轉化體及其製造方法以及乳酸的製造方法

2023-04-30 18:51:41

專利名稱：轉化體及其製造方法以及乳酸的製造方法
技術領域：
本發明涉及轉化體及其製造方法以及乳酸的製造方法。
背景技術：
乳酸廣泛用於食品用途和醫療、化妝品等的化學原料用途。另外，使用乳酸而得到的聚乳酸作為在微生物等的作用下最終分解為二氧化碳和水的生物分解性塑料而受到關注。因此，需要廉價地以高生產率製造乳酸。作為乳酸的製造方法，已知利用乳酸菌使糖發酵而進行製造的生物學方法。但是， 由於乳酸菌的耐酸性低，因此為了以該方法獲得高生產率，需要用鹼中和發酵所產生的乳酸而形成乳酸鹽。這種利用鹼進行的中和需要從乳酸鹽恢復成乳酸的步驟，因此製造步驟變得繁雜，製造成本也升高。因此，作為不用鹼進行中和而獲得乳酸的方法，提出了 使用以酵母菌屬的酵母等耐酸性微生物為宿主、在該耐酸性微生物中導入有編碼乳酸脫氫酶的基因的轉化體的方法 (專利文獻1)；使用導入有編碼乳酸脫氫酶的基因、且編碼丙酮酸脫羧酶1的基因缺失或失活的釀酒酵母(出芽酵母)的方法(專利文獻2)。現有技術文獻專利文獻專利文獻1 日本特開2001-204464號公報專利文獻2 日本特開2008-487 號公報

發明內容
但是，專利文獻1的方法即使在20 M小時的培養時間下也僅達到獲得2 5% 的乳酸的程度，生產率不充分。另外，專利文獻2的方法在大量生產乳酸時需要用鹼進行中和，因而不適合工業性的乳酸的大量生產。因此，期待不用鹼進行中和即可以高生產率製造乳酸的方法。因此，本發明的目的在於提供不需要用鹼中和即可以高生產率生產乳酸的粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的轉化體及該轉化體的製造方法。此外，本發明的目的還在於提供適於在高濃度的糖存在下產生乳酸、並且也適於高密度發酵的轉化體及該轉化體的製造方法。另外，本發明的目的在於提供使用上述轉化體、在不進行鹼中和步驟的情況下以高生產率製造乳酸的方法。需要說明的是，本發明中所說的乳酸是指利用生物學方法得到的L-乳酸。本發明的轉化體以粟酒裂殖酵母為宿主，重組有乳酸脫氫酶基因，且編碼上述粟酒裂殖酵母宿主的丙酮酸脫羧酶的基因簇部分缺失或失活。另外，本發明的轉化體中，上述缺失或失活的編碼丙酮酸脫羧酶的基因優選為 PDC2基因。上述乳酸脫氫酶基因優選為哺乳動物的乳酸脫氫酶基因。並且，上述乳酸脫氫酶基因優選重組到粟酒裂殖酵母的染色體中。另外，本發明的轉化體的製造方法為製造重組有乳酸脫氫酶基因且編碼丙酮酸脫羧酶的基因簇部分缺失或失活的轉化體的方法，其中，包括下述步驟以粟酒裂殖酵母為宿主，使用具有包含在粟酒裂殖酵母內發揮作用的啟動子、終止子和乳酸脫氫酶基因的表達盒的載體，將上述表達盒導入上述宿主中而得到轉化體；和使用編碼丙酮酸脫羧酶的基因簇部分缺失或失活的宿主作為上述宿主，或者使上述得到的轉化體的編碼丙酮酸脫羧酶的基因簇部分缺失或失活。另外，優選上述載體還具有對粟酒裂殖酵母的染色體進行同源重組的重組位點， 使用該載體將表達盒導入粟酒裂殖酵母的染色體中。並且，宿主的染色體中進行同源重組的靶位點優選為轉座子基因Tf2。另外，本發明的方法中，上述缺失或失活的編碼丙酮酸脫羧酶的基因優選為PDC2 基因。上述乳酸脫氫酶基因優選為哺乳動物的乳酸脫氫酶基因。此外，本發明為一種乳酸的製造方法，其中，將上述轉化體在培養液中進行培養， 並從該培養液中獲取乳酸。另外，該乳酸的製造方法中，優選使用含有濃度為1 50質量％ (更優選2 16 質量％)的葡萄糖的培養液進行培養。另外，優選在通過由上述轉化體產生的乳酸的作用使上述培養液的PH達到3. 5以下後，進一步繼續培養。並且，上述培養液中的轉化體的初始菌體濃度優選設定為0. 1 50克(以乾燥菌體換算)/升(更優選0.2 40克(以乾燥菌體換算)/升)。另外，優選在不中和由上述轉化體產生的培養液中的乳酸的情況下繼續進行培養，並且，優選在不中和培養液中的乳酸的情況下從培養液中分離乳酸。發明效果本發明的粟酒裂殖酵母的轉化體不需要用鹼中和即可以高生產率產生乳酸。另夕卜，適於在高濃度的糖、特別是葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖的存在下產生乳酸，並且也適於高密度培養。此外，通過本發明的轉化體的製造方法，能夠簡便地得到上述轉化體。另外，本發明的乳酸的製造方法能夠在不進行鹼中和步驟的情況下以高生產率製造乳酸。
具體實施例方式[轉化體]本發明的轉化體為以粟酒裂殖酵母為宿主、重組有乳酸脫氫酶基因、且編碼粟酒裂殖酵母宿主的丙酮酸脫羧酶的基因簇部分缺失或失活的轉化體。作為宿主的粟酒裂殖酵母為屬於裂殖酵母屬的酵母(裂殖酵母)，是與其他酵母相比耐酸性特別優良的微生物。本發明人發現粟酒裂殖酵母與釀酒酵母等其他酵母相比， 在高濃度葡萄糖下的乳酸的生產率優良，也適於高密度培養(使用大量酵母的培養)，並且發現通過使用粟酒裂殖酵母的轉化體，能夠以極高的生產率製造乳酸。需要說明的是，粟酒裂殖酵母的染色體的全鹼基序列作為「khizosaccharomyces pombe Gene DB (http //www. genedb. org/genedb/pombe/)，，收錄、公開於桑格研究所的資料庫「GeneDB」中。