用於減少脂質體誘導的補體激活的脂質體組合物的製作方法

2023-04-27 02:15:41 3

專利名稱：用於減少脂質體誘導的補體激活的脂質體組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於體內降低脂質體誘導的補體激活的脂質體組合物。
背景技術：
脂質體用於多種治療目的，特別是用於通過系統給予這些治療劑的脂質體製劑將這些治療劑攜帶到靶細胞。脂質體-藥物製劑提供潛在的改善的藥物遞送性質，如藥物控制釋放。脂質體從注射位置到達目標區域、細胞或位置通常需要長的循環時間。因此，當脂質體進行系統給藥時，期望使用無相互作用劑為脂質體包衣，例如親水聚合物鏈如聚乙二醇的包衣，以延長脂質體的血液循環持續時間。這種表面改性的脂質體通常稱為「長循環」或「空間穩定化」脂質體。最常見的表面改性是為構成脂質體的約5摩爾％的脂類連接典型地具有1000-5000分子量的PEG鏈。參見例如Lasic，D.和Martin，F.，編輯，「STEALTHLIPOSOMES」，CRC出版社，Boca Raton，FL，1995第108-100頁，及其中的參考文獻。這種脂質體表現出來的藥代動力學的特徵在於，與易於迅速地從血液除去並在肝臟和脾臟中積聚的非表面改性的脂質體相比(ld.)，非劑量依賴性地減少肝臟和脾臟(通過單核吞噬細胞系統、或MPS)攝入脂質體，並顯著延長血液循環時間。
最通常使用和市售的PEG取代的磷脂基於磷脂醯乙醇胺，通常為二硬脂醯磷脂醯乙醇胺(DSPE)，其在極性頭基帶負電荷。脂質體中的負表面電荷在某些方面不利，如在與細胞的相互作用中(參見例如Miller，C.M.等人，Biochemistry，3712875-12883(1998))、和陽離子藥物的遞送，其中可能發生藥物滲漏(參見例如Webb，M.S.等人，Biochim.Biophys.Acta，1372272-282(1998))。
在某些個體中，某些脂質體組合物的體內給藥產生的一個公認的問題是誘導補體激活(Laverman，P.等人，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems，18(6)551(2001)；Szebeni，J.等人，Am.J.Physiol Heart Circ.Physio.，279H1319(2000)；Szebeni，J.等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，15(1)57(1998))。補體系統是免疫系統體液分支的主要效應物，並且包括近三十種血清和膜蛋白。在初始活化之後，多種補體組分以高度受控的酶促級聯方式相互作用，生成反應產物，所述反應產物有助於清除抗原和產生炎性應答。有兩個補體激活途徑經典途徑和替代途徑。兩個途徑共用一個末端反應序列，其產生大分子的膜攻擊複合體(MAC)，其可溶解多種細胞、細菌、和病毒(Kuby，Janis，IMMUNOLOGY，W.H.Freeman and Company，第14章，1997)。
補體反應產物放大最初的抗原-抗體反應並將該反應轉化為更有效的防禦。在補體激活過程中釋放的多種小的可擴散反應產物誘導局部血管舒張並趨化性地吸引吞噬細胞，引起炎性反應。當抗原被補體反應產物覆蓋時，其更容易被帶有用於這些補體產物的受體的吞噬細胞所吞噬(Kuby，Janis，IMMUNOLOGY，W.H.Freeman andCompany，第14章，1997)。
已經報導了補體激活在由體內給予脂質體製劑所引起的心血管窘迫中的因果作用，所述脂質體製劑如市售的聚乙二醇化的脂質體阿黴素製劑(Doxil_，Caelyx_)和用於克羅恩結腸炎的閃爍掃描診斷的聚乙二醇化的脂質體製劑HYNIC-PEG(Szebeni，J.等人，Am.J.PhysiolHeart Circ.Physiol.，279H1319(2000)；Szebeni，J.等人，CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，15(1)57(1998)；SzebeniJ.等人，J.Liposome Res.，12(1 2)165(2002))。這些製劑輸液引起的症狀包括心肺窘迫如呼吸困難、呼吸急促、高血壓和/或低血壓、胸痛、背痛、潮紅、頭痛、和寒戰(Szebeni，J.等人，Am.J.Physiol HeartCirc.Physiol.，279H1319(2000))。
脂質體誘導的補體激活隨多種因素變化，還沒有弄清楚哪些因素或因素組合是主要誘因。脂質體誘導的補體激活似乎隨脂質飽和度、膽固醇含量、帶電磷脂的存在、和脂質體大小的變化而變化(Bradley，A.J.，Archives of Biochem.and Biophys.，357(2)185(1998))。
期望提供降低體內給予時補體激活應答的脂質體製劑。
發明概述一方面，本發明提供了當體內給予含有包載治療劑的脂質體時降低脂質體誘導的補體激活的方法。該方法包括提供包含成囊脂質和1-10摩爾％、更優選1-5摩爾％的下式的中性脂質聚合物的脂質體和餘量的成囊脂質 其中R1和R2各自為具有8到24個碳原子的烷基或鏈烯基鏈；n＝10-300，Z為選自C1-C3烷氧基、C1-C3烷基醚、N-甲基醯胺、二甲基醯胺、甲基碳酸酯、二甲基碳酸酯、氨基甲酸酯、醯胺、N-甲基乙醯胺、羥基、苄氧基、羧酸酯、和C1-C3烷基或芳基碳酸酯的惰性端基，L選自(i)-X-(C＝O)-Y-CH2-、(ii)-X-(C＝O)-、和(iii)-X-CH2-，其中X和Y獨立地選自氧、NH、和直接鍵，條件是當L為-X-(C＝O)-時，X不是NH。
在一個實施方案中，X為氧，Y為氮。
在另一個實施方案中，L為氨基甲酸酯鍵、酯鍵、或碳酸酯鍵。在其它實施方案中，L為-O-(C＝O)-NH-CH2-(氨基甲酸酯鍵)。
在一個實施方案中，Z為羥基或甲氧基。
在優選實施方案中，中性脂質聚合物是二硬脂醯基(氨基甲酸酯連接的)聚乙二醇或甲氧基-聚乙二醇1，2二硬脂醯基甘油。
在另一個實施方案中，R1和R2各自為具有8到24個碳原子的無支鏈的烷基或鏈烯基鏈。在優選實施方案中，R1和R2各自為C17H35。
在另一個實施方案中，n為約20到約115。
在一個實施方案中，治療藥物為化療劑。示例性的藥物包括蒽環類抗生素如阿黴素、柔紅黴素、表柔比星、和伊達比星。其它示例性的藥物包括含鉑化合物，如順鉑或選自以下的順鉑類似物卡鉑、奧馬鉑、奧沙利鉑、((-)-(R)-2-氨基甲基吡咯烷(1，1-環丁烷二羧基合))鉑、折尼鉑、恩洛鉑、洛鉑、(SP-4-3(R)-1，1-環丁烷-二羧基合(2-)-(2-甲基-1，4-丁二胺-N，N′))鉑、奈達鉑、和雙乙酸基合-氨絡物-二氯-環己胺-鉑(IV)。
在結合附圖閱讀以下本發明的詳細說明之後可以更透徹地理解本發明的這些及其它目的和特徵。
附圖簡述

