人胚胎幹細胞衍生的造血細胞的製作方法

2023-05-16 05:11:36 2

專利名稱：人胚胎幹細胞衍生的造血細胞的製作方法
技術領域：
本發明一般涉及細胞生物學、胚胎幹細胞和細胞分化。更具體的，本發明提供了具有造血能力、用於藥物開發和移植治療的分化細胞。
相關申請的引用本申請要求2001年12月7日提交的美國臨時申請號60/338,979的優先權。在先申請在此完整引入以供參考。
背景白血病是具有嚴重預後的造血細胞癌症。美國白血病協會估計在1998年，美國有28700人被診斷出白血病。最近10年來，在用異體或自身造血幹細胞聯合放療或化療治療白血病上取得了很大的進展。自身移植也用於治療晚期乳癌、卵巢癌和前列腺癌。幹細胞移植目前正在臨床測試中測試其對嚴重的、有生命危險的自身免疫疾病的治療作用。
不幸的是，常常不能得到合適的造血幹細胞用於治療這些病況。另一供體的異體細胞匹配困難，因而導致需要開發自身移植物，該移植物的治療細胞衍生自病人自身的骨髓。自身供給需要時間，來準備用於移植的足夠的細胞，常常有癌細胞通過施用的細胞重新引入病人的危險。
進行了大量的研究，來確定存在於人血和骨髓中，據信不斷補充了對造血系統幹細胞特徵的了解。Gunsilius等(Biomed.Pharmacother.55186，2001)提供了一個綜覽。美國專利5,750,397報導了人造血幹細胞的培養物為CD34陽性，能從人骨髓樣品中產生、增殖和分化。美國專利5,192,553報導了胎兒和血液新生幹祖細胞的分離。美國專利5,635,386報導了調節人造血細胞培養物中特定細胞系的方法。歐洲專利出版號EP 455,482A3報導了一個缺乏CD38但表達CD34的人祖細胞亞組。
Vaziri等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 919857，1994)報導了由於人造血幹細胞老化引起的端粒DNA喪失。Chiu等(Geron Corporation；Stem Cells14239，1996)描述了來自成人骨髓的造血祖細胞中端粒酶活性的差異表達。Gaffney等(Blood 911662，1998)報導了Flt-3配體和骨髓基質衍生的因子對原代人CD34陽性骨髓祖細胞的影響。Koller等(J.Hematother.5449，1995)比較了Flt-3配體與c-kit作為體外造血細胞擴展的刺激劑。
Bhatia等(Proc.Natl.Acad.Sci.945320，1997)報導了能再次增加免疫缺陷小鼠的原始人造血細胞。Bhatia等(Nature Med.41038，1998)報導了一類具有SCID再增活力的人造血細胞。Gallacher等(Blood 961，2000)報導了新循環性人胚胎血幹細胞的分離。國際專利出版物WO 99/23205報導了一群基本均質的、CD34陰性和Lin陰性的人造血幹細胞。Karanu等(J.Exp.Med.1921365，2000)報導了作為造血幹細胞生長因子的Motch配體Jagged-1。Bhatia等(J.Exp.Med.1891139，1999)報導了骨形態發生蛋白調節人造血幹細胞的發育過程。Karanu等(Blood 971960，2001)報導了Delta-2和Delta-4的功能是原始人造血細胞的有絲分裂調節劑。Bhardwaj等(Nature Immunol 2172，2001)報導了音速刺蝟(sonic hedgehog)因子能誘導人造血細胞增殖。
已鑑別了人骨髓和臍帶血的重要造血祖細胞，並發現了體外操縱它們的有效方法。但是這些細胞在整個捐贈的人細胞群僅佔很低的百分數仍然是一個問題。
另一種來源是早期胚胎組織分離的多能細胞。最近已開發了，用於分離和培養人ES細胞的技術(Thomson等，Science 282114，1998；美國專利號6,090,622和6,200,806)。國際專利出版物WO 99/20741和WO 01/51616(Geron Corp.)提供了無飼養細胞培養物中靈長類衍生的原幹細胞培養方法和材料，這種培養方便製備這些細胞及其衍生物，用於人的治療。
Li等(Blood 1598，2001)；美國專利6,280,718(Wisconsin)和Kaufman等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9810716，2001b)報導了使人多能幹細胞分化成造血品系的細胞的最初嘗試。必須與小鼠骨髓細胞或卵黃囊內皮細胞一起共同培養，從而產生具有造血細胞標記的細胞。
為了使得胚胎幹細胞衍生的造血細胞能夠進入商用，需要開發新的方法，該方法不需要與基質細胞共同培養，從而提供了與來自骨髓的細胞相比顯著改善的產率。
發明概述本發明提供一種有效生產靈長動物細胞的系統，所述細胞是由多能細胞分化成的造血細胞譜系的細胞。本文描述了相當富含造血祖細胞的細胞群。而造血祖細胞又可以分化成紅細胞系、粒細胞系、單核細胞系、巨核細胞系和淋巴細胞系細胞集落。本公開內容中描述的組合物、方法和技術具有各種應用前景，包括藥物篩選和各種臨床治療形式。
本發明的實施方式之一是一群在培養物中增殖，具有一定的造血細胞特徵的細胞。細胞群是通過分化靈長動物多能幹細胞(pPS)獲得的，示範性的pPS細胞是人胚胎幹細胞建立的細胞系。包括其中至少1％細胞是CD45陽性的，具有其它下列造血細胞的特徵性標記，並具有少部分未分化的pPS細胞。細胞群可以高接種效率在對造血細胞集落形成單位(CFU)甲基-纖維素試驗形成集落，從而當重新在第二個CFU試驗中接種時，形成次生集落。當注射到NOD-SCID小鼠中時，細胞可形成循環性紅細胞、粒細胞、單核細胞、巨核細胞或淋巴樣細胞。包括基因改造過，表達異源的用於基因治療，或延長細胞複製能力的基因的細胞。
本發明的另一個實施方式是一群人造血細胞，具有本文公開所述的至少一種特徵，例如至少20％細胞可表達內源基因產生的CD34；至少約2％細胞可表達內源基因產生的CD45；或其中細胞以高接種效率在CFU實驗中形成集落。這包括用任何方法製備得到的人細胞組合物，但不限於人多能幹細胞分化，或任何其它不涉及用特異性抗體(例如抗-CD34抗體)或其等價物細胞分離的方法。
本發明的另一個實施方式是一種通過分化pPS細胞製備造血細胞的方法。例如，可從無飼養細胞培養物收集pPS細胞，然後通過形成胚狀體(embryoid body)或其它方法引發分化途徑。然後可將引發的細胞與造血細胞生長因子的混合物一起培養，從而獲得在CFU實驗中形成集落的細胞。造血細胞生長因子的混合物可包含下列造血細胞分化因子的一種或多種幹細胞因子(SCF)、FLT-3配體、IL-3、IL-6、G-CSF、音速刺蝟(sonic hedgehog)或其它本公開列出的細胞因子，還可能與骨形態發生蛋白，例如BMP-4聯合。通常不需要與外源基質細胞或任何含有不同基因組的細胞共培育。可用該方法產生造血細胞祖細胞，或成熟的造血細胞，例如紅細胞樣細胞、粒細胞、單核細胞、巨核細胞或淋巴樣細胞。
本發明的另一個實施方式是一種篩選能調節造血細胞功能的化合物的方法。將該化合物與本發明的細胞群混合，並監測所致的細胞群中細胞的任何表型或代謝上的改變。
本發明還提供了一種可誘導免疫耐受的系統。給予病人衍生自多能(pPS)細胞的端粒化細胞群，可賦予病人對第二種細胞群的免疫耐受性，從而使缺陷組織功能再生。示範性的hPS細胞是人胚胎幹(hES)細胞或其等價物，例如可以從人胚泡獲得的細胞。第一種細胞群一般是與第二種細胞群MHC相容的，可能衍生自同樣的hPS細胞系。該方法可用於提高組織，例如肝細胞、神經元、少突神經膠質細胞和其它神經膠質細胞、心肌細胞、成骨細胞、間充質細胞、造血細胞、激素分泌性細胞，如胰島細胞和軟骨細胞的移植效率。
將在下面的描述中進一步闡明本發明的這些和其它實施方式。


圖1顯示了未分化人胚胎幹細胞的流式細胞計數分析。門控用活力(7AAD陰性；欄i)和大小(ii)選揀，然後篩揀未分化ES細胞群中的造血細胞表面標記(iii-vi)的表達。這些細胞都不表達人造血細胞標記CD45，僅1.2％是CD34陽性的(原始人造血細胞的一種標記)。
圖2顯示了通過分化hES細胞的H系獲得的造血細胞的流式細胞計數分析。通過將hES細胞條帶在含有20％FBS的培養基中培養成聚集體10天，引發分化。然後在含有造血細胞生長因子(HGF，是SCF，Flt-3配體、IL-3、IL-6和G-CSF)，含有或不含骨形態發生蛋白4(BMP-4)的無血清培養基(SF)中培養細胞。CD45標記可鑑定造血細胞祖細胞。
圖3是流程圖，其中hES細胞的H1品系分化成造血細胞祖細胞。在含FCS的培養基中分化後，在集落形成(CFU)實驗中，將整個培養物(左)或單個胚狀體(右)置於含幹細胞因子、GM-CSF、IL-3和EPO的甲基纖維素中。用流式細胞計數確定形成的集落的造血細胞表型，並在第二次CFU實驗中傳代。
圖4顯示了根據圖3左側流程圖從整個胚狀體培養物獲得的造血細胞。當分析整個CFU實驗(A)時，有83-86％為CD45染色，肯定了造血細胞的存在。B欄顯示了形態學評估結果。20,000個輸入細胞形成了47個集落，接種效率為1/425。C欄顯示的集落是挑出用於標記分析的，其中81-92％的細胞是CD45陽性，73％是CD13陽性。
圖5顯示了根據圖3右側的流程從分離的胚狀體形成的造血細胞。在CFU實驗中鑑定了紅細胞樣、粒細胞和巨噬細胞的集落。用流式細胞計數分析兩個紅細胞集落，發現其中93％是血型糖蛋白陽性。
圖6顯示了當從圖3所示的CFU實驗挑選兩個集落，在第二次CFU實驗中再接種的情況。A欄顯示了自含有82,500個細胞的原代粒細胞集落衍生出的不同次生集落(下文顯示了每個集落類型的數目)。此次生集落具有粒細胞、巨噬細胞、紅細胞樣細胞和GEMM集落(造血細胞類型的混合物)的特徵。具有高水平的CD45和CD13表達，但CD34和CD14水平低。將另一個原代粒細胞集落(12,500個細胞)在次生CFU實驗(B欄)中傳代，並形成14個集落，都具有單核細胞特徵。
圖7顯示了臍帶血單核細胞(CBMC)和未分化hES細胞系H1、H7和H9上主要組織相容性複合物(MHC)I類和II類的表達。灰線表示MHC染色；實線表示抗體對照。未分化的hES細胞是MHC I類陽性，但不是MHC II類陽性-即使用幹擾素γ處理過(插入)。
圖8顯示了混合的淋巴細胞反應中未分化hES細胞的效果。在A欄，hES細胞不能刺激異體移植的外周血或臍帶血單核細胞增殖。B欄中，全部三種hES細胞都不能刺激增殖，即使之前通過單核細胞耗竭富集過相應T細胞群。在C欄，通過與IFN-γ一起培養，提高MHC I類表達製備hES細胞，但仍然不能刺激T細胞的增殖。
圖9顯示hES細胞還能抑制第三方的抗原遞呈細胞刺激的混合淋巴細胞反應。在A欄，當用異體移植的樹突狀細胞(DC)刺激T細胞時，觀察到劇烈的增殖應答。在培養物中加入人成纖維細胞影響很小，但加入未分化的hES細胞即消除了該反應。在B欄，顯示抑制效果依賴於MLR中存在的hES細胞數量。少至3×104hES細胞即能顯著抑制該反應。
圖10顯示了將細胞注射到免疫缺陷型Prk-/-SCID小鼠中所產生的應答。MBA-1基質細胞和胎兒單核細胞都能夠誘導粒細胞滲透應答，但未分化的hES細胞沒有觀察到任何效果。
