用於產生導引RNA的方法和組合物與流程
2023-04-26 18:34:26
本申請根據35U.S.C.§119(e)要求提交於2014年4月3日的美國臨時申請號61/974,672的權益，其通過引用整體併入本文。聯邦政府資助的研究本發明根據由陸軍研究辦公室(ArmyResearchOffice)頒發的合同No.W911NF-11-2-0056在政府支持下完成。政府享有本發明中的某些權利。
技術領域：
本公開內容的一些方面涉及生物技術。具體而言，一些實施方案涉及轉錄調控和合成生物學領域。
背景技術：
：最近，細菌II型CRISPR/Cas系統(成簇的、規律間隔的短回文重複(CRISPR)/CRISPR相關系統(Cas)，clustered，regularlyinterspaced，shortpalindromicrepeats/CRISPRassociatesystem)已經適用於獲得可編程的DNA結合，而不需要複雜的蛋白質改造。Cas蛋白為專門用於切割DNA的核酸酶。在II型CRISPR/Cas系統中，所述CasDNA結合蛋白的序列特異性通過導引RNA(guideRNA，gRNA)確定，其具有與靶DNA位點的核苷酸鹼基配對互補性。這使得能夠簡單且高度靈活地編程Cas結合。技術實現要素：在哺乳動物細胞(例如人細胞)中構建基於CRISPR的線路(circuit)的主要挑戰是多個gRNA對於獲得所需的激活水平經常是必需的，特別是與內源啟動子相互作用的情況下。目前的技術依賴於使用多個gRNA表達構建體，每個構建體具有其各自的啟動子。在一些實施方案中，本文描述的經改造構建體可用於從單個轉錄本中表達許多功能gRNA，從而使得對具有多個輸出的合成基因線路進行緊湊的編碼(compactencoding)，以及用於調節天然基因和重接(rewire)天然網絡的簡潔策略成為可能。因此，在一些實施方案中，本文提供了方法和組合物(例如核酸和細胞)，其使得能夠通過整合基於核糖核酸(ribonucleicacid，RNA)的調控機制，如RNA幹擾和CRISPR/Cas系統，產生可擴展的合成基因線路和/或對內源基因及基因網絡進行修飾。例如，本文的多個實施方案在人細胞中，將多個哺乳動物RNA調控策略(包括RNA三螺旋結構、內含子、微小RNA(microRNA)以及核酶)與基於細菌Cas的CRISPR轉錄因子(CRISPRtranscriptionfactors，CRISPR-TF)以及基於核糖核酸酶(例如基於Cas6/Csy4)的RNA處理相組合，以修飾基因表達。出人意料的是，本公開內容的互補方法使得能夠從通過RNA聚合酶II(RNApolymeraseII，RNApolII或RNAPII)啟動子產生的轉錄本表達功能gRNA，同時允許目的蛋白質的共表達。此外，在一些實施方案中，本文提供的遺傳構建體使得能夠從單個轉錄本多重表達蛋白質和/或RNA幹擾分子(例如微小RNA)以及多個gRNA，以用於對合成構建體和內源人啟動子進行有效的調節。本文提供的經改造構建體可用於例如實施可調的合成基因線路，包括多階段轉錄級聯。此外，在一些實施方案中，本公開內容的方法和組合物可用於在具有多個輸出和反饋環(feedbackloop)的RNA依賴性基因線路中重接調控連接，以實現複雜的功能行為。本文提供的經改造構建體對於基礎生物學、治療以及合成生物學應用之例如人細胞中的可擴展基因線路的構建，以及天然調控網絡進行調節(例如微擾)是有價值的。本公開內容的多個方面提供了經改造構建體，其包含與核酸有效相連的啟動子，所述核酸包含(a)編碼至少1個導引RNA(gRNA)的核苷酸序列；以及(b)選自以下的一個或更多個核苷酸序列：(i)編碼目的蛋白質的核苷酸序列和(ii)編碼RNA幹擾分子的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述啟動子為RNA聚合酶II依賴性(RNApolII)啟動子。在一些實施方案中，至少1個gRNA的側翼為編碼核糖核酸酶識別位點的核苷酸序列。所述核糖核酸酶識別位點可以為例如Csy4核糖核酸酶識別位點。在一些實施方案中，至少1個gRNA的側翼為編碼核酶的核苷酸序列。所述核酶可以選自例如錘頭狀核酶(hammerheadribozyme)和丁型肝炎病毒核酶(Hepatitisdeltavirusribozyme)。在一些實施方案中，(a)所述的核苷酸序列的側翼為同源內含子剪接位點(cognateintronicsplicesites)。本公開內容的一些方面提供了經改造構建體，其包含與核酸有效相連的啟動子，所述核酸包含編碼至少1個導引RNA(gRNA)的第一核苷酸序列，所述gRNA的側翼為核糖核酸酶識別位點。在一些實施方案中，所述啟動子為RNA聚合酶II依賴性(RNApolII)啟動子。所述RNApolII啟動子可為例如人巨細胞病毒啟動子、人泛素啟動子、人組蛋白H2A1啟動子或人炎性趨化因子CXCL1啟動子。在一些實施方案中，所述第一核苷酸序列的側翼為同源內含子剪接位點。在一些實施方案中，所述核酸還包含編碼目的蛋白質的第二核苷酸序列。所述第一核苷酸序列可在所述第二核苷酸序列內，或者所述第二核苷酸序列可在所述第一核苷酸序列的上遊。在一些實施方案中，所述經改造構建體還包含編碼至少1個微小RNA的核苷酸序列。可例如在所述目的蛋白質內編碼微小RNA。在一些實施方案中，所述核酸還包含編碼三螺旋結構的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列在所述第二核苷酸序列與所述第一核苷酸序列之間。在一些實施方案中，所述第一核苷酸序列編碼至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或更多個gRNA，每個gRNA的側翼為核糖核酸酶識別位點。在一些實施方案中，所述第一核苷酸序列編碼至少2個側翼為核糖核酸酶識別位點的gRNA，並且其中所述gRNA彼此不同。在一些實施方案中，所述核糖核酸酶識別位點為Csy4核糖核酸酶識別位點。每個所述Csy4核糖核酸酶識別位點的長度可為例如28個核苷酸。在一些實施方案中，所述Csy4核糖核酸酶識別位點來自於銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。在一些實施方案中，所述三螺旋結構由來自於MALAT1基因座的3』末端或MENβ基因座的3』末端的核苷酸序列編碼。本公開內容的一些方面提供了經改造構建體，其包含與核酸有效相連的啟動子，所述核酸包含編碼目的蛋白質的第一核苷酸序列，以及編碼至少1個側翼為核糖核酸酶識別位點的導引RNA(gRNA)的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列的側翼為編碼同源內含子剪接位點的核苷酸序列並且位於所述第一核苷酸序列內。在一些實施方案中，所述啟動子為RNA聚合酶II依賴性(RNApolII)啟動子。所述RNApolII啟動子可為例如人巨細胞病毒啟動子、人泛素啟動子、人組蛋白H2A1啟動子或人炎性趨化因子CXCL1啟動子。在一些實施方案中，所述經改造構建體還包含編碼至少1個微小RNA的核苷酸序列。可例如在目的蛋白質內編碼微小RNA。在一些實施方案中，所述核酸還包含編碼三螺旋結構的第三核苷酸序列，以及編碼至少1個側翼為核糖核酸酶識別位點的gRNA的第四核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列在所述第一核苷酸序列的下遊，並且在所述第四核苷酸序列的上遊。在一些實施方案中，所述第二核苷酸序列編碼至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或更多個gRNA，每個gRNA的側翼為核糖核酸酶識別位點。在一些實施方案中，所述第二核苷酸序列編碼至少2個側翼為核糖核酸酶識別位點的gRNA，並且其中所述gRNA彼此不同。在一些實施方案中，所述核糖核酸酶識別位點為Csy4核糖核酸酶識別位點。所述Csy4核糖核酸酶識別位點的長度可為例如28個核苷酸。在一些實施方案中，所述Csy4核糖核酸酶識別位點來自於銅綠假單胞菌。在一些實施方案中，所述同源內含子剪接位點來自於共有內含子(consensusintron)。在一些實施方案中，所述同源內含子剪接位點來自於HSV1潛伏相關內含子(HSV1latency-associatedintron)。在一些實施方案中，所述同源內含子剪接位點來自於sno-IncRNA2內含子。在一些實施方案中，所述三螺旋結構由來自於MALAT1基因座的3』末端或MENβ基因座的3』末端的核苷酸序列編碼。在一些實施方案中，所述第四核苷酸序列編碼至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或更多個gRNA，每個gRNA的側翼為核糖核酸酶識別位點。在一些實施方案中，所述第四核苷酸序列編碼至少2個側翼為核糖核酸酶識別位點的gRNA，並且其中所述gRNA彼此不同。本公開內容的一些方面提供了經改造構建體，其包含與核酸有效相連的啟動子，所述核酸包含編碼至少1個側翼為核酶的導引RNA(gRNA)的第一核苷酸序列。在一些實施方案中，所述啟動子為RNA聚合酶II依賴性(RNApolII)啟動子。所述RNApolII啟動子可為例如人巨細胞病毒啟動子、人泛素啟動子、人組蛋白H2A1啟動子或人炎性趨化因子CXCL1啟動子。在一些實施方案中，所述核酸還包含編碼目的蛋白質的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列在所述第一核苷酸序列的上遊。在一些實施方案中，所述經改造構建體還包含編碼至少1個微小RNA的核苷酸序列。可例如在所述目的蛋白質內編碼微小RNA。在一些實施方案中，所述核酸還包含編碼三螺旋結構的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列在所述第二核苷酸序列與所述第一核苷酸序列之間。在一些實施方案中，所述第四核苷酸序列編碼至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或更多個gRNA，每個gRNA的側翼為核糖核酸酶識別位點。在一些實施方案中，所述第一核苷酸序列編碼至少2個側翼為核酶的gRNA，並且其中所述gRNA彼此不同。在一些實施方案中，所述核酶為順式作用核酶。例如，順式作用核酶可以是錘頭狀核酶或丁型肝炎病毒核酶。在一些實施方案中，錘頭狀核酶位於所述至少1個gRNA的5』末端。在一些實施方案中，錘頭狀核酶位於所述至少1個gRNA的3』末端。在一些實施方案中，丁型肝炎病毒核酶位於所述至少1個gRNA的5』末端。在一些實施方案中，丁型肝炎病毒核酶位於所述至少1個gRNA的3』末端。在一些實施方案中，所述三螺旋結構由來自於MALAT1基因座的3』末端或MENβ基因座的3』末端的核苷酸序列編碼。本公開內容的一些方面提供了經改造構建體，其包含與核酸有效相連的啟動子，所述核酸包含編碼目的蛋白質內的至少1個RNA幹擾分子的第一核苷酸序列，編碼至少1個側翼為核糖核酸酶識別位點的導引RNA的第二核苷酸序列，以及編碼三螺旋結構的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列在所述第一核苷酸序列與第二核苷酸序列之間。本公開內容的一些方面提供了經改造構建體，其包含與核酸有效相連的啟動子，所述核酸包含編碼目的蛋白質內的至少1個RNA幹擾分子的第一核苷酸序列，編碼至少1個側翼為核酶的導引RNA的第二核苷酸序列，以及編碼三螺旋結構的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列在所述第一核苷酸序列與第二核苷酸序列之間。在一些實施方案中，RNA幹擾分子選自微小RNA(miRNA)和小幹擾RNA(siRNA)。在一些實施方案中，所述至少1個RNA幹擾分子包含至少1個miRNA。一些方面提供了包含1個或更多個本公開內容之經改造構建體的載體。一些方面提供了包含本公開內容之經改造構建體和/或本公開內容之載體的細胞。本文還提供了包含至少2個本公開內容之經改造構建體和/或至少2個本公開內容之載體的細胞。在一些實施方案中，所述細胞被修飾以穩定表達核糖核酸酶。所述核糖核酸酶可以是例如Csy4核糖核酸酶。在一些實施方案中，所述細胞被修飾以穩定表達Cas蛋白。在一些實施方案中，所述Cas蛋白為Cas核酸酶，例如Cas9核酸酶。在一些實施方案中，所述Cas蛋白為具有轉錄活性的Cas蛋白。在一些實施方案中，所述具有轉錄活性的Cas蛋白為具有轉錄活性的Cas9蛋白。在一些實施方案中，所述細胞還包含經改造核酸，所述核酸包含與編碼核糖核酸酶的核苷酸序列有效相連的啟動子。所述核糖核酸酶可以是例如Csy4核糖核酸酶。在一些實施方案中，所述細胞還包含經改造核酸，所述核酸包含與編碼Cas蛋白的核苷酸序列有效相連的啟動子。在一些實施方案中，所述Cas蛋白為Cas核酸酶，例如Cas9核酸酶。在一些實施方案中，所述Cas蛋白為具有轉錄活性的Cas蛋白。在一些實施方案中，所述具有轉錄活性的Cas蛋白為具有轉錄活性的Cas9蛋白。在一些實施方案中，所述細胞還包含至少1個(或至少2個)額外的經改造核酸，所述核酸包含與編碼目的蛋白質的核苷酸序列有效相連的啟動子。在一些實施方案中，額外的經改造核酸的所述目的蛋白質與所述細胞中的任何其他目的蛋白質不同。在一些實施方案中，所述細胞為細菌細胞。在一些實施方案中，所述細胞為人細胞。本文還提供了包括培養本公開內容的任意細胞的方法。在一些實施方案中，所述方法包括在允許核酸表達的條件下培養所述細胞。本公開內容的一些方面提供了產生、修飾或重接細胞遺傳線路(cellulargeneticcircuit)的方法，所述方法包括在細胞中表達第一經改造構建體，所述構建體選自本文所提供的任意經改造構建體，以及在細胞中表達第二經改造構建體，所述構建體選自本文所提供的任意經改造構建體，其中所述第一經改造構建體的至少1個gRNA與所述第二經改造構建體的啟動子的區域或者內源啟動子的區域互補並結合。在一些實施方案中，所述方法還包括表達第三經改造構建體，所述構建體選自本文所提供的任意經改造構建體，其中所述第二經改造構建體的至少1個gRNA與所述第三經改造構建體的啟動子的區域或者內源啟動子的區域互補並結合。在一些實施方案中，所述方法還包括表達至少1個額外的經改造核酸，所述核酸選自本文所提供的任意所述經改造構建體，其中所述至少1個額外的經改造核酸的至少1個gRNA與所述細胞的任一個經改造核酸的啟動子的區域或者至少1個內源啟動子的區域互補並結合。在一些實施方案中，所述細胞被修飾以穩定表達核糖核酸酶。所述核糖核酸酶可以是例如Csy4核糖核酸酶。在一些實施方案中，所述細胞被修飾以穩定表達Cas蛋白。在一些實施方案中，所述Cas蛋白為Cas核酸酶，例如Cas9核酸酶。在一些實施方案中，所述Cas蛋白為具有轉錄活性的Cas蛋白。在一些實施方案中，所述具有轉錄活性的Cas蛋白為具有轉錄活性的Cas9蛋白。在一些實施方案中，所述細胞還包含經改造核酸，所述核酸包含與編碼核糖核酸酶的核苷酸序列有效相連的啟動子。所述核糖核酸酶可以是例如Csy4核糖核酸酶。在一些實施方案中，所述細胞還包含經改造核酸，所述核酸包含與編碼Cas蛋白的核苷酸序列有效相連的啟動子。在一些實施方案中，所述Cas蛋白為Cas核酸酶，例如Cas9核酸酶。在一些實施方案中，所述Cas蛋白為具有轉錄活性的Cas蛋白。在一些實施方案中，所述具有轉錄活性的Cas蛋白為具有轉錄活性的Cas9蛋白。在一些實施方案中，所述方法還包括培養所述細胞。本公開內容的一些方面提供了多重細胞表達導引核糖核酸(gRNA)的方法，其包括在細胞中表達經改造構建體，所述構建體包含與核酸有效相連的啟動子，所述核酸包含編碼至少2個gRNA的第一核苷酸序列，每個gRNA的側翼為核糖核酸酶識別位點。在一些實施方案中，所述核酸還包含編碼目的蛋白質的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列在所述第一核苷酸序列的上遊。在一些實施方案中，所述經改造構建體還包含編碼至少1個微小RNA的核苷酸序列。可例如在所述目的蛋白質內編碼微小RNA。在一些實施方案中，所述核酸還包含編碼三螺旋結構的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列在所述第二核苷酸序列與所述第一核苷酸序列之間。在一些實施方案中，所述細胞被修飾以穩定表達核糖核酸酶。所述核糖核酸酶可以是例如Csy4核糖核酸酶。在一些實施方案中，所述細胞被修飾以穩定表達Cas蛋白。在一些實施方案中，所述Cas蛋白為Cas核酸酶，例如Cas9核酸酶。在一些實施方案中，所述Cas蛋白為具有轉錄活性的Cas蛋白。在一些實施方案中，所述具有轉錄活性的Cas蛋白為具有轉錄活性的Cas9蛋白。在一些實施方案中，所述細胞還包含經改造核酸，所述核酸包含與編碼核糖核酸酶的核苷酸序列有效相連的啟動子。所述核糖核酸酶可以是例如Csy4核糖核酸酶。在一些實施方案中，所述細胞還包含經改造核酸，所述核酸包含與編碼Cas蛋白的核苷酸序列有效相連的啟動子。在一些實施方案中，所述Cas蛋白為Cas核酸酶，例如Cas9核酸酶。在一些實施方案中，所述Cas蛋白為具有轉錄活性的Cas蛋白。在一些實施方案中，所述具有轉錄活性的Cas蛋白為具有轉錄活性的Cas9蛋白。在一些實施方案中，所述方法還包括培養所述細胞。附圖簡述圖1A示出了經改造構建體CMVp-mK-Tr-28-g1-28，其包含與核酸有效相連的CMV啟動子(CMVp)，所述核酸包含編碼mKate2蛋白的核苷酸序列，其在編碼三螺旋結構(三鏈體，triplex)的核苷酸序列的上遊，而所述三螺旋結構在編碼側翼為Csy4識別位點(28bp)之導引RNA(gRNA1)的核苷酸序列的上遊。該改造的構建體的構造可被稱為「三鏈體/Csy4」構造。圖1A中的示意圖示出在共表達轉錄活性形式的Cas9蛋白(taCas9)、Csy4核糖核酸酶、CMVp-mK-Tr-28-g1-28以及P1-EYFP的細胞中，mKate2蛋白和導引RNA均表達。該導引RNA(gRNA)與具有轉錄活性的Cas9蛋白締合以激活合成啟動子(P1)，從而驅動增強的黃色螢光蛋白(P1-EYFP)的表達。圖1B示出了比較來自共表達CMVp-mK-Tr-28-g1-28、Cas9和Csy4之細胞的Csy4水平與相對的EYFP和mKate2表達水平的圖。EYFP的表達水平有60倍的提高，證明了功能gRNA的產生。表達Csy4的質粒濃度的提高導致mKate2表達水平的提高。以本圖和圖2B至圖2D的數據之間各自的最大螢光歸一化螢光值，以使得能夠在「三鏈體/Csy4」和「內含子/Csy4」構造之間進行交叉比較，如下文所討論。圖1C示出了比較在共表達CMVp-mK-Tr-28-g1-28、Csy4和Cas9之細胞中的Csy4和Cas9表達對於mKate2表達水平的作用的圖。Csy4和taCas9具有對mKate2螢光的相反作用。taCas9構建體單獨降低mKate2水平，而Csy4構建單獨增強mKate2螢光。以從四種檢測條件下所觀察到的最大mKate2表達值(僅Csy4)歸一化所述mKate2表達水平。圖1D示出了比較不同RNAPII啟動子對相對的IL1RNmRNA表達水平的作用的圖。使用了人RNAPII啟動子CXCL1p、H2A1p與UbCp，以及RNAPII啟動子CMVp，驅動4種不同gRNA(gRNA3-6，表1)的表達，其激活「三鏈體/Csy4」構建體的IL1RN啟動子。將結果與RNAPIII啟動子U6p對相同gRNA的直接表達的作用進行比較。將4種各自含有指定的啟動子之一以及gRNA3-6的不同質粒與編碼taCas9的質粒、有或無表達Csy4的質粒一起在細胞中共轉染。使用qRT-PCR監測相比較於具有非特異性gRNA(NS、CMVp-mK-Tr-28-g1-28)的對照構建體之相對IL1RNmRNA表達。RNAPII啟動子導致大範圍的IL1RN激活，相比於不存在Csy4，Csy4的存在極大地提高激活。即使不存在Csy4，通過RNAPII啟動子也會實現IL1RN的激活，雖然以比Csy4存在下低得多的水平。圖1E示出了比較通過「三鏈體/Csy4」構建體對內源IL1RN基因座激活的輸入-輸出轉移曲線的圖，其通過相對於相對IL1RNmRNA表達水平(作為輸出)繪製mKate2表達水平(作為輸入的代表)得以確定。該數據表明，可用不同長度的RNAPII啟動子實現內源基因座的可調調節。IL1RN數據與圖1D所示相同。圖2A示出了經改造構建體CMVp-mKEx1-[28-g1-28]內含子-mKEx2，其包含與核酸有效相連的CMV啟動子(CMVp)，所述核酸包含編碼側翼為Csy4識別位點(28bp)之導引RNA(gRNA1)的核苷酸序列，其側翼為同源內含子剪接位點，該位點在編碼mKate2蛋白的核苷酸序列內。該改造的構建體的構造可被稱為「內含子/Csy4」構造。圖2A中的示意圖示出了在共表達轉錄活性形式的Cas9蛋白、Csy4核糖核酸酶、CMVp-mKEx1-[28-g1-28]內含子-mKEx2以及P1-EYFP的細胞中，表達了導引RNA，之後其與具有轉錄活性的Cas9蛋白締合以激活合成啟動子(P1)，從而驅動增強的黃色螢光蛋白(P1-EYFP)的表達。