圖1表示製備本文稱為PEG-DS的氨基甲酸酯連接的不帶電荷的脂質聚合物的合成圖解；圖2A-2D表示製備醚、酯、醯胺、和酮基連接的不帶電荷的脂質聚合物的合成圖解；圖3A-3C為表示包含3摩爾％PEG-DS(圖3A)、5摩爾％PEG-DSPE(圖3B)、或5摩爾％PEG-DS(圖3C)的HSPC/Chol脂質體在血液、肝臟、和脾臟中的生物分布圖；圖4為表示不包含PEG脂質(十字形)、包含5摩爾％PEG-DSPE(三角形)、或5摩爾％PEG-DS(圓形)的氫化大豆卵磷脂脂質體在血液中的保留圖；圖5表示製備衍生自天然磷脂如磷脂醯乙醇胺或磷脂醯甘油的中性-兩性離子型mPEG-脂質共軛物的合成圖解；圖6表示通過SC5b-9誘導法測量製劑1、3、4、5、6、8、9、和10的體外人血清中補體激活的誘導，表示為通過磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)的SC5b-9誘導百分比。
發明的詳細說明定義如本文中使用的，「中性的」脂質體聚合物是不帶電荷的、沒有淨電荷，即，即使有電荷也是正負電荷等量的。
「成囊脂質」是指具有疏水性和極性頭基部分的兩性脂質，並且其可以在水中自發地形成雙分子層囊如磷脂，或者被穩定地結合到脂質雙分子層中，其疏水性部分與雙分子層膜內部(疏水性區域)接觸，極性頭基部分定向朝向外部(膜的極性表面)。這種類型的成囊脂質典型地包括一個或兩個疏水性醯基烴鏈或類固醇基團，並且可以在極性頭基處包含化學活性基團，如胺、酸、酯、醛、或醇。這一類成囊脂質包括磷脂，如磷脂醯膽鹼(PC)、磷脂醯乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA)、磷脂醯肌醇(PI)、和鞘磷脂(SM)，其中兩個烴鏈的長度典型為約14-22個碳原子，並且具有不同的不飽和度。其它成囊脂質包括糖脂，如腦苷脂和神經節苷脂；和固醇，如膽固醇。對於本文中描述的組合物，優選組分為本文中所述的磷脂如PC和PE、膽固醇、和中性脂質聚合物。
「烷基」是指包含碳和氫的完全飽和的單價基團，其可為支鏈或直鏈形式。烷基例子為甲基、乙基、正丁基、叔丁基、正庚基、和異丙基。「低級烷基」是指具有1-6個碳原子的烷基，例如甲基、乙基、正丁基、異丁基、叔丁基、異戊基、正戊基、和異戊基。
「鏈烯基」是指包含碳和氫的單價基團，其可為支鏈或直鏈，並且其包含一個或多個雙鍵。
縮寫PEG聚乙二醇；mPEG甲氧基封端的聚乙二醇；Chol膽固醇；PC磷脂醯膽鹼；PHPC部分氫化的磷脂醯膽鹼；PHEPC部分氫化的卵磷脂醯膽鹼；HSPC氫化的大豆磷脂醯膽鹼；DSPE二硬脂醯磷脂醯乙醇胺；DSP或PEG-DS二硬脂醯(氨基甲酸酯連接的)PEG；APD1-氨基-2，3-丙二醇；DTPA二亞乙基四胺五乙酸；Bn苄基。
減少補體激活的方法一方面，本發明提供了當對人體內給予脂質體製劑時減少補體激活誘導的方法。如以下所述，該方法包括提供脂質體製劑，所述製劑包括中性脂質聚合物，或者，在選擇性的實施方案中，包括中性-兩性離子型脂質聚合物。本發明還提供了包括中性脂質聚合物的脂質體組合物，或者，在選擇性的實施方案中，提供了包括中性-兩性離子型脂質聚合物，用於當體內給予脂質體製劑時減少補體激活誘導。本發明進一步考慮了脂質體組合物在製備用於減少受試者體內補體激活的藥物中的應用。
A.脂質體製劑本發明的PEG取代的中性脂質聚合物具有以下所示的結構
其中R1和R2各自為具有8到24個碳原子的烷基或鏈烯基鏈；n為約10到約300，Z為選自C1-C3烷氧基、C1-C3烷基醚、n-甲基醯胺、二甲基醯胺、甲基碳酸酯、二甲基碳酸酯、氨基甲酸酯、醯胺、n-甲基乙醯胺、羥基、苄氧基、羧酸酯、和C1-C3烷基或芳基碳酸酯的惰性端基；和L選自(i)-X-(C＝O)-Y-CH2-、(ii)-X-(C＝O)-、和(iii)-X-CH2-，其中X和Y獨立地選自氧、NH、和直接鍵。
選擇末端基團Z使得與誘導補體激活的體內組分的相互作用最小化。優選Z是作為結合水的氫鍵受體且不能作為氫鍵供體的部分。適合於Z的示例性惰性部分包括C1-C5烷氧基，更優選C1-C3烷氧基，C1-C5烷基醚，更優選C1-C3烷基醚，n-甲基醯胺、二甲基醯胺、甲基碳酸酯、二甲基碳酸酯、氨基甲酸酯、醯胺、n-甲基乙醯胺、羥基、苄氧基、羧酸酯、和C1-C3烷基或芳基碳酸酯。優選的Z部分包括甲氧基、乙氧基、和n-甲基乙醯胺。
脂質聚合物包括中性鍵(L)代替經常用於空間穩定化脂質體中的PEG-磷脂如PEG-DSPE的荷電磷酸酯鍵。L可包含荷電部分，條件是淨電荷為零，例如，L為兩性離子型。中性鍵可為例如氨基甲酸酯、酯、醯胺、碳酸酯、脲、胺、醚、硫或二氧化硫。在其中期望在體內給定循環時間之後除去PEG鏈的應用中優選可水解的或可裂解的鍵，如碳酸酯和酯。這種特徵可用於釋放藥物或有助於在脂質體到達其目標之後攝入細胞(Martin F.J.等人，美國專利5,891,468(1999)；Zalipsky，S.等人，PCT公開WO 98/18813(1998))。
優選與連接基團連接的PEG基團的分子量為約1000到15000，也就是說，其中n為約20到約340。更優選地，分子量為約1000到12000(n＝約20-275)，最優選為約1000到5000(n＝約20-115)。優選R1和R2基團的長度為16-20個碳原子，特別優選R1＝R2＝C17H35(使得COOR為硬脂醯基)。
如上所述，將不帶電荷的脂質引入到脂質體中可提供以下優點，如減少包封的兩性分子的弱鹼性或酸性藥物的滲漏。另一個優點是在調節脂質體表面與靶細胞和與RES的相互作用中有更大的靈活性(Miller，C.M.等人，Biochemistry，3712875-12883(1998))。PEG取代的合成神經醯胺已經用作空間穩定化脂質體的不帶電荷組分(Webb，M.S.等人，Biochim.Biophys.Acta，1372272-282(1998))；然而，這些分子為複合體，並且製備很昂貴，並且它們通常不能被裝入磷脂雙層以及二醯基甘油磷脂中。
可使用標準合成方法製備脂質聚合物。例如，如圖1所示，氨基甲酸酯連接的化合物(L＝-O-(C＝O)-NH-CH2-)的製備可通過使mPEG(甲氧基PEG)的末端羥基與對硝基苯基氯甲酸酯反應得到對硝基苯基碳酸酯，然後其與1-氨基-2，3-丙二醇反應得到中間體氨基甲酸酯。然後對鄰二醇部分的羥基醯化得到最終產物。使用甘油代替1-氨基-2，3-丙二醇，以類似的路線可用於生產碳酸酯連接的產物(L＝-O-(C＝O)-O-CH2-)。氨基甲酸酯連接的二硬脂醯基和二(二十烷醯基)脂質聚合物的製備在實施例1和2中描述。
如圖2A所示，醚連接的脂質聚合物(L＝-O-CH2-)可通過使mPEG-OH的末端羥基與縮水甘油基氯化物(如表氯醇)反應，水解得到的環氧化物，並將得到的二醇醯化而容易地製備。例如，如圖2B所示，酯連接的脂質聚合物(L＝-O-(C＝O)-或-(C＝O)-CH2-)可通過使mPEG-OH與甘油酸縮丙酮的活化衍生物(2，2-二甲基-1，3-二氧雜環戊烷-4-羧酸)或所示的四碳同系物2，2-二甲基-1，3-二氧雜環戊烷-4-乙酸反應製備。然後將二醇脫保護並醯化。
通過使用例如Zalipsky，S.等人(Eur.Polym.J.，191177-1183(1983))的方法製備的mPEG-NH2代替mPEG-OH的相應反應可用於製備具有醯胺、脲或胺連接的脂質聚合物(即，其中L＝-NH-(C＝O)-NH-、-NH-(C＝O)-CH2-、-NH-(C＝O)-NH-CH2-、或-NH-CH2-)。
其中L為-X-(C＝O)-，且其中X為O或NH的化合物可通過使活化的羧基封端的PEG(通過羥基封端的PEG的氧化和通過例如轉化為硝基苯基酯或與DCC反應而使羧基活化製備)分別與1，2，3-丙三醇或1-氨基-2，3-丙二醇反應製備(圖2C)。酮基連接的化合物(即，其中X為直接鍵)可通過使醛封端的PEG(通過羥基封端的PEG的溫和氧化製備)與例如1-溴-2，3-丙二醇縮丙酮的格氏試劑的縮合(圖2D)、隨後在無酸的條件下氧化成酮、並將縮丙酮水解得到二醇而製備。在所有情況下，然後照例將二醇醯化。
沒有與甘油部分連接的PEG低聚物的末端(α末端；上述基團Z)典型地為羥基或甲氧基，但可根據本領域中已知的方法將其官能化，以幫助將不同的分子連接到中性脂質聚合物上，用於使脂質體靶向於特定的細胞或組織類型，或者幫助藥物遞送。待連接的分子可包括例如肽、糖、抗體、或維生素。以下實施例2-3描述了根據類似於上述那些途徑製備α官能化的脂質聚合物的步驟，但是以市售的其中α末端被基團如叔丁基醚或苄基醚取代的PEG低聚物開始，在合成分子的脂質部分之後，所述基團容易地轉化為羥基。在這種情況下，然後通過轉化為對硝基苯基碳酸酯將該末端活化。
圖5中闡明另一個示例性的中性脂質聚合物。使用聚合物PEG和脂質DSPG舉例說明中性-兩性離子型聚合物-脂質的合成。應該理解，也可以使用其它親水聚合物和其它脂質，例如磷脂醯乙醇胺與mPEG醛的還原烷基化作用。簡單地說，如實施例4中更詳細的描述，通過用高碘酸鈉處理使DSPG氧化，然後在硼烷-吡啶的存在下使其與mPEG-NH2反應，形成中性-兩性離子型mPEG-DSPE聚合物。兩性離子型脂質聚合物在生理學pH下具有淨的中性電荷。其用於中性脂質體雙分子層，除去脂質體粒子中的不希望的電荷。
B.脂質體藥代動力學長循環脂質體通過在由成囊脂質組成的脂質體中引入1-10摩爾％，更優選1-5摩爾％，更優選3-10摩爾％的中性脂質聚合物或中性-兩性離子型聚合物而形成。為了說明，如實施例5中所述，製備了引入3到5摩爾％的mPEG2000-DSPE(二硬脂醯磷脂醯乙醇胺)或氨基甲酸酯連接的脂質聚合物mPEG2000-DS的脂質體。脂質的餘量由1.5∶1摩爾比的HSPC和膽固醇組成。為脂質體裝載標識物125I-tyraminylinulin。如實施例5所述，將各個製劑的樣品注射到小鼠尾靜脈中，並在不同的時間點測定組織分布。存在於血液、肝臟和脾臟中的水平如表1A-1C所示，並在圖3A-3C中用圖表表示。如數據所示，含PEG-DS的脂質體的藥代動力學非常類似於包含PEG-DSPE的脂質體。
表1A血液中的脂質體分布