圖11顯示了將細胞注射入野生型CD-1小鼠產生的應答。注射僅含內毒素的PBS在注射位點引起了淋巴細胞和粒細胞滲出。然而，注射載體和hES細胞完全消除了白細胞浸潤(右)，而MBA-1細胞不能抑制浸潤(插入)。未分化的hES細胞在這種情況下明顯不能誘導排斥反應，而且防止注射位點的宿主細胞浸潤，顯示了抑制炎症的能力。
圖12顯示了在形成胚狀體後，翌日在細胞因子和/或BMP-4中培養hPS細胞獲得的造血細胞的表型和功能特徵。細胞因子提高了總的細胞產率，並且相當大的提高了CD45陽性細胞和產生CFU的細胞的比例。
圖13顯示了次生CFU的結果，強調了在最初分化過程中BMP-4的重要性。用BMP-4(和或不和細胞因子)製備的造血細胞產生高比例的次生集落。這證明在BMP-4存在下，分化性hES細胞產生具有可觀自身更新能力的造血祖細胞。
圖14顯示了一種在分化過程中跟蹤細胞表型和功能的動力學方案的結果。第15天出現CD45陽性細胞，在第22天有更大的增加。第15天時產生集落的能力很高，而在第22日該能力的增加不顯著。在這些情況下，前15天代表了指導造血細胞分化的細胞因子和BMP的關鍵窗口。
發明詳述本發明解決了如何從多能幹細胞進行有效分化，產生大量人造血細胞的問題。
已發現人胚胎幹細胞可以以非特異性方式引發分化，然後在分化因子的混合物中培養引發的細胞，誘導沿造血細胞分化途徑分化。不同的生長因子組合能有效促進造血細胞分化。特別有效的組合包括幹細胞因子(SCF)、Flt-3配體、IL-3、IL-6和G-CSF。在該混合物中培養一段合適的時間，可產生可觀富集的造血前體細胞群，其中各種造血細胞譜系是多能的，並且在培養物中活躍增殖。該造血前體細胞可以通過與SCF、GM-SCF、IL-3和促紅細胞生成因子一起培養，沿著骨髓分化途徑下遊進一步分化。
與Kaufman等(見上)報導的不同，本文的公開內容認為在進行上述細胞的衍生中，與基質細胞共培養並不是必需的。
相反，用本文公開的技術，可以產生造血細胞表型相當富集的分化細胞群。通過在分化混合物中同時加入細胞因子和骨形態發生蛋白4(BMP-4)，獲得了含有8％CD45陽性細胞(多能造血細胞標記)和22％CD34陽性細胞(原始造血祖細胞標記)的細胞群。值得注意的是，5％以上的細胞同時是CD45和CD34陽性的。CD45標記的存在與CFU試驗中測定的活性集落形成細胞相關聯。胚胎幹細胞衍生的造血細胞以非常高的接種效率產生集落。
該發現是重要的，因為它提供了看來比任何目前的來源，包括外周血、成年人骨髓或甚至臍帶血，可獲得的造血祖細胞都要多的造血細胞群。用細胞因子分化的起始的1×105hES細胞群得到至少約137個造血祖細胞，與人臍帶血(182)或外周血中活動的骨髓祖細胞(249)相當。由於人胚胎幹細胞可導致無限增殖，本發明提供了一種可產生不限量的造血祖細胞-和定型成為造血細胞亞型之一的子代，或分化成成熟的紅血細胞或白細胞的系統。
下面的公開內容提供了關於生產和測試本發明的造血細胞的信息。還提供了有關這些細胞如何用於研究、藥物開發和治療管理血液相關異常的說明。
定義就本發明的目的而言，除非另外說明，術語「造血細胞」指任何來自造血細胞途徑的細胞。這些細胞表達包括造血祖細胞、定型的能複製或形成集落的細胞、以及完全分化的細胞的造血細胞譜系特有的一些已接受的形態學特徵和表型標記(下文例證)。
「造血祖細胞」、「造血前體細胞」或「造血幹細胞」是能夠產生完全分化的造血細胞和具有自我更新的能力的細胞。典型的，它在體外單獨培養不能產生胚胎胚層子代，除非以某些形式分化或重新程序化過。
就細胞個體發育而言，形容詞「分化的」是相對而言的。與對照細胞相比，術語「分化細胞」是進展到發育路徑下遊的細胞。因此，多能胚胎幹細胞可分化成譜系限制的前體細胞，例如多能造血祖細胞，它能形成紅細胞樣細胞、粒細胞、單核細胞、巨核細胞和淋巴樣細胞系之一的細胞。這些祖細胞還可以進一步分化成自我更新性的細胞，定型形成這四種造血細胞系之一的細胞。這些細胞進而可以進一步分化成終末的分化細胞，發揮其特徵性作用，可能或可能不保留進一步的增殖能力。紅細胞樣細胞、單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、血小板、以及淋巴細胞是終末分化的細胞的例子。
「分化劑」在本文中指化合物集合中的一種，用於本發明培養系統產生屬於造血細胞系的分化細胞(包括前體細胞和終末分化細胞)的化合物。對該化合物的作用方式沒有限定。例如，所述分化劑輔助分化的過程可以是通過誘導或輔助表型改變、促進具有特定表型的細胞生長或抑制其它細胞的生長，或與其它分化劑通過未知的機制協同作用。
原型「靈長動物多能幹細胞」(pPS細胞)是來自受精後任何時間的胚前、胚胎或胎兒組織的多能細胞，其特徵是能夠在合適的條件下產生數種不同細胞類型的子代，它們來自全部三個胚層(內胚層、中胚層、外胚層)的，這可根據標準試驗例如在8-12周齡SCID小鼠內形成畸胎瘤的能力來確定。該術語包括各種類型的已建立的幹細胞系和根據上述方式獲自多能原代組織的細胞。
pPS細胞的定義包括各種類型的胚胎細胞，例如人胚胎幹細胞(hES)，見Thomson等(Science 2821145，1998)；其它靈長動物的胚胎幹細胞，例如恆河猴幹細胞(Thomson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 927844，1995)，絨猴幹細胞(Thomson等，Biol.Reprod.55254，1996)和人胚胎生殖(hEG)細胞(Shamblott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9513726，1998)。該術語還包括其它類型的多能細胞。包括能產生所有三個生發層的衍生物、子代的任何靈長動物細胞，不論它們是來自胚胎組織、胎兒組織還是其它來源。pPS細胞最好不要來自惡性來源。通常希望(但非必須)此類細胞核型正常。
當細胞群中大部分幹細胞及其後代衍生物顯示明顯區別於胚胎或成人的分化細胞的未分化細胞形態特徵時，就稱pPS細胞培養物為「未分化的」。本領域技術人員很容易識別未分化pPS細胞，一般在二維顯微鏡下表現為具有高核/胞質比和明顯核仁的細胞集落。應理解的是，細胞群內非未分化細胞的集落通常被臨近的分化細胞所包圍。
「飼養細胞」指一種類型的細胞，當與另一種類型的細胞共培養時，可為第二種類型的細胞提供可生長環境。某些類型的pPS細胞可用原代小鼠胚胎成纖維細胞，無限增殖的小鼠胚胎成纖維細胞或分化自hES細胞的人成纖維細胞樣細胞來支持。如果pPS分裂後細胞已生長了至少一個周期，期間沒有加新鮮飼養細胞來支持其生長，則稱pPS細胞群為「基本無」飼養細胞。
術語「胚狀體」與「聚集體」同義，指已分化和未分化細胞的聚集體，出現在pPS細胞在單層培養物中過度生長或懸浮培養中維持。胚狀體是不同細胞類型(通常源自不同胚層)的混合物，可根據形態學標準區別和可用免疫細胞化學方法檢測細胞標記。
「生長環境」指感興趣的細胞增殖、分化或成熟的體外環境。此類環境的特徵包括培養細胞的培養基，可能存在的任何生長因子或分化誘導因子，以及可能存在的支持結構(例如固體表面上的基質)。
當用任一合適的人工手段將一段聚核苷酸轉移到某細胞內，或該細胞是遺傳了多核苷酸的原來改變的細胞的後代時，則稱細胞為「遺傳改變的」或「轉染的」細胞，或「遺傳轉化的」細胞。多核苷酸通常包含編碼感興趣的蛋白質的可轉錄序列，使細胞能在提高的水平上表達蛋白質。如果改變的細胞的子代有相同的變化，則稱遺傳改變為「可遺傳的」。
通用技術分子遺傳學和基因工程中的通用方法可參見「Molecular CloningA laboratoryManual」(Sambrook等，Cold Spring Harbor)；「Gene Transfer Vectors for MammalianCells」(Miller Calos編)和「Current Protocols in Molecular Biology」(F.M.Ausubel等，Wiley Sons)。細胞生物學、蛋白質化學和抗體技術可參見「Current Protocolsin Protein Sceince」(J.E.Colligan等，Wiley Sons)；「Current Protocols in CellBiology」(J.S.Bonifacino等，Wiley Sons)和「Current Protocols in Immunology」(J.E.Colligan等，Wiley Sons)。試劑、克隆載體和基因操作所用的試劑盒可向例如BioRad、Stratagene、Invitrogen、ClonTeck和Sigma-Aldrich Co.等廠商購買。
細胞培養方法可參見最新版的「Culture of Animal CellsA Manual of BasicTechnique」(R.I.Freshney編，Wiley Sons)；General Techniques of CellCulture(M.A.Harrison I.F.Rae.，Cambridge Univ.Press)和「Embryonic StemCellsMethods and Protocols」(K.Turksen等，Humana Press)。組織培養物和試劑可向Gibco/BRL、Nalgene-Nunc International，Sigma Chemical Co.和ICNBiomedicals等廠商購買。
與本公開有關的具體文獻包括Blood Cell Biochemistry，Plenum Pub.Corp.和Kluwer Academic Publishers；M.R.Koller B.Palsson編，PrimaryHematopoietic Cells(Human Cell Culture，Vol.4)，Kluwar Academic Publishers，1999；Molecular Biology of Hematopoiesis and Treatment of MyeloproliferativeDisease第11次研討會，Bormio，1998年6月(Acta Haematologica 101/2)，N.G.Abraham等編，S.Karger Publishing，1999；The Essential Dracula，B.Stoker，L.Wolf C.Bing，Penguin Putnam，1993；和HematopoiesisA DevelopmentalApproach，L.I.Zon編，第一版，Oxford University Press，2001。
幹細胞來源本發明可用各種幹細胞來實施。其中，適用於本發明的有妊娠後形成組織的靈長動物多能幹細胞(pPS)，或妊娠期任何時間的胚泡或胚胎組織。非限定性例子是胚胎幹細胞或胚胎生殖細胞的原代培養物或已建立的細胞系，詳見後文。
本發明也以直接用原代胚胎或胎兒組織來實施，即直接由能夠產生造血細胞的原代細胞衍生獲得造血細胞，而無需先建立未分化細胞系。在一些情況下，本發明的幾個方面可以用臍帶血、胎盤或一些成年組織的多能細胞來產生。
胚胎幹細胞胚胎幹細胞可自靈長動物的胚泡分離獲得(美國專利5,843,780；Thomson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 927844，1995)。人胚胎幹細胞(hES)可由人胚泡細胞製得，方法參見Thomson等(美國專利6,200,806；Science 2821145，1998；Curr.Top.Dev.Biol.，38133ff，1998)和Reubinoff等，Nature Biotch.18399，2000)。與hES相當的細胞包括它們的多能衍生物，例如原始外胚層樣(EPL)細胞，參見WO01/51610(Bresagen)。