與圖1A所示的「三鏈體/Csy4」構造相反，在Csy4水平提高的情況下，該「內含子/Csy4」構造導致mKate2基因表達的降低，在不受理論束縛的情形下，這可能是由於剪接之前的前mRNA的切割。圖2B示出了比較來自共表達CMVp-mKEx1-[28-g1-28]內含子-mKEx2、Cas9和Csy4之細胞的Csy4水平與相對的EYFP和mKate2表達水平的圖，其中所述同源內含子剪接位點來自於共有內含子。圖2C示出了比較來自共表達CMVp-mKEx1-[28-g1-28]內含子-mKEx2、Cas9和Csy4之細胞的Csy4水平與相對的EYFP和mKate2表達水平的圖，其中所述同源內含子剪接位點來自於snoRNA2內含子。圖2D示出了比較來自共表達CMVp-mKEx1-[28-g1-28]內含子-mKEx2、Cas9和Csy4之細胞的Csy4水平與相對的EYFP和mKate2表達水平的圖，其中所述同源內含子剪接位點來自於HSV1內含子。圖2E示出了比較來自共表達CMVp-mKEx1-[28-g1-28]內含子-mKEx2、Cas9和Csy4之細胞的Csy4水平與相對的EYFP和mKate2表達水平的圖，其中單個Csy4結合位點位於HSV1內含子內的gRNA上遊。該構造不產生功能gRNA但在更高的Csy4水平下會導致mKate2螢光的降低。以該實驗和[28-g1-28]HSV1對照(圖11)之間的最大螢光水平歸一化螢光值。圖2F示出了比較來自共表達CMVp-mKEx1-[28-g1-28]內含子-mKEx2、Cas9和Csy4之細胞的Csy4水平與相對的EYFP和mKate2表達水平的圖，其中單個Csy4結合位點位於HSV1內含子內的gRNA下遊。該構造產生低水平的功能gRNA並且也導致在更高的表達Csy4的質粒濃度下mKate2水平的降低。以該實驗和[28-g1-28]HSV1對照(圖11)之間的最大螢光水平歸一化螢光值。圖3A示出了經改造構建體CMVp-mK-Tr-HH-g1-HDV，其包含與核酸有效相連的CMV啟動子(CMVp)，所述核酸包含編碼mKate2蛋白的核苷酸序列，其在編碼三螺旋結構(三鏈體)的核苷酸序列的上遊，所述三螺旋結構在編碼導引RNA(gRNA1)的核苷酸序列的上遊，所述導引RNA側翼為核酶(5』錘頭狀(HH)核酶，以及3』HDV核酶)。該改造的構建體的構造可被稱為「三鏈體/核酶」構造。圖3A中的示意圖示出在共表達轉錄活性形式的Cas9蛋白、Csy4核糖核酸酶、以及CMVp-mK-Tr-HH-g1-HDV的細胞中，mKate2蛋白和導引RNA均表達。圖3B示出了經改造構建體CMVp-mK-HH-g1-HDV，其包含與核酸有效相連的CMV啟動子(CMVp)，所述核酸包含編碼mKate2蛋白的核苷酸序列，其在編碼導引RNA(gRNA1)的核苷酸序列的上遊，所述導引RNA的側翼為核酶(5』錘頭狀(HH)核酶，以及3』HDV核酶)。圖3B中的示意圖示出在共表達轉錄活性形式的Cas9蛋白、Csy4核糖核酸酶、以及CMVp-mK-HH-g1-HDV的細胞中，mKate2蛋白和導引RNA均表達。圖3C示出了經改造構建體CMVp-HH-g1-HDV，其包含與核酸有效相連的CMV啟動子(CMVp)，所述核酸包含編碼導引RNA(gRNA1)的核苷酸序列，所述導引RNA的側翼為核酶(5』錘頭狀(HH)核酶，以及3』HDV核酶)。圖3C中的示意圖示出在共表達轉錄活性形式的Cas9蛋白、Csy4核糖核酸酶、以及CMVp-HH-g1-HDV的細胞中，導引RNA表達。圖3D示出了比較共表達CMVp-mK-Tr-HH-g1-HDV、CMVp-mK-HH-g1-HDV或CMVp-HH-g1-HDV以及P1-EYFP的細胞中相對EYFP與mKate2表達水平的圖。示出了有或無Csy4情況下表達「三鏈體/Csy4」構建體(mK-Tr-28-g1-28)的細胞，以及表達RNAPIII啟動子、U6p、驅動性gRNA1(U6p-g1)的細胞的表達水平，以用於比較。圖4A示出了經改造構建體，其包含與核酸有效相連的CMV啟動子(CMVp)，所述核酸包含編碼側翼為Csy4識別位點(28bp)之導引RNA(gRNA1)的核苷酸序列，其側翼為同源內含子剪接位點，所述位點在編碼mKate2蛋白的核苷酸序列內，其位於編碼三螺旋結構(三鏈體)的核苷酸序列的上遊，所述三螺旋結構位於編碼側翼為Csy4識別位點(28bp)之gRNA(gRNA2)的核苷酸序列的上遊(輸入A，「內含子-三鏈體」)。通過gRNA1特異性P1-EYFP構建體和gRNA2特異性P2-ECFP構建體的激活評估功能gRNA的表達。圖4B示出了經改造構建體，其包含與核酸有效相連的CMV啟動子(CMVp)，所述核酸包含編碼mKate2蛋白的核苷酸序列，其位於編碼三螺旋結構(三鏈體)的核苷酸序列的上遊，所述三螺旋結構位於編碼2個gRNA(gRNA1和gRNA2)的核苷酸序列的上遊，所述gNRA各自的側翼為Csy4識別位點。所述gRNA與間插及側翼的Csy4識別位點串聯地編碼(輸入B，「三鏈體-串聯」)。通過gRNA1特異性P1-EYFP構建體和gRNA2特異性P2-ECFP構建體的激活評估功能gRNA的表達。圖4C示出的圖證明了這兩種多重gRNA表達構建體(輸入A和輸入B)表現出在Csy4存在下，對EYFP及ECFP表達的有效激活，從而證明了從單個轉錄本產生多活性gRNA。此外，如從圖1和圖2所預計的，mKate2水平因為內含子構造隨著輸入A而降低，而mKate2水平因為非內含子構造隨著輸入B而提高。圖5A示出了經改造構建體，其包含與核酸有效相連的CMV啟動子(CMVp)，所述核酸包含編碼mKate2蛋白的核苷酸序列，其位於編碼三螺旋結構(三鏈體)的核苷酸序列的上遊，所述三螺旋結構位於編碼4個不同的gRNA(gRNA3至gRNA6)的核苷酸序列的上遊，所述gNRA各自的側翼為Csy4識別位點。所述gRNA與間插及側翼的Csy4識別位點串聯地編碼(mK-Tr-(28-g-28)3-6)。圖5B示出的圖證明了多重mK-Tr-(28-g-28)3-6構建體表現出在Csy4的存在下相比於不存在Csy4的情況下相同構建體之IL1RN表達的高水平激活。與具有通過「三鏈體/Csy4」構造表達的非特異性gRNA1(NS，CMVp-mK-Tr-28-g1-28)的對照構建體相比，確定相對IL1RNmRNA的表達。為了比較，示出了非多重質粒組，其含有相同的gRNA(gRNA3至gRNA6)，每一個gRNA由分開的單獨質粒表達。圖6A示出了通過使用內含子gRNA1(CMVp-mKEX1-[28-g1-28]HSV-mKEX2)作為第一階段實施的三階段轉錄級聯。gRNA1特異性地靶向P1啟動子以表達gRNA2(P1-EYFP-Tr-28-g2-28)，之後從P2啟動子激活ECFP的表達(P2-ECFP)。圖6B示出了通過使用「三鏈體/Csy4」構造以表達gRNA1(CMVp-mK-Tr-28-g1-28)從而實施的三階段轉錄級聯。gRNA1特異性地靶向P1啟動子以表達gRNA2(P1-EYFP-Tr-28-g2-28)，之後從P2啟動子激活ECFP的表達(P2-ECFP)。圖6C示出的圖證明了圖6A中的完整三階段轉錄級聯表現出所有三種螢光蛋白的表達。將級聯中的三個階段的任意一個移除會導致該具體階段及依賴性的下遊階段的螢光喪失。圖6D示出的圖證明了圖6B中的完整三階段轉錄級聯表現出所有三種螢光蛋白的表達。將級聯中的三個階段的任意一個移除會導致該具體階段及依賴性的下遊階段的螢光喪失。圖7A示出了經改造構建體，其通過從mKate2內的內含子表達miRNA以及從「三鏈體/Csy4」構造(CMVp-mKEx1-[miR]-mKEx2-Tr-28-g1-28)表達gRNA1，編碼miRNA以及基於CRISPR-TF的調控兩者。在存在taCas9但不存在Csy4的情況下，該線路不激活下遊的gRNA1特異性P1-EYFP構建體並且確實阻抑下遊的ECFP轉錄本，該轉錄本具有8個(8x)miRNA結合位點，所述位點的側翼為Csy4識別位點(CMVp-ECFP-Tr-28-miR8xBS)。在taCas9和Csy4兩者均存在的情況下，該線路通過激活gRNA1的產生及隨後的EYFP表達，以及通過將ECFP轉錄本從8xmiRNA結合位點分離而被重接，從而消除了miRNA對ECFP表達的抑制。圖7B示出的圖證明了Csy4表達可通過重接線路互連改變圖7A中所述線路的行為。圖7C示出了線路基序圖(circuitmotifdiagram)，其舉例說明了Csy4催化的重接。圖7D示出了通過編碼位於輸入轉錄本(CMVp-mKEx1-[miR]-mKEx2-Tr-28-g1-28-miR4xBS)3』末端的4xmiRNA結合位點而被併入描述於圖7A中線路的網絡拓撲結構的自我調控的反饋環路。該負反饋在Csy4不存在的情況下抑制mKate2的表達。然而，在Csy4存在下，所述4xmiRNA結合位點被從mKate2mRNA中分離，從而導致mKate2的表達。圖7E示出的圖證明了Csy4的表達可通過重接線路互連改變圖7D中線路的行為。與圖7A中的線路相反，mKate2在Csy4不存在的情況下被抑制，但當Csy4存在的情況下由於基於miRNA的自我調控負反饋的消除，mKate2大量表達。圖7F示出了線路基序圖，其舉例說明了Csy4催化的重接。以所有測試方案中的各自最大螢光水平歸一化圖7B和圖7E中mKate2、EYFP以及ECFP每一個的水平。重複圖7B和圖7E中第3列和第4列的對照，而將圖7A和圖7D中的2個線路在相同的實驗中用相同的對照進行測試。圖8A示出了對應於「三鏈體/csy4」構造以從RNAPII轉錄本產生功能gRNA的流式細胞術數據。圖8B示出了用於從RNAPII轉錄本產生功能gRNA的「內含子/Csy4」構造。縮寫：Comp-PE-Tx-Red-YG-A(mKate2)；Comp-FITC-A(EYFP)。三鏈體：構建體#3(CMVp-mK-Tr-28-g1-28，1μg)。共有、snoRNA2以及HSV1：分別為構建體#8-構建體#10(CMVp-mKEX1-[28-g1-28]「內含子類型」-mKEX2，對應的內含子序列在gRNA和Csy4識別序列(「28」)側翼)。將這些質粒以1μg轉染。此外，指定了每個樣品中轉染的表達Csy4質粒(構建體#2)的量。其他轉染的質粒包括構建體#1(taCas9，1μg)和#5(P1-EYFP，1μg)。圖9示出了對應於圖1B的流式細胞術數據，以分析對於CMVp-mK-Tr-28-g1-28構造，Csy4和taCas9的多種組合如何影響mKate2基因的表達。縮寫：Comp-PE-Tx-Red-YG-A(mKate2)。所有樣品都含有構建體#3(CMVp-mK-Tr-28-g1-28，1μg)。將構建體#1(taCas9，1μg)與構建體#2(Csy4，100ng)按照指定方式應用。圖10示出的流式細胞術數據提供了多種對照，以證明通過gRNA3(上方兩圖)的P1啟動子的最小非特異性激活以及具有內含子gRNA1而沒有Csy4結合位點(下圖)的啟動子P1的最小EYFP激活。縮寫：Comp-PE-Tx-Red-YG-A(mKate2)；Comp-FITC-A(EYFP)。上方兩圖每個樣品中轉染的Csy4DNA量如圖中所指定。下圖(CMVp-mKEX1-[g1]cons-mKEX2)在Csy4不存在的情況下測試。該實驗中其他轉染的質粒包括構建體#1(taCas9，1μg)和構建體#5(P1-EYFP，1μg)。圖11示出了對應於圖2E和圖2F的流式細胞術數據，以分析在內含子內gRNA側翼的Csy4識別位點的多種構造如何影響CRISPR-TF活性。縮寫：Comp-PE-Tx-Red-YG-A(mKate2)；Comb-FITC-A(EYFP)。「28-gRNA-28」為HSV1內含子gRNA，其側翼為2個Csy4識別位點(構建體#4，CMVp-mKEX1-[28-g1-28]HSV1-mKEX2)；「28-gRNA」為HSV1內含子gRNA，其僅有5』Csy4識別位點(構建體#10，CMVp-mKEX1-[28-g1]HSV1-mKEX2)；「gRNA-28」為HSV1內含子gRNA，其僅有3』Csy4識別位點(構建體#11，CMVp-mKEX1-[g1-28]HSV1-mKEX2)。此外，在每個樣品中轉染的表達Csy4質粒的量如每個圖中所指定。該實驗中其他轉染的質粒包括構建體#1(taCas9，1μg)和構建體#5(P1-EYFP，1μg)。圖12示出了對應於圖3的流式細胞術數據。縮寫：Comp-PE-Tx-Red-YG-A(mKate2)；Comp-FITC-A(EYFP)。「三鏈體-Csy4」機制含有構建體#3(CMVp-mK-Tr-28-g1-28)。該實驗中其他轉染的質粒包括構建體#1(taCas9，1μg)；構建體#5(P1-EYFP，1μg)；構建體#2(Csy4，指定的濃度)。「核酶設計1」包含構建體#13(CMVp-mK-Tr-HH-g1-HDV)。該實驗中其他轉染的質粒包括構建體#1(taCas9，1μg)；構建體#5(P1-EYFP，1μg)。「核酶設計2」包含構建體#14(CMVp-mK-HH-g1-HD)。該實驗中其他轉染的質粒包括構建體#1(taCas9，1μg)；構建體#5(P1-EYFP，1μg)。「核酶設計3」包含構建體#15(CMVp-HH-g1-HDV)。該實驗中其他轉染的質粒包括構建體#1(taCas9，1μg)；構建體#5(P1-EYFP，1μg)。「U6p-gRNA1」包含構建體#7(U6p-g1，1μg)。該實驗中其他轉染的質粒包括構建體#1(taCas9，1μg)。圖13示出了對應於圖4C的流式細胞術數據。縮寫：Comp-PE-Tx-Red-YG-A(mKate2)；Comp-FITC-A(EYFP)；Comp-PacificBlue-A(ECFP)。「機制1」指「內含子-三鏈體」構造，並且含有構建體#16(CMVp-mKEX1-[28-g1-28]HSV1-mKEX2-Tr-28-g2-28，1μg)；構建體#5(P1-EYFP，1μg)；構建體#6(P2-ECFP，1μg)；以及構建體#1(taCas9，1μg)。「機制2」指「串聯-三鏈體」構造，並且含有構建體#17(CMVp-mK-Tr-28-g1-28-g2-28，1μg)；構建體#5(P1-EYFP，1μg)和構建體#6(P2-ECFP，1μg)；以及構建體#1(taCas9，1μg)。此外，在每個樣品中轉染的表達Csy4的質粒DNA(構建體#2)的量如上文每個圖中所指定。圖14示出了對應於圖6C和圖6D的流式細胞術數據。縮寫：Comp-PE-Tx-Red-YG-A(mKate2)；Comp-FITC-A(EYFP)；Comp-PacificBlue-A(ECFP)。所有樣品均用列於每個圖表名稱中的構建體(每種1μg，表2)，以及200ng的表達Csy4的質粒(構建體#2)轉染。圖15示出了對應於圖7B和圖7E的流式細胞術數據。縮寫：Comp-PE-Tx-Red-YG-A(mKate2)；Comp-FITC-A(EYFP)；Comp-PacificBlue-A(ECFP)。「機制1」含有以下構建體：構建體#20(CMVp-mKEx1-[miR]-mKEx2-Tr-28-g1-28)；構建體#22(CMVp-ECFP-Tr-28-miR8xBS-28)；以及構建體#5(P1-EYFP)。這些質粒以每種1μg的濃度轉染。該機制對應於圖7A中的線路圖。「機制2」含有以下構建體：構建體#21(CMVp-mKEx1-[miR]-mKEx2-Tr-28-g1-28-miR4xBS)；構建體#22(CMVp-ECFP-Tr-28-miR8xBS-28)；以及構建體#5(P1-EYFP)。這些質粒以每種1μg的濃度轉染。該機制對應於圖7D中的線路圖。「對照」樣品僅含有構建體#22(CMVp-ECFP-Tr-28-miR8xBS-28)以及構建體#5(P1-EYFP)。這些質粒以每種1μg的濃度轉染。此外，在每個樣品中轉染的表達Csy4的質粒(構建體#2)的量如上文每個圖中所指定。發明詳述建立複雜、穩健並可擴展的對人工部分與天然細胞過程之間的限定的互連進行操作的合成基因網絡的能力，是改造生物系統的核心。該能力可以使例如用於重接、微擾以及探知自然生物網絡的新策略成為可能。大量可調、正交、緊湊以及可多重的基因調控機制對於這些應用的實施具有根本的重要性。儘管在轉錄調控和合成生物學領域中有許多進展，但在本公開內容之前的可用工具無法滿足一種或更多種上述標準。轉錄調控利用與目的預定DNA序列相結合的轉錄因子。II型CRISPR/Cas系統(例如，具有靶向DNA的Cas蛋白)已經適用於獲得可編程的DNA結合而不需要複雜的蛋白質改造(Sander和Joung，2014)。在這些系統中，所述CasDNA結合蛋白的序列特異性通過導引RNA(gRNA)確定，其具有與靶DNA位點的鹼基配對互補性。這使得能夠簡單且高度靈活地編程Cas結合。在本公開內容以前，在人細胞中用於基因調控的gRNA僅從RNA聚合酶III(RNAPIII)啟動子表達。這對於將CRISPR/Cas調控與內源基因網絡整合的情況是限制，因為RNAPIII啟動子僅包含小部分的細胞啟動子，而且大部分為組成型活性，因此阻止了大部分細胞啟動子和信號與基於CRISPR-TF的網絡的連接。此外，通常需要多個gRNA以有效地激活內源啟動子，但在本公開內容之前，沒有可用的從單個轉錄本多重產生gRNA以用於轉錄調控的策略。因此，需要多個gRNA表達構建體以微擾天然轉錄網絡，從而限制了可擴展性。除了轉錄調控之外，天然線路通過基於RNA的翻譯和翻譯後調控，以獲得複雜的行為。本文所提供的將RNA與轉錄改造相結合的合成基因調控策略可用於天然系統的建模或人工行為的實施。因此，本文在多個方面中提供了整合基於哺乳動物與細菌RNA的調控機制的方法和組合物，以例如產生複雜的合成線路拓撲結構以及調控內源啟動子。可以使用多個哺乳動物RNA處理策略，包括3』RNA三螺旋(稱為三鏈體)、內含子與核酶，連同哺乳動物miRNA調控、來源於細菌的CRISPR-TF以及來自於銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)的Csy4RNA修飾蛋白。這些構建體可用於例如在人細胞中從RNAP-II調控的mRNA產生功能gRNA，同時使伴隨的mRNA翻譯可調。如本文所示，功能gRNA用於靶向合成的以及內源啟動子兩者，以通過CRISPR-TF激活。此外，開發了用於多重gRNA產生的策略，從而使得能夠緊湊地編碼單個轉錄本中的蛋白質和多個gRNA。為了證明這些調控部分的用途，實施了可用於複雜的合成基因線路構建的多階段轉錄級聯。在一些實施方案中，通過基於Csy4的RNA處理，本文還組合了基於哺乳動物miRNA的調控以及CRISPR-TF，以產生多組件的遺傳線路，其具有反饋環、互連和可重接的行為。因此，通過使用合成轉錄和RNA依賴性的機制，本公開內容的平臺可用於例如構建、同步以及轉換人工和內源這兩種複雜的調控網絡。在一些實施方案中，基於CRISPR-TF的基因調控系統與哺乳動物RNA調控構造的整合使得用於合成生物學以及基礎生物學應用的可擴展基因調控系統成為可能。本公開內容的一些方面涉及經改造構建體以及經改造核酸。「經改造構建體」為用於描述經改造具有多個遺傳元件的核酸的術語，所述遺傳元件包括例如啟動子及多種核苷酸序列(例如，編碼蛋白質和/或RNA幹擾分子的核苷酸序列，如本文所提供的)。核酸是至少兩個共價連接在一起的核苷酸，並且在一些情況下，其可以含有磷酸二酯鍵(例如磷酸二酯「骨架」)。經改造核酸是不天然存在的核酸。然而，應該理解的是，儘管經改造核酸整體上不是天然存在的，其可以包括天然存在的核苷酸序列。在一些實施方案中，經改造核酸包含來自於不同生物體的核苷酸序列(例如，來自於不同物種)。例如，在一些實施方案中，經改造核酸包括鼠核苷酸序列、細菌核苷酸序列、人核苷酸序列和/或病毒核苷酸序列。經改造核酸包括重組核酸以及合成核酸。重組核酸是通過將核酸(例如，分離的核酸、合成核酸或其組合)連接構建的分子，並且在一些實施方案中，其可以在活細胞中複製。合成核酸是擴增得到的或通過化學方法或其他手段合成的分子。合成核酸包括以化學方法修飾的或以其他方法修飾的，但可以與天然存在的核酸分子鹼基配對的那些。重組和合成核酸也包括前述任一複製產生的那些分子。在一些實施方案中，本公開內容的核酸被認為是核酸類似物，其可以含有至少一部分其他骨架，所述骨架包含例如磷醯胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、O-甲基亞磷醯胺鍵和/或肽核酸。具體而言，核酸可以為單鏈(single-stranded，ss)或雙鏈(double-stranded，ds)，或可以含有單鏈和雙鏈序列兩種部分。在一些實施方案中，核酸可含有三鏈序列的部分。核酸可以是DNA(基因組和/或cDNA兩者)，RNA或雜合體，其中核酸含有任何脫氧核糖核苷酸與核糖核苷酸的組合(例如，人工的或天然的)，以及任何鹼基的組合，包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、異胞嘧啶以及異鳥嘌呤。