本說明書中記載的粟酒裂殖酵母的基因的序列數據可通過基因名或上述系統名從上述資料庫中檢索獲得。本發明中使用的粟酒裂殖酵母只要具有耐酸性則沒有特別限定。粟酒裂殖酵母可從公共或民間的保藏機構、S卩、美國典型培養物保藏中心 (American Type Culture Collection) (ATCC、馬納薩斯、VA、USA)、英國酵母菌種保藏中心(National Collection of Yeast Cultures) (NCYC、諾裡奇、英國)、NITE 生物資源中心 (NBRC、日本千葉縣木更津市)、酵母遺傳資源中心(YGRC、日本大阪市立大學研究生院理學研究科內)等處獲得。粟酒裂殖酵母中編碼丙酮酸脫羧酶的基因(丙酮酸脫羧酶基因、以下也稱為「PDC 基因」)簇有以下4種編碼丙酮酸脫羧酶1的基因(以下也稱為「PDC1基因」)、編碼丙酮酸脫羧酶2的基因(以下也稱為「PDC2基因」)、編碼丙酮酸脫羧酶3的基因(以下也稱為 「PDC3基因」)、編碼丙酮酸脫羧酶4的基因(以下也稱為「PDC4基因」)。其中，粟酒裂殖酵母中，PDC2基因和PDC4基因是具有主要功能的PDC基因。各PDC基因的系統名如下所示。PDCl 基因(Pdcl) SPACl3A11. 06PDC2 基因(Pdc2) :SPAC1F8. 07cPDC3 基因(Pdc3) :SPAC186. 09PDC4 基因(Pdc4) :SPAC3G9. lie上述PDC基因的序列數據可通過基因名或系統名從上述粟酒裂殖酵母基因資料庫中檢索獲得。在野生型粟酒裂殖酵母中，通過糖酵解將葡萄糖代謝至丙酮酸，利用由前述的PDC 基因所表達的丙酮酸脫羧酶將丙酮酸轉變成乙醛，繼而由醇脫氫酶將該乙醛轉變成乙醇， 由此進行乙醇發酵。另外，野生型粟酒裂殖酵母不具有具備功能的乳酸脫氫酶基因，因此不存在由丙酮酸生成乳酸的途徑。另一方面，由重組的乳酸脫氫酶基因所表達的乳酸脫氫酶通過將丙酮酸還原成乳酸而產生乳酸。因此，即使在野生型粟酒裂殖酵母中重組入乳酸脫氫酶基因以使其能夠產生乳酸，在該狀態下也會同時進行乙醇發酵和乳酸發酵，因此乳酸的生產率不能充分提高。本發明的轉化體具有編碼上述丙酮酸脫羧酶的基因簇中部分缺失或失活的染色體。通過使轉化體的PDC基因簇部分缺失或失活，轉化體的乙醇發酵的效率降低，轉變成乙醇的丙酮酸量減少，因此乳酸的生產率提高。但是，若使PDC基因簇完全缺失或失活，則將完全無法進行乙醇發酵而抑制生長，因此將缺失或失活設定為在PDC基因簇的一部分發生。缺失或失活的PDC基因特別優選為PDC2基因。PDC2基因是具有特別主要功能的 PDC基因。如前所述，若使PDC基因完全缺失或失活，則該轉化體無法進行乙醇發酵因而會抑制生長。因此，PDC基因的缺失或失活必須以保留生長所必需的乙醇發酵能力從而獲得充分的轉化體量、同時降低乙醇發酵能力從而提高乳酸的發酵效率的方式進行。針對該課題本發明人進行了研究，結果發現，若使PDC2基因缺失或失活，則PDC4基因會以某種程度活化，能夠兼顧獲得充分的轉化體量的程度的乙醇發酵能力和高發酵效率的乳酸生產。
PDC基因的缺失或失活可利用公知的方法進行。例如，可通過使用Latour法(記載於Nucreic Acids Res雜誌、2006年、；34卷、ell頁，國際公開第2007/063919號小冊子等中)使PDC基因缺失。另外，通過使PDC基因的鹼基序列的一部分發生缺失、插入、取代、添加，也可以使該PDC基因失活。這些缺失、插入、取代、添加所致的突變，可以只發生其中的任意一種，也可以發生兩種以上。在PDC基因的一部分中導入上述突變的方法可以使用公知的方法。例如，可以列舉使用誘變劑的突變分離法(酵母分子遺傳學實驗法、1996年、學會出版中心)、利用PCR(聚合酶鏈式反應)的隨機突變法(PCR Methods Appl.、1992年、第2 卷、第觀-33頁)等。另外，在其一部分中導入有突變的PDC基因可以是表達溫度敏感突變型丙酮酸脫羧酶的PDC基因。溫度敏感突變型丙酮酸脫羧酶是指在某一培養溫度下顯示出與野生型丙酮酸脫羧酶同等的活性、但達到特定的培養溫度以上時可觀察到活性的消失或降低的酶。表達這種突變型丙酮酸脫羧酶的突變株，可以通過選擇在活性不受限制的溫度條件下顯示出與野生型酵母同等的生長速度、在活性受到限制的特定的溫度條件下生長速度顯著降低的突變株而獲得。〈宿主〉PDC基因缺失或失活的粟酒裂殖酵母的突變體，可作為用於製造本發明的轉化體的宿主而使用。此外，也可將除PDC基因以外進一步使PDC基因以外的特定基因缺失或失活的粟酒裂殖酵母作為宿主。作為使除PDC基因以外的特定基因缺失或失活的粟酒裂殖酵母宿主，例如，記載於國際公開第2002/101038號小冊子、國際公開第2007/015470號小冊子等中。通過使蛋白酶基因等缺失或失活，能夠提高異種蛋白的表達效率，通過應用於本發明中的宿主中，可期待乳酸生產效率的提高。並且，作為宿主使用的粟酒裂殖酵母，優選使用具有用於選擇轉化體的標記的粟酒裂殖酵母。例如，優選使用通過使某一基因缺失而使其生長需要特定營養成分的宿主。通過在載體中重組該缺失的基因(營養缺陷型互補標記)，使轉化體中宿主的營養缺陷性消失。利用該宿主與轉化體的營養缺陷性的差異，能夠區別出兩者而得到轉化體。