一種鏈黴素藥物快速檢測試劑盒及其應用的製作方法

2023-04-26 11:29:31

專利名稱：：一種鏈黴素藥物快速檢測試劑盒及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種檢測分析動物源性食品中獸藥殘留的技術，特別是快速檢測鏈黴素藥物的酶聯免疫試劑及方法。
背景技術：
：鏈黴素(Streptomycin)是氨基糖苷類抗生素的一種，對革蘭氏陰性菌和部分革蘭氏陽性菌特別是結核分枝桿菌具有顯著的抗菌活性。鏈黴素主要作用於細胞的核糖體，通過抑制細菌蛋白質的生物合成而呈現殺菌作用。正是由於其獨特的抗菌活性，所以自1943年首次在灰色鏈球菌屬中發現鏈黴素以來，它被廣泛應用於多種疾病的治療和動物飼料添加劑，並在人、畜傳染病的防治方面發揮了巨大作用。同時，鏈黴素對人又有一定的、有時甚至是嚴重的毒副作用。鏈黴素引起的主要毒副作用是耳毒性。因其能選擇性地損害第8對腦神經，導致前庭功能損害和耳蝸神經損害，嚴重時可造成永久性的耳聾。長期使用還會使細菌產生耐藥性,因此我國制定了食品中鏈黴素最高殘留限量,其中,牛奶中的鏈黴素殘留限量為200pg/L。鏈黴素目前一般採用HPLC或LC/MS，但這類方法樣本前處理及測定操作煩瑣，檢測所需時間較長，檢測費用高，推廣使用受到限制
發明內容本發明的檢測原理當包被原為鏈黴素偶聯抗原時是將鏈黴素與卵清白蛋白偶聯物(Strep-OVA)吸附於固相載體上，加入樣本或鏈黴素標準品，然後加鏈黴素特異性抗體，待測樣品中殘留的鏈黴素和酶標板上包被的鏈黴素抗原競爭鏈黴素特異性抗體。再加入酶標記抗抗體進行酶活性的放大作用，顯色後終止，測定樣品的吸光度值，該值與樣品中鏈黴素殘留量呈負相關，與標準曲線比較即可得出鏈黴素的濃度。包被原為抗抗體時是將抗抗體吸附於固相載體上，加入鏈黴素特異性抗體，再加入鏈黴素酶標記抗原和樣本或鏈黴素標準品溶液，待測樣本中殘留的鏈黴素和酶標記鏈黴素抗原競爭鏈黴素特異性抗體，顯色後終止，測定樣品的吸光度值，該值與樣品中鏈黴素殘留量呈負相關，與標準曲線比較即可得出鏈黴素的濃度，與標準溶液顏色比較則可判斷樣品中鏈黴素的濃度範圍。本發明提供了一種檢測動物源性食品中鏈黴素的酶聯免疫試劑盒，它含有(1)包被鏈黴素抗原的酶聯板或包被抗抗體的酶聯板；(2)酶標記物；(3)鏈黴素特異性抗體；(4)鏈黴素標準品溶液；(5)底物顯色液；(6)終止液；(7)濃縮洗滌液；(8)濃縮復溶液。本發明所述試劑盒中鏈黴素包被抗原是採用碳二亞胺法將鏈黴素半抗原與卵清白蛋白(OVA)進行偶聯得到的，抗抗體可為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體，羊抗鼠抗抗體是以鼠源抗體為免疫原對無病原體山羊進行免疫得到，羊抗兔抗抗體是以兔源抗體為免疫原對無病原體山羊進行免疫得到。製備酶聯板過程中所用的包被緩衝液為批pH值9.6、0.05mol/L的碳酸鹽緩衝液；包被鏈黴素抗原或抗抗體的載體物質可為聚苯乙烯、纖維素、聚丙烯醯胺、聚乙烯、聚丙烯、交聯葡聚糖、玻璃、矽橡膠、瓊脂糖凝膠等；載體的形式可以是試管、微量反應板凹孔、小珠、小圓片等；所用的洗滌液為含有0.1%-0.5%吐溫80，0.5%疊氮化鈉(NaN3)防腐劑的磷酸鹽緩衝液；所用的封閉液是含有8%-15%的脫脂奶和1%惰性蛋白的溶液。本發明所述試劑盒中包被鏈黴素抗原的酶聯板或包被抗鏈黴素抗體的酶聯板的製備步驟為(1)用包被緩衝液將鏈黴素半抗原與卵清白蛋白(OVA)偶聯物或抗抗體以0.02-0.08pg/ml濃度稀釋成抗原稀釋液或抗抗體稀釋液；(2)向酶聯板的每孔中加入10(^1已經稀釋好的抗原稀釋液或抗抗體稀釋液，37"C溫育2h，傾去包被液，用洗滌液洗滌4次，每次15-30s，拍幹；(3)向酶聯板的每孔中加入150-20(^1封閉液，37°(3溫育l-2h，傾去孔內液體，乾燥後用鋁膜真空密封保存。以上方法製備的酶聯板具有很好的穩定性，經過冷熱穩定性試驗，酶聯板的相關技術參數均在正常範圍，且包被原有良好的特異性。