包含輔助t細胞和細胞毒性t淋巴細胞(ctl)表位的新免疫原性脂肽的製作方法

2023-04-27 00:52:21

專利名稱：包含輔助t細胞和細胞毒性t淋巴細胞(ctl)表位的新免疫原性脂肽的製作方法
技術領域：
本發明一般地涉及免疫學領域，更特別地涉及用於產生針對肽免疫原的細胞應答的試劑，以及使用所述試劑增強個體的免疫應答或使用所述試劑接種個體的方法。更特別地，本發明涉及具有增強的免疫原性、特別是增強的激活針對CD8+T細胞表位的T細胞應答以誘導抗一種入侵病原或腫瘤細胞的細胞介導免疫的活性的新脂肽。本發明還提供了包含例如與藥物學可接受載體或賦形劑組合的所述脂肽的配製品和疫苗組合物，以及用於製備和使用本發明的配製品和疫苗組合物的方法。
背景技術：
1.概要本說明書含有用Patentln Version 3.1製作的胺基酸序列信息，見所附序列表。序列表中的每一序列用數字210後接序列標識符表示(例如2101，2102，等)。每一序列的長度和來源生物體分別在數字範圍211和213內指示。本說明書中指示的序列用術語″SEQID NO″加上後接的序列標識符定義(例如，SEQ ID NO1表示標為4001的序列)。
本文所用術語「來自」、「衍生自」是指一特定的整體(integer)可以得自一特定來源，但不是必需直接得自該來源。
在本說明書中，除非上下文有其它含義，術語「包含」、「包括」(″comprise″，″comprises″或″comprising″)應被理解為包括所述的步驟、元件或整體或者步驟、元件或整體組，但不排除任何其它步驟或元件或整體或者元件或整體組。
本領域技術人員能夠理解本文描述的本發明可以進行各種變化和修飾從而與所特異描述的有所不同。應理解的是本發明包括本說明書中單獨或集中指出或指明的所有步驟、特徵、組合物和化合物，以及任意兩個或多個所述步驟或特徵的任意組合和全部組合。
本發明的範圍不受本文描述的具體實施例的限制。很明顯，功能等價的產品、組合物和方法屬於本文描述的本發明範圍。
本申請所引用的全部參考文獻特別引入本文作參考。
除非另有說明，使用分子生物學、微生物學、病毒學、重組DNA技術、溶液肽合成、固相肽合成和免疫學的常規技術可以無需過多實驗而進行本發明。這種程序例如在引入本文作參考的下述教科書中有描述1.Sambrook，Fritsch Maniatis，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York，Second Edition(1989)，whole of Vols I，II，and III；2.DNA CloningA Practical Approach，Vols.I and II(D.N.Glover，ed.，1985)，IRL Press，Oxford，whole of text；3.Oligonucleotide SynthesisA Practical Approach(M.J.Gait，ed.，1984)IRL Press，Oxford，whole of text，and particularly thepapers therein by Gait，pp1-22；Atkinson et al.，pp35-81；Sproatet al.，pp 83-115；and Wu et al.，pp 135-151；4.Nucleic Acid HybridizationA Practical Approach(B.D.Hames S.J.Higgins，eds.，1985)IRL Press，Oxford，whole oftext；5.Animal Cell CulturePractical Approach，Third Edition(JohnR.W.Masters，ed.，2000)，ISBN 0199637970，whole of text；6.Immobilized Cells and EnzymesA Practical Approach(1986)IRL Press，Oxford，whole of text；7.Perbal，B.，A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；
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相關現有技術的描述免疫療法或接種對於各種疾病如某些傳染病或癌症的預防和治療是很有用的。但是這種治療的應用和成功部分由於靶CTL表位的免疫原性差而受到限制。代表T細胞免疫原的合成肽當被單獨輸送時僅引發弱免疫，因此在疫苗組合物中沒有效果。含有CTL表位的全長蛋白質不能有效進入MHC I類加工途徑。另外，CTL表位是HLA限制的，並且人群中高程度的HLA多態性意味著基於CTL的疫苗可能不能提供對人群中所有基因型的全面覆蓋。
已使用若干技術以增強個體對肽免疫原的免疫應答。
已知使用對肽免疫原而言是外來物質的佐劑配製品(即其在使用前與免疫原混合)，如完全Freund佐劑(CFA)，能增強個體對肽免疫原的免疫應答。但是，目前可應用的許多佐劑在人中應用毒性很大，或者無效。另外，這一類型的佐劑需要在即將給藥前與肽免疫原預先配製在一起，這種配製品通常溶解度低或者不穩定。
脂肽中一種已知作為佐劑的脂部分與肽免疫原共價偶聯，其可以增強在缺乏外來佐劑時弱免疫原性肽的免疫原性[Jung et al.，AngewChem，Int Ed Engl 10，872，(1985)；Martinon et al.，J Immunol 149，3416，(1992)；Toyokuni et al.，J Am Chem Soc 116，395，(1994)；Deprez，et al.，J Med Chem 38，459，(1995)；和Sauzet et al.，Vaccine13，1339，(1995)；BenMohamed et al.，Eur.J.Immunol.27，1242，(1997)；Wiesmuller et al.，Vaccine 7，29，(1989)；Nardin et al.，Vaccine16，590，(1998)；Benmohamed，et al.Vaccine 18，2843，(2000)；andObert，et al.，Vaccine 16，161，(1998)]。合適的脂肽顯示出沒有佐劑配製品相關的有害副作用，並且已觀察到針對脂肽的抗體和細胞應答。
已知有幾種不同脂肪酸可用作脂部分，舉例性的脂肪酸包括但不限於棕櫚醯、肉豆蔻醯、硬脂醯和癸醯基團，或者更一般地，任何C2至C30飽和、單不飽和或多不飽和脂肪醯基團均被認為是有用的。
脂胺基酸N-棕櫚醯-S-[2，3-雙(棕櫚醯氧基)丙基]半胱氨酸，也稱為Pam3Cys或Pam3Cys-OH(Wiesmuller et al.，Z.Physiol.Chem.364(1983)，p593)，是跨越革蘭氏陰性細菌的內膜和外膜的Braun’s脂蛋白的N-末端部分的合成版本。Pam3Cys具有式(I)的結構
Metzger等人的美國專利5,700,910(1997年12月23日授權)描述了用作製備脂肽的中間體的幾種N-醯基-S-(2-羥烷基)半胱氨酸，這些脂肽用作合成佐劑、B淋巴細胞刺激劑、巨噬細胞刺激劑或合成疫苗。Metzger等人還教導了使用這些化合物作為中間體合成Pam3Cys-OH(Wiesmuller et al.，Z.Physiol.Chem.364(1983)，p593)以及合成包含這一脂胺基酸或其類似物作為N-末端的脂肽。這些脂肽通過在合成過程中將脂胺基酸部分與肽部分偶聯而製備。
已經顯示當Pam3Cys與一CTL表位肽偶聯時可以刺激抗流感病毒感染的細胞的病毒特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應答(Deres etal.，Nature 342，561，1989)，並且當與合適的合成B細胞表位的N-末端偶聯時能引發抗口蹄疫的保護抗體(Wiesmuller et al.，Vaccine 7，29，1989；United States Patent No.6,024,964 to Jung et al.，February 15，2000)。
最近已合成了Pam3Cys的一種類似物，Pam2Cys(也稱為二棕櫚醯-S-甘油基半胱氨酸或S-[2，3-雙(棕櫚醯氧基)丙基]半胱氨酸)(Metzger，J.W.，A.G.Beck-Sickinger，M.Loleit，M.Eckert，W.G.Bessler，andG.Jung.1995.J Pept Sci 1184)，並且示出其相應於MALP-2的脂質部分，MALP-2是一種分離自支原體的巨噬細胞激活脂肽(Sacht，G.，A.Marten，U.Deiters，R.Sussmuth，G.Jung，E.Wingender，and P.F.Muhlradt.1998.Eur J Immunol 284207Muhlradt，P.F.，M.Kiess，H.Meyer，R.Sussmuth，and G.Jung.1998.Infect Immun 664804Muhlradt，P.F.，M.Kiess，H.Meyer，R.Sussmuth，and G.Jung.1997.J Exp Med 1851951)。Pam2Cys具有式(II)的結構 據報導Pam2Cys是一種比Pam3Cys更強力的脾細胞和巨噬細胞束激劑(Metzger et al.，J Pept.Sci 1，184，1995；Muhlradt et al.，J ExpMed 185，1951，1997；and Muhlradt et al.，Infect Immun 66，4804，1998).。
產生針對一特定CTL表位的強CD8+ T細胞應答需要產生強輔助T細胞應答。CD4+輔助T細胞通過分泌足夠的細胞因子例如IL-2由此促進CD8+T細胞的擴增而在細胞介導免疫(CMI)中發揮功能，或者通過與抗原呈遞細胞(APC)相互作用由此使其更易於激活CD8+T細胞而在細胞介導免疫(CMI)中發揮功能。因此，期望的是將CTL表位與至少一種輔助T細胞表位一起給予(Vitiello et al.，J.Clin.Invest.95，341-349，1995；Livingston et al.，J.Immunol.159，1383-1392，1997)。在APC表面存在MHC II類分子情況下，這些表位被輔助T細胞識別。
CTL表位或分離的表位可以與具有一系列輔助T細胞表位的大蛋白一起給予，以便適於個體群內II類分子的多樣性。或者含有混雜的或允許的(promiscuous or permissive)輔助T細胞表位的肽可以與一個或多個CTL表位一起給予。含有混雜的或允許的輔助T細胞表位的肽在絕大多數MHC II類單元型中存在，從而它們在大多數遠親人群中誘導強CD4+輔助T細胞應答。混雜的或允許的輔助T細胞的例子是破傷風類毒素肽、Plasmodium falciparum pfg27、乳酸脫氫酶和HIVgp120(Contreas et al.，Infect.Immun，66，3579-3590，1998；Gaudebout et al.，J.A.I.D.S.Human Retrovirol 14，91-101，1997；Kaumaya et al.，J.Mol.Recog.6，81-94，1993；and Fern and Good J.Immunol.148，907-913，1992)。Ghosh et al.，Immunol 104，58-66，2001和國際專利申請No.PCT/AU00/00070(WO 00/46390)也描述了來自犬瘟熱病毒(Canine Distemper Virus)的融合蛋白(CDV-F)的混雜的輔助T細胞表位。某些混雜輔助T細胞表位促進針對一特定CTL表位的強CTL應答，並且可以繞開某些單元型限制的免疫應答(Kaumaya et al.，J.Mol.Recog.6，81-94，1993)。
通常，疫苗製品包含一些多肽的混合物，這些多肽包含輔助T細胞表位和CTL表位，但是還已知其由同時包含輔助T細胞表位和CTL表位的一個單一多肽組成。
發明概述在完成本發明的工作中，本發明人努力改進生產高免疫原性脂肽的方法，所述脂肽具有一個脂質部分(lipid moeity)和一個多肽部分(polypeptide moeity)，該多肽部分包含可以引起免疫應答的輔助T細胞表位和CTL表位。本發明人發現一種包含輔助T細胞表位和CTL表位的高免疫原性脂肽可以如下產生，即合成一個包含所述表位的具有一個內部賴氨酸殘基或內部賴氨酸類似物殘基的單一多肽分子，然後將脂質部分與所述內部賴胺基酸殘基或所述內部賴氨酸類似物殘基的側鏈氨基基團偶聯，這與先前技術相反，先前技術是脂質附著於N-末端。本發明的脂肽可以使用一個單胺基酸鏈而方便地合成，從而不需要合成後修飾來摻入兩種表位。
通過在肽合成過程中將所述一或多個賴氨酸殘基或者一或多個賴氨酸類似物殘基以預定位置置於多肽內，脂質的附著位點能夠容易地確定。因此可以定向將脂質部分置於脂肽中，以增強終產物在疫苗或佐劑配製品中的實用性。
本發明人發現經位於輔助T細胞表位和CTL表位的胺基酸序列之間的內部賴氨酸殘基的側鏈ε氨基基團或內部賴氨酸類似物殘基的末端側鏈基團附著脂質部分，當與脂質附著於肽的N-末端而獲得的線性結構相比時，能夠增強的樹突細胞成熟。
本發明脂肽所提供的一個優點是它們有足夠的免疫原性，從而通常不需要在包含這些脂肽的疫苗配製品中包括外來佐劑。
本發明當然也包括經存在於輔助T細胞表位的胺基酸序列或CTL表位的胺基酸序列中的內部賴氨酸殘基的ε氨基基團或者內部賴氨酸類似物殘基的末端側鏈基團附著脂質部分，唯一的要求是脂質部分不附著於肽的N-末端或C-末端。「內部」是指在包含輔助T細胞表位和CTL表位的多肽的除N-末端或C-末端之外的一個位置。本領域技術人員能夠理解含CTL表位的疫苗的溶解性對於商業規模生產疫苗配製品是非常希望的。
優選地，脂質部分經位於輔助T細胞表位和CTL表位的胺基酸序列之間的賴氨酸殘基的ε氨基基團或賴氨酸類似物殘基的末端側鏈基團而附著。
任選地，在輔助T細胞表位和CTL表位之間加入一或多個胺基酸間隔物(spacer)，例如在位於所述表位之間的內部賴氨酸或賴氨酸類似物的任一側加入。
在脂質部分和多肽部分之間也可以加入任何常規類型的間隔物。在此方面特別優選的間隔物有絲氨酸二聚體、三聚體、四聚體等。其它的間隔物如精氨酸二聚體、三聚體、四聚體或6-氨基己酸也可以應用。
如本文所示，本發明人通過將脂質部分偶聯至合成肽部分中的一內部賴氨酸殘基的暴露的ε氨基基團而產生了本發明的脂肽。任選地，在加入脂質部分之前可以將一間隔物加至暴露的ε氨基基團。
如本文所述，式(III)或(IV)的脂胺基酸可以直接加至內部賴氨酸殘基的ε氨基基團或加至內部賴氨酸類似物殘基的末端側鏈基團。選自如下一組的脂胺基酸也是有用的，所述的組由(i)Pam2Cys(也稱為二棕櫚醯-S-甘油基半胱氨酸或S-[2，3-雙(棕櫚醯氧基)丙基]半胱氨酸)，(ii)Ste2Cys(也稱為二硬脂醯-S-甘油基半胱氨酸或S-[2，3-雙(硬脂醯氧基)丙基]半胱氨酸)，Lau2Cys(也稱為二月桂醯-S-甘油基半胱氨酸或S-[2，3-雙(月桂醯氧基)丙基]半胱氨酸)，和Oct2Cys(也稱為二辛醯-S-甘油基半胱氨酸或S-[2，3-雙(辛醯氧基)丙基]半胱氨酸)組成。
如本文所述，針對流感病毒的本發明的脂肽在不存在外來佐劑時也誘導病毒特異性CTL應答，這一點從它們誘導強CTL介導的病毒清除應答、誘導CD8+ T細胞遷移至肺以及正調節MHC II類分子在幼(immature)樹突細胞(DC)上的表面表達而反映出。與具有N-末端偶聯的脂質的脂肽相比，在給予本發明脂肽後樹突細胞的成熟增強這一點與增強的輔助T細胞表位呈遞一致。
本領域技術人員清楚，輔助T細胞和CTL表位的性質在本發明中不是關鍵的。將脂質部分偶聯至構建體的多肽部分內的一或多個賴氨酸殘基或賴氨酸類似物殘基的ε氨基基團的這一新途徑具有廣泛的應用。因此，基於本文的結果，應能理解各種輔助T細胞和C TL表位可以用於脂肽構建體。
附圖簡述

圖1是一示意圖，其顯示了用於本研究的肽和脂肽構建體的一般結構。肽結構由一個CD4+輔助T細胞表位[Th]和一個CTL細胞表位[CTL]組成，它們組裝成串連線性序列，具有一連接內部賴氨酸殘基(即[Th]-Lys-[CTL])或者不具有任何內部賴氨酸殘基(即[Th]-[CTL])。脂肽是分支結構，其中脂質部分通過在大約分子中心的位於兩個表位之間的一個賴氨酸殘基Lys的ε氨基基團而附著(即[Th]-Lys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL]；[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]或[Th]-Lys(Pam1Cys-Ser-Ser)-[CTL])。在分支構建體的情況中，附著脂質的位於中心的賴氨酸殘基用斜體Lys表示。在一些情況中，在肽和脂質部分之間加入2個絲氨酸殘基(Ser-Ser)。對於脂肽Pal2LysLys[Th]-[CTL]，兩個棕櫚酸殘基加到N-末端賴氨酸殘基的α和ε氨基基團上，[Th]附著於胺基酸序列中的倒數第2個賴氨酸的ε氨基基團上。在[Th]-Lys(Chol2Lys-Ser-Ser)-[CTL]中，兩個膽固醇殘基附著於N-末端賴氨酸殘基。
圖2示出附著於圖1所示結構的脂質部分的肽部分的一級胺基酸序列。包含這些胺基酸序列的未脂化肽如下所示(i)[Th]由來自流感病毒血凝素輕鏈的CD4+輔助T細胞表位組成，如SEQ ID NO1所示；(ii)[CTL]由流感病毒毒株A/Puerto Rico/8/34(PR8；H1N1)的核蛋白的第147-155位胺基酸殘基組成的免疫顯性H-2d-限制性CTL表位組成，如SEQ ID NO2所示；(iii)[Th]-[CTL]由具有(i)和(ii)的多肽組成，組裝的肽的序列如SEQ ID NO3所示；(iv)[Th]-Lys-[CTL]由具有由一個賴氨酸殘基(粗體下劃線殘基)分隔的(i)和(ii)的多肽組成，組裝的肽的序列如SEQ ID NO4所示；(v)[P25]-Lys-[SIINFEKL]由來自稱為P25的CDV-F蛋白的一個輔助T細胞表位(SEQ ID NO20)和來自卵清蛋白的一個CTL表位(SEQ ID NO173)組成，這兩個表位由一個賴氨酸殘基(粗體下劃線殘基)分隔，組裝的肽的序列如SEQ ID NO174所示；(vi)[P25]-Lys-[LLO91-99]由來自稱為P25的CDV-F蛋白的一個輔助T細胞表位(SEQ ID NO20)和來自Listeriamonocytogenes的一個CTL表位(SEQ ID NO172)組成，這兩個表位由一個賴氨酸殘基(粗體下劃線殘基)分隔，組裝的肽的序列如SEQ ID NO175所示；(vii)[P25]-Lys-[HCV]由來自稱為P25的CDV-F蛋白的一個輔助T細胞表位(SEQ ID NO20)和來自C型肝炎病毒核心蛋白的一個CTL表位(SEQ ID NO176)組成，，這兩個表位由一個賴氨酸殘基(粗體下劃線殘基)分隔，組裝的肽的序列如SEQ IDNO177所示。
包含這些胺基酸序列的脂肽如下指代(i)[Th]-Lys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL]由肽[Th]-Lys-[CTL](即SEQ ID NO4)和綴合於內部賴氨酸(粗體下劃線殘基)的ε氨基基團的式(III)的脂質組成；(ii)[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]由肽[Th]-Lys-[CTL](即SEQ ID NO4)和綴合於內部賴氨酸(粗體下劃線殘基)的ε氨基基團的式(IV)的脂質組成；(iii)[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[LLO91-99]由肽[P25]-Lys-[LLO91-99]和綴合於所述肽的內部賴氨酸(粗體下劃線殘基)的ε氨基基團的式(IV)的脂質組成；(iv)[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[SIINFEKL]由肽[P25]-Lys-[SIINFEKL]和綴合於所述肽的內部賴氨酸(粗體下劃線殘基)的ε氨基基團的式(IV)的脂質組成；(v)[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[HCV]由肽[P25]-Lys-[HCV]和綴合於所述肽的內部賴氨酸(粗體下劃線殘基)的ε氨基基團的式(IV)的脂質組成。
圖3示出用圖1所示脂肽引發並隨後用流感病毒攻擊的小鼠的降低的病毒負荷。小鼠用在50μl PBS中的9nmol脂肽[Th]-Lys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL]和[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]鼻內接種(第2列和第3列)，或者用50μl PBS中的[Th]-Lys-[CTL]肽(第1列)或僅用PBS(第4列)接種。肽和脂肽的代號見圖2。在接種後第9天，用甲氧氟烷麻醉小鼠，並用30000噬斑形成單位的稱為A/Memphis/1/71(Mem 71)的流感病毒亞型H3N1鼻內攻擊。5天之後，取出它們的肺，通過在MDCK細胞上的噬斑分析來分析感染性病毒的存在。每個條代表來自一組5個BALB/c小鼠的病毒效價的幾何平均效價，誤差杆代表平均值的標準差。條上的數字代表相對於PBS對照的肺病毒效價降低百分比。
圖4a示出在接受圖2所指示的脂肽的免疫小鼠中增強的脂肽誘導的病毒清除率。小鼠用在50μl PBS中的9nmole脂肽[Th]-Lys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL]和[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]接種(第2列和第3列)，或者用50μl PBS中的[Th]-Lys-[CTL]肽(第1列)或僅用PBS(第4列)接種。在接種後第28天，用30000噬斑形成單位的Mem 71病毒攻擊小鼠。肽和脂肽的代號見圖2。數據以攻擊後第5天肺病毒效價降低百分比表示。肽和脂肽的代號見圖2。數據以攻擊後第5天肺病毒效價降低百分比表示。數據顯示，在攻擊後5天，與肽(第1列)或PBS(第4列)相比，用脂肽[Th]-Lys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL](第2列)或[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL](第3列)免疫的小鼠的肺中有增加的感染性病毒降低。
圖4b示出在接受具有圖2代號的脂肽的免疫小鼠中增強的T細胞激活。小鼠用在50μl PBS中的9n mole脂肽[Th]-Lys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL]和[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]接種(第2列和第3列)，或者用50μl PBS中的[Th]-Lys-[CTL]肽(第1列)或僅用PBS(第4列)接種。接種後9天殺死接種的小鼠並進行支氣管肺泡灌洗術(BAL)。通過將BAL樣品在培養皿中於37℃保溫1小時除去粘附細胞。回收非粘附細胞並染色檢測CD8和CD4表達。用流式細胞計量術分析細胞。基於正散射和旁散射模式識別淋巴細胞群，並且分析了10000個淋巴細胞。數據以BAL液中是CD8+淋巴細胞的非粘附細胞百分比表示。數據顯示，在攻擊後5天，與肽(第1列)或PBS(第4列)相比，用脂肽[Th]-Lys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL](第2列)或[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL](第3列)接種的小鼠的BAL樣品中有增加的病毒特異性CD8+T細胞的激活。肽和脂肽的命名見圖2。
圖4c示出作為對如圖2命名的脂肽的應答，樹突細胞的成熟增加。將將一種BALB/c脾來源樹突細胞系(D1細胞)與0.45nmole/mL肽[Th]-Lys-[CTL](第1列)或脂肽[Th]-Lys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL](第2列)或[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL](第3列)或者與作為陰性對照的培養基(第4列)或作為陽性對照的脂多糖(LPS；第5列)保溫過夜。通過流式細胞計量術確定表達高水平MHC II類分子因而呈成熟狀態的D1細胞的百分比。肽和脂肽命名見圖2。數據顯示與暴露於肽和培養基相比，暴露於脂肽[Th]-Lys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL]或[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]後樹突細胞表面上的MHC II類分子的表達增強(即樹突細胞成熟增強)。
圖5示出在用x軸上指示的合成免疫原接種的小鼠中誘導的肺病毒清除應答，所述合成免疫原每個均包括SEQ ID NO1所示的CD4+輔助T細胞表位和SEQ ID NO2所示的H-2d-限制性CTL表位。各組的5隻小鼠用在PBS中的9nmole脂肽鼻內接種。在接種後28天用104.5PFU的Mem71流感病毒鼻內攻擊小鼠。通過在MDCK細胞單層上的噬斑形成確定在攻擊5天後取樣的肺勻漿液中感染性病毒的效價。每個圓圈代表一隻小鼠的病毒效價，線條代表一組的幾何平均效價。相對於PBS對照組的平均病毒效價降低百分比在每一列數據之上顯示。
