受體的製作方法

2023-05-01 14:47:41 3

專利名稱：：受體的製作方法
技術領域：
：本發明涉及已知受體的新功能。具體地，本發明涉及鞘氨醇磷脂醯膽鹼(sphingosylphosphorylcholine)受體和/或其配體在操縱邊緣系統中的用途。編碼GPR12的Annie位於人染色體13q12上。GPR12cDNA長度為1005bp。其首先由Songetal(Genomics，1995，28，347-349)公開。最初，認為它是鞘氨醇1-磷酸的受體(Uhlenbrock，K.etal.CellularSignalling2002，14941-953)。最近，其被去-孤化(de-orphanised)並顯示為鞘氨醇磷脂醯膽鹼(sphingosylphosphorylcholine)(SPC)的受體(Ignatov，.etal.2003，J.Neurosci.23，(2)907-914)。SPC的多種細胞效應可通過與S1P-EDG受體的低親和力結合以及活化來解釋。然而，SPC的一些細胞和亞細胞作用是S1P不具有的，其也在正常血漿、腹水、各種組織中鑑定，是脂質介導物。現在認識到鞘磷脂分解產物在細胞信號中顯示雙重作用，作為細胞內以及細胞外信號分子起作用。已經顯示G蛋白偶聯的受體對鞘氨醇1-磷酸和鞘氨醇磷脂醯膽鹼具有高親和力，鞘磷脂具有多種功能，包括調節心率，氧化爆發(oxidativeburst)，神經突縮回(neuriteretraction)，傷口癒合(有絲分裂發生效應(mitogeniceffect))和血小板活化。鞘氨醇-1磷酸(S1P)是有效的細胞外溶血磷脂磷酸介導物，其在例如血小板聚集過程中釋放。S1P通過多種刺激誘導，例如生長因子，細胞因子，GPCR激動劑，抗原等。S1P受體信號途徑與轉錄因子活化、細胞骨架蛋白，粘附分子表達等有關。因此，S1P可影響多種生物反應，包括有絲分裂發生，分化，增殖，遷移和凋亡等。此外，S1P在鈣動員中起作用。Edg1，3和5與細胞增殖，血管生成和細胞遷移相關。(Edg8最接近Edg5，序列同源性為40％)。Edg4是卵巢癌細胞的標記物。S1P與乳腺癌有關。S1P抑制雌激素依賴性乳腺癌細胞系MDA-MB-231中的化學侵入性(chemo-invasiveness)。白細胞遷移受S1P影響，因此S1P可能在炎症中有作用。肥大細胞中S1P水平可決定它們的過敏反應。Edg受體中的改變在控制S1P的細胞內/細胞外濃度中起關鍵作用，並且這可能對多種疾病有影響。Edg受體在與失調的凋亡有關的神經疾病諸如阿爾茨海默氏病和帕金森氏症(Alzheimer’sandParkinson’sdisease)中起作用。通過抑制PKC局部治療疤痕是另一種有效的應用，對於白血病而言也如此。利用Edg1空小鼠，Liu，etal.(2000)證實了經由Edg1的S1P信號對於血管形成必不可少。顯示胚胎出血的Edg1空小鼠導致在胚胎日齡12.5-14.5之間的子宮內死亡。脈管形成和血管生成在突變胚胎中表現正常。然而，血管成熟由於血管平滑肌細胞/周細胞缺陷而不完整。所述缺陷在平滑肌中不是普遍的缺陷，這是由於胃腸道和支氣管樹的肌肉層發育良好。利用野生型和Edge1空纖維母細胞培養物，發明人顯示Edg1介導S1P誘導的遷移反應，其在突變細胞中缺陷。突變細胞也不能應答於S1P刺激而活化Rac。Ishii，etal.(2001)破壞了小鼠中的Edg3基因，導致該基因、轉錄物以及蛋白質的完全缺乏。Edg3空小鼠可存活、可生育、可正常發育而沒有明顯表型異常。野生型小鼠胚胎纖維母細胞表達Edg1，Edg5，和Edg3，並對磷酸酶C(PLC；見600810)活化、腺苷酸環化酶抑制，以及Rho(見602732)活化中的S1P高反應。Edg3空纖維母細胞顯示PLC活化明顯減少，腺苷酸環化酶抑制稍有減少，Rho活化沒有改變。Ishii，etal.(2001)的結論是Edg3對正常小鼠發育具有非必要的作用，但顯示應答於S1P的非多餘的細胞信號。Ishii，etal.(2002)開發了Edg3和Edg5空小鼠。單獨的Edg5缺陷的小鼠可存活、生育並正常發育。Edg5-Edg3雙空雜交的同窩幼鼠的大小明顯減小，並且這些幼鼠通常不能存活至超過幼年，但是雙空存活小鼠顯示沒有明顯的表型。Ishii，etal.(2002)的結論是任何一種受體亞型都支持了胚胎發育，但是缺乏任何一種受體亞型都導致明顯的圍產期死亡。他們檢驗了小鼠胚胎纖維母細胞中受體缺失對S1P信號的影響。Edg5空纖維母細胞顯示，暴露於S1P時，Rho活化明顯降低，雙空纖維母細胞顯示Rho活化完全喪失，PLC活化和鈣動員明顯降低，而對腺苷酸環化酶抑制沒有影響。他們的結論是，在小鼠中Edg5和Edg3分別優選與Rho和PLC/Ca(2+)途徑偶聯。最近，在胚胎發育過程中，GPR12表達在腦內顯示，提示其在神經元分化，成熟和增殖中的作用。實際上，河馬細胞HT22應答於SPC導致細胞數目增加，用SPC處理的原代大鼠皮質培養物顯示突觸接觸增加。在小鼠中，GPR12已經在以下組織中用northern印跡檢出腦，具體在前腦和後腦，和肝。更具體地，在腦的海馬，杏仁核，梨狀皮質以及嗅皮質(邊緣系統)中原位檢出(Saeki，Y.，etalFEBSletters1993336317-322)。更接近現在，GPR12已經被去孤化(deorphanised)作為鞘氨醇磷脂醯膽鹼(SPC)受體。GPR12是僅有的SPC受體，其主要在胚胎和成年小鼠腦內表達。在胚胎發育過程中，GPR12mRNA在皮質和海馬內強表達，儘管該表達仍存在成年小鼠中，其較在發育過程中的表達更弱。發育過程中的表達也存在梨狀皮質(piriformcortex)，尾狀核(caudate)，殼核(putamen)，中間背側核(dorsomedial)和弓狀核(arcuatenuclei)，乳頭體(mammillarybody)，後腦的運動和感覺核，腦幹和脊髓。在成年小鼠中，GPR12在皮質(軀體感覺和retrosplenial皮質)，海馬(CA2區的錐狀細胞層中的標記最強)，伏核(nucleusaccumbens)，梨狀皮質，中隔(septum)，嗅球(僧帽瓣狀細胞層(mitral)和小球細胞層(glomerularcelllayers))，杏仁核和膝狀核中強表達。在後腦，GPR12表達弱，僅有小腦的一些細胞(小葉9和10)顯示表達。在大鼠中，Northern顯示GPR12在腦內以及睪丸內的表達。通過RT-PCR顯示，GPR12存在於垂體，腦和睪丸。原位雜交顯示GPR12在垂體前葉和後葉，梨狀皮質，以及外側隔核中的表達(Eidne，K.A.，etal.FEBSletters.1991.292.243-248)。然而，對GPR12在哺乳動物總體以及具體在腦中的作用的理解在現有技術中沒有報導。WO01/48483描述了提供食慾控制劑的方法，包括利用GPR12受體的一或多種激動劑或拮抗劑作為受試化合物，用作食慾控制劑。然而，cDNA序列和胺基酸序列的分析顯示許多錯誤，其不能從本說明書測定。由此這些研究不能得以重複。
發明內容本發明人首次製備了GPR12敲除小鼠以研究GPR12的體內作用。發明人顯示所述敲除小鼠與非突變體的運動(包括步態)不同，學習能力也不同，提示GPR12在控制神經元發育以及突觸形成以及神經內分泌行為調節中的作用。此外，所述小鼠顯示對疼痛的敏感性差異，它們是痛覺超敏的(hyperanalgesic)，即對疼痛刺激敏感。此外，所述突變體的生理和形態學提示GPR12在一些神經疾病以及其它疾病例如阿爾茨海默病和相關疾病(Alzheimer’sandrelateddiseases)，帕金森氏症(Parkinson’sdisease)，癲癇(epilepsy)以及致癲癇疾病(epileptogenic)，眩暈(dizziness)和暈動病(motionsickness)，運動神經元疾病(motorneurondisease)，以及神經元功能障礙疾病(diseasesofneuronaldysfunctions)，以及疼痛包括感受傷害性疼痛(nociceptivepain)中的作用。生物化學分子顯示所述敲除小鼠顯示肝和腎疾病(包括肝炎)，肌肉降解(muscledegradation)，甲狀腺機能低下(hypothyroidism)，胰腺炎或MI，多發性骨髓瘤，和糖尿病的病症。GPR12敲除小鼠可用作疾病模型以及鑑定用於治療用途的GPR12的拮抗劑或激動劑。因此，在第一方面，本發明提供了GPR12敲除哺乳動物，所述哺乳動物包含其中的GPR12多肽是功能失活的一或多種細胞。本發明人發現本發明上述方面的GPR12敲除小鼠顯示多種確定性特徵，所述特徵包括選自下組的特徵運動和平衡功能差(如通過抓握倒置柵格(invertedgrid)的能力較低所證實的)，rotarod成績差，步態異常、步距寬以及對疼痛的敏感性增加。敲除哺乳動物的產生對於本領域技術人員而言是熟悉的，並且可利用標準實驗室技術，其包括如本文所述的同源重組。優選，所述轉基因哺乳動物是選自下組的以下哺乳動物之一小鼠，大鼠，地鼠，沙鼠，豚鼠，猴，倉鼠，貓和狗。本領域技術人員將理解該列表並非意圖窮舉。最優選，所述哺乳動物是小鼠。如本文所述，術語「功能失活的」(GPR12，通過同源重組)表示與其中GPR12沒有被功能失活的對照相比，GPR12多肽在其天然環境(在體內環境中)起作用時，所述多肽正常執行的一或多種功能明顯受抑制。優選，術語「功能失活的」指與其中GPR12沒有被功能滅活的對照相比，當GPR12在其天然環境中(即在體內環境中)起作用時，一種以上由GPR12正常執行的功能顯著受到抑制。更優選，本文術語「功能失活的」指與其中GPR12沒有被功能滅活的對照相比，當GPR12在其天然環境中(即在體內環境中)起作用時，所有由GPR12正常執行的功能顯著受到抑制。同樣，本文術語「功能滅活的」GPR12核酸編碼本文定義的功能失活的GPR12。如上所述，術語「明顯受抑制的」(GPR12功能)指抑制(如上所述，通過的同源重組抑制至少一種GPR12功能)是與適宜的對照相比被抑制至少20％。適宜對照的實例是在相同或相似體內環境中的相同或相似細胞，其中GPR12沒有通過如上所述的同源重組而被功能滅活。優選，術語「明顯抑制的」(如上所述，通過同源重組抑制哺乳動物細胞中的GPR12功能)指與適宜對照相比，至少一種GPR12功能被抑制至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％。更優選，術語「明顯受抑制的」(如上所述，通過同源重組抑制哺乳動物細胞中的GPR12功能)指與適宜對照相比，至少一種GPR12功能被抑制100％。另一方面，本發明提供產生包含一或多種功能失活的GPR12基因的一或多種哺乳動物細胞的方法，包括以下步驟(a)選擇一或多種細胞，其包含一或多種功能活性內源GPR12基因；(b)用功能失活的GPR12核酸轉染根據步驟(a)的一或多種細胞，所述核酸能夠通過同源重組與一或多種內源GPR12基因重組；(c)選擇其中的一或多種內源GPR12基因已經與功能失活的GPR12核酸發生同源重組的一或多種細胞。有利地，本發明的哺乳動物細胞根據本發明上文詳述的方法產生。在本發明該方面優選的實施方案中，所述哺乳動物細胞包含在哺乳動物中。即本發明上述方面的細胞優選組成「敲除」哺乳動物。有利地，本發明的敲除哺乳動物是小鼠。用功能失活的GPR12轉染所述一或多種細胞的方法涉及標準分子生物學技術的使用，並在本發明描述。同樣地，用於選擇其中的一或多種內源GPR12基因已經與功能失活的GPR12核酸發生同源重組的一或多種細胞的方法利用標準實驗室技術進行，其在本文描述。另一方面，本發明提供適於功能滅活宿主細胞中的功能失活的GPR12核酸的核酸構建體，包含(a)非同源取代區；(b)位於所述非同源取代區上遊的第一同源區；(c)突變的GPR12基因，其表達時不編碼功能活性GPR12；(d)位於非同源取代部分的下遊的第二同源區，所述第二同源區位於所述非同源取代區下遊，其核苷酸序列與第二GPR基因具有至少90％的同一性。本發明人鑑定了與GPR12相關的數種功能，由此他們認為GPR12多肽，或其一或多種結合蛋白或編碼它們的核酸可具有治療意義。因此，另一方面，本發明提供了組合物，其包含GPR12多肽，或其一或多種結合蛋白或編碼它們的核酸，以及可藥用載體、稀釋劑或賦形劑。根據本發明的上述方面，所述組合物有利地包含一或多種GPR12多肽結合蛋白。優選所述一或多種GPR12結合蛋白是GPR12的拮抗劑或激動劑。GPR12結合蛋白可為天然存在的或合成的。天然存在的結合蛋白可為多肽，諸如本文所述的抗體或核酸。合成GPR12結合蛋白有利地是小分子，並可通過本領域技術人員熟悉的並在本文描述的篩選方法來選出。在本發明另一實施方案中，優選所述組合物包含編碼GPR12結合蛋白或GPR12多肽的核酸。本發明人吃驚地發現GPR12敲除小鼠與正常對照小鼠相比具有改變的神經元功能。此外，GPR12敲除小鼠具有其它形態學和解剖異常。由此，本發明人認為GPR12的激動劑和/或拮抗劑或包含它們的組合物具體可用於治療神經疾病。所述神經疾病包括但不限於以下任意一或多種疾病阿爾茨海默氏症以及相關疾病，帕金森氏症，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動症，運動神經元疾病，以及神經元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛以及痛覺過敏，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發性骨髓瘤和糖尿病。