本發明所述試劑盒中酶標記物為酶標記抗抗體或酶標記鏈黴素抗原，所用酶可為過氧化物酶或半乳糖甘酶，本發明優選過氧化物酶;酶標記物形式可為凍乾粉、濃縮液和工作液；酶標記物工作液所用的稀釋液為含有50%甘油(可防止放入-20°<106個/只，7天後採集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進行腹水純化，小瓶分裝，2(TC保存。3.鏈黴素兔多克隆抗體的製備釆用紐西蘭大白兔作為免疫動物，以鏈黴素半抗原與鑰孔槭血藍蛋白偶聯物為免疫原，免疫劑量為3mg/kg，首免時將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合製成乳化劑，頸背部皮下多點注射，間隔3周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫一次，共免疫5次，最後一次不加佐劑。最後一次免疫7天後採血，測定血清抗體效價，心臟採血，經硫酸銨分級沉澱得到純化的多克隆抗體。4.酶標板的製備用包被緩衝液將羊抗兔抗抗體稀釋成0.06|ig/ml，每孔加入100nl，37'C溫育2h，傾去包被液，用洗滌液洗滌4次，每次lmin，拍幹，然後在每孔中加入150pl封閉液，37'C溫育lh，傾去孔內液體，乾燥後用鋁膜真空密封保存。實施例2檢測鏈黴素的酶聯免疫試劑盒的組建組建檢測鏈黴素的酶聯免疫試劑盒，見圖l，使其包含下述組分(1)包被鏈黴素抗原的酶聯板；(2)用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗抗體；(3)鏈黴素鼠單克隆抗體；(4)鏈黴素標準品溶液6瓶，濃度分別為0ng/L、0.1ng/L、0.4pg/L、1.6^g/L、6都g/L、25.6pg/L;(5)底物顯色液A液為過氧化氫，底物顯色液B液為鄰苯二胺；(6)終止液為2mol/L的硫酸緩衝液；(7)濃縮洗滌液為pH7.4，含有0.1%-0.5%吐溫80，0.5%疊氮化鈉的磷酸鹽緩衝液；(8)抗體稀釋液為pH值8.2、0.05mol/L、含有3%小牛血清和596。N,N'-二甲基甲醯胺(DMF)的磷酸鹽緩衝液；(9)濃縮復溶液為含有50%甲醇、"/。小牛血清(BSA)的磷酸鹽緩衝液。實施例3檢測鏈黴素的酶聯免疫試劑盒的的組建組建檢測鏈黴素的酶聯免疫試劑盒，見圖1，使其包含下述組分(1)包被羊抗兔抗抗體的酶聯板；(2)用鹼性磷酸酯酶標記的鏈黴素抗原；(3)鏈黴素兔多克隆抗體；(4)鏈黴素標準品溶液6瓶，濃度分別為0pg/L、0.1pg/L、0.4pg/L、1.6pg/L、6勿g/L、25.6jug/L;(5)底物顯色液對硝基磷酸鹽緩衝液；(6)終止液為2mol/L的氫氧化鈉緩衝液；(7)濃縮洗滌液為PH7.4，含有0.8%吐糹顯20和0.P/。疊氮化鈉(NaN3)防腐劑的磷酸鹽緩衝液；(8)濃縮復溶液為含有50%甲醇、P/。小牛血清(BSA)的磷酸鹽緩衝液。實施例4樣品中鏈黴素殘留的檢測1.樣品前處理取2士0.05g去除脂肪的粉碎雞肉與8ml0.05MPB緩衝液混合5min，置56"C水浴環境放置30min;室溫4000r/min以上，離心10min;取50nl上清液，加入450^1稀釋後的復溶液混勻；取50pl用於分析。2.用試劑盒檢測向鏈黴素偶聯抗原包被的96孔酶標板微孔中加系列標準品或樣本溶液(各2孔)50pl，然後加鏈黴素酶標記物50W，再加入鏈黴素抗體工作液50W，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜封板，37。C恆溫箱中反應40min。倒出孔中液體，每孔加入250^1稀釋好的洗滌液，10秒後倒出孔中液體，如此重複操作共洗板5次，用吸水紙拍幹。加入底物顯色液A液過氧化氫5(^1，再加B液鄰苯二胺50nl，輕輕振蕩混勻，37'C恆溫箱避光顯色20min。每孔加入終止液2mol/L硫酸50|til，輕輕振蕩混勻，用酶標儀測定每孔吸光度^:。3.檢測結果分析用所獲得的每個濃度的標準溶液的吸光度平均值(B)，除以第一個標準溶液(O標準)的吸光度值(Bo)，再乘以100%，得到百分吸光度值。以鏈黴素濃度的半對數為x軸，百分吸光度值為Y軸，繪製標準曲線圖，見圖2。