圖6示出在病毒攻擊期間CTL決定簇特異性CD8+-T細胞加速流入脂肽接種的小鼠的肺中。脂肽包含SEQ ID NO1所示的CD4+輔助T細胞表位和SEQ ID NO2所示的H-2d-限制性CTL表位。各由3隻小鼠組成的各組鼻內用9n mole所示脂肽接種。在接種後第28天，將小鼠用104.5PFU的Mem71流感病毒進行鼻內攻擊。通過胞內細胞因子產生分析對在攻擊後第5天小鼠肺中的CTL決定簇特異性IFN-γ分泌細胞進行計數。每一樣品分析10,000個CD8+細胞。數據代表每組小鼠的平均值和標準差。
圖7示出在病毒攻擊後CTL決定簇特異性CD8-T細胞加速流入脂肽接種的小鼠的肺中。脂肽包含SEQ ID NO1所示的CD4+輔助T細胞表位和SEQ ID NO2所示的H-2d限制性CTL表位。小鼠用在PBS中的9n mole指示的肽鼻內接種。接種後9天，小鼠用104.5P FU的Mem71流感病毒進行鼻內攻擊。在感染後第5天，通過用抗CD8抗體和加載CTL表位的MHC I類複合物染色來自肺的淋巴細胞而計數肺中CTL決定簇特異性CD8T細胞總共分析了30,000個CD8T細胞。
圖8示出在首次用於實驗的小鼠中的細胞毒性T細胞活性。體內CTL決定簇特異性細胞毒性用經CTL決定簇刺激(pulsed)的並用高密度CFSE標記的同基因脾細胞測量。用低密度CFSE標記的未刺激的脾細胞用作對照。每一靶細胞群的15×106個細胞的混合物在感染後第4天靜脈注射進首次用於實驗的小鼠。16小時後殺死小鼠，通過流式細胞計量術分析脾中是否存在CFSE-high和CFSE-low細胞群。每一樣品總共分析1×106個淋巴細胞。
圖9示出脂肽接種的小鼠中的細胞毒性T細胞活性。用在PBS中的9nmole包含SEQ ID NO1所示CD4+輔助T細胞表位和SEQ IDNO2所示H-2d-限制性CTL表位的[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]鼻內接種小鼠。在第28天用Mem71攻擊小鼠。體內CTL決定簇特異性細胞毒性用經CTL決定簇刺激的並用高密度CFSE標記的同基因脾細胞測量。用低密度CFSE標記的未刺激的脾細胞用作對照。每一靶細胞群的15×106個細胞的混合物在感染後第4天靜脈注射進脂肽接種的被攻擊的小鼠。16小時後殺死小鼠，通過流式細胞計量術分析脾中是否存在CFSE-high和CFSE-low細胞群。每一樣品總共分析1×106個淋巴細胞。
圖10示出基於各種肽的免疫原誘導表位特異性CTL的能力。脂肽包含SEQ ID NO1所示的CD4+輔助T細胞表位和SEQ ID NO2所示的H-2d-限制性CTL表位。用在PBS中的各種脂肽鼻內接種各由3隻小鼠組成的各組，並在第28天用Mem71攻擊。為了分析體內CTL決定簇特異性細胞毒性，用CTL決定簇刺激並用高密度CFSE標記同基因脾細胞。通過共注射用低密度CFSE標記的同基因脾細胞而控制抗原特異性溶解。在感染後第4天靜脈注射每一靶細胞群的15×106個細胞的混合物。16小時後殺死小鼠，通過流式細胞計量術分析脾中是否存在CFSE-high和CFSE-low細胞群。每一樣品總共分析1×106個淋巴細胞。各個小鼠用實心方塊代表，條代表幾何平均效價。
圖11示出脂肽對幹擾素γ產生細胞的誘導。包含一種輔助T細胞表位和Listeria monocytogenes的CTL表位並經位於所示表位之間的一內部賴氨酸殘基的ε氨基基團與Pam2Cys連接的肽(即圖2列出的基於SEQ ID NO175的肽[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[LLO91-99])或者基於這一結構且其中Pam2Cys經所述賴氨酸的ε氨基基團連接的脂肽用於免疫小鼠。如x軸所示，5隻B ALB/c小鼠用細菌靜脈接種或者用9nmole脂化肽(lipidated peptide)[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[LLO91-99]或9nmole非脂化肽(non-lipidated peptide)[P25]-Lys-[LLO91-99](SEQ ID NO175；圖2)或磷酸緩衝鹽水(PBS)皮下免疫。從接種動物獲得脾細胞並用具有SEQ ID NO172所示序列的分離的CTL表位(空心條)體外刺激或不用抗原刺激(實心條)，28天後測量存在的(IFN-γ)產生細胞數。縱坐標指示每1,000,000個脾細胞中的IFN-γ產生細胞數。數據顯示用脂肽接種的小鼠的IFN-γ產生細胞數增加，表明脂肽相對於非脂化的肽具有增強的激活T細胞的能力。
圖12示出用圖2中命名為[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[LLO91-99]的脂肽免疫的小鼠具有抗L.monocytogenes感染的增強的保護。如x軸所示，5隻BALB/c小鼠用1000個細菌靜脈接種(第1列)，或者用PBS(第2列)或9nmol[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[LLO91-99]肽(第3列)或9nmol非脂化[P25]-Lys-[LLO91-99]肽(SEQ ID NO175；第4列)皮下免疫。小鼠用完整細菌攻擊，在攻擊後28天測量肝中存在的集落形成單位數(縱坐標)。
圖13示出用脂肽免疫產生的抗B16黑素瘤的保護作用。C57BL/6小鼠用20nmole脂化肽[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[SIINFEKL](空心圓)、非脂化肽[P25]-Lys-[SIINFEKL](空心三角)或用PBS(空心方塊)皮下免疫尾根。14天後小鼠用2×105B 16-OVA細胞(每組n＝6)背部皮下攻擊，如述監測腫瘤生長(Anraku，et al.，J Virol.76；3791-3799，2002)。
圖14示出由免疫後保持無腫瘤的動物百分比確定的用脂肽免疫原對Lewis肺腫瘤的治療性處理。用3×104個已用卵清蛋白轉染並因此表達CTL表位SIINFEKL的Lewis Lung腫瘤細胞[Nelson et al.，JImmunol.1665557-5566，2001]注射小鼠。接受腫瘤細胞4天後，在動物尾根皮下接種20nmole脂化肽[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[SIINFEKL](空心圓)、非脂化肽[P25]-Lys-[SIINFEKL](空心三角)或PBS(空心方塊)。接受腫瘤細胞後11天給予第二次類似劑量的免疫原。監測動物的腫瘤發生，當腫瘤面積超過100mm2時使動物安樂死。
圖15示出由免疫後動物存活率確定的用脂肽免疫原對Lewis肺腫瘤的治療性處理。用3×104個已用卵清蛋白轉染並因此表達CTL表位SIINFEKL的Lewis肺腫瘤細胞[Nelson et al.，J Immunol.1665557-5566，2001]注射小鼠。接受腫瘤細胞4天後，在動物尾根皮下接種20nmole脂化肽[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[SIINFEKL](空心圓)、非脂化肽[P25]-Lys-[SIINFEKL](空心三角)或PBS(空心方塊)。接受腫瘤細胞後11天給予第二次類似劑量的免疫原。監測動物的存活率，當腫瘤面積超過100mm2時使動物安樂死。
圖16示出基於肽和脂肽的免疫原正調節人樹突細胞上MHC II類、CD83和CD86的表達的能力。人單核細胞衍生的樹突細胞與培養基單獨、LPS(5μg/mL)、非脂化肽[P25]-Lys-[HCV](5μg/mL)或脂肽[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[HCV](5μg/mL)保溫48小時，之後在流式細胞計量術分析之前用針對HLA-DR，CD83和CD86的FITC綴合抗體染色。柱狀圖代表了進入正散射和旁散射點圖上的活的大粒細胞(live large granular cells gated on the forward and side scatter dotplot)。柱狀圖灰色區域以及給出的值相應於在分析的群體內表達高水平抗原的細胞百分比。輔助T細胞表位鑑別自Mobillivirus並具有胺基酸序列KLIPNASLIENCTKAEL(SEQ ID NO20)；具有胺基酸序列DLMGYIPLV(SEQ ID NO176)的CTL表位是一種來自C型肝炎病毒核心蛋白的HLA A2限制性CTL表位。
優選實施方案的詳細描述脂肽本發明的一個方面提供了分離的脂肽，其包含與一或多個脂質部分綴合的多肽，其中(i)所述多肽包含一種胺基酸序列，該胺基酸序列包含(a)一種輔助T細胞(Th)表位的胺基酸序列和一種CTL表位的胺基酸序列，其中所述這兩個胺基酸序列是不同的；和(b)一或多個內部賴氨酸殘基或內部賴氨酸類似物殘基，用於經所述賴氨酸或賴氨酸類似物的ε氨基基團或末端側鏈基團附著每一個所述脂質部分；以及(ii)所述一或多個脂質部分的每一個均直接或間接共價附著於所述一或多個內部賴氨酸殘基的ε氨基基團或所述內部賴氨酸類似物殘基的末端側鏈基團。
本文所用術語「脂肽」是指任何非天然存在的物質組合物，其包含直接或間接綴合的一或多個脂質部分(lipid moiety)和一或多個胺基酸序列，所述物質組合物基本上不含同種非綴合脂質或蛋白質。
術語「直接「是指脂質部分和胺基酸序列並列在所述脂肽中(即它們不由一個間隔分子隔開)。
術語「間接」是指脂質部分和胺基酸序列由包含一或多個含碳分子如一或多個胺基酸殘基的間隔物隔開。胺基酸序列可以是任意長度，由輔助T細胞表位和CTL表位的功能性需要而限制。
本文所用術語「內部賴氨酸殘基」是指包含輔助T細胞表位和CTL表位的多肽中的賴氨酸殘基，其中所述賴氨酸不是所述多肽的N-末端胺基酸殘基或者C-末端殘基。因此，內部賴氨酸殘基可以是輔助T細胞表位或CTL表位的C-末端或N-末端殘基，條件是其位於多肽的內部。這意味著用於附著脂質的賴氨酸殘基是存在於輔助T細胞表位的胺基酸序列中或CTL表位的胺基酸序列中的殘基。內部賴氨酸殘基也可以獨立於輔助T細胞表位或CTL表位之外，在這種情況下它必須連接多肽的這兩個表位。
類似地，術語「內部賴氨酸類似物」是指包含輔助T細胞表位和CTL表位的多肽中的賴氨酸類似物殘基，其中所述賴氨酸類似物不是所述多肽的N-末端胺基酸殘基或C-末端殘基。確定一個賴氨酸殘基是否是「內部」的標準同樣適用於確定一個賴氨酸類似物是否是內部的。
術語「賴氨酸類似物」是指能摻入到肽的內部的合成化合物，其具有合適的側基可以偶聯脂質部分，包括具有這種氨基側基的胺基酸類似物或非天然存在的胺基酸。優選的賴氨酸類似物包括下述通式(V)的化合物
其中n是從0到3的整數，X是選自NH、O和S的所述內部賴氨酸類似物殘基的末端側鏈基團。更優選地，n是具有從1到3的數值的整數。更優選地，X是氨基。在一個特別優選的實施方案中，賴氨酸類似物選自2，3-二氨基丙酸(Dpr)、2，4-二氨基丁酸(Dab)和2，5-二氨基戊酸[即鳥氨酸(Orn)]。
本領域技術人員了解術語「ε氨基基團」的含義。術語「末端側鏈基團」是指在賴氨酸類似物側鏈上的遠離所述類似物α-碳的取代基，如Dpr的β-氨基、Dab的γ-氨基或Orn的δ-氨基。
優選地，脂質部分經賴氨酸殘基的ε氨基基團附著或者附著於位於輔助T細胞表位和CTL表位的胺基酸序列之間的所述內部賴氨酸類似物的末端側鏈基團上。
本發明脂肽的增強的引起T細胞應答的能力反映在它們正調節幼樹突細胞(DC)、特別是D1細胞上MHC II類分子的表面表達的能力上，以及反映在增加的免疫動物的組織樣品中CD8+T細胞數上。在用病毒病原體的CTL免疫的動物中，本發明脂肽引起T細胞應答的能力增強也通過免疫動物後病毒清除增強而指示。
優選地，脂肽是可溶的，更優選地是高度可溶的。
本領域技術人員已知的是，賴氨酸的ε氨基基團是這一胺基酸的側鏈的末端氨基基團。使用內部賴氨酸或內部賴氨酸類似物的末端側鏈基團交聯脂質部分便於使多肽部分作為摻入輔助T細胞表位和CTL表位的共線性胺基酸序列而合成。脂質經賴氨酸殘基的ε氨基基團或賴氨酸類似物的末端側鏈基團而附著的脂肽與脂質經肽中賴氨酸的α-氨基基團而附著的脂肽有明顯的結構區別。
因此，特別優選的是脂質部分所附著的至少一個內部賴氨酸殘基或內部賴氨酸類似物位於多肽部分內，從而分隔免疫功能表位。例如，所述內部賴氨酸殘基或內部賴氨酸類似物可以作為表位之間的間隔和/或連接殘基。自然地，當內部賴氨酸或內部賴氨酸類似物位於輔助T細胞表位和CTL表位之間時，脂質部分也將位於這些表位之間的一個位置，形成多肽胺基酸序列的一個分支。如本文所示，使用一個單賴氨酸殘基分隔，CTL和輔助T細胞表位(例如SEQ ID No4)。
本發明很明顯包括所述內部賴氨酸殘基或內部賴氨酸類似物殘基位於一第三種胺基酸序列內，該第三種胺基酸序列不是CTL表位或輔助T細胞表位。例如，所述內部賴氨酸或內部賴氨酸類似物可以綴合於一或多個不同胺基酸殘基。
內部賴氨的ε氨基基團或內部賴氨酸類似物的末端側鏈基團可以用與用於保護其它胺基酸的α-氨基和側鏈官能團呈正交(orthogonally)的化學基團保護。以此方式，內部賴氨酸或賴氨酸類似物的ε氨基基團或其它側鏈基團可以選擇性暴露以允許化學基團如含脂質部分合適地附著於ε氨基基團或側鏈氨基。
為了用Fmoc化學進行肽合成，通過修飾的胺基酸殘基Fmoc-Lys(Mtt)-OH(Nα-Fmoc-Nε-4-甲基三苯甲基-L-賴氨酸)提供合適的正交保護的賴氨酸ε基團。對於本文所涉及的各種賴氨酸類似物，有類似的合適正交保護的側鏈基團可以利用，例如Fmoc-Om(Mtt)-OH(Nα-Fmoc-Nδ-4-甲基三苯甲基-L-鳥氨酸)，Fmoc-Dab(Mtt)-OH(Nα-Fmoc-Nγ-4-甲基三苯甲基-L-二氨基丁酸)和Fmoc-Dpr(Mtt)-OH(Nα-Fmoc-Nβ-4-甲基三苯甲基-L-二氨基丙酸)。側鏈保護基Mtt在存在於賴氨酸或賴氨酸類似物α-氨基基團上的Fmoc被除去的條件下是穩定的，但是其可以用存在於二氯甲烷中的1％三氟乙酸而選擇性除去。Fmoc-Lys(Dde)-OH(Nα-Fmoc-Nε-1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亞環己-1-基)乙基-L-賴氨酸)或Fmoc-Lys(ivDde)-OH(Nα-Fmoc-Nε-1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亞環己-1-基)-3-甲基丁基-L-賴氨酸)也可以如此應用，其中Dde側鏈保護基在肽合成過程中通過用肼處理而選擇性除去。
為了用Boc化學進行肽合成，可以使用Boc-Lys(Fmoc)-OH。側鏈保護基Fmoc可以通過用哌啶或DBU(1，8-二氮雜雙環[5.4.0]十一碳-7-烯)處理而選擇性除去，但是當用三氟乙酸從α末端除去Boc基團時，Fmoc仍留在原位。
優選地，輔助T細胞表位和CTL表位通過至少一個或兩個或三個或四個或五個胺基酸殘基包括單個內部賴氨酸殘基或內部賴氨酸類似物殘基而隔開。
很顯然本發明包括添加多個脂質部分至多肽部分上。例如，多肽可包括多個內部賴氨酸殘基和/或多個內部賴氨酸類似物。如果多個內部賴氨酸或多個賴氨酸類似物更緊密地位於一起則可能在脂質添加時發生空間位阻，從而產生終產物混合物或者收率降低。
與這一點相關的是無需包含輔助T細胞表位的完整胺基酸序列或者包含CTL表位的完整胺基酸序列均具有免疫應答。因此所述胺基酸序列在包含所述表位的同時也可具有額外的不具備輔助T細胞活性或CTL表位的序列。當這種額外序列包括一或多個內部賴氨酸或賴氨酸類似物殘基時，這些殘基的末端側鏈基團可以作為脂質部分的附著位點。自然地，必須保持輔助T細胞功能和CTL表位功能。
用於附著脂質部分的內部賴氨酸殘基或內部賴氨酸類似物的位置應該也被選擇，從而脂質的附著不會干擾輔助T細胞表位或CTL表位在給予脂肽的個體中的免疫功能。例如，根據脂質部分的選擇，所述脂質在CTL表位內的附著可能在空間上阻礙CTL表位呈遞。
下述通式(VI)提供了本發明脂肽的一般優選形式，其中內部賴氨酸或內部賴氨酸類似物位於輔助T細胞表位和CTL表位之間。
式(VI) 其中表位是輔助T細胞表位或CTL表位；
A存在或不存在，由長度約1至約6個胺基酸的一種胺基酸間隔物組成；n是值為1、2、3或4的整數；X是選自NH，O和S的末端側鏈基團，優選由NH組成；Y存在或不存在，由長度約1至約6個胺基酸的一種胺基酸間隔物組成，其中優選的是所述胺基酸為絲氨酸；以及Z是脂質部分，優選為Pam2Cys或Pam3Cys。
輔助T細胞表位是本領域技術人員已知能增強一特定靶個體(即人類個體，或特異的非人動物個體如大鼠、小鼠、豚鼠、狗、馬、豬或山羊)中的免疫應答的任何輔助T細胞表位，優選的輔助T細胞表位長度至少約10-24個胺基酸，更通常約15至約20個胺基酸。
混雜或允許輔助T細胞表位是特別優選的，因為它們能容易地化學合成，並且無需使用包含多個輔助T細胞表位的較長多肽。
適於用於本發明脂肽中的混雜或允許輔助T細胞表位的例子選自如下一組(i)破傷風類毒素肽(TTP)的嚙齒類或人類輔助T細胞表位，如TTP的胺基酸830-843(Panina-Bordignon et al.，Eur.J.Immun.19，2237-2242，1989)；(ii)Plasmodium falciparum pfg27的嚙齒類或人類輔助T細胞表位；(iii)乳酸脫氫酶的嚙齒類或人類輔助T細胞表位；(iv)HIV包膜蛋白或HIVgp120的嚙齒類或人類輔助T細胞表位(Berzofsky et al.，J.Clin.Invest.88，876-884，1991)；(v)從已知錨蛋白的胺基酸序列預測的合成的人類輔助T細胞表位(PADRE)(Alexander et al.，Immunity 1，751-761，1994)；(vi)麻疹病毒融合蛋白(MV-F；Muller et al.，Mol.Immunol.32，37-47，1995；Partidos et al.，J.Gen.Virol.，71，2099-2105，1990)的嚙齒類或人類輔助T細胞表位；
(vii)包含犬瘟熱病毒融合蛋白(CDV-F)的至少約10個胺基酸殘基、例如來自CDV-F的胺基酸位置148-283的輔助T細胞表位(Ghosh etal.，Immunol.104，58-66，2001；International Patent Publication No.WO 00/46390)；(viii)衍生自MUC1粘蛋白的胞外串聯重複結構域的肽序列的人類輔助T細胞表位(US Patent Application No.0020018806)；(ix)流感病毒血凝素(IV-H)的嚙齒類或人類輔助T細胞表位(Jacksonet al.Virol.198，613-623，1994)；以及(x)口蹄疫病毒VP3蛋白的牛或駱駝輔助T細胞表位，其包含口蹄疫病毒(FMDV-O1Kaufbeuren株)的VP3蛋白的殘基173-176或另一FMDV毒株的相應胺基酸。
如本領域技術人員已知的，一個輔助T細胞表位可以由一或多個不同物種識別。因此，本文中任何輔助T細胞表位的命名不應被視為僅限於表位被識別的該物種的免疫系統。例如，一個嚙齒類輔助T細胞表位可以被小鼠、大鼠、兔、豚鼠或其它嚙齒類或者人或狗的免疫系統識別。
更優選地，輔助T細胞表位包含選自如下一組的一個胺基酸序列(i)來自IV-H的ALNNRFQIKGVELKS(SEQ ID NO1)；(ii)來自IV-H的GALNNRFQIKGVELKS(SEQ ID NO14)；(iii)來自MV-F的LSEIKGVIVHRLEGV(SEQ ID NO15)；(iv)來自CDV-F的TAAQITAGIALHQSNLN(SEQ ID NO16)；(v)來自CDV-F的IGTDNVHYKIMTRPSHQ(SEQ ID NO17)；(vi)來自CDV-F的YKIMTRPSHQYLVIKLI(SEQ ID NO18)；(vii)來自CDV-F的SHQYLVIKLIPNASLIE(SEQ ID NO19)；(viii)來自CDV-F的KLIPNASLIENCTKAEL(SEQ ID NO20)；(ix)來自CDV-F的LIENCTKAELGEYEKLL(SEQ ID NO21)；(x)來自CDV-F的AELGEYEKLLNSVLEPI(SEQ ID NO22)；
(xi)來自CDV-F的KLLNSVLEPINQALTLM(SEQ ID NO23)；(xii)來自CDV-F的EPINQALTLMTKNVKPL(SEQ ID NO24)；(xiii)來自CDV-F的TLMTKNVKPLQSLGSGR(SEQ ID NO25)；(xiv)來自CDV-F的KPLQSLGSGRRQRRFAG(SEQ ID NO26)；(xv)來自CDV-F的SGRRQRRFAGVVLAGVA(SEQ ID NO27)；(xvi)來自CDV-F的FAGVVLAGVALGVATAA(SEQ ID NO28)；(xvii)來自CDV-F的GVALGVATAAQITAGIA(SEQ ID NO29)；(xviii)來自CDV-F的GIALHQSNLNAQAIQSL(SEQ ID NO30)；(xix)來自CDV-F的NLNAQAIQSLRTSLEQS(SEQ ID NO31)；(xx)來自CDV-F的QSLRTSLEQSNKAIEEI(SEQ ID NO32)；(xxi)來自CDV-F的EQSNKAIEEIREATQET(SEQ ID NO33)；(xxii)來自CDV-F的SSKTQTHTQQDRPPQPS(SEQ ID NO34)；(xxiii)來自CDV-F的QPSTELEETRTSRARHS(SEQ ID NO35)；(xxiv)來自CDV-F的RHSTTSAQRSTHYDPRT(SEQ ID NO36)；(xxv)來自CDV-F的PRTSDRPVSYTMNRTRS(SEQ ID NO37)；(xxvi)來自CDV-F的TRSRKQTSHRLKNIPVH(SEQ ID NO38)；(xxvii)來自CDV-F的TELLSIFGPSLRDPISA(SEQ ID NO39)；(xxviii)來自CDV-F的PRYIATNGYLISNFDES(SEQ ID NO40)；(xxix)來自CDV-F的CIRGDTSSCARTLVSGT(SEQ ID NO41)；(xxx)來自CDV-F的DESSCVFVSESAICSQN(SEQ ID NO42)；(xxxi)來自CDV-F的TSTIINQSPDKLLTFIA(SEQ ID NO43)；(xxxii)來自CDV-F的SPDKLLTFIASDTCPLV(SEQ ID NO44)；(xxxiii)來自MUC-1的STAPPAHGVTSAPDTRAPGSTAPP(SEQ ID NO45)；(xxxiv)來自MUC-1的GVTSAPDTRPAPGSTASSL(SEQ ID NO46)；(xxxv)來自MUC-1的GVTSAPDTRPAPGSTASL(SEQ ID NO47)；(xxxvi)來自MUC-1的TAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPKKG(SEQ ID NO48)；(xxxvii)MUC-1的STAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPK(SEQ ID NO49)；
(xxxviii)來自FMDV-VP3蛋白的GVAE(SEQ ID NO50)；(xxxix)FMDV-VP3的TASGVAETTN(殘基170-179)(SEQ ID NO51)；和(xl)來自FMDV的TAKSKKFPSYTATYQF(SEQ ID NO52)。
本文所述輔助T細胞表位僅為舉例目的而包括進來。使用本領域技術人員已知的標準肽合成技術，本文所述的輔助T細胞表位可以用一不同的輔助T細胞表位取代以適應本發明脂肽在不同物種中的應用。因此，本領域技術人員已知的用於引起或增強在靶物種中的免疫應答的另外的輔助T細胞表位不被排除在外。
另外的輔助T細胞表位可以使用用於鑑別合適序列的組分蛋白、蛋白片段和肽的體外T細胞刺激技術經詳細分析而鑑別(Goodman andSercarz，Ann.Rev.Immunol.，1，465，(1983)；Berzofsky，In″The Yearin Immunology，Vol.2″page 151，Karger，Basel，1986；andLivingstone and Fathman，Ann.Rev.Immunol.，5，477，(1987))。
CTL表位方便地衍生自病毒、原核生物或真核生物的免疫原性蛋白、脂蛋白或糖蛋白的胺基酸序列，包括但不限於衍生自哺乳動物個體或感染所述個體的細菌、真菌、原生動物或寄生蟲的CTL表位。CTL表位的Mimotope特別包括在本發明範圍內。
當CTL表位被給予哺乳動物時，其能夠引起T細胞應答，優選地通過特異於所述表位或衍生所述表位的抗原的CD8+ T細胞而引起T細胞應答，更優選地，通過誘導抗衍生所述表位的病原體或腫瘤細胞的細胞介導免疫而引起T細胞應答。
為便於肽合成，優選較短的CTL表位。優選地，CTL表位的長度不超過約30個胺基酸，更優選地，CTL表位序列由約25個胺基酸殘基或更少殘基組成，更優選地由少於20個胺基酸殘基組成，甚至更優選長度約8-12個胺基酸殘基。
來自寄生蟲的優選的CTL表位是與利什曼原蟲病(leishmania)，瘧疾，錐蟲病(trypanosomiasis)，巴貝蟲病(babesiosis)和血吸蟲病(schistosomiasis)相關的CTL表位，例如選自如下一組的一種寄生蟲的抗原的CTL表位Plasmodium falciparum；Circumsporozoa；Leishmania donovani；Toxoplasma gondii；Schistosoma mansoni；Schistosoma japonicum；Schistosoma hematobium；andTrypanosoma brucei.