hES細胞可由人植入前胚胎製備。或者，也可用體外授精(IVF)的胚胎，還使單細胞人胚胎擴增到胚泡階段(Bongso等，Hum Reprod 4706，1998)。可在G1.2和G22.培養基中將胚培養至胚泡階段(Gardner等，Fertil.Steril.6984，1998)。通過與鏈黴蛋白酶(Sigma)的短暫接觸從發育的胚泡中除去透明帶(zonapellucida)。內細胞團通過免疫手術分離獲得，手術中，胚泡與兔抗人脾細胞抗血清的1∶50稀釋液接觸30分鐘，然後在DMEM中洗滌三次，每次5分鐘，然後與豚鼠補體(Gibco)的1∶5稀釋液接觸3分鐘(Solter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 725099，1975)。DMEM中再洗滌2次後，從完整細胞團(ICM)中用移液管小心去除裂解的滋養外胚層細胞，然後將ICM接種在mEF飼養細胞層上。
9至15天後，通過與含1mM EDTA的無鈣、無鎂的磷酸鹽緩衝液(PBS)接觸，或分散酶或胰蛋白酶接觸，或用微量移液管機械分離，將由內細胞團衍生的生長物分散成小塊；然後，再接種在新鮮培養基中的mEF上。用微量移液管挑出含有未分化形態的正在生長的單集落，機械分散，再平板培養。ES樣形態的特徵是集落緻密，顯著的高核/質比，核仁明顯。然後，通過胰蛋白酶消化，Dulbecco′s PBS(含2mM EDTA)處理，IV型膠原酶(約200U/ml，Gibco)處理或用微量移液管挑選單個集落，使所得ES細胞每隔1至2周常規分散一次。最佳集落塊大小約為50-100細胞。
胚胎生殖細胞人胚胎生殖(hEG)細胞可由距最後一次月經後約8-11周時採集的人胎材料中的原始生殖細胞來製備。合適的製備方法參見Shamblott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9513726，1998和美國專利6,090,622。
簡而言之，處理性腺嵴形成不聚集的細胞。EG的生長培養基是DMEM，4500mg/L D-葡萄糖，2200mg/L mM NaHCO3；15％ES級(ES合格的)胎牛血清(BRL)；2mM穀氨醯胺(BRL)；1mM丙酮酸鈉(BRL)；1000-2000U/ml人重組白血病抑制因子(LIF，Genzyme)；1-2ng/ml人重組bFGF(Genzyme)和10μM毛喉素(10％的DMSO溶液)。由亞匯合的飼養細胞層(例如STO細胞，ATCC No.CRL1503)製備的96孔組織培養板，在無LIF、bFGF和毛喉素的改良EG生長培養基中培養3天，然後用5000rad的γ-輻射滅活。在每孔中加入約2ml原代生殖細胞(PGC)。在EG生長培養基中培養7-10天後進行第一次傳代，將每孔中的培養物轉移到24孔培養板的孔中，後者預先用輻照過的STO小鼠成纖維細胞製備過。培養細胞，每日更換新鮮培養基，直至觀察到符合EG細胞的細胞形態，一般需7-30天或1-4代。
非分化狀態下pPS細胞的增殖採用促進增殖但不促進分化的培養條件，可使pPS細胞可在培養物中持續繁殖。例如採用含血清的ES培養基，其中含80％DMEM(例如敲除DMEM，Gibco)，20％確定成分的胎牛血清(FBS，Hyclone)或代血清(WO98/30679)，1％非必需胺基酸，1mM L-穀氨醯胺和0.1mM β-巰基乙醇。臨用前，加入4ng/ml人bFGF(WO99/20741，Geron Corp.)。
通常將ES細胞培養在一層飼養細胞上，飼養細胞一般為衍生自胚組織或胎組織的成纖維細胞。從懷孕13天的CF1小鼠收集胚胎，轉移到2ml胰蛋白酶/EDTA中，然後小心切碎，37℃溫育5分鐘。加入10％FBS，使碎片沉澱，細胞在90％DMEM、10％FBS和2mM穀氨醯胺中增殖。為了製備飼養細胞層，輻照細胞以抑制增殖，但允許其合成支持ES細胞的因子(約4000radγ-輻射)。用0.5％明膠包被培養板過夜，每孔接種375,000輻射過的mEF，並在接種5小時到4天使用。在接種pPS細胞之前用新鮮hES培養基置換該培養基。
Geron的科學家發現，既使不用飼養細胞也可將pPS細胞維持於非分化狀態。無飼養細胞培養的條件包括合適的培養基質，尤其是胞外基質，例如Matrigel或層粘連蛋白。pPS細胞以＞15,000個細胞/cm2(最佳是90,000cm2-170,000cm2)接種。通常，在細胞完全分散前終止酶解(例如，用IV膠原酶處理約5分鐘)。然後將約10-2000個細胞左右的細胞塊不再進一步分散直接接種在基質上。另外，在板達到匯合之前，可通過用0.5mM EDTA的PBS溶液溫育5分鐘，不用酶收集細胞。從培養容器中洗下後，將細胞鋪在新的培養物中，不用進一步分散。
用含有支持細胞增殖但不支持分化的因子的營養培養基來支持無飼養細胞培養物。可通過在培養基中培養分泌此類因子的細胞，將這類因子引入培養基中，例如輻照過的(約4000rad)原代小鼠胚胎成纖維細胞、端粒化的小鼠成纖維細胞或衍生自pPS細胞的成纖維細胞樣細胞。可條件化培養基，例如在無血清培養基(例如補充了20％代血清和4ng/ml bFGF的KO DMEM)中以約5-6×104/cm2的密度接種飼養細胞。已條件化1-2天的培養基進一步補充bFGF，然後用於支持1-2天的pPS細胞培養物。此外，還可加入其它因子，來幫助增殖而不分化，例如FGF-2或FGF-4受體的配體，c-kit(例如幹細胞因子)的配體，與gp130相關受體的配體、胰島素、轉鐵蛋白、脂類、膽固醇、核苷、丙酮酸和還原劑如β-巰基乙醇。無飼養細胞培養法的其它特徵可參見國際專利出版物WO01/51616和Xu等，Nat.Biotechnol.19971，2001中所述。
顯微鏡下，ES細胞呈高核/質比，核仁明顯，形成的集落緻密，細胞連接看不清楚。靈長動物ES細胞可表達階段特異性胚胎抗原(SSEA)3和4，以及可用抗體測知的標記Tra-1-60和Tra-1-81(Thomson等，Science 2821145，1998)。小鼠ES細胞可用作SSEA-1的陽性對照和SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81的陰性對照。SSEA-4也存在於人胚胎性癌(hEC)細胞上。pPS的體外分化不表達SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81，但提高了SSEA-1的表達，這也見於hEG細胞。
製備造血細胞及其衍生物的材料和方法可通過在特殊的、能夠富集具有所需表型的細胞(通過所需細胞生長，或者抑制或殺死其它細胞類型)的生長環境中，培養、分化或重新對幹細胞程序控制，獲得本發明的造血細胞。這些方法可用於許多類型的幹細胞，包括前面所述的靈長類多能幹細胞。
當從已建立的pPS細胞譜系衍生時，本發明的細胞群和分離的細胞與衍生出它們的細胞系具有相同的基因組。這意味著除了核型異常外，在pPS細胞和造血細胞之間的染色體DNA有90％以上是相同的，如果造血細胞是通過正常有絲分裂過程從未分化的細胞系獲得的，這是不言而喻的。用重組方法處理過，以引入轉基因或敲除一個內源基因的造血細胞也還是被認為與衍生出它們的細胞系具有相同的基因組，因為所有沒有操作的基因元件都被保留了。
分化過程的引發雖然對於本發明造血細胞的衍生不是必需的，發現進行衍生的一種有效方法是以非特異性方式引發分化。一種方法是導致pPS細胞形成胚狀體或聚集體例如，通過使供體pPS細胞培養物過度生長，或在具有低粘著性基質的培養容器中懸浮培養pPS細胞，從而形成胚狀體。從培養物收集未分化的pPS細胞，分離成簇，然後將它們鋪在非粘附細胞培養板上，在支持分化的培養基中培養(實施例1)。在該方法的一個變化形式中，從未分化的細胞培養物中以條狀剝下pPS細胞，然後在分化培養基中培養，聚集形成圓形的細胞團塊(實施例2)。
收回抑制分化的因子(例如可能存在於培養pPS細胞的條件培養基中)是分化過程的一部分。在某些情況下，逐漸回收這些因子，例如通過使用較低密度的飼養細胞調節的培養基是有益的(實施例3)。以非特異方式分化pPS細胞的其它方法是已知的，而且也適合引發產生造血細胞的過程例如，通過在培養基中加入視黃酸(RA)或二甲亞碸(DMSO)；通過從培養細胞的常規胞外介質中回收(WO01/51616)，或形成原始外胚層樣細胞(Rathjen等，J.Cell Sci.112601，1999)。
驅動向造血細胞分化為了將培養物引向造血細胞途徑，在造血細胞分化因子混合物中培養未分化的或引發的pPS細胞。各因子單獨或聯合可以指導細胞沿造血細胞途徑下遊分化，導致生長出有造血細胞表型的細胞，抑制其它細胞類型的生長，或以另一種形式富集造血細胞實施本發明不需要知道作用機制。
造血細胞因子組合的例子包括幹細胞因子(SCF)、白細胞介素-3(IL-3)、白細胞介素-6(IL-6)、粒細胞-集落-刺激因子(G-CSF)-單獨或與骨形態發生蛋白，例如BMP-2、BMP-4或BMP-7組合。SCF通過c-kit配體介導的二聚化誘導胞內信號，它是與血小板衍生的生長因子(PDGF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-SCF)、Flt-3配體和血管內皮生長因子(VEGF)受體有關的受體酪氨酸激酶。其它感興趣的因子包括刺蝟蛋白(SHH)、Delta-1、Jagged-1和促血小板生成素(TPO)。如實施例9和10所示，看來細胞因子能促進CD45表型(造血前體細胞)的形成，而骨形態發生蛋白能促進具有自我更新能力的前體細胞擴增。
通常合用至少兩種、三種或三種以上這樣的因子來建立分化混合物。優選人蛋白，但也可使用物種同源物和變體。讀者可以用能結合相同受體或刺激相同信號轉導途徑的其它配體，例如受體特異性抗體來替換任意的這些因子。另外，可在培養基中加入其它成分，以中和其它因子(這些因子可能存在，以驅動沿不同途徑下遊分化)的效果。一個例子是神經生長因子的抗體，據信它幫助最大程度減少沿神經原性分化方向的細胞損失。以能支持所需細胞群擴增的營養培養基，例如含有牛清蛋白、胰島素和轉鐵蛋白的無血清培養基(SF)配製分化混合物。
未分化或已引發的pPS細胞在因子混合物中培養足夠的時間，使得所需表型出現。選擇營養培養物是重要的，因為某些配方更支持分化過程。在培養基中加入胎牛血清(或其等價物)增強造血細胞分化因子的活性，比僅含清蛋白和激素的簡單混合物高得多。在某些情況下，對此種培養物的好處超過支持造血細胞增殖的纖連蛋白等底物。
與先前的預測相反，發現在沒有共同培養的基質細胞情況下，可高效的進行pPS細胞到造血細胞的分化。因此，本發明包括一種形成造血細胞的方法，該方法中在沒有含基因組的細胞(至少直到在細胞群的大部分中出現造血表型以前)的情況下，培養分化的pPS細胞子代。這意味著在培養物中沒有同種異型或異種細胞，例如飼養細胞、基質細胞或其它能提供分化因子或支持基質的細胞。然而，允許在該培養基中包括這些細胞，作為該方法的輔助手段，除非明顯被排除。可促進分化過程的細胞包括從人骨髓分離的原代基質細胞，和MS-5小鼠基質細胞系的細胞。
