一種新的多肽－人腫瘤抑制因子46和編碼這種多肽的多核苷酸的製作方法

2023-04-26 20:36:26 1

專利名稱：一種新的多肽－人腫瘤抑制因子46和編碼這種多肽的多核苷酸的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體地說，本發明描述了一種新的多肽——人腫瘤抑制因子46，以及編碼此多肽的多核苷酸序列。本發明還涉及此多核苷酸和多肽的製備方法和應用。
背景技術：
人癌症的發生是通過至少兩種基因(原癌基因和腫瘤抑制因子基因)的改變，造成無性繁殖系的細胞數目劇增獲得對其他細胞的競爭優勢，於是腫瘤產生了。(Weinberg，R.A.，Science，2541138，1991；Bishop，J.M.，Science，235305，1987)早先的研究表明，腫瘤抑制因子在細胞凋亡的過程中起著控制細胞生長的作用。(Mol cell Biol 1997，Apr；17(4)2014-9)ING1是一種新的腫瘤抑制因子基因，此基因目前已被克隆。(I.Garkavtsev，A.Kazarov，A.Gudkov，and K.Riabowol，Nat.Genet.14415-420，1996)研究表明，(1)在已衰老的細胞中，ING1的表達要比年輕的細胞高出8-10倍。(2)在細胞周期中，核ING1蛋白的表達是受嚴格調控的，並且在DNA合成過程中表達量最高。(Mol cell Biol 1997，Apr；17(4)2014-9)ING1的過度表達與細胞生長的抑制或停滯有關，ING1的抑制可以導致致瘤性轉化/贅生轉化。利用放射性雜交定位，p33ING1被定位於人染色體13的長臂上(13q34)。(Somat Cell Mol Genet 1997 May；23(3)233-6)有研究表明，在成神經細胞瘤的腫瘤細胞中，ING1基因發生了突變；在一些乳腺癌細胞株中，ING1基因的表達量很低。(Nat Genet 1996 Dec；14(4)415-420)以上種種結果表明，ING1所編碼蛋白是一般細胞和確定細胞株的生長調節因子，並且ING1作為腫瘤抑制因子基因在癌症的發生過程中有重要作用。
根據同源比較的結果，本發明的多肽被推斷鑑定為人腫瘤抑制因子46(HING1P46)。
本發明的多肽與已公開的p33ING1所編碼多肽相比較，本發明的多肽多出一段信號肽，這段信號肽的作用目前尚不明確，但一定是與調節ING1的表達有關。

發明內容
本發明的一個目的是提供分離的新的多肽——人腫瘤抑制因子46以及其片段、類似物和衍生物。
本發明的另一個目的是提供編碼該多肽的多核苷酸。。
本發明的另一個目的是提供含有編碼人腫瘤抑制因子46的多核苷酸的重組載體。
本發明的另一個目的是提供含有編碼人腫瘤抑制因子46的多核苷酸的基因工程化宿主細胞。
本發明的另一個目的是提供生產人腫瘤抑制因子46的方法。
本發明的另一個目的是提供針對本發明的多肽——人腫瘤抑制因子46的抗體。
本發明的另一個目的是提供了針對本發明多肽——人腫瘤抑制因子46的模擬化合物、拮抗劑、激動劑、抑制劑。
本發明的另一個目的是提供診斷治療與人腫瘤抑制因子46異常相關的疾病的方法。
在本發明的第一方面，提供新穎的分離出的人腫瘤抑制因子46，該多肽是人源的，它包含具有2102胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物、類似物。較佳地，該多肽是具有2102胺基酸序列的多肽。
在本發明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少99％相同性(a)編碼上述人腫瘤抑制因子46的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有2102所示胺基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有2101中120-1376位的序列；和(b)具有2101中1-1805位的序列。
在本發明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉化或轉導的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉化或轉導的宿主細胞。
本發明的其它方面由於本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
下列附圖用於說明本發明的具體實施方案，而不用於限定由權利要求書所界定的本發明範圍。
圖1是本發明人腫瘤抑制因子46和人的腫瘤抑制因子pING33的胺基酸序列同源性比較圖。上方序列是人腫瘤抑制因子46，下方序列是人腫瘤抑制因子Ping33。相同胺基酸在兩個序列間用單字符胺基酸表示，相似胺基酸用「+」表示。
圖2為分離的人腫瘤抑制因子的聚丙烯醯胺凝膠電泳圖(SDS-PAGE)。46kDa為蛋白質的分子量。箭頭所指為分離出的蛋白條帶。
如本發明所用，「分離的」是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
如本文所用，「分離的」是指人腫瘤抑制因子46基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化人腫瘤抑制因子46。基本上純的多肽在非還原聚丙烯醯胺凝膠上能產生單一的主帶。人腫瘤抑制因子46多肽的純度能用胺基酸序列分析。
本發明提供了一種新的多肽——人腫瘤抑制因子46，其基本上是由SEQ ID NO2所示的胺基酸序列組成的。本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發明還包括人腫瘤抑制因子46的片段、衍生物和類似物。如本發明所用，術語「片段」、「衍生物」和「類似物」是指基本上保持本發明的人腫瘤抑制因子46相同的生物學功能或活性的多肽。本發明多肽的片段、衍生物或類似物可以是(I)這樣一種，其中一個或多個胺基酸殘基被保守或非保守胺基酸殘基(優選的是保守胺基酸殘基)取代，並且取代的胺基酸可以是也可以不是由遺傳密碼子編碼的；或者(II)這樣一種，其中一個或多個胺基酸殘基上的某個基團被其它基團取代包含取代基；或者(III)這樣一種，其中成熟多肽與另一種化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；或者(IV)這樣一種，其中附加的胺基酸序列融合進成熟多肽而形成的多肽序列(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列)通過本文的闡述，這樣的片段、衍生物和類似物被認為在本領域技術人員的知識範圍之內。