P.falciparum的特別優選的CTL表位衍生自選自如下一組的一種抗原環子孢子蛋白(CSP)，子孢子表面蛋白2(PfSSP2)，肝階段蛋白1(LSA1)，裂殖子表面蛋白1(MSP1)，絲氨酸重複抗原(SERA)，和AMA-1抗原(Amante，et al.J.Immunol.159，5535-5544，1997；.Chaba et al.Int.J.Immunopharm.20，259-273，1998；Shi et al.，Proc.Natl Acad.Sci(USA)96，1615-1620，1999；Wang et al.Science 282，476-479，1998；and Zevering et al. Immunol.94，445-454，1998)。L.donovani的特別優選的CTL表位衍生自重複肽(Liew et al.，J.Exp.Med.172，1359(1990))。T.gondii的特別優選的CTL表位衍生自P30表面蛋白(Darcy et al.，J.Immunol.149，3636(1992))。S.mansoni特別優選的CTL表位衍生自Sm-28GST抗原(Wolowxzuk et al.，J.Immunol1461987(1991))。
優選的病毒特異性CTL表位衍生自輪狀病毒(Rotaviruses)、皰疹病毒(Herpes viruses)、冠狀病毒(Corona viruses)、小RNA病毒(Picornaviruses)(例如Apthovirus)、呼吸合胞體病毒(Respiratory Synctial virus)、流感病毒、副流感病毒、腺病毒、痘病毒、牛皰疹病毒I型、牛病毒性腹瀉病毒、牛輪狀病毒、犬瘟熱病毒(FMDV)、麻疹病毒(MV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、Epstein-Barr病毒(EBV)、人巨細胞病毒(HCMV)或肝炎病毒等。
HIV-1的特別優選的CTL表位衍生自env，gag，或pol蛋白。流感病毒的特別優選的CTL表位衍生自核蛋白(Taylor et al.，Immunogenetics 26，267(1989)；Townsend et al.，Nature 348，674(1983))，基質蛋白(Bednarek et al.，J.Immunol.147，4047(1991))或聚合酶蛋白(Jameson et al.，J.Virol.72，8682-8689，1998；andGianfrani et al.，Human Immunol.61，438-452，2000)。淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)的特別優選的CTL表位衍生白糖蛋白-1抗原(Zinkernagel et al.Nature 248，701-702，1974)。巨細胞病毒的特別優選的CTL表位衍生自選自如下一組的一種抗原pp28，pp50，pp65，pp71，pp150，gB，gH，IE-1，IE-2，US2，US3，US6，US11，和UL18(例如，Diamond，USSN 6,074,645，June 13，2000；Longmate et al.，Immunogenet.52，165-173，2000；Wills et al.，J.Virol.70，7569-7579，1996；Solache et al.，J.Immunol.163，5512-5518，1999；Diamond etal.，Blood 90，1751-1767，1997；Kern et al.，Nature Med.4，975-978，1998；Weekes et al.，J.Virol.73，2099-2108，1999；Retière et al.，J.Virol.74，3948-3952，2000；and Salquin et al.，Eur.J.Immunol.30，2531-2539，2000)。麻疹病毒特別優選的CTL表位衍生自融合糖蛋白(MV-F)，特別是來自其殘基438-446(Herberts et al.J.Gen Virol.82，2131-2142，2001)。來自Epstein-Barr病毒(EBV)的特別優選的表位衍生自EBV的潛伏核蛋白(EBNA)或潛伏膜蛋白(LMP)，如來自A型EBV的EBNA 2A，EBNA 3A，EBNA 4A或EBNA 14a；；來自B型EBV的EBNA 2B，EBNA 3B，EBNA 4B或EBNA 14b；LMP1；或LMP2(國際專利申請PCT/AU95/00140，
公開日1995年9月16日；國際專利申請PCT/AU97/00328，
公開日1997年11月24日；國際專利申請PCT/AU98/00531，
公開日1998年1月10日)。
優選的細菌特異性CTL表位衍生自Pasteurella，Actinobacillus，Haemophilus，Listeria monocytogenes，Mycobacterium tuberculosis，Staphylococcus，Neisseria gonorrhoeae，Helicobacter pylori，Streptococcus pneumoniae，Salmonella enterica，E.coli，Shigella等。
合適的細菌CTL表位包括例如衍生自如下蛋白的CTL表位，所述的蛋白為Mycobacterium tuberculosis 65Kd蛋白(Lamb et al.，EMBOJ.，6，1245(1987))；M.tuberculosis ESAT-6蛋白(Morten et al.，Infect.Immun.66，717-723，1998)；Staphylococcus aureus核酸酶蛋白(Finnegan et al.，J.Exp.Med.164，897(1986))；Escherichia coli熱穩定腸毒素(Cardenas et al.，Infect.Immunity 61，4629(1993))；和Escherichia coli耐熱腸毒素(Clements et al.，Infect.Immunity 53，685(1986))。
來自哺乳動物個體的優選的CTL表位衍生自腫瘤CTL抗原和/或能夠產生抗腫瘤CTL抗原的T細胞應答。腫瘤特異性CTL表位通常是天然或外來CTL表位，其表達與腫瘤的發育、生長、存在或復發相關。只要這種CTL表位可用於區分異常組織和正常組織，它們即可用作治療性介入的靶。這種CTL表位是本領域熟知的。實際上，有一些例子被充分鑑定，並且目前是引起極大興趣的產生腫瘤特異性治療的焦點。腫瘤CTL表位的非限制性例子衍生自癌胚抗原(CEA)，前列腺特異性抗原(PSA)，黑素瘤抗原(MAGE，BAGE，GAGE)，和粘蛋白如MUC-1。
用於給予癌症患者的優選的CTL表位衍生自誘導癌症的蛋白，例如癌蛋白(例如p53，ras等)。
在一個特別優選的實施方案中，CTL表位包含或由選自如下一組的一種胺基酸序列組成(i)來自PR8病毒的NP的TYQRTRALV(SEQ ID NO2)；(ii)P.falciparum CSP的KPKDELDYENDIEKKICKMEKCS(SEQ ID NO53)；(iii)來自P.falciparum CSP的DIEKKICKMEKCSSVFNVVNS(SEQ ID NO54)；(iv)來自P.falciparum LSA1的KPIVQYDNF(SEQ ID NO55)；(v)來自P.falciparum MSP1的GISYYEKVLAKYKDDLE(SEQ ID NO56)；(vi)P.falciparum AMA-1的EFTYMINFGRGQNYWEHPYQKS(SEQ ID NO57)；(vii)來自P.falciparum A MA-1的DQPKQYEQHLTDYEKIKEG(SEQ ID NO58)；(viii)來自HIV-1env蛋白的NMWQEVGKAM(SEQ ID NO59)；
(ix)來自HIV-1env蛋白的APTKAKRRVV(SEQ ID NO60)；(x)來自HIV-1env蛋白的CTRPNNNTRK(SEQ ID NO61)；(xi)來自HIV-1env蛋白的TVYYGVPVWK(SEQ ID NO62)；(xii)來自HIV-1env蛋白的RPVVSTQLL(SEQ ID NO63)；(xiii)來自HIV-1gag蛋白的SLYNTVATLY(SEQ ID NO64)；(xiv)來自HIV-1gag蛋白的ELRSLYNTVA(SEQ ID NO65)；(xv)來自HIV-1gag蛋白的KIRLRPGGKK(SEQ ID NO66)；(xvi)來自HIV-1gag蛋白的IRLRPGGKKK(SEQ ID NO67)；(xvii)來自HIV-1gag蛋白的RLRPGGKKK(SEQ ID NO68)；(xviii)來自HIV-1gag蛋白的GPGHKARVLA(SEQ ID NO69)；(xix)來自HIV-1pol蛋白的SPIETVPVKL(SEQ ID NO70)；(xx)來自HIV-1pol蛋白的ILKEPVHGVY(SEQ ID NO71)；(xxi)來自HIV-1pol蛋白的AIFQSSMTK(SEQ ID NO72)；(xxii)來自HIV-1pol蛋白的SPAIFQSSMT(SEQ ID NO73)；(xxiii)來自HIV-1pol蛋白的QVRDQAEHLK(SEQ ID NO74)；(xxiv)來自HIV-1pol蛋白的GPKVKQWPLT(SEQ ID NO75)；(xxv)來自流感病毒核蛋白的TYQRTRALV(SEQ ID NO76)；(xxvi)來自流感病毒核蛋白的TYQRTRALVRTGMDP(SEQ ID NO77)；(xxvii)來自流感病毒核蛋白的IASNENMDAMESSTL(SEQ ID NO78)；(xxviii)來自LCMV gp1的KAVYNFATM(SEQ ID NO79)；(xxix)來自EBV的QVKWRMTTL(SEQ ID NO80)；(xxx)來自EBV的VFSDGRVAC(SEQ ID NO81)；(xxxi)來自EBV的VPAPAGPIV(SEQ ID NO82)；(xxxii)來自EBV的TYSAGIVQI(SEQ ID NO83)；(xxxiii)來自EBV的LLDFVRFMGV(SEQ ID NO84)；(xxxiv)來自EBV的QNGALAINTF(SEQ ID NO85)；(xxxv)來自EBV的VSSDGRVAC(SEQ ID NO86)；(xxxvi)來自EBV的VSSEGRVAC(SEQ ID NO87)；
(xxxvii)來自EBV的VSSDGRVPC(SEQ ID NO88)；(xxxviii)來自EBV的VSSDGLVAC(SEQ ID NO89)；(xxxix)來自EBV的VSSDGQVAC(SEQ ID NO90)；(xl)來自EBV的VSSDGRWC(SEQ ID NO91)；(xli)來自EBV的VPAPPVGPIV(SEQ ID NO92)；(xlii)來自EBV的VEITPYEPTG(SEQ ID NO93)；(xliii)來自EBV的VEITPYEPTW(SEQ ID NO94)；(xliv)來自EBV的VELTPYKPTW(SEQ ID NO95)；(xlv)來自EBV的RRIYDLIKL(SEQ ID NO96)；(xlvi)來自EBV的RKIYDLIEL(SEQ ID NO97)；(xlvii)來自EBV的PYLFWLAGI.(SEQ ID NO98)；(xlviii)來自EBV的TSLYNLRRGTALA(SEQ ID NO99)；(xlix)來自EBV的DTPLIPLTIF(SEQ ID NO100)；(l)來自EBV的TVFYNIPPMPL(SEQ ID NO101)；(li)來自EBV的VEITPYKPTW(SEQ ID NO102)；(lii)來自EBV的VSFIEFVGW(SEQ ID NO103)；(liii)來自EBV的FRKAQIQGL(SEQ ID NO104)；(liv)來自EBV的FLRGRAYGL(SEQ ID NO105)；(lv)來自EBV的QAKWRLQTL(SEQ ID NO106)；(lvi)來自EBV的SVRDRLARL(SEQ ID NO107)；(lvii)來自EBV的YPLHEQHGM(SEQ ID NO108)；(lviii)來自EBV的HLAAQGMAY(SEQ ID NO109)；(lix)來自EBV的RPPIFIRRL(SEQ ID NO110)；(lx)來自EBV的RLRAEAGVK(SEQ ID NO111)；(lxi)來自EBV的IVTDFSVIK(SEQ ID NO112)；(lxii)來自EBV的AVFDRKSDAK(SEQ ID NO113)；(lxiii)來自EBV的NPTQAPVIQLVHAVY(SEQ ID NO114)；(lxiv)來自EBV的LPGPQVTAVLLHEES(SEQ ID NO115)；
(lxv)來自EBV的DEPASTEPVHDQLL(SEQ ID NO116)；(lxvi)來自EBV的RYSIFFDY(SEQ ID NO117)；(lxvii)來自EBV的AVLLHEESM(SEQ ID NO118)；(lxviii)來自EBV的RRARSLSAERY(SEQ ID NO119)；(lxix)來自EBV的EENLLDFVRF(SEQ ID NO120)；(lxx)來自EBV的KEHVIQNAF(SEQ ID NO121)；(lxxi)來自EBV的RRIYDLIEL(SEQ ID NO122)；(lxxii)來自EBV的QPRAPIRPI(SEQ ID NO123)；(lxxiii)來自EBV的EGGVGWRHW(SEQ ID NO124)；(lxxiv)來自EBV的CLGGLLTMV(SEQ ID NO125)；(lxxv)來自EBV的RRRWRRLTV(SEQ ID NO126)；(lxxvi)來自EBV的RAKFKQLL(SEQ ID NO127)；(lxxvii)來自EBV的RKCCRAKFKQLLQHYR.(SEQ ID NO128)；(lxxviii)來自EBV的YLLEMLWRL(SEQ ID NO129)；(lxxix)來自EBV的YFLEILWGL(SEQ ID NO130)；(lxxx)來自EBV的YLLEILWRL(SEQ ID NO131)；(lxxxi)來自EBV的YLQQNWWTL(SEQ ID NO132)；(lxxxii)來自EBV的LLLALLFWL(SEQ ID NO133)；(lxxxiii)來自EBV的LLVDLLWLL(SEQ ID NO134)；(lxxxiv)來自EBV的LLLIALWNL(SEQ ID NO135)；(lxxxv)來自EBV的WLLLFLAIL(SEQ ID NO136)；(lxxxvi)來自EBV的TLLVDLLWL(SEQ ID NO137)；(lxxxvii)來自EBV的LLWLLLFLA(SEQ ID NO138)；(lxxxviii)來自EBV的ILLIIALYL(SEQ ID NO139)；(lxxxix)來自EBV的VLFIFGCLL(SEQ ID NO140)；(xc)來自EBV的RLGATIWQL(SEQ ID NO141)；(xci)來自EBV的ILYFIAFAL(SEQ ID NO142)；(xcii)來自EBV的SLVIVTTFV(SEQ ID NO143)；
(xciii)來自EBV的LMIIPLINV(SEQ ID NO144)；(xciv)來自EBV的TLFIGSHW(SEQ ID NO145)；(xcv)來自EBV的LIPETVPYI(SEQ ID NO146)；(xcvi)來自EBV的VLQWASLAV(SEQ ID NO147)；(xcvii)來自EBV的QLTPHTKAV(SEQ ID NO148)；(xcviii)來自HCMV pp65的SVLGPISGHVLK(SEQ ID NO149)；(xcix)來自HCMV pp65的FTSQYRIQGKL(SEQ ID NO150)；(c)來自HCMV pp65的FVFPTKDVALR(SEQ ID NO151)；(ci)來自HCMV pp65的FPTKDVAL(SEQ ID NO152)；(cii)來自HCMV pp65的NLVPMVATV(SEQ ID NO153)；(ciii)來自HCMV pp65的MLNIPSINV(SEQ ID NO154)；(civ)來自HCMV pp65的RIFAELEGV(SEQ ID NO155)；(cv)來自HCMV pp65的TPRVTGGGGAM(SEQ ID NO156)；(cvi)來自HCMV pp65的RPHERNGFTVL(SEQ ID NO157)；(cvii)來自HCMV pp65的RLLQTGIHV(SEQ ID NO158)；(cviii)來自HCMV pp65的VIGDQYVKV(SEQ ID NO159)；(cix)來自HCMV pp65的ALFFFDIDL(SEQ ID NO160)；(cx)來自HCMV pp65的YSEHPTFTSQY(SEQ ID NO161)；(cxi)來自HCMV pp65的VLCPKNMII(SEQ ID NO162)；(cxii)來自HCMV pp65的DIYRIFAEL(SEQ ID NO163)；(cxiii)來自HCMV pp65的ILARNLVPMV(SEQ ID NO164)；(cxiv)來自HCMV pp65的EFFWDANDIY(SEQ ID NO165)；(cxv)來自HCMV pp65的IPSINVHHY)(SEQ ID NO166)；(cxvi)來自HCMV IE-1的YILEETSVM(SEQ ID NO167)；(cxvii)來自HCMV IE-1的CVETMCNEY(SEQ ID NO168)；(cxviii)來自HCMV IE-1的RRIEEICMK(SEQ ID NO169)；(cxix)來自HCMV pp150的TTVYPPSSTAK(SEQ ID NO170)；(cxx)來自麻疹病毒融合糖蛋白的RRYPDAVYL(SEQ ID NO171)；
(cxxi)來自Listeria monocytogenes的GYKDGNEYI(SEQ ID NO172)；(cxxii)SIINFEKL from ovalbumin(SEQ ID NO173)；和(cxxiii)來自C型肝炎病毒核心蛋白的DLMGYIPLV(SEQ ID NO176)。
從前述描述可以明顯看出本發明脂肽的多肽部分方便地作為單胺基酸鏈合成，因而無需合成後修飾來摻入兩個表位。如本文所示，優選的是包含選自如下一組的一個胺基酸序列的多肽部分(i)ALNNRFQIKGVELKSTYQRTRALV(SEQ ID NO3)；(ii)ALNNRFQIKGVELKSKTYQRTRALV(SEQ ID NO4)；(iii)KLIPNASLIENCTKAELKTYQRTRALV(SEQ ID NO5)；(iv)KLIPNASLIENCTKAELKNLVPMVATV(SEQ ID NO6)；(v)AELGEYEKLLNSVLEPIKNLVPMVATV(SEQ ID NO7)；(vi)TAAQITAGIALHQSNLNKNLVPMVATV(SEQ ID NO8)；(vii)PRYIATNGYLISNFDESKNLVPMVATV(SEQ ID NO9)；(viii)KLIPNASLIENCTKAELKYLLEMLWRL(SEQ ID NO10)；(ix)AELGEYEKLLNSVLEPIKYLLEMLWRL(SEQ ID NO11)；(x)TAAQITAGIALHQSNLNKYLLEMLWRL(SEQ ID NO12)；(xi)PRYIATNGYLISNFDESKYLLEMLWRL(SEQ ID NO13)；(xii)KLIPNASLIENCTKAELKSIINFEKL(SEQ ID NO174)；(xiii)KLIPNASLIENCTKAELKGYKDGNEYI(SEQ ID NO175)and(xiv)KLIPNASLIENCTKAELKDLMGYIPLV(SEQ ID NO177)。
為命名目的，SEQ ID No3-4涉及包含來自流感病毒血凝素輕鏈的輔助T細胞表位(即SEQ ID NO1)和來自流感病毒毒株PR8的核蛋白的免疫顯性H-2d-限制性CTL表位(即SEQ ID NO2)的合成肽，其中在其ε氨基基團提供脂質附著位點的內部賴氨酸殘基以粗體表示。在SEQ ID No4中，在輔助T細胞表位和CTL表位之間有一額外內部賴氨酸殘基(SEQ ID NO4中的K16)。
SEQ ID No5涉及包含來自在狗、小鼠和人中有活性的犬瘟熱病毒的輔助T細胞表位(CDV-F；SEQ ID NO20)和來自流感病毒毒株PR8的免疫顯性H-2d-限制性CTL表位(即SEQ ID NO2)的合成肽，其中在其ε氨基基團位點提供脂質附著位點的內部賴氨酸殘基以粗體示出。在這個肽中，輔助T細胞表位和CTL表位之間有一額外內部賴氨酸殘基(SEQ ID NO5中的K18)。
SEQ ID No6涉及包含來自在狗、小鼠和人中有活性的犬瘟熱病毒的輔助T細胞表位(CDV-F；SEQ ID NO20)和來自人巨細胞病毒的免疫顯性pp65抗原(即HCMV p p65抗原)的免疫顯性HLA A2-限制性CTL表位(即SEQ ID NO153)的合成肽，其中在其ε氨基基團位點提供脂質附著位點的內部賴氨酸殘基以粗體示出。在這個肽中，輔助T細胞表位和CTL表位之間有一額外內部賴氨酸殘基(SEQ ID NO6中的K18)。
SEQ ID No7涉及包含來自在狗、小鼠和人中有活性的犬瘟熱病毒的輔助T細胞表位(CDV-F；SEQ ID NO22)和來自HCMV pp65抗原的免疫顯性HLA A2-限制性CTL表位(即SEQ ID NO153)的合成肽，其中在其ε氨基基團位點提供脂質附著位點的內部賴氨酸殘基以粗體示出。在這個肽中，輔助T細胞表位和CTL表位之間有一額外內部賴氨酸殘基(SEQ ID NO7中的K18)。
SEQ ID No8涉及包含來自在狗、小鼠和人中有活性的犬瘟熱病毒的輔助T細胞表位(CDV-F；SEQ ID NO16)和來自HCMV pp65抗原的免疫顯性HLA A2-限制性CTL表位(即SEQ ID NO153)的合成肽，其中在其ε氨基基團位點提供脂質附著位點的內部賴氨酸殘基以粗體示出。在這個肽中，輔助T細胞表位和CTL表位之間有一額外內部賴氨酸殘基(SEQ ID NO8中的K18)。
SEQ ID No9涉及包含來自在狗、小鼠和人中有活性的犬瘟熱病毒的輔助T細胞表位(CDV-F；SEQ ID NO40)和來自HCMV pp65抗原的免疫顯性HLA A2-限制性CTL表位(即SEQ ID NO153)的合成肽，其中在其ε氨基基團位點提供脂質附著位點的內部賴氨酸殘基以粗體示出。在這個肽中，輔助T細胞表位和CTL表位之間有一額外內部賴氨酸殘基(SEQ ID NO9中的K18)。
SEQ ID No10涉及包含來自在狗、小鼠和人中有活性的犬瘟熱病毒的輔助T細胞表位(CDV-F；SEQ ID NO20)和來自Epstein-Barr病毒LMP1抗原的免疫顯性HLA A2-限制性CTL表位(即EBV LMP1；SEQ ID NO129)的合成肽，其中在其ε氨基基團位點提供脂質附著位點的內部賴氨酸殘基以粗體示出。在這個肽中，輔助T細胞表位和CTL表位之間有一額外內部賴氨酸殘基(SEQ ID NO10中的K18)。