表1B肝臟中的脂質體分布

表1C脾臟中的脂質體分布

類似的研究比較了PEG脂質與不含PEG脂質的對照製劑的性能。圖4表示不含PEG脂質(十字形)、含5摩爾％的PEG2000-DSPE(三角形)、或5摩爾％PEG2000-DS(圓形)的2∶1 HSPC脂質體在血液中的保留。
使用包含mPEG2000-DS∶PHPC∶Choi為5∶55∶40摩爾比的脂質體進行了另一項研究。通過引入銦-DTPA複合體標記脂質體。在24小時測定血液中和不同的組織中的注射劑量的百分比。結果如表2A-2C中所示。再一次，脂質體表現出典型的長循環藥代動力學，其4小時後的平均保留大於注射劑量的70％，24小時之後大於30％。
表2A.血液中銦的注射劑量的百分比

表2B.24小時的組織中注射劑量的百分比

表2C.24小時的組織中的每克注射劑量的百分比

*每毫升注射劑量的百分比比較包含5摩爾％mPEG2000-DS或mPEG2000-DSPE、餘量為PHEPC的脂質體在給藥後最多24小時時血液中的保留百分比。如圖4所示，藥代動力學實質上是相同的，在24小時之後保留約40％。
C.體外補體激活的測量為了評價由中性脂質聚合物組成的脂質體製劑對補體激活誘導的作用，如實施例6中所述，製備了十二種脂質體製劑和兩種膠束製劑。實施例6中的表3詳述了製劑的脂質組成。簡而言之並參考表4，製劑包括製劑1、2、3兩種裝填藥物、具有相同脂質組成的脂質體，不同之處只在於包載藥物為阿黴素(Doxil_)和順鉑(製劑1和2)，和具有相同脂質組成但沒有包載治療劑的製劑，即安慰劑(製劑3)；製劑4通過比較具有0.6摩爾％PEG2000-DSPE的製劑與具有相同組成但具有更高(4.5摩爾％)量PEG2000-DSPE的製劑3，評價PEG2000-DSPE的量對補體激活誘導的作用；製劑5、6、7通過比較製劑3(相對於製劑1和2的Doxil_和順鉑的安慰劑)與其中除去帶負電荷的PEG2000-DSPE(製劑6)、代之以兩種中性脂質聚合物PEG2000-DS(製劑7)和PEG2000-DSG(製劑6；DSG＝二硬脂醯基甘油，參見圖2A的mPEG-DSG的結構)研究PEG-DSPE的負電荷的作用；製劑8、9通過比較具有帶負電荷的PEG-DSPE和具有350道爾頓(製劑8)、2000道爾頓(製劑3)、和12,000道爾頓(製劑9)的不同PEG分子量的脂質體，研究PEG部分的大小對補體激活誘導的作用；製劑10製備通過成脂質體的磷脂氫化大豆磷脂醯甘油(HSPG)引入負電荷的脂質體，與其中通過成膠束的脂質聚合物PEG2000-DSPE引入負電荷的脂質體(製劑3)比較；製劑11、12作為脂質體陽性對照，是大粒徑並由DMPC/膽固醇/DMPG組成的脂質體，其中膽固醇的摩爾百分數為50％(製劑11)和71％(製劑12)，因為這些製劑在補體系統，包括豬的補體依賴性心肺窘迫的活化中是高度有效的；製劑13、14為了測定沒有其它脂質的PEG2000-DSPE是否誘導補體激活，製備了PEG2000-DSPE膠束(製劑13)和PEG-DS膠束(製劑14)。
脂質體製劑10與脂質體製劑3的比較提供了對暴露的負電荷與隱藏的負電荷之間的區別的研究，因為具有通過成脂質體的磷脂HSPG引入的帶負電荷的脂質體具有暴露的負電荷，而其中通過脂質聚合物PEG2000-DSPE引入負電荷的脂質體具有由PEG鏈遮蔽的負電荷。
表4總結了脂質體和膠束製劑，並且表示了大小、表面電位(Ψ0)和ζ電位。
表4脂質體組合物的表徵