本發明提供了分離的核酸(多核苷酸)，基本由編碼具有2102胺基酸序列的多肽的多核苷酸組成。本發明的多核苷酸序列包括SEQ ID NO1的核苷酸序列。本發明的多核苷酸是從人胎腦組織的cDNA文庫中發現的。它包含的多核苷酸序列全長為1805個鹼基，其開放讀框(120-1376)編碼了418個胺基酸。根據胺基酸序列同源比較發現，此多肽與人的腫瘤抑制因子pING33有99％的同源性，本發明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區序列可以與2101所示的編碼區序列相同或者是簡併的變異體。如本發明所用，「簡併的變異體」在本發明中是指編碼具有2102的蛋白質或多肽，但與2101所示的編碼區序列有差別的核酸序列。
編碼2102的成熟多肽的多核苷酸包括只有成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語「編碼多肽的多核苷酸」是指包括編碼此多肽的多核苷酸和包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及上述描述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的胺基酸序列的多肽或多肽的片斷、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
本發明還涉及與以上所描述的序列雜交的多核苷酸(兩個序列之間具有至少50％，優選具有70％的相同性)。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，「嚴格條件」是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加用變性劑，如50％(v/v)甲醯胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在95％以上，更好是97％以上時才發生雜交。並且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發明還涉及與以上所描述的序列雜交的核酸片段。如本發明所用，」核酸片段」的長度至少含10個核苷酸，較好是至少20-30個核苷酸，更好是至少50-60個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段也可用於核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼人腫瘤抑制因子46的多核苷酸。
本發明中的多肽和多核苷酸優選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質。
本發明的編碼人腫瘤抑制因子46的特異的多核苷酸序列能用多種方法獲得。例如，用本領域熟知的雜交技術分離多核苷酸。這些技術包括但不局限於1)用探針與基因組或cDNA文庫雜交以檢出同源的多核苷酸序列，和2)表達文庫的抗體篩選以檢出具有共同結構特徵的克隆的多核苷酸片段。
本發明的DNA片段序列也能用下列方法獲得1)從基因組DNA分離雙鏈DNA序列；2)化學合成DNA序列以獲得所述多肽的雙鏈DNA。
上述提到的方法中，分離基因組DNA最不常用。DNA序列的直接化學合成是經常選用的方法。更經常選用的方法是cDNA序列的分離。分離感興趣的cDNA的標準方法是從高表達該基因的供體細胞分離mRNA並進行逆轉錄，形成質粒或噬菌體cDNA文庫。提取mRNA的方法已有多種成熟的技術，試劑盒也可從商業途徑獲得(Qiagene)。而構建cDNA文庫也是通常的方法(Sambrook，et al.，MolecularCloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。還可得到商業供應的cDNA文庫，如Clontech公司的不同cDNA文庫。當結合使用聚合酶反應技術時，即使極少的表達產物也能克隆。
可用常規方法從這些cDNA文庫中篩選本發明的基因。這些方法包括(但不限於)(1)DNA-DNA或DNA-RNA雜交；(2)標誌基因功能的出現或喪失；(3)測定人腫瘤抑制因子46的轉錄本的水平；(4)通過免疫學技術或測定生物學活性，來檢測基因表達的蛋白產物。上述方法可單用，也可多種方法聯合應用。
在第(1)種方法中，雜交所用的探針是與本發明的多核苷酸的任何一部分同源，其長度至少10個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸。此外，探針的長度通常在2000個核苷酸之內，較佳的為1000個核苷酸之內。此處所用的探針通常是在本發明的基因序列信息的基礎上化學合成的DNA序列。本發明的基因本身或者片段當然可以用作探針。DNA探針的標記可用放射性同位素，螢光素或酶(如鹼性磷酸酶)等。
在第(4)種方法中，檢測人腫瘤抑制因子46基因表達的蛋白產物可用免疫學技術如Western印跡法，放射免疫沉澱法，酶聯免疫吸附法(ELISA)等。
應用PCR技術擴增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science1985；2301350-1354)被優選用於獲得本發明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴增法)，用於PCR的引物可根據本文所公開的本發明的多核苷酸序列信息適當地選擇，並可用常規方法合成。可用常規方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
如上所述得到的本發明的基因，或者各種DNA片段等的多核苷酸序列可用常規方法如雙脫氧鏈終止法(Sanger et al.PNAS，1977，745463-5467)測定。這類多核苷酸序列測定也可用商業測序試劑盒等。為了獲得全長的cDNA序列，測序需反覆進行。有時需要測定多個克隆的cDNA序列，才能拼接成全長的cDNA序列。
本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或直接用人腫瘤抑制因子46編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述多肽的方法。