SEQ ID No11涉及包含來自在狗、小鼠和人中有活性的犬瘟熱病毒的輔助T細胞表位(CDV-F；SEQ ID NO22)和來自EBV LMP1的免疫顯性HLA A2-限制性CTL表位(即；SEQ ID NO129)的合成肽，其中在其ε氨基基團位點提供脂質附著位點的內部賴氨酸殘基以粗體示出。在這個肽中，輔助T細胞表位和CTL表位之間有一額外內部賴氨酸殘基(SEQ ID NO11中的K18)。
SEQ ID No12涉及包含來自在狗、小鼠和人中有活性的犬瘟熱病毒的輔助T細胞表位(CDV-F；SEQ ID NO16)和來自EBV LMP1的免疫顯性HLA A2-限制性CTL表位(即；SEQ ID NO129)的合成肽，其中在其ε氨基基團位點提供脂質附著位點的內部賴氨酸殘基以粗體示出。在這個肽中，輔助T細胞表位和CTL表位之間有一額外內部賴氨酸殘基(SEQ ID NO12中的K18)。
SEQ ID No13涉及包含來自在狗、小鼠和人中有活性的犬瘟熱病毒的輔助T細胞表位(CDV-F；SEQ ID NO40)和來自EBV LMP1的免疫顯性HLA A2-限制性CTL表位(即；SEQ ID NO129)的合成肽，其中在其ε氨基基團位點提供脂質附著位點的內部賴氨酸殘基以粗體示出。在這個肽中，輔助T細胞表位和CTL表位之間有一額外內部賴氨酸殘基(SEQ ID NO13中的K18)。
SEQ ID No174涉及包含來自在狗、小鼠和人中有活性的犬瘟熱病毒的輔助T細胞表位(CDV-F；SEQ ID NO20)和來自卵清蛋白的免疫顯性CTL表位(即；SEQ ID NO173)的合成肽，其中在其ε氨基基團位點提供可能的脂質附著位點的內部賴氨酸殘基以粗體示出。優選地，脂質經SEQ ID NO174中的K18附著，其是插入在輔助T細胞表位和CTL表位之間的一額外內部賴氨酸殘基。
SEQ ID No175涉及包含來自在狗、小鼠和人中有活性的犬瘟熱病毒的輔助T細胞表位(CDV-F；SEQ ID NO20)和來自Listeriamonocytogenes抗原的免疫顯性CTL表位(即；SEQ ID NO172)的合成肽，其中在其ε氨基基團位點提供可能的脂質附著位點的內部賴氨酸殘基以粗體示出。優選地，脂質經SEQ ID NO175中的K18附著，其是插入在輔助T細胞表位和CTL表位之間的一額外內部賴氨酸殘基。
SEQ ID No177涉及包含來自在狗、小鼠和人中有活性的犬瘟熱病毒的輔助T細胞表位(CDV-F；SEQ ID NO20)和來自C型肝炎核心蛋白的免疫顯性CTL表位(SEQ ID NO176)的合成肽，其中在其ε氨基基團位點提供可能的脂質附著位點的內部賴氨酸殘基以粗體示出。優選地，脂質經SEQ ID NO177中的K18附著。
本領域技術人員能夠容易地合成除了本文舉例示出的之外的另外的多肽部分以用於本發明脂肽，這通過將SEQ ID No3-13，174，175或177中的任一輔助T細胞表位和/或CTL表位用另一種輔助T細胞表位或CTL表，如SEQ ID No14-52任一所示的一種輔助T細胞表位或SEQ ID No53-173或176任一所示的CTL表位取代而實現。另外，本領域技術人員從說明書的描述中，根據所尋求的免疫應答針對的靶物種和CTL表位，可以很容易地選擇合適的輔助T細胞表位和CTL組合。
包括SEQ ID No3-13，174，175和177所示的舉例多肽在內的本文描述的多肽部分的胺基酸序列可以根據本領域技術人員熟知的方法為特定目的進行修飾而不負面影響它們的免疫功能。例如，特定的肽殘基可以被衍生化或化學修飾以增強免疫應答或允許肽與其它物質特別是脂質偶聯。還可以在不幹擾肽的整體結構或CTL免疫原性的情況下改變肽中的特定胺基酸。這種改變因此被稱為「保守」變化，並似乎依賴於殘基的親水性或極性。側鏈大小和/或變好也是確定何種取代是保守取代的相關因素。
本領域技術人員很清楚，生物學等價蛋白或肽這一定義中固有的是可在分子的規定部分進行改變的數目是受限的，以及仍能產生具有可接受水平的等價生物活性。生物學功能等價肽因此被定義為其中的特異胺基酸可被改變的肽。特別的實施方案包括在肽的胺基酸序列中有一個、兩個、三個、四個、五個或更多個變異的變體。當然，根據本發明可以容易地製備和使用具有不同取代的一系列不同蛋白質/肽。
本領域技術人員很明白下述取代是可允許的保守取代(i)涉及精氨酸，賴氨酸和組氨酸的取代；(ii)涉及丙氨酸，甘氨酸和絲氨酸的取代；和(iii)涉及苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸的取代。摻入了這類保守取代的肽在本文中定義為生物學功能等價物。
本領域通常已知親水性胺基酸指數在賦予蛋白質的相互作用性生物學功能方面的重要性(KyteDoolittle，J.Mol.Biol.157，105-132，1982)。已知某些胺基酸可以被具有相似親水性指數或分值的其它胺基酸取代並且仍保持相似的生物學活性。胺基酸的親水性指數也可以在確定產生功能等價分子的保守取代中加以考慮。基於其疏水性和電荷特徵賦予了每一胺基酸的親水性指數，如下所示異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；穀氨酸(-3.5)；穀氨醯胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬醯胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。在基於親水性指數進行變化時，優選的是進行親水性指數在+/-0.2之間的胺基酸取代。更優選地，取代涉及親水性指數在+/-0.1、更優選在約+/-0.05內的胺基酸。
本領域還能理解的是，基於親水性、特別是由此產生的生物學功能等價蛋白質或肽用於如本文所示免疫學實施方案的哪一部分而有效進行類似胺基酸的取代(例如US Patent No.4,554,101)。如US Patent No.4,554,101所述，給胺基酸殘基賦予了下述親水性值精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0+/-0.1)；穀氨酸(+3.0+/-0.1)；絲氨酸(+0.3)；天冬醯胺(+0.2)；穀氨醯胺(+0.2)；甘氨酸(O)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5+/-0.1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。在基於相似親水性值進行變化時，優選的是取代相互親水性值在約+/-0.2內、更優選在約+/-0.1、甚至更優選在約+/-0.05內的胺基酸。
鑑別了適用作免疫原的肽之後，還能理解的是其它空間相似化合物也可配製在一起以模擬肽結構的關鍵部分。這種化合物可稱為肽模擬物，可以如本發明肽相同方式進行應用，因此也是功能等價物。產生結構功能等價物可以通過本領域技術人員已知的建模和化學設計技術來實現。應理解的是所有這種空間相似構建體均落入本發明範圍內。
確定修飾肽的「等價性」的另一種方法涉及功能途徑。例如，合適的變體肽包含如用確定MHC I類結合表位的預測算法所測定的那樣以顯著水平與MHC I類等位基因相互作用的胺基酸序列，所述算法如德國Tuebingen大學的SYFPEITHI算法，或美國政府國立衛生研究院的生物信息學和分子分析部門(BIMAS)的HLA肽結合預測程序的算法。這類變體序列也與APC(例如在PBMC部分中或血清的淡黃層部分中)表面上的MHC I類分子結合和/或穩定該分子，和/或誘導記憶CTL應答或引起IFN-K生成，和/或在標準細胞毒性分析中刺激CTL活性。本領域技術人員能容易地完成這類功能的測定。
脂肽的多肽部分能用標準技術容易地合成，如Merrifield合成方法(Merrifield，J Am Chem Soc，85，2149-2154，1963)和該技術的各種改進(參見例如Synthetic PeptidesA U ser′s Guide，Grant，ed.(1992)W.H.FreemanCo.，New York，pp.382；Jones(1994)The ChemicalSynthesis of Peptides，Clarendon Press，Oxford，pp.230.)；Barany，G.and Merrifield，R.B.(1979)in The Peptides(Gross，E.and Meienhofer，J.eds.)，vol.2，pp.1-284，Academic Press，New York；Wünsch，E.，ed.(1974)Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Methoden derOrganischen Chemie(Müler，E.，ed.)，vol.15，4th edn.，Parts 1 and 2，Thieme，Stuttgart；Bodanszky，M.(1984)Principles of PeptideSynthesis，Springer-Verlag，Heidelberg；Bodanszky，M.Bodanszky，A.(1984)The Practice of Peptide Synthesis，Springer-Verlag，Heidelberg；Bodanszky，M.(1985)lnt.J.Peptide Protein Res.25，449-474。
脂質部分可包含任何C2-C30飽和的、單不飽和的或多不飽和的線性或支鏈脂醯基團，優選的是選自棕櫚醯，肉豆蔻醯，硬脂醯，月桂醯，辛醯和癸醯的脂肪酸基團。脂胺基酸是本發明特別優選的脂質部分。本文所用術語「脂胺基酸」是指包含一個或兩個或三個或更多個與胺基酸殘基如半胱氨酸或絲氨酸、賴氨酸或其類似物共價附著的脂質的分子。在一個特別優選的實施方案中，脂胺基酸包含半胱氨酸和任選地一個或兩個或更多個絲氨酸殘基。
脂質部分的結構對於所產生的脂肽的活性不是關鍵的，並且如本文所示，可以使用棕櫚酸和/或膽固醇和/或Pam1Cys和/或Pam2Cys和/或Pam3Cys。本發明清楚地包括用於脂肽中的其它脂質部分，如月桂酸、硬脂酸或辛酸，而不喪失免疫原性。因此，除非特別指明或者上下文需要，否則本發明不受脂質部分結構的限制。
類似地，除非特別指明或者上下文需要，否則本發明不限於單個脂質部分。很明顯包括多個脂質部分添加至肽部分，例如添加至輔助T細胞表位內的一個位置和輔助T細胞表位和B細胞表位之間的一個位置。
脂質部分優選地是具有通式(VII)的化合物 其中(i)X選自硫、氧、二硫鍵(-S-S-)、亞甲基、和氨基(-NH-)；(ii)m是值為1或2的整數；(iii)n是從0到5的一個整數；(iv)R1選自氫、羰基(-CO-)和R』-CO-，其中R』選自具有7-25個碳原子的烷基、具有7-25個碳原子的鏈烯基和具有7-25個碳原子的炔基，其中所述烷基、鏈烯基或炔基任選地由一個羥基、氨基、氧代、醯基或環烷基基團取代；(v)R2選自R』-CO-O-，R』-O-，R』-O-CO-，R』-NH-CO-，和R』-CO-NH-，其中R』選自具有7-25個碳原子的烷基、具有7-25個碳原子的鏈烯基和具有7-25個碳原子的炔基，其中所述烷基、鏈烯基或炔基任選地由一個羥基、氨基、氧代、醯基或環烷基基團取代；和(vi)R3選自R』-CO-O-，R』-O-，R』-O-CO-，R』NH-CO-，和R』-CO-NH-，其中R』選自具有7-25個碳原子的烷基、具有7-25個碳原子的鏈烯基、具有7-25個碳原子的炔基，其中所述烷基、鏈烯基或炔基任選地由一個羥基、氨基、氧代、醯基或環烷基基團取代以及其中R1，R2和R3各自相同或不同。
根據取代基，通式V的脂質部分可以是手性分子，其中直接或間接共價結合於R1和R2的碳原子成不對稱右旋或左旋(即R或S)構型。
優選地，X是硫；m和n均是1；R1選自氫和R』-CO-，其中R』是具有7-25個碳原子的烷基；R2和R3選自R』-CO-O-，R』-O-，R』-O-CO-，R』-NH-CO-，和R』-CO-NH-，其中R』是具有7-25個碳原子的烷基。
優選地，R』選自如下一組棕櫚醯，肉豆蔻醯，硬脂醯和癸醯。更優選地，R』是棕櫚醯。
所述脂質部分中的每個整數可以相同或不同。
在一個特別優選的實施方案中，X是硫；m和n均是1；R1是氫或R』-CO-，其中R』是棕櫚醯；R2和R3各自是R』-CO-O-，其中R』是棕櫚醯。這些特別優選的化合物如上述式(I)和式(II)所示。
脂質部分也可以具有下述通式(VIII) 其中(i)R4選自如下一組(i)一種由約7至約25個碳原子組成的α醯基脂肪酸殘基；(ii)一種α-烷基-β-羥基脂肪酸殘基；(iii)一種α-烷基-β-羥基脂肪酸殘基的β-羥基酯，其中所述酯基優選地是包含多於8個碳原子的直連或支鏈；以及(iv)一種脂胺基酸殘基；和(ii)R5是氫或一種胺基酸殘基的側鏈。
優選地，R4由約10到約20個碳原子組成，更優選地由約14到約18個碳原子組成。
任選地，當R4是一個脂胺基酸殘基時，R4和R5的側鏈可以形成共價鍵。例如，當R4包含選自由賴氨酸、鳥氨酸、穀氨酸、天冬氨酸、賴氨酸衍生物、鳥氨酸衍生物、穀氨酸衍生物、天冬氨酸衍生物組成的一組的一個胺基酸時，該胺基酸或衍生物的側鏈通過醯胺或脂鍵附著於R5。
優選地，通式VIII中的結構是選自如下一組的一種脂質部分N，N′-二醯基賴氨酸；N，N′-二醯基鳥氨酸；穀氨酸的二(單烷基)醯胺或酯；天冬氨酸的二(單烷基)醯胺或酯；絲氨酸、高絲氨酸或蘇氨酸的N，O-二醯基衍生物和半胱氨酸或高半胱氨酸的N，S-二醯基衍生物。
兩親性分子，特別是疏水性不超過Pam3Cys(式(I))的疏水性的兩親性分子也是優選的。
式(I)、式(II)、式(VI)或式(VIII)的脂質部分在合成過程中或合成後通過添加一或多個間隔分子、優選地包含碳的間隔分子、更優選地一或多個胺基酸殘基而進一步修飾。這些分子在常規縮合、添加、取代或氧化反應中經末端羧基添加至脂質結構。這類間隔分子的作用是分隔脂質部分和多肽部分以及增加脂肽產物的免疫原性。
絲氨酸二聚體、三聚體、四聚體等特別優選用於此目的。
優選地，這種間隔物包括末端保護的胺基酸殘基以便於稍後將修飾的脂胺基酸與多肽綴合。
根據這一實施方案產生的修飾脂胺基酸的例子如式(III)和式(IV)所示，它們容易地通過添加一個絲氨酸同二聚體而分別衍生自式(I)和式(II)。如本文所示，式(I)的Pam3Cys或式(II)的Pam2Cys方便地作為用於此目的的式(III)的脂胺基酸Pam3Cys-Ser-Ser或式(IV)的脂胺基酸Pam2Cys-Ser-Ser而合成。
式(III) 式(IV) 作為添加一間隔物至脂質部分的替代方案，間隔物可以被添加至多肽部分中的內部賴氨酸殘基的ε氨基基團或賴氨酸類似物的末端側鏈基團，間隔物作為短肽如絲氨酸同二聚體、同三聚體、同四聚體等而添加，或者通過依次添加胺基酸殘基由此產生分支的多肽鏈。這一途徑利用了內部賴氨酸或賴氨酸類似物上的末端側鏈基團的修飾性質而實現間隔物特異性添加。很明顯，為了避免依次添加間隔物，間隔物的末端胺基酸殘基應優選地被保護，從而脫保護作用可便於脂質部分綴合至分支多肽。
或者，間隔物可以通過常規親核取代反應被添加至多肽的未修飾的ε氨基基團。但是，如果多肽具有包含單個內部賴氨酸殘基的胺基酸序列和封閉的N-末端，則優選採用這一途徑。
脂質部分通過常規合成手段而製備，這些常規合成手段例如為美國專利5,700,910和6,024,964所述的方法，或者，如Wiesmuller et al.，Hoppe Seylers Zur Physiol.Chem.364，593(1983)，Zeng et al.，J.Pept.Sci 2，66(1996)，Jones et al.，Xenobiotica 5，155(1975)，或Metzger et al.，Int.J.Pept.Protein Res.38，545(1991)所述的方法。本領域技術人員能夠很容易地修改這些方法以實現用於綴合至多肽的期望脂質的合成。
不同脂質的組合也可用於本發明脂肽中。例如，含有一個或兩個肉豆蔻醯的脂質或脂胺基酸經內部賴氨酸或賴氨酸類似物殘基附著於多肽部分，其任選地通過一個間隔物與多肽分隔，並且有一個或兩個含棕櫚醯脂質或脂胺基酸分子附著於羧基末端賴氨酸殘基。其它的組合沒有被排除在外。
本發明的脂肽可為了診斷目的而容易地加以修飾。例如，通過添加天然或合成半抗原、抗生素、激素、類固醇、核苷、核苷酸、核酸、酶、酶底物、酶抑制劑、生物素、抗生物素蛋白、聚乙二醇、肽性多肽部分(例如tuftsin，聚賴氨酸)、螢光標記(例如FITC、RITC、丹磺醯、魯米諾或香豆素)、生物發光標記、自旋標記、生物鹼、生物胺、維生素、毒素(例如地高辛、鬼筆環肽、鵝膏毒環肽、河豚毒素)或複合物形成劑而進行修飾。
如本文所示，提供了能夠誘導CTL應答的高免疫原性脂肽，所述脂肽包含經位於CD4+輔助T細胞表位和CD8+CTL表位之間的賴氨酸殘基的ε氨基基團綴合的式(I)的Pam3Cys或式(II)的Pam2Cys。
脂肽的製備本發明的第二方面提供了生產脂肽的方法，包括
(i)產生一種多肽，該多肽包含一種胺基酸序列，該胺基酸序列包含(a)一種輔助T細胞(Th)表位的胺基酸序列和一種CTL表位的胺基酸序列，其中所述這兩個胺基酸序列是不同的；和(b)一或多個內部賴氨酸殘基或內部賴氨酸類似物殘基；以及(ii)將所述一或多個脂質部分的每一個直接或間接共價附著於所述一或多個內部賴氨酸殘基的ε氨基基團或所述一或多個內部賴氨酸類似物殘基的末端側鏈基團上，以產生具有附著於所述內部賴氨酸殘基的ε氨基基團的脂質部分或具有附著於所述內部賴氨酸類似物殘基的末端側鏈基團的脂質部分的脂肽。
優選地，所述方法進一步包括產生脂質部分。
本文所引述的常規化學合成是產生多肽部分和脂質部分的優選手段。
優選地，內部賴氨酸或賴氨酸類似物通過從末端側鏈基團選擇性除去封閉基團(例如Mtt)而使得在該位置可以添加一個胺基酸殘基、間隔物或脂質部分，包括脂胺基酸。
為了將脂質附著於多肽，方便的是以肽合成領域已知的方式保護多肽的官能團，以保證在這些基團不以顯著的反應速率發生不希望的反應。
通過已知的偶聯方法，多肽在固相或可溶載體上如聚合物(例如Merrifield樹脂)合成，並且被製備成可供與間隔物、胺基酸或脂質綴合。例如，賴氨酸或賴氨酸類似物的末端側鏈基團(例如內部賴氨酸的ε氨基基團)被許多保護基中的一種加以保護。使用封閉基團(也稱為保護基或掩蔽基團)保護具有參與偶聯反應的活化羧基的胺基酸的氨基，或者保護具有參與偶聯反應的醯化氨基的胺基酸的羧基。為了發生偶聯，封閉基團必須被除去而不破壞肽鍵或附著於肽的另一部分的任何保護基。
為進行固相肽合成，在除去生長的肽鏈的氨基封閉基團和重複胺基酸偶聯所需的重複處理下穩定的封閉基團用於保護胺基酸側鏈。另外，保護肽的C-末端的肽-樹脂固定必須在整個合成過程中被保護，直至需要從樹脂上裂解下來。因此，通過小心選擇正交保護的α-胺基酸，在生長的肽仍附著在樹脂上時將脂質和/或胺基酸加入到生長的肽的所需位置。
優選的氨基封閉基團是可容易除去的，但足夠穩定從而在偶聯反應和其它操作如修飾側鏈基團的條件下能夠保持。優選的胺基酸封閉基團選自如下一組(i)苄氧基羰基基團(Z或羧苯氧基)，其可以容易地通過在室溫和常壓下催化氫化或者用液氨中的鈉和乙酸中的氫溴酸而除去；(ii)叔丁氧羰基基團(Boc)，其用叔丁氧羰基疊氮或二叔丁基二碳酸酯導入，並用溫和酸如三氟乙酸(50％T FA於二氯甲烷中)或在乙酸/二噁烷/乙酸乙酯中的HCl除去；(iii)9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)，其在溫和鹼性、非水解條件下如用伯胺或仲胺(例如20％哌啶於二甲基甲醯胺中)裂解；(iv)2-(4-聯苯基)丙基(2)氧基羰基基團(Bpoc)；(v)2-硝基苯基亞磺醯(sulfenyl)(Nps)；和(vi)dithia-succionyl基團(Dts)。
側鏈保護基將根據形成正在合成的肽的胺基酸從功能側鏈而變化。側鏈保護基通常基於Bzl基團或tBu基團。側鏈中具有醇或羧酸的胺基酸作為Bzl醚、Bzl酯、cHex酯、tBu醚或tBu酯被保護。Fmoc胺基酸的側鏈保護需要理想地為鹼穩定和耐弱酸(TFA)的封閉基團。例如，賴氨酸的ε氨基基團用Mtt保護(例如Fmoc-賴氨酸(Mtt)-OH)。或者，如果需要增加的穩定性，則滷化苄基衍生物如CIZ用於保護賴氨酸側鏈。胱氨酸的硫醇基團、組氨酸的咪唑或精氨酸的胍基通常需要特殊的保護。用於肽合成的許多不同保護基已有描述(參見The Peptides，Gross et al.eds.，Vol.3，Academic Press，New York，1981)。
兩個最廣泛應用的保護策略是Boc/Bzl和Fmoc/tBu策略。在Boc/Bzl中，Boc用於胺基酸保護，各種胺基酸的側鏈使用基於Bzl或cHex的保護基進行保護。Boc在催化氫化條件下是穩定的，因而與Z基團正交使用以保護許多側鏈基團。在F moc/tBu中，Fmoc用於氨基保護，側鏈用基於tBu的保護基進行保護。
肽通過本發明熟知方法脂化。標準的縮合、添加、取代或氧化(例如在賴氨酸或賴氨酸類似物的末端氨基基團與要加入的胺基酸或肽或脂胺基酸之間形成內部二硫鍵或醯胺鍵)反應使脂質添加到多肽上。
在一替代方案，用作免疫原的本發明的肽通過化學選擇性連接或活性綴合或肟化學產生。這些方法是本領域熟知的，能夠使個體肽組分通過化學或重組方法產生，隨後以合適的構型或構象或次序化學選擇性連接(例如Nardin et al.，Vaccine 16，590(1998)；Nardin et al.，J Immunol.166，481(2001)；Rose et al.，Mol.Immunol.32，1031(1995)；Rose etal.，Bioconjug.Chem 7，552(1996)；和Zeng et al.，Vaccine 18，1031(2000)，這些文獻以其全文併入作參考)。
脂肽配製品脂肽可以方便地配製在藥物學可接受的賦形劑或稀釋劑中，如水性溶劑、非水溶劑、無毒賦形劑如鹽、防腐劑、緩衝劑等。非水溶劑的例子為丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射有機酯如油酸乙酯。水性溶劑包括水、醇/水溶液、鹽水溶液、腸胃外載體如氯化鈉、Ringer′s葡聚糖等。防腐劑包括抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體。藥物組合物各種組分的pH和精確濃度根據本領域常識進行調整。
儘管通常是不需要的，但是本發明也包含添加外源佐劑至脂肽配製品中。這種外源佐劑包括所有可接受的免疫刺激化合物如細胞因子、毒素或合成組合物。佐劑的例子包括IL-1，IL-2，BCG，氫氧化鋁，N-乙醯-胞壁醯-L-蘇氨醯-D-異穀氨醯胺(thur-MDP)，N-乙醯-正胞壁醯-L-丙氨醯-D-異穀氨醯胺(CGP 11637，稱作nor-MDP)，N-乙醯胞壁醯-L-丙氨醯-D-異穀氨醯胺-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕櫚醯-sn-甘油-3-羥基磷醯氧基)-乙胺(CGP)1983A，稱作MTP-PE)，脂質A，MPL和RIBI，其含有在2％鯊烯/Tween 80乳液中的提取自細菌的三種成分，即單磷醯脂質A、海藻糖二黴菌酸酯和細胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。
希望的是共同給予生物應答修飾劑(BRM)和脂肽，以負調節抑制T細胞活性。BRM的例子包括但不限於Cimetidine(CIM；1200mg/d)(Smith/Kline，PA，USA)；Indomethacin(IND；150mg/d)(Lederle，NJ，USA)；或小劑量環磷醯胺(CYP；75，150或300mg/m.sup.2)(Johnson/Mead，NJ，USA)。