本公開內容的經改造構建體(包括經改造核酸)包含一個或更多個遺傳元件。「遺傳元件」指在核酸表達中具有作用的特定核苷酸序列(例如啟動子、增強子、終止子)或編碼經改造核酸之不連續產物的特定核苷酸序列(例如編碼導引RNA、蛋白質和/或RNA幹擾分子的核苷酸序列)。本公開內容遺傳元件的實例包括但不限於啟動子以及編碼蛋白質、導引RNA、Csy4結合位點、三螺旋結構、內含子和內含子序列(例如，供體位點、接受體位點(acceptorsite)和/或分支位點)、外顯子以核酶的核苷酸序列。本公開內容的經改造核酸的遺傳元件的位置可相對於其他遺傳元件沿著5』至3』方向的編碼(有義)鏈限定。例如，圖1A示出了與編碼mKate2蛋白的核苷酸序列有效相連的CMV啟動子，該序列位於編碼三螺旋結構(或三鏈體)的核苷酸序列的上遊，該編碼三螺旋結構的核苷酸序列位於編碼側翼為Csy4結合位點的導引RNA的核苷酸序列的上遊。或者，圖1A所示的經改造核酸可描述為具有編碼側翼為Csy4結合位點的導引RNA的核苷酸序列，該序列位於編碼三螺旋結構的核苷酸序列的下遊，該編碼三螺旋結構的核苷酸序列位於編碼mKate2蛋白的核苷酸序列的下遊，該編碼mKate2蛋白的核苷酸序列與上遊的啟動子有效相連。因此，如果第一遺傳元件位於第二遺傳元件的3』，則認為所述第一遺傳元件位於所述第二遺傳元件的下遊。相似地，如果第二遺傳元件位於第一遺傳元件的5』，則認為所述第二遺傳元件位於所述第一遺傳元件的上遊。如果兩個遺傳元件彼此接近(例如，沒有其他遺傳元件位於兩者之間)，則認為一個遺傳元件是另一個遺傳元件的「緊接的下遊」或「緊接的上遊」。例如在圖1A所示的構造中，編碼側翼為Csy4結合位點的導引RNA的核苷酸序列位於編碼三螺旋結構的核苷酸序列的緊接的下遊。本公開內容的一些方面涉及經改造核酸，其包含(例如1個或更多個，至少1個)核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼(例如至少1個，包括至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個，或更多個)導引RNA(gRNA)。gRNA是CRISPR/Cas系統的組成部分。多種細菌和古細菌使用CRISPR/Cas系統來介導針對病毒和其他外來核酸的防禦。CRISPR/Cas系統的組成部分協調選擇性地切割核酸。II型CRISPR/Cas系統包括靶向DNA的Cas蛋白，而III型CRISPR/Cas系統包括靶向RNA的Cas蛋白。CasDNA結合蛋白的序列特異性由gRNA確定，其具有與靶DNA位點的鹼基配對互補性。因此，Cas蛋白由gRNA「導引」至靶DNA位點。在一些實施方案中，gRNA的鹼基配對互補性使得能夠簡單且靈活地編程Cas結合。鹼基配對互補性指腺嘌呤與胸腺嘧啶(DNA)或尿嘧啶(RNA)之間，以及鳥嘌呤與胞嘧啶之間的相區別的相互作用。在一些實施方案中，本公開內容的導引RNA的長度為10至500個核苷酸。在一些實施方案中，gRNA的長度為10至20個核苷酸、10至30個核苷酸、10至40個核苷酸、10至50個核苷酸、10至60個核苷酸、10至70個核苷酸、10至80個核苷酸、10至90個核苷酸、10至100個核苷酸、20至30個核苷酸、20至40個核苷酸、20至50個核苷酸、20至60個核苷酸、20至70個核苷酸、20至80個核苷酸、20至90個核苷酸、20至100個核苷酸、30至40個核苷酸、30至50個核苷酸、30至60個核苷酸、30至70個核苷酸、30至80個核苷酸、30至90個核苷酸、30至100個核苷酸、40至50個核苷酸、40至60個核苷酸、40至70個核苷酸、40至80個核苷酸、40至90個核苷酸、40至100個核苷酸、50至60個核苷酸、50至70個核苷酸、50至80個核苷酸、50至90個核苷酸或50至100個核苷酸。在一些實施方案中，gRNA的長度為10至200個核苷酸、10至250個核苷酸、10至300個核苷酸、10至350個核苷酸、10至400個核苷酸或10至450個核苷酸。在一些實施方案中，gRNA的長度為超過500個核苷酸。在一些實施方案中，gRNA的長度為10、15、20、15、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500或更多個核苷酸。出人意料的是，在一些實施方案中，本公開內容的方法和組合物允許從單個轉錄本產生多個導引RNA(gRNA)。然而，應理解，可在單細胞中從多個轉錄本產生多個gRNA。本文提供的所產生的gRNA可具有相同的核苷酸序列或可具有不同的核苷酸序列。因此，gRNA可靶向並結合相同的靶位點或不同的靶位點(例如，在特定啟動子內的區域)。例如，一些經改造核酸包含編碼第一gRNA的核苷酸序列以及編碼第二gRNA的核苷酸序列(或編碼至少2個gRNA的核苷酸序列)。所述第一gRNA可具有與第二gRNA相同的RNA序列，並且，因此這2個gRNA可靶向相同的位點。或者，所述第一gRNA可具有與第二gRNA不同的RNA序列，並且，因此這2個gRNA可靶向不同的位點(例如，在相同的啟動子內或在不同的啟動子內)。如圖4A中所示例，「gRNA1」靶向與增強的黃色螢光蛋白(EYFP)有效連接的啟動子(P1)，而「gRNA2」靶向與增強的青色螢光蛋白(ECFP)有效連接的啟動子(2)。如果第一核苷酸序列插入第二核苷酸序列的2個核苷酸之間，或者如果該核苷酸序列替換了第二核苷酸序列的一段連續的核苷酸，則認為所述第一核苷酸序列在所述第二核苷酸序列「內」。在一些實施方案中，核苷酸序列編碼目的蛋白質內的gRNA或RNA幹擾分子。例如在此構造中，編碼gRNA的核苷酸序列位於目的蛋白質的兩個相鄰外顯子之間，以使得當所編碼的gRNA被移除時(例如，如果該gRNA側翼為同源內含子剪接位點，則通過RNA剪接)，該蛋白質被翻譯。在一些實施方案中，如上文所討論的導引RNA「導引」Cas蛋白至核酸。Cas蛋白是切割核酸的核酸酶。在一些實施方案中，Cas蛋白(如Cas9蛋白)的核酸酶活性可被用於原核和真核細胞中的精確且有效的基因組編輯。本文還考慮到了突變的Cas蛋白。在一些實施方案中，突變的Cas蛋白缺乏核酸酶活性(例如，dCas9)。在一些實施方案中，對缺乏核酸酶活性的突變Cas蛋白進行修飾，以使得能夠在哺乳動物細胞中進行異位和天然啟動子的可編程轉錄調控，以產生基於CRISPR的轉錄因子(CRISPR-TF)(Cheng等，2013；Farzadfard等，2013；Gilbert等，2013；Maeder等，2013a；Mali等，2013a；Perez-Pinera等，2013a)。例如，將激活結構域(例如，VP16、VP64或p65)與Cas蛋白融合使得Cas具有轉錄活性(也稱為「taCas」蛋白)。轉錄激活蛋白募集RNA聚合酶II機器以及染色質修飾活性至啟動子。因此，在一些實施方案中，根據本公開內容使用了「具有轉錄活性的」Cas(taCas)蛋白，其缺乏核酸酶活性。在一些實施方案中，具有轉錄活性的Cas蛋白為具有轉錄活性的Cas9(taCas9)蛋白。本文考慮了其他具有轉錄活性的Cas蛋白。在一些實施方案中，本公開內容的導引RNA的側翼為核糖核酸酶識別位點。核糖核酸酶(縮寫為RNA酶)是催化RNA水解的核酸酶。核糖核酸酶可以為核糖核酸內切酶或核糖核酸外切酶。核糖核酸內切酶切割單鏈或雙鏈RNA。核糖核酸外切酶通過從RNA的5』末端或3』末端移除末端核苷酸降解RNA。在一些實施方案中，本公開內容的導引RNA的側翼為Csy核糖核酸酶識別位點(例如Csy4核糖核酸酶識別位點)。Csy4是核糖核酸內切酶，其識別特定的RNA序列、切割該RNA並保持與上遊片段的結合。在一些實施方案中，Csy核糖核酸酶(例如Csy4核糖核酸酶)被用於從經改造核酸轉錄本釋放導引RNA。因此，在一些實施方案中，用包含編碼側翼為Csy4或其他Cas6核糖核酸酶識別位點之導引RNA的核苷酸序列的經改造構建體，以及編碼Csy4或其他Cas6核糖核酸酶的經改造核酸對細胞共轉染。或者，或另外地，細胞可穩定表達，或經修飾而穩定表達Csy4或其他Cas6核糖核酸酶。在一些實施方案中，Csy核糖核酸酶(例如Csy4核糖核酸酶)來自於銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、激烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)或硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobussolfataricus)。本文考慮了其他核糖核酸酶及核糖核酸酶識別位點(參見例如，Mojica，F.J.M.等，CRISPR-CasSystems，RNA-mediatedAdaptiveImmunityinBacteriaandArchaea，Barrangou，Rodolphe，vanderOost，John(編輯)，2013，ISBN978-3-642-34657-6，其涉及核糖核酸酶/識別位點的主題通過引用併入本文)。在一些實施方案中，核糖核酸酶識別位點(例如Csy4核糖核酸酶識別位點)的長度為10至50個核苷酸。例如，Csy核糖核酸酶識別位點的長度可以為10至40、10至30、10至20、20至50、20至40或20至30個核苷酸。在一些實施方案中，Csy核糖核酸酶識別位點的長度為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸。在一些實施方案中，Csy核糖核酸酶識別位點(例如Csy4核糖核酸酶識別位點)的長度為28個核苷酸。在一些實施方案中，編碼核糖核酸酶識別位點的核苷酸序列包含SEQIDNO：26。本文還考慮了Csy同源物(參見例如，Mojica，F.J.M.等，CRISPR-CasSystems，RNA-mediatedAdaptiveImmunityinBacteriaandArchaea，Barrangou，Rodolphe，vanderOost，John(編輯)，2013，ISBN978-3-642-34657-6，其涉及核糖核酸酶/識別位點的主題通過引用併入本文)。當第一遺傳元件位於其他遺傳元件之間並與其緊鄰時，則稱所述第一遺傳元件的「側翼」為其他遺傳元件。例如，圖1A示出的示意圖，其為編碼側翼為Csy4結合位點(「28bp」)之「gRNA1」的核苷酸序列。相似的，圖2A中的示意圖代表編碼側翼為Csy4結合位點(「28bp」)之「gRNA1」的核苷酸序列，其側翼還有編碼同源內含子剪接位點的核苷酸序列，其側翼還有編碼mKate2蛋白外顯子的核苷酸序列。在一些實施方案中，經改造構建體含有多個串聯的gRNA，例如圖5A所示。這樣的構建體本文可描述為具有編碼至少2個gRNA的核苷酸序列，每個gRNA的側翼為核糖核酸酶識別位點。應當理解的是該構造意在包含多個串聯的gRNA，每個gRNA的側翼為單個核糖核酸酶識別位點(ribonucleaserecognitionsite，RRS)，如圖5A所示(在圖中RSS指代為「28bp」)；還包含多個串聯的gRNA，每個gRNA的側翼為2個或更多個核糖核酸酶識別位點。例如，在經改造構建體中，可以遺傳元件的順序可以如下：RRS1-gRNA1-RRS2-gRNA2-RRS3-gRNA-RRS4，其中單個核糖核酸酶識別位點將1個gRNA與相鄰的gRNA分開；或者RRS1-gRNA1-RRS2-RRS3-gRNA2-RRS4-RRS5-gRNA-RRS6，其中2個核糖核酸酶識別位點將1個gRNA與相鄰的gRNA分開。所述RRS可以是相同或不同的。即，在一些實施方案中，可以使用不同類型的核糖核酸酶以從經改造構建體釋放1個或更多個gRNA。本公開內容的一些方面涉及經改造構建體，其包含3』RNA穩定序列(stabilizingsequence)，例如形成三螺旋結構(或「三鏈體」)的RNA序列。3』RNA穩定序列為添加到編碼產物之核苷酸序列3』末端以補充poly(A)尾缺乏的核苷酸序列。因此，在一些實施方案中，如那些形成三螺旋結構的3』RNA穩定序列使得能夠對缺乏poly(A)尾的mRNA進行有效翻譯。三螺旋結構是例如通過富含腺嘌呤和尿苷的基序所形成的的二級或三級RNA結構。在一些實施方案中，3』RNA穩定序列來自於核酸的3』非翻譯區(untranslatedregion，UTR)。在一些實施方案中，三螺旋結構促進RNA穩定性和/或翻譯。在一些實施方案中，本公開內容的三螺旋結構由來自於MALAT1(轉移相關肺腺癌轉錄本1，metastasis-associatedlungadenocarcinomatranscript1)基因座或MENβ(多發性內分泌腺瘤形成β，multipleendocrineneoplasia-β)基因座的3』末端的核苷酸片段編碼。在一些實施方案中，三螺旋結構由來自於MALAT1基因座3』末端或MENβ基因座3』末端的核苷酸片段編碼(參見例如，Wilusz等，2012，通過引用併入本文；還參見，BrownJA等ProcNatlAcadSciUSA.201211月20；109(47)，通過引用併入本文)。在一些實施方案中，三螺旋結構由來自於MALAT1基因座3』末端的110個核苷酸序列(例如，110個連續的核苷酸序列)編碼。在一些實施方案中，三螺旋結構由包含SEQIDNO：1或由其組成的核酸編碼。本文考慮了其他3』RNA穩定序列，包括編碼三螺旋結構的那些(參見例如，WiluszJ.E.等RNA2010.16：259-266，通過引用併入本文)。本公開內容的一些方面涉及經改造構建體，其包含編碼側翼為核糖核酸酶(例如，Csy4)識別位點的gRNA的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列的側翼為編碼同源內含子剪接位點的核苷酸序列。在本領域中，術語「內含子」經常指基因中的DNA序列以及在RNA轉錄本中的對應序列兩者。本文為了清楚和一致，應當理解的是，在經改造構建體的情景中，「編碼內含子的核苷酸序列」指DNA序列，而術語「內含子」指RNA序列。內含子是非編碼RNA序列，其通過RNA剪接而被移除。RNA剪接是這樣的過程，通過其對前信使RNA進行修飾以移除內含子並將外顯子(例如，核酸的編碼蛋白質的區域)連到一起，以形成成熟的信使RNA(mRNA)分子。「同源內含子剪接位點」包括供體位點(例如，在內含子的5』末端)、分支位點(例如，接近內含子的3』末端)以及接受體位點(例如，在內含子的3』末端)，以使得在RNA剪接期間，移除任何間插序列(例如在5』剪接位點與3』剪接位點之間的序列)。例如，圖2A所示的經改造構建體包含側翼為內含子剪接位點的間插遺傳元件(例如，編碼側翼為Csy4結合位點之gRNA的核苷酸序列)。在從圖2A的經改造構建體產生轉錄本的過程中，所述間插遺傳元件被移除。在一些實施方案中，5』剪接供體位點在更大的、較不高度保守的區域內包含幾乎不變的序列GU。在一些實施方案中，3』剪接接受體位點包含幾乎不變的AG序列。在一些實施方案中，在所述AG的上遊有高嘧啶(例如，C和U)的區域，稱為多聚嘧啶串(polypyrimidinetract)。在一些實施方案中，在多聚嘧啶串上遊是分支點(branchpoint)，其可以包含例如腺嘌呤核苷酸。在一些實施方案中，內含子的共有序列(在IUPAC核酸標記法中)為：M-A-G-[切割]-G-U-R-A-G-U(供體位點)...內含子序列...C-U-R-[A]-Y(分支序列，例如在接受體位點上遊的20至50個核苷酸)...Y-富含-N-C-A-G-[切割]-G(接受體位點)。在一些實施方案中，本文考慮了產生相對穩定的(例如「長壽命的」)內含子的內含子序列。該序列的實例包括但不限於HSV-1潛伏相關內含子，其形成穩定的環狀內含子(Block和Hill，1997)，以及sno-IncRNA2內含子(Yin等，2012)。所述sno-IncRNA2內含子(或「sno-RNA2內含子」)在snoRNA機器的兩端上處理，這防止其降解並導致側翼為snoRNA序列的IncRNA的累積，其缺乏5』帽和3』poly(A)尾。本文還考慮了其他對內含子序列賦予結構穩定性的序列。本公開內容的一些方面涉及經改造構建體，其包含編碼側翼為核酶的gRNA的核苷酸序列。核酶是能夠催化特異性生化反應的RNA分子，與蛋白質酶的作用相似。順式作用核酶通常為自體形成並且能夠自體切割。順式作用核酶可介導從RNApolII啟動子的功能gRNA表達。相比而言，反式作用核酶不進行自體切割。自體切割指分子內的催化過程，其中含有核酶的RNA分子被其自身切割。根據本公開內容所使用的順式作用核酶的實例包括但不限於錘頭狀(HH)核酶(參見例如，Pley等，1994，通過引用併入本文)以及丁型肝炎病毒(HDV)核酶(參見例如，Ferre-D』Amare等，1998，通過引用併入本文)。根據本公開內容所使用的反式作用核酶的實例包括但不限於發現於菸草環斑病毒(tobaccoringspotvirus，sTRSV)、菊苣黃色斑駁病毒(chicoryyellowmottlevirus，sCYMV)和南芥菜花葉病毒(arabismosaicvirus，sARMV)之衛星RNA中的髮夾核酶的天然及人工形式。例如，圖3A至圖3C示出的示意圖為編碼側翼為核酶之「gRNA1」的核苷酸序列。在一些實施方案中，經改造構建體含有多個串聯的gRNA，每個的側翼為編碼核酶的核苷酸序列。這樣的構建體本文可描述為具有編碼至少2個gRNA的核苷酸序列，每個gRNA的側翼為核酶。應當理解的是該構造意在包含多個串聯的gRNA，每個gRNA的側翼為單個核酶(Ribo)；還包含多個串聯的gRNA，每個gRNA的側翼為2個或更多個核酶。例如，在經改造構建體中，遺傳元件的順序可以如下：Ribo1-gRNA1-Ribo2-gRNA2-Ribo3-gRNA-Ribo4，其中單個核酶將1個gRNA與相鄰的gRNA分開；或者Ribo1-gRNA1-Ribo2-Ribo3-gRNA2-Ribo4-Ribo5-gRNA-Ribo6，其中2個核酶將1個gRNA與相鄰的gRNA分開。所述核酶可以是相同或不同的。即，在一些實施方案中，可以使用不同類型的核酶以從經改造構建體釋放1個或更多個gRNA。本公開內容的一些方面涉及編碼目的蛋白質的核酸。目的蛋白質可以是任何蛋白質。目的蛋白質的實例包括但不限於涉及細胞信號傳導(例如，受體/配體結合)及信號轉導的那些。例如，目的蛋白質可以為纖維蛋白或球蛋白。纖維蛋白的實例包括但不限於細胞骨架蛋白和胞外基質蛋白。球蛋白的實例包括但不限於血漿蛋白(例如凝血因子、急性期蛋白)、血紅素蛋白、細胞粘附蛋白、跨膜轉運蛋白(例如，離子通道蛋白、同向轉運蛋白、逆向轉運蛋白)、激素和生長因子、受體(例如，跨膜受體、胞內受體)、DNA結合蛋白(例如，轉錄因子或其他涉及轉錄調控的蛋白質)、免疫系統蛋白、營養物儲存/轉運蛋白、伴侶蛋白，以及酶。考慮了其他蛋白質，並可以根據本公開內容使用。本公開內容的一些方面考慮了將基於CRISPR的機制與哺乳動物RNA幹擾機制進行整合，以例如實施更複雜的線路拓撲結構。如非限制性實施例8所示，將微小RNA調控與CRISPR-TF和Csy4合併，以通過移除同源miRNA結合位點破壞miRNA對靶RNA的抑制。RNA幹擾通常指這樣的生物學過程，其中RNA分子通常通過對特定mRNA分子的破壞抑制基因表達。這樣的RNA分子的實例包括微小RNA(miRNA)和小幹擾RNA(siRNA)。miRNA是短的非編碼單鏈RNA分子。本公開內容的miRNA可為天然存在的或合成的(例如，人工的)。miRNA通常通過與在所靶向的mRNA3』UTR(非翻譯區)內發現的靶位點結合來誘導基因沉默。該相互作用通過抑制蛋白質的合成和/或通過啟動mRNA的降解而阻止蛋白質的產生。mRNA上的大多數靶位點與其對應的微小RNA僅具有部分鹼基互補性，因此，單獨的微小RNA可靶向100個不同的mRNA，或更多個。此外，單獨的mRNA可含有不同miRNA的多個結合位點，從而導致複雜的調控網絡。在一些實施方案中，miRNA的長度為10至50個核苷酸。例如，miRNA的長度可以為10至40、10至30、10至20、20至50、20至40或20至30個核苷酸。在一些實施方案中，miRNA的長度為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸。在一些實施方案中，miRNA的長度為22個核苷酸。siRNA是短的非編碼單鏈RNA分子。本公開內容的siRNA可為天然存在的或合成的(例如，人工的)。siRNA與同源mRNA的結合通常導致所述mRNA的降解。在一些實施方案中，siRNA的長度為10至50個核苷酸。例如，siRNA的長度可以為10至40、10至30、10至20、20至50、20至40或20至30個核苷酸。在一些實施方案中，siRNA的長度為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸。在一些實施方案中，siRNA的長度為21至25個核苷酸。在一些實施方案中，本公開內容的經改造構建體包含與核苷酸序列(例如，編碼目的蛋白質)有效相連的啟動子。