薑黃素類似物CD35在製備治療乳腺癌藥物中的應用的製作方法

2023-05-01 12:16:41

本發明涉及醫學領域，確切的說是薑黃素類似物cd35新的醫藥用途。

背景技術：

乳腺癌（breastcarcinoma）是目前全球範圍內女性最常見的惡性腫瘤之一。乳腺癌的遠處轉移是導致乳腺癌患者死亡的重要原因。全球乳腺癌的發病率每年約以2%的速度遞增，預計到2030年全球發病人數和死亡人數將分別達到264萬和170萬。目前，臨床上針對乳腺癌治療仍是以手術切除為主，放化療和免疫療法治療為輔。手術治療對與生存密切相關的局部區域復發及遠處轉移事件起到的作用十分有限。放化療對乳腺癌的治癒率雖然有一定程度的提高，但是傳統的治療乳腺癌的藥物如紫杉醇和氟尿嘧啶類藥物等毒副作用大，嚴重影響患者生存質量。近幾年中醫預防和治療乳腺癌也成為研究熱點，且以靶向治療尤為突出，其可通過辨證施治來提高乳腺癌患者的生存質量，減輕放、化療的毒副作用。

薑黃素（curcumin）是從天然植物薑黃中提取的酚類化合物。近年來的體外和體內研究相繼證實薑黃素具有抗腫瘤作用，美國國立腫瘤研究所將其列為第3代癌化學預防藥，現已用於臨床ⅱ期。然而單純薑黃素水溶性差、水溶液在中性至鹼性條件下不穩定、在體內的抗腫瘤活性偏低且首關消除明顯、分解代謝快、生物利用度低等不良特性嚴重限制其臨床應用。鑑於薑黃素以上等缺點，國內外學者開始對薑黃素結構改造進行研究。薑黃素類藥物的開發途徑之一是定位於以薑黃素為先導化合物的類似物的開發，也就是通過結構改造獲得具有類似結構和藥學性質的化合物。薑黃素類似物保留了薑黃素藥物安全性、增強了抗腫瘤活性，克服了薑黃素的不足，有望成為繼薑黃素之後更為有效、安全的抗腫瘤藥物。

目前，薑黃素類似物在癌症方面的學術報導也被提及，但針對薑黃素cd35在乳腺癌中具體如何應用目前仍處於空白。

技術實現要素：

本發明的目的為：針對現有技術存在的不足，本發明在於提供一種薑黃素類似物cd35在製備治療乳腺癌藥物中的應用，在提高藥物的靶向性和降低藥物的毒副作用上具有顯著的優點。

為實現上述目的，本發明提供了如下技術方案：

一種薑黃素類似物cd35在製備治療乳腺癌藥物中的應用，薑黃素類似物cd35化學式為：一種薑黃素類似物cd35在製備治療乳腺癌藥物中的應用，薑黃素類似物cd35化學式為：1-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-5-(2-硝基苯基)-1，4-戊二烯-3-酮，結構式為

，

薑黃素類似物cd35下調hippo通路中yap蛋白的表達來抑制乳腺癌細胞自噬進而抑制乳腺癌細胞能量代謝。

所述薑黃素類似物cd35的含量為10µg/ml。

本發明基於介導hippo-yap/autophagy調控能量代謝抑制乳腺癌轉移的相關機制研究發現，採用薑黃素類似物cd35介導hippo通路與自噬共同調控能量代謝來抑制乳腺癌轉移，薑黃素類似物cd35下調hippo通路中yap蛋白的表達抑制乳腺癌細胞自噬進而抑制乳腺癌細胞能量代謝；提供薑黃素類似物cd35在製備治療乳腺癌藥物中的應用，提高治療乳腺癌藥物的靶向性和降低藥物的毒副作用。

附圖說明

圖1為本發明薑黃素類似物cd35對乳腺癌細胞增殖能力的抑制率曲線圖；

圖2為本發明薑黃素類似物cd35對乳腺癌細胞遷移、侵襲能力的抑制效果圖；

圖3為本發明薑黃素類似物cd35誘導乳腺癌mda-mb-231細胞凋亡；

圖4為本發明免疫印跡試驗中薑黃素類似物cd35對乳腺癌mda-mb-231細胞中周期相關蛋白cyclinb、cyclind、cycline、cdk2、cdk4、p21蛋白的表達水平影響；