用本發明的技術，可從pPS細胞衍生出具有攜帶祖細胞表型的造血細胞群，而這種祖細胞表型的比例是無先例的。SHH、BMP-4、SCF、IL-3、Flt-3L和IL-6的不同組合能夠誘導表型和功能性造血祖細胞。在實施例3-5中，通過培養胚狀體10天，然後在含有100-300ng/ml的SCF和Flt-3L、10-50ng/mlIL-3、IL-6和G-CSF、100ng/mL SHH和5-100ng/mL BMP-4(全都在含有20％胎牛血清的培養基中或含有清蛋白、轉鐵蛋白和胰島素的無血清培養基中)的環境中接種，引發pPS細胞分化。8-15天後，造血細胞出現，其中8％CD45陽性、22％CD34陽性、5.6％對於兩種標記都是陽性的。當在CFU試驗中測試時，接種效率是350個中有一個，具重複性。在實施例9和10中，在胚狀體形成後翌日，在培養基中加入細胞因子和BMP-4，然後在15-22日後進一步增加CD45陽性細胞的比例。BMP-4的存在使得用戶能夠獲得細胞群，其中每個原代CFU形成4、10或更多的次生CFU，表明自身更新性造血祖細胞存在。
pPS衍生的造血細胞的進一步成熟根據上面的描述獲得了含有高比例的祖細胞pPS衍生的造血細胞，這對於治療彌散性造血細胞不足和體外研究造血細胞分化具有特別的意義。本發明還包括可用於治療特定病況和某些體外藥物篩選應用的更成熟的細胞群。
有兩種方法可獲得本發明的成熟造血細胞。在一種方法中，通過在含有合適的成熟因子的培養基中培養，進一步分化上面獲得的造血細胞群。在另一種方法中，以非特異性方式引發分化的細胞群被直接進入成熟步驟。
所用的促成熟細胞因子視最終的細胞類型而定。如實施例4所述，可通過在含有SCF、GM-CSF、IL-3和促血小板生成素(EPO)的環境中培養，從胚狀體產生造血細胞集落。這驅動培養物朝骨髓細胞衍生，得到含有約66％的紅細胞樣細胞集落、約19％單核細胞集落、和約15％粒細胞集落的培養物。可用的其它因子包括粒細胞的G-CSF、單核細胞的M-CSF、淋巴樣細胞的IL-2和IL-4、巨核細胞的TPO和紅細胞樣細胞的EPO。
造血細胞的特徵可根據許多表型標準特徵分析細胞。這些標準包括但不限於顯微鏡觀察形態特徵、檢測或定量表達的細胞標記、體外可測定的功能性標準、和灌注入宿主動物後的行為。
表型標誌未分化的hES細胞SSEA-4、Oct-4原始造血細胞CD34、AC133、c-kit、CD38。
成熟多能造血細胞CD45紅細胞樣細胞血型糖蛋白A早期骨髓細胞CD33單核細胞CD14、CD64、HLA II類粒細胞CD13、CD15淋巴樣細胞CD19、免疫球蛋白(B細胞)、CD3(T細胞)巨核細胞CD56可用任何合適的免疫學技術，例如細胞表面標記的流式免疫細胞化學，或胞內或細胞表面標記的免疫組織化學(例如固定細胞或組織切片)，來檢測組織特異性標記。Gallacher等，Blood 961740，2000提供了詳細的流式細胞計數分析的方法。如果在標準免疫細胞化學或流式細胞計數中，任選在細胞固定後，和任選使用標記的二抗或其它偶聯物放大標記後，顯著可檢測量的抗體與細胞表面的抗原結合，定義細胞表面抗原的表達為陽性。
還可通過Northern印跡分析、斑點印跡雜交分析或通過反轉錄酶引發的聚合酶鏈式反應(RT-PCR)，用序列特異性探針，以標準擴增方法在mRNA水平檢測組織特異性基因產物的表達。見美國專利號5,843,780。該公開文獻中列出的具體標記的序列數據可從公共資料庫，例如GenBank中獲得。
本發明的一些實施例涉及的造血細胞中至少5％、10％、20％或40％CD34陽性；1％、2％、5％或10％CD45陽性(或與CD34雙陽性)；50％、70％或90％為CD14、CD14、CD19陽性；和不到5％、1％或0.2％以下對SSEA-4陽性或Oct-4陽性。這些特徵的不同組合可存在於特定的細胞群中。
功能性特徵可用功能標準確定本發明的細胞的特徵。見T.A.Bock(Stem Cells 15Suppl 1185，1997)對於造血祖細胞的實驗系統回顧。
常用的複製性造血細胞測試是這些細胞在集落形成(CFU)試驗中形成集落的能力。經典試驗是Till和McCulloch(Ser.Haematol 515，1972)的脾集落形成試驗。現在，集落形成試驗通常在補充有生長因子的甲基纖維素基質中進行。除了另有特別要求外，本文所指的CFU試驗是如實施例2所述進行的。
一旦形成集落，可通過形態標準對其進行評估並分類成爆發集落形成單位-紅細胞樣細胞(BFU-E)、集落形成單位-粒細胞-巨噬細胞(CFU-GM)、集落形成單位-巨核細胞(CFU-M)、集落形成單位-紅細胞樣細胞(CFU-E)和可產生全部4種細胞類型的多能集落(CFU-GEMM)。接種效率是輸入細胞對形成集落之比。根據本發明的方法製備的造血細胞可具有大於1/2000、1/500，在某些情況下大於1/100的接種效率。
可根據這些細胞的已知特徵確定最終分化的細胞的功能標準例如，巨噬細胞吞噬顆粒、遞呈抗原或響應合適的細胞因子的能力；粒細胞和血小板釋放合適的介質的能力；和淋巴細胞在混合淋巴細胞反應中，響應受過輻射的同種異體刺激細胞的增殖能力。
動物模型實驗對造血細胞在臨床中具有可觀興趣是由於細胞群重建宿主動物的造血系統的能力。可用幾種完全建立的動物模型測試重建。
可在經過基因改造，預防異植體排斥的小鼠中評估造血活性細胞的重建。特別推薦的是NOD/SCID小鼠，它含有非肥胖性糖尿病(NOD)基因型，與具有重度聯合免疫缺損(SCID)的小鼠雜交。Larochelle等，Nat.Med.21329，1996；Dick等，Stem Cells 15199，1997；和Vormoor等，J.Hematother.2215，1993描述了該模型的用途。簡單說，對小鼠進行亞致死輻照，然後通過尾靜脈注射約3-4×106CD34陽性細胞。8周後，從股、脛或髂嵴收集骨髓細胞，進行表面表型和CFU試驗分析，證明用施用的人細胞重建。由於重建產生了嵌合現象和一定程度的免疫耐受，可在較不嚴重受損的免疫系統，例如(為了增加精確性)未輻照的NOD/SCID小鼠、常規SCID小鼠、裸鼠和有免疫能力的小鼠中測試該造血細胞。
可在其它動物模型中對造血能力進行進一步的臨床前研究。合適的大型動物異植體模型是綿羊，利用其胎兒骨髓中胎兒免疫力未成熟和發育空間使得可移植造血幹細胞，而不需要條件化骨髓。這避免了與輻照、化療或遺傳缺陷性宿主有關的可能基質異常。在該模型中，人幹細胞在骨髓中定居並持續多年，能夠多譜系分化，顯示對人細胞因子的應答性，並保留移植到次代受體的能力。見Zanjani等，Int.J.Hematol.63179，1996；和Zanjani等，J.Clin.Invest.Med.931051，1994。C.E.Dunbar，J.Intern.Med.249329，2001和Donahue等，Hum.Gene Ther.12607，2001提供了靈長類模型。還可在非人靈長類中，用匹配的非人pPS細胞製備物測試本發明的細胞群能否分化成造血細胞。見Thomson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 927844，1995；和Thomson等，Bio.Reprod.55254，1996。
造血細胞的基因修飾本發明的造血細胞具有顯著的增殖能力。如需要，可通過提高細胞中的端粒酶反轉錄酶(TERT)水平，或提高內源基因的轉錄，或引入轉基因進一步增強其複製能力。特別合適的是國際專利申請WO98/14592中的人端粒酶(hTERT)的催化成分。Bodnar等，Science 279348，1998和Jiang等，Nat.Genet.21111，1999描述了人細胞中端粒酶的轉染和表達。可根據標準方法，通過RT-PCR、端粒酶活性(TRAP分析)、hTERT的免疫細胞化學染色、或複製能力評估基因改變的細胞的hTERT表達。還考慮了無限增殖細胞的其它方法，例如用編碼myc、SV40大T抗原或MOT-2的DNA轉化細胞(美國專利5,869,243，國際專利申請WO97/32972和WO01/23555)。
根據本發明的方法製備的細胞群顯著沒有未分化的pPS細胞。如需要，可體外製備本發明的細胞，或進一步處理以除去未分化的細胞，或保護避免體內成為回復體。從細胞群中消除未分化幹細胞的一種方法是用一種載體轉染細胞群，其中效應基因在一啟動子控制下，該啟動子導致在未分化細胞中優先表達-例如TERT啟動子或OCT-4啟動子。效應基因可以是指導細胞分揀的報導基因，例如綠色螢光蛋白。效應物可以直接裂解細胞，編碼例如毒素或凋亡的介體，例如天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Shinoura等，Cancer GeneTher.7739，2000)。效應基因可以使得細胞對外源藥劑，例如抗體或前藥的毒性效果敏感。一個例子是單純皰疹病毒胸苷激酶(tk)基因，它導致表達它的細胞對更昔洛韋敏感(WO 02/42445)。或者，效應物可以導致細胞表面表達一種外源決定簇，該決定簇能使任何回復成未分化表型的細胞對體內天然存在的抗體敏感(GB 0128409.0)。
本發明的細胞可以經基因改造而增強它們參與組織再生的能力，或對受到治療的個體傳遞治療性基因。用所需基因的已知編碼序列，與組成型或在造血細胞中特別活躍的啟動子操縱性連接，設計載體。下文描述了基因治療中轉基因的用途。
造血前體細胞及其衍生物的用途本發明提供了一種產生大量紅細胞樣細胞、粒細胞、單核細胞、巨核細胞和淋巴樣細胞系的造血前體細胞和造血細胞的方法。這些細胞群可用於許多重要的研究、開發和商業目的。
本發明的細胞可用於製備一種cDNA文庫，該文庫相對不含有在其它細胞系細胞中優勢表達的cDNA。本發明的分化細胞還可用於根據標準方法製備對造血前體細胞的標記及其衍生物具有特異性的單克隆或多克隆的抗體。
特別感興趣的是本發明的組合物可用於造血細胞病理學的藥物開發、臨床治療、和在其它類型移植治療中誘導選擇性免疫耐受。
藥物篩選本發明的造血細胞可用於篩選能影響造血前體細胞及其各種子代的特性的因子(例如溶劑、小分子藥物、肽、多核苷酸)或環境條件(例如培養條件或操作條件)。
在一些應用中，用pPS細胞(未分化或加入分化樣式)篩選促使造血細胞成熟，或促使這樣的細胞在長期培養物中增殖或維持的因子。例如，可通過將其加入不同孔的細胞中，然後測定其導致的表型改變，根據所需的進一步培養和細胞用途的標準來測試候選的成熟因子或生長因子。
本發明的其它篩選應用涉及測試藥物組合物對造血細胞生長、發育或毒性的潛在影響。進行這類篩選是因為要設計對造血細胞具有藥物療效的化合物，或者是因為要設計對與造血系統有不良副作用的化合物。
讀者一般可參考標準教科書「In vitro Methods in PharmaceuticalResearch」，Academic Press，1997，和美國專利5,030,015。候選藥物化合物活性的評估一般涉及將本發明的分化的細胞與候選化合物單獨混合或與其它藥物混合。本研究者可通過測定該化合物引起的細胞形態、標記表型、或功能活性的任何改變(與未處理的細胞或用惰性化合物處理的細胞相比)，然後將該化合物的作用與觀察到的改變相關聯。