1脂質體組合物的詳細信息參見以下實施例6中的表32測試方法學參見以下實施例6如實施例6中所述，通過當人血清與不同脂質體製劑培養時測量S-蛋白質結合的C末端複合物(SC5b-9)的形成作為補體激活的標識物來測定體外補體激活誘導。在典型的研究中，脂質體製劑與血清混合併在37℃下培養約30分鐘。中止反應，並通過酶聯免疫吸附試驗測定SC5b-9的量。製劑1、3、4、5、6、8、9和10的結果如圖6中所示。
圖6表示了所示脂質體製劑的SC5b-9誘導，其作為用磷酸鹽緩衝鹽水培養的細胞的基線SC5b-9誘導的百分比。脂質體製劑5和6為電中性的(製劑6包括中性脂質聚合物PEG-DS，製劑5由中性脂質HSPC/Chol組成)。這些中性製劑沒有引起SC5b-9形成的可測量的改變。包含0.6％PEG2000-DSPE的製劑5還引起很少的補體激活。然而，所有的其它脂質體製劑引起了相對於PBS對照的顯著的SC5b-9上升。「Doxil_安慰劑」製劑3和含帶負電荷的HSPG的脂質體製劑10引起中等的、約2倍的SC5b-9增加，Doxil_製劑1引起非常強烈的、7倍的SC5b-9增加。這些數據暗示了負電荷，特別是Doxil_中的阿黴素是補體激活的貢獻因素。該發現被具有與Doxil_脂質體製劑1相同的脂質組成和大小的、裝填了順鉑的脂質體製劑2沒有引起或引起較小的補體激活(數據未顯示)的事實所證實。當如製劑7中用EPC代替HSPC(相對於製劑6)時，在2/3的受試血清中得到了中等但顯著的補體激活。
通過向人血清中加入濃度增加的膠束評價製劑13(PEG2000-PE膠束)的補體激活效應。在當Doxil_(製劑1)引起顯著活化(數據未顯示)的條件下，膠束沒有在任何血清中引起顯著的SC5b-9的上升。事實上，加入比Doxil_製劑1高至多10倍的濃度的膠束時引起補體激活。因此，雙分子層膜上的補體結合部位的空間排列可能是脂質體誘導的補體激活的另一個關鍵因素。
D.體內補體激活的測量如實施例7中所述，通過對豬給予製劑體內評價上述脂質體製劑誘導的補體激活。為了統一量化引起豬體內由脂質體誘導的超敏(HSR)的多種生理變化，開發了從等級I到IV的鑑定這些反應的評分系統。評分系統在實施例7中詳述並且分別將沒有反應、中等反應、嚴重反應和致命反應指定為等級I、II、III、和IV。豬對不同的脂質體的劑量依賴性、劑量頻率、和心肺應答等級在表5中總結。
表5豬對不同脂質體的心肺反應

1等級的定義參見實施例7
2製劑的脂質組成在實施例6中的表3中給出。
與製劑1(Doxil_)以及帶負電荷的含PE的脂質體(製劑8、9、10)是有效的體外人血清中補體活化劑(圖6)的觀察相一致，這些同樣的脂質體是豬心肺窘迫的最有效的誘導物，其在3-150nmole磷脂/kg時在＞90％的試驗中引起嚴重到致命的反應。引起超敏反應的製劑1(Doxil_)的最小劑量為得自包含2mg/mL阿黴素和12.8mg/mL磷脂的原裝小瓶的50μL，相當於在大約輸注的最初15-30秒內到達血液的人治療劑量的1/400到1/1000份。在人和豬中，Doxil_的反應原性的劑量依賴性實際相同。
進一步與體外補體激活一致的是，等劑量的製劑3(安慰劑Doxil_)也在豬中引起超敏反應，但是速率較低(67％)，而製劑4(PEG2000-DSPE)、製劑8(PEG350-DSPE)、和製劑6(PEG2000-DS)和製劑13、14(PEG200膠束)即使在更高劑量下也沒有引起反應或引起溫和的反應。在體外補體激活和豬的超敏反應之間唯一明顯的分歧是，在人血清中沒有引起或引起較小補體激活的製劑9(PEG12000-DSPE脂質體)的三個試驗中的兩個試驗中產生嚴重的反應。
製劑6和製劑7都由中性脂質製備。製劑6由HSPC、膽固醇、和PEG-DS形成。製劑7由EPC和市售的中性脂質聚合物PEG-DSG形成(參見實施例6)。然而，兩種製劑的體內應答的不同之處在於製劑7引起受試動物中足夠嚴重到引起死亡的補體激活誘導。相比之下，製劑6在四隻受試動物中的三隻中的反應為等級I或最小反應，在一隻受試動物只為等級0(未應答)。該結果暗示了不是所有的中性脂質聚合物都能夠減小當給予脂質體製劑體時引起的補體激活誘導。
在豬中進行的另一個研究中，如實施例8中所述，製備了四種脂質體製劑。四種製劑的脂質組成和特徵在表6中表示。
表6用於體內評價補體激活誘導的脂質體製劑

1如實施例1中所述製備中性脂質體2帶負電荷的氫化大豆磷脂醯甘油製劑16、17、和19都包括HSPC和膽固醇，但脂質聚合物不同。製劑16與上述製劑3中類似包括PEG-DSPE。製劑17包括DEG-DS，製劑19包括HSPG。
如實施例8中所述，對豬給予脂質體製劑16-19和製劑1(Doxil_)。在注射之後約3-6分鐘內出現典型的血液動力學改變，包括肺動脈壓(PAP)上升30-300％、體動脈血壓(SAP)的不穩定上升和下降、心動過速(有或沒有隨後的心動過緩)和Hb氧飽和下降。這些變化通常互相成比例，雖然在某些動物中觀察到心臟應答相對於肺應答明顯具有嚴重的心動過緩而沒有PAP的顯著上升的傾向。
表7總結了受試動物中的血液動力學改變。在該研究中使用標號為P1-P12的12隻豬，表7中表示了個體應答。個體參數的改變定量表示為相對於注射前基線的百分比，根據實施例7中所述的評分系統(沒有(0)、最小(I)、溫和(II)、嚴重(III)、和致命(IV))主觀定性各個脂質體製劑的總應答。注射50-100微升的製劑1(Doxil_)引起9/9的豬的嚴重到致命的心肺反應，而即使在100倍的較高劑量下製劑18(HSPC/Chol小囊)在受試的所有六隻豬中沒有引起反應。如製劑19(HSPC/Chol/HSPG)那樣，製劑16(HSPC/Chol/PEG-DSPE)在4/5的豬中引起溫和到致命的反應。包括本發明的中性脂質聚合物的製劑17(HSPC/Chol/PEG-DS)只在最高劑量下產生溫和的反應。
表7對脂質體製劑給藥的血液動力血應答