圖5為本發明乳腺癌mda-mb-231細胞超微結構圖；

圖6為本發明薑黃素類似物cd35對mda-mb-231細胞能量代謝的影響；

圖7為本發明薑黃素類似物cd35對乳腺癌mda-mb-231細胞中蛋白表達的影響；

圖8為本發明過表達yap蛋白對乳腺癌mda-mb-231細胞能量代謝及相關蛋白表達的影響；

圖9為本發明模型鼠藥物處理17天平均瘤體體積與體重變化圖；

圖10為本發明病理切片he染色觀察經薑黃素及其類似物cd35處理過的乳腺癌組織病理形態變化（×200）；

圖11為本發明透射電鏡超薄切片觀察經薑黃素及其類似物cd35處理過的乳腺癌組織超微形態變化（×20000）；

圖12為本發明免疫組化檢測經薑黃素及其衍生物處理過的乳腺癌組織ki-67表達情況及半定量分析；

圖13為本發明藥物治療後裸鼠乳腺癌肺轉移模型balb/c-nu裸鼠肺組織病理結構變化（he，x40）；

圖14為本發明藥物治療後裸鼠乳腺癌肺轉移模型中肺組織e-cadherin、mmps蛋白的表達情況。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明進一步描述。

本發明提供的一種薑黃素類似物cd35在製備治療乳腺癌藥物中的應用，薑黃素類似物cd35化學式為：1-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-5-(2-硝基苯基)-1，4-戊二烯-3-酮，結構式為：。

1、薑黃素類似物cd35抑制乳腺癌細胞轉移的體外實驗；

1.1實驗材料；

實驗細胞：乳腺癌mda-mb-231細胞、乳腺癌hs578t細胞，用含10%fbs的dmem培養液的培養瓶（100µl/ml青黴素、100µl/ml鏈黴素、2mmol/l左旋穀氨醯胺）在37℃、5%co2培養箱中培養，常規0.125%胰蛋白酶消化，傳代。

實驗藥物：薑黃素、薑黃素類似物cd35；

其他實驗材料：凍存管、dmem培養液（gibco）、0.01mol/l的pbs緩衝液、0.125%胰蛋白酶（beyotime，c02010）、胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)、0.1%結晶紫、33%醋酸、4%多聚甲醛、戊二醛、甲苯胺蘭染色液、1%鋨酸、fitc羊抗小鼠igg、hrp標記的羊抗鼠igg、hrp標記的羊抗兔igg、甘氨酸、穀氨酸、甲醇、蛋白質標記marker、wb定影和顯影劑、脫脂奶粉、鋁箔紙、棉籤、15ml離心管、50ml離心管、10µl移液槍、200µl移液槍、1000µl移液槍、75cm2無菌細胞培養瓶、100mm培養皿、6孔無菌培養板、24孔無菌培養板、96孔無菌培養板、聚丙烯醯胺凝膠配製試劑盒、bio-rad電泳裝置、高速冷凍離心機（microfuge22r，beckman）、超淨工作檯（sw-cj-2f）、雪花製冰機、電熱恆溫鼓風乾燥箱（dk-600）、zealway（致微）git系列滅菌器、優普超純水機（upt-iii-107）、恆溫co2培養箱（galaxys170)、pcr自動系列化分析儀、光學顯微鏡（leicadmi4000b）、酶標儀（moleculardevies，spectramaxm5）、透射電子顯微鏡（hitach，h-7500）等。

1.2、mts實驗；

選用mda-mb-231乳腺癌細胞株系，用含10%胎牛血清的dmem培養液調整至6×l03/孔，將細胞接種到96孔板中，每個實驗組設置6個復孔；置於37℃，5%co2培養箱中貼壁培養24h，24h後細胞長至60%左右，進行實驗，實驗組分為mock(空白組)、nc（dmso組）、薑黃素組（5、10、20µg/ml濃度組）、薑黃素類似物cd35（5、10、20µg/ml濃度組）；放置於37℃，5%co2培養箱中繼續培養24h後將細胞培養液換成無血清培養液100μl/孔，加入20μlmts混合液（pms:mts=1：20）。加入mts混合液後，用錫箔紙包裹96孔板，於37℃培養箱中放置4h。在490nm波長下測od值。公式：抑制率（%）=1-實驗組od值/dmso組od值×100%。