可首先通過對細胞活力、存活、形態和某些標記和受體的表達的影響來測定細胞毒性。可通過測定DNA合成或修復來確定藥物對染色體DNA的作用。[3H]-胸腺嘧啶或BrdU摻入法，尤其是在細胞周期中不定時間的摻入，或高於細胞複製所需的水平是與藥效一致的。不良影響還包括用中期塗布法確定的姐妹染色單體交換的異常速率。讀者可參考A.Vickers(「In vitro Methods inPharmaceutical Research」，Academic Press，1997」pp.375-410)的進一步詳述。
可用任何標準試驗觀察表型或造血細胞活性，評估細胞功能的影響。包括對表型標記的分析和衡接觸藥物導致的各種表型平衡中的變化。還包括前述集落形成試驗和重建試驗。
造血細胞重建本發明還提供了用造血前體細胞或其衍生物恢復需要該治療的病人體內的造血功能。
可用造血祖細胞群和衍生的細胞群治療急性或慢性造血功能紊亂。這些病況包括先天或後天的紅細胞樣細胞、粒細胞、巨噬細胞、巨核細胞、或淋巴樣細胞譜系的基因缺陷，不健全的造血能力導致的貧血、再生障礙性貧血、脊髓發育不良症候群、偶爾接觸輻射、和有生命危險的自身免疫性疾病，例如狼瘡。
特別感興趣的是治療癌症，例如白細胞、淋巴瘤和某些化療敏感的和轉移活躍的實性腫瘤，例如骨髓瘤和乳癌。病人經歷骨髓燒蝕輻射(1200cGy)或用環磷醯胺、塞替哌或依託泊甙等藥物的化療，然後用本發明的造血細胞重建。預先培養大量的這些細胞的能力節約了自體骨髓移植的時間限制，並消除了由於自身細胞製備物中殘留的腫瘤細胞重新引入腫瘤的危險。
只要可能，待給予細胞的組織相容性和待治療病人的組織相容性相匹配是有益的。相同的匹配、或在HLA-A、HLA-B，和HLA-DR座位匹配的細胞是優選的。大獲得型pPS細胞衍生的造血細胞祖細胞庫，尤其是HLA等位基因純合子細胞使得匹配更容易。當不能得到精確匹配時，在一個或兩個I類或II類基因座的匹配也是有幫助的。在某些這樣的情況下，進一步操縱細胞可幫助最大程度減少移植物抗宿主疾病(GVHD)-例如給予去除了T細胞的細胞群(例如用針對CD2、CD3或CD4的抗體去除T細胞)。
通常將要施用的造血細胞以無菌等滲緩衝液配製成濃縮細胞懸液。融化冷藏或低溫保藏的袋裝幹細胞，並以20-50ml等份通過中央靜脈導管灌注。粗略的說，每公斤3.5×106CD3陽性細胞的劑量可能是合適的，視CFU試驗接種效率而定。在重度骨髓抑制後，嗜中性細胞計數可能下降到100個細胞/微升以下，而輸液依賴性血小板減少症低於10000/微升，病人應補充血小板和匹配的紅細胞。移植物首先出現在約7-21日，其標誌是在血液中觀察到嗜中性粒細胞和早期的造血細胞重建。一旦移植確立，造血細胞重建是迅速的，在14-28天出現足夠的嗜中性粒細胞(1000/微升)和血小板(20,000/微升)。生長因子，例如G-CSF和GM-CSF可增強治療效果。
標準教科書，例如Textbook of Internal Medicine，第三版，W.N.Kelley編，Lippincott-Raven，1997提供了造血細胞及其前體在臨床醫學中應用的一般方法；具體的參考文獻可見例如Hematopoietic Stem CellTransplantation，A.D.Ho等編，Marcel Dekker，2000；Hematopoietic CellTransplantation，E.D.Thomas等編，Blackwell Science Inc.，1999；Hematopoietic Stem Cell Therapy，E.D.Ball，J.Lister P.Law，ChurchillLivingstone，2000。
臨床治療中造血幹細胞的應用是正在進展的領域，對於臨床醫師來說可存在其它用途。本發明的細胞的用途和劑量的最終責任由主治醫師負責。
基因治療本發明的細胞不僅可用於重建造血功能，還可以用於矯正或補充其它可通過基因治療而改善的缺陷。造血細胞作為基因表達的儲存庫，具有一些優點它們可在整個體內循環和持續再生。細胞可以在施用前體外基因修飾並測試，避免了對病人施用基因載體的不確定性。
為了進行本發明的基因治療，可用含有治療性編碼區(在組成型或造血細胞特異性啟動子控制下)的轉基因，以能建立穩定修飾的技術；例如反轉錄病毒或慢病毒載體，或通過同源重組修飾所述細胞。修飾可以在造血細胞的增殖性培養物上進行，也可以在pPS細胞未分化時進行修飾，然後分化。然後評估細胞的造血功能和轉基因的表達。
在充分測試後，對需要基因治療的病人施用細胞，然後對其進行生物化學和臨床監測缺陷的矯正。當組合物與要治療的個體HLA相容時，不需要在治療之前對病人進行重度骨髓抑制，如果病人自身的細胞和基因改變的細胞的混合物提供了表達治療基因的充足儲存庫。
見Murdoch等(FASEB J.151628，2001)描述了造血幹細胞作為子宮基因治療的新目標。一般文獻包括Stem Cell Biology and Gene Therapy，P.J.Quesenberry等編，John Wiley Sons，1998；和Blood CellBiochemistrytherapyHematopoiesis and Gene Therapy(Blood CellBiochemistry，卷8)，L.J.Fairbairn N.G.Testa編，Kluwar AcademicPublishers，1999。這些參考文獻討論了幹細胞作為基因治療載體的治療可能性；基因治療的傳遞系統和示範性臨床應用。
在再生醫學中誘導特異性免疫耐受的細胞組合物本發明的細胞還可以誘導對特定組織類型的免疫耐受，用於準備與病人不匹配的同種異體移植物的移植。所選擇的耐受細胞應與同種異體移植物具有相同的組織相容性標記，在用一類能使病人所需要的細胞功能再生的細胞治療之前或之中施給病人。導致的免疫耐受隨後減少了同種異體移植物急性或慢性排斥的危險。
有效的細胞組合含有兩種成分第一類細胞用於誘導免疫耐受；第二類細胞用於再生所需的功能。可從pPS細胞和其它來源衍生出各種臨床上有用的細胞類型，用於再生性醫學。
例如，可根據國際專利出版物WO 01/18804和申請PCT/US02/19477(GeronCorporation)中所述的方法從pPS細胞產生神經細胞。在含有一種或多種神經營養因子和一種或多種有絲分裂原的培養基中培養未分化的pPS細胞或胚狀體細胞，產生一群細胞，其中至少約60％細胞表達A2B5、聚唾液醯基NCAM、或Nestin，至少能在培養物中倍增20次。示範性的有絲分裂原是EGF、鹼性FGF、PDGF和IGF-1。示範性的神經營養因子是NT-3和BDNF。然後讓正在增殖的細胞通過與不含有絲分裂原的神經營養因子一起培養，經過終末分化。可產生含有高比例酪氨酸羥化酶陽性細胞的細胞群，這是產多巴胺神經元的特徵。
可通過將pPS細胞作為細胞聚集體懸浮培養在含有有絲分裂原(例如FGF)，和少突神經膠質細胞分化因子(例如三碘甲腺原氨酸、硒和視黃酸)中產生少突神經膠質細胞。然後將細胞鋪在固體表面，除去視黃酸，擴增細胞群。可通過鋪在聚-L-賴氨酸上，除去所有的生長因子進行終末分化。可獲得90％以上的細胞都是GalC陽性的細胞群。
可用pPS根據美國專利6,458,589和PCT出版物WO 01/81549(GeronCorporation)所述的方法產生肝細胞。在組蛋白脫醯酶抑制劑存在下培養未分化的pPS細胞。在示範性方法中，用1％DMSO(4天)，然後2.5mM組蛋白脫醯酶抑制劑正丁酸酯引發分化。可將獲得的分化細胞在含正丁酸酯DMSO加生長因子(例如EGF)，肝細胞生長因子和TGF-α的肝細胞培養基中培養4天使其成熟。
可根據PCT/US02/22245中提供的方法從pPS細胞產生心肌細胞或心肌細胞前體。在含有影響DNA甲基化的心臟營養因子，例如5-氮胞苷的生長環境中培養pPS細胞。然後將細胞群的其它細胞通過密度離心與自發性收縮的細胞分開。其它處理步驟可包括在含有肌酸、卡尼汀或氨基乙磺酸的培養基中培養細胞。
可用PCT/US02/20998中所述的方法從pPS細胞產生成骨細胞及其祖細胞。在含有成骨因子(例如骨形態發生蛋白，特別是BMP-4、人TGF-β受體的配體、或人維生素D受體的配體)的培養基中分化pPS衍生的間充質細胞。可通過在例如活化素A、煙醯胺等因子和其它美國專利申請60/338,885中列出的其它因子中培養pPS細胞及其衍生物，產生分泌胰島素或其它胰臟激素的細胞。可通過和美國專利申請60/339,043中列出的分化因子的有效組合一起，以微聚集體培養pPS細胞，產生軟骨細胞或其祖細胞。
為了誘導對要植入同種異體移植受體體內的這些分化細胞的耐受，用「耐受」細胞(能導致對同種異體移植細胞較低的炎症或免疫學反應的細胞)預先處理或共處理病人，例如可通過注射位點的白細胞浸潤、抗體或MLR活性的誘導、或同種異體移植細胞的存活時間增加測定的。當目的是促進同種異型特異性耐受時，所選耐受性細胞應是與同種異體移植細胞「MHC相容」。這意味著至少耐受細胞與同種異體移植細胞在A、B或C基因座處至少有一個相同的MHC I類單元型。更優選相匹配，即耐受細胞攜帶有同種異型移植物的A單元型和/或B單元型之一或兩者。在不能精確匹配時，可通過建立來自不同譜系的MHC相容性細胞混合物，製備含有同種異體移植細胞群多種單元型的耐受性細胞。還可以通過從同一pPS細胞系衍生兩種細胞群，將耐受細胞基因裁剪成同種異體移植細胞。
在本發明的一個實施例中，耐受性細胞是如上所述獲得的pPS衍生的造血細胞，攜帶一種或多種特徵性表型或功能特徵。特別感興趣的造血細胞群，是含有或可以產生免疫調節性T細胞、樹突細胞及其前體，或能在施用後形成免疫嵌合性的細胞。另一實施例中，用於誘導免疫耐受的細胞(或其一部分)仍然具有未分化pPS細胞的特徵。如實施例6-8所示，未分化的pPS細胞常常缺乏明顯的MHC II類抗原。它們能夠活躍的抑制炎症反應和同種異體移植及異種免疫反應(針對其自身，和針對第三方的刺激性細胞)。
在某些情況下，擔心未分化的pPS細胞或早期祖細胞可能在施用後以失控方式生長或分化，產生惡性腫瘤或其它不良增生物。處理該擔心有幾種解決方法。一種方法是對未分化的細胞裝配一個自殺基因(例如胸腺嘧啶激酶)，使得前藥更昔洛韋對細胞具有毒性(WO 02/42445)。誘導耐受後，可通過施用該前藥從個體中剔除未分化的pPS細胞。另一種方法是將未分化pPS細胞滅活到一定程度，使其不再能夠在體內增殖，但仍然可以具有免疫抑制所需的活性(實施例7和8)。未分化的pPS細胞可通過輻照(約1000-3000 Rads)或用絲裂黴素c或其它滅活性化療、交聯、或烷基化劑處理，事先滅活，以抑制或預防細胞分裂。
本節所述的細胞組合物為再生醫學提供了一種重要的新系統。國際專利出版物WO 02/44343提供了幾種嚙齒類和非人靈長類模型，用於評估耐受性方案的存活率和隨後的組織再生。
通過施用第一群細胞，以誘導對第二群細胞的耐受，對人個體進行治療。為了幫助平息局部炎症，可對接受再生性同種異型移植物的同一部位給予所述耐受性細胞。或者，為了幫助產生造血細胞嵌合體，可系統性給予該耐受性細胞。可通過在單向混合的淋巴細胞反應中，用同種異體移植細胞作為刺激劑，測試病人的血液淋巴細胞，以確定是否有耐受誘導(實施例7)。增殖應答降低顯示了成功的耐受誘導。可通過評估循環單核細胞的HLA型和造血細胞表面標記評價受體的造血嵌合性。
同時或隨後對病人施用相容的神經元、少突神經膠質細胞、肝細胞、心肌細胞、間充質細胞、成骨細胞、激素分泌性細胞、軟骨細胞、造血細胞或一些其它的細胞類型以治療其疾病。在該過程後，病人受到必需的支持護理，並用合適的生物化學標記和臨床標準監測其功能的改進。