「啟動子」是核酸的控制區，在該區核酸其餘部分的轉錄起始和速率受到控制。啟動子也可含有亞區域，在該區域調控蛋白和分子可結合例如RNA聚合酶和其他轉錄因子。啟動子可以是組成型的、誘導型的、可激活的、可抑制的、組織特異性的、或其任意組合。啟動子驅動其調控的核酸序列的表達或轉錄。當啟動子位於其所調控的核苷酸序列相關的正確功能位置和方向以控制(「驅動」)該序列的轉錄起始和/或表達時，則認為所述啟動子被「有效連接」。可根據啟動子對RNA聚合酶(和/或σ因子)的親和性將其分類為強或弱；這與啟動子序列與聚合酶理想的共有序列相似的相近程度相關聯。啟動子的強度可依據在該啟動子上發生的轉錄起始是高頻還是低頻。可以使用具有不同強度的不同啟動子以構建具有不同基因/蛋白質表達水平(例如，從弱啟動子起始的表達的水平低於從強啟動子起始的表達的水平)的核酸。啟動子可以是一個與基因或序列天然締合的啟動子，如可通過分離位於給定基因或序列編碼區段上遊的5』非編碼序列獲得。這樣的啟動子可稱為「內源的」。在一些實施方案中，本公開內容的gRNA被設計為靶向內源啟動子(例如，內源人啟動子)。在一些實施方案中，核苷酸序列可位於重組或異源啟動子的控制下，其是指在其自然環境下通常不與該核苷酸序列締合的啟動子。這樣的啟動子可包括其他基因的啟動子；從任何其他原核細胞分離的啟動子；以及不「天然存在」的合成啟動子，例如包含不同轉錄調控區和/或突變的不同元件的那些，其通過本領域已知的遺傳改造方法改變表達。除了通過合成產生啟動子的核苷酸序列之外，也可使用重組克隆和/或核酸擴增技術(包括聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction，PCR))產生序列。在一些實施方案中，從啟動子起始轉錄依賴於RNA聚合酶(也稱為DNA依賴性RNA聚合酶)的活性。RNA聚合酶是在RNA轉錄本的3』末端聚合核糖核苷酸的核苷酸基轉移酶。真核生物具有多種類型的細胞核RNA聚合酶，每一種負責不同RNA亞組的合成。所有RNA聚合酶均在結構和機制上彼此相關以及與細菌RNA聚合酶相關。RNA聚合酶I合成前rRNA45S(在酵母中為35S)，其成熟為28S、18S和5.8SrRNA，它們將形成核糖體的主要RNA部分。RNA聚合酶II合成大多數snRNA和微小RNA以及mRNA的前體。RNA聚合酶III合成tRNA、rRNA5S以及其他發現於細胞核及胞質中的小RNA。RNA聚合酶IV合成植物中的siRNA。RNA聚合酶V合成在植物中參與siRNA所引導的異染色質形成的RNA。在一些實施方案中，本文考慮了RNApoiII和RNApolIII啟動子。通過RNA聚合酶II引導準確的轉錄起始的啟動子稱為RNApolII啟動子。根據本公開內容所使用的RNApolII啟動子的實例包括但不限於人巨細胞病毒啟動子、人泛素啟動子、人組蛋白H2A1啟動子和人炎性趨化因子CXCL1啟動子。本文還考慮了其他RNApolII啟動子。通過RNA聚合酶III引導準確的轉錄起始的啟動子稱為RNApolIII啟動子。根據本公開內容所使用的RNApolIII啟動子的實例包括但不限於U6啟動子、H1啟動子和轉移RNA的啟動子、5S核糖體RNA(rRNA)以及信號識別顆粒7SLRNA。在一些實施方案中，啟動子可以是誘導型啟動子。誘導型啟動子是這樣的啟動子，其特徵在於，當其在誘導物或誘導劑存在、影響或接觸下，會起始或增強轉錄活性。誘導物或誘導劑可以是內源的或通常為外源條件、化合物或蛋白質，其以這樣的方式接觸經改造核酸，從而在由該誘導型啟動子誘導轉錄活性中有活性。本公開內容的經改造核酸可使用標準分子生物學方法(參見，例如Green和Sambrook，MolecularCloning，ALaboratoryManual，2012，ColdSpringHarborPress)產生。在一些實施方案中，使用GIBSONCloning(參見例如，Gibson，D.G.等NatureMethods，343-345，2009；和Gibson，D.G.等NatureMethods，901-903，2010，其各自通過引用併入本文)產生經改造構建體和/或經改造核酸。GIBSON通常在單個試管反應中使用3種酶促活性：5』核酸外切酶、DNA聚合酶的3』延伸活性和DNA連接酶活性。所述5』核酸外切酶活性回嚼(chewback)序列的5』末端，並暴露互補序列以用於退火。然後，聚合酶活性填補在退火區域上的空位中。然後DNA連接酶封住該缺口並將DNA片段共價連接到一起。鄰近片段的重疊序列遠遠長於用於GoldenGate組裝的那些，並且因此導致更高百分比的正確組裝。在一些實施方案中，經改造構建體和/或經改造核酸包在於載體內。載體是用作人工地攜帶遺傳物質(例如經改造核酸)至另一個細胞中的載劑(vehicle)的核酸(例如DNA)，在該細胞中，例如，其可被複製和/或表達。在一些實施方案中，載體是附加型載體(episomalvector)(參見例如VanCraenenbroeckK.等Eur.J.Biochem.267，5665，2000，通過引用併入本文)。載體的一個非限制性實例是質粒。質粒是雙鏈的，通常為環狀的DNA序列，其能夠在宿主細胞中自動複製。質粒載體通常含有複製起始及轉基因插入物，前者使所述質粒得以在宿主中半獨立複製。質粒可具有更多特徵，包括例如，「多克隆位點」，其包括核苷酸突出端以用於核酸插入物的插入，以及在插入物任意一側的多個限制性酶共有位點。載體的另一個非限制性實例是病毒載體。本公開內容的經改造構建體可表達於多種細胞類型中。在一些實施方案中，經改造構建體表達於哺乳動物細胞中。例如，在一些實施方案中，經改造構建體表達於人細胞、靈長類動物細胞(例如vero細胞)、大鼠細胞(例如，GH3細胞、OC23細胞)或小鼠細胞(例如MC3T3細胞)中。有多種人細胞系，包括但不限於HEK細胞、HeLa細胞、來自於國家癌症研究所的60個癌細胞系的癌細胞(NCI60)、DU145(前列腺癌)細胞、Lncap(前列腺癌)細胞、MCF-7(乳腺癌)細胞、MDA-MB-438(乳腺癌)細胞、PC3(前列腺癌)細胞、T47D(乳腺癌)細胞、THP-1(急性髓性白血病)細胞、U87(膠質母細胞瘤)細胞、SHSY5Y人神經母細胞瘤細胞(克隆自骨髓瘤)以及Saos-2(骨癌)細胞。在一些實施方案中，經改造構建體表達於人胚胎腎(humanembryonickidney，HEK)細胞(例如，HEK293或HEK293T細胞)中。在一些實施方案中，經改造構建體表達於細菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞或其他類型細胞中。在一些實施方案中，經改造構建體表達於幹細胞(例如，人幹細胞)，例如多能幹細胞(例如，人多能幹細胞，包括人誘導多能幹細胞(humaninducedpluripotentstemcell，hiPSC))中。「幹細胞」指具有在培養物中的不定期分裂能力以及產生特化細胞能力的細胞。「多能幹細胞」指這樣類型的幹細胞，其能夠分化為生物體的所有組織，但其單獨不能夠維持完整的生物體的發育。「人誘導多能幹細胞」指這樣的體(例如，成熟或成體)細胞，其通過強制表達對於維持胚胎幹細胞的規定特性重要的基因和因子而已經被重編程為胚胎幹細胞樣狀態(參見例如，Takahashi和Yamanaka，Cell126(4)：663-76，2006，通過引用併入本文)。人誘導多能幹細胞表達幹細胞標誌物並能夠產生具有所有三個胚層(外胚層、內胚層、中胚層)特徵的細胞。可根據本公開內容所使用的細胞系的另外的非限制性實例包括293-T、293-T、3T3、4T1、721、9L、A-549、A172、A20、A253、A2780、A2780ADR、A2780cis、A431、ALC、B16、B35、BCP-1、BEAS-2B、bEnd.3、BHK-21、BR293、BxPC3、C2C12、C3H-10T1/2、C6、C6/36、Cal-27、CGR8、CHO、CMLT1、CMT、COR-L23、COR-L23/5010、COR-L23/CPR、COR-L23/R23、COS-7、COV-434、CT26、D17、DH82、DU145、DuCaP、E14Tg2a、EL4、EM2、EM3、EMT6/AR1、EMT6/AR10.0、FM3、H1299、H69、HB54、HB55、HCA2、Hepalc1c7、HighFive細胞、HL-60、HMEC、HT-29、HUVEC、J558L細胞、Jurkat、JY細胞、K562細胞、KCL22、KG1、Ku812、KYO1、LNCap、Ma-Mel1、2、3....48、MC-38、MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-MB-468、MDCKII、MG63、MONO-MAC6、MOR/0.2R、MRC5、MTD-1A、MyEnd、NALM-1、NCI-H69/CPR、NCI-H69/LX10、NCI-H69/LX20、NCI-H69/LX4、NIH-3T3、NW-145、OPCN/OPCTPeer、PNT-1A/PNT2、PTK2、Raji、RBL細胞、RenCa、RIN-5F、RMA/RMAS、S2、Saos-2細胞、Sf21、Sf9、SiHa、SKBR3、SKOV-3、T-47D、T2、T84、THP1、U373、U87、U937、VCaP、WM39、WT-49、X63、YAC-1以及YAR細胞。在一些實施方案中，本公開內容的細胞被修飾。被修飾的細胞為含有外源核酸或不天然存在的核酸的細胞。在一些實施方案中，被修飾的細胞含有基因組核酸中的突變。在一些實施方案中，被修飾的細胞含有外源獨立複製的核酸(例如，存在於附加型載體上的經改造核酸)。在一些實施方案中，被修飾的細胞通過向細胞中引入外來或外源核酸產生。核酸可通過常規方法引入細胞中，例如電穿孔(參見例如HeiserW.C.TranscriptionFactorProtocols：MethodsinMolecularBiologyTM2000；130：117-134)、化學方法(例如磷酸鈣或脂質)、轉染(參見例如LewisW.H.，等，SomaticCellGenet.19805月；6(3)：333-47；ChenC.，等，MolCellBiol.19878月；7(8)：2745-2752)、與含有重組質粒的細菌原生質體融合(參見例如SchaffnerW.ProcNatlAcadSciUSA.19804月；77(4)：2163-7)，或將純化的DNA直接微注射到細胞的核中(參見例如CapecchiM.R.Cell.198011月；22(2Pt2)：479-88)。在一些實施方案中，細胞被修飾以過表達目的內源蛋白質(例如，通過引入或者修飾啟動子或編碼目的蛋白質的內源基因附近的其他調控元件，以提高其表達水平)。在一些實施方案中，通過誘變修飾細胞。在一些實施方案中，為了產生目的遺傳改變，通過向細胞中引入重組核酸修飾細胞(例如通過插入或同源重組)。在一些實施方案中，經改造核酸可以經過密碼子優化，例如，以用於在人細胞或其他類型細胞中表達。密碼子優化是在活生物體中通過將一個物種的DNA核苷酸序列轉換至另一個物種的DNA核苷酸序列來提高目的基因的翻譯效率，從而將蛋白質表達最大化的技術。密碼子優化的方法是公知的。本公開內容的經改造構建體可瞬時表達或穩定表達。「瞬時細胞表達」指未整合入細胞的細胞核基因組中的核酸的細胞表達。相比之下，「穩定細胞表達」指存留於細胞及其子細胞的細胞核基因組中的核酸的細胞表達。通常，為了獲得穩定細胞表達，用標誌物基因和旨在細胞中穩定表達的外源核酸(例如，經改造核酸)共轉染細胞。所述標誌物基因為細胞提供了某些可選擇的優勢(例如，對毒素、抗生素或其他因子的抗性)。極少的經轉染細胞有機會將外源核酸整合至其基因組中。然後，如果例如向細胞培養物添加毒素，則僅有那些將毒素抗性標誌物基因整合入其基因組中的少量細胞將能夠增殖，而其他細胞將死亡。在將該選擇壓力施加一段時間後，僅具有穩定轉染的細胞保留，並且可進一步培養。根據本公開內容所使用的標誌物基因和選擇劑的實例包括但不限於二氫葉酸還原酶與甲氨蝶呤、穀氨醯胺合成酶與甲硫氨酸亞碸亞胺(methioninesulphoximine)、潮黴素磷酸轉移酶與潮黴素、嘌呤黴素N乙醯轉移酶與嘌呤黴素，以及新黴素磷酸轉移酶與遺傳黴素，也稱為G418。本文考慮了其他標誌物基因/選擇劑。在瞬時轉染的和/或穩定轉染的細胞中的核酸表達可以是組成型或誘導型。本文提供使用的誘導型啟動子已於上文中描述。經修飾以包含本公開內容經改造構建體的哺乳動物細胞(例如，人細胞)可使用常規哺乳動物細胞培養方法進行培養(例如，維持於細胞培養物中)(參見例如PhelanM.C.CurrProtocCellBiol.20079月；第1章：1.1節，通過引用併入本文)。例如細胞可生長並維持在細胞培養箱中的合適的溫度以及氣體混合物中(例如，對於哺乳動物細胞為37℃，5％CO2)。對於每種細胞類型的培養條件可以變化。例如，細胞生長培養基可在pH、葡萄糖濃度、生長因子以及其他營養物的存在方面變化。用於補充培養基的生長因子通常來自於動物血液的血清，如胎牛血清(FBS)、小牛血清、馬血清和/或豬血清。在一些實施方案中，本文提供使用的培養基可以是市售的和/或詳細描述的(參見例如BirchJ.R.，R.G..Spier(編輯)EncyclopediaofCellTechnology，Wiley.411-424，2000；KeenM.J.Cytotechnology17：125-132，1995；Zang，等Bio/Technology.13：389-392，1995)。在一些實施方案中，使用了化學成分確定的培養基(chemicallydefinedmedia)。本文也在多個方面考慮了用於在細胞(例如，哺乳動物細胞，如人細胞)內構建遺傳線路(包括轉錄級聯)的方法和組合物。許多複雜的基因線路需要實施級聯的能力，其中在一個階段整合的信號被傳送到多個下遊階段中，以進行處理和促動(actuation)。例如，基因級聯對於合成生物學應用是重要的，如在活細胞中進行計算的多層人工基因線路(Weber和Fussenegger，2009)。轉錄級聯對於天然調控系統是重要的，如控制分節(segmentation)、性別決定以及發育的那些(Dequeant和Pourquie，2008；Peel等，2005；Sinha等，2014)。圖6A和6B提供了本公開內容的多個經改造構建體可如何在單細胞中一起使用以構建轉錄級聯的非限制性實例。如圖6A所示，例如，可將細胞用以下構建體共轉染：具有「內含子-Csy4」構造的第一經改造構建體，以表達第一gRNA(「gRAN1」)，具有「三鏈體-Csy4」構造的第二經改造構建體mKate2，以表達第二gRNA(「gRNA2」)及EYFP，以及第三經改造構建體，設置為表達ECFP。所述細胞也表達Csy4和具有轉錄活性的Cas9(taCas9)。這些經改造構建體這樣設置，以使得當在Csy4核糖核酸酶存在下表達時，gRNA1從構建體釋放並導引taCas9蛋白至互補的在第二經改造構建體啟動子內的gRNA1結合位點(並使mKate2表達)。然後，所述taCas9蛋白激活第二經改造構建體的轉錄，從而產生第二gRNA(「gRNA2」)(並使EYFP表達)。然後，gRNA導引taCas9蛋白至互補的在第三經改造構建體啟動子內的gRNA2結合位點。然後，taCas9蛋白激活第三經改造構建體的轉錄，其表達ECFP。如圖6B所示，細胞可被例如2個經改造構建體共轉染，每個均具有「三鏈體-Csy4」構造，其中由第一構建體所編碼的gRNA(「gRNA1」)與由第二構建體所編碼的gRNA(「gRNA2」)不同。圖6B中每個構建體的激活機制與圖6A所述的機制相似。在一些實施方案中，本公開內容考慮了本文所提供的多個經改造構建體的表達。例如，細胞可表達2至500個或更多個不同的經改造構建體。在一些實施方案中，細胞可表達2至10、2至25、2至50、2至75、2至100、2至200、2至300或2至400個不同的經改造構建體。在一些實施方案中，細胞可表達2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多個不同的本公開內容的經改造構建體。如果經改造構建體的遺傳元件的構造不同，則認為這些構建體是彼此不同的，如圖6A所示。如果經改造構建體的遺傳元件的構造相同，但是具體的元件不同，則也認為這些構建體是彼此不同的，如圖6B所示。應當理解的是，在一些實施方案中，本文所提供的遺傳元件為模塊化的(modular)，以使得細胞可包含多個本公開內容的經改造構建體，每個構建體包含以不同方式設置的不同元件組合，只要元件設置的方式允許轉錄激活以及隨後的核酸表達。例如，經改造構建體可包含與核酸有效相連的啟動子(例如，RNApolII啟動子)，所述核酸包含：(a)編碼至少1個導引RNA(gRNA)的核苷酸序列；以及(b)選自以下的一個或更多個核苷酸序列：(i)編碼目的蛋白質的核苷酸序列和(ii)編碼RNA幹擾分子的核苷酸序列。這樣的經改造構建體可以還包含或可以不包含gRNA或RNA幹擾分子(例如，miRNA)側翼的同源內含子剪接位點。編碼gRNA的核苷酸序列側翼可以為核糖核酸酶識別位點(例如Csy4核糖核酸酶識別位點)或者gRNA的側翼可以為核酶。在一些實施方案中，經改造構建體包含編碼側翼為核糖核酸酶識別位點的gRNA的核苷酸序列與編碼側翼為核酶的gRNA的核苷酸序列的組合。在一些實施方案中，經改造構建體包含編碼側翼為核糖核酸酶識別位點的gRNA的第一核苷酸序列與編碼側翼為核酶的gRNA的第二核苷酸序列的組合，其中所述第一核苷酸序列或所述第二核苷酸序列的側翼為同源內含子剪接位點。在一些實施方案中，經改造構建體包含編碼側翼為核糖核酸酶識別位點的gRNA的第一核苷酸序列與編碼側翼為核酶的gRNA的第二核苷酸序列的組合，其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列每個的側翼均為同源內含子剪接位點。在一些實施方案中，經改造構建體包含編碼側翼為核糖核酸酶識別位點的gRNA的第一核苷酸序列和/或編碼側翼為核酶的gRNA的第二核苷酸序列，以及側翼為同源內含子剪接位點的編碼gRNA(其側翼有或沒有核糖核酸酶識別位點或核酶)的額外的核苷酸序列的組合。在一些實施方案中，編碼目的蛋白質的核苷酸序列也可編碼側翼為核糖核酸酶識別位點的gRNA，其側翼為同源內含子剪接位點。在一些實施方案中，側翼為核糖核酸酶識別位點的gRNA也可在目的蛋白質內編碼RNA幹擾分子(例如miRNA和/或siRNA)。本公開內容的經改造構建體依據構建體具體的構造和穩定性，可包含或可不包含編碼三螺旋結構的核苷酸序列。本文在多個方面也考慮了用於「重接」細胞調控線路的方法和組合物。基於CRISPR轉錄因子的調控可與RNA幹擾整合，例如以使抑制輸出無活性，和/或反之激活無活性的輸出。如圖7A至7F所示，本公開內容整合的方法可用於重接遺傳組件之間的多個互連和反饋環，從而導致線路行為同步轉換(synchronizedshift)。因此，本公開內容的多個方面和實施方案可用於促進多機制遺傳線路的構建，該線路整合RNA幹擾和基於CRISPR的系統以用於可調的、多輸出基因調控。此外，基於核糖核酸酶的RNA處理可用於重接遺傳組件之間的多個互連和反饋環，從而導致線路行為的同步轉換。實施例實施例1.用RNA三螺旋和Csy4產生功能gRNA使得複雜的基於CRISPR-TF線路成為可能的重要的第一步是從人細胞的RNAPII啟動子產生功能gRNA，其允許gRNA產物與特異性調控信號偶聯。例如，gRNA依賴性線路的激活可在限定的細胞類型或狀態下，或響應於外界輸入被起始。此外，從單個轉錄本同時表達gRNA以及蛋白質的能力是有益的。這使得能夠從簡潔的遺傳構造產生多個輸出，所述輸出包括效應物蛋白質和調控連接。其也可使得能夠將gRNA表達整合到內源基因座中。因而，本實施例證明了這樣的系統，其中通過內源RNAPII啟動子，同時產生功能gRNA和蛋白質。在本實施例中利用來自於銅綠假單胞菌之Csy4蛋白的RNA結合與RNA核酸內切酶能力(Haurwitz等，2012；Sternberg等，2012)。Csy4識別28個核苷酸的RNA序列(下文中稱為「28」序列)，切割RNA，並保持與RNA片段上遊的結合(Haurwitz等，2012)。因此，利用Csy4以從由RNAPII啟動子產生的轉錄本釋放gRNA，其也編碼功能蛋白質序列。為了產生含有gRNA的轉錄本，使用強效的CMV啟動子(CMVp)以表達mKate2蛋白。在mKate2編碼區的下遊編碼側翼為2個Csy4結合位點的gRNA(gRNA1)(圖1A)。在該構造中，通過Csy4切割RNA釋放出功能gRNA，而且從上遊mRNA(在該情況中編碼mKate2)移除了poly(A)尾，從而導致大多數真核生物mRNA的翻譯受損(Jackson，1993；Proudfoot，2011)。為了使得缺乏poly(A)尾的mRNA能夠有效地翻譯，使用了三螺旋結構以功能性地補充poly(A)的喪失。將來源於小鼠MALAT1基因座3』末端的110bp片段(Wilusz等，2012)克隆至mKate2的下遊以及側翼為Csy4識別位點的gRNA序列的上遊。