1.3、cck8實驗；

選用乳腺癌hs578t細胞株系，用含10%胎牛血清的dmem培養液調整至6×l03/孔，將細胞接種到96孔板中，每個實驗組設置6個復孔；置於37℃，5%co2培養箱中貼壁培養24h，24h後細胞長至60%左右，進行實驗，實驗組分為mock(空白組)、nc（dmso組）、薑黃素組（5、10、20µg/ml濃度組）、薑黃素類似物cd35（5、10、20µg/ml濃度組）；放置於37℃，5%co2培養箱中繼續培養24h後將細胞培養液更換為cck8稀釋液（cck8:dmem=1:10）100μl/孔。加入cck8混合液後，用錫箔紙包裹96孔板，於37℃培養箱中放置1-4h。在450nm波長下測od值。公式：抑制率（%）=1-實驗組od值/dmso組od值×100%。

1.4、transwell細胞遷移實驗；

選用乳腺癌mda-mb-231、hs578t細胞株系，用無血清培養液調整至2×l04/孔，將細胞接種到24孔板中，每個實驗組設置3個復孔；置於37℃，5%co2培養箱中貼壁培養2h，2h後進行實驗，實驗組分為mock(空白組)、nc（dmso組）、薑黃素組（10µg/ml濃度組）、薑黃素類似物cd35（10µg/ml濃度組）；將上室與下室中的培養液根據組別分別更換為含相應處理的無血清培養液與同樣處理的含10%胎牛血清的dmem培養液，放置於37℃，5%co2培養箱中繼續培養24h後對細胞進行固定、染色、觀察並計數。公式：細胞遷移率=實驗組細胞遷移數/dmso組細胞數×100%。

1.5、transwell細胞侵襲實驗；

取50µlmatrigel稀釋液（matrigel:dmem=1:9）鋪於小室。37℃培養箱中放置24h後，加入50µldmem進行水化。水化完畢後，吸走原液。其餘操作步驟同遷移實驗。

1.6流式凋亡檢測；

設置空白組、dmso組、薑黃素組（10µg/ml）、薑黃素類似物cd35組（10µg/ml），藥物作用24h。胰酶消化收集細胞，pbs重懸清洗2次，每管中加入300µl聯合緩衝液重懸細胞，加入3µlapc染液、3µlpi混勻，避光靜置15min後，進行流式細胞儀檢測。

1.7海馬能量代謝檢測；

設置空白組、dmso組、薑黃素組（10µg/ml）、薑黃素類似物cd35組（10µg/ml），藥物作用24h。收集細胞，於能量代謝分析儀測定各組乳腺癌細胞的代謝活性。

1.8電鏡觀察；

設置空白組、dmso組、薑黃素組（10µg/ml）、薑黃素類似物cd35組（10µg/ml），藥物作用5h。收集細胞，戊二醛固定後用環氧樹脂包埋。於超微切片機製成半薄切片，於超薄切片機製成超薄切片。電鏡下觀察各組細胞的超微結構變化。

進行藥物幹預後（方法同電鏡），裂解提取蛋白，並進行蛋白定量。依次進行電泳、轉膜、封閉後加入一抗，以gapdh為內參孵育，洗膜後加入二抗孵育，曝光後利用軟體分析。分別檢測各組細胞中自噬相關蛋白lc3、atg-3、atg-7；hippo通路相關蛋白p-yap、lats1、sav1、p-mob1、mob1、mst1、mst2、yap/taz；線粒體相關蛋白ef-4、polg；凋亡相關蛋白akt、p-akt、jak-2、nf-κb、cyclinb、cyclind、cycline、cdk2、cdk4、p21；轉移相關蛋白e-cadherin、mmp-2、mmp-9的表達水平。