對於本公開中描述的任何治療目的，本發明的造血或免疫耐受性細胞通常是以藥物組合物的形式提供的，其中含有用於人給藥的在充分無菌的條件下製備的等滲賦形劑。可獨立包裝並銷售有效的細胞組合，或採用置於藥盒中的獨立容器形式，或可以互相混合(為了同時對同一位點給藥)。本發明還包括製造、銷售或使用過程中的細胞組。細胞組含有本文所述的兩種或多種細胞群的任意組合，例如但不限於一類分化的pPS-衍生的細胞(造血細胞、神經細胞等)聯合未分化的pPS細胞或其它分化的細胞類型，有時具有相同基因組或MHC單元型。該組中的各細胞類型可包裝在一起，或裝在同一設備的不同容器中，或在不同位置，處於同一企業，或有商業關係的不同企業控制下。
對於細胞組合物的藥物製劑的基本原則，讀者可以參考G.Morstyn W.Sheridan編，Cell TherapyStem Cell Transplantation，Gene Therapy，and Cellular Immunotherapy，Cambridge University Press，1996。用於藥物銷售和使用的本發明的產品可任選的包裝在合適的容器或藥盒中，配有用於所需目的，例如重建血液功能、基因治療或免疫耐受誘導的說明書。
下列實施例提供了本發明具體實施方式
的非限制性說明。
實施例實施例1胚胎幹細胞的無飼養細胞繁殖將未分化的人胚胎幹細胞(hES)的已建立細胞系維持在基本無飼養細胞的培養環境中。
事先按照標準方法(WO 01/51616)用分離的原代小鼠胚胎成纖維細胞(mEF)製備條件培養基。
在Matrigel包被的平板上傳代hES培養物。接種後約一周，培養物變得匯合，可以傳代。在這些條件下維持培養物超過180天，並持續顯示ES樣形態。hES集落表達SSEA-4、Tra-1-60、Tra-1-81和鹼性磷酸酶，如免疫化學評估的，但集落之間的分化的細胞不表達。通過將集落用於產生特定細胞類型的已建立的方法，確定了多能性。
實施例2未分化的hES細胞培養物中缺乏造血細胞表型用流式細胞計數和集落形成試驗(CFU)分析H1 hES細胞系中未分化的細胞，以確定處於未分化狀態的造血細胞的特徵。
用胰蛋白酶-EDTA(1％胰蛋白酶、2％EDTA，Gibco)在室溫下10分鐘，或細胞分離緩衝液(CDB)37℃10分鐘(EDTA和高鹽，Gibco)處理從無飼養細胞培養物中收集細胞。離心沉澱收集細胞，重新懸浮在含有10％ FCS的IMDM(Iscove改良Dulbecco培養基)中，然後濾過85微米的尼龍篩。將其重新懸浮在含有3％ FCS的200微升PBS中，在室溫下與2微升抗體保溫15分鐘。洗滌細胞兩次，用15微升/ml 7AAD(Immunotech)在室溫下染色15分鐘。
圖1顯示了結果。活細胞(門控7AAD陰性；i欄)進一步用大小(ii)門控篩選，以分析未分化ES細胞群中造血細胞表面標記(iii-vi)的表達。基於培養基對照，排除150以下的具有正向散射特徵的細胞。根據各圖頂部標出的獨立試驗個數(n)，細胞百分數表示成平均值±SEN。
用基於各目的同種型對照(插頁)劃分的四象限分析未分化H1(A，B)和H9細胞(C，D)的各人造血細胞標記(iii-vi)的表達。沒有細胞表達人造血細胞標記CD45，僅1.2％是CD34陽性(原始人造血細胞的標記，欄iii)。分析了這些細胞的其它原始造血細胞標記，包括c-kit(iv)、CD38(v)和AC133(v)的表達。事實上沒有細胞表達CD38，但22-33％是c-Kit陽性，13-52％是AC133陽性。12-38％表達MHC I類抗原(HLA-A，B和C)(vi)。
如下進行CFU試驗。收集未分化的細胞，將2×105臺盼藍陰性細胞接種在含有50ng/ml SCF、10ng/ml GM-CSF(Novartis)、10ng/ml IL-3(Novartis)和3U/ml EPO(Amgen)的MethocultTMH4230甲基纖維素(StemCellTechnologies Inc.，Vancouver BC)中。在該生長因子混合物中加入25ng/mlBMP-4和300ng/ml Flt-3L，沒有提高未分化hES細胞系中所測到的造血細胞克隆形成性祖細胞。培養物在37℃、5％CO2，溼潤空氣中培育，並監測集落形成達40天。用形態特徵(如紅細胞系)和微紅色指示的血紅蛋白可區別集落的亞型。結果見表1。
表1未分化hES細胞的CFU能力

H1譜系的未分化hES細胞在4個獨立試驗，9個獨立的孔中不能產生造血細胞集落。用未分化的H9細胞獲得類似結果，除了在一個試驗中形成了3個小的紅細胞樣集落。
實施例3與造血細胞分化因子一起培養的hES細胞的造血細胞表型在該實驗中，hES細胞的H9譜系分化成造血祖細胞，用流式細胞計數評估表型。
用巴斯德吸管橫切匯合細胞的6孔板的孔徑，直到形成聚集的細胞，形成hES細胞條帶。將每條條帶懸浮在非條件性培養基中(含有20％FCS的KODMEM)，培養10天。此時，培養物含有細胞圓球，在下面的實施例中稱作胚狀體。許多細胞如形態學標準和臺盼藍染色評估那樣不是活的細胞。
收集胚狀體，分散並接種在粘附性組織培養皿或纖連蛋白包裹的皿中。培養基是BIT培養基(BSA、胰島素和轉鐵蛋白；StemCell Technologies，Vancouver BC)，補充有0.1mM β-巰基乙醇、2mM L-穀氨醯胺和下列重組人生長因子300mM幹細胞因子(SCF，Amgen)，300ng/ml Flt-3配體(Flt-3L，R D Systems，Minneapolis，MN)，50ng/ml G-CSF(Amgen)，10ng/ml I1-3(Novartis，Dorval QC)和10ng/ml IL-6(R D Systems)。分化後，用流式細胞計數評估H9細胞對造血細胞表面標記的表達。
圖2比較了未分化的hES細胞及其衍生物上檢測到的細胞表面標記。用於正確評估流式細胞計數數據的門控策略包括排除小於150的正向散射特徵確定的碎片(欄Ai)，用活力染料7AAD排除死亡和瀕死的細胞，該染色的陽性定義為那些要排除的細胞(欄Aii)，和用按同種型對照(插頁)劃分四象限。百分數已基於同種型對照進行了校正。未分化細胞不具有CD45，0.1％細胞是CD34陽性(欄A iv)。35％未分化的H9細胞表達AC133(欄A v)。從AC133陽性和CD34陰性的骨髓中分離出的原始造血細胞能重新建立免疫缺陷小鼠的細胞群。
下面顯示在不存在(欄B)或存在(欄C)BMP-4的情況下與SF+HGF一起，培養分化細胞的分析。在分化後，0.9％細胞表達CD45，原始表面標記CD34從0.1％增加到1.5％(欄B iv)。沒有細胞同時表達兩種標記。AC133陽性細胞從35％減少到14％(欄B v)。在這些無血清培養物中加入BMP-4得到與未分化的hES細胞類似比例的CD45陽性細胞(0.3％)和CD34陽性細胞(0.2％)。然而，在BMP-4存在下分化再次減少了AC133的表達(10％欄C iv)。
實施例4分化的hES細胞的造血細胞集落形成圖3顯示了評估從hES細胞的H1譜系分化的細胞的造血能力的流程。在mEF製備的條件培養基中，以常用密度的一半培養，傳代3次，引發分化。然後細胞條在KO DMEM+20％FCS中培養，如前形成胚狀體。此時，收集孔(含有胚狀體細胞和死細胞)中的所有內容物或分離單個胚狀體，排除死細胞。用CFU試驗(如實施例2中所述進行，含有或不含BMP-4幾乎觀察不到影響)評估收集的細胞。然後用流式細胞計數評估CFU試驗得到的細胞的表面表型。
圖4顯示了結果。左上角的顯微照片顯示了CFU試驗中典型培養物孔的外觀(放大100倍)。該培養物含有能大量增殖的細胞，和使人聯想起巨噬細胞、粒細胞和紅細胞樣祖細胞的各種形態特徵。深色的小塊是試驗培養物中的死細胞。卵形高亮區顯示的是血紅蛋白化的一簇細胞(紅色)，說明是紅細胞樣細胞。
合併CFU培養物，用針對血型糖蛋白A(表示紅血細胞前體)；CD45(表示造血細胞)；CD34、CD38和AC133(都表示原始人造血細胞)；和CD19(表示B淋巴細胞)的一抗染色。CD45陽性染色(83-86％)確認了造血細胞的存在(欄A i和ii)。血型糖蛋白A(4％)的陽性染色確認了紅細胞樣細胞的存在(欄A i)。如預期的，血型糖蛋白A陽性的細胞不對CD45染色。早期造血祖細胞佔了該培養物的一小部分，因為0.7％是CD34陽性而0.2％是AC133陽性。CFU培養物中排除了CD19陽性細胞(B淋巴細胞)，具有小百分數的CD33陽性細胞(0.9％)。CD33是髓樣途徑中早期細胞的標記，與淋巴樣譜系不同。由於CFU試驗針對形成髓樣祖細胞，不奇怪沒有觀察到淋巴樣細胞。
試驗培養物中的CFU亞型如欄B所示。培養物中總輸入20,000細胞，總CFU計數是47，意味著需要形成一個單集落所需的平均數目(接種效率)是1/425。
還對單個挑出的確定亞型的集落進行了流式細胞計數分析。選擇兩個集落，它們都具有欄C中繪出的粒細胞形態(放大50倍)。集落如粒細胞集落預期的那樣，是81-92％CD45陽性(欄Ci和iv)，73％CD13陽性(欄Ci)。低水平的CD15說明它位於發育的髓細胞階段的造血細胞層次。還發現了原始標記，例如CD34和c-kit在該集落中以6％和12％存在，而不表達AC133。
為了確定胚狀體單獨的祖細胞分布，從分化培養物中分離得到單個胚狀體，如前進行CFU試驗。在各試驗中總共放置了50,000個分化的細胞，在評估之前培養11天。
圖5顯示了結果。存在幾種CFU亞型紅細胞樣細胞(放大100倍)、粒細胞(放大100倍)和巨噬細胞(放大200倍)。基於培養物中祖細胞總數的定量評估(77個集落)揭示了朝紅細胞樣譜系的傾向，接種效率為649個輸入細胞中有1個(欄B)。用流式細胞分析兩個紅細胞樣集落，發現93％是血型糖蛋白A陽性。
實施例5次生集落形成在最後一個實施例中的CFU試驗中挑取單集落，並在次生CFU試驗中將它們重新接種，測試次生祖細胞的存在。基於整個內含物分化方案進行CFU試驗的兩個原始集落，和分離的胚狀體分化方案的兩個集落，分別在次生CFU試驗中接種傳代。
圖6顯示了結果。整個內含物方案的兩個粒細胞集落在次生試驗中形成了許多集落。
欄A顯示了衍生自82,500個細胞的一個原代集落的不同次生集落，顯示了粒細胞、巨噬細胞、紅細胞樣細胞集落和GEMM集落(粒細胞、紅細胞樣細胞、巨噬細胞和巨核細胞類型的混合物)。集落數目如下所示。收集次生集落，並合併用於流式細胞計數。有高水平CD45表達(45％，表示造血非紅細胞樣細胞)，但是CD34水平低(欄Av)。次生試驗中的細胞是CD13陽性(35％；欄A vi)，與衍生出它的原代集落一樣。CD14(表示單核細胞)表達低(2％，欄A vii)。血型糖蛋白A陽性細胞僅佔合併的試驗培養物的小部分(1.2％；欄A viii)，但如形態學標準評估的，清楚存在紅細胞樣祖細胞。
欄B顯示了從不同的原代粒細胞集落(由12,500個細胞組成)獲得的次生集落。總共獲得14個次生集落，全都是巨噬細胞樣集落。整個CFU試驗群的流式細胞計數顯示，細胞是50％CD45陽性，0.7％CD34陽性，57％CD13陽性，表示存在單核細胞或粒細胞類型。
顯示次生集落形成，表示最初的細胞是原始祖細胞，具有比原始CFU試驗中形成骨髓細胞的集落的典型增殖能力更高。