在許多人癌症中，MALAT1IncRNA失調(Lin等，2006)，並且儘管缺乏poly(A)尾，MALAT1仍是穩定的轉錄本(Wilusz等，2008；Wilusz等，2012)，其被高度保守的3』三螺旋結構(三鏈體)保護以防止外來體和3，-5，核酸外切酶(Wilusz等，2012)。因此，最終的「三鏈體/Csy4」構造是由CMVp驅動的mKate2轉錄本，其具有3』三鏈體序列，之後為28-gRNA-28序列(CMVp-mK-Tr-28-gRNA-28)(圖1A)。為了表徵gRNA活性，用CMVp-mK-Tr-28-gRNA1-28表達質粒以及編碼合成P1啟動子的質粒共轉染HEK-293T細胞，所述P1啟動子特異性地由gRNA1激活以表達EYFP。該P1啟動子含有gRNA1的8x結合位點並且基於最小啟動子構建體(Farzadfard等，2013)。在本實驗及隨後的那些實驗中(除非另有說明)，用CMV啟動子表達的具有轉錄活性的dCas9-NLS-VP64蛋白(taCas9)共轉染細胞。用0ng至400ng的Csy4表達質粒(其中通過鼠PGK1啟動子產生Csy4)以及1μg的其他質粒(原始數據見圖1B和圖8A)共轉染HEK-293T細胞。提高的Csy4濃度水平未導致mKate2水平的降低，而是導致5倍的提高(圖1B)。此外，產生自該構建體的功能gRNA誘導了從P1啟動子EYFP的達60倍的表達。雖然mKate2表達隨著Csy4表達質粒的濃度繼續提高，但是EYFP激活在50ng的Csy4產生質粒之後達到平臺(plateau)。此外，有證據表明400ng的Csy4質粒濃度具有細胞毒性。因此，在後續實驗中使用了100ng至200ng的Csy4質粒(除非某處另有說明)，儘管這會減少轉染之後的Csy4陽性細胞數目。或者，可使用更弱的啟動子以降低Csy4表達水平，或者可以用低或中等的Csy4水平產生穩定細胞系。有趣的是，儘管5』Csy4識別位點單獨應足以從RNA轉錄本釋放gRNA，然而該變體構造並未產生能夠激活下遊靶啟動子至背景水平之上的功能gRNA(數據未展示)。不被理論束縛，這可能是由於RNA不穩定、poly(A)介導的胞質轉運、具有taCas9活性的poly(A)尾的幹擾，或其他機制。還對Csy4和taCas9對mKate2表達的相對作用進行了表徵。在Csy4和taCas9、Csy4單獨、taCas9單獨，或沒有其中任何一種蛋白質存在的情況下，測量了來自基於「三鏈體/Csy4」的gRNA表達構建體的mKate2螢光(圖1C和圖9)。最低的mKate2螢光水平來源於僅有taCas9的條件。不被理論束縛，因為使用了具有強細胞核定位序列(nuclearlocalizationsequence，NLS)的taCas9，所述該作用可能產生自taCas9與在mRNA內的gRNA的結合併將轉錄本定位於核。該理論得到了數據的支持，該數據證明，即便不存在Csy4，內源啟動子可被產生自基於「三鏈體/Csy4」構造的gRNA激活(參見下文及圖1D、圖1E)。用單獨Csy4獲得了最高的mKate2表達水平，表明Csy4處理可增強mKate2水平。在Csy4和taCas9兩者都不存在以及Csy4和taCas9兩者都存在的情況下，mKate2表達相似，並且相比於僅有Csy4的情況降低了3倍至4倍。實施例2.用從人啟動子表達的CRISPR-TF對內源基因座進行調節為了證實「三鏈體/Csy4」構造的穩健，對其進行調整以調節人細胞中天然基因組靶標的表達。通過共表達4個不同的gRNA，即gRNA3至gRNA6，靶向內源IL1RN基因座以用於基因激活(表1)(Perez-Pinera等，2013a)。表1.該研究中使用的序列4個gRNA的每一個均被設計為與mKate2伴隨地表達，每個均來自於單獨的質粒。每組的4個gRNA由下列啟動子中的1個調控(根據其在HEK-293T細胞中的活性水平降序排列)：巨細胞病毒立即早期(CMVp)、人泛素C(UbCp)、人組蛋白H2A1(H2A1p)(Rogakou等，1998)，以及人炎性趨化因子CXCL1(CXCL1p)啟動子(Wang等，2006)。作為對照，使用了RNAPIII啟動子U6(U6p)驅動4個gRNA的表達。對於每種測試的啟動子，將4種編碼所述4個不同gRNA的質粒與表達taCas9和Csy4的質粒一起共轉染。作為陰性對照，用表達gRNA1的質粒替代靶向IL1RN的gRNA表達質粒，所述表達gRNA1的質粒對於IL1RN啟動子為非特異性的(圖1D，「NS」)。使用qRT-PCR以對內源IL1RN基因的mRNA水平進行定量，並以陰性對照歸一化結果。對於U6啟動子調控的4個gRNA，IL1RN激活水平相對於陰性對照，在不存在Csy4的情況下提高了8,410倍，而在有100ng的Csy4表達質粒的情況下提高了6,476倍(圖1D，「U6p」)。用從CMV啟動子表達的gRNA明顯激活IL1RN(圖1D，「CMVp」)，在不存在Csy4的情況下有61倍的增強，而存在Csy4的情況下有1539倍的增強。人RNAPII啟動子在不存在Csy4的情況下產生了約2至7倍的激活，而在存在Csy4的情況下產生了約85至328倍的激活(圖1D，「CXCLp」、「H2A1p」、「UbCp」)。為了進一步表徵內源基因調控的輸入-輸出轉移功能，將由每種啟動子所產生的mKate2螢光用作多種RNAPII啟動子之輸入啟動子活性的標誌(圖1E)。在所測試的mKate2的範圍中，所得到的IL1RN激活中的轉移函數幾乎為線性。該數據表明，IL1RN的激活在所測試的條件下並未飽和，並且用人RNAPII啟動子可獲得大動態範圍的內源基因調控。因此，使用具有從「三鏈體/Csy4」構造表達的gRNA的CRISPR-TF可達到天然基因的可調調節。實施例3.從具有Csy4的內含子產生功能gRNA作為對「三鏈體/Csy4」構造的補充，開發出了用於通過在基因編碼序列中的內含子內編碼gRNA，而從RNAPII啟動子產生功能gRNA的一個替代策略。具體而言，使用「共有」接受體、供體，以及分支序列，將gRNA1作為mKate2編碼序列內的內含子進行編碼(圖2A)(Smith等，1989；Taggart等，2012)。出人意料的是，該簡單的構造產生不可檢測的EYFP水平(圖10，下圖)。不被理論束縛，沒有任何穩定化的情況下，內含子gRNA表現為快速地降解。為了穩定內含子gRNA，使用了產生長壽命內含子的內含子序列。這些序列包括如HSV1潛伏相關內含子和sno-IncRNA2(snoRNA2)內含子，前者形成穩定的環狀內含子(Block和Hill，1997)。所述snoRNA2內含子的兩端被snoRNA機器處理，這保護該內含子不被降解並導致側翼為snoRNA序列的IncRNA的累積，所述snoRNA序列缺乏5』帽和3』poly(A)尾(Yin等，2012)。然而，這些用於產生穩定內含子gRNA的方法也導致了靶啟動子不可檢測的激活(數據未示出)。作為一個替代策略，通過在gRNA盒側翼添加2個Csy4識別位點穩定內含子gRNA。不被理論束縛，經剪接的含有gRNA的內含子應當被Csy4結合，這應當釋放功能gRNA。與「三鏈體/Csy4」設置相比，Csy4也可在剪接發生之前潛在地結合併消化前mRNA。在此情況下，將會產生功能gRNA，但含有mKate的前mRNA在該過程中被破壞(圖2A)。因此，提高的Csy4濃度預期會導致mkate2水平降低但功能gRNA的水平更高。不被理論束縛，在該構造中，隨著Csy4濃度的mKate2水平的降低以及功能gRNA的提高預期依賴於幾種因素，其示於圖2A中(黑線，不依賴於Csy4的過程；灰線，Csy4介導的過程)。這些競爭性因素包括Csy4與其靶位點結合併切割RNA的速率、剪接的速率，以及Csy4不存在下經剪接的gRNA的降解速率。為了檢查「內含子/Csy4」構造的行為，使用了CMV啟動子以驅動HSVl、snoRNA和含有側翼為兩個Csy4結合位點的gRNA1的共有內含子與mKate2(CMVp-mKEX1-[28-g1-28]內含子-mKEX2)，以及調控EYFP表達的合成P1啟動子的表達(圖2A)。通過EYFP激活測定，Csy4的存在產生功能gRNA1(原始數據參見圖2B至圖2D和圖8B)。產生自HSV1內含子的gRNA1產生了最強的EYFP激活(圖2D)，其在200ng的Csy4質粒下達到飽和。相比之下，snoRNA2內含子使EYFP表達在50ng的Csy4質粒下達到飽和，但由該內含子產生的最大EYFP水平在所有測試的內含子中最低(約為HSV1內含子的65％)。此外，Csy4水平的提高伴隨地降低了mKate2的水平。雖然這些趨勢對所有三種測試的內含子是相似的，但作用的量級是內含子特異性的。snoRNA2內含子表現出隨著Csy4質粒濃度提高的最大的mKate2水平降低，在400ng的Csy4質粒下，相比於無Csy4條件，具有15倍的mKate2螢光的降低(圖2C)。共有和HSV1內含子表現出mKate2水平對Csy4水平提高的較低敏感性(圖2B和圖2D)。因此，該「內含子/Csy4」方法與「三鏈體/Csy4」構造一起，提供了用於從翻譯的基因可調產生功能gRNA的一套組件。具體地，含有gRNA的基因及下遊靶基因的絕對蛋白質水平，以及它們之間的比，可通過Csy4的濃度和具體組件的選擇確定。實施例4.Csy4和內含子gRNA之間的相互作用為了確定是否5』和3』Csy4識別位點兩者對於功能gRNA從內含子產生都是必需的，使用了mKate2內基於HSV1的內含子。該內含子包含gRNA1序列，所述序列在其5』側的前面有Csy4結合位點(「28-gRNA」，圖2E和圖11)，或者在其3』末端的後面有Csy4結合位點(「gRNA-28」，圖2F和圖11)。使用了合成P1-EYFP構建體評估gRNA1活性。以「內含子/Csy4」構造的性能歸一化圖2E和2F的數據，其中內含子gRNA1側翼為2個Csy4結合位點(「28-gRNA-28」，圖11)。這兩種僅含有單個Csy4結合位點的構造的mKate2水平，相對於無Csy4的情況，都隨著Csy4的添加而降低(圖2E，圖2F)。相比之下，通過gRNA1引導的CRISPR-TF的下遊EYFP激活對於單個Csy4結合位點構造(圖2E，圖2F)顯著低於「內含子/Csy4」構建體(圖2D)。當僅有1個Csy4結合位點位於gRNA1內含子的5』末端時，EYFP的表達不可檢測(圖2E)。當僅有1個Csy4結合位點位於gRNA1內含子的3』末端時，相比於「內含子/Csy4」構造(其含有gRNA1側翼的Csy4識別位點)(圖2D)，觀察到EYFP水平6倍的降低(圖2F)。不受理論束縛，可能Csy4可以幫助穩定內含子gRNA。例如，被Csy4切割的RNA的5』末端含有羥基(OH-)，其可保護它們不受主要的5』-＞3』細胞RNA酶(如XRN家族)的作用，所述RNA酶需要5』磷酸以用於底物識別(Houseley和Tollervey,2009；Nagarajan等，2013)。此外，Csy4蛋白與被切割的gRNA3』末端的結合(Haurwitz等，2012)可保護其不受由真核生物外來體複合物所介導的3』-＞5』降解(Houseley和Tollervey，2009)。實施例5.用順式作用核酶產生功能gRNA除了上文描述的基於「三鏈體/Csy4」和「內含子/Csy4」的機制外，還利用了自體切割核酶以使得能夠在人細胞中通過產生自RNAPII啟動子的gRNA進行基因調控。具體而言，對gRNA進行改造，以使其在其5』末端含有錘頭狀(HH)核酶(Pley等，1994)並在其3』末端含有HDV核酶(Ferre-D′Amare等，1998)，如圖3所示。測試了3種不同構造中的核酶，所有均由CMVp驅動：(1)mKate2轉錄本，其後為三鏈體和HH-gRNA1-HDV序列(CMVp-mK-Tr-HH-g1-HDV，圖3A)；(2)mKate2轉錄本，其後為HH-gRNA1-HDV序列(CMVp-mK-HH-g1-HDV，圖3B)；以及(3)HH-gRNA1-HDV序列本身，無相關聯的蛋白質編碼序列(CMVp-HH-g1-HDV，圖3C)。將從這些構造產生的gRNA與之前所述的通過RNAPIII啟動子U6和「三鏈體/Csy4」構造(具有200ng的Csy4質粒)產生的gRNA相比較。所有構建體使用gRNA1，其驅動從含有P1-EYFP的質粒的EYFP表達。所有含有mKate2的構建體均表現出可檢測的mKate2螢光水平(圖3D和圖12)。出人意料的是，這包括CMVp-mK-HH-g1-HDV，其不含有三鏈體序列，並因此，由於poly(A)尾的移除而預期為具有低mKate2水平。不受理論束縛，這可能是由於無效的核酶切割(Beck和Nassal，1995；Chowrira等，1994；RHormes，1997)，這允許未處理的轉錄本被轉運至胞漿並翻譯，mKate2轉錄本受到殘留的3』核酶序列的保護，或其他機制。在輸出EYFP激活的方面，最高EYFP螢光水平從U6p表達的gRNA產生，隨後為CMVp-HH-g1-HDV和CMVp-mK-HH-g1-HDV構建體(圖3D)。CMVp-mK-Tr-HH-gRNA1-HDV和「三鏈體/Csy4」構造具有相似的EYFP水平。順式作用核酶是有用的，並可介導從RNAPII啟動子的功能gRNA表達。具有可由外界配體調控的活性的核酶(如茶鹼)也可用於引發gRNA的外源釋放。然而，這樣的策略不能將胞內核酶活性與單細胞內所產生的內源信號相關聯。相比之下，如下所示，遺傳編碼的Csy4的表達可用於重接由RNA引導的遺傳線路並改變其行為(圖7)。因此，反式作用核酶可用於將RNA切割和gRNA產生與細胞內事件相關聯。實施例6.從單RNA轉錄本進行多重gRNA表達為了證明從單個RNA轉錄本表達2個獨立的gRNA激活2個獨立的下遊啟動子，使用了2種構造。在第一種構造(「內含子-三鏈體」)中，在HSV1內含子內編碼gRNA1，其側翼為位於mKate2編碼序列內的2個Csy4結合位點。此外，被2個Csy4結合位點包圍的gRNA2在mKate2-三鏈體序列的下遊編碼(圖4A，CMVp-mKEX1-[28-g1-28]HSV1-mKEX2-Tr-28-g2-28)。在第二種構造中(「三鏈體-串聯」)，gRNA1和gRNA2兩者都用Csy4結合位點所圍繞，並串聯放置於mKate2-三鏈體序列的下遊(圖4B，CMVp-mK-Tr-28-g1-28-g2-28)。在這兩種構造中，gRNA1和gRNA2分別靶向合成啟動子P1-EYFP和P2-ECFP。如圖4C所示(原始數據參見圖13)，這兩種策略均導致活性多重gRNA的產生。「內含子-三鏈體」構建體表現出在200ng的Csy4質粒存在下，相比於無Csy4，有3倍的mKate2下降、10倍的EYFP提高，以及100倍的ECFP提高。在「三鏈體-串聯」構造中，在200ng的Csy4存在下，相比於無Csy4，mKate2、EYFP和ECFP的表達分別提高了3倍、36倍和66倍。與「三鏈體-串聯」構建體相比，「內含子-三鏈體」構造具有更高的EYFP和ECFP水平。因此，這兩種用於多重gRNA表達的策略均使得在多個下遊靶標有CRISPR-TF活性，並可以對所需的應用進行調整。為了進一步探究多重構建體的可擴展性，並證明其在靶向內源基因座中的應用，從單個轉錄本產生了4個不同的gRNA種類。將這4個對於IL1RN激活所需的gRNA串聯地克隆到單個轉錄本上的mKate2-三鏈體序列的下遊，由Csy4結合位點分開(圖5A)。將由該多重單個轉錄本構建體激活的IL1RN與這樣的構造相比較，該構造中從4種不同的質粒表達4個不同的gRNA(圖5B，分別為「多重」對「非多重」)。在100ng的Csy4質粒存在下，多重構造導致了相對於非特異性gRNA1(「NS」)約1111倍的激活，並比單gRNA表達質粒的非多重組更有效約2.5倍。此外，即使不存在Csy4，檢測到多重構造的約155倍的IL1RN的激活，這表明即便不存在Csy4，taCas9也可結合gRNA並募集其用於基因激活。這些結果證明，有可能從單個的簡潔RNA轉錄本編碼多個功能gRNA，以用於多重表達。因此，這些構造使得能夠緊湊編程Cas9功能，以用於實施多輸出的合成基因線路、用於調節內源基因，以及用於潛在地獲得有條件的多重基因組編輯。實施例7.具有RNA導引的調控的合成轉錄級聯為了證明RNA依賴性調控構建體的用途，本文使用其創建了第一基於CRISPR-TF的轉錄級聯。將「三鏈體/Csy4」和「內含子/Csy4」策略整合以建立2種不同的三階段CRISPR-TF介導的轉錄級聯(圖6)。在第一種設計中，來自「內含子/Csy4」構建體的由CMVp驅動的gRNA1表達從HSV1內含子產生gRNA1，其激活合成啟動子P1以從「三鏈體/Csy4」構造產生gRNA2，其隨後激活下遊調控ECFP的合成啟動子P2(圖6A)。在第二種設計中，級聯第一階段中的內含子gRNA表達盒被替換為「三鏈體/Csy4」構造，以表達gRNA1(圖6B)。這兩種設計在200ng的Csy4質粒存在下進行測試(圖6C、6D和圖14)。在第一種級聯設計中，相比於對照，觀察到EYFP76倍的提高和ECFP13倍的提高，對照中將級聯的第二階段(P1-EYFP-Tr-28-g2-28)替換為空質粒(圖6C)。在第二種級聯設計中，相比於對照，觀察到EYFP31倍的提高和ECFP21倍的提高，對照中將級聯的第二階段(P1-EYFP-Tr-28-g2-28)替換為空質粒(圖6D)。這些結果證明，存在通過gRNA1的啟動子P2的最小非特異性激活，其對於轉錄級聯的可擴展性和可靠性是關鍵的。此外，級聯中每一階段的倍數激活依賴於所有上遊節點(node)的存在，這是在正確起作用的轉錄級聯中所預期的(圖6C、6D)。實施例8.重接RNA依賴性的合成調控線路下述實驗試圖證明CRISPR-TF調控如何可以與哺乳動物RNA幹擾整合，以實施更複雜的線路拓撲結構。此外，下述實驗示出了網絡基序如何可以基於以Csy4為基礎的RNA處理而被重接。具體而言，將miRNA調控與CRISPR-TF合併，並使用Csy4通過移除同源miRNA結合位點幹擾miRNA對靶RNA的抑制。建立單個RNA轉錄本，其能夠表達功能miRNA(Greber等，2008；Xie等，2011)和功能gRNA兩者。這是通過編碼mKate2基因內共有內含子內部的哺乳動物miRNA，以及隨後的三鏈體序列和側翼為Csy4識別位點的gRNA1序列所實現的(圖7A，CMVp-mKEx1-[miR]-mKEx2-Tr-28-g1-28)。也使用了2種輸出構建體，以證明用經改造構建體進行多重基因調控的潛力。第一輸出為組成型表達的ECFP基因，其後為三鏈體序列、Csy4識別位點、8xmiRNA結合位點(8xmiRNA-BS)，以及另一個Csy4識別位點(圖7A)。第二輸出為合成P1啟動子，其調控EYFP表達(圖7A)。在Csy4不存在下，ECFP和EYFP水平低，因為miRNA抑制了ECFP表達，並且沒有功能gRNA1產生(圖7B和圖15「機制1」)。在Csy4存在下，相比於無Csy4條件，ECFP表達提高30倍，我們將其歸因於Csy4誘導的8xmiRNA-BS與ECFP轉錄本的分離(圖7B)。此外，Csy4的存在產生了功能gRNA1，導致相比於無Csy4條件EYFP表達提高了17倍(圖7B)。mKate2螢光水平在Csy4陽性和Csy4陰性條件下均高。因此，通過同時使抑制性輸出連接失活並使激活性輸出連接有功能，Csy4催化了基於RNA的線路連接的重接，該連接位於輸入節點及其2個輸出之間(圖7C)。為了證明使用RNA依賴性機制可對額外的線路拓撲結構進行編程的便捷特性，通過在含有mKate的轉錄本3』末端併入額外的4xmiRNA-BS，對圖7A中的設計進行了擴展(圖7D，CMVp-mKEx1-[miR]-mKEx2-Tr-28-g1-28-miR4xBS)。在Csy4不存在下，這通過產生於mKate2內含子內的miRNA導致了mKate2表達的自調控負反饋抑制(圖7E和圖15，「機制2」)。此外，由於miRNA對ECFP的抑制及缺乏功能gRNA1的產生，ECFP和EYFP兩者的水平均保持較低。然而，在Csy4存在下，由於Csy4介導的4xmiRNA-BS與mKate2轉錄本的分離，mKate2水平提高了21倍。此外，miRNA對ECFP的抑制以相似的方式得到緩解，導致了ECFP水平27倍的提高。最後，產生了功能gRNA1，導致EYFP水平50倍的提高(圖7E)。因此，通過同時使抑制性輸出連接失活、使激活性輸出連接有功能，並使自調控反饋環路失活，Csy4催化了基於RNA的線路連接的重接，該連接位於輸入節點及其2個輸出之間(圖7F)。合成生物學提供了用於通過破壞、重接以及模仿天然網絡基序(networkmotif)來研究天然調控網絡的工具。此外，合成線路可用於連接外源信號與內源基因調控，以實施生物醫學應用及進行細胞計算。儘管許多合成基因線路基於轉錄調控，然而基於RNA的調控可用於構建多種合成基因線路。儘管有許多優勢，然而先前的工作並未將基於RNA的調控與CRISPR-TF整合，考慮到其可編程性以及多重的潛力，它們對於實施可擴展的遺傳線路均是有前景的策略。本文提供了用於在人細胞中對人工基因線路和內源基因調控進行改造的構建體。