本發明中，編碼人腫瘤抑制因子46的多核苷酸序列可插入到載體中，以構成含有本發明所述多核苷酸的重組載體。術語「載體」指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其它載體。在本發明中適用的載體包括但不限於在細菌中表達的基於T7啟動子的表達載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體(Lee and Nathans，J Bio Chem.2633521，1988)和在昆蟲細胞中表達的來源於杆狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內複製和穩定，任何質粒和載體都可以用於構建重組表達載體。表達載體的一個重要特徵是通常含有複製起始點、啟動子、標記基因和翻譯調控元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用於構建含編碼人腫瘤抑制因子46的DNA序列和合適的轉錄/翻譯調控元件的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，aLaboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體的PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核細胞或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子等。在載體中插入增強子序列將會使其在高等真核細胞中的轉錄得到增強。增強子是DNA表達的順式作用因子，通常大約有10到300個鹼基對，作用於啟動子以增強基因的轉錄。可舉的例子包括在複製起始點晚期一側的100到270個鹼基對的SV40增強子、在複製起始點晚期一側的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。
此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用於選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新黴素抗性以及綠色螢光蛋白(GFP)，或用於大腸桿菌的四環素或氨苄青黴素抗性等。
本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體/轉錄調控元件(如啟動子、增強子等)和選擇性標記基因。
本發明中，編碼人腫瘤抑制因子46的多核苷酸或含有該多核苷酸的重組載體可轉化或轉導入宿主細胞，以構成含有該多核苷酸或重組載體的基因工程化宿主細胞。術語「宿主細胞」指原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈黴菌屬；細菌細胞如鼠傷寒沙門氏菌；真菌細胞如酵母；植物細胞；昆蟲細胞如果蠅S2或Sf9；動物細胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤細胞等。
用本發明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重組載體轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期後收穫，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。可供選擇的是用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉澱法，或者常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
通過常規的重組DNA技術，利用本發明的多核苷酸序列可用來表達或生產重組的人腫瘤抑制因子46(Science，1984；2241431)。一般來說有以下步驟(1).用本發明的編碼人人腫瘤抑制因子46的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養基中培養宿主細胞；(3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。
在步驟(2)中，根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適於宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度後，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
在步驟(3)中，重組多肽可包被於細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法包括但並不限於常規的復性處理、蛋白沉澱劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲波處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
根據已有的研究，ING1編碼的蛋白是一般細胞和確定細胞株的生長調節因子，並且ING1作為腫瘤抑制因子基因在癌症的發生過程中有重要作用。如果本發明的多肽在人體內的表達過低，則可能會引起癌症等；如果本發明的多肽的表達量過高，則可能會導致細胞生長的停滯。因此本發明的多肽可用於很多疾病的診斷和治療，如惡性腫瘤，免疫性疾病，人獲得性免疫缺乏綜合症(AIDS)，內分泌系統疾病，神經系統疾病等等。
本發明的多肽可直接用於治療人的惡性腫瘤，包括但不限於胃癌、肝癌、大腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、宮頸癌、胰腺癌、食道癌。
本發明的多肽是一種免疫調節劑，具有免疫促進或免疫抑制作用。本發明的多肽可用於一些疾病的治療，這些疾病包括免疫反應的無反應性，或異常免疫反應，或宿主防衛無效。本發明的多肽和其抗體多免疫組織的損傷、缺陷或失調類疾病也有作用，特別是對於造血系統疾病(如惡性貧血)，皮膚病(如牛皮癬)，自身免疫病(如類風溼性關節炎)，放射性疾病以及免疫淋巴細胞的生成和調節有極為密切的關係。
本發明多肽的抗體是細胞生長的餓調節物，可以在細胞生長受到抑制的時候促進細胞的生長和個體的發育。本發明多肽及其抗體都可用於細胞周期過程中的調節，起到對細胞裂殖、分化、衰老、凋亡的調控作用。
本發明也提供了篩選化合物以鑑定提高(激動劑)或阻遏(拮抗劑)人腫瘤抑制因子46的藥劑的方法。激動劑提高人腫瘤抑制因子46刺激細胞增殖等生物功能，而拮抗劑阻止和治療與細胞過度增殖有關的紊亂如各種癌症。例如，能在藥物的存在下，將哺乳動物細胞或表達人腫瘤抑制因子46的膜製劑與標記的人腫瘤抑制因子46一起培養。然後測定藥物提高或阻遏此相互作用的能力。
人腫瘤抑制因子46的拮抗劑包括篩選出的抗體、化合物、受體缺失物和類似物等。人腫瘤抑制因子46的拮抗劑可以與人腫瘤抑制因子46結合併消除其功能，或是抑制該多肽的產生，或是與該多肽的活性位點結合使該多肽不能發揮生物學功能。