1各個製劑的脂質組成詳見表6和32等級評分細節參見實施例7在本文中所述的研究中，選擇具有阿黴素或順鉑、或空的安慰劑脂質體的脂質體製劑作為研究模型。應該理解，中性脂質聚合物PEG-DS引起補體激活誘導減少的發現適用於包含任何包載的藥物或治療劑的脂質體製劑。示例性的治療劑包括化療劑、抗病毒藥、抗菌劑等等。考慮了蒽環類抗生素化療劑阿黴素和其它這種化合物，如柔紅黴素、表柔比星、和依達比星。還考慮了含鉑的化療劑順鉑和其它含鉑藥物，如本領域中已知的多種順鉑類似物，其包括但不限於卡鉑、奧馬鉑、奧沙利鉑、((-)-(R)-2-氨基甲基吡咯烷(1，1-環丁烷二羧基合))鉑、折尼鉑、恩洛鉑、洛鉑、(SP-4-3(R)-1，1-環丁烷-二羧基合(2-)-2-甲基-1，4-丁二胺-N，N′))鉑、奈達鉑、和雙乙酸基合-氨絡物-二氯環己胺-鉑(IV)。然而，應該理解，本文的發現適用於任何藥物或治療劑。
實施例以下實施例說明本發明，但不以任何方式限制本發明。
實施例1AmPEG-DS(mPEG氨基丙二醇二硬脂醯基；α-甲氧基-ω-2，3-二(硬脂醯氧基)丙基氨基甲酸酯聚(氧化乙烯))的合成將mPEG2000(20g，10mol)的溶液在甲苯(50mL，120℃)中共沸乾燥。在上述溶液的溫度達到25℃之後，用硝基苯基氯甲酸酯(3.015g，15mol)處理，然後用TEA(2.01mL，15mol)處理。然後使混合物反應1.5小時。過濾TEA-鹽並除去溶劑，得到粗mPEG2000-硝基苯基氯甲酸酯，向其中加入氨基丙二醇(3g，30mol)在乙腈(50mL)中的溶液。將混合物在室溫下攪拌過夜。通過過濾除去不溶性物質並蒸發溶劑。產物從異丙醇重結晶兩次。收率13.7g，65％。1H-NMR(300MHz，DMSO-D6)δ3.23(s，OCH3，3H)，3.65(s，PEG，180H)，4.05(t，烏拉坦CH2，2H)，4.42(t，1°OH，1H)，4.57(d，2°OH，1H)。
將產物mPEG2000氨基丙二醇(2.3g，1.08mol，2.17毫當量的OH)溶解於甲苯(30mL)中並共沸乾燥，除去約10mL的溶液。將溶液冷卻到室溫。通過移液管加入吡啶(4mL，20％)，隨後加入硬脂醯氯(1g，4.3mol)。緊接著形成白色沉澱。使反應混合物在120℃下回流過夜並使其冷卻。當反應燒瓶的溫度達到約40℃時，過濾吡啶鹽。蒸發濾液。通過從異丙醇重結晶兩次(2×30mL)純化產物(PEG2000-DS)，並在P2O5下真空乾燥。
收率2.26g，80％。TLC(氯仿∶甲醇，90∶10)mPEG氨基丙二醇Rf＝0.266；PEG-DS Rf＝0.533。1H-NMR(300MHz，DMSO-D6)δ0.89(t，CH3，6H)，1.26(s，CH2，56H)，1.50(2t，2CH2，4H)，2.24(t，CH2CH2C＝O，4H)，3.23(s，OCH3，3H)，3.50(s，PEG，180H)，4.00(dd，APD的CH2，1H)，4.02(t，CH2OC＝O-N，2H)，4.20(dd，APD的CH2，1H)，4.98(m，CHOC(O)，1H)，7.34(m，NH，1H)。
根據類似的過程，使用分子量為750、5000、和12000的mPEG聚合物製備mPEG-DS。結構通過1H-NMR和質譜驗證。通過MALDI(基質輔助雷射解析/電離)測定的分子量如下。

實施例1BPEG-DE(mPEG氨基丙二醇二(二十烷醯基)；α-甲氧基-ω-2，3-二(二十烷醯氧基)丙基氨基甲酸酯聚(氧化乙烯))的合成在100mL圓底燒瓶中，將二十烷酸(500mg，1.6mmol)溶解於甲苯(20mL)中，並通過移液管加入草醯氯(147μl，1.68mmol)。向攪拌的反應中加入1％DMF。在加入DMF時放出氣體，應避免與這種氣體的任何接觸。在10分鐘之後，蒸發甲苯，並加入另外20mL的甲苯並蒸發以除去任何過量的草醯氯。將殘餘物再溶解在10mL甲苯中。將如上所述製備的mPEG-氨基丙二醇(1.19g，0.56mmol)加入到溶液中，連接回流冷凝器並使混合物回流過夜。通過TLC分析(甲醇和氯仿，9∶1)顯示反應完成。在反應混合物冷卻之後，過濾不溶解的物質，並將濾液乾燥。通過從異丙醇重結晶三次純化產物並通過P2O5真空乾燥。收率1.0mg，70％。1HNMR(360MHz，DMSO-D6)δ0.89(t，CH3，6H)，1.26(s，CH2，脂質的66H)，1.50(t，2CH2，4H)，2.24(t，CH2CH2C＝O，4H)，3.23(s，OCH3，3H)，3.50(s，PEG，180H)，4.00(dd，APD的CH2，1H)，4.05(t，CH2CH2C+O，4H)，3.23(s，OCH3，3H)，3.50(s，PEG，180H)，4.00(dd，APD的CH2，1H)，4.05(t，CH2OC＝O-N，2H)，4.20(dd，APD的CH2，1H)，4.98(m，CHOC(O)，1H)，7.34(m，NH，1H)ppm。
實施例2通過t-Bu-O-PEG-O-琥珀醯亞胺製備t-Bu-O-PEG-氨基丙二醇A.t-Bu-O-PEG-O-琥珀醯亞胺通過將得自Polymer Labs的tBu-O-PEG-2000(10g，5mmol)溶解於120mL甲苯中並除去約20mL溶劑進行共沸乾燥，在Dean Stark分水器中收集水。
將溶液冷卻到室溫並加入碳醯氯(15mL)。使混合物在室溫下反應過夜。在反應完成之後，通過旋轉蒸發器除去溶劑。加入約50mL的新鮮的甲苯並通過旋轉蒸發器除去。將殘餘物溶解於無水甲苯(30mL)和二氯甲烷(10mL)中。向該溶液中加入N-羥基琥珀醯亞胺(1.7g，14.8mmol)和三乙胺(2.1mL，14.9mmol)，並使混合物在室溫下反應過夜，之後通過TLC判斷反應完成。

從反應混合物中過濾鹽，通過蒸發除去溶劑，並將固體從異丙醇重結晶兩次並通過P2O5乾燥。收率9.2，85％。1HNMR(CDCl3，360MHz)δ1.25(s，t-Bu，9H)，2.82(s，CH2CH2，4H)，3.60(s，PEG，180H)，4.45(t，CH2OCONH，2H)ppm。
B.t-Bu-O-PEG-氨基丙二醇向氨基丙二醇(300mg，3.2mmol)在DMF(10mL)的溶液中加入t-Bu-PEG-OSc(5g，2.29mmol)並反應過夜。所有的NHS酯被消耗掉，得到在TLC上表現為一個點的混合物。