該框架整合了哺乳動物RNA調控機制與來自於細菌的RNA依賴性蛋白質dCas9和RNA加工蛋白Csy4。此外，這使得能夠基於核酸之間的鹼基配對互補對調控連接進行方便的編程。在一些實施方案中，本文提供了多種互補的方法，以從RNAPII啟動子調控的蛋白質編碼序列產生功能gRNA，其也允許目的蛋白質的伴隨表達。所使用的基因為螢光基因，因為它們是啟動子活性的方便的報告基因。然而，這些基因可容易地與任何其他蛋白質編碼序列交換，從而使得能夠從單個構建體多重表達gRNA以及任意蛋白質輸出。基於RNA三鏈體與Csy4、RNA內含子與Csy4、以及順式作用核酶，證實了這些策略通過靶向合成啟動子產生功能gRNA的能力。此外，當gRNA側翼為Csy4識別位點並位於RNA三鏈體之前的基因的下遊時，所述基因的水平隨著Csy4的水平而提高。相反的作用發現於當gRNA側翼為Csy4識別位點並位於內含子之內時，該作用的量級根據所使用的特定內含子序列而變化。因此，這些互補的構造使得能夠在合成基因線路內獲得可調的RNA和蛋白質水平。作為對合成線路的補充，在一些實施方案中，本公開內容的經改造構建體可用於從多個不同的人RNAPII啟動子以及CMV啟動子激活內源啟動子。在一些實施方案中，本文提供了新策略以用於從緊湊的單個轉錄本的多重gRNA表達，以對合成和天然啟動子兩者進行調節。該特徵是有用的，因為其可用於例如從單個節點調控多個節點。在單個轉錄本內簡潔地編碼多個gRNA的能力使得具有大量平行「輸出端(fan-ont)」(例如，來自給定節點的對外互連)的複雜線路以及具有密集互連的網絡成為可能。此外，用幾個gRNA以精簡的方式協同調節內源基因座的能力是有優勢的，因為例如，經常需要多個gRNA以對天然啟動子進行明顯的調節。因此，在一些情況下，本文所述的經改造構建體可用於建立有效的人工基因網絡以及微擾天然調控網絡。除了轉錄調控之外，在一些實施方案中，也可使用成熟的核酸酶Cas9(nuclease-proficientCas9)代替taCas9，以通過gRNA表達的調控條件性將多重基因組編輯活性與細胞信號連接。這使得能夠在體內環境(例如細胞特異性的、時間或空間控制)下條件性地多重敲除。除了遺傳研究之外，在一些實施方案中，該能力可用於創建體內基於DNA的將細胞事件與突變相連的「紙帶(tickertape)」。在一些實施方案中，這些構造為人細胞中複雜且緊湊的合成基因線路的構建奠定了基礎。不受理論束縛，因為用經改造構建體的調控互鏈的特異性僅由RNA序列決定，所以可構建具有幾乎任何網絡拓撲結構的可擴展的線路。例如，多層網絡拓撲結構在人工和天然遺傳環境下，對於獲得複雜行為是重要的。因此，為了證明本構建體對於實施更複雜合成線路的用途，將其用於創建高度特異且有效的第一基於CRISPR-TF的轉錄級聯。本文通過所提供的實施例證明了這是可靠的具有2種不同構造的三步轉錄級聯，所述不同構造合併了RNA三鏈體、內含子、Csy4和CRISPR-TF。在所述級聯的不同階段之間不存在不希望的串擾，這突出了RNA依賴性調控方案對於合成基因線路設計的正交性及可擴展性。在一些情況下，可使用多重gRNA表達與轉錄級聯的組合以創建多階段、多輸入/多輸出的基因網絡，其能夠推理、計算、以及與內源系統交互。此外，在一些實施方案中，可用的拓撲結構，如多階段前饋和反饋環，可被容易地編程。此外，RNA調控部分(如CRISPR-TF和RNA幹擾)被整合在一起以創建多種線路拓撲結構，其可通過條件性RNA處理而重接。因為正調控和負調控兩者均可能以相同的taCas9蛋白和miRNA進行可調的負調控，許多重要的多組件網絡拓撲結構可使用該組調控部分實施。此外，Csy4可用於例如通過修飾RNA轉錄本催化基因表達中的改變。例如，釋放功能gRNA以用於轉錄調節，並且從RNA轉錄本移除miRNA結合位點以消除基於miRNA的連接。此外，Csy4的不存在或存在用於分別轉換基於miRNA的自調控負反饋環的開與關(圖7B)。在一些實施方案中，該特徵可在線路中擴展以使得將正反饋環中不需要的洩漏最小化，並使線路在不同狀態之間動態地轉換。通過連接Csy4表達與例如內源啟動子，線路與網絡行為之間的互連也可條件性地與特定的組織、事件(例如，細胞周期階段，突變)或環境條件相連。通過基因組發掘或對Csy4的定向誘變，正交的Csy4變體可用於更複雜的RNA處理方案。此外，通過使用正交的Cas9蛋白可獲得額外的靈活性和可擴展性。總之，本公開內容提供了多樣的構建體組，以用於建立可擴展的調控基因線路、對其調整、修飾線路組件之間的連接，以及使網絡中的多個基因表達同步。此外，在一些實施方案中，這些調控部分可用於交互合成基因線路與內源系統以及用於重接內源網絡。將RNA依賴性調控機制與RNA處理整合將使得複雜的轉錄及轉錄後調控成為可能，加快合成生物學，並促進在人細胞中的基礎生物學的研究。質粒構建CMVp-dCas9-3xNLS-VP64(taCas9，構建體1，表2)質粒的建立如前所述(Farzadfard等，2013)。來自於銅綠假單胞菌菌株UCBPP-PA14(Qi等，2012)的csy4基因被密碼子優化以用於在人細胞中表達，經PCR擴增含有N端6x-His標籤以及TEV識別序列，並克隆至PGK1-EBFP2質粒(Farzadfard等，2013)中HindIII/SacI位點之間的PGK1啟動子下遊，以創建PGK1p-Csy4-pA(構建體2，表2)。表2.構建體名稱、設計及縮寫使用GIBSON由用合適的同源突出端擴增的三個部分建立質粒CMVp-mKate2-三鏈體-28-gRNA1-28-pA(構建體3，表2)：1)mKate2的全長編碼序列；2)小鼠MALAT13』三螺旋的前110個鹼基對(bp)(Wilusz等，2012)；以及3)含有20bp特異性決定序列(SpecificityDeterminingSequence，SDS)和釀膿鏈球菌(S.pyogenes)gRNA骨架以及28個核苷酸(nt)Csy4識別位點的gRNA1。報告質粒P1-EFYP-pA(構建體5，表2)和P2-ECFP-pA(構建體6，表2)為通過將gRNA1結合位點的8個重複和gRNA2結合位點的8個重複經由對互補寡核苷酸退火克隆到pG5-Luc(Promega)的NheI位點中建立。然後，將EYFP和ECFP分別克隆到NcoI/FseI位點中。通過GIBSON由具有合適同源性突出端的以下部分建立質粒CMVp-mKate2_EX1-[28-gRNA1-28]HSV1-mKate2-EX2-pA(構建體4，表2)：1)mKate2的mKate2_EX1(a.a.1-90)；2)mKate2的mKate_EX2(a.a.91-239)以及3)gRNA1，其含有20bpSDS，之後為釀膿鏈球菌gRNA骨架，所述骨架的側翼為Csy4識別位點和HSV1接受體、供體及分支序列。以相似的方式建立CMVp-mKate2_EX1-[28-gRNA1-28]HSV1-mKate2_EX2-pA質粒的變化，所述質粒含有共有接受體和SnoRNA2接受體、供體及分支序列，並且具有或不具有Csy4識別序列(構建體8至12，表2)。通過GIBSON由XmaI消化的CMVp-mKate2和經PCR延伸的gRNA1擴增子(具有或不具有三鏈體，並在5』末端上含有HHRibo(Gao和Zhao，2014)以及在3』末端上含有HDVRibo(Gao和Zhao，2014))建立核酶表達質粒CMVp-mKate2-三鏈體-HHRibo-gRNA1-HDVRibo-pA和CMVp-mKate2-HHRibo-gRNA1-HDVRibo-pA質粒(分別為構建體13和14，表2)。相似地通過GIBSON由SacI消化的CMVp-mKate2和經PCR延伸的gRNA1擴增子(在5』末端上含有HHRibo，且在3』末端上含有HDVRibo)建立質粒CMVp-HHRibo-gRNA1-HDVRibo-pA(構建體15，表2)。使用合適的同源性通過GIBSON由以下部分建立質粒CMVp-mKate2_EX1-[28-gRNA1-28]HSV1-mKate2_EX2-三鏈體-28-gRNA2-28-pA(構建體16，表2)：1)XmaI消化的CMVp-mKate2_EX1-[28-gRNA1-28]HSV1-mKate2_EX2-pA(構建體4，表2)以及2)從CMVp-mKate2-三鏈體-28-gRNA1-28-pA(構建體3，表2)之經PCR擴增的三鏈體-28-gRNA2-28。使用合適的同源性通過GIBSON的以下部分建立質粒CMVp-mKate2-三鏈體-28-gRNA1-28-gRNA2-28-pA(構建體17，表2)：1)XmaI消化的CMVp-mKate2-三鏈體-28-gRNA1-28-pA(構建體3，表2)以及2)經PCR擴增的28-gRNA2-28。利用GoldenGate方法，使用II型限制性酶，BsaI構建質粒CMVp-mKate2-三鏈體-28-gRNA3-28-gRNA4-28-gRNA5-28-gRNA6-28-pA(構建體19，表2)。具體而言，PCR擴增靶向含有20bpSDS的gRNA3、gRNA4、gRNA5、gRNA6序列的IL1RN以及釀膿鏈球菌gRNA骨架，以使其含有5』末端上的BsaI限制性位點以及Csy4「28」和3』末端上的BsaI限制性位點。使PCR擴增產物進行30個如下交替的循環：消化隨後分別在37℃和20℃連接。將含有gRNA3-28-gRNA4-28-gRNA5-28-gRNA6-28排列的540bpPCR產物擴增並用NheI/XmaI消化，並且克隆至CMVp-mKate2-三鏈體-28-gRNA1-28-pA質粒(構建體3，表2)中。以來自LilaWroblewska的贈送接受含有內含子FF4(合成miRNA)的CMVp-mKate2_EX1-[miRNA]-mKate2_EX2-pA質粒。將合成FF4miRNA克隆至位於mKate2的a.a.90與91之間的具有共有接收者、供體及分支序列的內含子中，以產生CMVp-mKate2_EX1-[miRNA]-mKate2_EX2-三鏈體-28-gRNA1-28-pA(構建體20，表2)以及CMVp-mKate2_EX1-[miRNA]-mKate2_EX2-三鏈體-28-gRNA1-28-4xFF4BS-pA(構建體21，表2)。質粒CMVp-ECFP-三鏈體-28-8xmiRNA-BS-28-pA(構建體22，表2)通過具有以下部分的GIBSON克隆：1)ECFP的全長編碼序列，和2)110nt的MALAT13』三螺旋序列，其用含有8個FF4miRNA結合位點及兩端上的Csy4識別序列的寡核苷酸通過PCR延伸擴增。細胞培養和轉染HEK293T細胞獲自美國組織保藏中心(AmericanTissueCollectionCenter，ATCC)，並在Dulbecco改良Eagle培養基(Dulbecco′sModifiedEagleMedium，DMEM)中在37℃、5％CO2下維持，所述培養基補充有10％胎牛血清(fetalbovineserum，FBS)、1％青黴素-鏈黴素、1％GlutaMAX、非必需胺基酸。將HEK293T細胞用HD轉染試劑(Promega)根據製造商的說明書轉染。在6孔板中，使用200,000細胞/孔進行每個轉染。作為對照，使用了2μg的單質粒，其中CMV啟動子調控mKate2，轉染效率常規地高於90％(通過用與實驗相同的設置進行的流式細胞術測定)。除非另有說明，每種質粒以1μg/樣品轉染。所有樣品用taCas9轉染，除非具體說明。在轉染後72小時將細胞進行流式細胞術或qRT-PCR分析。定量反轉錄-PCR(RT-PCR)下述實驗過程描述於(Perez-Pinera等，2013a)中。在轉染後72小時收穫細胞。使用RNeasyPlusRNA分離試劑盒(Qiagen)分離總RNA。使用qScriptcDNASuperMix(QuantaBiosciences)進行cDNA合成。用具有以下寡核苷酸引物的Mastercyclereprealplex實時PCR系統(Eppendorf)進行使用PerfeCTaSYBRGreenFastMix(QuantaBiosciences)的實時PCR：IL1RN-正向GGAATCCATGGAGGGAAGAT(SEQIDNO：22)，反向TGTTCTCGCTCAGGTCAGTG(SEQIDNO：23)；GAPDH-正向CAATGACCCCTTCATTGACC(SEQIDNO：24)，反向TTGATTTTGGAGGGATCTCG(SEQIDNO：25)。使用Primer3Plus軟體設計所述引物並且其購自IDT。通過熔化曲線分析確定引物特異性。計算了合適動態範圍內的反應效率，以確保標準曲線的線性。通過ddCt法計算以GAPDH表達歸一化的目的基因mRNA表達的倍數提高。然後，我們以非特異性gRNA1對照條件歸一化mRNA水平。報告的值為用對每個實驗進行平均的技術性重複的三次獨立生物學重複的平均值。誤差條代表平均值的標準差(standarderrorofthemean，s.e.m)。流式細胞術轉染後72小時用胰蛋白酶收穫細胞，用DMEM培養基和1xPBS洗滌，用1xPBS重懸到流式細胞術管中並立即用BectonDickinsonLSRIIFortessa流式細胞儀測定。在每個數據組中對每個樣品至少記錄50,000個細胞。每個實驗結果代表來自至少3次生物學重複的數據。誤差條為對加權中位螢光值的s.e.m(關於數據分析的詳細信息參見擴展的實驗流程)。補償對照補償對照是嚴格的並設計為移除假陽性細胞，甚至以移除真陽性細胞為代價。用BDFACSDiva(版本號6.1.3；BDBiosciences)完成補償，詳細信息如下：表3.用於流式細胞術的補償設置螢光染料-％螢光染料光譜重疊PE-Tx-Red-YGFITC0％PacificBlueFITC0.2％FITCPE-Tx-Red-YG21.1％PacificBluePE-Tx-Red-YG1％FITCPacificBlue7.5％流式細胞術分析對補償的流式細胞術結果使用FlowJo軟體(vX.0.7r2)進行分析。按以下描述進行計算：對所有樣品進行設門(gate)以排除細胞團塊和碎片(群P1)。根據以下設門分析P1細胞的柱狀圖，根據在相同獲取條件下非轉染細胞的自體螢光對其進行確定，以使得假陽性細胞的比例低於0.1％：mKate2：「mKate2陽性」細胞限定為高於100a.u.的螢光閾值的細胞。EYFP：「EYFP陽性」細胞限定為高於300a.u.的螢光閾值的細胞。ECFP：「ECFP陽性」細胞限定為高於400a.u.的螢光閾值的細胞。計算每個「陽性細胞」群的陽性細胞的百分比(％陽性)和中位螢光。將％陽性細胞乘以中位螢光，得到加權中位螢光表達水平，其將螢光強度與細胞數目相關聯。該檢測策略與幾個先前的研究(Auslander等，2012；Xie等，2011)相一致。確定每個樣品的加權中位螢光。計算生物學重複的加權中位螢光的平均值。這些是展示於文章中的數據。還計算了平均值的標準差(s.e.m)並以誤差條表示。為了促進不同構建體之間的比較以及說明不同螢光蛋白的亮度變化，將每種實驗條件的加權中位螢光除以相同實驗設置下測試的所有條件中相同螢光團的最大加權中位螢光。示於補充信息中的流式細胞術數據圖代表來自單個實驗的補償數據。如上文所述，對細胞進行設門以排除細胞團塊和碎片(群P1)，並將活細胞的整個設門的群呈現於每個圖中。根據上述閾值設定每個亞群Q1至Q4的閾值。每個亞群中細胞的百分比如圖中所示。圖中的黑色十字表明了具體亞群的中位螢光。雖然本文描述並舉例說明了幾個創造性實施方案，然而本領域普通技術人員將容易地預見到用於實施本文所描述的功能和/或獲得結果和/或一種或更多種優勢的多種其他手段和/或構建體，並且每個這樣的變化和/或修改都被認為是在本文所描述的創造性實施方案的範圍內。更普遍地說，本領域技術人員將容易地理解，所有本文描述的參數、尺寸、材料和構造意在作為示例，並且實際的參數、尺寸、材料和/或構造將取決於使用該創造性教導的具體應用。本領域技術人員將認識到，或能夠僅使用常規實驗確定本文所描述的具體創造性實施方案的許多等同方案。因此，應當理解的是，上述實施方案僅通過實例的方式展示，並且除非具體描述和要求保護，創造性實施方案可在附加權利要求及其等同方案的範圍內實施。本公開內容的創造性實施方案針對本文所述的每個單獨特徵、系統、製品、材料、試劑盒和/或方法。此外，如果這些特徵、系統、製品、材料、試劑盒和/或方法相互不一致，則任何2種或更多種所述特徵、系統、製品、材料、試劑盒和/或方法的組合均包括在本公開內容的創造性範圍內。本文所限定並使用的所有定義應當理解為相比於詞典的定義、通過參考併入的文件中的定義，和/或所限定的術語的普通含義，以本文所限定並使用的所有定義為準。除非清楚指明相反，否則本文用於說明書和權利要求中的沒有數詞限定的表述應理解為意指「至少一個/種」。本文用於說明書和權利要求中的短語「和/或」應理解為意指這樣連接的要素的「任一個或兩者全部」，即要素在一些情況下相結合，而在其他情況下不結合。用「和/或」列出的多個要素應以相同方式詮釋，即這樣連接的要素的「一個/種或更多個/種」。除了通過「和/或」分句具體限定的要素外的其他要素可以任選地存在，無論其是否與那些具體限定的要素相關。因此，作為一個非限制性實例，提及「A和/或B」，當其與開放式語句(如「包含」)聯用時，在一個實施方案中，可指僅有A(任選地包括除B以外的要素)；在另一個實施方案中，可指僅有B(任選地包括除A以外的要素)；而在另一個實施方案中，可指A與B兩者(任選地包括其他要素)；等。本文用於說明書和權利要求中的「或」應理解為具有與上文限定的「和/或」相同的含義。例如，當分離列表中的項目時，「或」或者「和/或」應解釋為包括性的，即包括許多要素或要素列表的至少一個/種，但也包括多於一個/種，並且任選地包括未列出的額外項目。僅有清楚相反指明的短語時，如「僅其中一個/種」或「確切地其中一個/種」或當用於權利要求中時的「由...組成」，指確切地包括許多要素或要素列表中的一個要素。通常，當前面是排他性短語，如「兩者之一」、「其中一個/中」、「僅其中一個/種」或「確切地其中一個/種」時，本文所使用的術語「或」僅應當被解釋為表示排斥的選擇(即，「一個/種或另一個/種但並非兩者全部」)。當「基本上由...組成」用於權利要求中時，應具有其在專利法領域使用時的普通含義。本文用於說明書和權利要求中的涉及一個/種或更多個/種要素列表的短語「至少一個/種」應理解為意指選自該要素列表中的任何一個/種或更多個/種要素中的至少一個/種要素，但並非必須包括該要素列表內所具體列出的各個/種和每個/種要素的至少一個/種，也不排除該要素列表中的要素的任意組合。該定義也允許除了短語「至少一個/種」所指的要素列表內所具體限定的要素外的要素可以任選地存在，無論其是否與所具體限定的要素相關。因此，作為一個非限制性實例，「A和B中的至少一個/種」(或等同地，「A或B中的至少一個/種」，或等同地，「A和/或B中的至少一個/中」)在一個實施方案中可指至少一個/種，任選地包括多於一個/種，A而不存在B(並且任選地包括除B以外的要素)；在另一個實施方案中，指至少一個/種，任選地包括多於一個/種，B而不存在A(並且任選地包括除A以外的要素)；而在另一個實施方案中，指至少一個/種，任選地包括多於一個/種A，以及至少一個/種，任選地包括多於一個/種B(並且任選地包括其他要素)；等。應當理解的是，除非清楚相反指明，在本文所要求保護的任何包括多於一個步驟或動作的方法中，所述方法的步驟或動作的順序並不必須受限於其中記載了所述方法的步驟或動作的順序。本文所公開的所有參考文獻、專利及專利申請均以其各自被引用的主題通過引用併入，在一些情況下其可包括整個文件。在權利要求以及上述說明書中，所有過渡短語如「包含」、「包括」、「帶有」、「具有」、「含有」、「涉及」、「容納」、「由...構成」等應理解為開放式的，即意指包括但不限於。只有過渡短語「由...組成」和「基本上...組成」應分別為封閉的或半封閉的過渡短語，如美國專利局專利審查程序手冊，章節2111.03所闡釋的。參考文獻(下面的每一篇參考文獻均通過引用併入本文。)Alon，U.(2007).Networkmotifs:theoryandexperimentalapproaches.NatRevGenet8，450-461.Audibert，A.，Weil，D.，andDautry，F.(2002).InvivokineticsofmRNAsplicingandtransportinmammaliancells.MolCellBiol22，6706-6718.Auslander，S.，Auslander，D.，Muller，M.，Wieland，M.，andFussenegger，M.(2012).Programmablesingle-cellmammalianbiocomputers.Nature487，123-127.Babiskin，A.H.，andSmolke，C.D.(2011).AsyntheticlibraryofRNAcontrolmodulesforpredictabletuningofgeneexpressioninyeast.Molecularsystemsbiology7，471.Barrangou,R.,andvanderOost,J.