促樹突狀細胞成熟的體外培養方法及專用培養基的製作方法
2023-05-03 14:18:41 1
專利名稱：促樹突狀細胞成熟的體外培養方法及專用培養基的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種促樹突狀細胞成熟的體外培養方法及專
用培養基。
背景技術：
目前，全球約有4億HBV慢性感染者，主要分布在發展中國家，每年分別有超過20和30萬HBV慢性感染者死於肝硬化和肝細胞癌(HCC)。抗病毒治療是慢性B型肝炎(CHB)治療的關鍵，目前主要抗病毒藥物包括幹擾素(包括普通幹擾素和聚乙二醇幹擾素)和核苷(酸)類似物如拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋和替比夫定等，但療效並不滿意。幹擾素應答比例約為30%，而核苷(酸)類似物治療應答不持久，停藥復發率高，長期治療存在病毒變異等問題。因此，有必要開發更有效的新型療法。 大量研究顯示，HBV (B肝病毒)慢性感染者HBV特異性抗病毒免疫低下與樹突狀細胞(DC)功能受損有關。DC是最強的抗原提呈細胞(APC)，在誘導CD4+和CD8+T細胞抗病毒免疫應答中起重要作用。目前，體外誘導DC的方案已經很成熟，而且以DC為基礎的免疫療法(治療性DC疫苗)已用於黑色素瘤、惡性淋巴瘤等惡性腫瘤的治療，此外，治療性DC疫苗也在HIV感染患者進彳丁了臨床試驗，並顯不出一定的治療效果。基於DC在免疫應答中的重要作用，治療性DC疫苗將是很有前景的一種治療策略。HBV DC疫苗大量體外研究和初步臨床試驗為其大規模臨床應用提供了重要的理論和實踐基礎。目前，初步臨床研究顯示HBV DC疫苗可有效抑制慢性B型肝炎患者病毒複製，提高HBeAg血清轉換率，並且安全，不存在耐藥等問題。此外，HBV DC疫苗和其它抗病毒藥物聯合可能進一步提高慢性B型肝炎治療效果。HBV DC疫苗除了可用於慢性B型肝炎的治療外，在B肝疫苗無應答者中也有很好的應用前景。儘管HBV DC疫苗有一定的療效，特別是對HBeAg陰性慢性B型肝炎效果較好，但是對HBeAg陽性慢性B型肝炎的療效較差，因此，對於這些問題還需要進行更深入的研究。此外，在HBV DC疫苗臨床應用中還有一些問題需要考慮，如DC的來源，最佳抗原負載方案，體外培養時間，促成熟方案，免疫細胞的數量，免疫的間隔時間，免疫次數以及免疫途徑等，這些環節都有可能影響HBV DC疫苗的治療效果。因此，有必要進行更深入的臨床前研究來闡明這些問題。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種製備成熟樹突狀細胞的促成熟培養基。本發明提供的一種製備成熟樹突狀細胞的促成熟培養基，按照如下方法製備將雷西莫特(小分子免疫反應調節劑，R848，英文為resiquimod，又可譯為瑞喹莫德)、前列腺素E2(PGE2)、青黴素、鏈黴素和細胞培養基混合，得到培養基，所述雷西莫特在所述促成熟培養基中的濃度為(1-10) μ g/mL ;所述前列腺素E2在促成熟培養基中的濃度為I μ g/mL ；所述青黴素在所述促成熟培養基中的濃度為100U/mL,所述鏈黴素在所述促成熟培養基中的濃度為100 μ g/mL。
所述促成熟培養基中，所述雷西莫特在所述促成熟培養基中的濃度為(1、2. 5、5、7. 5或10) μ g/mL ;所述細胞培養基為無血清AM-V培養基。所述雷西莫特在所述促成熟培養基中的濃度具體為5 μ g/mL ；本發明的第二個目的是提供一種用所述培養基製備所述成熟樹突狀細胞的方法。