棉花有絲分裂s期激酶蛋白相關基因skp1及其應用的製作方法

2023-05-01 12:45:56

專利名稱：棉花有絲分裂s期激酶蛋白相關基因skp1及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學領域，涉及棉花細胞S期(DNA合成期)激酶蛋白相關基因 SKPl及其應用。
背景技術：
SCF複合體的名稱最初源於發現的三個組成部分SKPl (DNA合成期激酶相關蛋白)、Culin/CDC53(細胞周期蛋白依賴性激酶)和F_box(F盒子)。在生物體內，選擇性降解蛋白是一種重要的功能調節機制。而真核生物中，泛素/26S蛋白酶體是目前了解比較多的一種降解途徑，而SCF複合體又是降解途徑中泛素連接酶E3的組成成分。因此SCF複合體在泛素/26S蛋白酶體降解途徑中起著比較重要的作用。SKPl，即 S 期激酶相關蛋白 1 (S-PHASE KINASE-ASSOCIATED PR0TEIN1, SKP1)，是真核生物中普遍存在的一類蛋白，是泛素連接酶SCF複合體的核心單位。SKPl參與SCF複合體的形成，還參與生物發育過程的多個代謝途徑，調控著包括植物減數分裂過程及生長素、 赤黴素、茉莉酸、乙烯和脫落酸等激素代謝過程。擬南芥中對此基因的研究表明，SKPl基因功能的缺失，會出現雄性不育突變體。目前，國內外棉花中對此基因的研究尚未有報導。因此，棉花中對此基因功能的研究，為進一步創造雄性不育突變體奠定了基礎。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供棉花有絲分裂S期激酶蛋白相關基因SKP1。為研究SKPl在棉花中的生物學效應奠定了基礎。本發明還要解決的技術問題，是提供上述基因SKPl的應用。為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案如下一種棉花有絲分裂S期激酶蛋白相關基因SKP1，該基因來源於陸地棉(Gossypium hirsutum L.)，具有如SEQ ID NO. 4所示的cDNA序列和如SEQ ID NO. 6所示的DNA序列。編碼上述棉花有絲分裂S期激酶蛋白相關基因SKPl的胺基酸序列如SED ID NO. 5 所示。該蛋白是小分子量蛋白，其主要的生物學功能在於參與SCF((聯會複合體))複合體的形成，是SCF複合體的核心亞單位，從而調控生物體內泛素介導的蛋白質降解，並參與多方面的生物發育過程。上述基因SKPl的超表達載體，為含有所述基因SKPl的植物表達載體PBI121。所述基因SKPl在棉花雄性不育系的不育株雄蕊中表達量高於其他組織中的應用。所述基因SKPl及所述基因SKPl的超表達載體在抑制菸草種子萌發、抑制菸草主根生長以及提高菸草激素含量中的應用。有益效果本發明用RACE方法克隆到了棉花S期激酶蛋白1相關基因SKP1，提供了一種棉花S期激酶蛋白1基因序列及其編碼蛋白質序列和應用。①該基因表達量在棉花雄性不育系中抗A的不育株雄蕊高於可育株雄蕊，且同一植株雄蕊表達量高於雌蕊，說明此基因很有可能與棉花的雄性不育有關。②在雄蕊、胚根、幼根、幼莖等分化能力比較強的組織中表達量比較高，說明該基因與植株的生長發育可能有一定的關係。本發明構建了 35S =SKPl重組表達載體，通過農桿菌介導的遺傳轉化方式轉化菸草驗證功能。為研究SKPl在棉花中的生物學效應奠定了基礎。通過轉基因菸草Tl代分析， 在整個萌發過程中，SKPl的過量表達延緩了種子的萌發，降低了萌發率。在萌發50小時後轉基因株系中某種激素或者化學物質出現了量的變化。轉基因株系主根長度都短於野生型 CK, SKPl基因超表達影響了菸草的根系生長發育過程。超表達SKPl還影響了植株體內各種激素含量的變化。