用同樣的辦法計算樣品溶液的百分吸光度值，將樣品溶液的百分吸光度值代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣品溶液中鏈黴素所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣品溶液中鏈黴素的實際濃度。實施例5樣品中鏈黴素殘留的檢測1.樣品前處理稱量2士0.05g蜂蜜加入4ml0.04M磷酸，振蕩10min至完全溶解，加入450^11MNaOH將PH值調至7-9之間，室溫3000r/min以上，離心5min，直至清亮。取50nl上清液，加入45(Hil稀釋後的復溶液混勻；取50pl用於分析。2.用試劑盒檢測向羊抗兔抗抗體包被的96孔酶標板微孔中加入鏈黴素兔多克隆抗體工作液10(^1，用蓋板膜封板，20-25"C恆溫箱中反應60min，倒出孔中液體，每孔加入25(Hil濃縮洗滌液，30秒後倒出孔中液體，如此重複操作共洗板5次，用吸水紙拍幹。每孔加入細菌提取鹼性磷酸酯酶標記的鏈黴素抗原50pl，再加入系列標準品或樣本溶液5(^1，用蓋板膜封板，20-25"恆溫箱中反應30min，重複洗滌過程。加入對硝基磷酸鹽緩衝液IOOW，輕輕振蕩混勻，20-25T:恆溫箱避光顯色30min。每孔加入終止液2mol/L氫氧化鈉溶液50|til，輕輕振蕩混勻，用酶標儀測定每孔吸光度值。3.檢測結果分析用所獲得的每個濃度的標準溶液的吸光度平均值(B)除以第一個標準溶液(O標準)的吸光度值(Bo)再乘以100%，得到百分吸光度值。以鏈黴素濃度Oig/L)的半對數為x軸，百分吸光度值為Y軸，繪製標準曲線圖，見圖2。用同樣的辦法計算樣品溶液的百分吸光度值，將樣品溶液的百分吸光度值代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣品溶液所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣品溶液中鏈黴素實際濃度。實驗例1標準品精密度試驗從每批按照實施例1(4)中的方法製備的酶聯板中，各抽出10個微孔，測定1.6pg/L。標準溶液的吸光度值(OD值)，重複3次，計算變異係數cvy。，結果見表l。表1標準可重複性試驗(CVn/(0批號1234567891001批5.66.79.25.97.99.97.68.95.97.1cv%03批4.66.56.37.510.310.96.34.97.68.2CV%06批3.94.98.66.110.611.010.88.09.610.0CV%結果表明變異係數範圍在3.9%-11.0%之間，符合了變異係數小於20%的規定，說明本試劑盒標準品精密度達到了標準。實驗例2樣本可重複性試驗以0.5pg/L，濃度的鏈黴素對雞肉、雞肝和蜂蜜，添加到樣品中，分別取三:個不同批次的試劑盒各五個，每個濃度重複5次，分別計算變異係數，結果見表2、表3。表2雞肉、雞肝樣品可重複性試驗批號實測值pg/nl變異係數CV%0.430.500.430.460.4111.2010.390.360.460.400.4210.90.380.420.430.430.4411.60.360.420.500.410.399.8030.390.410.410.500.460.370.460.380.380.3911.010.20.450.490.460.460.3611.0060.470.460.320.380.410.410.390.370.460.4512.311.9表3蜂蜜樣品可重複實驗批號實測值Hg/pl變異係數cv%0.410.460.390.430.4212.3tableseeoriginaldocumentpage24結果表明雞肉、雞肝樣本變異係數均低於20%，蜂蜜樣本的變異係數均低於20%，符合了變異係數小於25%的規定，說明本試劑盒測定樣本的精密度達到了標準。實驗例3試劑盒的準確度試驗取兩個濃度的鏈黴素標準品溶液，分別為0.5pg/kg(L;)和2pg/kg(L)，分別對樣品進行添加回收試驗，每個濃度做4個平行，分別計算回收率。表4試劑盒的準確度tableseeoriginaldocumentpage24結果表明雞肉、雞肝添加的回收率在83%-88.3%之間，蜂蜜添加回收率在82.5%-92.3%之間。