在篩選作為拮抗劑的化合物時，可以將人腫瘤抑制因子46加入生物分析測定中，通過測定化合物對人腫瘤抑制因子46和其受體之間相互作用的影響來確定化合物是否是拮抗劑。用上述篩選化合物的同樣方法，可以篩選出起拮抗劑作用的受體缺失物和類似物。能與人腫瘤抑制因子46結合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的胺基酸結合於固相物組成的隨機多肽庫而獲得。篩選時，一般應對人腫瘤抑制因子46分子進行標記。
本發明提供了用多肽，及其片段、衍生物、類似物或它們的細胞作為抗原以生產抗體的方法。這些抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。本發明還提供了針對人腫瘤抑制因子46抗原決定簇的抗體。這些抗體包括(但不限於)多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和Fab表達文庫產生的片段。
多克隆抗體的生產可用人腫瘤抑制因子46直接注射免疫動物(如家兔，小鼠，大鼠等)的方法得到，多種佐劑可用於增強免疫反應，包括但不限於弗氏佐劑等。製備人腫瘤抑制因子46的單克隆抗體的技術包括但不限於雜交瘤技術(Kohler and Milstein.Nature，1975，256495-497)，三瘤技術，人B-細胞雜交瘤技術，EBV-雜交瘤技術等。將人恆定區和非人源的可變區結合的嵌合抗體可用已有的技術生產(Morrison et al，PNAS，1985，816851)。而已有的生產單鏈抗體的技術(U.S.Pat No.4946778)也可用於生產抗人腫瘤抑制因子46的單鏈抗體。
抗人腫瘤抑制因子46的抗體可用於免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的人腫瘤抑制因子46。
與人腫瘤抑制因子46結合的單克隆抗體也可用放射性同位素標記，注入體內可跟蹤其位置和分布。這种放射性標記的抗體可作為一種非創傷性診斷方法用於腫瘤細胞的定位和判斷是否有轉移。
抗體還可用於設計針對體內某一特殊部位的免疫毒素。如人腫瘤抑制因子46高親和性的單克隆抗體可與細菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆鹼等)共價結合。一種通常的方法是用巰基交聯劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結合於抗體上，這種雜交抗體可用於殺滅人腫瘤抑制因子46陽性的細胞。
本發明中的抗體可用於治療或預防與人腫瘤抑制因子46相關的疾病。給予適當劑量的抗體可以刺激或阻斷人腫瘤抑制因子46的產生或活性。
本發明還涉及定量和定位檢測人腫瘤抑制因子46水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的人腫瘤抑制因子46水平，可以用作解釋人腫瘤抑制因子46在各種疾病中的重要性和用於診斷人腫瘤抑制因子46起作用的疾病。
本發明的多肽還可用作肽譜分析，例如，多肽可用物理的、化學或酶進行特異性切割，並進行一維或二維或三維的凝膠電泳分析，更好的是進行質譜分析。
編碼人腫瘤抑制因子46的多核苷酸也可用於多種治療目的。基因治療技術可用於治療由於人腫瘤抑制因子46的無表達或異常/無活性表達所致的細胞增殖、發育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設計用於表達變異的人腫瘤抑制因子46，以抑制內源性的人腫瘤抑制因子46活性。例如，一種變異的人腫瘤抑制因子46可以是縮短的、缺失了信號傳導功能域的人腫瘤抑制因子46，雖可與下遊的底物結合，但缺乏信號傳導活性。因此重組的基因治療載體可用於治療人腫瘤抑制因子46表達或活性異常所致的疾病。來源於病毒的表達載體如逆轉錄病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒、單純皰疹病毒、細小病毒等可用於將編碼人腫瘤抑制因子46的多核苷酸轉移至細胞內。構建攜帶編碼人腫瘤抑制因子46的多核苷酸的重組病毒載體的方法可見於已有文獻(Sambrook，et al.)。另外重組編碼人腫瘤抑制因子46的多核苷酸可包裝到脂質體中轉移至細胞內。
多核苷酸導入組織或細胞內的方法包括將多核苷酸直接注入到體內組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質粒等)先將多核苷酸導入細胞中，再將細胞移植到體內等。
抑制人腫瘤抑制因子46mRNA的寡核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發明的範圍之內。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機制是核酶分子與互補的靶RNA特異性雜交後進行核酸內切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術獲得，如固相磷酸醯胺化學合成法合成寡核苷酸的技術已廣泛應用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內轉錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下遊。為了增加核酸分子的穩定性，可用多種方法對其進行修飾，如增加兩側的序列長度，核糖核苷之間的連接應用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
編碼人腫瘤抑制因子46的多核苷酸可用於與人腫瘤抑制因子46的相關疾病的診斷。編碼人腫瘤抑制因子46的多核苷酸可用於檢測人腫瘤抑制因子46的表達與否或在疾病狀態下人腫瘤抑制因子46的異常表達。如編碼人腫瘤抑制因子46的DNA序列可用於對活檢標本進行雜交以判斷人腫瘤抑制因子46的表達狀況。雜交技術包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術方法都是公開的成熟技術，相關的試劑盒都可從商業途徑得到。本發明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(Microarray)或DNA晶片(又稱為「基因晶片」)上，用於分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用人腫瘤抑制因子46特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測人腫瘤抑制因子46的轉錄產物。