1.10過表達乳腺癌細胞內yap蛋白；

構建yap質粒，通過lip2000將質粒轉染至人乳腺癌mda-mb-231細胞中，設置對照組（dmso組）、薑黃素類似物cd35組（10µg/ml）、yap過表達組以及yap過表達組與薑黃素類似物cd35（10µg/ml）共同作用組，進行相應處理後，採用海馬能量代謝實驗檢測乳腺癌mda-mb-231細胞的能量代謝水平，並通過westernblot實驗對相關蛋白的表達水平進行檢測。

2裸鼠乳腺癌肺轉移動物模型的體內實驗；

2.1實驗材料；

實驗細胞：乳腺癌mda-mb-231細胞。

實驗動物：spf級雌性balb/c-nu裸鼠，20±5g。在本校實驗動物中心晝夜12h交替光照，自由食水，飼養於室溫（23±2）℃條件下。

實驗藥物：薑黃素、薑黃素類似物cd35。

其他實驗材料：dmem培養液（giboc）、生理鹽水、蓖麻油溶液、胎牛血清、75cm2無菌細胞培養瓶、0.01mol/l的pbs緩衝液、0.125%胰蛋白酶（beyotime，c02010）、二甲基亞碸（dmso）、細胞計數板、棉籤、無水酒精、70%酒精、75%酒精、80%酒精、90%酒精、95%酒精、10%中性甲醛溶液、二甲苯、石蠟、蒸餾水、蘇木精染液、伊紅染液、中性樹膠、3%戊二醛固定液（ph7.4）、1%鋨酸、4%甲醛、13%過氧化氫、雙抗、大小鼠耳標、1ml注射器、5ml注射器、胰島素注射器、飽和苦味酸、冰醋酸、200µl移液槍、1000µl移液槍、15ml離心管、40ml離心管、50ml離心管、搖床（ts-200）、自動電子天平（al204）、dj-cj-2n型超級潔淨工作檯、離心機（centrifuge，tdsg）、冰凍切片機（hm525）、光學顯微鏡（nikon，eclipse，ts100）、nikona1r/a1雷射共聚焦顯微鏡等、倒置顯微鏡（ts100led-f）。

2.2模型鼠移植瘤抑制實驗；

將balb/c-nu雌性裸鼠飼養於spf級環境中，將人乳腺癌mda-mb-231細胞接種至6周齡雌性裸鼠的腹股溝右側，每側接種癌細胞1×107個，待腫瘤達到50mm3時，將建模成功的裸鼠24隻隨機分成3組，每組8隻，薑黃素組和薑黃類似物cd35組隔天相同時間按25mg/kg給藥劑量進行腹腔注射治療，每隻注射0.2ml，空白對照組給以同體積蓖麻油混合液，注射完畢繼續飼養，各組均連續治療17天。瘤體體積計算：v=ab2/2（a為長徑,b為短徑），連續治療17天後處死裸鼠剝離腫瘤組織稱重，計算抑瘤率：抑瘤率=(1-實驗組移植瘤體積/對照組移植瘤體積）×100%。

2.3裸鼠乳腺癌肺轉移模型建模及治療；

尾靜脈接種0.1ml（4×105cell）乳腺癌mda-mb-231細胞，建立裸鼠乳腺癌肺轉移模型。24天後將建模成功的24隻裸鼠隨機分成生理鹽水組、蓖麻油組、薑黃素組、薑黃素類似物cd35組。每天定時腹腔注射0.2ml相應溶液，給藥劑量按25mg/kg，連續治療21天。

2.4透射電鏡觀察

戊二醛固定的組織用環氧樹脂包埋，在超微切片機上製作成半薄切片，經超薄切片機切片，製成超薄切片，於電子顯微鏡下觀察瘤組織的超微結構變化。

2.5組織石蠟切片製備；

將取下的肺組織以常規10%的中性緩衝甲醛溶液固定36h，石蠟包埋，5µm連續切片，he染色。中性樹膠封片後，於光鏡下觀察各組肺組織病理學差異與改變。

2.6免疫組織化學檢測ki-67表達；

切片抗原修復，3%h2o2阻斷，孵育一抗，漂洗後孵育二抗，經dab顯色，蘇木精復染後封片。以pbs代替一抗作為陰性對照，在細胞核、細胞膜或細胞質中呈現棕黃色為陽性。