因此，另一方面本發明提供鑑定激動GPR12多肽的功能活性的一或多種分子的方法，包括以下步驟(a)選擇一或多種哺乳動物，其包含功能失活的GPR12多肽；(b)用一或多種可能的GPR12類似物處理所述一或多種哺乳動物，所述GPR12類似物可能激動GPR12活性的至少一個方面；(c)檢測根據步驟(b)處理的一或多種哺乳動物，確定所述經處理的哺乳動物與根據步驟(a)選出的哺乳動物相比是否具有一或多種恢復的性質；和(d)選擇所述一或多種GPR12-配體類似物，其使得根據步驟(a)選出的那些哺乳動物恢復野生型哺乳動物的一或多種特徵。本發明提供鑑定拮抗GPR12多肽的功能活性的一或多種分子的方法，包括以下步驟(a)選擇一或多種哺乳動物，包含功能活性GPR12多肽；(b)用一或多種可能的GPR12類似物處理所述一或多種哺乳動物，所述GPR12類似物可能拮抗GPR12活性的至少一個方面；(c)檢測根據步驟(b)處理的一或多種哺乳動物，確定所述經處理的哺乳動物與根據步驟(a)選出的哺乳動物相比是否具有一或多種經調節的性質。此外，本發明提供了轉基因GPR12敲除哺乳動物在一或多種化合物的生物效應的測定法中的用途。根據本發明的上述方面，術語「拮抗劑」指與適宜對照相比如本文定義那樣明顯抑制GPR12的一或多種功能的分子。本發明利用GPR12本身，其激動劑和拮抗劑，以及GPR12活性的調節物。本領域技術人員將認識到各種試劑將作用以增加和降低GPR12的效果，並且實現所述效應的途徑各異；因此激動劑可模擬活化的GPR12，或結合GPR12並增加其活性；GPR12活性的激動型調節物也如此，並且可增加GPR12的內源激動劑或內源GPR12本身的生成。拮抗劑和拮抗型調節物可起類似作用，但是降低GPR12的生物效應。根據本發明，術語『哺乳動物』可以是任何哺乳動物。有利地，所述哺乳動物是非人哺乳動物。優選，所述哺乳動物是任何選自下組的哺乳動物小鼠，大鼠，豚鼠，兔，倉鼠，沙鼠，貓，狗和猴。本領域技術人員將理解所述列表並非意圖窮舉。根據本發明的該方面，術語「治療」(利用GPR12的有效拮抗劑治療哺乳動物)指將所述哺乳動物的一或多種細胞(與GPR12的一或多種有效的拮抗劑)接觸。根據本發明上述方面，異常神經特徵的指徵包括選自下組的任何一種阿爾茨海默氏症以及相關疾病，帕金森氏症，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動症，運動神經元疾病，以及神經元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛以及痛覺過敏，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發性骨髓瘤和糖尿病。用於檢測異常神經元功能的試驗利用標準實驗室技術，並且是本領域技術人員熟悉的。有利地，本發明以上方面的步驟(c)包括檢測所述一或多種哺乳動物以確定所述哺乳動物是否顯示GPR12敲除小鼠顯示的一或多種特徵。根據本發明的上述方面，根據步驟(a)選出的一或多種哺乳動物優選是GPR12敲除小鼠。優選它們根據本文所述的方法產生。如本文所述，術語「功能失活的」(GPR12，通過同源重組)表示與其中GPR12沒有被功能失活的對照相比，GPR12多肽在其天然環境(在體內環境中)起作用時，所述多肽正常執行的一或多種功能明顯受抑制。優選，術語「功能失活的」指與其中GPR12沒有被功能滅活的對照相比，當GPR12在其天然環境中(即在體內環境中)起作用時，一種以上由GPR12正常執行的功能顯著受到抑制。更優選，本文術語「功能失活的」指與其中GPR12沒有被功能滅活的對照相比，當GPR12在其天然環境中(即在體內環境中)起作用時，所有由GPR12正常執行的功能顯著受到抑制。同樣，本文術語「功能滅活的」GPR12核酸編碼本文定義的功能失活的GPR12。如上所述，術語「明顯受抑制的」(GPR12功能)指抑制(如上所述，通過的同源重組抑制至少一種GPR12功能)是與適宜的對照相比被抑制至少20％。適宜對照的實例是在相同或相似體內環境中的相同或相似細胞，其中GPR12沒有通過如上所述的同源重組而被功能滅活。優選，術語「明顯抑制的」(如上所述，通過同源重組抑制哺乳動物細胞中的GPR12功能)指與適宜對照相比，至少一種GPR12功能被抑制至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％。更優選，術語「明顯受抑制的」(如上所述，通過同源重組抑制哺乳動物細胞中的GPR12功能)指與適宜對照相比，至少一種GPR12功能被抑制100％。根據本發明的該方面，術語「治療」(利用GPR12的有效拮抗劑治療哺乳動物)指將所述哺乳動物的一或多種細胞(與GPR12的一或多種有效的拮抗劑)接觸。根據本發明的上述方面，術語「野生型哺乳動物的一或多種經調節的特徵」指與包含本文所述的功能失活的GPR12多肽的哺乳動物相比，對野生型哺乳動物顯示的一或多種特徵的調節。優選，所述調節是對喪失的功能的恢復。如本文所述GPR12類似物，與野生型GPR12的至少一種活性和功能相同。所述類似物可模擬活化的GPR12和可模擬失活的GPR12，使得它們進一步抑制功能，所述功能本身在缺乏天然失活的GPR12時受到抑制。本發明人考慮GPR12核酸或編碼GPR12的一或多種激動劑或拮抗劑的核酸可插入哺乳動物，以產生一或多種治療效果。因此另一方面，本發明提供轉基因動物，其中的至少部分細胞包含編碼一或多種選自下組的物質的外源核酸GPR12多肽，GPR12多肽的一或多種激動劑和GPR12多肽的一或多種拮抗劑。有利地，所述轉基因動物選自下組小鼠，人，豬，山羊，鹿，猴和母牛。本領域熟練技術人員將理解所述列表並非意圖窮舉。根據本發明的上述方面，術語「外源核酸」指並非源自特定哺乳動物的核酸。然而，其可源自同樣的動物類型和品種。例如，轉基因小鼠可包含細菌來源的GPR激動核酸。優選，轉基因動物的部分細胞中包含編碼GPR12的一或多種激動劑或一或多種拮抗劑的外源DNA。如本文所述，非人轉基因動物可為選自下組的任意一或多種小鼠，大鼠，猴，狗，貓和豬。本領域技術人員將理解該列表並非意圖窮舉。利用根據本發明製備的GPR12敲除小鼠的研究顯示，GPR12多肽與神經元功能以及其它疾病相關。所述神經疾病包括但不限於以下疾病中的一或多種阿爾茨海默氏症以及相關疾病，帕金森氏症，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動症，運動神經元疾病，以及神經元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛以及痛覺過敏，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發性骨髓瘤和糖尿病。因此，另一方面，本發明提供診斷選自下組的疾病或病症的方法阿爾茨海默氏症以及相關疾病，帕金森氏症，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動症，運動神經元疾病，以及神經元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛以及痛覺過敏，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發性骨髓瘤和糖尿病，包括以下步驟(a)選擇來自待診斷患者的細胞樣品；和(b)比較細胞樣品與一或多種來自健康個體的對照樣品中的GPR12多肽的表達水平和/或功能活性。另一實施方案中，GPR12及其天然配體中的多態性可用於診斷疾病。因此，本發明提供用於診斷選自下組的疾病或病症阿爾茨海默氏症以及相關疾病，帕金森氏症，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動症，運動神經元疾病，以及神經元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛以及痛覺過敏，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發性骨髓瘤和糖尿病，包括以下步驟(a)選擇來自待診斷患者的細胞樣品；和(b)分析所述細胞中的內源基因以檢測所述內源GPR12基因或GPR12的一或多種天然配體中的多態性。根據本發明上述方面，其中GPR12的表達水平或功能活性增加，降低或改變，或其中GPR12核酸或編碼GPR12配體的核酸與一或多種來自健康個體的對照樣品相比包含一或多種多態性，表明自其獲得樣品的個體患有上述疾病中的任何一或多種。根據本發明上述方面，利用標準實驗室技術的獲自患者的細胞樣品，所述技術是本領域技術人員熟悉的。如上所述，GPR12多肽的「功能活性」指GPR12在其天然環境即在其細胞中通常發揮的功能。另一方面，本發明提供了GPR12的一或多種激動劑或拮抗劑在製備用於預防或治療患者中選自下組的疾病或病症的藥物中的用途阿爾茨海默氏症以及相關疾病，帕金森氏症，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動症，運動神經元疾病，以及神經元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛以及痛覺過敏，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發性骨髓瘤和糖尿病。附圖簡述圖1顯示GPR12敲除以前小鼠GPR12的基因組基因座結構。圖2顯示GPR12敲除以後小鼠GPR12的基因組基因座結構。圖3顯示用於GPR12的同源重組的靶向型載體的結構，包括相關限制位點。圖4顯示利用PCR以及電子Northern的GPCR12的基因表達模式。圖5顯示雄性敲除小鼠在rotarod測驗中的表現。圖6顯示步態評估的結果；突變體在左道，野生型在右道。圖7從5』探針FII-3』探針R1的基因組基因座。圖8顯示雄性敲除小鼠在擺尾(tailflick)試驗中的評估結果(-/-敲除，+/+野生型對照)。圖9顯示雄性敲除小鼠在熱板試驗(hotplatetest)中的評估結果。圖10顯示水迷宮試驗(watermazetest)中的評估結果(野生型空心方塊；敲除小鼠實心圓圈)。圖11a顯示小鼠攀爬過夜持續時間(climbingdurationovernight)的Laboras評估(野生型用X表示；敲除小鼠用實心三角表示)；圖11b顯示小鼠攀爬過夜頻率的Laboras評估(野生型用X表示；敲除小鼠用實心三角表示)。圖12顯示敲除小鼠中肌酐激酶的評估結果(1.野生型雌性3月齡；2.敲除(KO)雌性3月齡；3.野生型雌性9月齡；4.敲除(KO)雌性9月齡；5.野生型雄性3月齡；6.敲除(KO)雄性3月齡；7.野生型雄性9月齡；8.敲除(KO)雌性9月齡。發明詳述常規技術本發明的實施將採用，除非另有說明，常規化學、分子生物學、微生物學、重組DNA和免疫學的技術，其是本領域技術人員能力範圍之內的。所述技術的解釋見文獻。參見例如J.Sambrook，E.F.Fritsch，andT.Maniatis，1989，MolecularCloningALaboratoryManual，SecondEdition，Books1-3，ColdSpringHarborLaboratoryPress；Ausubel，F.M.etal.(1995andperiodicsupplements；CurrentProtocolsinMolecularBiology，ch.9，13，and16，JohnWileySons，NewYork，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree，andA.Kahn，1996，DNAIsolationandSequencingEssentialTechniques，JohnWileySons；J.M.PolakandJamesO』D.McGee，1990，InSituHybridizationPrinciplesandPractice；OxfordUniversityPress；M.J.Gait(Editor)，1984，OligonucleotideSynthesisAPracticalApproach，IrlPress；D.M.J.LilleyandJ.E.Dahlberg，1992，MethodsofEnzymologyDNAStructurePartASynthesisandPhysicalAnalysisofDNAMethodsinEnzymology，AcademicPress；UsingAntibodiesALaboratoryManualPortableProtocolNO.IbyEdwardHarlow，DavidLane，EdHarlow(1999，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ISBN0-87969-544-7)；AntibodiesALaboratoryManualbyEdHarlow(Editor)，DavidLane(Editor)(1988，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ISBN0-87969-314-2)，1855，Lars-IngeLarsson「ImmunocytochemistryTheoryandPractice」，CRCPressinc.