檢測人腫瘤抑制因子46基因的突變也可用於診斷人腫瘤抑制因子46相關的疾病。人腫瘤抑制因子46突變的形式包括與正常野生型人腫瘤抑制因子46DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發明的序列對染色體鑑定也是有價值的。該序列會特異性地針對某條人染色體具體位置且並可以與其雜交。目前，需要鑑定染色體上的各基因的具體位點。現在，只有很少的基於實際序列數據(重複多態性)的染色體標記物可用於標記染色體位置。根據本發明，為了將這些序列與疾病相關基因相關聯，其重要的第一步就是將這些DNA序列定位於染色體上。
簡而言之，根據cDNA製備PCR引物(優選15-35bp)，可以將序列定位於染色體上。然後，將這些引物用於PCR篩選含各條人染色體的體細胞雜合細胞。只有那些含有相應於引物的人基因的雜合細胞會產生擴增的片段。
體細胞雜合細胞的PCR定位法，是將DNA定位到具體染色體的快捷方法。使用本發明的寡核苷酸引物，通過類似方法，可利用一組來自特定染色體的片段或大量基因組克隆而實現亞定位。可用於染色體定位的其它類似策略包括原位雜交、用標記的流式分選的染色體預篩選和雜交預選，從而構建染色體特異的cDNA庫。
將cDNA克隆與中期染色體進行螢光原位雜交(FISH)，可以在一個步驟中精確地進行染色體定位。此技術的綜述，參見Verma等，Human Chromosomesa Manualof Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦序列被定位到準確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數據相關聯。這些數據可見於例如，V.Mckusick，MendelianInheritance in Man(可通過與Johns Hopkins University Welch Medical Library聯機獲得)。然後可通過連鎖分析，確定基因與業已定位到染色體區域上的疾病之間的關係。
接著，需要測定患病和未患病個體間的cDNA或基因組序列差異。如果在一些或所有的患病個體中觀察到某突變，而該突變在任何正常個體中未觀察到，則該突變可能是疾病的病因。比較患病和未患病個體，通常涉及首先尋找染色體中結構的變化，如從染色體水平可見的或用基於cDNA序列的PCR可檢測的缺失或易位。根據目前的物理作圖和基因定位技術的分辨能力，被精確定位至與疾病有關的染色體區域的cDNA，可以是50至500個潛在致病基因間之一種(假定1兆鹼基作圖分辨能力和每20kb對應於一個基因)。
可以將本發明的多肽、多核苷酸及其模擬物、激動劑、拮抗劑和抑制劑與合適的藥物載體組合後使用。這些載體可以是水、葡萄糖、乙醇、鹽類、緩衝液、甘油以及它們的組合。組合物包含安全有效量的多肽或拮抗劑以及不影響藥物效果的載體和賦形劑。這些組合物可以作為藥物用於疾病治療。
本發明還提供含有一種或多種容器的藥盒或試劑盒，容器中裝有一種或多種本發明的藥用組合物成分。與這些容器一起，可以有由製造、使用或銷售藥品或生物製品的政府管理機構所給出的指示性提示，該提示反映出生產、使用或銷售的政府管理機構許可其在人體上施用。此外，本發明的多肽可以與其它的治療化合物結合使用。
藥物組合物可以以方便的方式給藥，如通過局部、靜脈內、腹膜內、肌內、皮下、鼻內或皮內的給藥途徑。人腫瘤抑制因子46以有效地治療和/或預防具體的適應症的量來給藥。施用於患者的人腫瘤抑制因子46的量和劑量範圍將取決於許多因素，如給藥方式、待治療者的健康條件和診斷醫生的判斷。


下列附圖用於說明本發明的具體實施方案，而不用於限定由權利要求書所界定的本發明範圍。
圖1是本發明人腫瘤抑制因子46和人的腫瘤抑制因子pING33的胺基酸序列同源性比較圖。上方序列是人腫瘤抑制因子46，下方序列是人腫瘤抑制因子Ping33。相同胺基酸在兩個序列間用單字符胺基酸表示，相似胺基酸用「+」表示。
圖2為分離的人腫瘤抑制因子類似蛋白的聚丙烯醯胺凝膠電泳圖(SDS-PAGE)。46kDa為蛋白質的分子量。箭頭所指為分離出的蛋白條帶。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1人腫瘤抑制因子46的克隆用異硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取人胎腦總RNA。用Quik mRNA Isolation Kit(Qiegene公司產品)從總RNA中分離poly(A)mRNA。2ug poly(A)mRNA經逆轉錄形成cDNA。用Smart cDNA克隆試劑盒(購自Clontech)將cDNA片段定向插入到pBSK(+)載體(Clontech公司產品)的多克隆位點上，轉化DH5α，細菌形成cDNA文庫。用Dyeterminate cycle reaction sequencing kit(Perkin-Elmer公司產品)和ABI 377自動測序儀(Perkin-Elmer公司)測定所有克隆的5′和3′末端的序列。將測定的cDNA序列與已有的公共DNA序列資料庫(Genebank)進行比較，結果發現其中一個克隆0340g09的cDNA序列為新的DNA。通過合成一系列引物對該克隆所含的插入cDNA片段進行雙向測定。結果表明，0340g09克隆所含的全長cDNA為1805bp(如2101所示)，從第120bp至1376bp有一個1177bp的開放閱讀框架(ORF)，編碼一個新的蛋白質(如2102所示)。我們將此克隆命名為pBS-0340g09，編碼的蛋白質命名為人腫瘤抑制因子46。
實施例2cDNA克隆的同源檢索將本發明的人腫瘤抑制因子46的序列及其編碼的蛋白序列，用Blast程序(Basiclocal Alignment search tool)[Altschul，SF et al.J.Mol.Biol.1990；215403-10]，在Genbank、Swissport等資料庫進行同源檢索。與本發明的人腫瘤抑制因子46同源性最高的基因是一種已知的人的腫瘤抑制因子p338ING1基因，其編碼的蛋白在Genbank的準入號為AC004537。蛋白質同源結果示於圖1，兩者高度同源，其相同性為99％；相似性為100％。
實施例3用RT-PCR方法克隆編碼人腫瘤抑制因子46的基因用胎腦細胞總RNA為模板，以oligo-dT為引物進行逆轉錄反應合成cDNA，用Qiagene的試劑盒純化後，用下列引物進行PCR擴增Primer15』-GGGAGTCGAGCGGGTGCTGCTAG-3』(2103)Primer25』-ACCATTTATATACAGTGTTACATA-3』(2104)Primer1為位於2101的5』端的第1bp開始的正向序列；Primer2為2101的中的3』端反向序列。