脂肽在免疫接種中的應用本發明的新脂肽在一些關鍵方面與已知的CTL表位的脂肽綴合物不同，這表現在脂質部分通過一內部賴氨酸或賴氨酸類似物殘基的末端側鏈基團進行綴合，由此無需給予額外佐劑即可增強T細胞應答。因此，本發明脂肽的一個特別用途是下述領域體內或離體(ex vivo)刺激T細胞應答、合成疫苗製備物、採用T細胞的診斷方法以及獸醫和人類的免疫治療。
更特別地，本發明的脂肽當給予動物個體時能增強抗CTL表位部分的CTL記憶應答，且無需佐劑來實現相似水平的CTL激活。另外，在給予疫苗後還觀察到樹突細胞成熟增加和其它生物學作用，包括產生IFN-γ的CD8+細胞的誘導以及病毒、細菌和腫瘤細胞清除。
因此，本發明的另一方面提供了在個體中增強抗CTL表位所來源的生物的細胞介導免疫的方法，包括在足以激活所述個體的CTL和/或CTL前體和條件下給予本發明的脂肽或所述脂肽的衍生物或功能等價變體或包含所述脂肽或變體或衍生物的疫苗組合物一段時間。
「CTL前體」是指原初T細胞(即在其表面表達一或多種T細胞受體並能增殖和分化成記憶T細胞或效應T細胞的T細胞)。
優選地，脂肽或疫苗預防性給予未攜帶寄生蟲、細菌或病毒所致潛伏或活動感染的個體或者患癌個體，或者治療性給予攜帶寄生蟲、細菌或病毒所致潛伏或活動感染的個體或者患癌個體。
在本文中，術語「激活」是指T細胞識別和溶解攜帶衍生CTL表位的抗原的細胞的能力被增強，或者T細胞識別所述抗原的T細胞表位的能力被增強，這種增強可以是瞬時的或持續的。術語「激活」也包括在寄生蟲或細菌或病毒激活潛伏感染後、或在用寄生蟲或細菌或病毒再感染後、或在用本發明脂肽或組合物免疫接種先前被感染過的個體後，對T細胞群的再激活。
本領域技術人員能認識到最佳T細胞激活需要T細胞受體(TcR)對抗原/MHC的關連識別，以及涉及將T細胞上的各種細胞表面分子與抗原呈遞細胞(APC)上的細胞表面分子連接起來的共刺激。共刺激作用CD28/B7，C D40L/CD40和O×40/O×40L對於T細胞激活是優選的，但不是必需的。也可進行其它共刺激途徑。
為了測定CTL或前體CTL的激活或表位特異性活性水平，可以使用分析樣本中CD8+T細胞數的標準方法。優選的分析方法包括細胞毒性分析，如標準鉻釋放分析、IFN-γ生成分析如ELISPOT分析。這些分析方法在所附實施例中有詳細描述。
MHC I類四聚體分子也可以用於特別是CD8+T細胞的CTL表位特異性定量(AItman et al.，Science 274，94-96，1996；Ogg et al.，CurrOpin Immunol.10，393-396，1998)。為產生四聚體，MHC分子例如HLA A2重鏈的羧基末端與一種特異性肽表位或多表位結合，並對其處理以便形成結合有合適的報導分子的四聚體複合物，所述合適的報導分子優選為一種螢光染料如異硫氰酸螢光素(FITC)、藻紅蛋白、藻藍蛋白或別藻藍蛋白。四聚體形成例如通過產生作為生物素化分子的MHC-肽融合蛋白然後將生物素化MHC-肽與已用螢光團標記的去糖基化抗生物素蛋白以摩爾比4∶1混合而實現。所產生的四聚體與來自一個體的一亞類CD8+T細胞(例如在全血或PBMC樣品中)上的獨特類別的CD8+T細胞受體(TcR)結合，所述個體為所述肽HLA限制性的個體。對於體外T細胞激活或擴充沒有限制。在結合併洗滌T細胞以除去未結合的或非特異性結合的四聚體之後，特異性與HLA-肽四聚體結合的CD8+細胞數可以容易地通過標準流式細胞計數方法定量，例如使用FACSCalibur流式細胞儀(Becton Dickinson)。四聚體也可以附著於順磁性或磁性珠以促進除去非特異性結合的報導分子以及促進細胞分選。這類顆粒可從商業來源獲得(例如Beckman C oulter，Inc.，S an Diego，CA，USA)。四聚體染色不殺死標記的細胞，因此保持了細胞的完整性以用於進一步分析。MHC四聚體使得能實現對特異性細胞免疫應答的精確定量分析，即使對於發生率小於1％CD8+T細胞的極端罕見事件也能實現精確定量分析(Bodinier et al.，Nature Med.6，707-710，2000；Ogg et al.，Curr Opin Immunol.10，393-396，1998)。
樣品中CD8+細胞的總數也可以容易地通過將樣品與綴合有與檢測四聚體所用不同的報導分子的抗CD8單克隆抗體保溫而測定。這類抗體是可容易獲得的(例如Becton Dickinson)。來自所用兩個報導分子的信號的相對強度使得可以定量CD8+細胞的總數和四聚體結合T細胞的總數，以及確定與四聚體結合的總T細胞的比例。
由於CD4+輔助T細胞在CMI中作為細胞因子如IL-2的生產者從而促進CD8+T細胞的擴充或者與APC相互作用以使其更易激活CD8+T細胞，因此細胞因子生成是T細胞激活的一個間接測量指標。因此，也可以用細胞因子分析來確定人類個體中CTL或前體CTL的激活或者細胞介導免疫的水平。在這種分析中，檢測細胞因子如IL-2或細胞因子的生成作為表位特異性活性T細胞的指示。
優選地，用於確定細胞因子水平或細胞因子生成的細胞因子分析形式基本上如Petrovsky and Harrison，J.Immunol.Methods 186，37-46，1995所述，該分析文獻引入本文作參考。
優選地，細胞因子分析在全血或PBMC或淡黃層上進行。
優選地，脂肽或衍生物或變體或疫苗組合物在足以引起或增強CD8+T細胞擴充的條件下被給予一段時間。
更優選地，脂肽或衍生物或變體或疫苗組合物在足以增強個體中細胞介導免疫(CMI)的條件下被給予一段時間。
術語「CMI」是指激活的並克隆擴充的CTL是MHC-限制性的並特異於一個CTL表位。CTL是基於抗原特異性和MHC限制性而分類(即非特異性CTL和抗原特異性、MHC限制性CTL)。非特異性CTL由各種細胞類型組成，包括NK細胞，其可以在免疫應答非常早期起作用以降低病原體負荷，而此時抗原特異性應答仍在建立過程中。相反，MHC限制性CTL晚於非特異性CTL達到最佳活性，通常在抗體產生之前。抗原特異性CTL抑制或降低病原體的擴散並優選地終止感染。
CTL激活、克隆擴充或CMI可以系統性誘導或誘導限於局部。在限於局部作用的情況下，優選的是利用配製為適合給予該局部的疫苗。另一方面，對於在個體中系統性誘導CTL激活、擴充或CMI沒有這種嚴格限制。
引起CTL激活、克隆擴充或CMI的待給藥脂肽單獨或在疫苗組合物中的有效量將根據免疫原性表位的性質、給藥途徑、免疫個體的體重、年齡、性別或總的健康狀況以及所需要的CTL應答的性質而變化。所有這類變量均可通過本領域熟知手段憑經驗確定。
任選地與任何合適的或期望的載體、佐劑、BRM或藥物學可接受的賦形劑配製後的脂肽方便地以可注射組合物形式給藥。注射可以是鼻內、肌肉內、皮下、靜脈內、真皮內、腹膜內或其它已知途徑。對於靜脈內注射，希望的是包括一或多種液體和營養補劑。
使用動物模型建立給藥最佳劑量和給藥優選途徑，例如用包含脂肽的配製品注射小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、狗、馬、牛、山羊或豬，隨後用任一常規分析監測CTL免疫應答。
為了測試對本發明的包含HLA A2限制性CTL表位的脂肽或包含所述脂肽的疫苗組合物的體內應答，特別優選的是使用攜帶由人HLAA*0201等位基因的α1和α2結構域及小鼠H-2KbI類分子的α3結構域組成的嵌合人-小鼠I類主要組織相容性複合物(MHC)基因座的HLAA2/Kb轉基因小鼠(Vitiello et al.，J.Exp.Med.173，1007，1991)。
不受任何理論或作用模式的限制，我們相信脂肽的生物學作用通過其刺激和使樹突細胞成熟的能力而表現出。是樹突細胞隨後激活引流淋巴結中的CD4+和CD8+T細胞。為此，我們不會也不可能如設想的那樣直接激活T細胞。因此以下段落被相應地修改以適應樹突細胞激活的概念。
在一相關的實施方案中，本發明提供了一種增強個體的細胞介導免疫的方法，所述方法包括在足以使樹突細胞成熟的條件下，將得自一個體的細胞、優選為樹突細胞與本發明的免疫學活性脂肽或其衍生物或變體或者包含所述脂肽或衍生物或變體的疫苗組合物ex vivo接觸一段時間。所述樹突細胞隨後能賦予T細胞表位特異性激活。
在一個優選的實施方案中，本發明提供了一種增強個體的細胞介導免疫的方法，所述方法包括(i)在足以使樹突細胞成熟的條件下，將得自一個體的樹突細胞與本發明的免疫學活性脂肽或其衍生物或變體或者包含所述脂肽或衍生物或變體的疫苗組合物ex vivo接觸一段時間；和(ii)將激活的樹突細胞自體導入所述個體或者同基因地導入另一個個體，以便發生T細胞激活。
T細胞可以是CTL或CTL前體細胞。
用於獲得樹突細胞的個體可以是被治療的個體或者是不同的個體。被治療的個體可以是攜帶由病原體如寄生蟲、細菌或病毒所致的潛伏或活動感染的任何個體，或者是需要獲得抗這種病原體的免疫接種或希望獲得抗這種免疫接種的個體。也可以對被治療的個體攜帶的腫瘤進行治療。
術語「表位特異性活性」是指如上所述使得T細胞能夠被激活(即T細胞將識別和溶解攜帶一種衍生所述CTL表位的病原體的細胞，或者能以瞬時或持續方式識別一種病原體的抗原的T細胞表位)。因此，特別優選的是T細胞為一種CTL前體，其通過本發明的方法可以使得能識別並溶解攜帶病原體的細胞或者能以瞬時或持續方式識別病原體抗原的T細胞表位。
對這種ex vivo應用，優選地，樹突細胞包含在得自個體的生物學樣品中，如血液、PBMC或衍生自其中的淡黃層部分。
本發明的另一方面提供了在未感染的個體中增強或賦予抗一種病原體的免疫性的方法，包括在足以提供抗病原體未來感染的免疫記憶的條件下，將本發明的免疫活性脂肽或其衍生物或變體或者包含所述脂肽或衍生物或變體的疫苗組合物給予所述個體一段時間。與本文所述的其它實施方案一樣，病原體可以是寄生蟲、病毒或細菌，並且優選是本文上述的已鑑別了CTL表位的寄生蟲、病毒或細菌。
在相關的實施方案中，本發明提供了在未感染的個體中增強或賦予抗一種病原體的免疫性的方法，包括在足以賦予T細胞以表位特異性活性的條件下，將得自所述個體的樹突細胞與本發明的免疫活性脂肽或其衍生物或變體或者包含所述脂肽或衍生物或變體的疫苗組合物體外(exvivo)接觸一段時間。
因此，本發明的這一方面提供了給予個體預防性疫苗的方法，其中所述疫苗的活性成分(即本發明的脂肽)在未感染的個體中誘導了經記憶T細胞產生的免疫記憶。本文描述的用於增強個體中細胞介導免疫的接種方案的優選實施方案經過必要的修正適用於在個體中誘導抗病原體的免疫記憶。
本發明進一步參照下述非限制性實施例和附圖進行描述。本文提供的在小鼠中的實施例是人類中同等疾病的可接受的模型，並且本領域技術人員無需過多實驗即可容易地將本文描述的關於這一模型的發現延伸至人類疾病。
實施例1材料和方法化學品除非另有說明，化學品均是分析級或等價級。N，N』-二甲基甲醯胺(DMF)，哌啶，三氟乙酸(TFA)，O′苯並三唑-N，N，N′，N′-四甲基六氟磷酸鹽(tetramethyluronium hexafluorophosphate)(HBTU)，1-羥基苯並三唑(HOBt)和二異丙基乙胺(DIPEA)以及二異丙基碳二亞胺(DIPCDI)得自Auspep Pty.Ltd.，Melbourne，Australia和Sigma-Aldrich Pty.Ltd.，Castle Hill，Australia。O′苯並三唑-N，N，N′，N′-四甲基四氟硼酸鹽(tetramethyluronium tetrafluoroborate)(TBTU)得自Bachem，(Bachem A G，S witzerland)。二氯甲烷(DCM)和二乙醚得自Merck P tyLtd.(Kilsyth，Australia)。苯酚和三異丙基矽烷(TIPS)得自Aldrich(Milwaulke，WI)，三硝基苄基磺酸(TNBSA)和二氨基吡啶(DMAP)得自Fluka；1，8-二氮雜雙環[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)得自Sigma，棕櫚酸得自Fluka。
病毒本研究使用的A型流感病毒是稱為Mem 71的H3N1亞型病毒，其來自A/Memphis/l/71(H3N2)×A/Bellamy/42(HIN1)的遺傳重配。在10日齡含胚雞蛋的尿囊腔中培養病毒2天。含病毒的尿囊液等份儲存在-70℃。通過分析在Madin-Darby犬腎(MDCK)細胞單層(Tannocketal，Infect.Immun.43，457-462，1984)中的噬斑形成獲得感染性病毒效價並表示為PFU/ml。
細菌Listeria monocytogenes EGD在馬血瓊脂(HBA)平板上於37℃過夜培養。用無菌PBS將細菌從平板上洗下並將濃度調整至5×103Listeria細胞/ml。Balb/c小鼠用1×103Listeria細胞進行靜脈內感染。通過將10倍系列稀釋液在HBA平板上鋪板檢測劑量。
肽合成包含流感病毒CTL表位的肽合成了一組免疫原，這些免疫原摻入了代表均來自流感病毒的針對CD8+ T細胞的最小決定簇和/或針對CD4+ T細胞的決定簇的肽。具有序列TYQRTRALV(一種存在於PR8病毒的NP中的CTL決定簇；SEQ ID NO2)的肽NP(147-155)是由BALB/c小鼠識別的主要CD8+T細胞決定簇並在所有A型流感病毒株中是共有的(Bodmer et al，Cell52，253-258，1988；和Sherman et al，J.Exp.Med.175，1221-1226，1992)。具有序列ALNNRFQIKGVELKS(SEQ ID NO1)的肽HA2(166-180)是存在於Mem 71流感病毒血凝素的HA2鏈內的CD4+輔助T細胞決定簇，其激發與所有H3亞型病毒交叉反應的CD4+ T細胞(Jackson et al，Virology 198，153-170，1994)。
包含L.monocytogenes CTL表位的肽合成了一種免疫原性肽，其摻入了具有來自L.monocytogenes的胺基酸序列GYKDGNEYI(literialysin蛋白的殘基91-99)的最小CTL表位(即SEQ ID NO172)和來自CDV-F的一個輔助T細胞表位(SEQ IDNO20)。
包含由B16-OVA腫瘤細胞系表達的CTL表位的肽合成了一種免疫原性肽，其摻入了具有胺基酸序列SIINFEKL(SEQ ID NO173)的一個CTL表位和來自CDV-F的一個輔助T細胞表位(SEQ ID NO20)。
包含來自C型肝炎病毒核心蛋白的一個CTL表位的肽合成了一種免疫原性肽，其摻入了具有胺基酸序列DLMGYIPLV(SEQ ID NO176)的一個CTL表位和來自CDV-F的一個輔助T細胞表位(SEQ ID NO20)。
一般程序用Fmoc化學經常規固相方法學組裝合成免疫原。用於肽合成的一般程序如Jackson et al.，Vaccine 18，355(1999)所述。為了實現在CD4+輔助T細胞表位和CTL表位之間的脂質附著，Fmoc-賴氨酸(Mtt)-OH插入到兩個表位之間的位於樹脂結合肽的大致中心的一個點。肽合成完成後，通過用在二氯甲烷中的1％T FA持續流動洗滌30-45分鐘而除去Mtt基團。
式(I)的脂質部分的合成根據Weismuller et al.，Hoppe Seylers Z Physiol Chem 364，593(1983)所述並根據Zeng et al.，J Pept Sci 2，66(1996)所述方法改進的方法製備Pam3Cys。根據Zeng et al.(supra)的程序將脂胺基酸Pam3Cys偶聯至賴氨酸的暴露的ε氨基基團。簡而言之，將2倍過量的Pam3Cys，T BTU和H OBt溶解於DCM中並加入3倍過量的DIPEA。然後將這一溶液加到樹脂結合肽以產生脂肽。
式(II)的脂質部分的合成Pam2Cys合成適應於Jones et al.，Xenobiotica 5，155(1975)andMetzger et al.，Int J Pept Protein Res 38，545(1991)先前描述的方法，例外之處是使用3-溴-丙-1，2-二醇代替3-氯-丙-1，2-二醇，並且使用離心二非過濾回收產物。
脂肽的合成本研究製備的脂肽具有圖1所示的一般結構。包括在各種脂肽中的肽部分的胺基酸序列如圖2所示。根據Jones et al.，Xenobiotica 5，155(1975)和Metzger et al.，Int J Pept Protein Res 38，545(1991)等人的方法將Pam2Cys與肽偶聯，但方法有如下修改
I.S-(2，3-二羥基丙基)半胱氨酸的合成將三乙胺(6g，8.2ml，58mmole)加入到水中的鹽酸L-半胱氨酸(3g，19mmole)和3-溴-丙-1，2-二醇(4.2g，2.36ml，27mmole)中，將這一均勻溶液在室溫保持3天。將溶液在40℃真空乾燥成白色殘渣，殘渣用甲醇(100ml)煮沸，離心並將殘渣溶於水(5ml)中。將這一水溶液加入丙酮(300ml)中，離心分離沉澱。用丙酮經幾次從水中沉澱而純化所述沉澱，得到白色無定形粉末狀S-(2，3-二羥基丙基)半胱氨酸(2.4g，12.3mmol，64.7％)。
II.N-芴基甲氧基羰基-S-(2，3-二羥基丙基)半胱氨酸(Fmoc-Dhc-OH)的合成將S-(2，3-二羥基丙基)半胱氨酸(2.45g，12.6mmole)溶解於9％碳酸鈉(20ml)中。加入在乙腈(20ml)中的芴基甲氧基羰基-N-羥基琥珀醯亞胺(3.45g，10.5mmole)溶液，攪拌混合物2小時，然後用水(240ml)稀釋，並用二乙醚萃取(25ml×3)。用濃鹽酸酸化水相至pH2，然後用乙酸乙酯萃取(70ml×3)。萃取物用水(50ml×2)和飽和氯化鈉溶液(50ml×2)洗滌，在硫酸鎂上乾燥，並蒸發至乾燥。用乙醚和乙酸乙酯在-20℃重結晶，獲得無色粉末(2.8g，6.7mmole，63.8％)。
III.Fmoc-Dhc-OH偶聯至樹脂結合的肽上在DCM和DMF(1∶1，v/v，3ml)中，用HOBt(36mg，0.24mmole)和DICI(37ul，0.24mmol)在0℃激活Fmoc-Dhc-OH(100mg，0.24mmole)5min。然後將混合物加入到含有樹脂結合的肽(0.04mmole，0.25g氨基肽樹脂)的燒瓶中。振蕩2小時後，過濾除去溶液，樹脂用DCM和DMF洗滌(每種各3×30ml)。用TNBSA測試檢測反應是否完全。如果需要進行雙重偶聯。
IV.Fmoc-Dhc-肽樹脂的兩個羥基基團的棕櫚醯化將棕櫚酸(204mg，0.8mmole)，DICI(154ul，1mmole)和DMAP(9.76mg，0.08mmole)溶解在2ml DCM和1ml of DMF中。將樹脂結合的Fmoc-Dhc-肽樹脂(0.04mmole，0.25g)懸浮於這一溶液中，並在室溫搖動16小時。過濾除去溶液，然後用DCM和DMF充分洗樹脂以除去任何殘留的脲。用2.5％DBU(2×5min)除去Fmoc基團。
用試劑B(88％TFA，5％苯酚，2％TIPS，5％水)處理2小時從固相支持物上裂解下全部樹脂結合的肽構建體，如Zeng et al.，Vaccine18，1031(2000)所述經反相色譜純化肽構建體。
用安裝在Waters HPLC系統中的Vydac C4柱(4.6×300mm)進行分析反相高壓液相色譜(RP-HPLC)，並用於H2O中的0.1％T FA和於CH3CN中的0.1％TFA作為極限溶劑以1ml/min流速走柱。所有產物在分析RP-HPLC上均呈單主峰，並且當用在配有延遲離子萃取的Bruker BIFLEX儀器上進行的MALDI-TOF質譜分析時均具有預期質量。
在某些情況下，兩個絲氨酸殘(Ser-Ser)被加到肽和脂質部分之間，在這種情況下，在脂質部分被附著之前，將絲氨酸殘基加到中心賴氨酸殘基的ε-氨基基團。
本研究中使用的肽和脂肽的示意圖如圖1所示。
免疫方案包含流感病毒CTL表位的肽由6-8周齡的雌性BALB/c小鼠組成的各組在第0天和第28天進行接種。對於皮下(s.c.)接種，每劑將9nmole脂肽構建體在100μl鹽水中製備，非脂化肽在等體積完全弗氏佐劑(CFA)中配製成乳液進行初次注射，或者在等體積部完全弗氏佐劑中配製成乳液進行第二次接種。對於鼻內(i.n.)接種，將在50μl鹽水中的9nmole肽塗在吸入甲氧氟烷麻醉的小鼠的鼻孔中。
包含L.monocytogenes的CTL表位的肽5隻BALB/c小鼠用9nmole非脂化肽([P25]-Lys-[LLO91-99])或脂化肽([P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[LLO91-99])接種或用1000個細菌接種，所述脂化肽中脂質附著於兩個表位之間的大約分子中心的位置。在肽疫苗情況下進行皮下接種，在細菌情況下進行靜脈內接種。在體外用CTL表位或無抗原刺激後第28天測量脾中存在的產生幹擾素-γ的細胞數。縱軸示出每1,000,000個脾細胞中產生幹擾素-γ的細胞數。
包含卵清蛋白的CTL表位的肽9隻C57BL/6小鼠(8-10周齡)的每一隻用在100μl鹽水中的20nmole脂化的[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[SIINFEKL]或非脂化的[P25]-Lys-[SIINFEKL]肽皮下免疫。在脂化肽情況下，脂質附著於兩個表位之間的大約分子中心的位置。
包含C型肝炎病毒核心蛋白的CTL表位的肽人單核細胞衍生的樹突細胞與脂肽[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[HCV](5μg/mL)保溫48小時，之後用針對HLA-DR，CD83和CD86的FITC綴合的抗體染色以進行流式細胞計量術分析。
用流感病毒攻擊免疫的小鼠經甲氧氟烷麻醉的預先用包含流感病毒CTL表位的肽免疫的小鼠用104.5PFU的感染性Mem 71流感病毒進行鼻內(i.n.)攻擊。每隻小鼠接受50μl用PBS稀釋的尿囊液形式的病毒。攻擊後5天通過頸脫節殺死小鼠，取出肺並無菌轉移進含有每ml補加100U青黴素、100μg鏈黴素和30μg慶大黴素的1.5ml Hank′s平衡鹽溶液的瓶子中。用組織勻漿機製備肺勻漿，通過在300×g離心5min沉澱細胞材料。取上清液分成等份，儲存在-70℃備用。肺上清液中的感染性病毒效價用在MDCK細胞上的噬斑分析(Tannock et al，Infect.Immun.431，457-462，1984)測定。
用L.monocytogenes攻擊免疫的小鼠在致敏後28天通過靜脈注射細菌攻擊用9nmol肽免疫原或PBS皮下免疫的或用1000個細菌靜脈內免疫的小鼠，在攻擊後28天測定肝中存在的細菌的菌落形成單位數。
用腫瘤細胞攻擊免疫的小鼠黑素瘤攻擊用非脂化[P25]-Lys-[SIINFEKL]或脂化肽[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[SIINFEKL]接種14天後，每組6隻小鼠用2×105個表達卵清蛋白[B16-OVA]因而表達CTL表位SIINFEKL的黑素瘤細胞(Bellone，et al，J.Immunol.1652651-2656)攻擊。在注射之前用電動剃鬚刀去除注射部位周圍的毛髮以便測量出現的腫瘤。監測生長的腫瘤，當腫瘤大小達到15×15mm時殺死動物。在腫瘤攻擊後指定天數計算每個處理組的平均腫瘤面積。