將預先洗滌過的酸性離子交換樹脂(～1g)加入到反應混合物中，並在30分鐘之後通過過濾除去，除去溶劑並將殘餘物從200mL異丙醇重結晶。收集固體並通過P2O5乾燥。收率4.2g，85％。
1HNMR(D6-DMSO，360MHz)δ1.25(s，t-Bu，9H)，3.68(s，PEG，180H)，4.03(t，CH2OCONH，2H)，4.43(t，1°OH，1H)，4.55(d，2°OH，1H)，6.98(t，NH，1H)ppm.
實施例3對硝基苯基碳酸酯-PEG-DS的製備A.Bn-O-PEG-硝基苯基碳酸酯(NPC)通過將得自Shearwater Polymers的Bn-O-PEG-2000(Huntsville，LA；5g，2.41mmol)溶解於120mL甲苯中並除去約20mL溶劑對其進行共沸乾燥，在Dean Stark分水器中收集水。將溶液冷卻到室溫並在減壓下蒸發殘留的溶劑。
將殘餘物溶解於30mL二氯甲烷/乙酸乙酯(60∶40)中，並加入對硝基苯基氯甲酸酯(729mg，3.6mmol)和三乙胺(1mL，7.2mmol)。使反應在4℃進行8-16小時。該方法使反應變慢，但排除了雙PEG-碳酸酯的形成。在GF二氧化矽板上的UV可見斑點表明反應完成。
用預先清潔的酸性和鹼性離子交換樹脂處理反應混合物30分鐘，過濾，並使其完全乾燥。產物從異丙醇重結晶並P2O5上乾燥。收率4.4g，80％。
B.Bn-O-PEG-氨基丙二醇向氨基丙二醇(260mg，1.9mmol)在DMF(10mL)的溶液中加入如上製備的Bn-O-PEG-NPC(4.3g，2.9mmol)並反應5小時。所有的Bn-O-PEG-NPC被消耗，反應混合物在TLC上給出一個斑點(氯仿∶甲醇∶水90∶18∶2)。
用5g預先清潔的酸性離子交換樹脂處理反應混合物30分鐘，過濾，並使其徹底乾燥。產物從異丙醇重結晶並通過P2O5乾燥。收率3.8g，91％。
C.Bn-O-PEG-二硬脂醯基在室溫下將Bn-O-PEG-氨基丙二醇(3g，1.36mmol)、硬脂酸(1.94g，6.79mmol)、和作為催化劑的DPTS(4-(二甲氨基)吡啶4-甲基苯磺酸鹽)(408mg，1.36mmol)的溶液攪拌20分鐘。通過移液管加入二異丙基碳二亞胺(1.28mL，8.16mmol)並使混合物反應過夜。TLC(氯仿∶甲醇，90∶10)表明二醇完全反應。
向反應混合物中加入鹼性離子交換樹脂(～5g)，在振搖30分鐘之後，過濾樹脂並將濾液乾燥。殘餘物從異丙醇(100mL)重結晶並通過P2O5乾燥。收率4g，80％。
D.HO-PEG-二硬脂醯基採用兩種不同的方法為Bn-O-PEG-DS的苄基脫保護。
方法1.氫解通過碳載鈀脫保護向Bn-O-PEG-DS(218mg，0.08mmol)在5mL的甲醇的溶液中加入10％Pd/C(110mg)和甲酸銨(107mg，0.8mmol)並使混合物在室溫下反應過夜。
通過Celte_過濾除去Pd/C，並將濾液乾燥。將殘餘物溶解於氯仿並用飽和NaCl洗滌三次。收集氯仿相，用MgSO4乾燥，過濾並濃縮。將固體殘餘物從tBuOH凍幹，並將得到的粉末通過P2O5乾燥，收率80％，175mg。
方法2.通過四氯化鈦脫保護在冰浴中冷卻Bn-O-PEG-DS(1.18g，0.43mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液5分鐘。通過烘乾的注射器將四氯化鈦(3mL，21.5mol，過量)轉移到密封的反應燒瓶中。5分鐘之後，除去冰浴，在室溫下進行脫保護反應過夜。通過在GF二氧化矽TLC色譜板上(相對於起始原料)較低的位移斑點顯示完全脫保護。
向反應混合物中加入約40mL氯仿並將混合物轉移到包含40mL飽和NaHCO3的分液漏鬥中。輕輕地振搖混合物(避免形成乳液)並收集氯仿層。重複這種萃取3次，並收集氯仿相，並用新鮮的飽和NaHCO3再萃取一次，以保證完全除去TiCl4。用MgSO4乾燥收集的氯仿相，過濾並濃縮。
將上述殘餘物溶解於1mL的氯仿中並將其加到矽膠(200-400目，60A)的製備柱上。通過以2％漸增的方式加入甲醇使流動相(氯仿)的極性增加，直到在10％甲醇/90％氯仿時洗脫產物。收集產物並通過旋轉蒸發器除去溶劑。將固體從tBuOH凍幹並通過P2O5乾燥。收率70％，800mg。
E.對硝基苯基碳酸酯-PEG-DS在反應開始之前將反應燒瓶、攪拌棒、注射器、起始原料(如上製備的HO-PEG-DS)小心地乾燥。
向HO-PEG-DS(1.2g，0.45mmol)在10mL二氯甲烷/乙酸乙酯(60∶40)的溶液中加入對硝基苯基碳酸酯(136mg，0.65mmol)和三乙胺(188μL，1.35mmol)。在4℃下反應8-16小時(消除雙PEG-碳酸酯的形成)，然後通過GF矽膠TLC檢驗反應完成。