擴增反應的條件在50μl的反應體積中含有50mmol/L KCl，10mmol/LTris-Cl，(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，10pmol引物，1U的Taq DNA聚合酶(Clontech公司產品)。在PE9600型DNA熱循環儀(Perkin-Elmer公司)上按下列條件反應25個周期94℃ 30sec；55℃ 30sec；72℃ 2min。在RT-PCR時同時設β-actin為陽性對照和模板空白為陰性對照。擴增產物用QIAGEN公司的試劑盒純化，用TA克隆試劑盒連接到pCR載體上(Invitrogen公司產品)。DNA序列分析結果表明PCR產物的DNA序列與2101所示的1-1805bp完全相同。
實施例4Northern印跡法分析人腫瘤抑制因子46基因的表達用一步法提取總RNA[Anal.Biochem 1987，162，156-159]。該法包括酸性硫氰酸胍苯酚-氯仿抽提。即用4M異硫氰酸胍-25mM檸檬酸鈉，0.2M乙酸鈉(pH4.0)對組織進行勻漿，加入1倍體積的苯酚和1/5體積的氯仿-異戊醇(49∶1)，混合後離心。吸出水相層，加入異丙醇(0.8體積)並將混合物離心得到RNA沉澱。將得到的RNA沉澱用70％乙醇洗滌，乾燥並溶於水中。用20μg RNA，在含20mM 3-(N-嗎啉代)丙磺酸(pH7.0)-5mM乙酸鈉-1mM EDTA-2.2M甲醛的1.2％瓊脂糖凝膠上進行電泳。然後轉移至硝酸纖維素膜上。用α-32P dATP通過隨機引物法製備32P-標記的DNA探針。所用的DNA探針為圖1所示的PCR擴增的人腫瘤抑制因子46編碼區序列(120bp至1376bp)。將32P-標記的探針(約2×106cpm/ml)與轉移了RNA的硝酸纖維素膜在一溶液中於42℃雜交過夜，該溶液包含50％甲醯胺-25mM KH2PO4(pH7.4)-5×SSC-5×Denhardt’s溶液和200μg/ml鮭精DNA。雜交之後，將濾膜在1×SSC-0.1％SDS中於55℃洗30min。然後，用Phosphor Imager進行分析和定量。
實施例5重組人腫瘤抑制因子46的體外表達、分離和純化根據2101和圖1所示的編碼區序列，設計出一對特異性擴增引物，序列如下Primer35』-CCCGAGCTCATGTTGTACCTAGAAGACTATC-3』(2105)Primer45』-CCCCTCGAGTTATTTGTGTCTGCTGCCTCTT-3』(2106)此兩段引物的5』端分別含有NcoI和BamHI酶切位點，其後分別為目的基因5』端和3』端的編碼序列，NcoI和BamHI酶切位點相應於表達載體質粒pET-28b(+)(Novagen公司產品，Cat.No.69865.3)上的選擇性內切酶位點。以含有全長目的基因的pBS-0340g09質粒為模板，進行PCR反應。PCR反應條件為總體積50μl中含pBS-0340g09質粒10pg、引物Primer-3和Primer-4分別為10pmol、Advantage polymerase Mix(Clontech公司產品)1μl。循環參數94℃ 20s，60℃ 30s，68℃ 2min，共25個循環。用NcoI和BamHI分別對擴增產物和質粒pET-28(+)進行雙酶切，分別回收大片段，並用T4連接酶連接。連接產物轉化用氯化鈣法大腸杆細菌DH5α，在含卡那黴素(終濃度30μg/ml)的LB平板培養過夜後，用菌落PCR方法篩選陽性克隆，並進行測序。挑選序列正確的陽性克隆(pET-0340g09)用氯化鈣法將重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)plySs(Novagen公司產品)。在含卡那黴素(終濃度30μg/ml)的LB液體培養基中，宿主菌BL21(pET-0340g09)在37℃培養至對數生長期，加入IPTG至終濃度1mmol/L，繼續培養5小時。離心收集菌體，經超聲波破菌，離心收集上清，用能與6個組氨酸(6His-Tag)結合的親和層析柱His.Bind Quick Cartridge(Novagen公司產品)進行層析，得到了純化的目的蛋白人腫瘤抑制因子46。經SDS-PAGE電泳，在46kDa處得到一單一的條帶(圖2)。將該條帶轉移至PVDF膜上用Edams水解法進行N-端胺基酸序列分析，結果N-端15個胺基酸與2102所示的N-端15個胺基酸殘基完全相同。
實施例6 抗人腫瘤抑制因子46抗體的產生用多肽合成儀(PE公司產品)合成下述人腫瘤抑制因子46特異性的多肽NH2-Met-Leu-Tyr-Leu-Glu-Asp-Tyr-Leu-Glu-Met-Ile-Glu-Gln-Leu-Pro-OH。將該多肽分別與血藍蛋白和牛血清白蛋白耦合形成複合，方法參見Avrameas，et al.Immunochemistry，1969；643。用4mg上述血藍蛋白多肽複合物加上完全弗氏佐劑免疫家兔，15天後再用血藍蛋白多肽複合物加不完全弗氏佐劑加強免疫一次。採用經15μg/ml牛血清白蛋白多肽複合物包被的滴定板做ELISA測定兔血清中抗體的滴度。用蛋白A-Sepharose從抗體陽性的家兔血清中分離總IgG。將多肽結合於溴化氰活化的Sepharose4B柱上，用親和層析法從總IgG中分離抗多肽抗體。免疫沉澱法證明純化的抗體可特異性地與人腫瘤抑制因子46結合。
序列表110上海博德基因開發有限公司120一種新的多肽--人腫瘤抑制因子46和編碼這種多肽的多核苷酸1300340g091606170PatentIn version 3.121012111805212DNA213Homo sapiens220
221CDS222(120)..(1376)223
4001gggagtcgag cgggtgctgc tagcggaggc gccatattgg aggggacaaa actccggcga60cagcgagtga cacaaataaa cccctggacc ccctcgttcc ctcagctcta agggccgcg 119atg ttg tac cta gaa gac tat ctg gaa atg att gag cag ctt cct atg 167Met Leu Tyr Leu Glu Asp Tyr Leu Glu Met Ile Glu Gln Leu Pro Met1 5 10 15gat ctg cgg gac cgc ttc acg gaa atg cgc gag atg gac ctg cag gtg 215