實施例6未分化的hES細胞上MHC表達的特徵確定人組織上MHC抗原的表達決定了體外和體內同種異體特異性T細胞應答的結果。MHC II類主要在骨髓衍生的細胞和胸腺表皮上表達。它將抗原遞呈給免疫系統，以引發特異性免疫應答。相反，MHC I類幾乎在所有哺乳動物細胞上表達。它在免疫系統的效應臂上起作用，當宿主細胞被組織不相容或含有外源基因的病毒感染時，可被特異性T淋巴細胞識別。
通過免疫染色和流式細胞計數分析未分化hES細胞上的MHC表達。用於這些研究的hES細胞系是H1(傳代36-45)、H7(傳代37-43)和H9(傳代31-40)。使用了下列抗體HLA-A、B、C；HLA-DP、DQ、DR(BD-Pharmingen)。細胞和抗體一起在0℃保溫，洗滌，並用二碘化丙錠對染。在FACScanTM或FACScaliburTM流式細胞計數(Becton Dickinson)上進行流式細胞計數分析。
圖7顯示了結果。灰線表示MHC抗體染色；實線表示同種型對照。H1、H7和H9 hES細胞系都表達MHC I類(n＝26)，人胎兒臍帶血單核細胞也是一樣(CBMC；n＝4)。hES細胞沒有可檢測的MHC II類(第二個峰)。最後欄中的插入顯示用50-100單位γ幹擾素(IFN)處理hES細胞仍然不能誘導可檢測的MHC II類表達。
實施例7培養物中未分化hES細胞的免疫抑制在混合淋巴細胞反應(MLR)中測定hES細胞誘導同種異體T細胞增殖的能力。發現hES細胞系不能誘導原代人T細胞的同種異體反應性，即使用IFN-γ刺激後。
用Ficoll-HypaqueTM密度梯度(Amersham Pharmacia)離心從肝素化的血液中分離外周血單核細胞(PBMC)，重新懸浮在含有10％ FBS的RPMI 1640培養基中。或者，為了富集T淋巴細胞，將分離的細胞在37℃保溫2小時，收集未粘附的細胞，冷凍在60％AIM-V、30％胎牛血清(FBS)、10％DMSO中備用。將剩餘的粘附的細胞在含有10ng/ml的人重組GM-CSF和10ng/ml IL-4(RDSystems)的AIM-V中培養7天，製備樹突細胞(DC)。混合淋巴細胞反應如下進行輻照刺激物細胞(DC，3000rad；BJ成纖維細胞，3000Rad；或hES細胞系，1000Rad)，然後將1×105-1×102個細胞置於96孔圓底平板的AIM-V培養基中。以每孔1×105的濃度加入反應物PBMC或T細胞，將平板在AIM-V中培養5天。然後各孔加入[3H]胸苷(1μCi每孔)培育16-20小時，收集並計數。
圖8顯示了結果(來自3個獻血者的多個孔的平均刺激指數±SEM)。hES細胞不能誘導PBMC應答細胞中的同種異體T細胞增殖，而用PBMC作為刺激細胞時觀察到顯著的T細胞增殖。類似的，用胎兒血單核細胞作為反應細胞，當用hES細胞作為刺激細胞時，沒有觀察到顯著的增殖(欄A)。當用富含T細胞的(耗竭單核細胞)的PBMC作為應答細胞時，也觀察到hES細胞系H1、H7和H9缺乏對T細胞的刺激能力(欄B)。與IFN-γ一起保溫導致MHC I類表達的顯著上調(插入∶灰線＝未處理的hES細胞；虛線＝IFN-γ處理的細胞；黑線＝各同種型對照)。然而，通過與IFN-γ一起培養增加了MHC表達所製備的hES細胞系H1和H9還是不能刺激T細胞增殖(欄C)。在相關實驗中，通過與IFN-γ一起培養製備人包皮成纖維細胞，使其能更好的刺激T細胞。
進行了抑制實驗，以確定未分化的hES細胞是否能活躍的調節對第三方的刺激細胞的同種異體-MHC應答。將應答T細胞(1×105)與不同數量的受過輻照的人成纖維細胞和hES細胞一起培養0-2小時。隨後，每孔加入1×104個受過輻照的樹突細胞。培養5天後，加入[3H]胸苷脈衝細胞16-20小時，洗滌和計數。
圖9顯示了結果(平均值±SEM)。hES細胞廢除了同種異體樹突狀細胞激發的T細胞增殖。當PBMC和同種異體專門(professional)抗原遞呈細胞以10∶1的比例共培養時，檢測到強烈的增殖反應。然而，在這些共培養物中加入任何未分化的hES細胞系，即強烈抑制了T細胞體外增殖(欄A)。加入相等數目的人成纖維細胞沒有抑制效果(欄A)。遞次減少hES細胞數目導致抑制效果的逐步喪失，顯示hES細胞抑制混合淋巴細胞反應的同種異體活化是劑量依賴性的(欄B)。hES細胞T細胞比為1∶1-1∶3抑制了MLR。
實施例8體內未分化的hES細胞沒有同種異體刺激作用。
通過測試hES細胞刺激體內細胞免疫應答的能力進一步評估了未分化hES細胞的免疫原性。
在免疫缺陷型Prk-/-SCID小鼠的肌肉內注射2-5×105未分化的hES細胞、胎兒單核細胞或MBA-1新巨核細胞系。48-72小時後，固定組織，包埋，並在低溫恆溫器上切片。保存每份第二張切片用於蘇木精和曙紅(HE)染色。在HE染色的切片中放大1000倍，通過形態特徵鑑定白細胞的存在(以盲法進行分析；R＞0.97)。
圖10顯示了該實驗的結果。MBA-1細胞和單核臍帶細胞都能誘導Prk-/-SCID小鼠中的粒細胞滲出反應。相反，在注射了未分化hES細胞的動物注射位點沒有觀察到粒細胞滲出。
圖11顯示了用野生型免疫活性CD-1小鼠隨後進行的實驗結果。與Prk-/-SCID小鼠不同，注射含有內毒素的PBS載體在注射位點誘導淋巴細胞和粒細胞滲出(左下圖)。然而，同時注射載體和hES細胞完全消除了白細胞滲出(右下圖)。注射重新懸浮在相同載體中的MBA-1細胞不能抑制白細胞滲出(插入)。
該研究得到兩個結論。首先，hES細胞不能在免疫缺陷或免疫活性小鼠中引發針對自身的應答。這提示它們應該能抑制異種免疫應答。將細胞施給異種宿主原理上比將其施給同種異體的人將引起更劇烈的反應，因為抗原不匹配水平高得多。第二，hES細胞還能顯著抑制對內毒素反應的非抗原特異性炎症應答中出現的非特異性滲出。
如本文前面提到的，未分化的hES細胞同時活躍抑制免疫和炎症反應，這是臨床治療的重要意義。
實施例9BMP促進hES細胞衍生的造血祖細胞自我更新在下面的一系列試驗中，用改良的分化時間線從hES獲得造血細胞。
用膠原酶IV處理無飼養細胞培養物中的未分化的hES細胞，並從Matrigel基質上以條狀刮下。然後將它們轉移到低吸附的平板中，在含有20％未熱滅活的FBS的分化培養基中過夜，形成胚狀體。翌日將培養基更換為含有造血細胞因子(300ng/ml SCF；300ng/ml Flt-3配體、10ng/ml IL-3、10ng/mlIL-6和50ng/mL G-CSF)；或BMP-4(50ng/ml)；或同時加入細胞因子和BMP-4。繼續在同一分化培養基中繼續對照培養，而不加入任何因子。每3天更換培養基。
圖12顯示了總細胞計數和獲得的CD45陽性造血祖細胞數。還顯示了每105輸入細胞獲得的原代CFU數目。細胞因子相對於對照，可觀的提高了CD45陽性細胞(p＜0.02)和CFU(p＜0.001)的產率。根據這些標準，含或不含細胞因子時，BMP-4的效果都可忽略不計。
圖13顯示了次生CFU的結果，強調BMP-4的重要性。在對照條件下，從hES細胞衍生出的造血祖細胞的自我更新是不常見的事件，僅在6％原代CFU中發生(左欄)。相反，用細胞因子處理分化中的hES細胞使得所有被檢測的原始CFU中提高到21％有自我更新能力。雖然當用細胞因子分化細胞時，祖細胞的自我更新頻率提高對照或細胞因子衍生的造血祖細胞的自我更新數量級都是最小的，平均在每個原代CFU中僅有0.5和0.3個次生CFU(右欄)。當同時用細胞因子和BMP-4分化hES細胞時，36％的原代CFU產生次生CFU。在細胞因子和BMP-4存在下分化的hES細胞產生的單個原代CFU產生每個原代CFU達4個次級CFU，比對照或單獨用細胞因子處理自我更新的數量級大了8倍。雖然用BMP-4處理分化的hES細胞不能提高造血特異性超過基線能力以上(實施例2和3)，本實施例中顯示BMP-4影響了原代造血祖細胞的自我更新能力。在BMP-4存在下，50％以上產生的原代CFU能自我更新(左欄)，每個原代CFU平均能形成10個次級CFU(右欄)，在自我更新能力上比對照或細胞因子分化細胞提高了20倍。
為了比較hES衍生的造血祖細胞和已知來源的定型造血組織之間祖細胞自我更新的頻率和數量級，以相同方式測試了從人臍帶血樣本產生的原代CFU的自我更新能力(右欄，插入)。當單獨測試時，臍帶血衍生的原始CFU不能產生次級祖細胞。然而，當合併多個原代集落，觀察到祖細胞以每個原代CFU0.5個次生集落的頻率自我更新。與BMP-4存在下分化性hES細胞衍生的造血祖細胞相比，這顯示定型造血組織自我更新性祖細胞的珍貴。
這些結果顯示，在BMP-4存在下分化性hES細胞產生具有卓越自我更新能力的造血祖細胞。
實施例10祖細胞誘導的動力學在該實施例中，進一步檢測了造血細胞分化的動力學。從胚狀體形成後翌日開始，將細胞與HGF細胞因子和BMP-4一起培養。在不同時間從培養物中採集細胞樣品，分析CD45和原代CFU。
圖14顯示了結果，用細胞因子加BMP-4培養的第3、7和10天未觀察到造血細胞。第15和22天，CD45陽性細胞的頻率可觀的上升。在第7和10天，CFU試驗中克隆產生的效率低至1/15000，但在第15天上升到1/262。在第15和22天之間克隆產生效率的提高無統計學顯著性，提示第15-22天之間定型造血細胞的增殖伴隨著分化和祖細胞功能的喪失。
本文提出了針對hES細胞造血細胞分化的概念性模型。該模型僅僅是為了增強讀者的理解；不是為了要不必要的限制本發明。
hES細胞產生造血細胞子代似乎是分兩個階段進行的-一是造血細胞因子引發程序控制的誘導期，然後是定型造血細胞的增殖期。細胞因子誘導了能多譜系成熟的定型造血祖細胞，以CD45標記為代表。在對照條件下，hES細胞自發分化產生的少量定型造血祖細胞能在次生CFU試驗中自我更新，並因此可以最終分化。因此，控制hES細胞分化的內在程序不能產生用細胞因子和BMP-4處理所誘導的維持能力。
結果顯示BMP-4(單獨或聯合細胞因子)對獲自hES細胞的造血祖細胞的頻率或總數沒有作用。然而，在BMP-4存在下hES細胞的衍生產生了具有更高自我更新能力的特異性造血祖細胞。BMP-4可以在發育前14天內起作用，刺激負責祖細胞更新的長期程序。
本領域技術人員讀者應理解作為常規優化，本發明可被修改，但不脫離本發明的思路或權利要求規定的範圍。
在法律允許包括以下多重引用權利要求的情況下本發明的實施方案1.培養物中增殖異種分化的細胞群，其特徵在於，該細胞群具有以下一個或多個特徵·至少1％細胞是CD45陽性，·至少20％是CD34陽性，·至少70％是CD13陽性，·至少10％是AC133陽性。
2.如權利要求1所述的細胞群，其特徵在於，所述細胞群是通過分化靈長類多能幹細胞獲得的。
3.兩種細胞群，其特徵在於，包括權利要求2的細胞群和衍生出該細胞群的未分化的pPS細胞系。
4.任一前述權利要求所述的細胞群，其特徵在於，至少5％細胞同時是CD34陽性和CD45陽性。
5.任一前述權利要求所述的細胞群，其特徵在於，該細胞群含有不到1％的未分化靈長類多能幹細胞。
6.任一前述權利要求所述的細胞群，其特徵在於，該細胞群在造血細胞集落形成單位試驗中以至少約1/1000的接種效率形成集落。
7.任一前述權利要求所述的細胞群，其特徵在於，次生CFU試驗中再接種時，從CFU試驗收集的集落形成次生集落。
8.任一前述權利要求所述的細胞群，其特徵在於，當注射入NOD-SCID小鼠時，形成循環性紅細胞樣細胞、粒細胞和單核細胞。