(2013).RNA-mediatedAdaptiveImmunityinBacteriaandArchaea(Springer).Bashor,C.J.,Helman,N.C.,Yah,S.,andLim,W.A.(2008).UsingengineeredscaffoldinteractionstoreshapeMAPkinasepathwaysignalingdynamics.Science319,1539-1543.Beck,J.，andNassal，M.(1995).Efficienthammerheadribozyme-mediatedcleavageofthestructuredhepatitisBvirusencapsidationsignalinvitroandincellextracts，butnotinintactcells.NucleicAcidsResearch23，4954-4962.Beerli，R.R.，andBarbas，C.F.,3rd(2002).Engineeringpolydactylzinc-fingertranscriptionfactors.NatBiotechno120，135-141.Benenson，Y.(2012).Biomolecularcomputingsystems:principles，progressandpotential.NatRevGenet13，455-468.Block，T.M.，andHill，J.M.(1997).Thelatencyassociatedtranscripts(LAT)ofherpessimplexvirus:stillnoendinsight.JNeurovirol3,313-321.Blount,B.A.,Weenink,T.,Vasylechko,S.,andEllis,T.(2012).Rationaldiversificationofapromoterprovidingfine-tunedexpressionandorthogonalregulationforsyntheticbiology.PLoSOne7，e33279.Chen，M.,andManley，J.L.(2009).Mechanismsofalternativesplicingregulation:insightsfrommolecularandgenomicsapproaches.NaturereviewsMolecularcellbiology10，741-754.Chen，Y.Y.，Jensen，M.C.，andSmolke，C.D.(2010).GeneticcontrolofmammalianT-cellproliferationwithsyntheticRNAregulatorysystems.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica107,8531-8536.Cheng,A.W.,Wang,H.,Yang,H.,Shi,L.,Katz,Y.,Theunissen,T.W.,Rangarajan,S.,Shivalila,C.S.,Dadon,D.B.,andJaenisch，R.(2013).MultiplexedactivationofendogenousgenesbyCRISPR-on，anRNA-guidedtranscriptionalactivatorsystem.CellRes23，1163-1171.Chowrira，B.M.，Pavco，P.A.，andMcSwiggen，J.A.(1994).Invitroandinvivocomparisonofhammerhead，hairpin，andhepatitisdeltavirusself-processingribozymecassettes.JournalofBiologicalChemistry269，25856-25864.Clement，J.Q.，Qian，L.，Kaplinsky，N.，andWilkinson，M.F.(1999).Thestabilityandfateofasplicedintronfromvertebratecells.Rna5，206-220.Cong，L.，Ran，F.A.，Cox，D.，Lin，S.，Barretto，R.，Habib，N.，Hsu，P.D.，Wu，X.，Jiang，W.，Marraffini，L.A.，etal.(2013).MultiplexGenomeEngineeringUsingCRISPR/CasSystems.Science339，819-823.Cronin，C.A.，Gluba，W.，andScrable，H.(2001).Thelacoperator-repressorsystemisfunctionalinthemouse.Genes&development15，1506-1517.Culler，S.J.，Hoff，K.G.，andSmolke，C.D.(2010).ReprogrammingcellularbehaviorwithRNAcontrollersresponsivetoendogenousproteins.Science330，1251-1255.Deans，T.L.，Cantor，C.R.，andCollins，J.J.(2007).AtunablegeneticswitchbasedonRNAiandrepressorproteinsforregulatinggeneexpressioninmammaliancells.Cell130，363-372.Delebecque，C.J.，Lindner，A.B.，Silver，P.A.，andAldaye，F.A.(2011).OrganizationofintracellularreactionswithrationallydesignedRNAassemblies.Science333，470-474.Dequeant，M.L.，andPourquie，O.(2008).Segmentalpatterningofthevertebrateembryonicaxis.NatRevGenet9,370-382.Ellefson，J.W.，Meyer，A.J.，Hughes，R.A.，Cannon，J.R.，Brodbelt，J.S.,andEllington，A.D.(2014).Directedevolutionofgeneticpartsandcircuitsbycompartmentalizedpartneredreplication.NatBiotech32,97-101.Ellis，T.，Wang，X.，andCollins，J.J.(2009).Diversity-based，model-guidedconstructionofsyntheticgenenetworkswithpredictedfunctions.NatBiotechnol27，465-471.Elowitz，M.，andLim，W.A.(2010).Buildlifetounderstandit.Nature468，889-890.Esvelt，K.M.，Carlson，J.C.，andLiu，D.R.(2011).Asystemforthecontinuousdirectedevolutionofbiomolecules.Nature472，499-503.Esvelt，K.M.，Mali，P.，Braff，J.L.，Moosburner，M.，Yaung，S.J.，andChurch，G.M.(2013).OrthogonalCas9proteinsforRNA-guidedgeneregulationandediting.NatureMethods10，1116-1121.Farzadfard，F.，Perli，S.D.，andLu，T.K.(2013).TunableandMultifunctionalEukaryoticTranscriptionFactorsBasedonCRISPR/Cas.ACSSyntheticBiology2,604-613.Feng，J.，Bi，C.，Clark，B.S.，Mady，R.，Shah，P.，andKohtz，J.D.(2006).TheEvf-2noncodingRNAistranscribedfromtheDlx-5/6ultraconservedregionandfunctionsasaDlx-2transcriptionalcoactivator.Genes&development20,1470-1484.Ferre-D′Amare，A.R.，Zhou，K.，andDoudna，J.A.(1998).Crystalstructureofahepatitisdeltavirusribozyme.Nature395,567-574.Fussenegger，M.，Morris，R.P.，Fux，C.，Rimann，M.，vonStockar，B.，Thompson，C.J.，andBailey，J.E.(2000).Streptogramin-basedgeneregulationsystemsformammaliancells.Naturebiotechnology18,1203-1208.Gao，Y.，andZhao，Y.(2014).Self-processingofribozyme-flankedRNAsintoguideRNAsinvitroandinvivoforCRISPR-mediatedgenomeediting.JournalofIntegrativePlantBiology，n/an/a.Gilbert，LukeA.，Larson，MatthewH.，Morsut，L.，Liu，Z.，Brar，GloriaA.，Torres，SandraE.，Stern-Ginossar，N.，Brandman，O.，Whitehead，EvanH.，Doudna，JenniferA.，etal.(2013).CRISPR-MediatedModularRNA-GuidedRegulationofTranscriptioninEukaryotes.Cell154,442-451.Gossen，M.，andBujard，H.(1992).Tightcontrolofgeneexpressioninmammaliancellsbytetracycline-responsivepromoters.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences89，5547-5551.Greber，D.，E1-Baba，M.D.，andFussenegger，M.(2008).IntronicallyencodedsiRNAsimprovedynamicrangeofmammaliangeneregulationsystemsandtoggleswitch.NucleicAcidsRes36,e101.Guido,N.J.,Wang,X.,Adalsteinsson,D.,McMillen,D.,Hasty,J.,Cantor,C.R.，Elston，T.C.，andCollins，J.J.(2006).Abottom-upapproachtogeneregulation.Nature439，856-860.Haurwitz，R.E.，Sternberg，S.H.，andDoudna，J.A.(2012).Csy4reliesonanunusualcatalyticdyadtopositionandcleaveCRISPRRNA.Emboj31，2824-2832.Hooshangi，S.，Thiberge，S.，andWeiss，R.(2005).Ultrasensitivityandnoisepropagationinasynthetictranscriptionalcascade.ProcNatlAcadSciUSA102，3581-3586.Houseley，J.，andTollervey，D.(2009).TheManyPathwaysofRNADegradation.Cell136，763-776.Jackson，R.J.(1993).CytoplasmicregulationofmRNAfunction:Theimportanceofthe3′untranslatedregion.Cell74，9-14.Jiang，W.，Bikard，D.，Cox，D.，Zhang，F.，andMarraffini，L.A.(2013).RNA-guidededitingofbacterialgenomesusingCRISPR-Cassystems.NatBiotech31，233-239.Jinek，M.，Chylinski，K.，Fonfara，I.，Hauer，M.，Doudna，J.A.，andCharpentier，E.(2012).AProgrammableDual-RNA-GuidedDNAEndonucleaseinAdaptiveBacterialImmunity.Science337,816-821.Jinek，M.，East，A.，Cheng，A.，Lin，S.，Ma，E.，andDoudna，J.(2013).RNA-programmedgenomeeditinginhumancells，eLife2，e00471.Kampf，M.M.，Engesser，R.，Busacker，M.，Homer，M.，Karlsson，M.，Zurbriggen，M.D.，Fussenegger，M.，Timmer，J.，andWeber，W.(2012).Rewiringanddosingofsystemsmodulesasadesignapproachforsyntheticmammaliansignalingnetworks.MolecularbioSystems8，1824-1832.Kemmer，C.，Fluri，D.A.，Witschi，U.，Passeraub，A.，Gutzwiller，A.，andFussenegger，M.(2011).Adesignernetworkcoordinatingbovineartificialinseminationbyovulation-triggeredreleaseofimplantedsperms.Journalofcontrolledrelease:officialjournaloftheControlledReleaseSociety150，23-29.Kemmer，C.，Gitzinger，M.，Daoud-E1Baba，M.，Djonov，V.，Stelling，J.，andFussenegger，M.(2010).Self-sufficientcontrolofuratehomeostasisinmicebyasyntheticcircuit.Naturebiotechnology28，355-360.Kennedy,A.B.，Liang，J.C.，andSmolke，C.D.(2013).Aversatilecis-blockingandtransactivationstrategyforribozymecharacterization.Nucleicacidsresearch41，e41.Khalil，A.，Lu，T.K.，Bashor，C.，Ramirez，C.，Pyenson，N.，Joung，J.K.，andCollins，J.J.(2012).ASyntheticBiologyFrameworkforProgrammingEukaryoticTranscriptionFunctions.Cell150，647-658.Kim，Y.-K.，andKim，V.N.(2007).ProcessingofintronicmicroRNAs.TheEMBOJournal26，775-783.Koizumi,M.，Soukup，G.A.，Kerr，J.N.，andBreaker，R.R.(1999).AllostericselectionofribozymesthatrespondtothesecondmessengerscGMPandcAMP.Naturestructuralbiology6,1062-1071.Kuwabara，T.，Warashina，M.，Tanabe，T.，Tani，K.，Asano，S.，andTaira，K.(1998).Anovelallostericallytrans-activatedribozyme，themaxizyme，withexceptionalspecificityinvitroandinvivo.MolCell2,617-627.Lee，J.T.(2012).EpigeneticRegulationbyLongNoncodingRNAs.Science14，1435-1439.Levine，J.H.，Fontes，M.E.，Dworkin，J.，andElowitz，M.B.(2012).Pulsedfeedbackdeferscellulardifferentiation.PLoSbiology10，e1001252.Lin，R.，Maeda，S.，Liu，C.，Karin，M.，andEdgington，T.S.(2006).AlargenoncodingRNAisamarkerformurinehepatocellularcarcinomasandaspectrumofhumancarcinomas.Oncogene26，851-858.Lohmueller，J.J.，Armel，T.Z.，andSilver，P.A.(2012).Atunablezincfinger-basedframeworkforBooleanlogiccomputationinmammaliancells.NucleicAcidsResearch.Maeder，M.L.，Linder，S.J.，Cascio，V.M.，Fu，Y.，Ho，Q.H.，andJoung，J.K.(2013a).CRISPRRNA-guidedactivationofendogenoushumangenes.NatMethods10，977-979.Maeder，M.L.，Linder，S.J.，Reyon，D.,Angstman,J.F.,Fu,Y.,Sander，J.D.，andJoung，J.K.(2013b).Robust，synergisticregulationofhumangeneexpressionusingTALEactivators.NatMeth10，243-245.Maeder，M.L.，Thibodeau-Beganny，S.，Sander，J.D.，Voytas，D.F.，andJoung，J.K.(2009).Oligomerizedpoolengineering(OPEN):an′open-source′protocolformakingcustomizedzincfingerarrays.NatProtocols4，1471-1501.Mali，P.，Aach，J.，Stranges，P.B.，Esvelt，K.M.，Moosburner，M.，Kosuri，S.，Yang，L.，andChurch，G.M.(2013a).CAS9transcriptionalactivatorsfortargetspecificityscreeningandpairednickasesforcooperativegenomeengineering.NatBiotechnol31,833-838.Mali，P.，Yang，L.，Esvelt，K.M.，Aach，J.，Guell，M.，DiCarlo，J.E.，Norville，J.E.，andChurch，G.M.(2013b).RNA-GuidedHumanGenomeEngineeringviaCas9.Science339,823-826.McMillen，D.，Kopell，N.，Hasty，J.，andCollins，J.J.(2002).Synchronizinggeneticrelaxationoscillatorsbyintercellsignaling.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences99，679-684.Mercer，T.R.，Dinger，M.E.，andMattick，J.S.(2009).Longnon-codingRNAs:insightsintofunctions.NatRevGenet10，155-159.Muller，K.,Engesser,R.,Metzger,S.，Schulz，S.，Kampf，M.M.，Busacker，M.，Steinberg，T.，Tomakidi，P.，Ehrbar，M.，Nagy，F.，etal.