Asp Leu Arg Asp Arg Phe Thr Glu Met Arg Glu Met Asp Leu Gln Val20 25 30cag aat gca atg gat caa cta gaa caa aga gtc agt gaa ttc ttt atg 263Gln Asn Ala Met Asp Gln Leu Glu Gln Arg Val Ser Glu Phe Phe Met35 40 45aat gca aag aaa aat aaa cct gag tgg agg gaa gag caa atg gca tcc 311Asn Ala Lys Lys Asn Lys Pro Glu Trp Arg Glu Glu Gln Met Ala Ser50 55 60atc aaa aaa gac tac tat aaa gct ttg gaa gat gca gat gag aag gtt 359Ile Lys Lys Asp Tyr Tyr Lys Ala Leu Glu Asp Ala Asp Glu Lys Val65 70 75 80cag ttg gca aac cag ata tat gac ttg gta gat cga cac ttg aga aag 407Gln Leu Ala Asn Gln Ile Tyr Asp Leu Val Asp Arg His Leu Arg Lys85 90 95ctg gat cag gaa ctg gct aag ttt aaa atg gag ctg gaa gct gat aat 455Leu Asp Gln Glu Leu Ala Lys Phe Lys Met Glu Leu Glu Ala Asp Asn100 105 110gct gga att aca gaa ata tta gag agg cga tct ttg gaa tta gac act 503Ala Gly Ile Thr Glu Ile Leu Glu Arg Arg Ser Leu Glu Leu Asp Thr115 120 125cct tca cag cca gtg aac aat cac cat gct cat tca cat act cca gtg 551Pro Ser Gln Pro Val Asn Asn His His Ala His Ser His Thr Pro Val130 135 140gaa aaa agg aaa tat aat cca act tct cac cat acg aca aca gat cat 599
Glu Lys Arg Lys Tyr Asn Pro Thr Ser His His Thr Thr Thr Asp His145 150 155 160att cct gaa aag aaa ttt aaa tct gaa gct ctt cta tcc acc ctt acg 647Ile Pro Glu Lys Lys Phe Lys Ser Glu Ala Leu Leu Ser Thr Leu Thr165 170 175tca gat gcc tct aag gaa aat aca cta ggt tgt cga aat aat aat tcc 695Ser Asp Ala Ser Lys Glu Asn Thr Leu Gly Cys Arg Asn Asn Asn Ser180 185 190aca gcc tct tct aac aat gcc tac aat gtg aat tcc tcc caa cct ctg 743Thr Ala Ser Ser Asn Asn Ala Tyr Asn Val Asn Ser Ser Gln Pro Leu195 200 205gga tcc tat aac att ggc tcg tta tct tca gga act ggt gca ggg gca 791Gly Ser Tyr Asn Ile Gly Ser Leu Ser Ser Gly Thr Gly Ala Gly Ala210 215 220att acc atg gca gct gct caa gca gtt cag gct aca gct cag atg aag 839Ile Thr Met Ala Ala Ala Gln Ala Val Gln Ala Thr Ala Gln Met Lys225 230 235 240gag gga cga aga aca tca agt tta aaa gcc agt tat gaa gca ttt aag 887Glu Gly Arg Arg Thr Ser Ser Leu Lys Ala Ser Tyr Glu Ala Phe Lys245 250 255aat aat gac ttt cag ttg gga aaa gaa ttt tca atg gcc agg gaa aca 935Asn Asn Asp Phe Gln Leu Gly Lys Glu Phe Ser Met Ala Arg Glu Thr260 265 270gtt ggc cat tca tca tct tcg gca ctt atg aca aca tta aca cag aat 983
Val Gly His Ser Ser Ser Ser Ala Leu Met Thr Thr Leu Thr Gln Asn275 280 285gcc agt tca tca gca gcc gac tca cgg agt ggt cga aag agc aaa aac 1031Ala Ser Ser Ser Ala Ala Asp Ser Arg Ser Gly Arg Lys Ser Lys Asn290 295 300aac aac aag tct tca agc cag cag tca tca tct tcc tcc tcc tct tct 1079Asn Asn Lys Ser Ser Ser Gln Gln Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser305 310 315 320tcc tta tca tcg tgt tct tca tca tca act gtt gta caa gaa atc tct 1127Ser Leu Ser Ser Cys Ser Ser Ser Ser Thr Val Val Gln Glu Ile Ser325 330 335caa caa aca act gta gtg cca gaa tct gat tca aat agt cag gtt gat 1175Gln Gln Thr Thr Val Val Pro Glu Ser Asp Ser Asn Ser Gln Val Asp340 345 350tgg act tac gac cca aat gaa cct cga tac tgc att tgt aat cag gta 1223Trp Thr Tyr Asp Pro Asn Glu Pro Arg Tyr Cys Ile Cys Asn Gln Val355 360 365tct tat ggt gag atg gtg gga tgt gat aac cga gat tgc cct ata gaa 1271Ser Tyr Gly Glu Met Val Gly Cys Asp Asn Arg Asp Cys Pro Ile Glu370 375 380tgg ttc cat tat ggc tgc gtt gga ttg aca gag gca ccg aaa ggc aaa 1319Trp Phe His Tyr Gly Cys Val Gly Leu Thr Glu Ala Pro Lys Gly Lys385 390 395 400tgg tac tgt cca cag tgc act gct gca atg aag aga aga ggc agc aga 1367