，Bacaraton，Florida，1988，ISBN0-8493-6078-1，JohnD.Pound(ed)；「ImmunochemicalProtocols，vol80」，intheseries「MethodsinMolecularBiology」，HumanaPress，Totowa，NewJersey，1998，ISBN0-89603-493-3，HandbookofDrugScreening，editedbyRamakrishnaSeethala，PrabhavathiB.Femandes(2001，NewYork，NY，MarcelDekker，ISBN0-8247-0562-9)；LabRefAHandbookofRecipes，Reagents，andOtherReferenceToolsforUseattheBench，EditedJaneRoskamsandLindaRodgers，2002，ColdSpringHarborLaboratory，ISBN0-87969-630-3；andTheMerckManualofDiagnosisandTherapy(17thEdition，Beers，M.H.，andBerkow，R，Eds，ISBN0911910107，JohnWileySons)。每篇文獻都包含在本文作為參考。GPR12多肽本文術語「多肽」指任何肽或部分，其包含兩或多個胺基酸，它們通過肽鍵或修飾的肽鍵即肽等排體互相連接。「多肽」指短鏈，通常指肽，寡肽或寡聚體，通常指蛋白質。多肽可包含除所述20種基因編碼的胺基酸以外的胺基酸。「多肽」包括通過天然過程諸如翻譯後加工或通過本領域已知的化學修飾技術修飾的胺基酸序列。所述修飾在基礎教科書種較好地描述，並在專論中更為詳細地描述，以及在大量研究文獻中也有描述。修飾可出現在多肽中的任何位置，包括肽主鏈，胺基酸側鏈，以及氨基或羧基末端。將理解同種類型的修飾可以相同或不同程度存在給定多肽中的數個位點。同樣，給定的多肽也含有許多類型的修飾。作為泛化的結果，多肽可以是分支狀的(遍在蛋白化的結果)，可以是環形的，有或無分支。環形、分支狀及分支環形多肽可以得自翻譯後的天然加工或者可用合成方法來製備。所述修飾包括乙醯化、醯化、ADP-核糖基化、醯胺化、生物素化、共價連接黃素、共價連接亞鐵血紅素部分、共價連接核苷酸或核苷酸衍生物、共價連接脂類或脂類衍生物、共價連接磷脂酸肌醇(phosphotidylinositol)、交聯、環化、形成二硫鍵、去甲基化、生成共價交聯、生成胱氨酸、生成焦穀氨酸、甲醯化、γ-羧化、糖基化、GPI錨定形成、羥基化、碘化、甲基化、豆蔻醯化、氧化、蛋白酶處理、磷酸化、異戊二烯化、外消旋化、硒代化(selenoylation)、磺化、轉運-RNA介導的蛋白添加胺基酸如精氨酸化，以及遍在蛋白化。見例如，Proteins-StructureandMolecularProperties，2ndEd.，T.E.Creighton，W.H.FreemanandCompany，NewYork，1993andWold，F.，PosttranslationalProteinModificationsPerspectivesandProspects，pgs.1-12inPosttranslationalCovalentModificationofProteins，B.C.Johnson，Ed.，AcademicPress，NewYork，1983；Seifter，etal.，「Analysisforproteinmodificationsandnonproteincofactors」，MethEnzymol(1990)182626-646andRattan，etal.，「ProteinSynthesisPosttranslationalModificationsandAging」，AnnNYAcadSci(1992)66348-62。本發明術語「變體」，「同源物」，「衍生物」或「片段」指來自序列或對序列的任何一或多個胺基酸取代，改變，修飾，置換，缺失或添加。除非另有說明，參見「GPR12」以及GPR12的變體，同源物，衍生物和片段。當參照受體諸如GPR12的「受體活性」或受體的「生物活性」時，這些術語意圖指GPR12受體的代謝或生理功能，包括相似的活性或改良的活性或與降低的不良副作用相關的活性。還包括GPR12受體的抗原或免疫原活性。GPCR活性的實例以及檢測和定量這些活性的方法是本領域已知的，並在本發明其它部分詳述。術語「缺失」定義為核苷酸和胺基酸序列的改變，其中一或多個核苷酸和胺基酸殘基分別缺失。本文術語「插入」和「添加」指核苷酸和胺基酸序列的改變，其導致與天然存在的物質相比，一或多個核苷酸或胺基酸殘基的添加。本文術語「取代」是一或多種核苷酸或胺基酸分別被不同的核苷酸或胺基酸取代的結果。本發明的GPR12多肽也可具有胺基酸的缺失，插入或取代，其在功能等同的胺基酸序列中產生沉默改變並導致功能對等的胺基酸序列。有意的胺基酸可基於殘基的極性，電荷，溶解性，疏水性，親水性和/和兩親性的相似性進行。例如，帶負電的胺基酸包括天冬氨酸和穀氨酸；帶正電的胺基酸殘基包括賴氨酸和精氨酸，以及具有非帶電急性頭基團的胺基酸具有相似的疏水值包括亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，甘氨酸，丙氨酸，天冬醯胺，穀氨醯胺，絲氨酸，苯丙氨酸以及酪氨酸。GPR12核苷酸和多核苷酸「多核苷酸」通常是指任意多核糖核酸(RNA)或多脫氧核糖核酸(DNA)，可以是未經修飾的或者修飾後的RNA或DNA。「多核苷酸」包括，但不限於，單鏈及雙鏈DNA，DNA為單鏈和雙鏈區的混合體，單鏈及雙鏈RNA，以及由單鏈和雙鏈區形成的RNA混合體，包含DNA和RNA的雜合分子，所述DNA和RNA可以是單鏈或更通常為雙鏈或者單鏈及雙鏈區的混合體。此外，「多核苷酸」是指三鏈區，包含RNA或DNA或者同時包含二者。術語「多核苷酸」還包括含1個或多個經修飾的鹼基的DNA或RNA以及為穩定或其他原因對骨架修飾後的DNAs或RNA。「經修飾的」鹼基包括，例如三苯甲基化的(tritylated)鹼基以及肌苷(inosine)等非常見鹼基。可對DNA及RNA作多種修飾；因此「多核苷酸」包括自然界中常見的多核苷酸的化學、酶促或代謝方式修飾的形式，以及以病毒及細胞為特徵的化學形式DNA及RNA。「多核苷酸″還包括相對短的多核苷酸，通常稱為寡核苷酸。本領域技術人員應理解多種核苷酸序列可編碼相同的多肽，這是遺傳密碼簡併性的結果。本文術語「核苷酸序列」指核苷酸序列，寡核苷酸序列，多核苷酸序列以及其變體，同源物，片段和衍生物(諸如其部分)。核苷酸序列可以是基因組或合成或重組來源的DNA或RNA，其可為雙鏈和單鏈的，而無論其代表有義或是反義鏈或其組合。術語核苷酸序列可通過利用重組DNA技術製備(例如重組DNA)。優選，術語「核苷酸序列」指DNA。本發明術語「變體」，「同源物」，「衍生物」或「片段」包括來自或對GPR12核苷酸序列的一(或多個)核酸的任何取代，改變，修飾，置換，缺失或添加。除非另有說明，參照「GPR12」和「GPR12」包括參照GPR12的所述變體，同源物，衍生物和片段。GPR12的表達測定法為了設計用於治療GPR12相關疾病的有用治療劑，確定GPR12(無論是野生型和特定的突變體)的表達圖譜是有用的。因此，本領域已知的方法可用於確定器官，組織和細胞類型(以及發育階段)，其中表達有GPR12。例如，可進行常規和「電子」Northern。反轉錄酶PCR(RT-PCR)也可用於檢測GPR12基因或突變體的表達。測定GPR12的表達圖譜的更為敏感的方法包括RNAse保護試驗，如本領域已知那樣。Northern分析是實驗室技術，用於檢測基因轉錄物的存在，涉及使標記的核苷酸序列與膜的雜交，所述膜上結合有來自具體細胞類型和組織的RNA。(Sambrook，supra，ch.7andAusubel，F.M.，etal.supra，ch.4and16.)利用BLAST的類似計算機技術(「電子Northern」)可用於在核苷酸資料庫諸如GenBank和LIFESEQ資料庫(IncytePharmaceuticals)中搜索相同和相關的分子。這種類型的分析的優勢在於它們比基於膜的多重雜交更快。此外，計算機搜索的敏感性可被修飾以確定是否任何具體的匹配被分類為準確或同源。本發明的多核苷酸和多肽，包括上述探針，可用作研究試劑以及物質，用於發現對動物和人疾病的治療和診斷，如本發明文件中其它部分詳述的。GPR12多肽的表達GPR12多肽的表達是GPR12抗體的產生所需的，所述抗體可作為本文所述的GPR12的激動劑和拮抗劑其作用。為了表達生物活性GPR12多肽，編碼GPR12的核苷酸序列或其類似物，變體或衍生物可被插入適宜的表達載體，即含有所插入的編碼序列的轉錄和翻譯所需的必要元件。本領域技術人員已知的方法被用於構建含有編碼GPR12和適宜轉錄以及翻譯控制元件的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術，合成技術，以及體內基因重組。所述技術描述於Sambrook，J.，etal.，(1989；MolecularCloning，ALaboratoryManual，ch.4，8，and16-17，ColdSpringHarborPress，Plainview，N.Y.)andAusubel，F.M.，etal.，(1995andperiodicsupplements；CurrentProtocolsinMolecularBiology，ch.9，13，and16，JohnWileySons，NewYork，N.Y.)。各種表達載體/宿主系統可用於含有並表達編碼GPR12的序列。這些包括，但不限於，微生物，諸如用重組噬菌體，質粒和粘粒DNA表達載體轉化的細菌；用酵母表達載體轉化的酵母；用病毒表達載體(例如杆狀病毒)感染的昆蟲細胞系統；用病毒表達載體轉化的植物細胞系統(例如花椰菜花葉病毒(CaMV)或菸草花葉病毒(TMV))或利用細菌表達載體(例如TiorpBR322質粒)；或動物細胞系統。本發明不受所用宿主細胞的限制。「控制元件」或「調控序列」是載體的未翻譯的區域(即增強子，啟動子，5』和3』未翻譯區)，其與宿主細胞蛋白作用以執行轉錄和翻譯。所述元件的長度和特異性不同。根據所用的載體系統和宿主，任何數目的適宜轉錄和翻譯元件，包括組成型和可誘導型轉錄和翻譯啟動子，可以使用。例如，當在細菌系統中克隆時，誘導型啟動子諸如BLUESCRIPT噬粒(Stratagene，LaJolla，Calif.)或PSPorT1質粒(GIBCO/BRL)的雜合lacZ啟動子等可以使用。杆狀病毒多角體蛋白啟動子可用於昆蟲細胞。源自植物細胞基因組的啟動子或增強子(例如熱休克，RUBISCO，和儲藏蛋白基因)或來自植物病毒的(例如病毒啟動子或前導序列)可克隆入所述載體。在哺乳動物細胞系統中，來自哺乳動物基因或來自哺乳動物病毒的啟動子是優選的。如果需要產生含有多個拷貝的GPR12多肽編碼序列的細胞系，基於SV40或EBV的載體可與適當的選擇標記一起使用。在細菌系統中，多種表達載體可根據對於GPR12多肽的目的用途來選擇。例如，當需要大量GPR12多肽以誘導抗體時，可以使用指導可輕易純化的融合蛋白的高水平表達的載體。所述載體包括，但不限於，多功能大腸桿菌克隆和表達載體諸如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中編碼GPR12多肽的序列被連入載體，與氨基末端Met序列以及隨後的β-半乳糖苷酶的7個殘基相連，使得產生雜合蛋白，pIN載體(VanHeeke，G.andS.M.Schuster(1989)J.Biol.Chem.2645503-5509)等。pGEX載體(Promega，Madison，Wis.)也可用於表達異源多肽作為與穀胱苷肽S轉移酶(GST)的融合蛋白。通常，所述融合蛋白可溶並可通過吸附於穀胱苷肽-瓊脂糖珠從裂解的細胞輕易純化，然後在游離穀胱苷肽存在下洗脫。在所述系統中製備的蛋白可設計成包含肝素，凝血酶，或因子XA蛋白酶裂解位點，使得目的克隆的多肽可從GST部分隨意釋放。在酵母釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中，多種含有構成型或誘導型啟動子的載體，諸如alpha因子，乙醇氧化酶，和PGH可以使用。綜述參見Ausubel(supra)和Grantetal.(1987；MethodsEnzymol.153516-544)。使用植物表達載體的情況下，GPR12多肽編碼序列的表達可通過多種啟動子中的任何啟動子驅動。例如，病毒啟動子諸如CaMV35S和19S啟動子可單獨使用或與來自TMV的omega前導序列聯用。(Takamatsu，N.(1987)EMBOJ.6307-311.)可選，可以使用植物啟動子諸如RUBISCO小亞基或熱休克啟動子。(Coruzzi，G.etal.(1984)EMBOJ.31671-1680；Broglie，R.，etal.，(1984)Science224838-843；andWinter，J.