本發明提供的方法，包括如下步驟I)將單核細胞在培養基A中培養，得到離體未成熟樹突狀細胞；3)步驟2)獲得的細胞在所述培養基中培養，得到成熟樹突狀細胞；所述培養基A按照如下方法製備將無血清AM-V培養基、青黴素、鏈黴素、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細胞介素-4 (IL-4)混合，所述青黴素在所述培 養基A中的濃度為100U/mL，所述鏈黴素在所述培養基A中的濃度為100 μ g/mL，所述粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子在所述培養基A中的濃度為1000U/mL，所述白細胞介素_4在所述培養基A中的濃度為500U/mL。所述單核細胞為⑶14陽性的單核細胞；所述單核細胞為從離體的人外周血單個核細胞中分離得到；所述分離的方法具體為用⑶14磁珠分選。步驟I)中，所述培養時間為5-6天，所述培養時間具體為5天；步驟2)中，所述培養時間為1-2天，所述培養時間具體為I天或2天。由所述方法得到的成熟樹突狀細胞也是本發明保護的範圍。所述的成熟樹突狀細胞在製備こ肝病毒疫苗中的應用也是本發明保護的範圍。未成熟的樹突狀細胞為低表達⑶83的細胞；成熟的樹突狀細胞為高表達⑶83的的細胞。本發明的實驗證明，本發明的促成熟培養基要優於對照標準培養基，本發明的促成熟培養基使用的刺激因子少，促DC成熟的能力強，並且促成熟後DC存活率高。此外，本發明的促成熟培養基促成熟DC可產生高水平IL-12p70同時產生IL-10的水平較低。更重要的是，本發明的促成熟培養基促成熟的抗原肽負載DC具有較強的刺激HBV慢性感染者自體HBV特異性CTL増殖的能力。
圖I為不同促成熟方案促成熟2天DC吞噬能力圖2為不同促成熟方案促成熟DC刺激異體T細胞増殖的能力圖3為不同促成熟方案促成熟DC誘導Thl/Th2應答的能力圖4為不同促成熟方案促成熟DC誘導Thl反應的能力圖5為不同促成熟方案促成熟DC誘導Th2反應的能力圖6為不同促成熟方案促成熟DC誘導⑶4+CD25+fOXp3highTreg細胞反應的能力圖7為抗原肽負載DC促成熟後存活率圖8為抗原肽負載DC促進HBV特異性CTL増殖圖9為抗原肽負載DC誘導CD4+CD25+foxp3highTreg細胞增殖
具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中的實驗均為重複三次，結果取平均值。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到，具體如下從離體的健康人血液(由解放軍307醫院提供，該人員知情)中採集濃縮白細胞；粒細胞-巨卩遼細胞集落刺激因子(granulocyte -macrophagecolony-stimulatingfactor, GM-CSF)(美國 PeproTech,目錄號300-03)；白細胞介素-2 (interleukin-2,IL-2)(美國 P印roTech，目錄號200-02);白細胞介素 _4 (interleukin-4, IL-4)(美國 PeproTech,目錄號200-04)；白細胞介素-I β (interleukin-1 β , IL-I β )(美國PeproTech,目錄號200_01Β);白細胞介素-6 (interleukin-6, IL-6)(美國 PeproTech，目錄號:200-06);白細胞介素-15 (interleukin-15, IL-15)(美國 PeproTech,目錄號200-15);腫瘤壞死因子- a (tumor necrosis factor- α , TNF- α )(美國 PeproTech,目錄號300_01A)；前列腺素-E2 (prostaglandin E2, PGE 2)(美國 sigma aldrich,目錄號P6532);聚肌苷-聚胞苷酸(Polyinosinic-Polycytidylic acid)(美國 sigmaaldrich,目錄號P9582);雷西莫特(Resiquimod, R848(,目錄號ALX-420-038))(美國 Alexis);淋巴細胞分離液(Ficoll-Paque Plus)(英國 GE