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Thr Ala Ser Ser Asn Asn Ala Tyr Asn Val Asn Ser Ser Gln Pro Leu195 200 205Gly Ser Tyr Asn Ile Gly Ser Leu Ser Ser Gly Thr Gly Ala Gly Ala210 215 220Ile Thr Met Ala Ala Ala Gln Ala Val Gln Ala Thr Ala Gln Met Lys225 230 235 240Glu Gly Arg Arg Thr Ser Ser Leu Lys Ala Ser Tyr Glu Ala Phe Lys245 250 255Asn Asn Asp Phe Gln Leu Gly Lys Glu Phe Ser Met Ala Arg Glu Thr260 265 270Val Gly His Ser Ser Ser Ser Ala Leu Met Thr Thr Leu Thr Gln Asn275 280 285Ala Ser Ser Ser Ala Ala Asp Ser Arg Ser Gly Arg Lys Ser Lys Asn290 295 300Asn Asn Lys Ser Ser Ser Gln Gln Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser305 310 315 320Ser Leu Ser Ser Cys Ser Ser Ser Ser Thr Val Val Gln Glu Ile Ser325 330 335Gln Gln Thr Thr Val Val Pro Glu Ser Asp Ser Asn Ser Gln Val Asp340 345 350Trp Thr Tyr Asp Pro Asn Glu Pro Arg Tyr Cys Ile Cys Asn Gln Val355 360 365
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1.一種分離的多肽-人腫瘤抑制因子46，其特徵在於它包含有2102所示的胺基酸序列的多肽、或其多肽的活性片段、類似物或衍生物。
2.如權利要求1所述的多肽，其特徵在於所述多肽、類似物或衍生物的胺基酸序列具有與2102所示的胺基酸序列至少95％的相同性。
3.如權利要求2所述的多肽，其特徵在於它包含具有2102所示的胺基酸序列的多肽。
4.一種分離的多核苷酸，其特徵在於所述多核苷酸包含選自下組中的一種(a)編碼具有2102所示胺基酸序列的多肽或其片段、類似物、衍生物的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸；或(c)與(a)或(b)有至少99％相同性的多核苷酸。
5.如權利要求4所述的多核苷酸，其特徵在於所述多核苷酸包含編碼具有2102所示胺基酸序列的多核苷酸。
6.如權利要求4所述的多核苷酸，其特徵在於所述多核苷酸的序列包含有2101中120-1376位的序列或2101中1-1805位的序列。
7.一種含有外源多核苷酸的重組載體，其特徵在於它是由權利要求4-6中的任一權利要求所述多核苷酸與質粒、病毒或運載體表達載體構建而成的重組載體。
8.一種含有外源多核苷酸的遺傳工程化宿主細胞，其特徵在於它是選自於下列一種宿主細胞(a)用權利要求7所述的重組載體轉化或轉導的宿主細胞；或(b)用權利要求4-6中的任一權利要求所述多核苷酸轉化或轉導的宿主細胞。
9.一種具有人腫瘤抑制因子46活性的多肽的製備方法，其特徵在於所述方法包括(a)在表達人腫瘤抑制因子46條件下，培養權利要求8所述的工程化宿主細胞；(b)從培養物中分離出具有人腫瘤抑制因子46活性的多肽。
10.一種能與多肽結合的抗體，其特徵在於所述抗體是能與人腫瘤抑制因子46特異性結合的抗體。
11.一類模擬或調節多肽活性或表達的化合物，其特徵在於它們是模擬、促進、拮抗或抑制人腫瘤抑制因子46的活性的化合物。
12.如權利要求11所述的化合物，其特徵在於它是2101所示的多核苷酸序列或其片段的反義序列。
13.一種權利要求11所述化合物的應用，其特徵在於所述化合物用於調節人腫瘤抑制因子46在體內、體外活性的方法。
14.一種檢測與權利要求1-3中的任一權利要求所述多肽相關的疾病或疾病易感性的方法，其特徵在於其包括檢測所述多肽的表達量，或者檢測所述多肽的活性，或者檢測多核苷酸中引起所述多肽表達量或活性異常的核苷酸變異。
15.如權利要求1-3中的任一權利要求所述多肽的應用，其特徵在於它應用於篩選人腫瘤抑制因子46的模擬物、激動劑，拮抗劑或抑制劑；或者用於肽指紋圖譜鑑定。
16.如權利要求4-6中的任一權利要求所述的核酸分子的應用，其特徵在於它作為引物用於核酸擴增反應，或者作為探針用於雜交反應，或者用於製造基因晶片或微陣列。
17.如權利要求1-6及11中的任一權利要求所述的多肽、多核苷酸或化合物的應用，其特徵在於用所述多肽、多核苷酸或其模擬物、激動劑、拮抗劑或抑制劑以安全有效劑量與藥學上可接受的載體組成作為診斷或治療與人腫瘤抑制因子46異常相關的疾病的藥物組合物。
18.權利要求1-6及11中的任一權利要求所述的多肽、多核苷酸或化合物的應用，其特徵在於用所述多肽、多核苷酸或化合物製備用於治療惡性腫瘤，血液病，HIV感染和免疫性疾病和各類炎症的藥物。
全文摘要
本發明公開了一種新的多肽——人腫瘤抑制因子46，編碼此多肽的多核苷酸和經DNA重組技術產生這種多肽的方法。本發明還公開了此多肽用於治療多種疾病的方法，如惡性腫瘤，血液病，HIV感染和免疫性疾病和各類炎症等。本發明還公開了抗此多肽的拮抗劑及其治療作用。本發明還公開了編碼這種新的人腫瘤抑制因子46的多核苷酸的用途。
文檔編號C07K14/47GK1493584SQ0211230
公開日2004年5月5日 申請日期2002年6月28日 優先權日2002年6月28日
發明者毛裕民, 謝毅 申請人:上海博德基因開發有限公司