，etal.，(1991)ResultsProbl.CellDiffer.1785-105.)這些構建體可通過直接DNA轉化或病原介導的轉染而被導入植物細胞。所述技術在多種常規可得的綜述中描述。(See，forexample，Hobbs，S.orMurry，LE.inMcGrawHillYearbookofScienceandTechnology(1992)McGrawHill，NewYork，N.Y.；pp.191-196.)。昆蟲系統也可用於表達GPR12多肽。例如，一種所述系統中，苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographacalifomicanuclearpolyhedrosisvirus)(AcNPV)用作載體在秋粘蟲(Spodopterafrugiperd)細胞或擬尺蠖幼蟲(Trichoplusialarvae)中表達外來基因。編碼GPR12的序列可被克隆入病毒的非必需區域，諸如多角體蛋白基因，並置於多角體蛋白啟動子的控制之下。將GPR12多肽成功插入將使得多角體蛋白基因失活，並產生缺乏包膜蛋白的重組病毒。所述重組病毒隨後可用於感染例如秋粘蟲細胞或擬尺蠖幼蟲，其中表達有GPR12多肽。(Engelhard，E.K.，etal.，(1994)Proc.Nat.Acad.Sci.913224-3227.)在哺乳動物宿主細胞中，多種基於病毒的表達系統可以使用。如果使用腺病毒作為表達載體，編碼GPR12多肽的序列可連入腺病毒轉錄/翻譯複合體，其由晚期啟動子和三分前導序列組成。插入病毒基因組的非必需E1或E3區可用於獲得能在感染的宿主細胞中表達GPR12多肽的存活病毒。(Logan，J.andT.Shenk(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.813655-3659.)此外，轉錄增強子，諸如勞斯肉瘤病毒(RSV)增強子，可用於增強在哺乳動物宿主細胞中的表達。人類人工染色體(HAC)也可用於遞送大於質粒中所包含並表達的DNA片段的較大DNA片段。約6kb-10Mb的HAC被構建並經由常規遞送方法遞送(脂質體，多聚陽離子氨基聚合物或小泡)用於治療目的。具體起始信號也可用於實現GPR12多肽編碼序列的更為有效的翻譯。所述信號包括ATG起始密碼子和相鄰序列。在編碼GPR12多肽的序列及其起始密碼子以及上遊序列被插入適宜表達載體中的情況下，無需其它轉錄和翻譯對照信號。然而，在僅僅插入編碼序列或其片段的情況下，外源翻譯控制序列包括ATG起始密碼子應被提供。此外，起始密碼子應當位於正確的讀框中以保證完整插入物的翻譯。外源翻譯元件和起始密碼子可以是各種來源的，包括天然和合成的。表達效率可通過包含適於所用具體細胞系統的增強子而得以增強，諸如文獻中描述的那些。(Scharf，D.，etal.，(1994)ResultsProbl.CellDiffer.20125-162.)。此外，可根據宿主細胞株調節插入序列的表達或以所需方式加工所表達的蛋白的能力來選擇。多肽的所述修飾包括，但不限於，乙醯化，羧化，糖基化，磷酸化，脂質化，和醯化。切割「前原」形式的蛋白質的翻譯後加工也可用於促進正確的插入，摺疊，和/或功能。具有特異性細胞機制和翻譯後活性的特徵機制的不同宿主細胞(例如CHO，HeLa，MDCK，HEK293，和WI38)，可得自美國典型培養物保藏中心(ATCC，Bethesda，Md.)並可被選擇用於保證對外來蛋白的正確修飾和加工。對於長期、高產量的重組蛋白製備，穩定的表達是優選的。例如，能夠穩定表達GPR12GPCR的細胞系可利用表達載體轉化，其中含有病毒複製起點和/或內源表達元件以及選擇標記基因，它們位於相同或分離的載體上。導入所述載體之後，允許細胞在富集的培養基中生長約1-2天，然後轉移到選擇培養基。可選擇標記的目的是賦予對選擇的抗性，其存在允許成功表達導入的序列的細胞的生長和回收。穩定轉化的細胞的抗性克隆可利用適於該細胞類型的組織培養技術增殖。任何數目的選擇系統可用於回收轉化的細胞系。這些包括，但不限於，單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶基因(Wigler，M.etal.(1977)Cell11223-32)和腺苷酸磷酸核糖基轉移酶基因(Lowy，I.，etal.，(1980)Cell22817-23)，其可分別用於tk-或apr-細胞中。此外，抗代謝物，抗生素或除莠劑抗性可用作選擇的基礎。例如，dhfr賦予對氨甲蝶呤的抗性(Wigler，M.，etal.，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.773567-70)；npt賦予對氨基糖苷類新黴素和G-418的抗性(Colbere-Garapin，F.，etal.，(1981)J.Mol.Biol.1501-14)；和als和pat分別賦予對氯磺隆(chlorsulfuron)和草銨膦(phosphinotricin)乙醯轉移酶的抗性(Murry，supra).也描述了其它選擇性基因，例如，trpB，其允許細胞利用吲哚取代色氨酸，或hisD，其允許細胞利用組氨醇(histinol)取代組氨酸。(Hartman，S.C.andR.C.Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.858047-51.)最近，可見(visible)標記物的利用獲得了普及，利用諸如花青苷，β-葡糖醛酸酶及其底物GUS，和螢光素酶及其底物蟲螢光素。這些標記物不僅可用於鑑定轉化物，也可用於定量由於具體載體系統導致的瞬時或穩定的蛋白表達(Rhodes，C.A.，etal.，(1995)MethodsMol.Biol.55121-131.)。儘管標記基因表達的存在/缺失提示目的基因也存在，所述基因的存在和表達可能需要被證實。例如，如果編碼GPR12多肽的序列被插入標記基因序列中，含有GPR12多肽的編碼序列的經轉化的細胞可通過缺乏標記基因功能而得以鑑定。可選，標記基因可與GPR12多肽編碼序列串聯，並在單個啟動子的控制之下。標記基因應答於誘導和選擇的表達通常也指示串聯的基因的表達。可選，含有編碼GPR12多肽的核酸序列並表達GPR12的宿主細胞可通過本領域已知的多種方法鑑定。這些方法包括，但不限於，DNA-DNA或DNA-RNA雜交以及蛋白生物測定或免疫測定技術，其包括基於膜，溶液，或晶片的技術，用於檢測和/和定量核酸和蛋白序列。編碼GPR12多肽的多核苷酸序列的存在可通過DNA-DNA或DNA-RNA雜交檢測或利用探針或編碼GPR12GPCR的多核苷酸的片段來擴增。基於核酸擴增的測定法涉及利用寡核苷酸或寡聚物，基於編碼GPR12多肽的序列以檢測含有編碼GPR12的DNA或RNA的轉化體。多種用於檢測和測定GPR12表達的方案，其利用蛋白特異性多克隆或單克隆抗體，是本領域已知的。所述技術的實例包括酶聯免疫吸附測定法(ELISA)，放射免疫測定法(RIA)，以及螢光活化的細胞分選(FACS)。利用對GPR12上的兩個非幹擾型表位反應的單克隆抗體的雙位點型、基於單克隆的免疫測定法是優選的，但是也可採用競爭結合試驗。這些和其它測定法在本領域較好地描述，例如在Hampton，R.etal.(1990；SerologicalMethods，aLaboratoryManual，SectionIV，APSPress，StPaul，Minn.)和Maddox，D.E.，etal.，(1983；J.Exp.Med.1581211-1216)中。多種標記和偶聯技術是本領域已知的，並可用於各種核酸和胺基酸測定法中。產生標記的雜交和PCR探針以檢測與編碼GPR12的多核苷酸相關的序列的手段包括寡標記(oligolabelling)，缺口翻譯(nicktranslation)，末端標記(end-labelling)，或利用標記的核苷酸的PCR擴增。可選，編碼GPR12的序列或其片段可克隆入載體用於產生mRNA探針。所述載體是本領域已知的，並且可購得，並通過加入適宜的RNA聚合酶諸如T7，T3，或SP6以及標記的核苷酸可用於在體外合成RNA探針。這些方法可利用多種可購得的試劑盒進行，諸如PharmaciaUpjohn(Kalamazoo，Mich.)，Promega(Madison，Wis.)，andU.S.BiochemicalCorp.(Cleveland，Ohio)提供的那些。可用於易化檢測的適宜的報導分子或標記包括放射性核素，酶，螢光物質，化學螢光物質，或發色物質，以及底物，輔因子，抑制物，磁性顆粒等。用編碼GPR12的核苷酸序列轉化的宿主細胞可在適於從細胞培養物表達並回收蛋白的條件下培養。經轉化的細胞產生的蛋白可位於細胞膜內，被分泌或包含在細胞內，根據序列和/和所用載體而定。本領域技術人員理解，含有編碼GPR12的多核苷酸的表達載體被設計為包含信號序列，其指導GPR12通過原核或真核細胞膜的分泌。其它結構可用於將GPR12的編碼序列連接於編碼促進可溶蛋白的純化的多肽結構域的核苷酸序列。所述純化促進結構域包括，但不限於，金屬鰲合肽，諸如組氨酸-色氨酸模塊，其允許在固定的金屬上的純化，以及允許在固定的免疫球蛋白上純化的蛋白A結構域，以及用於FLAGS延伸/親和純化系統中的結構域(ImmunexCorp.，Seattle，Wash.)。可裂解接頭序列，諸如對因子XA和腸激酶特異的那些(Invitrogen，SanDiego，Calif.)包含在純化結構域和GPR12GPCR編碼序列之間可用於促進純化。一種所述的表達載體提供含有GPR12以及編碼硫氧還蛋白或腸激酶裂解位點前的6組氨酸殘基的融合蛋白的表達。所述組氨酸殘基促進在固定的金屬離子親和層析上的純化(IMIAC；describedinPo大鼠h，J.，etal.，(1992)Prot.Exp.Purif.3263-281)，腸激酶裂解位點提供從融合蛋白純化GPR12的方法。含有融合蛋白的載體的討論見Kroll，D.J.，etal.，(1993；DNACellBiol.12441-453)。GPR12的片段不僅可以通過重組製備產生，也可以通過直接肽合成利用固相技術製備。(MerrifieldJ.(1963)J.Am.Chem.Soc.852149-2154.)蛋白合成可通過人工技術或自動化進行。自動化的合成可例如利用AppliedBiosystems431A肽合成儀進行(PerkinElmer)。GPR12的各種片段可分別合成，然後組合以產生全長分子。轉基因動物(a)敲除本發明的另一方面，提供了GPR12敲除哺乳動物，其包含一或多種細胞，其中GPR12多肽是功能失活的。本發明的GPR12敲除動物可作為GPR12基因或該基因的任何部分的功能破壞的結果產生，包括GPR12基因的一或多種功能喪失型突變，包括GPR12基因的缺失或取代。所述突變包括單點突變，並可靶向GPR12的編碼或非編碼區。優選，所述敲除動物是非人哺乳動物，諸如豬，綿羊或嚙齒類動物。最優選所述敲除動物是小鼠或大鼠。所述敲除動物可用於篩選方法中以鑑定GPR12的激動劑和/或拮抗劑，以及檢測它們作為體內疾病療法的效力。例如，經改造GPR12產生缺乏的敲除動物可用於試驗中以鑑定GPR12的激動劑和/或拮抗劑。一種試驗被設計為評估潛在的藥物(候選配體或化合物)以確定其是否在缺乏GPR12受體的條件下產生生理反應。這可通過將藥物給予上述敲除動物來實現，然後測定所述動物的特定反應。任何生理參數可以這種方式測定。源自GPR12敲除動物的組織可用於受體結合實驗中以測定潛在的藥物(候選配體或化合物)是否與GPR12受體結合。所述試驗可通過從經改造GPR12受體生成缺乏的敲除動物獲得第一受體製備物以及從已知結合任何鑑定的GPR12配體或化合物獲得第二受體製備物來進行。通常，所述第一和第二製備物在所有方面都類似除外它們的來源。例如，如果在實驗中使用來自敲除動物(諸如上下文所述的)的腦組織，來自正常(野生型)動物的可比腦組織也可用作第二受體製備物的來源。每種受體製備物與已知結合GPR12受體的配體一起，在單獨或存在候選配體或化合物的條件下保溫。優選，所述候選配體或化合物將在多種濃度進行檢測。對於第一和第二受體製備物，測定已知配體的結合被受試化合物取代的程度。來自敲除動物的組織可直接用於試驗或所述組織可被加工以分離膜或膜蛋白，其本身用於所述試驗。優選的敲除動物是小鼠。所述配體可利用任何適於結合試驗的手段標記。這將包括，但不限於，放射活性標記，酶促標記，螢光標記或化學發光標記(以及下文進一步詳述的其它標記技術)。此外，GPR12受體的拮抗劑可通過將候選化合物等給予表達有功能的GPR12的野生型動物以及被鑑定為顯示任何與GPR12受體功能的表達的降低或消除相關的表型特徵的動物來鑑定。非人敲除動物的產生方法在下文更為詳細的描述。轉基因構建體可被導入動物的生殖細胞系以製備敲除哺乳動物。例如，所述構建體的一個或多個拷貝可通過標準轉基因技術摻入哺乳動物胚胎的基因組。在示例性實施方案中，本發明的敲除非人動物通過將轉基因導入非人動物的生殖系來製備。各種發育階段的胚胎靶細胞可用於導入轉基因。根據胚胎靶細胞的發育階段可採用不同方法。選擇用於實施本發明的任何動物的具體細胞系根據該動物總體健康狀況好，胚胎生長良好，胚胎內的原核(pronuclear)可見性好，以及生殖健康良好來選擇。此外，單體型是明顯的因素。