例如，以乳清酸核苷磷酸脫羧酶基因(ura4基因)缺失或失活而形成的尿嘧啶缺陷型粟酒裂殖酵母為宿主，利用具有ura4基因(營養缺陷型互補標記)的載體進行轉化後，選擇尿嘧啶缺陷性消失的轉化體，由此能夠得到重組有載體的轉化體。對於宿主中通過缺失而導致營養缺陷性的基因而言，只要可用於轉化體的選擇則不限定於ura4基因，可以是異丙基蘋果酸脫氫酶基因(Ieul基因)等。另外，也可以使用PDC基因簇既未缺失也未失活的粟酒裂殖酵母作為用於轉化體製造的宿主。作為該情況下的宿主，可以使用除PDC基因以外的上述基因(營養缺陷型標記或蛋白酶基因等)缺失或失活的宿主。使用該宿主製造轉化體後，使該轉化體的PDC基因簇部分缺失或失活，能夠得到本發明的轉化體。本發明的轉化體具有乳酸脫氫酶基因(編碼乳酸脫氫酶的基因、以下也稱為「LDH 基因」)。如上所述，粟酒裂殖酵母本來不具有LDH基因。因此，利用基因工程的方法將粟酒裂殖酵母之外的生物的LDH基因導入粟酒裂殖酵母中，得到轉化體。本發明中的LDH基因沒有特別限定，可以列舉例如屬於雙歧桿菌屬、乳桿菌屬等的微生物來源的LDH基因、人等哺乳動物來源的LDH基因。其中，從粟酒裂殖酵母的乳酸產生效率優良的方面考慮，優選為哺乳動物來源的LDH基因。其中，更優選為人來源的LDH 基因(文獻Tsujibo H，Tiano HF, Li SS-L Nucleotide sequences of the cDNA and an intronless pseudogene for human lactate dehydrogenase—^ isozyme. Eur. J. Biochem. (1985) 147,9-15)。進一步優選為下述序列表的序列號1所示的LDH基因。[轉化體的製造]本發明的轉化體通過以PDC基因簇部分缺失或失活的粟酒裂殖酵母為宿主，利用基因工程的方法將LDH基因導入粟酒裂殖酵母中而得到。另外，以PDC基因簇既未缺失也未失活的粟酒裂殖酵母為宿主，利用基因工程的方法將LDH基因導入粟酒裂殖酵母中而得到轉化體，然後使所得到的轉化體的PDC基因簇部分缺失或失活，也能夠得到本發明的轉化體。在後述的實施例中，利用前一方法製造了目標轉化體，但利用後一方法也能夠製造大致等同的轉化體。以下，以前一方法為例對轉化體的製造方法進行說明。作為利用基因工程的方法將LDH基因導入宿主中的方法，可以使用公知的方法。 作為以粟酒裂殖酵母為宿主、向其中導入異種蛋白的結構基因的方法，可以使用例如日本特開平5-15380號公報、國際公開第95/09914號小冊子、日本特開平10-234375號公報、日本特開2000-262^4號公報、日本特開2005-198612號公報等中記載的方法。LDH基因優選導入粟酒裂殖酵母的染色體中。通過向染色體中導入LDH基因，可獲得傳代中的維持穩定性優良的轉化體。另外，也可以向染色體中導入多個LDH基因。通過導入多個LDH基因，能夠提高LDH基因的表達效率，進而可提高乳酸的生產效率。本發明的轉化體中，重組到染色體中的LDH基因個數優選為1 20，特別優選為1 8。作為向染色體中導入LDH基因的方法，可以使用公知的方法。例如，可以通過上述日本特開2000-262284號公報中記載的方法，向染色體中導入多個LDH基因。另外，也可以通過該方法向染色體中導入一個LDH基因。另外，還可以如後所述在染色體的多個位置上導入一個或多個LDH基因。作為將LDH基因導入粟酒裂殖酵母的染色體中的方法，優選使用具有包含LDH基因的表達盒和重組位點的載體，利用同源重組法進行導入的方法。以下，對該方法中使用的載體和同源重組法進行說明。載體具有包含LDH基因的表達盒和重組位點。表達盒是指表達乳酸脫氫酶所需要的DNA的組合，包含LDH基因、在粟酒裂殖酵母內發揮作用的啟動子和在粟酒裂殖酵母內發揮作用的終止子。此外，還可以包含5』 -非翻譯區、3』-非翻譯區中的任意一個以上。此外，還可以包含上述營養缺陷型互補標記。優選的表達盒為包含LDH基因、啟動子、終止子、5』 -非翻譯區、3』 -非翻譯區、營養缺陷型互補標記的表達盒。表達盒中可以存在多個LDH基因。表達盒中的LDH基因個數優選為1 8， 更優選為1 5。在粟酒裂殖酵母內發揮作用的啟動子和終止子，只要滿足以下條件即可即使因本發明的轉化體使乳酸蓄積而成酸性(即使PH達到6以下)，也能夠在轉化體內發揮作用而維持乳酸脫氫酶的表達。作為在粟酒裂殖酵母內發揮作用的啟動子，可以使用粟酒裂殖酵母本來所具有的啟動子(優選轉錄起始活性高的啟動子)或粟酒裂殖酵母本來不具有的啟動子(病毒來源的啟動子等)。需要說明的是，載體內可存在兩種以上的啟動子。
作為粟酒裂殖酵母本來所具有的啟動子，可以列舉例如醇脫氫酶基因啟動子、參與硫胺素代謝的nmtl基因啟動子、參與葡萄糖代謝的果糖-1，6- 二磷酸酶基因啟動子、參與分解代謝物阻遏的轉化酶基因的啟動子(參考國際公開第99/23223號小冊子)、熱休克蛋白基因啟動子(參考國際公開第2007/26617號小冊子)等。
作為粟酒裂殖酵母本來不具有的啟動子，可以列舉例如日本特開平5-15380號公報、日本特開平7-163373號公報、日本特開平10-234375號公報中記載的動物細胞病毒來源的啟動子，優選hCMV啟動子、SV40啟動子。
作為在粟酒裂殖酵母內發揮作用的終止子，可以使用粟酒裂殖酵母本來所具有的終止子或粟酒裂殖酵母本來不具有的終止子。需要說明的是，載體內可存在兩種以上的終止子。