Lewis肺癌攻擊小鼠用3×104個已用卵清蛋白轉染因而表達CTL表位的Lewis肺腫瘤細胞(Nelson et al.，J Immunol.1665557-5566，2001)接種。接受腫瘤細胞後，在動物尾根部皮下接種20nmole脂化肽[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[SIINFEKL]、非脂化肽[P25]-Lys-[SIINFEKL]或PBS。接受腫瘤細胞11天後給予第2劑免疫原。監測動物中腫瘤發生和動物存活，當腫瘤面積超過100mm2時對動物實行安樂死。
肽特異性CD8+ T細胞的四聚體染色使用H-2Kd糖蛋白和結合的CTL肽(TYQRTRALV；SEQ ID NO2)的四聚體複合物鑑別特異於脂肽免疫原中的SEQ ID NO2所示的免疫顯性H-2Kd限制性CTL表位的CD8+T細胞(Bodmer et al，Cell 52253-258，1988；Sherman et al，J.Exp.Med.1751221-1226，1992)，該免疫顯性H-2Kd限制性CTL表位由流感病毒株A/Puerto Rico/8/34(PR8；H1N1)的核蛋白的胺基酸殘基147-155組成。單體由墨爾本大學微生物學和免疫學系的Peter Doherty教授惠贈，並且是在St.JudeChildren’s Research Hospital，Memphis TN，USA製備。四聚體通過以4∶1的摩爾比將單體與鏈親和素-藻紅蛋白(Molecular Probes，Eugene，OR，USA)保溫而製備。
來自肺的淋巴細胞首先用20μL正常小鼠血清(NMS)在室溫處理5分鐘，然後用1∶25稀釋的四聚體複合物染色60分鐘。之後，用綴合有別藻藍蛋白的抗CD8α(53-6.7)在冰上染色30分鐘，洗滌2次，經螢光素激活的細胞分選儀(FACSort，Becton Dickinson，San Jose’s，USA)分析。數據用FlowJo(Tree Star，Inc，CA，USA)分析。
T細胞培養基T細胞培養基由補加10％(vol/vol)熱滅活胎牛血清、2mM L-穀氨醯胺、2mM丙酮酸鈉、30μg慶大黴素/ml、100μg鏈黴素/ml、100IU青黴素/ml和10-4M 2-巰基乙醇的RPM11640(CSL Ltd.)組成。
細胞毒性T細胞分析從預先用脂肽免疫原皮下免疫7天的小鼠的腹股溝淋巴結和膕淋巴結產生二級效應細胞，或者從預先用脂肽免疫原致敏至少28天的小鼠的脾細胞產生二級效應細胞(secondary effector cells)。簡而言之，在含有15ml T細胞培養基的25-cm2組織培養瓶(Falcon)中，將4×107個通過用Tris緩衝的氯化銨(0.15M NH4Cl於17mM Tris-HCl中，pH7.2)處理而耗竭紅細胞的淋巴結細胞或脾細胞與107個照射的(2,200rads，60Co源)病毒感染的或脂肽刺激的同基因脾細胞一起培養。所述病毒感染的脾細胞預先與在1ml無血清RPM1中的3000凝血單位的感染性Mem 71或PR8病毒在37℃保溫30min，並且在加到培養瓶中之前洗滌一次。脂肽刺激的脾細胞預先與100μg CTL脂肽/ml在37℃保溫60min並且在加入培養瓶中之前也洗滌一次。在含有5％CO2的潮溼環境下於37℃培養5天後，細胞洗滌3次，用於51Cr-釋放分析中。51Cr釋放分析如前所述(Harling-McNabb et al，Int.Immunol.11，1431-1439，1999)使用P815母細胞瘤細胞(H-2d，D BA/2)作為靶進行，共重複3份。
體內細胞毒性T細胞分析體內測定基於各種肽的免疫原誘導表位特異性CTL的能力。用在50μl PBS中的各種脂肽鼻內接種每組3隻小鼠，在第28天用Mem71攻擊。為了分析體內CTL決定簇特異性細胞毒性，用CTL決定簇刺激同基因脾細胞並用高密度CFSE(2.5μM)標記。通過共注射用低密度CFSE(0.25μM)標記的同基因脾細胞而控制抗原特異性溶解。在感染後第4天靜脈內注射每個靶細胞群的15×106個細胞的混合物。16小時後殺死小鼠，通過流式細胞儀分析脾中CFSE-high和CFSE-low細胞群的存在。每一樣品總共分析1×106個淋巴細胞。個體小鼠用實心方塊代表，條杆代表幾何平均效價。
IFN-γ分泌細胞的ELISPOT分析CTL特異性IFN-Y分泌細胞通過由Murali-Krishna et al，Immunity8，177-187，1998的方法改良而來的ELISPOT分析進行計數。用50μl於PBS中的5μg/ml大鼠抗(小鼠IFN-Y)抗體(clone R4-14a2)過夜包被平底聚氯乙烯微滴板(96孔Dynatech)。孔中的未佔據位點隨後通過與PBS中的10mg牛血清/ml保溫1小時而封閉，用含0.05％Tween 20(PBST)的PBS洗板3次。然後向孔中加入在T細胞培養基中的脾或淋巴結細胞的2倍稀釋液以及5×105照射的(2,200rads，60Co源)來自未免疫小鼠的同基因脾細胞和10U重組人白介素-2(Pharmingen，SanDiego，C alif.)/孔。在存在濃度為1μg肽/ml的CTL肽或不存在CTL肽條件下於37℃、5％CO2中培養細胞18小時。然後溶解細胞並通過首先用蒸餾水接著用PBST洗板而除去細胞。然後，加入50μl的1/500稀釋的生物素化抗(小鼠IFN-γ)抗體(clone XMG 1.2；Pharmingen)，在室溫保溫板2小時。再次洗板，向每孔中加入50μl鏈親和素-鹼性磷酸酶(Pharmingen；於5mg牛血清白蛋白/ml PBST中的1/400稀釋液)，混合物隨後進一步保溫2小時。洗板，然後向每孔中加入含有1mg BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸)/ml 2-氨基-2-甲基-1-丙炔醇緩衝液(Sigma)的100μl ELISPOT底物(Sedgwick et al，J.Immunol.Methods 57，301-309，1983)。當出現藍綠色斑點時，用水洗板並乾燥，藉助於倒置顯微鏡計數斑點。
D1樹突細胞培養物在基於完全IDDM的培養基中培養樹突細胞(DC)，這一培養基由含有25mM HEPES且不含α-硫代甘油或L-穀氨醯胺(JRHBioscience，Lenexa，USA)並且補加10％(v/v)熱滅活(56℃，30min)胎牛血清(CSL Ltd.，Parkville，Victoria，Australia)、慶大黴素(24μg/mL)、穀氨醯胺(2mM)丙酮酸鈉(2mM)、青黴素(100IU/mL)、鏈黴素(180μg/mL)和2-巰基乙醇(0.1mM)的Iscove改良的Dulbecco培養基(IMDM)組成。為產生DC，完全IMDM進一步補加30％來自培養的NIH/3T3細胞的上清和5％的呈用GM-CSF基因轉染的Ag8653細胞上清形式的GM-CSF(DC培養基)。
幼樹突細胞的培養方法由Winzler et al.，J.Exp Med.185，317(1997)適應而來。將來自BALB/c小鼠的脾細胞在3ml DC培養基中以1.5×106細胞/55mm培養皿(Techno-Plas，S.A.，A ustralia)接種並在37℃、5％CO2下保溫。用於培養的所有設備均是無熱原的。每4天更換培養基，且全部細胞均返回培養皿中。在第12天，通過用力抽吸培養基收集懸浮的和弱粘附的細胞。用2ml PBS重複這一程序。棄去剩餘的強粘附細胞。離心沉澱收集的細胞並再接種於一新的培養皿。隨後細胞保持在培養基更換和傳代的4天交替循環中。連續培養1個月後，漂浮的和半粘附的細胞呈現幼DC的表觀和染色特徵，被稱為D1細胞。在這些傳代條件下，大部分培養的D1細胞保持未成熟表型，其特徵為細胞表面MHC II類分子呈中等表達水平。
D1細胞的流式細胞計量術分析將D1細胞(1×105個細胞/樣品)接種在具有1mL DC培養基的新Petri培養皿中並與溶解在完全IMDM培養基中的0.0045nmole脂肽保溫。純化自Lipopolysaccharide(LPS)purified from E.coli血清型O111:B4的脂多糖(LPS)(Difco，D etroit，Michigan，U SA)以5μg/mL用作DC成熟的陽性對照。在保溫過夜後，收穫細胞並用含1％FCS的PBS洗一次。為防止與FCγRII/III的非特異性結合，細胞預先與20μL正常小鼠血清在室溫保溫5分鐘。然後細胞在冰上與FITC綴合的單克隆抗體14-4-4S(IgG2a，anti-I-Ek，d；O zato et al.，J.Immunol.，124，533(1980))接觸30分鐘。特異於輔助T細胞表位所來源的流感病毒抗原的單克隆抗體36/1(Brown et al.，Arch Virol 1141，1990)用作同種型對照。所有抗體均以2.5μg/mL的濃度應用。樣品用含1％FCS的PBS洗一次，然後在冰上用含4％低聚甲醛的PBS固定15分鐘。用FACSort(Becton Dickinson，San Jose，USA)進行流式細胞計數分析，數據用FlowJo軟體(Tree Star，Inc.，San Carlos，CA，USA)分析。
人樹突細胞培養物單核細胞衍生的樹突細胞的產生外周血單核細胞(PMBC)通過Ficoll Paque(Amersham Pharmacia，Sweden)梯度分離從得自血液供體的淡黃層製備物中製備。細胞在PBS中洗三次，然後與最佳量的鼠抗CD14雜交瘤上清(3C10，American Type Culture Collection)在冰上保溫45分鐘。洗滌兩次後，將細胞進一步根據廠商指導與山羊抗鼠IgG微珠(Miltenyi Biotech，Germany)保溫。然後用磁激活細胞分選(MACS)柱經親和層析陽性選擇CD14+單核細胞。通過在補加GM-CSF和IL-4(分別為40ng/ml和20ng/ml[Schering Plough，USA])的並含有10％FCS(CSL，Australia)、2mmol/L穀氨酸、2mmol/L丙酮酸鈉、100U/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素、30μg/ml慶大黴素和0.1mmol/L 2-巰基乙醇的RPMI-1640(Gibco，USA)中培養單核細胞而產生幼DC。細胞培養5天，之後每2天更換一半體積的培養基。
DC成熟的測量通過將每毫升5×105個細胞在補加GM-CSF和IL-4以及LPS(5μg/mL)、非脂化肽，[Th]-Lys-[CTL](5μg/mL)或脂肽[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL](5μg/mL)三者中任一種的培養基中保溫2天而測定基於肽和脂肽的免疫原正調節人單核細胞衍生的樹突細胞上MHC class II，CD83和CD86的表達的能力，共測試48小時。通過用得自Becton Dickinson(USA)的針對HLA-DR(G46-6[L243])，CD83(HB15e)，CD86(Cat.No.2331[FUN-1])的螢光素綴合的單克隆抗體以及合適的同種型匹配抗體(MOPC-21 and G155-178)根據廠商指導進行染色來進行表面標記的表型分析。然後洗滌細胞，在1％甲醛中固定並在流式細胞計數儀上分析。柱狀圖代表在正散射和旁散射點圖上的大粒細胞。柱狀圖的陰影區域和相關數值代表表達高水平CD83，CD86或HLA-DR的細胞群的百分比。
實施例2包含來自流感病毒的CTL表位的脂肽的免疫原性測試了具有來自流感病毒的CTL表位的脂肽、特別是包含SEQ IDNO4所示的胺基酸序列的脂肽[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]和[Th]-Lys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL]的誘導增強的CTL介導的病毒清除以及增強，樹突細胞成熟的能力。在所有實驗中使用具有SEQ ID NO4的胺基酸序列的非脂化肽作為陰性對照。
病毒清除與非脂化肽相比脂肽引起更高水平的病毒清除(圖3，圖4a)。與來自僅用PBS免疫的小鼠的樣品相比，在用脂肽免疫並在9天後用感染性Mem 71病毒攻擊的小鼠的肺中的病毒負荷降低了95％([Th]-Lys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL]；圖3)或99％([Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]；圖3)。相反，非脂化肽僅達到了病毒負荷降低65％([Th]-Lys-[CTL]；圖3)。在接種了脂肽並且在初次接種後28天用Mem 71病毒攻擊的動物中也觀察到了增加的病毒清除。相反，在用非脂化肽接種的小鼠中在此時間點清除病毒的能力明顯較弱。
如圖4b所示，與僅接受非脂化肽或PBS的小鼠相比，接受根據圖2命名的脂肽的免疫小鼠中也存在增強的CD8+T細胞激活，這一點通過在BAL液體中發現的CD8+ T細胞數可見。
樹突細胞成熟樹突細胞對二級淋巴器官中原初CD4+ T細胞和CD8+ T細胞的引發之前是在暴露於抗原表位時DC的成熟。這一成熟的特徵在於DC表面上的MHC產物和共刺激分子的正調節。因此，我們測定了各種肽和脂肽是否能差異激活樹突細胞，以試圖解釋這些疫苗候選者的不同免疫原性。
實驗中，一株幼DC細胞系D1細胞與肽接觸，針對MHC II類分子的表達進行染色，隨後經流式細胞計量術分析，結果證實在細胞與肽[Th]-Lys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL]或[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]接觸後，相比於細胞與接觸[Th]-Lys-[CTL]肽或培養基，樹突細胞的成熟增強(圖4c)。
在導致DC成熟方面，[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]是最有效的，非脂化肽[Th]-Lys-[CTL]是效果最差的，而[Th]-Lys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL]與[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]幾乎一樣有效(圖4c)。脂化肽[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]正調節II類表達的能力與細菌脂多糖(LPS)相同。非脂化肽誘導D1細胞成熟不超過約26％，這一水平是培養物中自發發生的水平。這些脂肽誘導D1細胞成熟的相對能力直接反映了它們誘導CTL介導的病毒清除應答以及BAL中的CD8+ T細胞的能力。
不同脂質對體外和體內細胞毒性及T細胞增殖的作用還測定了綴合不同脂質、包括Pam1Cys，Pam2Cys，Pam3Cys，棕櫚酸和膽固醇至肽免疫原的作用。
如圖5所示，在用含Pam2Cys脂肽免疫的小鼠肺中的病毒負荷低於用包含所測試的其它脂質的脂肽免疫的小鼠肺中的病毒負荷，提示Pam2Cys對於賦予抗病毒的保護作用是優選的。但是所有的脂質均提供一定的抗病毒保護作用。這一作用也反映在IFN-γCD8+ T細胞計數上(圖6)。總之，這些數據提示如在[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]表位結構中一樣將脂質附著至半胱氨酸甘油殘基對於最大細胞毒性作用是重要的。
在四聚體分析中，與非脂化肽或脂質加至肽的N-末端的脂肽(例如圖7中的構建體Pal2LysLys[Th]-[CTL])相比，使用脂質部分加至一內部賴氨酸殘基的ε氨基基團的脂肽(例如圖7中的脂肽[Th]-Lys(Pam1Cys-Ser-Ser)-[CTL]，[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]，[Th]-Lys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL]，和[Th]-Lys(Chol2Lys-Ser-Ser)-[CTL])觀察每個肺四聚體陽性CD8+ T細胞數最高。這些數據還證實通過附著於一內部賴氨酸殘基的ε氨基基團而將脂質置於肽的內部能增強CTL表位的細胞毒性活性。
為分析體內CTL決定簇特異性細胞毒性，小鼠鼻內接種9nmole在PBS中的各種脂肽並在第28天用Mem71病毒攻擊。用經CTL決定簇刺激並用高密度CFSE標記的同基因脾細胞測量體內CTL決定簇特異性細胞毒性。用低密度CFSE標記的未刺激的脾細胞用作對照。在感染後第4天靜脈內注射每一靶細胞群的細胞混合物。16小時後殺死小鼠並用流式細胞計量術分析脾中CFSE-high和CFSE-low細胞群的存在。每一樣品分析總共1×106個淋巴細胞。圖8中的數據示出在首次用於實驗的小鼠中的細胞毒性T細胞活性。圖9示出包含SEQ IDNO1所示的CD4+輔助T細胞表位和SEQ ID NO2所示的H-2d-限制性CTL表位的脂肽[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]誘導了明顯的體內細胞毒性。
如圖10所示，脂肽比非脂化肽具有更高的活性，其中與非脂化肽[Th]-Lys-[CTL]和其它所測試的脂肽相比，命名為[Th]-Lys(Pam1Cys-Ser-Ser)-[CTL]，[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]和[Th]-Lys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL]的脂肽提供了顯著增強的體內特異性溶解。這些數據再次證實通過附著於一內部賴氨酸殘基的ε氨基基團而將脂質置於肽的內部增強了體內CTL表位的細胞毒性活性。
實施例3包含來自L.monocytogenes的CTL表位的脂肽的免疫原性測試了具有來自L.monocytogenes的CTL表位的脂肽、特別是包含SEQ ID NO175所示胺基酸序列的脂肽[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[LLO91-99]誘導CD8+T細胞應答以及抗L.monocytogenes攻擊的保護作用的能力。在所有實驗中使用PBS或具有SEQ ID NO175所示胺基酸序列的非脂化肽作為陰性對照。分離的細菌用作陽性對照。
脾細胞產生IFN-γ本研究中測試的脂肽誘導抗免疫CTL表位的特異性CD8+ T細胞應答，這一點通過相對於非脂化肽在用脂化肽免疫的小鼠中存在的產生IFN-γ的脾細胞數增加而表明。每一百萬個脾細胞中，用9nmole包含SEQ ID NO175所示胺基酸序列的脂化肽疫苗[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[LLO91-99]免疫的小鼠產生比接受非脂化肽或PBS對照的小鼠多約15倍的IFN-γ產生細胞，表明在接受脂化肽的小鼠中產生IFN-γ的CD8+T細胞的激活增加(圖11)。
抗分離細菌攻擊的保護作用圖12的數據顯示脂化[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[LLO91-99]肽成功地提供了抗隨後的全細菌攻擊的保護作用。在用脂化[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[LLO91-99]肽免疫的小鼠中也觀察到相對於用非脂化[P25]-Lys-[LLO91-99]肽或PBS(即非免疫小鼠)免疫的小鼠顯著增強的保護。
實施例4抗腫瘤細胞攻擊的保護作用抗黑素瘤細胞攻擊的保護作用評價了含有卵清蛋白CTL表位(SIINFEKL)的脂肽疫苗誘導抗表達這一CTL表位的黑素瘤細胞(B16-OVA細胞)的保護作用的能力。在用如下脂肽接種的小鼠中確定了IFN-γ生成，所述脂肽包含C DV-F輔助T細胞表位(P25)和卵清蛋白的CTL表位(SIINFEKL)，這兩個表位經位於所述表位之間的一個內部賴氨酸殘基的ε氨基基團與Pam2Cys連接(即圖2所列的基於SEQ ID NO174的肽[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[SIINFEKL])。C57BL/6小鼠用20nmole脂化肽[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[SIINFEKL]、非脂化肽[P25]-Lys-[SIINFEKL]或用PBS在尾根部皮下免疫。在14天後小鼠用B16-OVA細胞在背部皮下攻擊。從接種動物獲得脾細胞並用具有序列SIINFEKL的CTL表位體外刺激，側鏈每1,000,000個脾細胞中產生IFN-γ的細胞數。數據顯示，用脂肽接種的小鼠中產生IFN-γ的細胞數增加(表1)，表明脂肽相對於非脂化肽激活T細胞的能力增強。
重要的是，與用非脂化肽[P25]-Lys-[SIINFEKL]或單獨PBS免疫的小鼠相比，用脂肽進行免疫引起了對腫瘤生長的控制(圖13)。在用[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[SIINFEKL]免疫的小鼠中在15天期間內未觀察到腫瘤生長。相反，在用[P25]-Lys-[SIINFEKL]或單獨PBS免疫的小鼠中觀察到直徑大於75mm2的腫瘤。總之這些數據證實與非脂化肽相比脂肽在抗腫瘤保護方面具有保護能力。
表1與接受非脂化[P25]-Lys-[SIINFEKL]肽或PBS相比在接受[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[SIINFEKL]脂肽的代表性黑素瘤樣品中的分泌IFN-γ的脾細胞數
對用Lewis肺腫瘤細胞進行的攻擊的保護作用還測試了脂肽提供在動物體內抗Lewis肺腫瘤發育的保護作用的能力。用3×104個用卵清蛋白轉染因此表達CTL表位SIINFEKL的Lewis肺腫瘤細胞(Nelson et al.，J Immunol.1665557-5566，2001)注射小鼠。接受腫瘤細胞4天後，在動物尾根皮下接種20nmole脂化肽[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[SIINFEKL]，或者非脂化肽[P25]-Lys-[SIINFEKL]或PBS。接受腫瘤細胞11天後給予第二次相似劑量的免疫原。圖14中的數據表明與接受非脂化肽或PBS的動物相比，接受脂肽的動物中具有較少損害發生的動物的百分數顯著較高。如圖15所示，接受脂肽免疫原的動物比接受非脂化肽或PBS的動物的存活時間也長。這些數據進一步證實脂肽與非脂化肽相比的抗腫瘤的保護作用的保護能力。
實施例5在給予包含CDV-F輔助T細胞表位和來自C型肝炎病毒的CTL表位的脂肽後人樹突細胞上的MHC II類、CD83和CD86的增強表達測試具有圖2中所述的命名的脂肽[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[HCV]的正調節人樹突細胞上的MHC II類、CD83和CD86的表達的能力。人單核細胞衍生的樹突細胞與培養基單獨、LPS(5μg/mL)，非脂化肽[P25]-Lys-[HCV](5μg/mL)或脂肽[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[HCV](5μg/mL)保溫48小時，之後在經流式細胞計量術分析之前用針對HLA-DR，C D83和CD86的FITC綴合的抗體染色。圖16所示數據證實在用脂化肽處理之後與用非脂化肽或PBS單獨處理之後相比，有更高百分比的在其細胞表面表達HLA-DR，C D83和CD86抗原的樹突細胞群。脂肽誘導人樹突細胞成熟的能力直接反映了脂肽與非脂化肽相比的免疫原性，提供了免疫原性的一個可能機制。