圖1棉花RNA的提取。圖2SKP1中間片段PCR，M :Marker2000,1為目的片段。圖 33，-RACE 片段 PCR，M :Marker2000。圖 45，RACE 片段 PCR，M :Marker2000。圖 5cDNA 全長 PCR，M :Marker2000, 2 為目的片段。圖6基因組全長PCR，M :Marker2000,1為目的片段。圖7植物超表達載體的陽性克隆。圖8重組表達載體PCR檢測。圖9重組表達載體酶切鑑定，1號泳道已經酶切開，2號泳道為對照。圖10轉基因菸草Tl代抗性篩選，已經轉入的植株可以健康生長。圖11轉基因菸草Tl代PCR檢測，1-7是轉基因植株，Marker2000, CK未轉基因植株。圖12SKP1在雄性不育系中的時空表達。圖13轉基因植株Tl代種子萌發統計。圖14轉基因植株主根短於非轉基因植株。圖15轉基因植株Tl代主根長度的測量。圖16a轉基因植株Tl代激素ABA含量的測定。圖16b轉基因植株Tl代激素IAA含量的測定。圖16c轉基因植株Tl代激素GA含量的測定。圖16d轉基因植株Tl代激素觀含量的測定。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用於說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例1 陸地棉(Gossypium hirsutum L.)棉花DNA和RNA的提取。棉花DNA的提取參照FANG等人的DNA提取方法[FANG G, Hammar S, Grumet R. Aquickand inexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA[J], Biotechniques, 1992，13 :52-56.]；棉花RNA的提取參照蔣建雄和張天真改進的CTAB法提取總RNA[蔣建雄，張天真·利用CTAB/酸酚法提取棉花組織總RNA[J].棉花學報，2003，15 (3) :166-167]。實施例2 :cDNA的製備。參照The first-strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒說明書(TaKaRa，Japan)。實施例3 :RT-PCR中間片段的獲得。(1)根據擬南芥SKPl基因的保守區設計簡併引物(預計350bp左右大小)。前引物:5-GA(T/C) GG (C/T) GA (G/A) (A/G/T) (A/T/C) (A/G/T/C) TT (C/T) GAGGT-3 ；後引物5-ATCTC(T/C) TC (A/G/C/T) GG (A/T/G) GT (T/C) TT (C/G/T) CC-3。(2)25ul 反應體系為前引物 Iul，後引物 Iul，d NTP (2. 5mM) 2ul，10X 緩衝液!3ul， MgCl22ul，模板 lul，ddH20 14. 8ul，Taq 酶 0. 2ul(3) RT-PCR反應程序(圖 2) :94°C，3m ；94°C，30s ；51 °C，45s ；72°C，70s，；35 個循環； 72°C, IOmin0(4)送上海生工測序，測序結果如SED ID N0. 1。(5)測序結果在NCBI上比對，與蓖麻、菸草、楊樹、擬南芥等多個物種的SKPl基因同源性很高。實施例4 :3，RACE (3，片段的獲得)。(1)引物3， CDS(12uM) :5' -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30V N-3『；(N = A, C, G, or T ;V = A, G, or C)；NUP :NUP(10 μ Μ)) 5' -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3『；3' GSP 5' -GGGACGCTGACTTTGTCAAGGTCG-3『；3' NGSP 5' -ATTCTGGCAGCGAACTATTTGAACATC-3『；10X UPM (通用引物混合物)；0. 4μΜ 長引物5 『 -CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3『；2μΜ短引物5 『 -CTAATACGACTCACTATAGGGC-3『；(2)3，-RACE-Ready cDNA 的製備參照TaKaRa公司的SMARTTM RACE cDNA擴增試劑盒操作說明(TaKaRa，Japan)。(3) 3，-RACE (快速擴增 3，末端 cDNA 片段)①混合物1的製備水34. 5ul，緩衝液5ul，dNTP (IOmM) Iul，聚合酶lul。②混勻簡短離心。③分別加入3，cDNA2. 5ul，UPM5ul，3，GSP (10 μ Μ) Iul 和上述混合物 41. 5ul。④混勻簡短離心。⑤25 個循環94°C，30sec(秒)；68°C，30sec ；72°C，3min。PCR產物作為下一反應的模板。⑥巢式PCR 引物為NUP和3NGSP，模板為上述⑤PCR產物。
