吸附樹脂法分離漢防己總生物鹼中的單體生物鹼的製作方法

2023-04-26 20:36:36

專利名稱：吸附樹脂法分離漢防己總生物鹼中的單體生物鹼的製作方法
技術領域：
本發明涉及高選擇性吸附樹脂的合成和中藥有效成分的分離技術領域。
背景技術：
漢防己為防己科多年生木本藤本植物粉防己的根。防己的英文名Fourstamen StephaniaRoot；處方名防己、漢防己、粉防己、廣防己、炒防己、木防己、木防己；商品名漢防己，又名粉防己。防己在我國分布廣泛，主產於安徽、浙江、江西等地。在臨床應用方面，防己可以用於治療冠心病、矽肺、肺癌。
漢防己含多種生物鹼，已分離出的有漢防己甲素(tetrandrine，漢防己鹼，又稱漢甲素)、漢防己乙素(fangchinoline，漢防己諾林鹼)、漢防己丙素、漢己素(輪環藤酚鹼)、漢防己β6以及黃酮甙、酚類、有機酸、揮髮油等。漢防己生物鹼中含量較高的為漢防己甲素和漢防己乙素，粉防己的塊莖中甲素含量約為1％，乙素約為0.5％。隨著研究的深入，發現這兩種生物鹼的功效有一定的差異，漢防己甲素具有解熱鎮痛、抗炎、利尿及抗過敏性休克、治療矽肺等作用；漢防己甲素可以逆轉GLC-82/ADR耐藥肺癌細胞對阿黴素的耐藥，下調化療耐藥肺癌細胞MRP蛋白表達，協同阿黴素增強對化療耐藥肺癌細胞凋亡作用[徐萌，周蓓等，漢防己甲素逆轉肺癌化療耐藥和凋亡抗性的實驗研究，新中醫NEW JOURNAL OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE，2006，38(6)90-91]；另外在抗炎、鎮痛、降壓作用和抗腫瘤等作用方面，漢防己乙素的作用比甲素弱。正是由於二者藥效的差別以及用藥的質量穩定性考慮，目前的漢防己生物鹼製劑均需以漢防己甲素純度高於98％的提取物為原料，因此分離漢防己生物鹼粗提物中的甲素和乙素成為漢防己製劑研究和生產的關鍵技術。漢防己甲素和乙素都屬於雙苄基異喹啉類生物鹼，分子結構如下 (A)漢防己甲素 (B)漢防己乙素其N原子呈叔胺狀態，鹼性比較強，親脂性較強，具有脂溶性生物鹼的一般溶解性，但兩者分子結構中C7位置取代基的不同，前者為甲氧基，後者為酚羥基，所以漢防己甲素的極性相對較小，能溶於冷苯，而漢防己乙素則因為極性較大，難溶於冷苯，所以目前的分離方法主要是溶劑萃取法[藥學保健論壇，中藥化學，2007年1月]，以冷苯為萃取溶劑，根據溶解度不同分離甲素和乙素，但是此方法步驟繁雜，且消耗大量強毒性溶劑苯，環境汙染較強，生產成本高。另外有文獻報導用層析法和高速逆流色譜法分離漢防己甲素和漢防己乙素[徐娟華，姚愛平，調整工藝路線改革天然藥物化學實驗，實驗室研究與探索，2004年，1卷23期；蔡定國等，應用高速逆流色譜分離粉防己主要生物鹼，中草藥，1993年，24卷7期]，但是上述兩種方法成本高，操作複雜，處理量較低，難於得到大量樣品，不適於工業化生產。目前也有把吸附樹脂用於提取漢防己總鹼的文獻報導，陶曙紅，喻蓉等利用D101大孔吸附樹脂和矽膠柱層析進行分離、提取漢防己甲素和乙素，得到純度較高的漢防己甲素和乙素，得率分別為0.06％，0.016％，總鹼含量大於98％[陶曙紅，喻蓉，大孔吸陽樹脂在提取粉防己中漢防己甲素和漢防己乙素中的應用，時珍國醫國藥，2005年05期]，但是目前所使用的樹脂仍是全聚苯乙烯型或者含有少量的弱極性基團的吸附樹脂，此類樹脂的疏水作用力很強，對於具有大部分相同疏水結構的漢防己甲素和漢防己乙素具有相同的吸附能力，無法對二者進行有效分離，因此目前未見利用吸附樹脂分離漢防己甲素和乙素的文獻報導。