作為終止子，可以列舉例如日本特開平5-15380號公報、日本特開平7-163373號公報、日本特開平10-234375號公報中記載的人來源的終止子，優選人脂皮素I的終止子。
載體的重組位點是具有能夠對粟酒裂殖酵母的染色體中的同源重組的靶位點進行同源重組的鹼基序列的位點。另外，靶位點是粟酒裂殖酵母的染色體內成為重組表達盒的標靶的位點。靶位點可以通過使載體的重組位點為對該靶位點進行同源重組的鹼基序列而自由地設定。
上述重組位點的鹼基序列與靶位點的鹼基序列的相同性需要設定為70%以上。另外，從容易發生同源重組的觀點考慮，重組位點的鹼基序列與靶位點的鹼基序列的相同性優選設定為90%以上，更優選為95%以上。通過使用具有這樣的重組位點的載體，利用同源重組將表達盒重組到靶位點中。
重組位點的長度(鹼基數)優選為20 2000bp。重組位點的長度為20bp以上時，容易發生同源重組。另外，重組位點的長度為2000bp以下時，容易防止因載體過長而難以發生同源重組。重組位點的長度更優選為IOObp以上，進一步優選為200bp以上。另外， 重組位點的長度更優選為SOObp以下，進一步優選為400bp以下。
載體中除上述表達盒和重組位點以外可具有其他DNA區域。可以列舉例如對於在大腸桿菌內複製所必需的稱為「ori」的複製起始區或抗生素抗性基因(新黴素抗性基因等)。這些是使用大腸桿菌構建載體時通常所需要的基因。但是，上述複製起始區優選如後所述在將載體重組到宿主的染色體中時除去。
載體是具有環形DNA結構或線形DNA結構的載體，在導入到粟酒裂殖酵母的細胞中時優選以線形DNA結構導入。即，在通常使用的質粒DNA等具有環形DNA結構的載體的情況下，優選用限制性內切酶將載體切開為線形後導入粟酒裂殖酵母的細胞中。
該情況下，將具有環形DNA結構的載體的切開位置設定在重組位點內。由此，使被切開的載體的兩端分別存在部分重組位點，通過同源重組將整個載體重組到染色體的靶位點中。
只要載體能夠形成兩端分別具有部分重組位點的線形DNA結構，也可以採用除了將具有環形DNA結構的載體切開的方法以外的方法進行構建。
作為載體，可以適合使用例如pBR322、pBR325、pUCl 18、pUCl 19、pUC18、pUC19 等大腸桿菌來源的質粒。
該情況下，用於同源重組時的質粒載體優選已將在大腸桿菌內複製所必需的稱為 「ori」的複製起始區除去。由此，將上述載體重組到染色體中時，能夠提高其重組效率。
除去複製起始區的載體的構建方法沒有特別限定，優選使用日本特開 2000-262284號公報中記載的方法。S卩，優選事先構建在重組位點內的切割部位插入有複製起始區的前體載體，在如前所述地形成線形DNA結構的同時，將複製起始區切除的方法。 由此，能夠簡便地得到除去複製起始區的載體。
另外，也可以採用以下方法應用日本特開平5-15380號公報、日本特開平 7-163373號公報、國際公開第96/23890號小冊子、日本特開平10-234375號公報等中記載的表達載體及其構建方法，構建具有表達盒及重組位點的前體載體，再利用通常的基因工程的方法從該前體載體中除去複製起始區，得到用於同源重組的載體。

用於重組入載體的靶位點在粟酒裂殖酵母的染色體中可以僅存在於1處，也可以存在於2處以上。存在2處以上的靶位點時，可以使重組到粟酒裂殖酵母的染色體中的載體為2處以上。另外，表達盒中的LDH基因為多個的情況下，可以在靶位點的1個部位重組多個LDH基因。此外，也可以在2種以上的靶位點，使用具有與各靶位點對應的重組位點的 2種以上的載體來重組入表達盒。通過這些方法，能夠在粟酒裂殖酵母的染色體中重組入多個LDH基因，由此能夠增大乳酸脫氫酶的表達量，提高乳酸的生產率。
在1處靶位點重組表達盒時，例如可以使用日本特開2000-262284號公報中記載的方法。使用具有不同重組位點的2種以上的載體，能夠將載體分別重組到不同的靶位點中。但是，將載體重組到染色體的2處以上時，該方法較為繁雜。
若能夠以染色體中多處存在的實質上彼此相同的鹼基序列部分為靶位點、將載體分別重組到該多處的靶位點中，則能夠使用1種載體將載體重組到染色體的2處以上。實質上彼此相同的鹼基序列是指鹼基序列的相同性為90 %以上。靶位點之間的相同性優選為 95%以上。另外，實質上彼此相同的鹼基序列的長度為包含上述載體的重組位點的長度，優選為IOOObp以上。與在1處靶位點重組有多個LDH基因的情況相比，即使LDH基因的重組數相同，當在多個存在的靶位點分散地重組有LDH基因時，轉化體增殖時LDH基因曾經從染色體上脫落的情況減少，轉化體在傳代中的維持穩定性提高。
作為在染色體中多處存在的靶位點，優選轉座子基因Tf2。已知Tf2是在粟酒裂殖酵母的3條(單倍體)染色體中分別合計存在13處的轉座子基因，長度(鹼基數)約為 4900bp，這些基因間的鹼基序列相同性為99. 7% (參考下述文獻)。
Nathan J. Bowen et al,"Retrotransposons and Their Recognition of pol II Promoters :A Comprehensive Survey of the Transposable Elements From the Complete Genome Sequence of Schizosaccharomyces pombe，，，Genome Res. 200313 :1984-1997