用預先清潔的酸性和鹼性離子交換樹脂處理反應混合物30分鐘並過濾。將濾液徹底乾燥並將殘餘物從異丙醇重結晶。固體通過P2O5乾燥。收率70％。1NHMR(D6-DMSO，360MHz)δ0.86(t，CH3，6H)，1.22(s，DS，56H)，1.48(m，CH2CH2(CO))，4H)，2.26(2 xt，CH2OCONH，2H)，4.03 4.22(2 xd，脂質的CH2CH，2H)，4.97(M，脂質的CHCH2)，6.98(t，NH，1H)，7.55％8.32(2xd，芳香，4H)ppm。
實施例4通過mPEG-NH2和高碘酸鹽氧化的DSPG的還原胺化偶聯製備中性-兩性離子型mPEG-DSPE將1，2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸基-外消旋[(1-甘油)]或二硬脂醯基磷脂醯甘油(DSPG，200mg，0.25mmol)懸浮在乙酸鈉鹽水緩衝液(1.5mL，50mM，pH＝5)中，並用高碘酸鈉(348mg，1.6mmol)處理4h，同時將懸浮液超聲。TLC(氯仿∶甲醇∶水＝90∶18∶2)表明DSPG耗盡。在離心之後從溶液分離不溶性產物，然後用水(1mL)、水/乙腈1∶1(2mL，兩次)洗，然後只用乙腈(1mL，3次)洗。通過P2O5真空乾燥產物1.5h，將mPEG-NH2(1g，0.5mmol，2eq)加入到氧化的DSPG和苯(3ml)中並將溶劑旋轉蒸發以除去殘留的水。再重複苯蒸發步驟2次。向混合物中加入無水甲醇(6mL)和粉狀分子篩(4_，320mg)，隨後加入硼烷(borant)-吡啶(8M，1.6mL，12mmol)。將反應混合物在25℃攪拌15h。TLC確認脂質聚合物產物的形成。為了除去過量的未反應的mPEG-NH2，用水(3mL)稀釋產物混合物，轉移到spectropore CE滲析膜(MWCO 300,000)並在4℃下相對鹽水溶液(～50mM，1000mL，3次)透析。然後相對去離子水透析(3次)。將粗產物(通過TLC確認，包含一些氧化的DSPG雜質)凍幹並通過P2O5真空乾燥並進一步通過矽膠柱色譜法純化，使用在具有甲醇梯度(0-15％)的氯仿作為洗脫液。收集包含純脂質聚合物產品的洗脫級分並蒸發，得到141mg(20％)固體。1H NMR(360MHz，CDCl3)δ0.88(t，CH3，6H)；1.26(s，CH2，56H)；1.58(m，CH2CH2CO，4H)；2.28(2xt，CH2CO，4H)；3.2(br m，NHCH2CH2，1H)；3.32(br m，NHCH2CH2，1H)；3.6(s，PEG～180H)；4.15(dd，反式PO4CH2CH，1H)；4.35(dd，順式PO4CH2CH，1H)；5.2(m，PO4CH2CH，1H)。MALDI-TOFMS產生以相同的44道爾頓間隔分隔並在2770道爾頓處集中的離子鐘形分布(計算分子量2813道爾頓)。
實施例5含PEG-DSPE和PEG-DS的脂質體的製備和生物分布研究通過溶解並從HSPC∶Chol∶PEG為以下比例的脂質混合物中除去溶劑形成脂質膜A58∶39∶3；PEG-脂質＝PEG-DSB57∶38∶5PEG-脂質＝PEG-DSPEC57∶38∶5PEG-脂質＝PEG-DS在包含140mM NaCl、pH為7.4的25mM HEPES中的新製備的125I-酪氨菊粉中將膜水合併擠出形成直徑為100-105nm的脂質體。使脂質體通過0.22μm的Millipore(Millipore Corporation，Bedford，MA)低蛋白結合注射器末端過濾器過濾滅菌。計數等分樣品以測定125I的注射計數。通過分析脂質體製劑的磷酸鹽含量測定脂質濃度，並將脂質體製劑在無菌緩衝液中稀釋到2.5μmol/mL的最終濃度。通過尾靜脈為小鼠靜脈內注射0.2mL的稀釋後的脂質體，使每隻小鼠接受0.5μmol的磷脂。在不同的時間點，通過氟烷麻醉、隨後斷頸將小鼠處死，分析心臟取血的血樣，以及血液和不同器官的125I計數。
實施例6體外補體激活的測量材料二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、二肉豆蔻醯基磷脂醯基甘油(DMPG)、膽固醇(Chol)和蛋黃卵磷脂(EPC)購自Avanti Polar Lipids(Alabaster，AL)完全氫化的大豆磷脂醯膽鹼(HSPC)和完全氫化的大豆磷脂醯甘油(HSPG)得自Lipoid Inc.，Ludwigshafen，Germany。所有的脂質都具有≥97％的純度。酵母多糖得自Sigma Chem.Co.(St.Louis，MO)。
市售的Doxil_得自ALZA Corp(Mountain View，CA)，並且包含阿黴素HCl，2mg/mL(4.22mM)；脂質體脂質16mg/mL；硫酸銨≈0.2mg/mL；組氨酸，10mM(pH6.5)和蔗糖，10％。脂質組分包括HSPC，9.58mg/mL；Chol，3.19mg/mL；PEG2000-DSPE，3.19mg/mL(總磷脂12.8mg/mL，13.3mM)。
具有350道爾頓、2000道爾頓、和12,000道爾頓的PEG部分的N-氨甲醯基-聚(乙二醇甲基醚)-1，2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷醯乙醇胺三乙基銨鹽(PEG-DSPE)(PEG350-DSPE、PEG2000-DSPE、PEG12000-DSPE，也分別稱為0.35K-PEG-DSPE、2.0K PEG-DSPE、12.0KPEG-DSPE)得自Alza Corporation。
如上所述製備具有聚乙二醇(2000Da的PEG部分)的3-甲氧基聚乙二醇-氧羰基3-氨基-1，2-丙二醇二硬脂酸酯(PEG2000-DS，還稱為2K-PEG-DS)。
3-甲氧基聚乙二醇1，2-二硬醯甘油(PEG2000-DSG，還稱為2K-PEG-DSG)(Sunbright DSG-2H)得自Nippon Oil Fat Co.，Ltd(Tokyo，Japan)。
人血清得自健康的志願者供體。在使用前將血清保持在-70℃。方法磷脂濃度的測定使用Bartlett方法的改進方法測定磷脂濃度。
粒度分布測定在25℃使用具有ALV-5000/EPP多重數字相關器的高性能粒度篩選器ALV-NIBS/HPPS(ALV-Laser VertriebsgesellschaftGmbH，Langen，Germany)或Nicomp Model 370(Pacific Scientific，Silver Spring，MD)亞微細粒篩選器通過動態光散射測定粒度分布。
脂質體表面電荷(Ψ電位)的測量為了測定脂質體的表面電位，測量了寬pH值範圍內的HC離子化程度。將30μL的等份的脂質體在1.5mL緩衝液中稀釋。通過加入適量的濃氫氧化鈉和鹽酸調節pH。將所有的樣品在水浴中超聲處理約5秒以保證在大的單層小囊(LUV)內外的pH平衡。為了測量HC離子化狀態，使用LS550B發光光譜儀(PerkinElmer，Norwalk，CT)在室溫(22℃)下記錄HC螢光激發光譜。在兩個激發波長下進行測量330nm，其為pH非依賴性的(等吸光點)並且表示脂質環境中HC的總量(未離子化的+離子化的)；和380nm，其只反映離子化的HC-。對於兩個激發波長，發射波長都是450nm。使用2.5nm的激發譜帶和發射譜帶寬。對於每個脂質組成，由激發波長380/330的比的變化計算HC的表觀pKa，作為整體pH(bulk pH)的函數。表示HC相對於參考中性面的表觀質子結合常數的表觀pKa的變化是HC螢光團周圍環境中表面pH和表面電位的指徵。表面電位值(Ψ)使用以下方程式計算0=pKelKTeln10]]>ξ電位的測定使用Zetasizer 3000 HAS，Malvern InstrumentsLtd，Malvern，UK，在25℃下測量ξ電位。將40μL等份的脂質體在20mL的10mM NaCl(pH6.7)中稀釋並將溶液穿過0.2μm的針筒式濾器(Minisart，Sartorius，Germany)。測量原理如下當對帶電粒子在電解液中的懸浮液施加電場時，它們朝向相反極性電極的移動速度取決於電場強度、介電常數、介質粘度、和ζ-電位。在單位電場中ζ電位與粒子速度的關係(電泳遷移率)由Henry方程式表示
UE=zf(Ka)6]]>其中UE＝電泳遷移率，z＝ζ電位，ε＝介電常數，η＝粘度。f(Ka)為電偶層厚度和粒徑的函數。在水介質或中等電解質濃度(10mM的NaCl)中，f(Ka)值為1.5，將其帶入Smoluchowski近似關係UE=z4n]]>在25℃時，ζ電位可近似為z＝12.85UEmVA.脂質體製劑製備包括如下表3所示的多種脂質組成的脂質體。將各個製劑的脂質組分溶解於叔丁醇中。將澄清溶液凍幹。將粉末在10mL熱(65℃)的無菌無熱原的鹽水中通過在70℃下渦流水合2-3分鐘，形成多層小囊(MLV)。使用得自Northern Lipids Inc.(以前是Lipex，Vancouver，BC，Canada)的TEX 020 10mL桶式擠出機在62℃下使多層小囊通過0.4和0.1μm孔徑的聚碳酸酯過濾器的兩步擠出步驟中使其尺寸縮小，分別通過每種孔徑10次。脂質體的所有製備步驟都在無菌條件下進行。將脂質體懸浮在0.15M NaCl/5mM組氨酸緩衝液(pH6.5)中。所有的脂質體製劑都是無菌的並且是無熱原的。
通過將鹽水中的2mg/mL的2K-PEG-DSPE或2K-PEG-DS大規模渦流混合併隨後通過0.22μm過濾器過濾製備膠束。
表3脂質體組成