9.任一前述權利要求所述的細胞群，其特徵在於，當注射入NOD-SCID小鼠時，形成淋巴樣細胞。
10.任一前述權利要求所述的細胞群，其特徵在於，該細胞群經過基因改造能表達異源基因。
11.任一前述權利要求所述的細胞群，其特徵在於，所述靈長類多能幹細胞是人胚泡分離的細胞的子代。
12.任一前述權利要求所述的細胞群，其特徵在於，所述靈長類多能幹細胞是人胚胎幹細胞。
13.一種使靈長類多能幹細胞分化成具有造血能力的細胞群的方法，其特徵在於，該方法包括步驟在基本無任何具有不同基因型的細胞但含有造血細胞生長因子混合物的培養環境中，培養未分化的pPS細胞，然後從該培養環境中收集至少1％CD45陽性的細胞群或在造血細胞集落形成試驗中以至少約1/1000的接種效率形成集落的細胞群。
14.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，分化包括形成胚狀體或細胞聚集體。
15.如權利要求13-14所述的方法，其特徵在於，分化包括在低密度條件培養基中培養。
16.如權利要求13-15所述的方法，其特徵在於，造血細胞生長因子的混合物含有至少下列兩種幹細胞因子(SCF)、Flt-3配體、IL-3、IL-6和粒細胞集落刺激因子(G-CSF)。
17.如權利要求16所述的方法，其特徵在於，在分化開始12天內用所述造血細胞生長因子培養細胞。
18.如權利要求13-17所述的方法，其特徵在於，在用造血細胞生長因子混合物培養的同時或隨後用骨形態發生蛋白培養分化的細胞。
19.如權利要求18所述的方法，其特徵在於，在用所述造血細胞生長因子培養之後用骨形態發生蛋白4培養細胞。
20.如權利要求13-19所述的方法，其特徵在於，用該方法獲得的細胞具有權利要求1-12任一所述的分化細胞的特徵。
21.如權利要求13-20所述的方法，其特徵在於，該方法可用於產生造血祖細胞、紅細胞樣細胞、粒細胞、單核細胞、巨核細胞或淋巴樣細胞。
22.一種獲得權利要求1-12所述的分化細胞群的方法，其特徵在於，包括分化性靈長類多能幹細胞。
23.如權利要求13-22任一所述的方法，其特徵在於，所述靈長類多能幹細胞是人胚泡分離的細胞的子代。
24.如權利要求13-23任一所述的方法，其特徵在於，所述靈長類多能幹細胞是人胚胎幹細胞。
25.通過進一步分化權利要求1-12中所述的分化細胞群產生的紅細胞、成紅細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、巨核細胞、血小板或淋巴細胞。
26.一種篩選化合物調節造血細胞功能的能力的方法，其特徵在於，該方法包括將化合物與權利要求1-12任一所述的分化細胞群混合，測定由於與化合物混合所導致的細胞群的任何表型或代謝改變，並將所述改變與該化合物調節造血細胞功能的能力相關聯。
27.一種用於治療人或動物個體的藥物組合物，其特徵在於，該組合物含有權利要求1-12任一所述的，或用權利要求13-24任一所述的方法獲得的分化的細胞群。
28.權利要求1-12所述的，或用權利要求13-24任一所述的方法獲得的分化的細胞群的用途，其特徵在於，用於製備重建人體造血功能的藥物。
29.權利要求1-12所述的，或用權利要求13-24任一所述的方法獲得的分化的細胞群的用途，其特徵在於，用於製備人基因治療的藥物。
30.權利要求1-12所述的，或用權利要求13-24任一所述的方法獲得的分化的細胞群的用途，其特徵在於，用於製備使人與該藥物中的細胞MHC相容的細胞耐受的藥物。
31.一種藥物組合物，其特徵在於，含有包裝在一起，或分裝在獨立容器中的第一群細胞，所述第一群細胞是配製成適合人給藥的權利要求1-12任一所述的分化的細胞群，或滅活的未分化的靈長類多能幹細胞；和第二群細胞，所述第二群細胞是與第一群細胞MHC相容的分化的細胞。
32.如權利要求31所述的藥物組合物，其特徵在於，在對個體施用該組合物後，第一群細胞可抑制個體針對第二群細胞的炎症反應。
33.如權利要求31-32所述的藥物組合物，其特徵在於，對個體施用第一群細胞後賦予個體對第二群細胞的免疫耐受。
34.如權利要求31-33所述的藥物組合物，其特徵在於，未分化的pPS細胞是通過輻照或用絲裂黴素c處理滅活的人胚胎幹細胞。
35.如權利要求31-34所述的藥物組合物，其特徵在於，所述第一和第二群細胞是衍生自人胚胎幹細胞的相同細胞系。
36.如權利要求31-35所述的藥物組合物，其特徵在於，第二群細胞是肝細胞、神經元、少突膠質細胞、心肌細胞、成骨細胞、間充質細胞、造血細胞、胰島細胞、軟骨細胞或這些細胞類型任一的譜系限制性前體細胞。
權利要求
1.在培養物中增殖的一種分化的細胞群，其特徵在於，該細胞群具有以下一個或多個特徵·至少1％細胞是CD45陽性，·至少20％是CD34陽性，·至少70％是CD13陽性，·至少10％是AC133陽性。
2.如權利要求1所述的細胞群，其特徵在於，所述細胞群是通過分化靈長類多能幹細胞獲得的。
3.兩種細胞群，其特徵在於，包括權利要求2所述的細胞群和衍生該細胞群的未分化的pPS細胞系。
4.如權利要求1所述的細胞群，其特徵在於，至少5％細胞同時為CD34陽性和CD45陽性。
5.如權利要求1所述的細胞群，其特徵在於，該細胞群含有1％以下未分化的靈長類多能幹細胞。
6.如權利要求1所述的細胞群，其特徵在於，該細胞群在造血細胞集落形成單位試驗中以至少約1/1000的接種效率形成集落。
7.如權利要求6所述的細胞群，其特徵在於，在次生CFU試驗中再接種時，從CFU試驗收集的集落形成次生集落。
8.如權利要求1所述的細胞群，其特徵在於，當注射入NOD-SCID小鼠時，該細胞群可形成循環性紅細胞樣細胞、粒細胞和單核細胞。
9.如權利要求1所述的細胞群，其特徵在於，當注射入NOD-SCID小鼠時，該細胞群可形成淋巴樣細胞。
10.如權利要求1所述的細胞群，其特徵在於，該細胞群經過基因改造，表達異源基因。
11.如權利要求1所述的細胞群，其特徵在於，所述靈長類多能幹細胞是人胚泡分離的細胞的子代。
12.如權利要求1所述的細胞群，其特徵在於，所述靈長類多能幹細胞是人胚胎幹細胞。
13.一種使靈長類多能幹細胞分化成具有造血能力的細胞群的方法，其特徵在於，該方法包括步驟在基本無任何具有不同基因型的細胞，但含有造血細胞生長因子混合物的培養環境中培養未分化的pPS細胞，然後從培養環境中收集至少1％CD45陽性的細胞群或在造血細胞集落形成試驗中以至少約1/1000的接種效率形成集落的細胞群。
14.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，分化包括形成胚狀體或細胞聚集體。
15.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，分化包括在低密度條件培養基中培養。
16.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，造血細胞生長因子的混合物含有至少下列兩種幹細胞因子(SCF)、Flt-3配體、IL-3、IL-6和粒細胞集落刺激因子(G-CSF)。
17.如權利要求16所述的方法，其特徵在於，在分化開始12天內用所述造血細胞生長因子培養細胞。
18.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，在用造血細胞生長因子混合物培養的同時或隨後用骨形態發生蛋白培養分化的細胞。
19.如權利要求18所述的方法，其特徵在於，在用所述造血細胞生長因子培養之後用骨形態發生蛋白4培養細胞。
20.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，用該方法獲得的細胞具有權利要求1所述的分化的細胞的特徵。
21.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，該方法用於產生造血祖細胞、紅細胞樣細胞、粒細胞、單核細胞、巨核細胞或淋巴樣細胞。
22.一種獲得權利要求1所述的分化細胞群的方法，其特徵在於，包括分化靈長類多能幹細胞。
23.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，所述靈長類多能幹細胞是人胚泡分離的細胞的子代。
24.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，所述靈長類多能幹細胞是人胚胎幹細胞。
25.通過進一步分化權利要求1中所述的分化細胞群產生的紅細胞、成紅細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、巨核細胞、血小板或淋巴細胞。
26.一種篩選化合物調節造血細胞功能的能力的方法，其特徵在於，該方法包括將化合物與權利要求1所述的分化細胞群混合，測定由於與該化合物混合所導致的細胞群的任何表型或代謝改變，並將所述改變與該化合物調節造血細胞功能的能力相關聯。
27.一種用於治療人或動物個體的藥物組合物，其特徵在於，該組合物含有權利要求1所述的，或用權利要求13所述的方法獲得的分化的細胞群。
28.權利要求1所述的，或用權利要求13所述方法獲得的分化的細胞群的用途，其特徵在於，用於製備重建人體造血功能的藥物。
29.權利要求1所述的，或用權利要求13所述方法獲得的分化的細胞群的用途，其特徵在於，可用於製備人基因療法的藥物。
30.權利要求13所述的分化的細胞群，或未分化的經過滅活的靈長類多能幹細胞群的用途，其特徵在於，可用於製備使人與該藥物中的細胞MHC相容的細胞耐受的藥物。
31.一種藥物組合物，其特徵在於，該藥物組合物含有包裝在一起或分裝在獨立容器中的第一群細胞，所述第一群細胞是配製成適合人給藥的權利要求13所述的分化的細胞群，或滅活的未分化靈長類多能幹細胞；和第二群細胞，所述第二群細胞是與第一群細胞MHC相容的分化的細胞。
32.如權利要求31所述的藥物組合物，其特徵在於，個體給予組合物後，第一群細胞可抑制個體針對第二群細胞的炎症反應。
33.如權利要求31所述的藥物組合物，其特徵在於，對個體施用第一群細胞後可賦予該個體對第二群細胞的免疫耐受。
34.如權利要求31所述的藥物組合物，其特徵在於，未分化的pPS細胞是通過輻照或用絲裂黴素c處理滅活的人胚胎幹細胞。
35.如權利要求31所述的藥物組合物，其特徵在於，所述第一和第二群細胞衍生自人胚胎幹細胞的相同細胞系。
36.如權利要求31所述的藥物組合物，其特徵在於，第二群細胞是肝細胞、神經元、少突膠質細胞、心肌細胞、成骨細胞、間充質細胞、造血細胞、胰島細胞、軟骨細胞或這些細胞類型任一的譜系限制性前體細胞。
全文摘要
本發明提供了一種從胚胎幹細胞產生造血細胞系細胞的系統。在造血原性細胞因子和本公開內容中所列的其它因子存在下進行分化。獲得的細胞群顯著富含CD45陽性細胞，該標記是有自我更新功能的早期造血前體細胞的標記。在分化過程中，摻入骨形態發生蛋白增強了細胞群形成次生代集落的能力。由於胚胎幹細胞的強大複製能力，提供了造血細胞重要的新商業來源。
文檔編號A61P37/02GK1630716SQ02827064
公開日2005年6月22日 申請日期2002年12月6日 優先權日2001年12月7日
發明者M·巴蒂亞, J·馬登斯, I·A·赫伯, A·S·馬宗達 申請人:傑龍公司, 羅巴茨研究所