將轉基因導入胚胎可通過本領域已知的任何方法實現，諸如顯微注射，電穿孔或脂質轉染。例如，GPR12受體轉基因可通過以下方法導入哺乳動物將所述構建體顯微注射到受精的哺乳動物卵中導致所述構建體的一或多個拷貝被保持在發育中的哺乳動物細胞內。將轉基因構建體導入受精卵之後，所述卵可在體外保溫不同時間，和/或再植入代理宿主。體外保溫到成熟是本領域範圍之內的。一種常規方法是在體外保溫所述胚胎約1-7天，根據物種而不同，然後將它們再植入代理宿主中。可通過對組織片段的Southern印跡分析來檢測轉基因操作的胚胎的子代中所述構建體的存在。如果外源克隆的構建體的一或多個拷貝保持整合入所述敲除胚胎的基因組，可能確定攜帶轉基因添加的構建體的永久敲除哺乳動物系。敲除改變的哺乳動物的幼崽可在出生後檢測所述構建體向後代基因組中的摻入。優選，該實驗通過使對應編碼所需重組蛋白產物或其片段的DNA序列的探針雜交到來自子代的染色體物質上來實現。發現基因組中含有至少一個拷貝的所述構建體的那些哺乳動物子代生長至成熟。為了本發明的目的，受精卵主要是雙倍體細胞的形成，其能夠發育成完整的生物體。通常，受精卵由含有天然或人工形成的細胞核組成，通過將來自一或多個配子的兩個單倍體細胞核進行融合。因此，配子細胞核必需是能天然相容的，即產生能夠進行分化並發育成有功能的生物體的存活合子的那些。通常，整倍體合子是優選的。如果獲得非整倍體合子，染色體的數目變化就配子來源的生物體的整倍體數目而言應不超過1個。除了類似的生物考慮，物理因素也控制可加入合子細胞核或形成部分合子細胞核的遺傳物質的外源遺傳物質的量(例如體積)。如果沒有去除遺傳物質，可加入的外源遺傳物質的量受到將被吸收而不被物理破壞的量的限制。通常，插入的外源遺傳物質的體積將不超過約10皮升。加入的物理效應必需不大到物理破壞所述合子的生存力的程度。DNA序列的數量和品種的生物限制將根據具體的合子以及所述外源遺傳物質的功能而不同，並且對於本領域技術人員而言是顯而易見的，這是由於產生的合子的遺傳物質，包括外源遺傳物質，必需在生物上能夠啟動並保持合子分化並發育成功能生物體。加入合子的轉基因構建體的拷貝數量有賴於加入的外源遺傳物質的總量，並將是能夠使得遺傳轉化發生的量。理論上，僅僅需要一個拷貝；然而，通常利用多個拷貝，例如1,000-20,000個拷貝的轉基因構建體，以保證一個拷貝是有功能的。根據本發明，通常每種插入的外源DNA序列具有超過一個的功能拷貝對於增強外源DNA序列的表型表達是有利的。允許加入外源遺傳物質到細胞核遺傳物質中的任何技術可被利用，只要其對細胞，細胞核膜和其它存在的細胞或遺傳結構沒有破壞性。所述外源遺傳物質優選通過顯微注射被插入核遺傳物質。細胞和細胞結構的顯微注射是已知的並可用於本領域。再植入利用標準方法實施。通常，代理宿主被麻醉，將胚胎插入輸卵管。插入具體宿主的胚胎的數量根據不同物種而不同，但通常與所述物種天然產生的後代數目相當。可通過任何適宜方法篩選代理宿主的敲除後代中的轉基因的存在和/或表達。篩選通常通過Southern和Nothern印跡分析，利用與該轉基因的至少一部分互補的探針實施。利用針對所述轉基因編碼的蛋白的抗體的Western印跡分析可作為篩選所述轉基因產物的存在的可選或其它方法。通常，DNA自尾組織製備，並通過Southern分析或PCR來分析所述轉基因。可選，據信表達所述轉基因水平最高的組織和細胞利用Southern分析和PCR檢測所述轉基因的存在或表達，但是任何組織或細胞類型可用於該分析。用於評估所述轉基因存在的可選或其它方法包括，但不限於，適宜的生物化學測定法諸如酶和/或免疫測定法，針對具體標記物或酶活性的組織學染色，流式細胞分析等。血液的分析也可用於檢測轉基因產物在血液中的存在，以及評估所述轉基因對各種類型的血細胞以及其它血液成分的水平的影響。逆轉錄病毒感染也可用於將轉基因導入非人動物。發育中的非人胚胎可在體外培養到胚泡階段。在該時期內，分裂球可用作逆轉錄病毒感染的靶(Jaenich，R.(1976)PNAS731260-1264)。分裂球的有效感染通過酶處理去除透明帶(zonapellucida)獲得(ManipulatingtheRatEmbryo，Hoganeds.(ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，1986)。可用於將轉基因導入的病毒感染系統通常是攜帶所述轉基因的、複製缺陷型逆轉錄病毒(Jahneretal.(1985)PNAS826927-6931；VanderPuttenetal.(1985)PNAS826148-6152)。轉染可通過在病毒生成細胞的單層上培養分裂球輕易且有效地獲得(VanderPutten，supra；Stewart，etal.，(1987)EMBOJ.6383-388)。可選，感染可在以後的階段進行。病毒或病毒生成細胞可被注入囊胚腔(Jahner.，etal.，(1982)Nature298623-628)。大多數初始動物對於轉基因而言是嵌合的，這是由於摻入僅僅在形成轉基因非人動物的細胞亞組中出現。此外，初始動物可含有多種在基因組不同位置的轉基因逆轉錄病毒插入物，其通常將在子代中分離。此外，也可能通過子宮內逆轉錄感染孕中期胚胎而將轉基因導入生殖細胞系(Jahner.，etal.，(1982)見上文)。第三種類型的轉基因導入用靶細胞是胚胎幹細胞(ES)。ES細胞可獲自培養在體外的植入前的胚胎並與胚胎融合(Evans.，etal.，(1981)Nature292154-156；Bradley.，etal.，(1984)Nature309255-258；Gossler.，etal.，(1986)PNAS839065-9069；andRobertson，.etal.，(1986)Nature322445-448)。轉基因可通過DNA轉染或逆轉錄病毒介導的轉導有效導入ES細胞。所述轉化的ES細胞此後可與來自非人動物的胚泡結合。隨後，ES細胞定植在胚胎並對產生的嵌合動物的生殖系有貢獻。綜述參見Jaenisch，R.(1988)Science2401468-1474。本發明還涉及用於功能破壞宿主細胞中的GPR12基因的核酸構建體。所述核酸構建體包括a)非同源取代部分；b)所述非同源取代部分上遊的第一同源區，具有與第一GPR12基因序列基本相同一的核苷酸序列的第一同源區；和c)位於該非同源取代部分下遊的第二同源區，具有與第二GPR12基因序列基本相同的核苷酸序列的第二同源區，所述第二GPR12基因序列具有位於天然存在的內源GPR12基因中的第一GPR12基因序列的下遊的位置。此外，當核酸分子被導入宿主細胞時，所述第一和第二同源區長度足以使得在核酸構建體與該宿主細胞的內源GPR12基因之間進行同源重組。優選實施方案中，非同源取代部分包含表達報導物，優選包括lacZ和陽性選擇表達盒，優選包括新黴素磷酸轉移酶基因，其可操作連接於調節元件。GPR12GPCR缺陷轉基因動物可通過以下方法產生(a)GPR12基因靶向型載體的構建小鼠GPR12基因組克隆分離自獲自HGMP(Hinxton，UK)的小鼠大插入物PAC文庫，所述分離利用自部分預測的小鼠開放讀框cDAN序列(SEQIDNO4)擴增的探針序列，利用標準技術進行。分離的小鼠GPR12基因組克隆隨後利用小寡核苷酸探針和標準技術在GPR12基因的區域中限制作圖。對小鼠基因組基因座進行部分測序使得能夠設計同源臂以克隆入靶向型載體。DNA的兩個區域(通常大小為1-5kb，從待缺失開放讀框的區域的任何一側起)，稱為5』和3』同源臂，通過PCR擴增並克隆入靶向型載體。這些臂的位置被選擇為使得同源重組事件將通過缺失至少七個跨膜橫跨(spanning)區域來功能破壞GPR12基因。製備靶向型載體，其中缺失的GPR12序列被非同源序列取代，所述非同源序列由選擇盒上遊的內源基因表達報導物(框-獨立的LacZ基因)啟動的新黴素磷酸轉移酶(neo)基因組成，所述非同源序列以與GPR12基因相同的方向排列。(b)胚胎幹細胞的轉染和分析胚胎幹細胞(EvansandKaufman，1981)培養在新黴素抗性胚胎纖維母細胞培養層上，生長於Dulbecco’s改良的Eagles培養基中，所述培養基中補充有20％胎牛血清，10％新生牛血清，2mM穀氨醯胺，非必需胺基酸，100μM2-巰基乙醇和500u/ml白血病抑制因子。培養基每天更換，ES細胞每三天傳代一次。5×106ES細胞用5μg線性化的質粒通過電穿孔(25μF電容(capacitance)和400伏特)轉染。電穿孔24小時以後，轉染的細胞在培養基中培養9天，所述培養基含有200μg/ml新黴素。將克隆挑入96孔板，用PCR篩選之前進行複製和擴增，以鑑定其中在內源GPR12基因和靶向型構建體之間發生了同源重組的克隆。所鑑定的陽性克隆比例通常為1-5％。擴增這些克隆以允許複製子被冷凍，製備足夠高的量的DNA用於利用外部5』和3』探針通過Southern印跡證實靶向型事件，所有均利用標準方法(Russ，etal.，2000，Nature2000Mar2；404(6773)95-9)。(c)GPR12缺陷小鼠的產生使C57BL/6雌性和雄性小鼠交配並分離孕3.5天的胚泡。10-12個來自所選克隆的細胞被注入每個胚泡，7-8個胚泡被植入假孕F1雌性小鼠的子宮。出生的嵌合同窩幼仔含有多隻高水平(達100％)的具深淺環紋的雄性(深淺環紋外皮顏色指示來自靶向的克隆的細胞後代的分布)。雄性嵌合體與雌性以及MF1和129小鼠交配，種系傳播分別通過深淺環紋外皮顏色以及PCR基因分型來確定。其它非人轉基因動物本發明還涉及非人轉基因動物，其導致GPR12受體的過表達或低表達(與適宜對照相比)。所述動物可用於鑑定受體功能的激動劑和拮抗劑，其也為治療性的。抗體如本文所述的抗體可用作GPR12多肽的激動劑或拮抗劑。為本發明的目的，除非具體指明為相反的含義，術語「抗體」包括但不限於，多克隆，單克隆，嵌合，單鏈，Fab片段以及Fab表達文庫產生的片段。所述片段包括完整抗體的片段，其保持對靶物質的結合活性，Fv，F(ab』)和F(ab』)2片段，以及單鏈抗體(scFv)，融合蛋白和其它合成蛋白，其包含抗體的抗原結合片段。抗體及其片段可為人源化的抗體，例如EP-A-239400所述。此外，具有完整人可變區(或其片段)的抗體(例如US專利5,545,807和6,075,181中所述)也可使用。中和型抗體，即抑制物質胺基酸序列的生物活性的那些，對於診斷和治療而言尤其優選。抗體也可利用標準技術製備，諸如免疫化和通過利用噬菌體展示文庫。本發明的多肽和肽可用於通過已知技術開發抗體。所述抗體可特異性結合GPR12蛋白和同源物，片段等。如果需要多克隆抗體，選定的哺乳動物(例如小鼠，兔子，山羊，馬等)可用免疫原組合物免疫，所述組合物包含本發明的多肽或肽。根據宿主的物種，各種佐劑可用於加強免疫反應。所述佐劑包括，但不限弗氏(Freund’s)佐劑，礦物凝膠諸如氫氧化鋁，以及表面活性劑諸如溶血卵磷脂pluronic多元醇，多聚陰離子，肽，油乳劑，匙孔血藍蛋白，以及二硝基酚。BCG(卡介苗(BacilliCalmette-Guerin))和短小棒狀桿菌(Corynebacteriumparvum)可用作人佐劑，如其是純化的，可用於將物質胺基酸序列給予免疫受損的個體以刺激系統防禦。收集來自免疫的動物的血清並根據已知方法處理。如果含有可得自本發明多肽表位的多克隆抗體的血清含有針對其它抗原的抗體，所述多克隆抗體可通過免疫親合層析純化。用於製備並加工多克隆抗血清的技術是本領域已知的。為了製備所述的抗體，本發明還提供了本發明的胺基酸序列或其片段，其對其它胺基酸序列半抗原化，在動物或人類中用作免疫原。針對可得自本發明的多肽或肽的表位的單克隆抗體也可通過本領域技術人員輕易製備。通過雜交瘤製備單克隆抗體的常用方法是已知的。永生化的抗體生成細胞系可通過細胞融合產生，並且也通過其它技術諸如利用原癌DNA直接轉化B淋巴細胞，或用EB病毒轉染來產生。可篩選產生的針對眶表位的單克隆抗體的圖譜(panel)的各種性質；即篩選同種型和表位親和力。單克隆抗體可利用任何提供通過連續細胞系培養基中的產生抗體分子的技術來製備。這些包括，但不限於，雜交瘤技術，最初由KoehlerandMilstein(1975Nature256495-497)描述，三交瘤(trioma)技術，人B細胞雜交瘤技術(Kosbor.，etal.，(1983)ImmunolToday472；Cote.，etal.，(1983)ProcNatlAcadSci802026-2030)，EBV-雜交瘤技術(Cole.，etal.，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy，pp.77-96，AlanR.Liss，Inc.，1985)。此外，可採用被開發用於製備「嵌合抗體」的技術，即小鼠抗體基因與人抗體基因的拼接以獲得具有適當抗原特異性以及生物活性的分子(Morrison.，etal.，(1984)ProcNatlAcadSci816851-6855；Neuberger.，etal.，(1984)Nature312604-608；Takeda.，etal.，(1985)Nature314452-454)。可選，被描述用於製備單鏈抗體的技術(美國專利4,946,779)可用於製備物質特異性單鏈抗體。針對來自本發明的多肽和肽的表位的單克隆和多克隆抗體，具體用於診斷中，其中中和型的那些抗體可用於被動免疫。具體地，單克隆抗體可用於激發抗獨特型抗體。