可以僅在染色體中存在13處的Tf2中的1處重組入載體。該情況下，通過重組入具有2個以上LDH基因的載體，能夠得到具有2個以上LDH基因的轉化體。另外，通過在2 處以上的Tf2中重組入載體，能夠得到具有2個以上LDH基因的轉化體。該情況下，通過重組入具有2個以上LDH基因的載體，能夠得到具有更多LDH基因的轉化體。若在所有13處Tf2中重組入載體，則可能會對轉化體的生存和增殖造成過大負荷。優選在13處Tf2的8 處以下重組入載體，更優選在5處以下重組入載體。

作為利用同源重組法對粟酒裂殖酵母宿主進行轉化的方法，可以使用公知的同源重組法。作為本發明的轉化方法，優選以上述PDC基因簇部分缺失或失活的粟酒裂殖酵母為宿主、使用上述載體通過同源重組在宿主染色體中重組入表達盒的方法。根據該製造方法，能夠簡便地製造本發明的轉化體。
本發明的轉化法中，通常在進行同源重組後，對所得的轉化體進行選擇。作為選擇的方法，例如，可以列舉以下所示的方法。使用能夠利用上述營養缺陷型標記對轉化體進行選擇的培養基進行篩選，從所得的菌落中選擇多個菌落。然後，將這些菌落分別進行液體培養後，考察各培養液中的異種蛋白的表達量，選擇異種蛋白的表達量更多的轉化體。另外， 利用脈衝場凝膠電泳法對這些選擇出的轉化體進行基因組分析，由此能夠考察出染色體中重組的載體數和表達盒數。
染色體中重組的載體數可通過調節重組條件等進行某種程度的調節，但根據載體的大小(鹼基數)、結構的不同，重組效率和重組數也會發生變化。
認為通過在粟酒裂殖酵母的染色體中重組多個LDH基因，能夠增大乳酸脫氫酶的表達量，提高乳酸的生產率。但是，本發明的目的在於獲得乳酸的生產效率高的轉化體，其目的並不在於獲得僅僅是表達盒的總數更多的轉化體。一般而言，表達盒數越多，預測乳酸脫氫酶的表達效率越高，進而乳酸的生產效率越高。但是，表達盒數過多時，對細胞的生存和增殖的負荷增大，進而乳酸生產效率也降低。另外，載體變大時，重組到染色體中的概率降低，難以增加重組的載體數，進而獲得轉化體本身也變得困難。
[乳酸的製造方法]
本發明的乳酸的製造方法是在培養液中培養上述本發明的轉化體，並從該培養液中獲取乳酸的乳酸的製造方法。
通過將本發明的轉化體在含糖的培養液中進行培養，由該糖經糖酵解而得到的丙酮酸被乳酸脫氫酶還原而產生乳酸，從培養液中獲取產出於培養液中的乳酸，由此能夠製造乳酸製造。
作為乳酸的製造中使用的培養液，可以使用含有糖的公知的酵母培養用培養基， 並且只要是含有粟酒裂殖酵母可同化的氮源、無機鹽類等、能夠以良好的效率進行粟酒裂殖酵母的培養的培養基即可。作為培養液，可以使用天然培養基，也可以使用合成培養基。
作為碳源的糖，可以列舉例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖等糖。作為氮源，可以列舉例如氨、氯化銨、乙酸銨等無機酸或無機酸的銨鹽、蛋白腖、酪蛋白水解物、酵母提取物等。作為無機鹽類，可以列舉例如磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉等。可以進一步含有蛋白脂質等發酵促進因子等。
本發明的乳酸的製造方法中，特別優選使用含有葡萄糖作為糖的培養液。培養初期的培養液(100質量％)中的葡萄糖濃度優選為1質量％以上，更優選為1 50質量％， 進一步優選為2 16質量％。由於葡萄糖濃度會隨培養而降低，因此優選根據需要添加葡萄糖而繼續進行培養。培養末期的葡萄糖濃度可變為1質量％以下。另外，在邊分離乳酸邊使培養液循環而進行連續培養的情況下，優選維持上述葡萄糖濃度。通過使葡萄糖濃度為2質量％以上，可進一步提高乳酸的生產率。另外，通過使培養液中的葡萄糖為16質量％ 以下，可進一步提高乳酸的生產率。
另外，為了提高乳酸製造的生產率，優選進行高密度培養。高密度培養時，優選使培養液中的轉化體的初始菌體濃度以乾燥菌體重量換算值表示為0. 1 50克/升。更優選使培養液中的轉化體的初始菌體濃度以乾燥菌體重量換算值表示為0. 2 40克/升。通過提高初始菌體濃度，能夠在短時間內實現高生產率。另外，初始菌體濃度過高時，可能會產生菌體的凝聚或純化效率的降低等問題。
需要說明的是，後述的實施例等中所示的菌體濃度是由利用日本分光公司製造的可見光紫外分光光度計V550測定的波長660nm的光的吸光度(0D660)換算得到的值。 660nm下OD = 1時相當於裂殖酵母乾重的0. 2g、溼重的0. 8g。
培養可以使用公知的酵母培養方法，例如可通過振蕩培養、攪拌培養等進行。
另外，培養溫度優選為23 37°C。另外，培養時間可以適當決定。
另外，培養可以是分批培養，也可以是連續培養。例如，對於分批培養，在進行培養後，從培養液中分離出菌體，可以獲得含有乳酸的培養液。另外，對於連續培養法，可以列舉例如從培養中的培養槽中抽出部分培養液，從抽出的培養液中分離乳酸，同時回收培養上清，向該培養上清中加入葡萄糖和新的培養液並將其返回到培養槽中，重複上述操作從而進行連續培養的方法。通過進行連續培養，可進一步提高乳酸的生產率。