Healthcare,目錄號17-1440-02);無血清 AM-V培養基(美國 Gibco，目錄號0870112DK);人0)14磁珠(humanCD14+microbeads)(德國 Miltenyi Biotec,目錄號130-050-201)；鼠抗人 CD40, CD86,CDla, IFN-Y-FITC(美國 BD 公司，目錄號分別為555588，555657，555806，340449);鼠抗人 CD80，CD83, CD274, CD25, IL-4-PE(美國 BD 公司，目錄號分別為:557227,556855,557924,340451);鼠抗人 HLA-DR，CD4，CD8_PerCp (美國 BD 公司，目錄號分別為:347364,347324,347314);鼠抗人 CDllb，CDllc，CD14，CD3-APC(美國 BD 公司，目錄號分別為340937，340544，555399，340440);鼠抗人 IgGl-FITC(美國 BD 公司，目錄號555748);鼠抗人IgGl-PE (美國BD公司，目錄號555749);鼠抗人IgG2a_PerCp (美國BD公司，目錄號349054);鼠抗人IgGl-APC(美國BD公司，目錄號555751);鼠抗人Foxp3_FITC，CCR7-FITC 和鼠抗人 IgG2a-FICT(美國 eBioscience 公司，目錄號分別為:11-4776-73,11-1979-73，11-4321-73)；鼠抗人CXCR4-PE和鼠抗人IgG2a_PE (美國BD公司，目錄號分別為:555974,555574) ;Annexin_V kit (美國 BD 公司，目錄號為556422) ;7_AAD (美國 BD 公司，目錄號為:559925) ；PH 7. 2磷酸鹽緩衝液(PBS)(美國Gibco,目錄號為=20012-027)；TruCount管(美國BD公司，目錄號為340334) ;1%的多聚甲醛(美國Sigma公司，目錄號為P6148) ;Dextran_FITC(美國 sigma aldrich,目錄號為46945) ；CellTiter 96 AQueous non-radioactive reagent (美國 Promega 公司，目錄號為G5421) ；Cytof ix/Cytoperm kit (美國 BD 公司，目錄號為554715) ;IL_4，IL-10，IL_12p40，IFN-y ELISAkit (美國 BD 公司，目錄號分別為550614，550613，551116，550612) ;IL_10，IL_12p40，IL-12p70ELISA kit(美國 Biolegend 公司，目錄號分別為:430607,430701,431707)；Fixation permeabilization solution (美國 eBioscience 公司，目錄號為00-5123)；絲裂黴素 C(mitomycin-C) (R0CHE,目錄號為:10107409001);鼠抗人 HLA-A2-FITC 和IgG2b-FITC(美國 BD 公司，目錄號分別為551285，555742) ；HBV 抗原肽HBV Coreantigen 18-27(FLPSDFFPSV), HBV Surface antigen 172-181(WLSLLVPFV), HBV Surfaceantigen 185-194(GLSPTVffLSV), HBV Polymerase 573-581 (FLLSLGIHL)，HBV Envelope183-191 (FLLTRILTI)(美國 Cali-Bio 公司，目錄號分別為P01025, P01027, P01026,PO 1023，PO 1022) ；PE標記的HLA-A2限制性HBV特異性五聚體Pentamer-HBVcore 18-27-PE ；Pentamer-HBVsurface172-181-PE ；Pentamer-HBVsurface 185-194-PE ；Pentamer-HBVpoly573-581-PE ;Pentamer-HBVenvl83-191-PE(美國 Proimmunue,目錄號分別為F023-82A-G，F031-82A-G，F028-82A-G，F032-82A-G，F027-82A-G)二氧化碳培養箱(德國Heraeus);超淨工作檯(JTT-7A，北京半導體設備廠);FACSCalibur型流式細胞儀(美國BD公司)；臺式離心機(北京六一儀器廠)；架盤天平(JPT-10，北京醫用天平廠);倒置顯微鏡(XSZ-D2，日本Olympus) ;12，24孔培養板(美國Corning);微量加樣器(美國Thermo公司)；渦旋振蕩器(江蘇海門儀器廠)；酶聯儀(芬蘭 Labsystem 公司)； 實施例I、促樹突狀細胞成熟的條件摸索及表型檢測I、外周血單個核細胞分離(PBMC)(I)將離體的健康人濃縮白細胞分裝於IOmL離心管中，每管約4mL，加入PH 7. 2磷酸鹽緩衝液等倍稀釋並充分混勻；(2)將稀釋後濃縮白細胞緩慢加至預裝4_5mL淋巴細胞分離液(密度I. 077g/mL)的IOmL離心管中，注意保持兩者界面清晰；(3)室溫(25°C )離心，1600rpm, 35min ；(4)小心吸取中間白膜層(即為外周血單個核細胞)，加入至預裝4_5mL PBS的離心管中並輕輕混勻；(5)室溫離心，1500rpm, IOmin ；(6)棄上清,加入PBS輕輕混勻，室溫離心，IOOOrpm, IOmin ；(7)棄上清，加入5mL PBS，充分混勻後計數。2、⑶14陽性單核細胞分選(I)計算PBMC總數後，邊加PBS邊輕輕混勻至8-lOmL ；(2)室溫離心，1500rpm, IOmin,徹底吸棄上清；(3)將細胞團懸於PBS中，每IO7細胞加80 μ L PBS ；(4)每IO7細胞加20 μ L⑶14磁珠，充分混勻後，在冰箱中孵育15min (2_8°C )；(5)每IO7細胞加l-2mL PBS充分混勻，室溫離心，1500rpm, IOmin,徹底吸棄上清；(6)每IO8細胞加500 μ L PBS充分混勻；(7)將細胞懸液加至LS柱(Miltenyi Biotec,目錄號130-042-401)中，收集通過LS柱的未標記細胞即為去掉⑶14+單核細胞的PBMC，每次加入3mL PBS清洗，重複3次；(8)將柱子從分離器上取下，放置於IOmL離心管上，加入5mL PBS後，迅速將柱塞推至柱底，為提高分選純度可重新過柱，得到CD14+單核細胞。3、GM-CSF/1L-4 誘導獲得未成熟 DC (I)將⑶14+單核細胞重懸於無血清AM-V培養液中(含100U/mL青黴素，100 μ g/mL鏈黴素)，重新計數後種於12孔板中，每孔100萬，培養體系2mL (磁珠分選法)，置於37 °C，5% 二氧化碳培養箱中；
(2) 2h後，輕輕吸棄培養液，再加入2mL培養基A，培養基A按照如下方法製備，將新鮮無血清AM-V培養液、青黴素、鏈黴素、GM-CSF, IL-4混合，青黴素在培養基A中的濃度為100U/mL，鏈黴素在培養基A中的濃度為100 μ g/mL, GM-CSF在培養基A中的濃度為1000U/mL, IL-4在培養基A中的濃度為500U/mL ；(3)培養第3天半量換液，補充新鮮培養基A，培養第5天，獲得imDC。4、未成熟DC (imDC)到成熟DC (mDC)的培養基的摸索對照組將上述得到的imDC加入標準培養基促成熟(37°C，5 % ニ氧化碳培養箱中)2天，得到對照組mDC。標準培養基按照如下方法製備將IL-I β，IL-6，TNF- a，PGE2、青黴素、鏈黴素和無血清AM-V培養基混合得到培養基，IL-I β，IL-6，TNF- a，PGE2在標準培養基中的濃度均為1000U/mL，PGE2在標準培養基中的濃度為I μ g/mL，青黴素在標準培養基中的濃度為100U/mL，鏈黴素在標準培養基中的濃度為100 μ g/mL。