抗獨特型抗體是攜帶物質的「內部」圖像的免疫球蛋白和/或需要針對其的保護的藥劑。用於激發抗獨特性抗體的技術是本領域已知的。這些抗獨特型抗體也可用於治療。抗體也可通過誘導在淋巴細胞群體中的體內生成或通過篩選重組免疫球蛋白文庫或高特異性結合藥劑的圖如Orlandi.，etal.，(1989，ProcNatlAcadSci863833-3837)，以及WinterG和MilsteinC(1991；Nature349293-299)公開的。含有多肽或肽的特異性結合位點的抗體片段也可產生。例如，所述片段包括，但不限於F(ab』)2片段，其可通過抗體分子的胃蛋白酶消化產生，以及Fab片段，其可通過還原F(ab』)2片段的二硫橋產生。可選，Fab表達文庫可被構建以允許快速並容易地鑑定具有所需特異性的單克隆Fab片段(HuseWD.，etal.，(1989)Science2561275-1281)。用於製備單鏈抗體的技術(美國專利4,946,778)也可用於製備本發明多肽的單鏈抗體。轉基因小鼠或其它生物體包括其它哺乳動物也可用於表達人源化的抗體。因此，本發明人考慮GPR12抗體或包含其的組合物，具體可用於治療神經性、生殖激素相關的以及其它疾病。所述神經疾病包括但不限於以下疾病中的任何一或多種阿爾茨海默氏症以及相關疾病，帕金森氏症，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動症，運動神經元疾病，以及神經元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛以及痛覺過敏，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發性骨髓瘤和糖尿病。診斷實驗另一方面，本發明提供診斷選自下組的疾病或病症的方法阿爾茨海默氏症以及相關疾病，帕金森氏症，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動症，運動神經元疾病，以及神經元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發性骨髓瘤和糖尿病，包括以下步驟選擇來自待診斷患者的細胞樣品；和比較細胞樣品與一或多種來自健康個體的對照樣品中的GPR12多肽的表達水平和/或功能活性。本發明還涉及利用GPR12多核苷酸，編碼多核苷酸的GPR12肽配體的多核苷酸以及多肽(以及其同源物，變體或衍生物)，作為診斷劑用於診斷或用於基因分析的用途。互補於或能與GPR12核酸(包括同源物，變體和衍生物)雜交的核酸，以及針對GPR12多肽的抗體和GPR12配體多肽可用於所述測定法中。檢測GPR12基因或其它天然配體基因的與功能障礙相關的突變形式將提供診斷工具，其可添加或限定由於GPR12或其天然配體的表達低下，過表達或表達改變導致的疾病或對所述疾病的易感性的診斷。攜帶GPR12基因中的突變的個體(包括控制序列)可通過各種技術在DNA水平檢測。例如，DNA可分離自患者，切GPR12的DNA多態性模式可測定。鑑定的模式與已知患有與GPR12過表達、表達低下或表達異常相關的疾病的患者的對照比較。表達與GPR12相關疾病相關的遺傳多態性模式的患者隨後被鑑定。GPR12基因的遺傳分析可通過本領域已知的任何技術進行。例如，個體可通過測定GPR12等位基因的DNA序列通過RFLP或SNP分析等來篩選。通過檢測GPR12基因序列中的DNA或任何控制其表達的序列中多態性的存在，患者可被鑑定為具有對與GPR12過表達、表達低下或表達異常相關的疾病的遺傳易感性。如此鑑定的患者可隨後被治療以防止GPR12相關疾病的出現，或在GPR12或相關疾病的早期階段更為積極進行以防止疾病的進一步出現或發展。GPR12相關疾病包括阿爾茨海默氏症以及相關疾病，帕金森氏症，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動症，運動神經元疾病，以及神經元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發性骨髓瘤和糖尿病。優選的實施方案中，GPR12相關疾病包括阿爾茨海默氏症以及相關疾病，帕金森氏症，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動症，運動神經元疾病，以及神經元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發性骨髓瘤和糖尿病中的任意一種。本發明進一步公開了試劑盒，其用於鑑定與GPR12相關疾病有關的患者遺傳多態性模式。所述試劑盒包括DNA樣品收集裝置以及用於測定遺傳多肽性模式的裝置，其隨後與對照樣品比較以測定患者對GPR12相關疾病的易感性。也提供用於診斷GPR12相關疾病的試劑盒包含GPR12多肽和/或針對所述多肽(或其片段)的抗體。用於診斷的核酸可獲自受試者的細胞，諸如來自血液，尿液，唾液，組織活檢或屍檢物質。優選的實施方案中，所述DNA獲自來自收集在吸收紙上的患者指血的血細胞。在優選實施方案中，所述血液收集在AmpliCardTM(UniversityofSheffield，DepartmentofMedicineandPharmacology，RoyalHallamshireHospital，Sheffield，EnglandS102JF)上。所述DNA可直接用於檢測或可利用PCR或其它擴增技術進行酶促擴增然後進行分析。可製備靶向目的基因中的特異性多態性DNA區域的寡核苷酸DNA引物使得實現靶序列擴增的PCR反應。RNA或cDNA也可以類似方式用作模板。自模板DNA擴增的DNA序列隨後利用限制酶分析以確定存在擴增的序列中的遺傳多態性，並由此提供患者中的遺傳多態性圖譜。限制片段長度可通過凝膠分析鑑定。可選或同時，也可採用諸如SNP(單核苷酸多態性)分析。缺失和插入可通過擴增的產物與正常基因型相比的大小改變來檢測。點突變可通過使擴增的DNA與標記的GPR12核苷酸序列雜交來鑑定。非常匹配的序列可通過RNase消化和通過融解溫度的差異來與錯配雙鏈區分。DNA序列差異可通過DNA片段在凝膠中的電泳淌度(mobility)的改變(所述凝膠中含有和不含有變性劑)，或通過直接DNA測序來檢測。見，例如，Myers.，etal.，Science(1985)2301242。特定位點的序列改變也可通過核酸酶保護試驗來顯示，諸如RNase和S1保護或化學裂解方法。見Cotton.，etal.，ProcNatlAcadSciUSA(1985)854397-4401。其它實施方案中，可構建包含GPR12核苷酸序列或其片段的寡核苷酸探針的陣列以有效篩選，例如基因突變。陣列技術方法是已知的並具有廣泛的可用性，並可用於說明包括基因表達、遺傳連鎖以及遺傳變異在內的多種分子遺傳學問題。(見例如M.Chee.，etal.，Science，Vol274，pp610-613(1996))。單鏈構象多態性(SSCP)可用於檢測突變體和野生型核酸之間的電泳淌度差異(Orita.，etal.，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA862766，seealsoCotton(1993)Mutat.Res.285125-144；andHayashi(1992)Genet.Anal.Tech.Appl.973-79)。樣品的單鏈DNA片段和對照GPR12核酸可被變性並允許復性。不同序列的單鏈核酸的二級結構不同，產生的電泳淌度改變使得能夠檢測甚至單個鹼基的改變。DNA片段可被標記或用標記的探針檢測。試驗的敏感度可通過利用RNA(而不是DNA)來提高，其中所述二級結構對序列中的改變更為敏感。優選的實施方案中，受試方法利用基於電泳淌度的改變對分離的雙鏈異二聚體分子的異源雙鏈分析(Keen.，etal.，(1991)TrendsGenet7:5)。通過用所述方法檢測GPR12基因中的突變，診斷試驗提供診斷和測定對感染諸如細菌、真菌、原生動物和病毒感染的易感性，具體是HIV-1或HIV-2導致的感染；疼痛；癌症；糖尿病，肥胖；食慾減退；貪食症；哮喘；帕金森氏症；血栓形成；急性心衰；低血壓；高血壓；勃起功能障礙；尿瀦留；代謝性骨病諸如骨質疏鬆和大理石樣骨病；心絞痛；心肌梗死；潰瘍；哮喘；過敏；類風溼性關節炎；炎性腸病；腸易激症候群；良性前列腺肥大；以及精神和神經疾病，包括焦慮，精神分裂症，燥狂型抑鬱症，譫妄，痴呆，嚴重智力落後和運動功能障礙，諸如亨廷頓氏症或GillesdelaTourett′s症候群。具體優選的實施方案中，所述診斷試驗用於診斷或測定對阿爾茨海默氏症以及相關疾病，帕金森氏症，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動症，運動神經元疾病，以及神經元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發性骨髓瘤和糖尿病的易感性。GPR12多肽和核酸的存在可在樣品中檢測。因此，上述的感染和疾病可通過這樣的方法診斷，其中包含測定源自受試者的樣品中GPR12多肽或GPR12mRNA的水平的異常降低或增加。所述樣品可包含來自患有或可疑患有與GPR12表達的增加，降低或其它異常相關的疾病的生物體的細胞或組織樣品，包括表達水平或模式的空間或時間改變。患有或可疑患有所述疾病的生物體中的GPR12表達的水平或模式可與正常生物體中的表達水平或模式相比較作為診斷疾病的手段。因此通常，本發明包括檢測樣品中包含GPR12核酸的核酸的存在，通過將樣品與至少一種特異於所述核酸的核酸探針接觸，並監測所述樣品中核酸的存在來進行。例如，所述核酸探針可特異性結合GPR12核酸或其一部分，並檢測二者之間的結合；所述複合體本身的存在也可被檢測。此外，本發明包括檢測GPR12多肽的存在的方法，通過將細胞樣品與能夠結合多肽的抗體接觸，以及監測所述樣品中該多肽的存在來進行。這可通過監測抗體和多肽之間形成的複合體的存在來實現，或檢測所述多肽與抗體之間的結合。檢測兩種實體之間的結合的方法是本領域已知的，並包括FRET(螢光共振能量轉移)，表面胞質團共振等。降低或增加的表達可利用本領域已知用於定量多核苷酸的任何方法諸如PCR，RT-PCR，RNase保護，Northern印跡和其它雜交方法在RNA水平測定。可用於檢測源自宿主的樣品中的蛋白質諸如GPR12的水平的實驗技術是本領域已知的。所述實驗方法包括免疫測定法，競爭結合測定法，Western印跡分析以及ELISA實驗。本發明涉及診斷疾病或疾病易感性的試劑盒，所述疾病包括阿爾茨海默氏症以及相關疾病，帕金森氏症，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動症，運動神經元疾病，以及神經元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛以及痛覺過敏，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發性骨髓瘤和糖尿病中的任何一種。具體優選的診斷試劑盒用於檢測或診斷疾病或對以下疾病中任意一種的易感性阿爾茨海默氏症以及相關疾病，帕金森氏症，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動症，運動神經元疾病，以及神經元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛以及痛覺過敏，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發性骨髓瘤和糖尿病。所述診斷試劑盒包含GPR12多核苷酸或其片段；互補核苷酸序列；GPR12多肽或其片段，或抗GPR12多肽抗體。預防和治療方法本發明提供了治療與GPR12多肽活性的量過剩或不足相關的異常疾病的方法，並且考慮到GPR12多肽，其結合蛋白和/或編碼它們的核酸可具體用於治療神經性，生殖激素相關的，以及其它一些疾病。所述神經疾病包括但不限於以下疾病中的任何一或多種阿爾茨海默氏症以及相關疾病，帕金森氏症，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動症，運動神經元疾病，以及神經元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛以及痛覺過敏，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發性骨髓瘤和糖尿病。如果GPR12活性過量，可採用多種方法。一種方法包括給予受試者本文所述的抑制性化合物(拮抗劑)以及可藥用的載體，其量可通過阻斷配體與GPR12的結合，或通過抑制第二信號有效抑制活化，並由此緩解異常疾病。其它方法中，可給藥仍能與內源GPR12競爭結合配體的GPR12多肽的可溶形式。這種競爭物的常見實施方案包括GPR12多肽的片段。其它方法中，編碼內源GPR12多肽的基因的表達可利用表達阻斷技術來抑制。已知的所述技術包括反義序列的使用，而無論其是內部生成的或是分別給藥的。見，例如，O』Connor，JNeurochem(1991)56560inOligodeoxynucleotidesasAntisenseInhibitorsofGeneExpression，CRCPress，Bocaraton，Fla.