在使用本發明的轉化體的乳酸的製造方法中，即使因乳酸的蓄積而達到較低的 pH(pH2 4左右)，也能夠在不進行中和的情況下生產乳酸。因此，在培養液的pH達到4 以下之後也能通過進一步繼續培養的連續培養來製造乳酸。培養末期的PH和連續培養中的PH優選為1 4，特別優選為1. 5 3. 5。為了提高乳酸的生產率，優選在培養液的pH 達到3. 5以下之後進一步繼續培養。由於本發明的轉化體的耐酸性優良，因此能夠在不中和轉化體所產生的培養液中的乳酸的情況下繼續培養。
從培養液中獲取乳酸可以使用公知的方法進行。特別優選在不中和培養液中的乳酸的情況下將培養液和乳酸分離而獲取乳酸。可以列舉例如通過離心分離從培養結束後的培養液中分離菌體，將PH調節為1以下後用乙醚、乙酸乙酯等進行提取的方法；使其吸附於離子交換樹脂上，洗滌後將其洗脫的方法；使用活性炭除去雜質的方法；在酸催化劑的存在下與醇反應後進行蒸餾的方法；使用分離膜進行分離的方法。另外，根據情況也可以在對培養液中的乳酸進行中和後將培養液與乳酸鹽分離而獲取乳酸。例如，通過將培養液中的乳酸轉變成鈣鹽或鋰鹽並使該中和鹽析出的方法也能夠獲取乳酸。
以上說明的本發明的乳酸的製造方法，由於使用了以耐酸性特別優良的粟酒裂殖酵母為宿主的轉化體，因此即使不用鹼進行中和也能夠以高生產率簡便地製造乳酸。另外， 由於PDC基因簇部分缺失或失活而使乙醇發酵的效率降低，因此乳酸的對糖收率(乳酸的生產量相對於消耗的糖量的比例)提高。本發明中，能夠容易地使乳酸的對糖收率為50質量％以上。根據情況，乳酸的對糖收率也可達到70質量％以上。另外，本發明的乳酸的製造方法也適合高濃度葡萄糖存在下及高濃度轉化體的高密度培養。
實施例
以下，示出實施例及比較例詳細地說明本發明。但是，本發明不受以下記載的限定。需要說明的是，本實施例中，若無特別說明，則「 ％ 」表示「質量％ 」。
[例1]

按照Latour 法(記載於 Nucleic Acids Res.雜誌、2006 年、34 卷、ell 頁，國際公開第2007/063919號小冊子)對粟酒裂殖酵母的尿嘧啶缺陷型株(ARC010、基因型 h-leUl-32Ura4-D18、由東京大學研究生院理學系研究科附屬基因實驗設施的飯野雄一教授提供)進行轉化，製作刪除了丙酮酸脫羧酶(PDC)基因及醇脫氫酶(ADH)基因的刪除株。
製作刪除片段時，以利用DNeaSy(QIAGEN公司制)由粟酒裂殖酵母的ARC032株 (基因型h_、由東京大學研究生院理學系研究科附屬基因實驗設施的飯野雄一教授提供) 製備的全基因組DNA為模板，對於各個要刪除的基因分別使用如下所示序列的8種合成寡聚DNA (才 口>公司制)。
1)用於製作Pdcl (系統名:SPAC13A11. 06)刪除片段的寡聚DNA
UF :5，-AGGCAAATCGTGAACTCGG-3，(下述序列表的序列號2)
UR :5，-GCCAATTCCACTCTCAATAGCCCGAACGTTCCGTCTCG-3，(下述序列表的序列號 3)
OF :5，-GCTATTGAGAGTGGAATTGGC-3，(下述序列表的序列號 4)
OR :5，-AGTGGGATTTGTAGCTAAGCTACTGGTTTCCACATTGTTTGG-3，(下述序列表的序列號5)
DF :5，-AAGTTTCGTCAATATCACAAGCTCGAGACGGAACGTTCGG-3，(下述序列表的序列號 )
DR :5，-TTACAATGCTGAGTGTGTATTCC-3，(下述序列表的序列號 7)
FF :5，-TGAACTCGGTTGAAAAATGTCG-3，(下述序列表的序列號 8)
FR :5，-TGAGTGTGTATTCCTTTTTCGC-3，(下述序列表的序列號 9)。
⑵用於製作Pdc2(系統名SPAC1F8. 07c)刪除片段的寡聚DNA
UF :5，-CTCTCCAGCTCCATCCATAAG-3，(下述序列表的序列號 10)
UR :5，-GACACAACTTCCTACCAAAAAGCCTTTCTGCCCATGTTTTCTGTC-3'(下述序列表的序列號11)
OF :5，-GCTTTTTGGTAGGAAGTTGTGTC-3，(下述序列表的序列號 12)
OR :5，-AGTGGGATTTGTAGCTAAGCTGTATCCATTTCAGCCGTTTGTG-3』 (下述序列表的序列號13)
DF :5，-AAGTTTCGTCAATATCACAAGCTGACAGAAAACATGGGCAGAAAG-3'(下述序列表的序列號14)
DR :5，-GTTCCTTAGAAAAAGCAACTTTGG-3，(下述序列表的序列號 15)
FF :5，-CATAAGCTTGCCACCACTTC-3，(下述序列表的序列號 16)
FR :5，-GAAAAAGCAACTTTGGTATTCTGC-3，(下述序列表的序列號 17)。
⑶用於製作Pdc3(系統名SPAC186. 09)刪除片段的寡聚DNA
UF :5，-AAGGCATATTCGTTGATTAACCC-3，(下述序列表的序列號 18)
UR :5，-GGTGGAAAGGTTTGTGCAATCCGTCAACTCATGATATTTCTTTATGG-3』(下述序列表的序列號19)
OF :5，-GATTGCACAAACCTTTCCACC-3，(下述序列表的序列號 20)
