ecificgenerationoffbnctionalneuronsfromnaiveembryonicstemcellsin'adultbrain.JT.N鎖diem.2004;88:1229-1239,42.Lawr咖B,SchillerH,WillboldBetal,扭剎ysensitivebiosafetymodelforst卦cell-derivedgrafts.Cytotherapy.2004;6:212-222.43*FukudaH，T^kahashiJ,WatanabeKetal...Fluorescence-activatedcellsorting-basedpurificationofembryomcstemcell-derivedneuralprecursorsavertstuiaorfo血ationaftertransplantation,Ste邁Cells2006;24:763-771.44.HewittZ，PriddleTho加sonAetal.Ablationof^mdiffea:etttiatedhumanembiyonicstemcells:exploitinginnateinmmnityagainstflieGal{alpha}1-3Gal{beta)l-4GlcNAc-R({alplm}-gal)epitope.StemCells加06;2005-048i.tableseeoriginaldocumentpage44權利要求1.一種鑑定可能包含未分化人胚胎幹細胞的樣品中的所述未分化人胚胎幹細胞的方法，所述方法包括鑑定所述樣品中表達其表面上的足糖萼蛋白樣蛋白(PODXL)的細胞。2.—種從包含未分化人胚胎幹細胞的樣品中分離所述未分化人胚胎幹細胞的方法，所述方法包括分離所述樣品內表達其表面上的PODXL的細月包。3.—種/人包含未分化人胚胎幹細力包的樣品中去除所述未分化人胚胎幹細胞的方法，所述方法包括從所述樣品中去除表達其表面上的PODXL的細月包。4.一種^5皮壞包含未分化人胚胎幹細胞的樣品中的所述未分化人胚胎幹細胞的方法，所述方法包括-皮壞樣品內表達其表面上的PODXL的細月包。5.根據權利要求1至4中任何一項所述的方法，其中所述樣品是來自人胚胎的樣品或是人胚胎組織。6.根據權利要求1至4中任何一項所述的方法，其中所述樣品是體外培養的樣品。7.根據權利要求3或4所述的方法，其中所述樣品中的未分化人胚胎幹細胞經促進而分化為特定細胞譜系，且所述樣品包含源自未分化人胚胎幹細胞的分化細胞。8.根據權利要求1至3中任何一項所述的方法，其中所述樣品與結合PODXL的結合部分接觸，且所述人胚胎幹細胞通過與所述結合部分結合而在所述樣品中4皮鑑定或乂人所述樣品中分離或去除。9.根據權利要求8所述的方法，其中所述結合部分是抗體。10.根據權利要求8或9所述的方法，其中所述結合部分被固定於固體載體。11.根據權利要求8或9所述的方法，其中所述結合部分被可檢測地標記或所述結合部分能夠被檢測。12.根據權利要求11所述的方法，其中所述標記物有利於所述細月包的^r測。13.根據權利要求4所述的方法，其中所述未分化人胚胎幹細胞通過結合於結合PODXL的結合部分而被破壞。14.根據權利要求13所述的方法，其中所述結合部分是抗體。15.才艮據片又利要求14所述的方法，其中所述結合部分進一步包括細月包毒性部分。16.結合PODXL的部分在鑑定包含未分化人胚胎幹細胞的樣品中的所述未分化人胚胎幹細胞中的應用。17.結合PODXL的部分在從包含未分化人胚胎幹細胞的樣品中分離所述未分化人胚胎千細胞中的應用。18.結合PODXL的部分在從包含未分化人胚胎幹細胞的樣品中去除所述未分化人胚胎幹細胞中的應用。19.結合PODXL的基團在破壞包含未分化人胚胎幹細胞的樣品中的所述未分化人胚胎幹細胞中的應用。20.根據權利要求16至19中任何一項所述的應用，其中所述結合部分是抗體。21.—種結合PODXL的部分，進一步包含可檢測的標記。22.—種結合PODXL的部分，進一步包含細胞毒性部分。23.根據權利要求21或22所述的部分是抗體。24.—種多組分試劑盒，包含結合PODXL的部分以及才企測另一種人胚胎幹細胞標誌物的另外試劑。25.4艮據權利要求24所述的多組分試劑盒，其中所述另一種人胚月臺幹細月包標記物是Oct4、SSEA-4、Tra畫l畫60、Tra-1國81和GCTM-2中的4壬4可一種。