(2013a).Ared/far-redlight-responsivebi-stabletoggleswitchtocontrolgeneexpressioninmammaliancells.Nucleicacidsresearch41，e77.Muller，K.，Engesser，R.，Schulz，S.，Steinberg，T.，Tomakidi，P.，Weber，C.C.，Ulm，R.，Timmer，J.，Zurbriggen，M.D.，andWeber，W.(2013b).Multi-chromaticcontrolofmammaliangeneexpressionandsignaling.NucleicAcidsRes41，e124.Nagano，T.，Mitchell，J.A.，Sanz，L.A.，Pauler，F.M.，Ferguson-Smith，A.C.，Feil，R.，andFraser，P.(2008).TheAirNoncodingRNAEpigeneticallySilencesTranscriptionbyTargetingG9atoChromatin.Science322，1717-1720.Nagarajan,V.K.,Jones,C.I.,Newbury,S.F.,andGreen,P.J.(2013).XRN5′-＞3′exoribonucleases:Structure，mechanismsandfunctions.BiochimicaetBiophysicaActa(BBA)-GeneRegulatoryMechanisms1829，590-603.Nissim，L.，andBar-Ziv，R.H.(2010).Atunabledual-promoterintegratorfortargetingofcancercells.MolSystBiol6，444.Nissim，L.，Beatus，T.，andBar-Ziv，R.(2007).Anautonomoussystemforidentifyingandgoverningacell′sstateinyeast.Physicalbiology4,154-163.Orioli，A.，Pascali，C.，Pagano，A.，Teichmann，M.，andDieci，G.(2012).RNApolymeraseIIItranscriptioncontrolelements:Themesandvariations.Gene493，185-194.Pandey，R.R.，Mondal，T.，Mohammad，F.，Enroth，S.，Redrup，L.，Komorowski，J.，Nagano，T.，Mancini-DiNardo，D.，andKanduri，C.(2008).Kcnqlot1AntisenseNoncodingRNAMediatesLineage-SpecificTranscriptionalSilencingthroughChromatin-LevelRegulation.MolecularCell32，232-246.Park，S.H.，Zarrinpar，A.，andLirm，W.A.(2003).RewiringMAPkinasepathwaysusingalternativescaffoldassemblymechanisms.Science299，1061-1064.Peel，A.D.，Chipman，A.D.，andAkam，M.(2005).Arthropodsegmentation:beyondtheDrosophilaparadigm.NatRevGenet6,905-916.Perez-Pinera，P.，Kocak，D.D.，Vockley，C.M.，Adler，A.F.，Kabadi，A.M.，Polstein，L.R.，Thakore，P.I.，Glass，K.A.，Ousterout，D.G.，Leong，K.W.，etal.(2013a).RNA-guidedgeneactivationbyCRISPR-Cas9-basedtranscriptionfactors.NatMeth10，973-976.Perez-Pinera，P.，Ousterout，D.G.，Brunger，J.M.，Farin，A.M.，Glass，K.A.，Guilak，F.，Crawford，G.E.，Hartemink，A.J.，andGersbach，C.A.(2013b).Synergisticandtunablehumangeneactivationbycombinationsofsynthetictranscriptionfactors.NatMeth10，239-242.Pley，H.W.，Flaherty，K.M.，andMcKay，D.B.(1994).Three-dimensionalstructureofahammerheadribozyme.Nature372,68-74.Proudfoot，N.J.(2011).Endingthemessage:poly(A)signalsthenandnow.GenesandDevelopment25,1770-1782.Qi，L.，Haurwitz，R.E.，Shao，W.，Doudna，J.A.，andArkin，A.P.(2012).RNAprocessingenablespredictableprogrammingofgeneexpression.NatBiotech30，1002-1006.RHormes，M.H.，IOelze，PMarschall，MTabler，FEckstein，andGSczakiel(1997).Thesubcellularlocalizationandlengthofhammerheadribozymesdetermineefficacyinhumancells.NucleicAcidsResearch25，769-775.Reyon，D.，Tsai，S.Q.，Khayter，C.，Foden，J.A.，Sander，J.D.，andJoung，J.K.(2012).FLASHassemblyofTALENsforhigh-throughputgenomeediting.NatBiotech30，460-465.Rinaudo，K.，Bleris，L.，Maddamsetti，R.，Subramanian，S.，Weiss，R.，andBenenson，Y.(2007).AuniversalRNAi-basedlogicevaluatorthatoperatesinmammaliancells.NatBiotechnol25，795-801.Rinn，J.L.，Kertesz，M.，Wang，J.K.，Squazzo，S，L.，Xu，X.，Brugmann，S.A.，Goodnough，L.H.，Helms，J.A.，Farnham，P.J.，Segal，E.，etal.(2007).FunctionalDemarcationofActiveandSilentChromatinDomainsinHumanHOXLocibyNoncodingRNAs.Cell129，1311-1323.Rogakou，E.P.，Pilch，D.R.，Orr，A.H.，Ivanova，V.S.，andBonner，W.M.(1998).DNAdoublestrandedbreaksinducehistoneH2AXphosphorylationonserine139.JBiolChem273,5858-5868.Saito,H.,Fujita,Y.,Kashida,S.,Hayashi,K.,andInoue,T.(2011).Synthetichumancellfateregulationbyprotein-drivenRNAswitches.Naturecommunications2,160.Saito,H.,Kobayashi,T.,Hara,T.,Fujita,Y.,Hayashi,K.，Furushima，R.，andInoue，T.(2010).SynthetictranslationalregulationbyanL7Ae-kink-turnRNPswitch.Naturechemicalbiology6，71-78.Sander，J.D.，andJoung,J.K.(2014).CRISPR-Cassystemsforediting,regulatingandtargetinggenomes.NatBiotechnol.Sanjana，N.E.，Cong，L.，Zhou，Y.，Cunniff，M.M.，Feng，G.,andZhang,F.(2012).Atranscriptionactivator-likeeffectortoolboxforgenomeengineering.NatProtocols7,171-192.Shoval,O.,andAlon,U.(2010).SnapShot:NetworkMotifs.Cell143,326-326.e321.Sinha,A.,Hughes,K.R.,Modrzynska,K.K.,Otto,T.D.,Pfander,C.,Dickens,N.J.,Religa,A.A.,Bushell，E.，Graham，A.L.，Cameron，R.，etal.(2014).AcascadeofDNA-bindingproteinsforsexualcommitmentanddevelopmentinPlasmodium.Nature507，253-257.Smith，C.W.J.，Porro，E.B.，Patton，J.G.，andNadal-Ginard，B.(1989).Scanningfromanindependentlyspecifiedbranchpointdefinesthe3[prime]splicesiteofmammalianintrons.Nature342，243-247.Soukup，G.A.，andBreaker，R.R.(1999).Designofallosterichammerheadribozymesactivatedbyligand-inducedstructurestabilization.Structure7，783-791.Sprinzak，D.，Lakhanpal，A.，LeBon，L.，Garcia-Ojalvo，J.,andElowitz,M.B.(2011).MutualinactivationofNotchreceptorsandligandsfacilitatesdevelopmentalpatterning.PLoScomputationalbiology7,e1002069.Sternberg,S.H.,Haurwitz,R.E.,andDoudna,J.A.(2012).MechanismofsubstrateselectionbyahighlyspecificCRISPRendoribonuclease.Rna18,661-672.Tabor,J.J.,Salis,H.M.，Simpson，Z.B.，Chevalier，A.A.，Levskaya，A.，Marcotte，E.M.，Voigt，C.A.，andEllington，A.D.(2009).Asyntheticgeneticedgedetectionprogram.Cell137，1272-1281.Taggart，A.J.,DeSimone,A.M.,Shih,J.S.,Filloux,M.E.,andFairbrother,W.G.(2012).Largescalemappingofbranchpointsinhumanpre-mRNAtranscriptsinvivo.Naturestructural&molecularbiology19，719-721.Teichmann，M.，Dieci，G.，Pascali，C.，andBoldina,G.(2010).GeneraltranscriptionfactorsandsubunitsofRNApolymeraseIII:Paralogsforpromoter-andcelltype-specifictranscriptioninmulticellulareukaryotes.Transcription1，130-135.Upadhyay，S.K.，Kumar，J.，Alok，A.，andTuli，R.(2013).RNA-GuidedGenomeEditingforTargetGeneMutationsinWheat.G3:GeneslGenomeslGenetics3，2233-2238.Urlinger，S.，Baron，U.，Thellmann，M.，Hasan，M.T.，Bujard，H.，andHillen，W.(2000).Exploringthesequencespacefortetracycline-dependenttranscriptionalactivators:Novelmutationsyieldexpandedrangeandsensitivity.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences97，7963-7968.Wang，D.，Wang，H.，Brown，J.，Daikoku，T.，Ning，W.，Shi，Q.，Richmond，A.，Strieter，R.，Dey，S.K.，andDuBois，R.N.(2006).CXCL1inducedbyprostaglandinE2promotesangiogenesisincolorectalcancer.JExpMed203,941-951.Wang，H.，Yang，H.，Shivalila，C.S.，Dawlaty，M.M.，Cheng，A.W.，Zhang，F.，andJaenisch，R.(2013).One-stepgenerationofmicecarryingmutationsinmultiplegenesbyCRISPR/Casmediatedgenomeengineering.Cell153，910-918.Wang，X.，Arai，S.，Song，X.，Reichart，D.，Du，K.，Pascual，G.，Tempst，P.，Rosenfeld，M.G.，Glass，C.K.，andKurokawa，R.(2008).InducedncRNAsallostericallymodifyRNA-bindingproteinsincistoinhibittranscription.Nature454，126-130.Weber，W.，Bacchus，W.，Gruber，F.，Hamberger，M.，andFussenegger，M.(2007).AnovelvectorplatformforvitaminH-inducibletransgeneexpressioninmammaliancells.Journalofbiotechnology131，150-158.Weber，W.，andFussenegger，M.(2009).EngineeringofSyntheticMammalianGeneNetworks.Chemistry&Biology16,287-297.Weber,W.,andFussenegger,M.(2012).Emergingbiomedicalapplicationsofsyntheticbiology.NaturereviewsGenetics13，21-35.Weber，W.，Fux,C.,Daoud-elBaba,M.,Keller,B.，Weber，C.C.,Kramer,B.P.,Heinzen,C.,Aubel,D.,Bailey,J.E.,andFussenegger,M.(2002).Macrolide-basedtransgenecontrolinmammaliancellsandmice.Naturebiotechnology20，901-907.Weber，W.，Schoenmakers，R.，Keller,B.,Gitzinger，M.，Grau，T.，Daoud-E1Baba，M.，Sander，P.，andFussenegger，M.(2008).Asyntheticmammaliangenecircuitrevealsantituberculosiscompounds.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica105,9994-9998.White，R.J.(1998).RNAPolymeraseIIITranscription(Springer-Verlag).Willis，I.M.(1993).RNApolymeraseIII.EuropeanJournalofBiochemistry212,1-11.Wilson，R.C.，andDoudna，J.A.(2013).MolecularMechanismsofRNAInterference.AnnualReviewofBiophysics42。217-239.Wilusz，J.E.，Freier，S.M.，andSpector，D.L.(2008).3′EndProcessingofaLongNuclear-RetainedNoncodingRNAYieldsatRNA-likeCytoplasmicRNA.Cell135，919-932.Wilusz，J.E.，JnBaptiste，C.K.，Lu，L.Y.，Kuhn，C.D.，Joshua-Tor，L.，andSharp，P.A.(2012).Atriplehelixstabilizesthe3′endsoflongnoncodingRNAsthatlackpoly(A)tails.Genes&development26,2392-2407.Win，M.N.，Liang，J.C.，andSmolke，C.D.(2009).FrameworksforprogrammingbiologicalfunctionthroughRNApartsanddevices.ChemBiol16，298-310.Xie，Z.，Wroblewska，L.，Prochazka，L.，Weiss，R.，andBenenson，Y.(2011).Multi-inputRNAibasedlogiccircuitforidentificationofspecificcancercells.Science333，1307-1311.Yang，H.，Wang，H.，Shivalila，C.S.，Cheng，A.W.，Shi，L.，andJaenisch，R.(2013).One-stepgenerationofmicecarryingreporterandconditionalallelesbyCRISPR/Cas-mediatedgenomeengineering.Cell154，1370-1379.Ye，H.，Daoud-E1Baba，M.，Peng，R.W.，andFussenegger，M.(2011).Asyntheticoptogenetictranscriptiondeviceenhancesblood-glucosehomeostasisinmice.Science332，1565-1568.Yin，Q.-F.，Yang，L.，Zhang，Y.，Xiang，J.-F.，Wu，Y.-W.，Carmichael，G.G.，andChen，L.-L.(2012).LongNoncodingRNAswithsnoRNAEnds.Molecularcell48，219-230.Ying，S.-Y.，andLin，S.-L.(2005).IntronicmicroRNAs.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications326，515-520.Zhao，J.，Sun，B.K.，Erwin，J.A.，Song，J.-J.，andLee，J.T.(2008).PolycombProteinsTargetedbyaShortRepeatRNAtotheMouseXChromosome.Science322，750-756.Auslander，S.，Auslander，D.，Muller，M.，Wieland，M.，andFussenegger，M.(2012).Programmablesingle-cellmammalianbiocomputers.Nature487，123-127.Xie,Z.，Wroblewska，L.，Prochazka，L.，Weiss，R.，andBenenson，Y.(2011).Multi-InputRNAi-BasedLogicCircuitforIdentificationofSpecificCancerCells.Science333，1307-1311.當前第1頁1 2 3