程序:94°C,3min；94°C，30s ；58°C,45s ；72°C，70s，35 個循環；72°C IOmin ；結果見圖3。⑦送上海生工測序，測序結果如SED ID NO. 2。⑧測序結果出現了連續的A，即mRNA的poly㈧尾巴，說明已經獲得該基因的3』 端全長。實施例5 :5，RACE (5，片段的獲得)。(1)引物5，CDS(12u M) :5'-⑴ 25VN-3' (N = A，C，G，或 T ;V = A，G，或 C)SMART(12 μ M) 5' -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3『5GSP 5' -CGAATGCCCACTGGTTCTCCCGACG-3『5NGSP 5' GAAAGTCTTCCTGATCTCTTCTGGGG3『(2)5，-RACE-Ready cDNA 的製備參照TaKaRa公司的SMARTTM RACE cDNA擴增試劑盒操作說明(TaKaRa，Japan)。(3)5，-RACE:①混合物1的製備水34. 5ul，緩衝液5ul，dNTP (IOmM) Iul，聚合酶Iul。②混勻簡短離心。③分別加入5，cDNA2. 5ul，UPM5ul，5，GSP (10 μ Μ) Iul 和①的混合物 41. 5ul。④簡短離心收集液體。⑤25 個循環-MV，30s ；68°C，30s ；72°C，3min。⑥巢式PCR 引物NUP、5NGSP ；模板為⑤的PCR產物。程序-MV，3min；94°C，30s ；60°C，45s ；72°C，50s ；32 個循環，72°C，5min。結果如圖4。⑦送上海生工測序，測序結果如SED ID NO. 3。⑧本測序結果與實施例3(5)的中間片段和實施例4(3)的3』片段拼接後BLAST 比對，含有完整的編碼框，可知已經獲得本基因的全長序列。實施例6 =SKPl基因全長的PCR擴增。設計特異性引物分別以陸地棉(Gossypium hirsutum L.)基因組DNA(由實施例 1獲得)和cDNA(由實施例2獲得)為模板，擴增SKPl基因的DNA序列和cDNA序列。(1)引物設計SKPl-Fl 5- |ATC^ TCGTCGTCGGGGAG-3，17 TM :56. 3 位置73SKP1-R2 5-CACTCGAAATTGACCCT |TCAj· -3，20TM :55. 8 位置560PCR 程序:94°C,3m ；94°C，30s ；61 °C，45s ；72°C，70s，32 個循環；72°C，5mim。(2) ORF(開放閱讀框)的獲得PCR結果如圖5。測序結果如SED ID NO. 4。(3)基因組全長的獲得PCR結果如圖6。測序結果如SED ID N0. 6。(4)結果分析
擴增出的cDNA(SED ID NO. 4)與實施例5(3)⑧拼接的SKPl的ORF序列一致，且SKPl只有一個內含子(SED ID NO. 5)，大小為1395bp。實施例7 螢光定量 PCR技術檢測SKPl在棉花中的表達模式分析。(1)反應體系25 μ 1 反應體系中加入 ddH20 14. 75 μ 1，IOx buffer 2. 5 μ L，上下遊引物各 1 μ 1， dNTPl μ 1，TaqE 1 μ 1，SYBR Green I 染料 2. 5 μ 1，模板 DNAl μ 1，氯化鎂 0. 25 μ 1，所有樣品均在冰上加入，其中TaqE最後加以保持酶的活性。(2)反應條件94°C，5min ；94°C，30s ；64°C，30s ；72°C, Imin ；40 個循環，最後一個循環 72°C延伸 lOmin，4°C保存，並對反應產物電泳分析，確定其是否與擴增曲線結果吻合。(3)引物序列P rimerl :5，-ACGGGATACCGTTGCCTAATG-3，；ρ rimer2 :5， -GCGGATCGATCGTCTGTCTT-3，。