26.才艮據4又利要求25所述的多組分試劑盒，其中所述另一種人胚月臺幹細月包標i己物進一步包4舌mAb5、mAb8、mAb14、mAb63、mAb84、mAb85、mAb95、mAb375、mAb432和mAb529中的^f壬何一種。27.—種通過^又利要求2所述方法分離的未分化人胚胎幹細胞。28.—種分離的表達其表面上的PODXL的未分化人胚胎幹細胞。29.—種包含分化細胞的組合物，但其已經耗盡了通過權利要求7所述方法得到的未分化人胚胎幹細胞。30.—種包含從未分化人胚胎幹細胞分化而來的細胞的組合物，所述組合物基本不包含表達其表面上的PODXL的未分化人胚胎幹細胞。31.—種治療需要細月包療法的患者的方法，所述方法包括糹會予所述患者根據權利要求27或28所述的細胞或者根據權利要求29或30所述的組合物。32.根據權利要求27或28所述的細胞或者根據權利要求29或30所述組合物在製造治療需要細胞療法的患者的藥劑中的應用。33.—種製備未分化人胚胎幹細力包的藥物組合物的方法，所述方法包括實施權利要求2所述的方法或提供權利要求28所述的細月包，以及^l尋如此分離的細月包併入藥物組合物中。34.—種製備包含分化細胞但已經耗盡了未分化人胚胎幹細胞的藥物組合物的方法，所述方法包括實施糹又利要求7所述的方法或提供權利要求29所述的組合物，以及將所述細胞的組合物併入藥物《且合物中。35.—種抗-PODXL的抗體，包含胺基酸序列i)至iii)或胺基酸序列iv)至vi)或優選包含胺基酸序列i)至vi):S雄SYNYMY(SEQIDNO:2)i0DTSNLAS(SBQS>NO:3)蹄QQ，SWYT(,IDNO:4》的NYmm(犯QIDNO:5)ERA(SBQ1DN0:7)或其變異體，其中所述序列i)至Vi)的一個或多個中的一個或兩個或三個胺基酸被另一種胺基酸取代。36.根據權利要求35所述的抗體，具有至少一個併入下列CDR的車聖《連可變區Omi:SASISSVNYMY《SEQ10恥:2)OD勝鵬NLAS卿ID脆3》37.根據權利要求36所述的抗體，具有至少一個包含圖11中所列出的胺基酸序列(SEQIDNO:8)的輕《連可變區。38.根據權利要求35所述的抗體，具有至少一個併入下列CDR的重鏈可變區CDB1:NYWMN(SEQNO:5)ODE2:EIIOLKSNHYMHY細YKG(SEQ1B微6)CDB3:BRA(犯QIDNO:7)或其變異體，其中所述序列i)至vi)的一個或多個中的一個或兩個或三個胺基酸^皮另一種胺基酸耳又^。39.根據權利要求38所述的抗體，具有至少一個包含圖12中所列出的胺基酸序列(SEQIDNO:IO)的重鏈可變區。40.根據權利要求35所述的抗體，具有至少一個根據權利要求36或37所述的輕鏈可變區以及至少一個4艮據4又利要求38或39所述的重鏈可變區。41.一種選擇性地結合PODXL表位的抗體，其中所述表位已由具有至少一個才艮據斥又利要求37所述的輕《連可變區和至少一個才艮據一又利要求39所述的重鏈可變區的抗體結合。42.—種編碼才艮據片又利要求35至41中任何一項所述的抗體的多核苷酸，或一種包含本文中的Vh或VL鏈的分子。43.—種包含才艮據片又利要求42所述多核苷酸的宿主細月包。44.根據權利要求9或14中任何一項所述的方法或者根據權利要求20或23所述的應用，其中所述抗體是片又利要求35至41中4壬一項所述的抗體。全文摘要本發明涉及一種鑑定樣品中未分化人胚胎幹細胞的方法，樣品可能包含這種細胞，該方法包括鑑定樣品內表達其表面上的足糖萼蛋白樣蛋白(PODXL)的細胞。本發明還涉及一種從包含未分化人胚胎幹細胞樣品中分離這種細胞的方法，該方法包括分離樣品內表達其表面上的PODXL的細胞。通常，所述方法利用結合PODXL的抗體。利用所述方法分離的未分化人胚胎幹細胞在細胞療法中可以是非常有利的。此外，特別的，本發明還提供從人胚胎幹細胞分化而來的細胞的組合物，但該組合物已經耗盡了未分化人胚胎幹細胞，該組合物在細胞療法中非常有利。文檔編號C12N5/0735GK101454441SQ200780008235公開日2009年6月10日申請日期2007年3月6日優先權日2006年3月6日發明者徐文華申請人:新加坡科技研究局