實驗組將上述得到的imDC分別加入促成熟培養基1_5促成熟(37°C，5%ニ氧化碳培養箱中)2天，分別得到實驗組mDCl、實驗組mDC2、實驗組mDC3、實驗組mDC4、實驗組mDC5。促成熟培養基I按照如下方法製備將R848、PGE2、青黴素、鏈黴素和無血清AM-V培養液混合，得到促成熟培養基1，所述R848在促成熟培養基I中的濃度為I μ g/mL ;所述PGE2在促成熟培養基I中的濃度為I μ g/mL，青黴素在促成熟培養基I中的濃度為100U/mL，鏈黴素在促成熟培養基I中的濃度為100 μ g/mL ；促成熟培養基2按照如下方法製備將R848、PGE2、青黴素、鏈黴素和無血清AM-V培養液混合，得到促成熟培養基2，所述R848在促成熟培養基2中的濃度為2. 5 μ g/mL ;所述PGE2在促成熟培養基2中的濃度為I μ g/mL,青黴素在促成熟培養基2中的濃度為100U/mL，鏈黴素在促成熟培養基2中的濃度為100 μ g/mL ；促成熟培養基3按照如下方法製備將R848、PGE2、青黴素、鏈黴素和無血清AM-V培養液混合，得到促成熟培養基3，所述R848在促成熟培養基3中的濃度為5 μ g/mL ;所述PGE2在促成熟培養基3中的濃度為I μ g/mL,青黴素在促成熟培養基3中的濃度為100U/mL，鏈黴素在促成熟培養基3中的濃度為100 μ g/mL ； 促成熟培養基4按照如下方法製備將R848、PGE2、青黴素、鏈黴素和無血清AM-V培養液混合，得到促成熟培養基4所述R848在促成熟培養基4中的濃度為7. 5 μ g/mL ;所述PGE2在促成熟培養基4中的濃度為I μ g/mL,青黴素在促成熟培養基4中的濃度為100U/mL，鏈黴素在促成熟培養基4中的濃度為100 μ g/mL ；促成熟培養基5按照如下方法製備將R848、PGE2、青黴素、鏈黴素和無血清AM-V培養液混合，得到促成熟培養基5，所述R848在促成熟培養基5中的濃度為10 μ g/mL ;所述PGE2在促成熟培養基5中的濃度為I μ g/mL,青黴素在促成熟培養基5中的濃度為100U/mL，鏈黴素在促成熟培養基5中的濃度為100 μ g/mL。將得到的對照組成熟DCl、實驗組mDCl、實驗組mDC2、實驗組mDC3、實驗組mDC4和實驗組mDC5分別進行如下檢測I)不同促成熟方案促成熟DC表型檢測用流式細胞儀檢測表型，具體如下
a、收集的mDC均分至4個流式管中，每管加入ImL PBS,室溫(25 °C )離心，1500rpm，5min ；b、上清，調整PBS體積至100 μ L，對照管(C)和試驗管(Tl，Τ2，Τ3)中分別加入相應抗體10 μ L後混勻，室溫避光孵育20min ；C管加PE-，FITC-, PerCp-, APC-同型對照(即鼠抗人IgGl-FITC(美國BD公司，目錄號555748);鼠抗人IgGl-PE (美國BD公司，目錄號:555749);鼠抗人IgG2a-PeKp (美國BD公司，目錄號:349054);鼠抗人IgGl-APC(美國 BD 公司，目錄號:555751)) ,Tl 管加 CD40-FITC，CD80-PE，CD14-APC，T2 管加 CD86-FITC，CD83-PE，CDllb-APC, T3 管加 CDla-FITC, CD274-PE，CDl Ic-APC,同時取少量細胞準備CD86-FITC 和 CD83-PE 單陽管；C、分別加入ImL PBS混勻，室溫離心，1500rpm，5min ；d、棄上清，加入200μ 1%多聚甲醛固定，上流式細胞儀檢測。
對照組成熟DCl的結果如表I所示，表I對照組促成熟DCl表型
Markers對照組成熟DCl
~CD40%99.63
MFI51.53
CD80%99.68
MFI219.55
CD83%95.85
MFI100.63