(4)制定標準曲線根據不同濃度的質粒標準品的擴增曲線，在SDS軟體下系統自動生成標準曲線， 通過標準曲線方程，可計算待測樣品的基因相對含量。(5)結果分析(圖12)①該基因表達量在棉花核雄性不育系中抗A的不育株雄蕊高於可育株雄蕊，且同一植株雄蕊表達量高於雌蕊，說明此基因可能與棉花的育性有關。②在雄蕊、胚根、幼根、幼莖等分化能力比較強的組織中相對表達量比較高(螢光定量PCR)，說明該基因與植株的生長發育可能有一定的關係。實施例8 :35S =SKPl雙元表達載體的構建及鑑定。(1)35S :SKP1雙元表達載體的構建①引物SKP1-Xbal5-CGC TCTAG AATGTCGTCGTCGGGGAG-3 ；SKP I-BamHl 5-CGC GGATCCCTCGAAATTGACCCTACA-3。PCR 程序:94°C,3min ；94°C，30s ；61 °C，45s ；72°C，70s，32 個循環；72°C，5min。②經上海生工測序，本載體已經成功引入Xbal和BamHl兩個酶切位點，且順序正確(SED ID NO. 7)。③酶切回收目的片段分別用)(bal和BamHl雙酶切含有SKPl的克隆載體和植物表達載體PBI121，分別回收含有SKPl的目的片段以及PBI121大片段。④連接用T4連接酶將上述③兩個回收的片段連接並轉化大腸桿菌DH5 α獲得陽性克隆 (圖 7)。(2)35S =SKPl雙元表達載體的PCR鑑定①引物SKPl-Xbal 5-CGC TCTAGA ATGTCGTCGTCGGGGAG-3SKPl-BamHl 5-CGC GGATCC CTCGAAATTGACCCTACA-3PCR 程序
94°C，3min ；94°C，30s ；61 °C，45s ；72°C，70s，32 個循環；72°C，5min。②提取上述陽性克隆的質粒做模板，用來PCR檢測，結果如圖8。③預計片段的大小為500bp左右，結果在圖8中出現了預計500bp左右的條帶。(3)重組表達載體PBI121-35S-SKP1的雙酶切鑑定①酶切體系X-bal Iul, BamH I lul，緩衝液 lul，17ul 質粒總體系為20ul，37°C，3h。②結果如圖9。③結果分析1號為X-bal和BamH I雙酶切質粒結果，2號為未酶切的質粒，說明質粒已經切開， 初步說明成功引入了酶切位點。(4)重組表達載體PBI121-35S-SKP1測序鑑定結果如SED ID NO. 7，測序後酶切位點、保護鹼基、基因內部的序列都沒有發生突變；可進行轉基因實驗。實施例9 轉基因菸草的獲得。農桿菌(Agrobacterium tumefacjens)介導的菸草遺傳轉化法[Horsch RB, Fry JE, Hoffman NL, et al. A simple and general method for transferring gene into plants. Science，1985，227 (4691) :1229-1231]是目前研究最多、理論機理最清楚、技術方法最熟練的基因轉化途徑。迄今，近200種轉基因植物中80%以上是利用該系統產生。根據農桿菌侵染植物細胞的化學機理侵染開始於受傷的植物細胞分泌一些酚類和糖類化學物質，農桿菌被這些化學信號所吸引(Ti質粒中VirA和VirG基因介導的趨化性)，這些化學物質進入農桿菌並誘導Ti質粒的基因表達，從而起到活化作用。(1)菸草轉基因的準備工作①無菌苗的培養取本塞母氏菸草(由南京曉莊學院張邊江贈與)種子，用30%的乙醇浸泡30s，然後無菌水清洗3次，再轉至0. 1 %的升汞裡面脫菌7min，最後用無菌水清洗5次，平鋪於MS 固體培養基中，待菸草苗長至6片真葉即可用於侵染。 ②農桿菌菌液培養的準備。③MS1、MS2、MS3培養基的配置基本培養基MS1:MS分化培養基MS2 :MS+6-BA lug/ml+Cef (頭孢黴素)500ug/ml生根培養基MS3 1/2MS+Kan (卡納黴素)100ug/ml+IAA 0. 2g/l，其中 1/2MS 是指大量元素和鐵鹽減半，其它不變。④試劑配置70%的乙醇，0. 的生汞。另外，準備純水升)、培養皿(裝有濾紙)、打孔器、手術刀、封口膜(d = 2-5mm)、鑷子把)等工具，槍頭、離心管(50ml)、用於配抗生素的專用無菌水，所有這些都需要近期滅菌。