2.7免疫螢光染色

將取下的肺組織用oct包埋劑浸沒，置於液氮中製作成冰凍切片。室溫晾乾後封閉組織，孵育一抗，漂洗後進行二抗孵育。經dba顯色，蘇木精復染後封片，觀察照相。

3、臨床相關性實驗

通過臨床乳腺癌組織晶片採用免疫組化法檢測hippo通路中的關鍵蛋白yap的表達水平。乳腺癌組織切片常規脫蠟和水化，pbs漂洗3次，每次3min；於溼盒內用3%過氧化氫溶液（a液）室溫孵育10min，滴加5%-10%封閉用正常動物非免疫血清工作液（b液）。滴加一抗工作液，yap於37℃孵育箱內孵育12h，pbs漂洗3次，每次3min。滴加生物素標記二抗工作液（c液）；滴加辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素工作液，配製新鮮的dab顯色劑。蘇木素復染細胞核，染色時間2min。進行yap蛋白與乳腺癌的相關性分析以及生存分析，探討yap蛋白在乳腺癌中的臨床意義。

4、數據統計，所有實驗均測試3次以上，採用spss17.0統計軟體進行分析，計量資料以x±s表示，以p＜0.05為標準認為差異具有統計學意義。

5、實驗結果；

5.1、薑黃素類似物cd35對乳腺癌細胞的增殖抑制作用；

結果顯示薑黃素及其類似物cd35均不同程度地抑制乳腺癌mda-mb-231、hs578t細胞的增殖，並呈現濃度依賴性，且薑黃素類似物cd35較薑黃素有更強的增殖抑制作用，兩者作用效果差異顯著，具有統計學意義（p<0.01，圖1）。

5.2、薑黃素類似物cd35對乳腺癌細胞遷移、侵襲能力的抑制作用；

使用10µg/ml薑黃素及其類似物cd35處理乳腺癌細胞24h，結果顯示和對照組相比，薑黃素組與類似物cd35組的乳腺癌mda-mb-231細胞在遷移實驗中每區域的遷移個數分別為117.73±33.87，31.73±6.53個（p<0.01，圖2-a），在侵襲實驗中每區域的遷移個數分別為78.55±23.36，8.5±5.48個（p<0.01，圖2-a）；薑黃素組與類似物cd35組的乳腺癌hs578t細胞在遷移實驗中每區域的遷移個數分別為165.8±23.71個，28.47±19.42個（p<0.01，圖2-b），在侵襲實驗中每區域的遷移個數分別為157.75±31.54個，24.25±3.3個（p<0.01，圖2-b），

結果表明薑黃素類似物cd35對乳腺癌細胞的遷移、侵襲能力有明顯的抑制作用，且作用效果優於薑黃素，差異具有統計學意義。westernblot結果進一步顯示薑黃素類似物cd35可下調乳腺癌mda-mb-231細胞中轉移相關蛋白mmp-2、mmp-9的表達，並上調粘連蛋白e-cadherin的表達（圖2-c），可見薑黃素類似物cd35是通過減弱乳腺癌細胞的轉移能力並增大癌細胞間的黏附力來抑制乳腺癌轉移的。

5.3、薑黃素類似物cd35誘導乳腺癌細胞凋亡；

使用10µg/ml薑黃素及其類似物cd35處理細胞24h，結果顯示薑黃素與類似物cd35組細胞的凋亡率分別為3.0%±2.47%，33.3%±2.5%說明薑黃素類似物cd35較薑黃素有更強的誘導癌細胞凋亡的能力（p<0.05，圖3-a）。westernblot結果顯示薑黃素類似物cd35可影響乳腺癌細胞中凋亡相關蛋白p-sapk/jnk、jak-2、akt、p-akt、nf-κb的表達水平（圖3-b），可見薑黃素類似物cd35可通過多種途徑來實現誘導乳腺癌細胞凋亡的作用。

5.4、薑黃素類似物cd35抑制乳腺癌細胞周期的進程；

westernblot結果顯示薑黃素類似物cd35可影響乳腺癌mda-mb-231細胞中周期相關蛋白cyclinb、cyclind、cycline、cdk2、cdk4、p21蛋白的表達水平，使乳腺癌細胞周期發生阻滯，且作用效果優於薑黃素（圖4）。