實施例6討論在本研究中，我們描述了各種脂肽免疫原的組裝，所述脂肽免疫原由CD4+T細胞表位、CD8+CTL表位以及經一內部賴氨酸殘基的ε氨基基團與其連接的Pam3Cys或Pam2Cys組成。
脂質部分的精確性質未顯示出對於產生免疫應答是關鍵的，因為一系列脂質、包括膽固醇、棕櫚酸、Pam1Cys、Pam2Cys和Pam3Cys均顯示出成功引起了T細胞增殖和細胞毒性。但是在保護作用和IFN-γ產生方面觀察到顯著不同，至少是在抗流感病毒的脂肽的情況下，由此提示脂質結構可能在體內是一個重要考慮因素。特別是至少對於摻入流感病毒CTL表位的疫苗而言，Pam2Cys與肽中的一內部賴氨酸殘基的氨基基團連接能最有效地賦予保護作用，提示與半胱氨酸甘油的連接是優選的。
本發明的脂肽能有效增強免疫動物的抗細菌和病毒病原體以及抗腫瘤細胞的CD8+T細胞應答。考慮到本文表明的肽自身作為佐劑以抗病毒和細菌病原體以及腫瘤細胞的保護作用的成功，可以合理地預期這一技術可廣泛地適用於各種免疫方案。
在脂質部分和肽序列之間插入絲氨酸殘基不負面影響所得的含Pam2Cys免疫原的效力。
脂肽可以在不含額外佐劑的情況下激發免疫應答，並可以經腸胃外和非腸胃外途徑、特別是鼻內途徑輸送。
總之，本文提供的數據證實將各種脂質、包括但不限於Pam2Cys和Pam3Cys置於CTL表位和輔助T細胞表位之間的大約整個合成肽疫苗的中心位置增加了疫苗的免疫原性。
序列表110昆士蘭醫學研究所理事會120包含輔助T細胞和細胞毒性T淋巴細胞(cTL)表位的新免疫原性脂肽13094947/MRO150US 60/4028391512002-08-12160177170PatentIn version 3.1210121115212PRT213synthetic T-helper epitope4001Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser1 5 10 1521022119212PRT213synthetic CTL epitope4002Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val1 5210321124212PRT213synthetic peptide comprising CTL and Th epitope4003
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21126212PRT213synthetic T-helper epitope40049Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg1 5 10 15Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Lys20 25210502114212PRT213synthetic T-helper epitope40050Gly Val Ala Glu12105121110212PRT213synthetic T-helper epitope40051Thr Ala Ser Gly Val Ala Glu Thr Thr Asn1 5 102105221116212PRT213synthetic T-helper epitope40052
Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala Thr Tyr Gln Phe1 5 10 152105321123212PRT213synthetic CTL epitopes40053Lys Pro Lys Asp Glu Leu Asp Tyr Glu Asn Asp Ile Glu Lys Lys Ile1 5 10 15Cys Lys Met Glu Lys Cys Ser202105421121212PRT213synthetic CTL epitopes40054Asp Ile Glu Lys Lys Ile Cys Lys Met Glu Lys Cys Ser Ser Val Phe1 5 10 15Asn Val Val Asn Ser20210552119212PRT213synthetic CTL epitopes40055Lys Pro Ile Val Gln Tyr Asp Asn Phe1 5
2105621117212PRT213synthetic CTL epitopes40056Gly Ile Ser Tyr Tyr Glu Lys Val Leu Ala Lys Tyr Lys Asp Asp Leu1 5 10 15Glu2105721122212PRT213synthetic CTL epitopes40057Glu Phe Thr Tyr Met Ile Asn Phe Gly Arg Gly Gln Asn Tyr Trp Glu1 5 10 15His Pro Tyr Gln Lys Ser202105821119212PRT213synthetic CTL epitopes40058Asp Gln Pro Lys Gln Tyr Glu Gln His Leu Thr Asp Tyr Glu Lys Ile1 5 10 15Lys Glu Gly
2105921110212PRT213synthetic CTL epitopes40059Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met1 5 102106021110212PRT213synthetic CTL epitopes40060Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val Val1 5 102106121110212PRT213synthetic CTL epitopes40061Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys1 5 102106221110212PRT213synthetic CTL epitopes40062Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys
1 5 10210632119212PRT213synthetic CTL epitopes40063Arg Pro Val Val Ser Thr Gln Leu Leu1 52106421110212PRT213synthetic CTL epitopes40064Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr1 5 102106521110212PRT213synthetic CTL epitopes40065Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala1 5 102106621110212PRT213synthetic CTL epitopes
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213synthetic CTL epitopes40070Ser Pro Ile Glu Thr Val Pro Val Lys Leu1 5 102107121110212PRT213synthetic CTL epitopes40071Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val Tyr1 5 10210722119212PRT213synthetic CTL epitopes40072Ala Ile Phe Gln Ser Ser Met Thr Lys1 52107321110212PRT213synthetic CTL epitopes40073Ser Pro Ala Ile Phe Gln Ser Ser Met Thr1 5 1021074
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2107821115212PRT213synthetic CTL epitopes40078Ile Ala Ser Asn Glu Asn Met Asp Ala Met Glu Ser Ser Thr Leu1 5 10 15210792119212PRT213synthctic CTL epitopes40079Lys Ala Val Tyr Asn Phe Ala Thr Met1 5210802119212PRT213synthetic CTL epitopes40080Gln Val Lys Trp Arg Met Thr Thr Leu1 5210812119212PRT213synthetic CTL epitopes40081
Val Phe Ser Asp Gly Arg Val Ala Cys1 5210822119212PRT213synthetic CTL epitopes40082Val Pro Ala Pro Ala Gly Pro Ile Val1 5210832119212PRT213synthetic CTL epitopes40083Thr Tyr Ser Ala Gly Ile Val Gln Ile1 52108421110212PRT213synthetic CTL epitopes40084Leu Leu Asp Phe Val Arg Phe Met Gly Val1 5 102108521110212PRT213synthetic CTL epitopes
40085Gln Asn Gly Ala Leu Ala Ile Asn Thr Phe1 5 10210862119212PRT213synthetic CTL epitopes40086Val Ser Ser Asp Gly Arg Val ALa Cys1 5210872119212PRT213synthetic CTL epitopes40087Val Ser Ser Glu Gly Arg Val Ala Cys1 5210882119212PRT213synthetic CTL epitopes40088Val Ser Ser Asp Gly Arg Val Pro Cys1 5210892119
212PRT213synthetic CTL epitopes40089Val Ser Ser Asp Gly Leu Val Ala Cys1 5210902119212PRT213synthetic CTL epitopes40090Val Ser Ser Asp Gly Gln Val Ala Cys1 5210912119212PRT213synthetic CTL epitopes40091Val Ser Ser Asp Gly Arg Val Val Cys1 52109221110212PRT213synthetic CTL epitopes40092Val Pro Ala Pro Pro Val Gly Pro Ile Val1 5 10
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1 5210972119212PRT213synthetic CTL epitopes40097Arg Lys Ile Tyr Asp Leu Ile Glu Leu1 5210982119212PRT213synthetic CTL epitopes40098Pro Tyr Leu Phe Trp Leu Ala Gly Ile1 52109921113212PRT213synthetic CTL epitopes40099Thr Ser Leu Tyr Asn Leu Arg Arg Gly Thr Ala Leu Ala1 5 1021010021110212PRT213synthetic CTL epitopes
400100Asp Thr Pro Leu Ile Pro Leu Thr Ile Phe1 5 1021010121111212PRT213synthetic CTL epitopes400101Thr Val Phe Tyr Asn Ile Pro Pro Met Pro Leu1 5 1021010221110212PRT213synthetic CTL epitopes400102Val Glu Ile Thr Pro Tyr Lys Pro Thr Trp1 5 102101032119212PRT213synthetic CTL epitopes400103Val Ser Phe Ile Glu Phe Val Gly Trp1 52101042119212PRT
213synthetic CTL epitopes400104Phe Arg Lys Ala Gln Ile Gln Gly Leu1 52101052119212PRT213synthetic CTL epitopes400105Phe Leu Arg Gly Arg Ala Tyr Gly Leu1 52101062119212PRT213synthetic CTL epitopes400106Gln Ala Lys Trp Arg Leu Gln Thr Leu1 52101072119212PRT213synthetic CTL epitopes400107Ser Val Arg Asp Arg Leu Ala Arg Leu1 5210108
2119212PRT213synthetic CTL epitopes400108Tyr Pro Leu His Glu Gln His Gly Met1 52101092119212PRT213synthetic CTL epitopes400109His Leu Ala Ala Gln Gly Met Ala Tyr1 52101102119212PRT213synthetic CTL epitopes400110Arg Pro Pro Ile Phe Ile Arg Arg Leu1 52101112119212PRT213synthetic CTL epitopes400111Arg Leu Arg Ala Glu Ala Gly Val Lys1 5
2101122119212PRT213synthetic CTL epitopes400112IIe Val Thr Asp Phe Ser Val Ile Lys1 521011321110212PRT213synthetic CTL epitopes400113Ala Val Phe Asp Arg Lys Ser Asp Ala Lys1 5 1021011421115212PRT213synthetic CTL epitopes400114Asn Pro Thr Gln Ala Pro Val Ile Gln Leu Val His Ala Val Tyr1 5 10 1521011521115212PRT213synthetic CTL epitopes400115
Leu Pro Gly Pro Gln Val Thr Ala Val Leu Leu His Glu Glu Ser1 5 10 1521011621114212PRT213synthetic CTL epitopes400116Asp Glu Pro Ala Ser Thr Glu Pro Val His Asp Gln Leu Leu1 5 102101172118212PRT213synthetic CTL epitopes400117Arg Tyr Ser Ile Phe Phe Asp Tyr1 52101182119212PRT213synthetic CTL epitopes400118Ala Val Leu Leu His Glu Glu Ser Met1 521011921111212PRT213synthetic CTL epitopes
400119Arg Arg Ala Arg Ser Leu Ser Ala Glu Arg Tyr1 5 1021012021110212PRT213synthetic CTL epitopes400120Glu Glu Asn Leu Leu Asp Phe Val Arg Phe1 5 102101212119212PRT213synthetic CTL epitopes400121Lys Glu His Val Ile Gln Asn Ala Phe1 52101222119212PRT213synthetic CTL epitopes400122Arg Arg Ile Tyr Asp Leu Ile Glu Leu1 52101232119
212PRT213synthetic CTL epitopes400123Gln Pro Arg Ala Pro Ile Arg Pro Ile1 52101242119212PRT213synthetic CTL epitopes400124Glu Gly Gly Val Gly Trp Arg His Trp1 52101252119212PRT213synthetic CTL epitopes400125Cys Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val1 52101262119212PRT213synthetic CTL epitopes400126Arg Arg Arg Trp Arg Arg Leu Thr Val1 5
2101272118212PRT213synthetic CTL epitopes400127Arg Ala Lys Phe Lys Gln Leu Leu1 521012821116212PRT213synthetic CTL epitopes400128Arg Lys Cys Cys Arg Ala Lys Phe Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg1 5 10 152101292119212PRT213synthetic CTL epitopes400129Tyr Leu Leu Glu Met Leu Trp Arg Leu1 52101302119212PRT213synthetic CTL epitopes400130Tyr Phe Leu Glu Ile Leu Trp Gly Leu
1 52101312119212PRT213synthetic CTL epitopes400131Tyr Leu Leu Glu Ile Leu Trp Arg Leu1 52101322119212PRT213synthetic CTL epitopes400132Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr Leu1 52101332119212PRT213synthetic CTL epitopes400133Leu Leu Leu Ala Leu Leu Phe Trp Leu1 52101342119212PRT213synthetic CTL epitopes
400134Leu Leu Val Asp Leu Leu Trp Leu Leu1 52101352119212PRT213synthetic CTL epitopes400135Leu Leu Leu Ile Ala Leu Trp Asn Leu1 52101362119212PRT213synthetic CTL epitopes400136Trp Leu Leu Leu Phe Leu Ala Ile Leu1 52101372119212PRT213synthetic CTL epitopes400137Thr Leu Leu Val Asp Leu Leu Trp Leu1 52101382119212PRT
213synthetic CTL epitopes400138Leu Leu Trp Leu Leu Leu Phe Leu Ala1 52101392119212PRT213synthetic CTL epitopes400139Ile Leu Leu Ile Ile Ala Leu Tyr Leu1 52101402119212PRT213synthetic CTL epitopes400140Val Leu Phe Ile Phe Gly Cys Leu Leu1 52101412119212PRT213synthetic CTL epitopes400141Arg Leu Gly Ala Thr Ile Trp Gln Leu1 5210142
2119212PRT213synthetic CTL epitopes400142Ile Leu Tyr Phe Ile Ala Phe Ala Leu1 52101432119212PRT213synthetic CTL epitopes400143Ser Leu Val Ile Val Thr Thr Phe Val1 52101442119212PRT213synthetic CTL epitopes400144Leu Met Ile Ile Pro Leu Ile Asn Val1 52101452119212PRT213synthetic CTL epitopes400145Thr Leu Phe Ile Gly Ser His Val Val1 5
2101462119212PRT213synthetic CTL epitopes400146Leu Ile Pro Glu Thr Val Pro Tyr Ile1 52101472119212PRT213synthetic CTL epitopes400147Val Leu Gln Trp Ala Ser Leu Ala Val1 52101482119212PRT213synthetic CTL epitopes400148Gln Leu Thr Pro His Thr Lys Ala Val1 521014921112212PRT213synthetic CTL epitopes400149
Ser Val Leu Gly Pro Ile Ser Gly His Val Leu Lys1 5 1021015021111212PRT213synthetic CTL epitopes400150Phe Thr Ser Gln Tyr Arg Ile Gln Gly Lys Leu1 5 1021015121111212PRT213synthetic CTL epitopes400151Phe Val Phe Pro Thr Lys Asp Val Ala Leu Arg1 5 102101522118212PRT213synthetic CTL epitopes400152Phe Pro Thr Lys Asp Val Ala Leu1 52101532119212PRT213synthetic CTL epitopes