OR :5，-AGTGGGATTTGTAGCTAAGCTCATCCCACATCTGTAATAATCACG-3'(下述序列表的序列號21)DF 5' -AAGTTTCGTCAATATCACAAGCTCCATAAAGAAATATCATGAGTTGACG-3，(下述序列 表的序列號22)DR :5，-TTTGAGAAGAAAATTTTATGTCCAGC-3，(下述序列表的序列號 23)FF :5，-CCATTTAGCAGTATAAGGGTCG-3，(下述序列表的序列號 24)FR :5，-AAGTAAAAATGTGAAAGCAATGTAGG-3，(下述序列表的序列號 25)。(4)用於製作pdc4(系統名SPAC3G9. lie)刪除片段的寡聚DNAUF :5，-ACACACAAACACTTCCATTCC-3，(下述序列表的序列號洸)UR 5，-CCTAACAAAAGCATCATTTGAGAAGACGAATGAAATGACAGCAAC-3，(下述序列表的 序列號27)OF :5，-TTCTCAAATGATGCTTTTGTTAGG-3，(下述序列表的序列號沘)OR :5，-AGTGGGATTTGTAGCTAAGCTCTGGACAAGTCTACCTTGGAG-3，(下述序列表的序列 號四)DF :5，-AAGTTTCGTCAATATCACAAGCTGTTGCTGTCATTTCATTCGTC-3，(下述序列表的序 列號30)DR :5，-GATACAGGAGTACAACAAAACAC-3，(下述序列表的序列號 31)FF :5，-TCTCCATCCCTCCTCCC-3，(下述序列表的序列號 32)FR :5，-ACGCTACTTAAACAAGACAAGC-3，(下述序列表的序列號 33)。(5)用於製作adhl (系統名SPCC13B11. 01)刪除片段的寡聚DNAUF :5，-TCATTCCTCGATATTCAGTTC-3，(下述序列表的序列號 34)UR :5，-GCCAGTGGGATTTGTAGCTACTCTGATCGGCATTTTTTGG-3，(下述序列表的序列號 35)OF :5，-GTTTCGTCAATATCACAAGCTTCCCCAACCTCCCATTTCCTCC-3，(下述序列表的序 列號36)OR 5，-CTACGATCAGAAGAAGATCAATGAGACGCGGAAGGGGAGCGCC-3，(下述序列表的序 列號37)DF :5，-GGCGCTCCCCTTCCGCGTCTCATTGATCTTCTTCTGATCGTAG-3，(下述序列表的序 列號3 DR :5，-ATGCATTTCACTCTATTCCTC-3，(下述序列表的序列號 39)FF :5，-GCTATAGTTAAGTGTAAGAC-3，(下述序列表的序列號 40)FR :5，-TTGTCCACACCACTCATTCG-3，(下述序列表的序列號 41)。(6)用於製作adh4(系統名SPAC5H10. 06c)刪除片段的寡聚DNAUF :5，-ATCGTCGTCGATGCTGATTGG-3，(下述序列表的序列號 42)UR :5，-GCCAGTGGGATTTGTAGCTCAGCAGTCATTCTCATTCCG-3，(下述序列表的序列號 43)OF :5，-CGTCAATATCACAAGCTTGTCTCCCCTTCTATTGGGATTTGC-3，(下述序列表的序列 號44)OR :5，-GATTACCTGCAATCATGTTTCCGGCCTTTTGTGAAACCTGCC-3，(下述序列表的序列 號4
DF :5，-GGCAGGTTTCACAAAAGGCCGGAAACATGATTGCAGGTAATC-3，(下述序列表的序列號46)
DR :5，-GGAGAATGATGTATTGGTAAATAAC-3，(下述序列表的序列號 47)
FF :5，-CCTTGGGAATGAGCGAATTC-3，(下述序列表的序列號 48)
FR :5，-GGGTTGTGAAGAGCATACTG-3，(下述序列表的序列號 49)。
(7)用於製作adhX(系統名SPBC1773. 06c)刪除片段的寡聚DNA
UF :5，-GAAGGAGATTATGTGAAACAAGTTGAAATC-3，(下述序列表的序列號 50)
UR 5，-AGCTTAGCTACAAATCCCACTCTGAGGGTAGTGTTCTTGCTACAAAAATCT-3，(下述序列表的序列號51)
OF :5，-AAGTTTCGTCAATATCACAAGCTCATGACGGAAGATTCCGAGAAATTCCGTTT-3，(下述序列表的序列號52)
OR :5，-CAAAGCCATGCTTTTAATGTTAAAGTGAAT-3，(下述序列表的序列號 53)
DF 5 』-ATTCACTTTAACATTAAAAGCATGGCTTTGATCGATTGAGATTTTTGTAGCAAGAACACT-3』 (下述序列表的序列號
DR :5，-GGAAATGGTTCATGTGGACTGGGTTTTATT-3，(下述序列表的序列號 55)
FF :5，-CCTGCTCTTAAAATGACGAATGGTGTAGGC-3，(下述序列表的序列號 56)
FR :5，-ATATAGTGCGATATGGATGAAGGAGAAGAG-3，(下述序列表的序列號 57)。