(1988)。可選，可採用與該基因形成三螺旋的寡核苷酸。見，例如，Lee.，etal.，NucleicacidsRes(1979)63073；Cooney.，etal.，Science(1988)241456；Dervan.，etal.，Science(1991)2511360。這些寡聚物自身可給藥或相關寡聚物可在體內表達。為治療與GPR12表達低下及其活性相關的異常疾病，也可採用多種方法。一種方法包括給予受試者治療有效量的化合物，其模擬配體結合的GPR12，即上述激動劑，與可藥用的載體聯合，由此緩解所述異常疾病。可選，基因治療可用於實現通過受試者中相關細胞的GPR12的內源性產生。例如，本發明的多核苷酸可被改造用於在複製缺陷型逆轉錄病毒載體中表達，如上所述。所述逆轉錄病毒表達構建體可隨後被分離，並導入用逆轉錄病毒質粒載體轉導的包裝細胞，所述載體含有編碼本發明多肽的RNA，使得所述包裝細胞現在產生含有目的基因的感染性病毒顆粒。這些產生者細胞可給予受試者用於在體內改造細胞並在體內表達所述多肽。對於基因治療的綜述，參見HumanMolecularGenetics，TStrachanandAPRead，BIOSScientificPublishersLtd(1996)中的Chapter20，GeneTherapyandOtherMolecularGenetic-basedTherapeuticApproaches。配製和給藥肽，諸如GPR12多肽的可溶形式，以及激動劑和拮抗劑肽或小分子，可與適宜的可藥用載體配製在一起。所述配製劑包含治療有效量的多肽或化合物，以及可藥用載體或賦形劑。所述載體包括但不限於，鹽水，緩衝的鹽水，葡萄糖，水，甘油，乙醇及其組合。配製應當適合給藥方式，並且是本領域技術人員已知的。本發明還涉及藥物包以及試劑盒，其含有一或多個充滿了本發明前述組合物的一或多種成分的容器。本發明的多肽和其它化合物可單獨使用或與其它化合物聯用，諸如治療性化合物。系統給藥所述藥物組合物的優選形式包括注射，通常通過靜脈內注射。其它注射途徑，諸如經皮下，經肌內或經腹腔內，也可使用。可選用於系統給藥的方式包括利用穿透劑諸如膽鹽或梭鏈孢酸(fusidicacid)或其它清潔劑的透黏膜和透皮給藥。此外，如果適當配製在腸溶或包被的製劑中，口服給藥也是可能的。這些化合物的給藥也可是局部的和/或局限化的，採用軟膏，糊劑，凝膠等的形式。所述劑量範圍需要依賴於所選的肽，給藥途徑，配製劑的形式，受試者疾病的性質，以及臨床醫師的判斷。但適宜的劑量的範圍是0.1-100μg/kg受試者。然而，所需劑量中的較大變化可預期根據可得化合物的種類以及各種給藥途徑的效率不同而異。例如，預期口服給藥需要高於通過靜脈給藥的劑量。這些劑量水平的不同可利用經驗優化途徑調整，這也是本領域技術人員所理解的。用於治療的多肽也可是在受試者中內源產生，在治療模式中通常稱為如上所述「基因治療」。因此，例如來自受試者的細胞可用多核苷酸改造，諸如DNA或RNA，以離體編碼多肽，並例如利用逆轉錄質粒載體。所述細胞隨後被導入受試者。藥物組合物本發明還提供了藥物組合物，包括給藥治療有效量的根據本發明的GPR12多肽，其結合分子或編碼它們的核酸，以及可選的可藥用載體，稀釋劑或賦形劑(包括其組合)。所述藥物組合物可在人和動物藥物中用於人或動物，並將通常包含一或多種可藥用稀釋劑，載體或賦形劑。用於治療用途的可接受載體或稀釋劑是製藥領域已知的，並在例如Remington’sPharmaceuticalSciences，MackPublishingCo.(A.R.Gennaroedit.1985)中描述。藥物載體，賦形劑或稀釋劑的選擇可根據意圖給藥途徑以及標準製藥實踐來選出。所述藥物組合物可包含作為或作為除載體，賦形劑或稀釋劑以外的任何適宜的粘合劑，潤滑劑，懸浮劑，包被劑，助溶劑。防腐劑，穩定劑，染料以及甚至調味劑可在藥物組合物中提供。防腐劑的實例包括苯甲酸鈉，山梨酸和p-羥基苯甲酸的酯。也可使用抗氧化劑和懸浮劑。根據不同遞送系統，存在不同組合物/配製劑的要求。通過舉例，本發明的藥物組合物可配製成利用微型泵或經黏膜途徑遞送，例如作為鼻噴霧或氣溶膠用於吸入或內服溶液，或經胃腸外遞送，其中所述組合物配製成可注射的形式，用於通過例如經靜脈內、經肌內或經皮下途徑遞送。可選，所述配製劑可被設計為經兩種途徑遞送。所述藥劑經胃腸道黏膜遞送，其將能夠在通過胃腸道運送的過程中保持穩定；例如，其應抵抗蛋白水解降解，在酸性pH穩定並對膽汁的清潔效應抵抗。適宜的情況下，所述藥物組合物可通過吸入給藥，以栓劑或陰道栓的形式給藥，以洗液、溶液、乳膏、油膏或粉末的形式經局部給藥，通過使用皮膚貼劑給藥，以含有賦形劑諸如澱粉或乳糖的片劑的形式口服給藥，或單獨或與賦形劑混合在膠囊或扁囊中給藥，或以酏劑、含有調味劑或著色劑的溶液或懸液的形式給藥，或它們可經胃腸外諸如，例如經靜脈內，經肌內或經皮下給藥。對於經胃腸外給藥，所述組合物最好以無菌含水溶液的形式使用，其中包含其它物質，例如足夠的鹽或單糖以製備與血液等張的溶液。對於經頰或舌下給藥，所述組合物可以片劑或錠劑的形式給藥，其可以常規方式配製。給藥通常，醫師將確定最適合個體受試者的實際劑量，其隨具體患者的年齡，體重和反應而不同。以下劑量是平均情況的示例。當然可以存在個別情況，其中較高或較低的劑量範圍有利。本發明的藥物組合物可通過直接注射給藥。所述組合物可配製用於經胃腸外，經黏膜，經肌內，經靜脈內，經皮下，經眼內或透皮給藥。通常，每種蛋白可以0.01-30mg/kg體重的劑量給藥，優選0.1-10mg/kg，更優選0.1-1mg/kg體重。術語「給藥」包括通過病毒或非病毒技術遞送。病毒遞送機制包括但不限於腺病毒載體，腺伴隨病毒(GPR12V)載體，皰疹病毒載體，逆轉錄病毒載體，慢病毒載體，和杆狀病毒載體。非病毒遞送機制包括脂質介導的轉染，脂質體，免疫脂質體，脂質轉染，陽離子表面兩性分子(CFAs)及其組合。所述遞送機制的途徑包括但不限於，經黏膜，經鼻，經胃腸外，經胃腸道，經局部或經舌下途徑。術語「給藥」包括但不限於，通過黏膜途徑，例如作為鼻噴霧或氣溶膠用於吸入或作為可攝入的溶液遞送；經胃腸外途徑遞送，其中遞送通過可注射的形式，諸如經靜脈內，經肌內或經皮下途徑進行。術語「共給藥的」指例如本發明的多肽和其它實體諸如佐劑的每一種的給藥位點和時間，使得實現免疫系統的必要調節。因此，雖然所述多肽和佐劑可同時給藥同一位點，在不同於佐劑的時間和給藥位點給藥多肽可以是有利的。所述多肽和佐劑甚至可在相同的遞送載體中遞送，並且所述多肽和抗原可偶聯和/或非偶聯和/或基因偶聯和/或非偶聯的。所述多肽，多核苷酸，肽，核苷酸，以及可選的佐劑可作為單個劑量或在多個劑量中分別給藥或共同給藥宿主受體。本發明的藥物組合物可通過多種給藥途徑給藥，諸如注射(其包括胃腸外，經皮下和經肌內注射)，經鼻內，經黏膜，口服，經陰道內，經尿道或經眼給藥。本發明的藥物組合物可常規經胃腸外給藥，其通過注射，例如經皮下或經肌內進行。其它適於其它給藥模式的配製劑包括栓劑，並且在一些情況中，口服製劑。對於栓劑，常規粘合劑和載體可包括，例如聚烷撐二醇或甘油三酯；所述栓劑可從含有活性成分的混合物形成，所述活性成分的範圍為0.5％-10％，可為1％-2％。口服製劑包括所述常規應用的賦形劑，諸如藥物級別的甘露醇，乳糖，澱粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，纖維素，碳酸鎂等。這些組合物為溶液，懸液，片劑，丸劑，膠囊，持續釋放配製劑或粉末的形式，並含有10％-95％的活性成分，優選25％-70％。如果所述疫苗組合物是凍幹的，所述凍幹的物質可被溶解然後給藥，例如作為懸液給藥。溶解優選在緩衝液中進行。本發明現在參照具體實施例描述，其不應被認為是對本發明的限制。實施例1.轉基因GPR12敲除小鼠構建GPR12基因靶向型載體含有PAC的小鼠GPR12基因利用放射活性標記的PCR片段鑑定，所述片段含有部分編碼序列。其它側接編碼序列的基因組序列可利用限制位點錨定的PCR技術由內部獲得。組裝8kb帶缺口的片段組(contig)，提供足夠的序列信息以允許設計靶向型載體。隨後的生物信息工作將該片段組延伸到14kb，並填充了缺失的序列。該片段組提供了足夠的側接序列信息，使得能夠設計同源臂以克隆入靶向型載體(所用靶向型載體的結構，包括相關限制位點，顯示於圖3)。小鼠GPR12基因具有單個編碼型外顯子。靶向型策略設計為去除部分編碼外顯子，然後是7tm編碼結構域的開始，並包括整個7tm結構域。側接待缺失含7tm的區域的3.7kb5』同源臂和1.1kb3』同源臂通過PCR擴增並且將所述片段克隆入靶向型載體。用於擴增所述臂的每個寡核苷酸引物的5』末端被合成為含有罕見切割型(rare-cutting)限制酶的不同識別位點，與載體多聚接頭的克隆位點相容，並且其本身自臂缺乏。在GPR12的情況下，所述引物被設計為下表所列的序列，具有NotI/SpeI的5』臂克隆酶以及AscI/FseI的3』臂克隆酶。除了臂引物對(5』臂F/5』臂R)和(3』臂F/3』臂R)，設計其它GPR12基因座特異性引物用於以下目的5』和3』探針引物對(5』prF/5』prR和3』prF/3』prR)以擴增每個臂的外部以及延伸超過每條臂的非重複性基因組DNA的兩個短的150-300bp片段，以允許對分離的推定靶向的克隆中被靶向的基因座進行Southern分析；小鼠基因分型引物對(hetF和hetR)，其允許野生型，雜合子和純合子小鼠之間的區分，當其用於利用載體特異性引物的多聚體PCR中，在本發明情況中為Asc403；最後是靶篩選引物(3’scr)，其在3』臂區的末端的下遊退火，並且其與特異於載體(neo36)3』末端的引物配對時產生靶事件特異性1.5kb擴增物。所述擴增物可僅僅源自來自細胞的模板DNA，其中所需的基因組改變已經出現並允許從含有隨機整合的拷貝的載體的克隆的背景鑑定正確靶向的細胞。這些引物的位置以及用於靶向策略中的GPR12基因座基因組結構顯示於SEQIDNO14(圖7)。musGPR125』prFGPR12actcatggctgcctagagcGPR12cttg-SeqID1musGPR125』prRTggtgtgcttGPR12gacttttgttaccac-SeqID2GPR12GPR12GPR12gcggccgcGPR12cagtcattcGPR12ggagcGPR12gGmusGPR125』臂FPR12gtc-SeqID3musGPR125』臂RTtttttactagtgggaggggacagcggctgagatgttc-SeqID4musGPR123』臂FGPR12GPR12GPR12ggcgcgccagGPR12agccctctgcctcatttgctg-SeqID5musGPR123』臂RTttttggccggccgcttcagatgcGPR12tttgccctaccGPR12c-SeqID6musGPR123’scrTgtgccattcaggGPR12ttctttcacttc-SeqID7musGPR123』prFActaggtctgaggcacgcccagctGPR12c-SeqID8musGPR123』prRAcagccatgagcccattgcGPR12actgag-SeqID9musGPR12hetFGPR12AGGGGTCTCGACCCTGGCTCTCATC-SeqID10musGPR12hetRGATGCACCCACAGCGPR12ATGAGGCAGAG-SeqID11Asc403CAGCCGGPR12CTGTTCGCCAGGCTCGPR12GG-SeqID12Neo36CGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGAC-SeqID13表1.GPR12引物序列選擇同源臂的位置以通過缺失所有7個跨膜區功能破壞GPR12基因。製備靶向型載體，其中待缺失的GPR12序列被位於選擇盒上遊的內源基因表達報導物(框架非依賴性lacZ基因)組成的非同源序列取代，所述表達盒由與GPR12基因方向相同的啟動的新黴素磷酸轉移酶(neo)基因組成。一旦5』和3』同源臂已經被克隆入靶向型載體pTK5IBLMNL(見圖5)，較大的高純度DNA製備物通過利用標準分子生物學技術製備。20μg新鮮製備的無內毒素DNA用其它罕見的切割限制酶PmeI限制切割，其存在於載體骨架中氨苄西林抗性基因和複製的細菌起點之間的獨特位點。線性化的DNA隨後被沉澱並重懸於100μl磷酸鹽緩衝的鹽水，備用於電穿孔。電穿孔後24小時，經轉染的細胞在含有200μg/ml新黴素的培養基中培養9天。克隆被挑入96孔板，複製並擴增，然後通過PCR篩選(利用引物3’scr和neo36，如上所述)以鑑定其中同源重組在內源GPR12基因和靶向型構建體之間發生的克隆。鑑定的陽性克隆比例為1-5％。這些克隆被擴增以允許複製物被冷凍，並且製備足夠的高質量DNA用於利用如上製備的外部5』和3』探針通過Southern印跡證實靶向型事件，所有都利用標準方法(Russ，.etal.，Nature2000Mar2；404(6773)95-99)。當用診斷性限制酶消化的DNA的Southern印跡與外部探針雜交時，同源靶向的ES細胞克隆通過突變體帶以及未改變的野生型帶的存在證實。例如，利用5』探針，EcoRI消化的DNA將產生5.5kb野生型帶，和4.0kb靶向的帶。