B.體外補體激活測量在振搖的水浴(80循環/分鐘)中將脂質體與未稀釋的人血清溫孵並通過測量補體終端複合體SC5b-9的形成評價補體激活。在典型的實驗中，在Eppendorf管中將10μL的脂質體與40μL的血清混合，然後在振搖的水浴(振搖速率為80rpm)中在37℃下溫孵30分鐘。通過加入20倍體積的10mM EDTA、25mg/mL牛血清清蛋白、0.05％吐溫20和0.01％硫柳汞(pH7.4)(即，由EDTA補充的SC5b-9 ELISA試劑盒的「樣品稀釋液」)中止反應。如前所示(Szebeni，J.等人，J.Natl.Cancer Inst.，90300(1998))，通過酶聯免疫吸附試驗(Quidel Co.，San Diego，CA)測定SC5b-9。
實施例7體內補體激活的測量將實施例6中所述製備的脂質體對豬進行如下給藥。使用25-40kg的不分性別的約克夏(Yorkshire)豬。對動物肌肉注射氯胺酮(500mg)使其鎮靜並使用麻醉機用2％異氟烷麻醉。使肺動脈導管經由右頸內靜脈穿過右心房進入肺動脈，以測量肺動脈嵌入壓(PAP)。在股動脈中測量體動脈壓(SAP)。手術、儀器、和血液動力學分析的其它細節如先前所述(Szebeni，J.等人，Circulation，992302(1999)))進行。
將所示量的各個脂質體製劑在1mL PBS中稀釋並通過導管導引器注射到頸靜脈中或通過肺動脈插管直接注射到肺動脈中。這些注射方法在誘導血液動力學變化中是等效的。用5-10mL PBS將脂質體衝洗到循環中。為了提供對脂質體反應的綜合測量，通過監測以下生理學異常之一通過隨機分級方案對血液動力學改變進行定量測量異常PAP上升體動脈壓(SAP)上升或下降心輸出量下降EKG異常呼出的CO2下降心率上升或下降血漿TXB2上升肺循環和體血管阻力上升潮紅如下將豬中脂質體誘導的心血管反應分級

實施例8脂質體製劑的體內表徵製備四種脂質體(LUV)製劑。脂質體組成和表徵如表6中所述。在製備每種製劑時，將製劑的所有脂質組分溶解於叔丁醇中。將澄清的溶液凍幹。將粉末在10mL熱(65℃)無菌無熱原的鹽水中通過在70℃下渦流水合1分鐘形成多層小囊。使用得自Northern Lipids(以前為Lipex，Vancouver，BC，Canada)的TEX 020 10mL桶式擠出機在62℃下使多層小囊通過0.4和0.4μm孔徑的聚碳酸酯過濾器兩步擠出步驟中使其尺寸縮小，分別通過每種孔徑10次。脂質體製備的所有步驟都在無菌條件下進行。
使用市售的Doxil_(磷脂濃度13.3mM，150μg阿黴素/μmol磷脂)。在鹽水(0.9％NaCl)和沒有(NH4SO4)梯度中製備所有的其它脂質體。使用的所有脂質體的大小都為105nm±35nm(參見表6)。
將所示量的Doxil_和其它試驗用脂質體在1mL PBS中稀釋並注射到右心室中、或通過肺動脈插管直接注射到豬的肺動脈中。用10mLPBS將脂質體衝洗到循環中。以前的發現表明小的脂質體團的血液動力學效果是非快速免疫的並在相同的動物中可定量地重現若干次，因此，在各個豬中注射增加量的同樣類型的脂質體，直到出現反應，或在沒有反應時，直到某一預定的極限劑量。結果如表7中所示。
雖然已經參考特定方法和實施方案描述了本發明，應該理解，可在不脫離本發明的基礎上進行多種改進。
權利要求
1.用於製備當體內給予含有包載治療劑的脂質體時減少脂質體誘導的補體激活的藥物的脂質體組合物，包括由成囊脂質和1-10摩爾％的下式表示的中性脂質聚合物以及餘量的成囊脂質組成的脂質體 其中R1和R2各自為具有8到24個碳原子的烷基或鏈烯基鏈；n＝10-300，Z選自C1-C3烷氧基、C1-C3烷基醚、n-甲基醯胺、二甲基醯胺、甲基碳酸酯、二甲基碳酸酯、氨基甲酸酯、醯胺、n-甲基乙醯胺、羥基、苄氧基、羧酸酯、和C1-C3烷基碳酸酯，或芳基碳酸酯；和L選自(i)-X-(C＝O)-Y-CH2-、(ii)-X-(C＝O)-、和(iii)-X-CH2-，其中X和Y獨立地選自氧、NH、和直接鍵，條件是當L為-X-(C＝O)-時，X不是NH。
2.權利要求1的組合物，其中X為氧，Y為氮。
3.權利要求1或2的組合物，其中L為氨基甲酸酯鍵、酯鍵、或碳酸酯鍵。
4.權利要求1-3中任一項的組合物，其中L為-O-(C＝O)-NH-CH2-(氨基甲酸酯鍵)。
5.權利要求1-4中任一項的組合物，其中Z是羥基或甲氧基。
6.權利要求1-5中任一項的組合物，其中所述脂質體包括1摩爾％到10摩爾％的中性脂質聚合物二硬脂醯基(氨基甲酸酯連接的)聚乙二醇。
7.權利要求1-5中任一項的組合物，其中所述脂質體包含1摩爾％到10摩爾％的中性脂質聚合物甲氧基聚乙二醇1，2-二硬脂醯甘油。
8.權利要求1-7中任一項的組合物，其中R1和R2各自是具有8到24個碳原子的無支鏈的烷基或鏈烯基鏈。
9.前述權利要求中任一項的組合物，其中R1和R2各自為C17H35。
10.權利要求1-9中任一項的組合物，其中n為約20到約115。
11.權利要求1-10中任一項的組合物，其中治療藥物為化療劑。
12.權利要求11的組合物，其中所述化療劑為蒽環類抗生素。
13.權利要求12的組合物，其中所述化療劑選自阿黴素、柔紅黴素、表柔比星、和依達比星。
14.權利要求11的組合物，其中所述化療劑為含鉑的化合物。
15.權利要求14的組合物，其中所述含鉑的抗生素為順鉑或選自以下的的順鉑類似物卡鉑、奧馬鉑、奧沙利鉑、((-)-(R)-2-氨基甲基吡咯烷(1，1-環丁烷二羧基合))鉑、折尼鉑、恩洛鉑、洛鉑、(SP-4-3(R)-1，1-環丁烷-二羧基合(2-)-2-甲基-1，4-丁二胺-N，N′))鉑、奈達鉑、和雙乙酸基合-氨絡物-二氯環己胺-鉑(IV)。
全文摘要
本發明提供了當體內給予含有包載治療劑的脂質體製劑時減少補體激活的方法。該方法提供了具有聚乙二醇衍生的中性脂質聚合物的脂質體。
文檔編號A61K9/127GK1756534SQ200480005534
公開日2006年4月5日 申請日期2004年2月26日 優先權日2003年2月28日
發明者S·扎利普斯基, Y·巴倫霍爾茲 申請人:阿爾扎公司, 耶路撒冷希伯來大學伊森姆研究發展公司