5.5、電鏡觀察；

鏡下可見空白組與dmso組細胞胞體光滑，細胞核清晰可見，核仁大且完整，細胞器結構清晰；薑黃素組細胞核仁發生不同程度碎裂，胞漿內空泡增多，細胞器溶解；薑黃素類似物cd35組細胞呈凋亡現象，染色質固縮，凝集成團塊狀聚集在核膜內緣，核質濃縮，碎裂溶解，胞漿內空泡增多，細胞器嚴重破壞（圖5）。

5.6、薑黃素類似物cd35抑制乳腺癌細胞的能量代謝；

海馬能量代謝檢測結果顯示經薑黃素及其類似物cd35處理後乳腺癌mda-mb-231細胞活力明顯降低，藥物可同時抑制乳腺癌細胞內的氧化磷酸化與糖酵解過程，且薑黃素類似物cd35的作用效果明顯優於薑黃素，差異有統計學意義（p<0.01，圖6-a）。westernblot結果進一步顯示薑黃素類似物cd35可下調乳腺癌mda-mb-231細胞中線粒體相關蛋白ef-4、polg的表達（圖6-b）。可見薑黃素類似物cd35可抑制乳腺癌細胞的能量代謝。

5.7、薑黃素類似物cd35對乳腺癌細胞hippo通路與自噬過程的影響；

結果顯示薑黃素類似物cd35可下調乳腺癌細胞內自噬相關蛋白lc3、atg-3、atg-7的表達水平（圖7-a）；下調hippo通路相關蛋白lats1、p-yap（s397）、p-yap(s127)、yap/taz、mob1、mst1、mst2、sav1的表達水平並上調hippo通路相關蛋白p-mob1的表達水平（圖7-b）。

5.8、過表達乳腺癌細胞中的yap蛋白；

通過基因轉染技術過表達乳腺癌細胞中的yap蛋白。westernblot結果進一步顯示，過表達的yap蛋白可影響自噬相關蛋白beclin、lc3的表達水平，促進了乳腺癌細胞中自噬的發生，並且能抵抗由薑黃素類似物cd35引起的自噬抑制效應（圖8-b）。可見yap蛋白在調控乳腺癌mda-mb-231生理活性中起重要作用。

5.9、模型鼠瘤體體積及體重變化結果；

本實驗成功建立人乳腺癌mda-mb-231細胞裸鼠移植瘤模型，經17天不同試劑處理，各組裸鼠瘤體體積有明顯差異，藥物組較對照組瘤體增加速度顯著減小，且薑黃素類似物cd35組的減緩程度大於薑黃素組裸鼠。處死裸鼠計算抑瘤率，薑黃素和薑黃素類似物cd35組的抑瘤率各達17.90%和47.81%（圖9），差異有統計學意義（p＜0.05）。

5.10、移植瘤病理切片he染色結果；

對照組腫瘤細胞排列緊密，呈實體癌巢狀，細胞體積偏大，胞質豐富，細胞間連接緊密，核膜清楚，可見較多核分裂象，少見核固縮、核碎裂等壞死表現；薑黃素組腫瘤組織有輕微退行性改變，癌巢狀實體減少，核質比減小，有核固縮、核碎裂等壞死表現，可見中性粒細胞等炎症細胞浸潤；薑黃素類似物cd35組腫瘤細胞排列疏鬆，鮮有實體癌巢，多見核固縮現象，有較多中性粒細胞等炎症細胞浸潤（圖10）。

5.11、透射電鏡結果；

在電鏡下，對照組瘤組織細胞表面可見大小不等的微足和微絨毛，細胞核形狀不規則，核內富含常染色質，分布均勻，核仁明顯，胞質內核糖體豐富，線粒體外膜和內嵴完整。薑黃素組瘤組織細胞超微結構變化較明顯，部分細胞線粒體出現嵴斷裂和基質空化，可見大量自噬體。薑黃素類似物cd35組瘤組織細胞胞質內的線粒體損傷更為嚴重，部分或大部分呈現空泡樣和髓鞘樣變，部分出現較典型的凋亡改變，細胞核固縮，核膜間隙增大，核內染色質濃縮，凝集呈半月形或團塊狀，聚集在核膜內緣，胞質內出現許多大小不等的空泡，細胞外可查見大量細胞碎片（圖11）。