400153Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val1 52101542119212PRT213synthetic CTL epitopes400154Met Leu Asn Ile Pro Ser Ile Asn Val1 52101552119212PRT213synthetic CTL epitopes400155Arg Ile Phe Ala Glu Leu Glu Gly Val1 521015621111212PRT213synthetic CTL epitopes400156Thr Pro Arg Val Thr Gly Gly Gly Gly Ala Met1 5 1021015721111
212PRT213synthetic CTL epitopes400157Arg Pro His Glu Arg Asn Gly Phe Thr Val Leu1 5 102101582119212PRT213synthetic CTL epitopes400158Arg Leu Leu Gln Thr Gly Ile His Val1 52101592119212PRT213synthetic CTL epitopes400159Val Ile Gly Asp Gln Tyr Val Lys Val1 52101602119212PRT213synthetic CTL epitopes400160Ala Leu Phe Phe Phe Asp Ile Asp Leu1 5
21016121111212PRT213synthetic CTL epitopes400161Tyr Ser Glu His Pro Thr Phe Thr Ser Gln Tyr1 5 102101622119212PRT213synthetic CTL epitopes400162Val Leu Cys Pro Lys Asn Met Ile Ile1 52101632119212PRT213synthetic CTL epitopes400163Asp Ile Tyr Arg Ile Phe Ala Glu Leu1 521016421110212PRT213synthetic CTL epitopes400164Ile Leu Ala Arg Asn Leu Val Pro Met Val
1 5 1021016521110212PRT213synthetic CTL epitopes400165Glu Phe Phe Trp Asp Ala Asn Asp Ile Tyr1 5 102101662119212PRT213synthetic CTL epitopes400166Ile Pro Ser Ile Asn Val His His Tyr1 52101672119212PRT213synthetic CTL epitopes400167Tyr Ile Leu Glu Glu Thr Ser Val Met1 52101682119212PRT213synthetic CTL epitopes
400168Cys Val Glu Thr Met Cys Asn Glu Tyr1 52101692119212PRT213synthetic CTL epitopes400169Arg Arg Ile Glu Glu Ile Cys Met Lys1 521017021111212PRT213synthetic CTL epitopes400170Thr Thr Val Tyr Pro Pro Ser Ser Thr Ala Lys1 5 102101712119212PRT213synthetic CTL epitopes400171Arg Arg Tyr Pro Asp Ala Val Tyr Leu1 52101722119212PRT
213Listeria monocytogenes CTL epitope400172Gly Tyr Lys Asp Gly Asn Glu Tyr Ile1 52101732118212PRT213Ovalbumin CTL epitope400173Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu1 521017421126212PRT213synthetic peptide comprising CTL epitope and T-helper epitope400174Lys Leu Ile Pro Asn Ala Ser Leu Ile Glu Asn Cys Thr Lys Ala Glu1 5 10 15Leu Lys Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu20 2521017521127212PRT213synthetic peptide comprising T helper and CTL epitope400175Lys Leu Ile Pro Asn Ala Ser Leu Ile Glu Asn Cys Thr Lys Ala Glu1 5 10 15
Leu Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn Glu Tyr Ile20 252101762119212PRT213CTL epitope from core protein of hepatitis C virus400176Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val1 521017721127212PRT213Synthetic peptide [P25]-Lys-[HCV]400177Lys Leu Ile Pro Asn Ala Ser Leu Ile Glu Asn Cys Thr Lys Ala Glu1 5 10 15Leu Lys Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val20 2權利要求
1.一種脂肽，其包含與一或多個脂質部分綴合的多肽，其中(i)所述多肽包含一種胺基酸序列，所述胺基酸序列包含(a)一種輔助T細胞(Th)表位的胺基酸序列和一種細胞毒性T細胞(CTL)表位的胺基酸序列，其中所述的胺基酸序列是不同的；以及(b)一和多個內部賴氨酸殘基或內部賴氨酸類似物殘基，用於經所述賴氨酸或賴氨酸類似物的ε(epsilon)氨基基團或末端側鏈基團共價附著所述脂質部分的每一個；和(ii)所述一或多個脂質部分的每一個均共價附著於所述一或多個內部賴氨酸殘基的ε氨基基團或所述一或多個內部賴氨酸類似物殘基的末端側鏈基團。
2.權利要求1的脂肽1，其中所述脂質附著於賴氨酸殘基的ε氨基基團。
3.權利要求1或2的脂肽，其中脂質部分所附著的所述內部賴氨酸殘基位於Th表位和CTL表位之間。
4.權利要求1或2的脂肽，其中脂質部分所附著的所述內部賴氨酸殘基位於Th表位內。
5.權利要求1-4任一項的脂肽，其中所述脂質部分具有通式(VII)的結構式(VII) 其中(i)X選自由硫、氧、二硫鍵(-S-S-)、亞甲基、和氨基(-NH-)組成的一組；(ii)m是整數1或2；(iii)n是從0至5的一個整數；(iv)R1選自由氫、羰基(-CO-)和R』-CO-組成的一組，其中R』選自由具有7-25個碳原子的烷基、具有7-25個碳原子的鏈烯基和具有7-25個碳原子的炔基組成的一組，其中所述烷基、鏈烯基或炔基任選地由羥基、氨基、氧代(oxo)、醯基或環烷基取代；(v)R2選自由R』-CO-O-，R』-O-，R』-O-CO-，R』-NH-CO-，和R』-CO-NH-組成的一組，其中R』選自由具有7-25個碳原子的烷基、具有7-25個碳原子的鏈烯基和具有7-25個碳原子的炔基組成的一組，其中所述烷基、鏈烯基或炔基任選地由羥基、氨基、氧代(oxo)、醯基或環烷基取代；以及(vi)R3選自由R』-CO-O-，R』-O-，R』-O-CO-，R』-NH-CO-，和R』-CO-NH-組成的一組，其中R』選自由具有7-25個碳原子的烷基、具有7-25個碳原子的鏈烯基和具有7-25個碳原子的炔基組成的一組，其中所述烷基、鏈烯基或炔基任選地由羥基、氨基、氧代(oxo)、醯基或環烷基取代；並且其中R1，R2和R3各自相同或不同。
6.權利要求5的脂肽，其中X是硫；m和n均是1；R1選自由氫和R』-CO-組成的一組，其中R』是具有7-25個碳原子的烷基；R2和R3選自由R』-CO-O-，R』-O-，R』-O-CO-，R』-NH-CO-和R』-CO-NH-組成的一組，其中R』是具有7-25個碳原子的烷基。
7.權利要求6的脂肽，其中R』選自由棕櫚醯，肉豆蔻醯，硬脂醯，月桂醯，辛醯，癸醯和膽固醇組成的一組。
8.權利要求5-7任一項的脂肽，其中脂質包含在由Pam1Cys，Pam2Cys，Pam3Cys，Chol2Lys，Ste2Cys，Lau2Cys，and Oct2Cys組成的一組的一種脂胺基酸部分內。
9.權利要求8的脂肽，其中所述脂胺基酸部分是Pam2Cys。
10.權利要求1-4任一項的脂肽，其中脂質部分具有下述通式(VIII)式(VIII) 其中(ii)R4選自如下一組(i)一種由約7至約25個碳原子組成的α醯基脂肪酸殘基；(ii)一種α-烷基-β-羥基脂肪酸殘基；(iii)一種α-烷基-β-羥基脂肪酸殘基的β-羥基酯；以及(iv)一種脂胺基酸殘基；(iii)R5是氫或一種胺基酸殘基的側鏈。
11.權利要求1-10任一項的脂肽，其中脂質部分通過一間隔物與肽部分隔開。
12.權利要求11的脂肽，其中所述間隔物包括精氨酸、絲氨酸或6-氨基己酸。
13.權利要求11或12的脂肽，其中所述間隔物由一種絲氨酸同二聚體組成。
14.權利要求1-13任一項的脂肽，其中所述內部賴氨酸或內部賴氨酸類似物位於一種具有低免疫原性的合成胺基酸序列內。
15.權利要求1-14任一項的脂肽，其中輔助T細胞表位是流感病毒血凝素的輔助T細胞表位或者犬瘟熱病毒F蛋白(CDV-F)的輔助T細胞表位。
16.權利要求15的脂肽，其中流感病毒血凝素的輔助T細胞表位包含SEQ ID NO1所示的胺基酸序列。
17.權利要求15的脂肽，其中CDV-F蛋白的輔助T細胞表位包含SEQ ID NO20所示的胺基酸序列。
18.權利要求1-17任一項的脂肽，其中CTL表位來自一種病毒的免疫原性蛋白、脂蛋白或糖蛋白。
19.權利要求18的脂肽，其中所示病毒是流感病毒。
20.權利要求19的脂肽，其中CTL表位包含SEQ ID NO2所示的胺基酸序列。
21.權利要求18的脂肽，其中病毒是C型肝炎病毒。
22.權利要求21的脂肽，其中CTL表位包含SEQ ID NO176所示的胺基酸序列。
23.權利要求1-17任一項的脂肽，其中CTL表位來自一種原核生物的免疫原性蛋白、脂蛋白或糖蛋白。
24.權利要求23的脂肽，其中CTL表位來自Listeriamonocytogenes。
25.權利要求24的脂肽，其中CTL表位包含SEQ ID NO172所示的胺基酸序列。
26.權利要求1-17任一項的脂肽，其中CTL表位來自一種真核生物的免疫原性蛋白、脂蛋白或糖蛋白。
27.權利要求26的脂肽，其中真核生物是一種寄生蟲。
28.權利要求26的脂肽，其中真核生物是一種哺乳動物。
29.權利要求28的脂肽，其中CTL表位來自哺乳動物的卵清蛋白或來自一種腫瘤細胞。
30.權利要求29的脂肽，其中CTL表位包含SEQ ID NO173所示的胺基酸序列。
31.權利要求1-30任一項的脂肽，其中多肽包含選自SEQ IDNO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO174，SEQ ID NO175和SEQ IDNO177的一種胺基酸序列。
32.權利要求1-31任一項的脂肽1 to 31，其能夠正調節幼樹突細胞(DC)上的MHC II類分子的表面表達。
33.權利要求32的脂肽，其中DC是D1細胞。
34.一種脂肽，其包含與一或多個脂質部分綴合的多肽，其中(i)所述多肽包含一種胺基酸序列，所述胺基酸序列包含(a)一種輔助T細胞(Th)表位的胺基酸序列和一種CTL表位的胺基酸序列，其中所述這兩個胺基酸序列是不同的；和(b)一或多個內部賴氨酸或賴氨酸類似物殘基，用於經所述一或多個賴氨酸或賴氨酸類似物殘基的ε氨基基團共價附著所述脂質部分的每一個；(ii)所述一或多個脂質部分的每一個均共價附著於所述一或多個內部賴氨酸殘基的氨基基團；並且(iii)所述脂肽脂肽具有通式(VI)式(VI) 其中表位是輔助T細胞表位或CTL表位；A存在或不存在，由長度約1至約6個胺基酸的胺基酸間隔物組成；n是值為1，2，3或4的整數；X是選自NH，O和S的一個末端側鏈基團；Y存在或不存在，由長度約1至約6個胺基酸的胺基酸間隔物組成；以及Z是一個脂質部分。
35.權利要求34的脂肽，其中A不存在。
36.權利要求34或35的脂肽，其中Y存在並由一個絲氨酸同二聚體組成。
37.權利要求34-36任一項的脂肽，其中Z選自Pam1Cys，Pam2Cys，Pam3Cys，Chol2Lys，Ste2Cys，Lau2Cys和Oct2Cys。
38.權利要求34-37任一項的脂肽，其能夠正調節幼樹突細胞(DC)上的MHC II類分子的表面表達。
39.權利要求38的脂肽，其中DC是D1細胞。
40.一種生產脂肽的方法，包括(i)產生一種多肽，該多肽包含一種胺基酸序列，該胺基酸序列包含(c)一種輔助T細胞(Th)表位的胺基酸序列和一種CTL表位的胺基酸序列，其中所述這兩個胺基酸序列是不同的；和(d)一或多個內部賴氨酸殘基或內部賴氨酸類似物殘基；以及(ii)將所述一或多個脂質部分的每一個直接或間接共價附著於所述一或多個內部賴氨酸殘基的ε氨基基團或所述一或多個內部賴氨酸類似物殘基的末端側鏈基團上，以產生具有附著於所述內部賴氨酸殘基的ε氨基基團的脂質部分或具有附著於所述內部賴氨酸類似物殘基的末端側鏈基團的脂質部分的脂肽。
41.權利要求40的方法，其中所述多肽通過化學合成手段合成。
42.權利要求40或41的方法，進一步包括產生脂質部分。
43.權利要求42的方法，包括以脂胺基酸形式合成脂質部分。
44.權利要求43的方法，進一步包括將一間隔物加至脂胺基酸的胺基酸部分。
45.權利要求44的方法，其中間隔物包括一種精氨酸同二聚體或絲氨酸同二聚體或6-氨基己酸。
46.權利要求44或45的方法，包括在一包括進行縮合、添加、取代或氧化反應的方法中經末端羧基將間隔物加至脂氨酸上。
47.權利要求44-46任一項的方法，其中間隔物包含一末端保護的胺基酸殘基以促進脂胺基酸與多肽的綴合。
48.權利要求47的方法，進一步包括將間隔物的末端保護的胺基酸脫保護，並將脂胺基酸綴合至多肽。
49.權利要求43的方法，包括在一包括進行親核取代反應的方法中將一個間隔物加至多肽的未修飾ε氨基基團上。
50.權利要求49的方法，其中所述多肽具有包含一單個內部賴氨酸或賴氨酸類似物殘基的胺基酸序列和一個封閉的N-末端。
51.權利要求49或50的方法，其中間隔物包含一種精氨酸同二聚體或絲氨酸同二聚體或6-氨基己酸。
52.一種包含權利要求1-39任一項的脂肽和一種藥物學可接受賦形劑或稀釋劑的組合物。
53.權利要求52的組合物，進一步包含一生物應答修飾劑(BRM)。
54.一種在個體中引起免疫應答的方法，包括在足以引起抗脂肽中的CTL表位的細胞毒性T細胞應答的條件下給予所述個體權利要求1-39任一項的脂肽或權利要求52或53的組合物一段時間。
55.權利要求54的方法，其中脂肽鼻內給予個體。
56.權利要求54的方法，其中脂肽通過注射給予個體。
57.一種免疫個體抗流感病毒的方法，包括給予個體一種脂肽，所述脂肽包含與一或多個脂質部分綴合的一個多肽，其中(i)所述多肽包含(a)一種輔助T細胞(Th)表位的胺基酸序列和一種流感病毒蛋白的CTL表位的胺基酸序列，其中所述這兩個胺基酸序列是不同的；(b)一或多個內部賴氨酸殘基或內部賴氨酸類似物殘基，用於經所述內部賴氨酸的ε氨基基團或經所述內部賴氨酸類似物的末端側鏈基團共價附著每一個所述脂質部分；以及(c)所述一或多個脂質部分的每一個均直接或間接共價附著於所述一或多個內部賴氨酸殘基的ε氨基基團或所述一或多個內部賴氨酸類似物殘基的末端側鏈基團；以及(ii)在足以引起對所述CTL表位的CTL應答的條件下給予所述脂肽一段時間。
58.權利要求57的方法，其中脂肽與一種藥物學可接受賦形劑或稀釋劑一起給予。
59.權利要求57或58的方法，其中針對CTL表位產生免疫記憶。
60.權利要求57-59任一項的方法，其中CTL表位包含SEQID NO2所示的胺基酸序列。
61.權利要求57-60任一項的方法，其中輔助T細胞表位包含SEQ ID NO1或SEQ ID NO20所示的胺基酸序列。
62.權利要求57-61任一項的方法，其中所述脂質部分包含選自(i)Pam1Cys；(ii)Pam2Cys；(iii)Pam3Cys；和(iv)Chol2Lys的脂胺基酸。
63.權利要求62的方法，其中所述脂質部分包含脂胺基酸Pam2Cys。
64.權利要求57-63任一項的方法，進一步包括產生所述脂肽。
65.權利要求57-64任一項的方法，進一步包括用預先取自個體的樣品確定個體的免疫應答。
66.一種包含權利要求1-39任一項的脂肽的抗流感病毒的疫苗，其中CTL表位來自流感病毒蛋白。
67.權利要求1-39任一項的脂肽在製備抗流感病毒的疫苗中的應用。
68.一種免疫個體抗C型肝炎病毒的方法，包括給予個體一種脂肽，所述脂肽包含與一或多個脂質部分綴合的一個多肽，其中(i)所述多肽包含(a)一種輔助T細胞(Th)表位的胺基酸序列和一種C型肝炎病毒蛋白的CTL表位的胺基酸序列，其中所述這兩個胺基酸序列是不同的；(b)一或多個內部賴氨酸殘基或內部賴氨酸類似物殘基，用於經所述內部賴氨酸的ε氨基基團或經所述內部賴氨酸類似物的末端側鏈基團共價附著每一個所述脂質部分；以及(c)所述一或多個脂質部分的每一個均直接或間接共價附著於所述一或多個內部賴氨酸殘基的ε氨基基團或所述一或多個內部賴氨酸類似物殘基的末端側鏈基團；以及(ii)在足以引起對所述CTL表位的CTL應答的條件下給予所述脂肽一段時間。
69.權利要求68的方法，其中脂肽與一種藥物學可接受賦形劑或稀釋劑一起給予。
70.權利要求68或69的方法，其中針對CTL表位產生免疫記憶。
71.權利要求68-70任一項的方法，其中CTL表位包含SEQ IDNO176所示的胺基酸序列。
72.權利要求68-71任一項的方法，其中輔助T細胞表位包含SEQ ID NO20所示的胺基酸序列。
73.權利要求68-72任一項的方法，其中脂質部分包含選自(i)Pam1Cys；(ii)Pam2Cys；(iii)Pam3Cys；和(iv)Chol2Lys的脂胺基酸。
74.權利要求73的方法，其中脂質部分包含脂胺基酸Pam2Cys。
75.權利要求68-74任一項的方法，進一步包括產生所述脂肽。
76.權利要求68-75任一項的方法，進一步包括用預先取自個體的樣品確定個體的免疫應答。
77.一種包含權利要求1-39任一項的脂肽的抗C型肝炎病毒的疫苗，其中CTL表位來自一種C型肝炎病毒蛋白。
78.權利要求1-39任一項的脂肽在製備抗C型肝炎病毒的疫苗中的應用。
79.一種免疫個體抗Listeria monocytogenes的方法，包括給予個體一種脂肽，所述脂肽包含與一或多個脂質部分綴合的一個多肽，其中(i)所述多肽包含(a)一種輔助T細胞(Th)表位的胺基酸序列和一種Listeria monocytogenes蛋白的CTL表位的胺基酸序列，其中所述這兩個胺基酸序列是不同的；(b)一或多個內部賴氨酸殘基或內部賴氨酸類似物殘基，用於經所述內部賴氨酸的ε氨基基團或經所述內部賴氨酸類似物的末端側鏈基團共價附著每一個所述脂質部分；以及(c)所述一或多個脂質部分的每一個均直接或間接共價附著於所述一或多個內部賴氨酸殘基的ε氨基基團或所述一或多個內部賴氨酸類似物殘基的末端側鏈基團；以及(ii)在足以引起對所述CTL表位的CTL應答的條件下給予所述脂肽一段時間。
80.權利要求79的方法，其中脂肽與一種藥物學可接受賦形劑或稀釋劑一起給予。
81.權利要求79或80的方法，其中針對CTL表位產生免疫記憶。
82.權利要求79-81任一項的方法，其中CTL表位包含SEQ IDNO172所示的胺基酸序列。
83.權利要求79-82任一項的方法，其中輔助T細胞表位包含SEQ ID NO20所示的胺基酸序列。
84.權利要求79-83任一項的方法，其中脂質部分包含選自(i)Pam1Cys；(ii)Pam2Cys；(iii)Pam3Cys；和(iv)Chol2Lys的脂胺基酸。
85.權利要求84的方法，其中脂質部分包含脂胺基酸Pam2Cys。
86.權利要求79-85任一項的方法，進一步包括產生所述脂肽。
87.權利要求79-86任一項的方法，進一步包括用預先取自個體的樣品確定個體的免疫應答。
88.一種包含權利要求1-39任一項的脂肽的抗Listeriamonocytogenes的疫苗，其中CTL表位來自一種Listeriamonocytogenes蛋白。
89.權利要求1-39任一項的脂肽在製備抗Listeriamonocytogenes的疫苗中的應用。
90.一種預防或治療癌症的方法，包括給予個體一種脂肽，所述脂肽包含與一或多個脂質部分綴合的一個多肽，其中(i)所述多肽包含(a)一種輔助T細胞(Th)表位的胺基酸序列和一種腫瘤特異性CTL表位的胺基酸序列，其中所述這兩個胺基酸序列是不同的；(b)一或多個內部賴氨酸殘基或內部賴氨酸類似物殘基，用於經所述內部賴氨酸的ε氨基基團或經所述內部賴氨酸類似物的末端側鏈基團共價附著每一個所述脂質部分；以及(c)所述一或多個脂質部分的每一個均直接或間接共價附著於所述一或多個內部賴氨酸殘基的ε氨基基團或所述一或多個內部賴氨酸類似物殘基的末端側鏈基團；以及(ii)在足以引起對所述CTL表位的CTL應答的條件下給予所述脂肽一段時間。
91.權利要求90的方法，其中脂肽與一種藥物學可接受賦形劑或稀釋劑一起給予。
92.權利要求90或91的方法，其中針對CTL表位產生免疫記憶。
93.權利要求90-92任一項的方法，其中腫瘤特異性CTL表位包含SEQ ID NO173所示的胺基酸序列。
94.權利要求90-93任一項的方法，其中輔助T細胞表位包含SEQ ID NO20所示的胺基酸序列。
95.權利要求90-94任一項的方法，其中脂質部分包含選自(i)Pam1Cys；(ii)Pam2Cys；(iii)Pam3Cys；和(iv)Chol2Lys的一個脂胺基酸。
96.權利要求95的方法，其中脂質部分包含脂胺基酸Pam2Cys。
97.權利要求90-97任一項的方法，進一步包括產生脂肽。
98.權利要求90-97任一項的方法，進一步包括用預先取自個體的樣品確定個體的免疫應答。
99.一種包含權利要求1-39的脂肽的針對癌症的預防或治療性疫苗，其中CTL表位是腫瘤特異性CTL表位。
100.權利要求1-39的脂肽在製備針對癌症的預防或治療性疫苗中的應用。
全文摘要
本發明提供了包含共線性(co－linear)輔助T細胞和CTL表位的合成的免疫原性脂肽分子、其生產方法和其在產生初級和次級免疫應答中的用途以及接種動物個體抗特定CTL表位的用途。更具體地，本發明提供了高度可溶的脂肽，其中脂質部分附著於一內部賴氨酸或賴氨酸類似物的末端側鏈基團，優選地附著於一內部二胺基酸殘基的末端側鏈基團。優選地，所述內部賴氨酸或賴氨酸類似物位於輔助T細胞表位和CTL表位之間。
文檔編號A61K39/385GK1688605SQ03824145
公開日2005年10月26日 申請日期2003年8月12日 優先權日2002年8月12日
發明者戴維·傑克遜, 曾偉光 申請人:昆士蘭醫學研究所理事會