類似地，利用3』探針，BamHI將產生3.9kb野生型帶，和1.5kb靶向的帶。敲除前小鼠GPR12的基因組基因座的結構在圖1描述。敲除後小鼠GPR12的基因組基因座的結構在圖2中顯示。Southern證實相關酶的位點已經被標明。GPR12GPCR缺陷小鼠的產生使C57BL/6雌性和雄性小鼠交配並在孕3.5日分離胚泡。來自所選克隆的10-12個細胞被注入每個胚泡並將7-8個胚泡植入假孕F1雌性的子宮。嵌合小鼠同窩幼仔出生時含有數隻高水平(達100％)帶深淺環紋的雄性(所述深淺環紋外皮顏色表明靶向的克隆的後代的細胞的貢獻)。這些雄性嵌合小鼠與雌性MF1和129小鼠交配，種系傳遞通過深淺環紋外皮顏色並通過PCR基因分型分別確定。PCR基因分型在裂解的尾片段(lysedtailclips)上，利用引物hetF和hetR以及第三種載體特異性引物(Asc403)進行。該多聚體PCR允許從野生型基因座(如果存在)自引物hetF和hetR擴增，產生219bp帶。hetF的位點在敲除小鼠中缺失，使得從靶向的等位基因的擴增失敗。然而，Asc403引物將從靶向的基因座擴增441bp帶，其中聯合hetR引物，其與3』臂內部的區域退火。因此，該複合體PCR解釋同窩幼鼠的基因型如下野生型樣品將顯示單個219bp帶；雜合DNA樣品產生兩條位於219bp和441bp的帶；純合樣品將僅僅顯示靶特異性441bp帶。實施例2B)結果I)基因表達模式1)電子Northern利用電子Northern，所述基因顯示在以下器官中表達睪丸，小腸，肺，腦，心臟和脾(圖4)。2)LacZ染色的結構列表LacZ染色顯示Annie在腦內的強表達以及具體在嗅球、梨狀皮質(嗅覺)，紋狀體(計劃和調節運動途徑，也參與多種其它認知過程包括執行功能)，丘腦(接受聽覺，軀體感覺和視覺感覺信號)，海馬(在學習和記憶鞏固中重要)，膝狀體核(外側視覺；中間聽覺)和皮質中表達。II)解剖觀察一些雄性的背部具有白色成片的皮毛。敲除動物中沒有觀察到明顯的解剖學缺陷。III)行為對所有動物進行圈養，可自由獲取食物和水，在12小時光/12小時黑暗的光-黑暗周期中進行，在7am開始給光。在設定的時間檢測動物以避免生理節奏效應。試驗顯示突變體和野生型之間的差異。a).Pop-Map雄性敲除小鼠顯示對於倒置柵格以及線操作的抓握表現差。b).Rotarod雄性敲除小鼠在加速rotarod上表現不佳。對於雌性突變體沒有觀察到差異。這指示小腦學習和運動協調，以及運動疾病諸如帕金森氏症和亨廷頓舞蹈症(Huntington’sChorea)。c).足跡/步態試驗據觀察突變體雄性步態異常，步距寬於野生型動物。d).擺尾試驗突變體雄性利用擺尾試驗檢測，該實驗室試驗用於檢測痛覺，是本領域技術人員已知的。該實驗用作敲除小鼠對感受傷害性疼痛的反應的指徵。觀察到所述突變體對熱誘導的疼痛顯示痛覺過敏。所述突變體據觀察擺動尾部的潛伏期較短(圖8)。e).熱板試驗熱板試驗用於指示敲除小鼠對感受傷害性疼痛的反應。敲除小鼠對熱誘導的疼痛更為敏感，這可通過熱誘導的舔足潛伏期縮短證實。該試驗證實了以前在GPR12敲除小鼠的擺尾(tail-flick)實驗(圖9)中見到的痛覺過敏表型.f).水迷宮試驗水迷宮是廣泛用於評估嚙齒類空間學習能力的試驗。學習是作為整個實驗中達到隱藏的平臺的時間減少來評估的。這些數據提示利用空間線索學習隱藏平臺的位置的能力降低(圖10)。該試驗缺陷表示各種病理情況中的學習和記憶問題，諸如阿爾茨海默氏症，老年性痴呆，或總體學習和記憶困難。g).LaborasLaboras是長期監測系統，其使得嚙齒類能夠被長期檢測並評估它們的運動。過夜LABORAS監測Annie小鼠顯示，與野生型小鼠相比它們具有降低的爬行傾向(持續時間(圖11a)和頻率(圖11b))。這些數據支持了rotarod數據並提示運動協調或力量缺陷。h).生化分析完整生化分析在來自Annie敲除小鼠的樣品上進行，包括血液生物化學和激素分析。雄性Annie敲除小鼠具有升高的肌酸激酶(CK)水平(圖12)。CK轉化ATP和肌酐稱為ADP和肌酸磷酸，並且在細胞損傷之後從心臟，骨骼肌以及腦釋放。CK的增加指示神經肌肉疾病，例如心臟疾病，線粒體疾病，炎性肌病，肌無力，多發性肌炎，McArdle’s疾病，NMJ疾病，肌肉萎縮，ALS，甲狀腺功能低下-甲狀腺功能亢進疾病，中央軸空病(centralcoredisease)，酸性麥芽糖酶缺乏，肌球蛋白尿症，橫紋肌溶解，MND和類風溼疾病。肌肉損傷也可通過行為研究中降低的運動協調/力量得到支持。生化分子中見到的其它明顯改變包括1.葡萄糖在3和9月齡雄性和3月齡雌性中增加(～20％)。增加的葡萄糖水平指示疾病諸如糖尿病以及肝病。2.肌酐(肌肉代謝廢物)在9月齡雄性中增加(增加的水平見於腎疾病和肌肉變性)。3.甘油三酯在3月齡雌性和9月齡雄性中增加(～25％)(指示肝病，甲狀腺功能減退，胰腺炎和MI)。4.尿酸(見於肝和腎中，是嘌呤代謝的終產物)在3月齡雄性和(～15％)9月齡雄性中增加(～80％)(增加的水平見於痛風，感染，腎病，吸收障礙，肝損傷或過酸腎(overacidkidney))。5.白蛋白在9月齡雄性中增加(～25％)(增加的白蛋白見於肝病，多發性骨髓瘤)。6.門冬氨酸氨基轉移酶(～80％)在39月雄性中增加(指示急性肝細胞損傷或肝炎)。總體結果提示肝或腎功能障礙。本文件中涉及的申請和專利中的每一個，以及其中引用或參照的每篇文獻，包括每篇申請和專利(「申請引用的文件」)，包括在每篇申請和專利的過程中以及任何申請引用的文獻中引用或涉及的產品的生產商說明或分類，均包含在本文作為參考。此外，本文引用的所有文獻，以及本文引用的文獻中的所有引用或參考文獻，以及本文引用或涉及的產品的任何生產商說明，包含在本文作為參考。本發明所述方法和系統的各種修飾和改變對本領域技術人員而言是顯而易見的，不偏離本發明的範圍和精神。儘管本發明已經通過具體優選實施方案描述，應理解權利要求所述的發明不應不適當地顯示到所述具體實施方案，對其進行的修飾和添加應在本發明範圍內進行。實際上，實施本發明的所述模式的各種改變對於分子生物領域或相關領域的技術人員而言是顯而易見的，意圖包含在本發明權利要求範圍內。此外，可針對獨立權利要求的特徵對從屬權利要求的特徵進行各種組合，並且不偏離本發明的範圍。權利要求1.GPR12敲除哺乳動物，其包含一或多種細胞，所述細胞中的GPR12多肽在功能上無活性。2.權利要求1的GPR12敲除小鼠，其與野生型對照相比具有任意一或多種以下特徵Rotarod測驗、倒置柵格、酒操縱測驗、步態試驗的成績降低。3.權利要求2的GPR12敲除小鼠，其具有選自下組的特徵阿爾茨海默氏症以及相關疾病，帕金森氏症，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動症，運動神經元疾病，以及神經元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛以及痛覺過敏，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發性骨髓瘤和糖尿病。4.產生一或多個包含一或多個功能失活的GPR12基因的哺乳動物細胞的方法，包括以下步驟(a)選擇一或多個包含一或多個功能活性內源GPR12基因的細胞；(b)將步驟(a)的一或多個細胞用功能失活的GPR12核酸進行轉染，所述核酸能夠通過同源重組與一或多個內源GPR12基因進行重組；和(c)選擇一或多個其中的一或多個內源GPR12基因已經與功能失活的GPR12核酸發生同源重組的細胞。5.適於功能滅活宿主細胞內的一或多個內源GPR12基因的核酸構建體，包括(a)非同源取代區；(b)位於所述非同源取代區上遊的第一同源區；(c)突變的GPR12基因，其在表達時不編碼功能活性GPR12；(d)位於所述非同源取代部分的下遊的第二同源區，所述第二同源區位於所述非同源取代區的下遊，所述第二同源區具有與第二GPR基因有至少90％的同一性的核苷酸序列。6.組合物，其包含GPR12多肽，或其一或多種結合蛋白，或編碼它們的核酸，以及可藥用載體、稀釋劑或賦形劑。7.鑑定GPR12多肽的功能活性的一或多種拮抗劑的方法，包括以下步驟(a)選擇一或多種哺乳動物，其包含功能活性GPR12多肽；(b)用GPR12多肽的一或多種可能的拮抗劑處理所述一或多種哺乳動物；(c)檢測所述一或多種哺乳動物以確定所述哺乳動物是否顯示GPR12敲除小鼠的一或多種特徵，所述特徵選自以下特徵組成的組阿爾茨海默氏症以及相關疾病，帕金森氏症，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動症，運動神經元疾病，以及神經元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛以及痛覺過敏，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發性骨髓瘤和糖尿病；和(d)選擇顯示步驟(c)的一或多種特徵的一或多種拮抗劑。8.權利要求的7的方法，其中步驟(c)包括檢測所述一或多種哺乳動物以確定那些哺乳動物是否顯示所述的特徵。9.鑑定一或多種激動GPR12多肽的功能活性的分子的方法，包括以下步驟(a)選擇一或多種哺乳動物，其中包含功能失活的GPR12多肽；(b)用一或多種可能的GPR12類似物處理所述一或多種哺乳動物，所述GPR12類似物有效激動GPR12活性的至少一個方面；(c)檢測根據步驟(b)處理的一或多種哺乳動物，確定所述經處理的哺乳動物與根據步驟(a)選出的哺乳動物相比是否具有一或多種恢復的性質；和(d)選擇所述一或多種GPR12-配體類似物，其使得根據步驟(a)選出的那些哺乳動物恢復野生型哺乳動物的一或多種特徵。10.鑑定一或多種拮抗GPR12多肽的功能活性的分子的方法，包括以下步驟(a)選擇一或多種哺乳動物，其中包含功能活性GPR12多肽；(b)用一或多種可能的GPR12拮抗劑處理所述一或多種哺乳動物，所述GPR12拮抗劑有效拮抗GPR12活性的至少一個方面；和(c)檢測根據步驟(b)處理的一或多種哺乳動物，確定所述經處理的哺乳動物與根據步驟(a)選出的哺乳動物相比是否具有一或多種經調節的性質。11.轉基因GPR12敲除哺乳動物在一或多種化合物的生物效應測定法中的用途。12.診斷選自以下疾病組成的組的疾病或病症的方法阿爾茨海默氏症以及相關疾病，帕金森氏症，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動症，運動神經元疾病，以及神經元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛以及痛覺過敏，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發性骨髓瘤和糖尿病，包括以下步驟(a)選擇來自待診斷患者的細胞樣品；和(b)比較所述細胞樣品與來自健康個體的一或多種對照樣品中的GPR12多肽的表達水平和/或功能活性。13.轉基因動物，其中至少部分細胞中包含編碼選自下組的一或多種物質的外源核酸GPR12多肽，GPR12多肽的一或多種激動劑，GPR12多肽的一或多種拮抗劑和GPR12活性的一或多種調節物。14.治療患者中選自下組的疾病的方法阿爾茨海默氏症以及相關疾病，帕金森氏症，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動症，運動神經元疾病，以及神經元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛以及痛覺過敏，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發性骨髓瘤和糖尿病，包含用治療有效量的選自下組的一或多種物質治療所述患者的步驟GPR12多肽，GPR12多肽的一或多種激動劑，GPR12多肽的一或多種拮抗劑和GPR12活性的一或多種調節物。15.選自GPR12多肽，GPR12多肽的一或多種激動劑，GPR12多肽的一或多種拮抗劑和GPR12活性的一或多種調節劑組成的組的一或多種物質在製備用於預防或治療患者中的疾病的藥物中的用途，所述疾病選自以下疾病組成的組阿爾茨海默氏症以及相關疾病，帕金森氏症，癲癇和致癲癇疾病，眩暈和暈動症，運動神經元疾病，以及神經元功能障礙疾病，以及疼痛包括感受傷害性疼痛以及痛覺過敏，肝炎，肌肉降解，甲狀腺功能減退，胰腺炎或MI，多發性骨髓瘤和糖尿病。16.操縱患者中的神經元增殖和突觸形成的方法，包括用治療有效量的選自下組的一或多種物質治療患者的步驟GPR12多肽，GPR12多肽的一或多種激動劑，GPR12多肽的一或多種拮抗劑以及GPR12活性的一或多種調節物。17.選自下組的物質在製備用於操縱動物中的神經元增殖和突觸形成的藥物中的用途GPR12多肽，GPR12多肽的一或多種激動劑，GPR12多肽的一或多種拮抗劑以及GPR12活性的一或多種調節物。全文摘要本發明涉及已知受體的新功能。具體地，本發明涉及鞘氨醇磷脂醯膽鹼受體和/和其配體在神經元和邊緣系統的操作以及疼痛的診斷和治療中的用途。文檔編號G01N33/50GK1893821SQ200480027168公開日2007年1月10日申請日期2004年9月8日優先權日2003年9月19日發明者馬克·卡爾頓,約翰·狄克遜,阿蘭·亨德裡克,索菲·梅塞傑,珍妮弗·M·霍伍德,德克·詹申請人:帕拉迪姆醫療有限公司