(8)用於製作akrY(系統名SPAC977. 14c)刪除片段的寡聚DNA
UF :5，-ATCATAACTTACTATATCGTGAAGAAGAGA-3，(下述序列表的序列號 58)
UR 5，-AGCTTAGCTACAAATCCCACTTAGAATGAGTAATTCAACTTCTTAAACCAC-3，(下述序列表的序列號59)
OF :5，-AAGTTTCGTCAATATCACAAGCTTTAGCTTAAAAGTAATAAGCTTCTATGTGA-3，(下述序列表的序列號60)
OR :5，-TGAAGACATTTTATAAAACTTAAATAAAAA-3，(下述序列表的序列號 61)
DF :5， -TTTTTATTTAAGTTTTATAAAATGTCTTCAGAAATTTAAATCTGTGGTTTAAGAAGTTGA-3』(下述序列表的序列號62)
DR :5，-ACTTTGTTTATTGTAGAAAGTCGAGCTTGA-3，(下述序列表的序列號 63)
FF :5，-CAAAAGACAGGGGTCGGATTGATTCCTTGG-3，(下述序列表的序列號 64)
FR :5，-TGTGCTGTTTTTCAAGTGGTCATGCGTTAC-3，(下述序列表的序列號 65)。
對於各個要刪除的基因，分別通過使用KOD-Dash (東洋紡公司制)的PCR法，以UF 和UR製作UP區域，以OF和OR製作OL區域，以DF和DR製作DN區域，然後再以它們為模板，通過使用FF和FR的同樣的PCR法分別製作全長的刪除片段。製作全長的刪除片段時， 使用下述2種合成寡聚DNA (才《口 >公司制)、以利用ARC032株同樣製備的全基因組DNA 為模板、通過同樣的PCR法製備得到的ura4區域片段也一併作為模板使用。
5，-AGCTTAGCTACAAATCCCACT-3，(下述序列表的序列號 66)
5，-AGCTTGTGATATTGACGAAACTT-3，(下述序列表的序列號 67)
使用製作成的各刪除片段而製作的刪除株的株名、刪除的基因示於表1。
[表1]
權利要求
1.一種轉化體，其以粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)為宿主，重組有乳酸脫氫酶基因，且編碼所述粟酒裂殖酵母宿主的丙酮酸脫羧酶的基因簇部分缺失或失活。
2.如權利要求1所述的轉化體，其中，缺失或失活的編碼丙酮酸脫羧酶的基因為PDC2基因。
3.如權利要求1或2所述的轉化體，其中，所述乳酸脫氫酶基因為哺乳動物的乳酸脫氫酶基因。
4.如權利要求1 3中任一項所述的轉化體，其中，所述乳酸脫氫酶基因重組到粟酒裂殖酵母的染色體中。
5.一種轉化體的製造方法，所述轉化體為重組有乳酸脫氫酶基因且編碼丙酮酸脫羧酶的基因簇部分缺失或失活的轉化體，所述製造方法中，包括下述步驟以粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)為宿主，使用具有包含在粟酒裂殖酵母內發揮作用的啟動子、終止子和乳酸脫氫酶基因的表達盒的載體，將所述表達盒導入所述宿主中而得到轉化體，和使用編碼丙酮酸脫羧酶的基因簇部分缺失或失活的宿主作為所述宿主，或者使所述得到的轉化體的編碼丙酮酸脫羧酶的基因簇部分缺失或失活。
6.如權利要求5所述的轉化體的製造方法，其中，所述載體還具有對粟酒裂殖酵母的染色體進行同源重組的重組位點，使用該載體將表達盒導入粟酒裂殖酵母的染色體中。
7.如權利要求6所述的轉化體的製造方法，其中，宿主的染色體中進行同源重組的靶位點為轉座子基因Tf2。
8.如權利要求5 7中任一項所述的轉化體的製造方法，其中，以編碼丙酮酸脫羧酶的基因PDC2基因缺失或失活的粟酒裂殖酵母作為宿主。
9.如權利要求5 8中任一項所述的轉化體的製造方法，其中，所述乳酸脫氫酶基因為哺乳動物的乳酸脫氫酶基因。
10.一種乳酸的製造方法，其中，將權利要求1 4中任一項所述的轉化體在培養液中進行培養，並從該培養液中獲取乳酸。
11.如權利要求10所述的乳酸的製造方法，其中，使用含有濃度為1 50質量％的葡萄糖的培養液進行培養。
12.如權利要求10或11所述的乳酸的製造方法，其中，在通過由所述轉化體產生的乳酸的作用使所述培養液的PH達到3. 5以下後，進一步繼續培養。
13.如權利要求10 12中任一項所述的乳酸的製造方法，其中，使所述培養液中的轉化體的初始菌體濃度以乾燥菌體換算為0. 1 50克/升。
14.如權利要求10 13中任一項所述的乳酸的製造方法，其中，在不中和由所述轉化體產生的培養液中的乳酸的情況下繼續進行培養。
15.如權利要求10 14中任一項所述的乳酸的製造方法，其中，在不中和由所述轉化體產生的培養液中的乳酸的情況下從培養液中分離乳酸。
全文摘要
本發明涉及以粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)為宿主、重組有乳酸脫氫酶基因、且編碼所述粟酒裂殖酵母宿主的丙酮酸脫羧酶的基因簇部分缺失或失活的轉化體。
文檔編號C12P7/56GK102498209SQ20108003719
公開日2012年6月13日 申請日期2010年8月17日 優先權日2009年8月21日
發明者東田英毅, 原太志, 浜祐子(已逝) 申請人:旭硝子株式會社