發明內容本發明目地是解決現有技術中存在的上述問題，提供一種高選擇性的高極性基團含量的聚苯乙烯型吸附樹脂，並用於傳統中藥漢防己中主要兩種生物鹼-漢防己甲素和漢防己乙素的分離，利用偶極、疏水等多種弱相互作用的協同效應，使樹脂對漢防己甲素和乙素的吸附能力產生差別，通過「吸附-梯度洗脫」一個工藝流程即可達到漢防己甲素和漢防己乙素的完全分離。
本發明提供的吸附樹脂法分離漢防己總生物鹼中的單體生物鹼的方法，通過以下步驟實現(1)將漢防己粗提物溶解在2％-5％鹽酸的水溶液中，製得上柱液；(2)將高極性基團含量的聚苯乙烯吸附樹脂裝入吸附柱中，吸附柱的徑長比為1∶5-1∶20；(3)樹脂的處理量為0.2-0.6mg漢防己粗提物/ml溼樹脂；(4)室溫下，將上柱液以0.5-3.0BV/小時的流速通過樹脂柱，漢防己甲素和漢防己乙素被吸附在樹脂上；(5)室溫下，以30-50％乙醇水溶液和70-90％乙醇水溶液分步洗脫，分別接收洗脫液，在30-50％乙醇洗脫液中主要含有漢防己乙素，在70-90％乙醇洗脫液中主要含有漢防己甲素；(6)將兩部分洗脫液分別經旋轉蒸發回收乙醇水溶液、真空乾燥，即得所需產品，漢防己甲素和乙素的外觀均為白色固體。
上述方法(2)步中使用的高極性基團含量的聚苯乙烯吸附樹脂通過以下步驟製備而成
在常溫下，將分散劑聚乙烯醇(PVA)或明膠溶解於NaCl的水溶液中，配成0.5％-5％的水相，將水相加熱至30-50℃，以丙烯酸甲酯和二乙烯苯的混合物為反應單體(丙烯酸甲酯與二乙烯苯的質量比為1∶2.5-1∶1)，以甲苯和液蠟為混合致孔劑，用量為反應單體質量的80-100％，且甲苯和液蠟的質量比為2∶1-1∶1，以偶氮二異丁氰或過氧化苯甲醯為引發劑，用量為反應單體質量的0.5-2.0％，混合均勻後配成反應的油相。將油相加入水相中，水相和油相的體積比為3∶1，經懸浮聚合，升溫至60-80℃反應2-6小時，再繼續升溫至80-90℃反應3小時；最後經過濾、洗滌處理後得到所需的高極性基團含量的聚苯乙烯吸附樹脂。
所述的高極性基團含量的聚苯乙烯吸附樹脂的外觀特徵和結構參數為樹脂為球形，乳白色，粒徑0.3-1.0mm，比表面積為120-600m2/g幹樹脂，含水量為50-70％，平均孔徑為10-100nm，孔隙率50-65％。
本發明的優點和積極效果本發明根據漢防己總鹼中漢防己甲素和漢防己乙素的結構特徵，合成了一種以聚苯乙烯為骨架的、高極性基團含量的新型吸附樹脂，利用該樹脂偶極、疏水等多種弱相互作用的協同效應，可使極性差別極小、分子結構極相似的漢防己甲素和漢防己乙素與樹脂的結合力產生差別，通過「吸附-梯度洗脫」一個工藝流程，即可達到漢防己甲素和漢防己乙素的有效分離，解決了現有吸附樹脂法只能製備漢防己總生物鹼提取物而無法進行漢防己單體生物鹼分離的局限，同時也避免現有溶劑萃取分離工藝中使用大量強毒性、易揮發、易燃的有機溶劑且分離工藝煩瑣的缺陷，本發明工藝簡單，不使用低沸點、強毒性有機溶劑，環境友好，樹脂可再生使用，生產成本低，製備的漢防己甲素純度高於98％，可為進一步的藥用研究和製劑生產提供大量試驗樣品和原料藥。
具體實施方式實施例1高極性基團含量的聚苯乙烯吸附樹脂的製備常溫下，在1000ml三口瓶中將4.8g聚乙烯醇、24gNaCl溶於450g水中，加熱至30-50℃。將40g丙烯酸甲酯、40g二乙烯苯、53g甲苯、27g液蠟、0.8g偶氮二異丁氰混合均勻，配成油相。將油相加入水相中，懸浮聚合。首先升溫至68℃反應5小時，再繼續升溫至85℃反應3小時；最後經過濾、洗滌處理後得到所需的吸附樹脂，其外觀特徵和結構參數為樹脂為球形，乳白色，粒徑0.3-0.7mm，比表面積為428m2/g幹樹脂，含水量為65.4％，平均孔徑為34.8nm，孔隙率61.2％。