5.12免疫組化檢測ki-67表達情況；

免疫組化結果由兩位附屬醫院病理科醫生分別計數，結果顯示：對照組、薑黃素組、薑黃素類似物cd35組ki-67在移植性mda-mb-231乳腺癌中的表達陽性率分別為74.6%，46.0%，26.1%。與對照組相比，薑黃素對ki-67表達下調較為明顯，薑黃素類似物cd35組能明顯下調ki-67的表達（p＜0.05），從而抑制癌細胞的生長增殖(如圖12)。

5.13裸鼠乳腺癌肺轉移模型肺組織病理切片he染色結果；

鏡下各組肺組織he染色結果顯示：生理鹽水組與蓖麻油組裸鼠肺部癌轉移灶數量多，累及面積廣，核深染；薑黃素組與薑黃素類似物cd35組裸鼠肺組織轉移灶數量明顯較少且累及面積較窄。高倍鏡下可見薑黃素類似物cd35組裸鼠肺組織轉移灶周圍仍保留正常細胞形態（圖13）。

5.14裸鼠乳腺癌肺轉移模型免疫螢光結果分析；

免疫螢光結果顯示：經藥物作用後，乳腺癌肺轉移裸鼠肺組織粘連蛋白e-cadherin表達增強，轉移相關蛋白mmp-2、mmp-9蛋白表達減弱，且薑黃素類似物cd35組較薑黃素組變化更明顯（圖14）。

綜上試驗，mts、cck8實驗結果顯示薑黃素類似物cd35對乳腺癌mda-mb-231、hs578t細胞的增殖抑制作用呈現濃度依賴性；transwell細胞遷移和侵襲實驗結果表明薑黃素類似物cd35在抑制乳腺癌mda-mb-231、hs578t細胞遷移、侵襲方面較薑黃素更為有效；流式凋亡實驗顯示薑黃素類似物cd35可有效誘導乳腺癌mda-mb-231細胞凋亡；電鏡下可見經cd35處理後的乳腺癌細胞呈現凋亡狀態；westernblot實驗結果也進一步驗證cd35可影響乳腺癌細胞內線粒體相關蛋白ef-4、polg，周期相關蛋白cyclinb、cyclind、cycline、cdk2、cdk4、p21，凋亡相關蛋白p-sapk/jnk、akt、p-akt、jak-2、nf-κb，轉移相關蛋白e-cadherin、mmp-2、mmp-9的表達水平，抑制乳腺癌mda-mb-231細胞的能量代謝，阻滯細胞周期的進展，誘導癌細胞凋亡，導致其轉移能力減弱。

ki-67是一種核蛋白，與核糖體rna轉錄有關，其作為一個細胞增殖的標記物可反映腫瘤細胞活性。經藥物治療後，瘤體ki-67表達下調，且以cd35組最為明顯，結合治療期間瘤體體積變化情況，可見cd35能有效抑制乳腺癌移植瘤在裸鼠體內的生長。與此同時，經薑黃素類似物cd35治療後，裸鼠肺部乳腺癌轉移症狀減輕，肺組織中轉移相關蛋白mmp-2、mmp-9蛋白表達水平下調，粘連蛋白e-cadherin表達水平上升，提示在藥物作用下乳腺癌在裸鼠體內的轉移過程受到抑制。而藥物治療期間裸鼠體重無明顯波動，可見薑黃素類似物cd35具有良好的生物安全性。研究從增殖和轉移兩方面共同驗證了薑黃素類似物cd35在體內抑制乳腺癌發生發展的作用效果，薑黃素類似物cd35在治療乳腺癌上表現出明顯優於薑黃素的強大作用，薑黃素類似物cd35在抑制乳腺癌轉移上表現出了強大的效應，其可通過下調hippo通路中yap蛋白的表達、抑制乳腺癌細胞的自噬來影響乳腺癌細胞的能量代謝過程，進而起到抑制乳腺癌轉移的作用。