(2)農桿菌介導的葉盤轉換法①EHA105(Tiangen，Beijing)/PBI121 (TaKaRa，Japan)(菌株在甘油中於 _80°C保存，使用前在YEB培養基上，分別於和37°C下)經活化後，單菌落接種於aiil YEB液體培養基(分別加50ug/ml的利福平和25ug/ml的卡納黴素)中，分別於和37°C震蕩培養過夜，轉速分別為220rpm和165rpm②以的接種量接種於100ml LB液體培養基(胰蛋白腖10g/L，酵母提取5g/L， 氯化鈉5g/L) (kan 50ug/ml, Rif 25ug/ml)，震蕩培養至對數生長中期(OD600 = 0 . 5)。③無菌狀態下，4000rpm離心lOmin。④沉澱用20ml MSl液體培養基洗滌後，4000rpm離心lOmin，用20ml MSl液體培
養基懸浮。⑤從菸草幼苗(溫室或完全培養箱栽培植株)上摘取完全展開的葉片，將葉片先用蒸餾水清洗2-3次，再用70%乙醇浸泡45秒，30%次氯酸鈉或0. 1 %的生汞消毒6-8min 後，再用無菌水洗葉片5次，最後用無菌濾紙吸乾多餘的水分。⑥用打孔器從表面消毒後的菸草葉片中打得葉盤直徑2cm左右。將葉盤放入步驟 5的菌液中，渦旋混合4-5min，使細菌與葉盤組織傷口部位充分接觸。將葉盤從細菌懸浮液中取出，置於滅菌濾紙上吸乾，然後置於MSl培養基(即MS培養基)上(葉片的光滑面朝上)，用封口膜封好後，在25°C的培養室裡共培養2天。⑦把MSl培養基上的葉盤轉接到分化培養基MS2(MS+6-BA lug/ml+Km IOOug/ ml+Cp500ug/ml)，在25°C光照周期14h (20001ux)培養2_3周，每隔5天換一次培養基，即每隔4天轉接一次。轉接過程中注意要將葉盤的邊緣侵入到培養基裡，以便葉盤吸收營養，而且轉接當中要一直按照開始時轉接的方式把葉片的光滑面朝上。⑧待愈傷組織分化成苗後，用解剖刀切取整體的小植株轉入裝有分化培養基MS2 的三角瓶中，繼續培養。⑨植株長大後，切除多餘的愈傷組織保留整株的植株轉入生根培養基中 MS3(l/2MS+Km 100ug/ml+IAA 0. 2mg/l)中，讓其生根。⑩待再生幼苗根系發達後，開蓋培養2-3天。強化植株後，取出植株，用無菌水洗掉幼苗根部的瓊脂再移栽到滅菌土的盆缽中，放置於室溫中培養。注意觀察整個過程轉基因菸草的生長狀況，注意澆水，開關燈等。實施例10 轉基因菸草的篩選與鑑定。(1)通過抗性初步篩選利用表達載體的抗性基因，對轉基因植株進行初步篩選，卡那黴素的濃度依據不同的植物以及不同的生長期不同而異。含有目的基因的轉基因植株，會在抗性培養基中茁長生長。反之，就會不出芽或者即使出芽了，也會慢慢枯萎黃花而死亡。本實驗採用的是PBI121表達載體，有卡那黴素抗性；轉入基因的植株會在含有卡那黴素的培養基中健康生長(如圖10)。(2)分子鑑定①引物SKPl-Fl :5，- |ATC^ TCGTCGTCGGGGAG-3』 ；SKP 1-R2 :5，-CACTCGAAATTGACCCT |TCA| -3，。PCR 程序94°C，3min ；94°C，30s ；61 °C，45s ；72°C，70s，32 個循環；72°C，5min。
②基因組PCR鑑定如圖11，1至7是轉基因植株，均有500bp左右的目的條帶，CK是未轉基因植株的對照，沒有檢測出目的條帶，因此可以初步說明7個植株均已成功導入了目的基因SKP1。實施例11 通過轉基因菸草Tl代分析SKPl的功能。(I)Tl代種子萌發延遲①實驗方法取直徑IOcm培養皿，鋪上一層濾紙；用洗瓶加水至培養品中，至完全浸潤為止；每個培養皿中撒100粒菸草種子；於溫室中23°C放置，12小時光周期。以未轉基因菸草為對照，總計選取7個轉基因株系，每個株系做三次重複，取平均值，統計種子的萌發率。以種胚突破種皮視為萌發標準。種子萌發率=(萌發數/總數)X100%。②結果分析(圖13):在萌發48小時後，野生型種子的萌發率已經達到了 68. 82 %，而此時7個轉基因株系中最大的萌發率才49. 78%。持續萌發到M小時後，野生型種子萌發率為92. 85%，此時 7個轉基因株系的萌發率均低於85. 