實施例2高極性基團含量的聚苯乙烯吸附樹脂的製備常溫下，在10升三口瓶中將54g明膠、540gNaCl溶於4.8Kg水中，加熱至30-50℃。將400g丙烯酸甲酯、600g二乙烯苯、400g甲苯、400g液蠟、10g偶氮二異丁氰混合均勻，配成油相。將油相加入水相中，懸浮聚合。首先升溫至66℃反應6小時，再繼續升溫至85℃反應3小時；最後經過濾、洗滌處理後得到所需的吸附樹脂，其外觀特徵和結構參數為樹脂為球形，乳白色，粒徑0.3-1.0mm，比表面積為502m2/g幹樹脂，含水量為62.1％，平均孔徑為31.3nm，孔隙率65.4％。
實施例3將漢防己粗提物10.5mg(含漢防己甲素90.5％，漢漢防己乙素5.2％)，溶解於30ml、0.3M的鹽酸水溶液中，製成上柱液，將其通過裝有上述樹脂的樹脂柱吸附(樹脂柱內徑1.5cm，柱長30cm，裝有30ml溼樹脂)，吸附速度為0.5BV/h，吸附完成後，用30％乙醇和80％乙醇分步洗脫，流速均為0.5BV/h，兩部分洗脫液分別蒸乾得固體樣品，經Waters484高效液相色譜儀檢測，30％乙醇解吸液蒸乾後的固體中未檢測到漢防己甲素，漢防己乙素含量為30.2％，而80％乙醇解吸液蒸乾後的固體中漢防己甲素含量為99.1％，漢防己乙素含量為0.8％。
實施例4將漢防己粗提物12.6mg(含漢防己甲素90.5％，漢漢防己乙素5.2％)，溶解於40ml、0.3M的鹽酸水溶液中，製成上柱液，將其通過裝有上述樹脂的樹脂柱吸附(樹脂柱內徑1.5cm，柱長30cm，裝有30ml溼樹脂)，吸附速度為1.0BV/h，吸附完成後，用50％乙醇和80％乙醇分步洗脫，流速均為1.0BV/h，兩部分洗脫液分別蒸乾得固體樣品，經Waters484高效液相色譜儀檢測，50％乙醇解吸液蒸乾後的固體中漢防己甲素含量為1.5％，漢防己乙素含量為32.4％，而80％乙醇解吸液蒸乾後的固體中未檢測到漢防己乙素，漢防己甲素含量為98.6％。
實施例5將漢防己粗提物9.9mg(含漢防己甲素90.5％，漢漢防己乙素5.2％)，溶解於40ml、0.3M的鹽酸水溶液中，製成上柱液，將其通過裝有上述樹脂的樹脂柱吸附(樹脂柱內徑1.5cm，柱長30cm，裝有30ml溼樹脂)，吸附速度為2.0BV/h，吸附完成後，用40％乙醇和80％乙醇分步洗脫，流速均為2.0BV/h，兩部分洗脫液分別蒸乾得固體樣品，經Waters484高效液相色譜儀檢測，40％乙醇解吸液蒸乾後的固體中未檢測到漢防己甲素，漢防己乙素含量為35.8％，而80％乙醇解吸液蒸乾後的固體中未檢測到漢防己乙素，漢防己甲素含量為98.8％。
實施例6將漢防己粗提物37.9mg(含漢防己甲素90.5％，漢漢防己乙素5.2％)，溶解於120ml、0.3M的鹽酸水溶液中，製成上柱液，通過裝有上述樹脂的樹脂柱(樹脂柱內徑2.5cm，柱長40cm，裝有100ml溼樹脂)，吸附速度為1.5BV/h，吸附完成後，用40％乙醇和80％乙醇分步洗脫，流速均為1.0BV/h，兩部分洗脫液分別蒸乾得固體樣品，經Waters484高效液相色譜儀檢測，40％乙醇解吸液蒸乾後的固體中未檢測到漢防己甲素，漢防己乙素含量為32.6％，而80％乙醇解吸液蒸乾後的固體中未檢測到漢防己乙素，漢防己甲素含量為99.4％。
實施例7將漢防己粗提物15.2mg(含漢防己甲素62.5％，漢防己乙素30.6％)，溶解於40ml、0.3M的鹽酸水溶液中，製成上柱液，將其通過裝有上述樹脂的樹脂柱吸附(樹脂柱內徑1.5cm，柱長30cm，裝有30ml溼樹脂)，吸附速度為1.0BV/h，吸附完成後，用40％乙醇和80％乙醇分步洗脫，流速均為0.5BV/h，兩部分洗脫液分別蒸乾得固體樣品，經Waters484高效液相色譜儀檢測，40％乙醇解吸液蒸乾後的固體中未檢測到漢防己甲素，漢防己乙素含量為62.6％，而80％乙醇解吸液蒸乾後的固體中漢防己甲素含量為98.8％，漢防己乙素含量為0.86％。