實驗例4試劑盒保存條件為2-8°C，經過6個月的測定，試劑盒的最大吸光度值(零標準)、50%抑制濃度、鏈黴素添加實際測定值均在芷常範圍之內。考慮在運輸和使用過程中，會有非正常保存條件出現，將試劑盒在37"C保存的條件下放置6天，進行加速老化實驗，結果表明該試劑盒各項指標完全符合要求。考慮到試劑盒冷凍情況發生，將試劑盒放入-2(TC冰箱冷凍5天，測定結果也表明試劑盒各項指標完全正常。從以上結果可得出試劑盒在2-8"可以保存6個月以上。權利要求1.一種檢測動物源性食品中鏈黴素的酶聯免疫試劑盒，它含有(1)包被鏈黴素抗原的酶聯板或包被抗抗體的酶聯板；(2)酶標記物；(3)鏈黴素特異性抗體；(4)鏈黴素標準品溶液；(5)底物顯色液；(6)終止液；(7)濃縮洗滌液；(8)濃縮復溶液；其特徵是鏈黴素包被抗原採用碳二亞胺法將鏈黴素半抗原與卵清白蛋白進行偶聯得到，抗抗體為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體，羊抗鼠抗抗體是以鼠源抗體為免疫原對無病原體山羊進行免疫得到，羊抗兔抗抗體是以兔源抗體為免疫原對無病原體山羊進行免疫得到，特異性抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。2.如權利要求l所述的檢測動物源性食品中鏈黴素的酶聯免疫試劑盒，其特徵是試劑盒中酶標記物為酶標記抗抗體或酶標記鏈黴素抗原，所用酶為過氧化物酶或半乳糖甘酶，酶標記物形式為凍乾粉、濃縮液或工作液。3.如權利要求2所述的檢測動物源性食品中鏈黴素的酶聯免疫試劑盒，其中所用酶為過氧化物酶。4.如權利要求2或3所述的檢測動物源性食品中鏈黴素的酶聯免疫試劑盒，其特徵是試劑盒中酶標記抗原是採用活性酯法將標記酶與鏈黴素半抗原進行偶聯得到，鏈黴素特異性抗體為鼠源單克隆抗體或兔源多克隆抗體，免疫原是採用碳二亞胺法將鏈黴素半抗原與鑰孔槭血藍蛋白進行偶聯得到的；抗體形式為凍乾粉、濃縮液或工作液。5.如權利要求4所述的檢測動物源性食品中鏈黴素的酶聯免疫試劑盒，其特徵是包被鏈黴素抗原或抗抗體的載體物質為聚苯乙烯、纖維素、聚丙烯醯胺、聚乙烯、聚丙烯、交聯葡聚糖、玻璃、矽橡膠或瓊脂糖凝膠，載體的形式是試管、微量反應板凹孔、小珠或小圓片，洗滌液為含有0.1%-0.5°/。w/v吐溫80，0.5%\￥疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩衝液，封閉液是含有8%-15%w/v的脫脂奶和P/。w/v惰性蛋白的溶液。6.如權利要求1-3和5任一項所述的檢測動物源性食品中鏈黴素的酶聯免疫試劑盒，其特徵是試劑盒中鏈黴素標準品溶液為六個濃度梯度的鏈黴素溶液，濃度為(Hig/L、0.1昭/L、0.4ng/L、1.6pg/L、6.4ng/L、25.6ng/L。7.如權利要求4所述的檢測動物源性食品中鏈黴素的酶聯免疫試劑盒，其特徵是試劑盒中鏈黴素標準品溶液為六個濃度梯度的鏈黴素溶液，濃度為0ng/L、0.1pg/L、0.4pg/L、1.6)ng/L、6.4^g/L、8.據權利要求1所述的鏈黴素酶聯免疫檢測試劑盒，其特徵在於，所述底物顯色液為單底物液。9.一種檢測動物源性食品中鏈黴素的方法，包括了以下步驟(1)樣品前處理；(2)用權利要求1-8任一所述的試劑盒進行檢測；(3)分析檢測結果。全文摘要本發明提供了一種檢測鏈黴素的酶聯免疫試劑盒，它含有包被有包被原的酶聯板；酶標記物；鏈黴素特異性抗體；鏈黴素標準品溶液；底物顯色液；終止液；濃縮洗滌液；濃縮復溶液。本發明還提供了一種檢測動物源性食品中鏈黴素的方法，包括了以下步驟樣品前處理；用試劑盒的試劑進行檢測；分析檢測結果。本發明的目的是提供一種操作簡便、費用低廉、適用於大量樣本篩查的檢測動物源性食品鏈黴素的酶聯免疫試劑盒及檢測方法。文檔編號G01N33/577GK101526536SQ20091004516公開日2009年9月9日申請日期2009年1月12日優先權日2009年1月12日發明者青吳,俊唐,成李,宏楊,楊宗繁,溫俊梅,聶繼斌,欣齊申請人:深圳市綠詩源生物技術有限公司