CD86%97.35
MFI162.76
CD274 %99.57MFI140.50
CDla%20.26
MFI10.64
HLA-DR %99.60
MFI661.25
CDllc%99.84
MFI760.22
CDllb %98.74
MFI354.55
CD14%1.59
MFI3.87實驗組mDCl、實驗組mDC2、實驗組mDC3、實驗組mDC4和實驗組mDC5結果如表2所示，表2不同濃度的實驗組促成熟DC表型
權利要求
1.一種製備樹突狀細胞的促成熟培養基，按照如下方法製備將雷西莫特、前列腺素E2、青黴素、鏈黴素和細胞培養基混合，得到培養基，所述雷西莫特在所述促成熟培養基中的濃度為(1-10) μ g/mL ;所述前列腺素E2在促成熟培養基中的濃度為I μ g/mL ;所述青黴素在所述促成熟培養基中的濃度為100U/mL,所述鏈黴素在所述促成熟培養基中的濃度為100 μ g/mL。
2.根據權利要求I所述的培養基，其特徵在於 所述促成熟培養基中，所述雷西莫特在所述促成熟培養基中的濃度為(1、2.5、5、7.5或 10) μ g/mL ； 所述細胞培養基為無血清AM-V培養基。
3.根據權利要求I或2所述的培養基，其特徵在於 所述促成熟培養基中，所述雷西莫特在所述促成熟培養基中的濃度為5 μ g/mL。
4.一種用權利要求1-3中任一所述培養基製備所述樹突狀細胞的方法，包括如下步驟 1)將單核細胞在培養基A中培養，得到離體未成熟樹突狀細胞； 2)步驟I)獲得的細胞在權利要求1-3中任一所述培養基中培養，得到樹突狀細胞； 所述培養基A按照如下方法製備將無血清AIM-V培養基、青黴素、鏈黴素、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、白細胞介素-4混合，所述青黴素在所述培養基A中的濃度為100U/mL，所述鏈黴素在所述培養基A中的濃度為100μ g/mL，所述粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子在所述培養基A中的濃度為1000U/mL，所述白細胞介素-4在所述培養基A中的濃度為500U/mL。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於 步驟I)中，所述單核細胞為CD14陽性的單核細胞； 所述單核細胞為從離體的人外周血單個核細胞中分離得到； 所述分離的方法具體為用CD14磁珠分選。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其特徵在於 步驟I)中，所述培養時間為5-6天，所述培養時間具體為5天； 步驟2)中，所述培養時間為1-2天，所述培養時間具體為I天或2天。
7.由權利要求4-6中任一所述方法得到的成熟樹突狀細胞。
8.權利要求7所述的成熟樹突狀細胞在製備B肝病毒疫苗中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種促樹突狀細胞成熟的體外培養方法及專用培養基。本發明提供一種由離體未成熟樹突狀細胞製備樹突狀細胞的促成熟培養基。本發明提供的由離體未成熟樹突狀細胞製備樹突狀細胞的促成熟培養基，按照如下方法製備將R848、PGE2和無血清AIM-V培養基混合，得到培養基，所述R848在所述促成熟培養基中的濃度為(1-10)μg/mL；所述PGE2在促成熟培養基2中的濃度為1μg/mL。本發明的實驗證明，本發明的促成熟培養基要優於對照標準培養基，本發明的促成熟培養基使用的刺激因子少，促DC成熟的能力強，並且促成熟後DC存活率高。
文檔編號C12N5/0786GK102851256SQ201110180449
公開日2013年1月2日 申請日期2011年6月30日 優先權日2011年6月30日
發明者王貴強, 吳學傑, 劉永哲, 任媛媛, 李世紅 申請人:北京大學第一醫院