實施例8將漢防己粗提物52.3mg(含漢防己甲素62.5％，漢防己乙素30.6％)，溶解於120ml、0.3M的鹽酸水溶液中，製成上柱液，通過裝有上述樹脂的樹脂柱吸附(樹脂柱內徑2.5cm，柱長40cm，裝有100ml溼樹脂)，吸附速度為1.5BV/h，吸附完成後，用40％乙醇和80％乙醇分步洗脫，流速均為1.0BV/h，兩部分洗脫液分別蒸乾得固體樣品，經Waters484高效液相色譜儀檢測，40％乙醇解吸液蒸乾後的固體中未檢測到漢防己甲素，漢防己乙素含量為58.2％，而80％乙醇解吸液蒸乾後的固體中漢防己甲素含量為98.4％，漢防己乙素含量為1.1％。
權利要求
1.一種吸附樹脂法分離漢防己總生物鹼中的單體生物鹼的方法，其特徵是通過以下步驟實現(1)將漢防己粗提物溶解在2％-5％鹽酸的水溶液中，製得上柱液；(2)將高極性基團含量的聚苯乙烯吸附樹脂裝入吸附柱中，吸附柱的徑長比為1∶5-1∶20；(3)樹脂的處理量為0.2-0.6mg漢防己粗提物/ml溼樹脂；(4)室溫下，將上柱液以0.5-3.0BV/小時的流速通過樹脂柱，漢防己甲素和漢防己乙素被吸附在樹脂上；(5)室溫下，以30-50％乙醇水溶液和70-90％乙醇水溶液分步洗脫，分別接收洗脫液，在30-50％乙醇洗脫液中主要含有漢防己乙素，在70-90％乙醇洗脫液中主要含有漢防己甲素；(6)將兩部分洗脫液分別經減壓蒸餾回收乙醇、真空乾燥，即得所需產品，漢防己甲素和乙素的外觀均為白色固體。
2.根據權利要求1所述的吸附樹脂法分離漢防己總生物鹼中的單體生物鹼的方法，其特徵是(2)步中使用的高極性基團含量的聚苯乙烯吸附樹脂通過以下步驟製備而成在常溫下，將分散劑聚乙烯醇或明膠溶解於濃度為5-10％NaCl的水溶液中，配成0.5％-5％的水相，將水相加熱至30-50℃，以丙烯酸甲酯和二乙烯苯的混合物為反應單體，其中丙烯酸甲酯與二乙烯苯的質量比為1∶2.5-1∶1，以甲苯和液蠟為混合致孔劑，用量為反應單體質量的80-100％，且甲苯和液蠟的質量比為2∶1-1∶1，以偶氮二異丁氰或過氧化苯甲醯為引發劑，用量為反應單體質量的0.5-2.0％，混合均勻後配成反應的油相；將油相加入水相中，水相和油相的體積比為3∶1，經懸浮聚合，升溫至60-80℃反應2-6小時，再繼續升溫至80-90℃反應3小時；最後經過濾、洗滌處理後得到所需的高極性基團含量的聚苯乙烯吸附樹脂。
3.根據權利要求2所述的吸附樹脂法分離漢防己總生物鹼中的單體生物鹼的方法，其特徵是所述的高極性基團含量的聚苯乙烯吸附樹脂的外觀特徵和結構參數為樹脂為球形，乳白色，粒徑0.3-1.0mm，比表面積為120-600m2/g幹樹脂，含水量為50-70％，平均孔徑為10-100nm，孔隙率50-65％。
4.根據權利要求2所述的吸附樹脂法分離漢防己總生物鹼中的單體生物鹼的方法，其特徵是所述的分散劑為聚乙烯醇或明膠。
全文摘要
吸附樹脂法分離漢防己總生物鹼中單體生物鹼的方法。包括漢防己粗提物溶解在鹽酸水溶液中，室溫下通過樹脂柱，漢防己甲素和乙素被吸附；以30－50％和70－90％乙醇水溶液分步洗脫，兩部分洗脫液分別經減壓蒸餾回收乙醇、乾燥，即得白色固體，經HPLC測定，第一步洗脫液只含有漢防己乙素，第二步洗脫液中只含有漢防己甲素。本發明利用樹脂偶極、疏水等多種弱相互作用的協同效應，可使分子結構極相似的漢防己甲素和乙素與樹脂的結合力產生差別，通過「吸附－梯度洗脫」一個工藝流程即可使二者分離，且製備的漢防己甲素純度高於98％，可為進一步的藥用研究和製劑生產提供大量試驗樣品。
文檔編號A61K36/185GK101033229SQ20071005675
公開日2007年9月12日 申請日期2007年2月9日 優先權日2007年2月9日
發明者王春紅, 施榮富, 夏建軍, 任萍 申請人:南開大學