00%。再持續萌發到63小時後，野生型種子和7個轉基因株系的種子萌發率均達到95%左右，並趨於平衡，但是相對於野生型而言，轉基因株系種子萌發率已經明顯延遲。在所有轉基因株系中，150、278和280三個株系的萌發速度比其他株系更慢。這說明，在整個萌發過程中，SKPl的過量表達延緩了種子的萌發，降低了萌發率。在萌發50小時後，轉基因植株有萌發率出現陡增的現象，說明在此之後轉基因株系中某種激素或者化學物質出現了量的變化，而非轉基因株系沒有此現象。(2) Tl代株系主根長度①測量方法待轉基因菸草長至20天左右，以野生型為對照，測量主根長度，每個株系取100棵植株，每個株系測量三個重複，統計主根長度。②結果分析(圖14和圖15)發現野生型對照和7個轉基因株系主根長度分別為0. 51 士 0. 054cm (CK)， 0. 34 + 0. 014cm(T150),0. 29 + 0. 018cm(T241),0. 30 + 0. 021em(T255), 0. 2 + 0. 005cm (T276) , 0. 46 + 0. 087cm (T278) , 0. 44 + 0. 036cm (T280)， 0.41 士0.049cm(T283)。結果顯示，7個轉基因株系主根長度都短於野生型CK。這說明SKPl 基因超表達影響了菸草的根系生長發育過程。(3)轉基因菸草激素含量變化①測量方法分別選取萌發45小時、52小時、和60小時的種子以及幼株的葉片，用分析天平精確稱取0. Ig樣品，每個樣品3次重複，將樣品放入冷凍管中液氮速凍10-15分鐘，置於-70 度冰箱備用。將待測樣品送至中國農業大學化控實驗室，使用酶聯免疫法(ELSA)分別測定 IAA (生長素)、GA3 (赤黴素3)、ZR (玉米素)和ABA (脫落酸)的含量(ng每克鮮重)。實驗數據用SAS8. 0軟體進行統計分析。③結果分析(圖16a d)
在種子萌發階段野生型和7個轉基因株系ABA的含量幾乎一致，而到苗期野生型和7個轉基因株系ABA的含量均驟降，且含量基本一致。IAA含量在種子萌發至營養生長階段均呈現下降趨勢，而7個轉基因株系與野生型菸草IAA含量在每個階段的含量基本沒有變化。在種子萌發和營養生長階段，GA的含量幾乎沒有什麼變化，但是轉基因菸草GA的含量普遍高於野生型菸草。玉米素觀在種子萌發過程和營養生長階段中的含量也是幾乎沒有什麼變化，但是7個轉基因株系在整個過程的含量均明顯高於野生型菸草(圖16a d)。這說明超表達SKPl影響了植株體內各種激素含量的變化。
權利要求
1.棉花有絲分裂S期激酶蛋白相關基因SKP1，其特徵在於，該基因來源於陸地棉 (Gossypium hirsutum L.)，其 cDNA 序列如 SEQ ID NO. 4 所示，其 DNA 序列如 SEQ IDNO. 6 所示。
2.編碼權利要求1所述基因SKPl的胺基酸序列如SEQID NO. 5所示。
3.權利要求1所述基因SKPl的超表達載體，其特徵在於，含有權利要求1所述基因 SKPl的植物表達載體PBI121。
4.權利要求1所述基因SKPl在棉花雄性不育系的不育株雄蕊中表達量高於其他組織中的應用。
5.權利要求1所述基因SKPl在抑制菸草種子萌發、抑制菸草主根生長以及提高菸草激素含量中的應用。
6.權利要求3所述超表達載體在抑制菸草種子萌發、抑制菸草主根生長以及提高菸草激素含量中的應用。
全文摘要
本發明屬於分子生物學領域，涉及棉花細胞S期(DNA合成期)激酶蛋白相關基因SKP1及其應用，該基因具有SEQ ID NO.4所示的cDNA序列和SEQ ID NO.6所示的DNA序列，其編碼產物胺基酸序列為SED ID NO.5。包括該基因超表達載體的構建、超表達載體質粒的遺傳轉化以及應用。研究發現，該基因參與了SCF複合體的形成並調控著植物雄性減數分裂、生長素、赤黴素、脫落酸、茉莉酸和乙烯等生理髮育過程，並且與植物的生長發育有密切關係。因此，本發明對於研究該基因對植物生長發育的影響，具有重要的意義。
文檔編號C07K14/415GK102363785SQ20111033962
公開日2012年2月29日 申請日期2011年10月31日 優先權日2011年10月31日
發明者唐燦明, 張朝軍, 胡德龍, 陳全戰 申請人:南京農業大學