神經退行性障礙的製作方法

2023-04-22 21:42:51 2

專利名稱：神經退行性障礙的製作方法
神經退行性障礙交叉參考本申請涉及2002年3月2日提交的序列號為10/102沈5的申請，其要求2001年 3月20日提交的臨時申請序列號60/277，516，本文中公開通過完整引入其作為參考，並根 據35 USC § 120和§ 119要求該申請的優先權。
背景技術：
本發明涉及提高神經元的存活的組合物和方法。外周和中樞神經系統(分別為 PNS和CNQ中的神經元的生長、存活和分化部分地依賴於源自目標的、旁分泌和自分泌的 神經營養因子。相反，缺乏神經營養因子被認為在神經退行性疾病(如帕金森氏病、阿爾 茨海默氏症和肌萎縮側索硬化症(ALS或葛雷克氏症(Lou Gehrig' s disease))的病 因中發揮作用。在神經細胞培養中，通過與星形膠質細胞共培養或通過提供由星形膠質 細胞製備的條件培養基(CM)提供神經營養支持。與來自CNS的其他區域(如新紋狀體 (neostriatum)和大腦皮質)的星形膠質細胞相比，腹側中腦源的星形膠質細胞在促進腹 側中腦多巴胺能神經元的存活方面發揮更大的效能。在21天體外(DIV)或更長時間的慢 性中腦培養中，多巴胺能神經元的百分比從20%提高至60%，與星形膠質細胞的單層的增 殖相一致。相反，在星形膠質細胞的增殖受到抑制的情況下，多巴胺能神經元而不是GABA 能神經元幾乎從5DIV的培養中消除。這些結果證明同型來源的星形膠質細胞對於鄰近多 巴胺能神經元的存活和發育的重要性，並表明中腦星形膠質細胞是中腦多巴胺能神經元的 生理、旁分泌神經營養因子的可能的來源。星形膠質細胞分泌促進神經細胞存活的分子的反覆證明使得星形膠質細胞成為 治療神經退行性疾病的治療的研究焦點。許多實驗室試圖分離星形膠質細胞源性神經營養 因子，但受到重大技術問題的阻礙血清是用於培養中原代星形膠質細胞最佳生長的培養 基的關鍵組分，但血清的存在幹擾了分泌到條件培養基中的因子的後續純化。因此，仍然需要涉及治療神經病性疾病的組合物和方法。發明概述在本發明的各個方面中，提供了涉及治療神經障礙的組合物和方法。在某些實施 方式中，向受試者施用MANF和/或其生物功能片段以治療神經障礙。在一個實施方式中， 神經障礙是帕金森氏病。在本發明的另一方面中，向受試者共同施用MANF和/或其生物功能片段與一種或 多種治療劑。在某些實施方式中，一種或多種治療劑是神經營養因子。在一個實施方式中，提供了用於提高黑質(substantia niagra)的GABA能神經末 端的GABA釋放的神經障礙治療方法，包括向患有帕金森氏病的受試者施用有效量的MANF。 在另一個實施方式中，治療神經障礙的治療方法包括向患有神經障礙的受試者施用有效量 的MANF，導致拮抗穀氨酸對多巴胺神經元的興奮性毒性(excitotoxic)作用。在進一步的 實施方式中，神經障礙是帕金森氏病。通過引用引入本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請通過引用引入本文，如同各單個出版物、專利或專利申請具體和單獨地表明通過引用引入。


在所附的權利要求中詳細地提出本發明的新特點。通過參考下面的詳細說明(其 給出了利用本發明的原理的說明性實施方式)和以下附圖可以獲得對於本發明的特點和 優勢的更好的理解圖1說明苯異丙胺(aphetamine)給藥之後大鼠的漸增的身體同側轉向行為；A = VEH+VEH ；B = VEH+60HDA ；C =⑶NF+60HDA ；D = MANF+60HDA ；E =⑶NF+VEH ；F = MANF+VEH。圖2說明在各種組織(包括成年和發育中的小鼠腦組織)中MANFl表達的RT-PCR 分析。發明詳述雖然本發明的優選實施方式中已被顯示和描述，但對於本領域技術人員顯而易見 的是這些實施方式只是以舉例的方式來提供。本領域技術人員在不背離本發明的情況下 容易想到許多變化、更改和替換。應該理解，本文所述的本發明實施方式的各種替代方案可 以用於實施本發明。下列權利要求意圖限定本發明的範圍，並從而涵蓋這些權利要求及其 等值範圍內的方法和結構。本發明一般涉及使用中腦星形膠質細胞源性神經營養因子(MANF)提高神經元存 活的組合物和方法。MANF是一種在體外選擇性保護DA神經細胞並在體內糾正大腦一側的 多巴胺能神經元(DA)神經細胞退化造成的神經缺損的新的神經營養因子。MANF的作用表 明，它可用於治療帕金森氏病(PD)。此外，MANF在腹側中腦(在PD中死亡的DA神經元所 在的同一大腦區域)高水平地表達。MANF也增加黑質(substantia nigra)中GABA能神經 末端的GABA釋放。GABA拮抗穀氨酸對於DA神經元的興奮性毒性作用。本文的公開表明， 在PD患者的大腦中存在MANF的兩個靶標1) DA神經元的細胞體；2)黑質中的突觸前GABA 能神經末端。在一個方面中，本發明特徵在於治療患有神經系統疾病或障礙的患者的方法。該 方法包括向患者施用促進多巴胺能神經元存活量的基本上純化的MANF多肽的步驟。在第二方面中，本發明特徵在於防止哺乳動物中的多巴胺能神經細胞死亡的方 法。這種方法包括向哺乳動物施用促進多巴胺能神經元存活量的基本上純化的MANF多肽。在第三方面中，將細胞移植到哺乳動物(例如，人)的神經系統中的方法包括(i) 將細胞移植到哺乳動物的神經系統中；和(ii)在移植細胞前的2到4小時至移植細胞後的 2到4小時的時間窗口內，向哺乳動物施用促進多巴胺能神經元存活量的MANF多肽。在第四方面中，本發明特徵在於將細胞移植到哺乳動物(例如，人)的神經系統中 的另一種方法。該方法包括如下步驟(a)將細胞與MANF多肽接觸；和(b)將步驟(a)的 細胞移植到哺乳動物的神經系統中。在一個實施方式中，需要步驟(a)和步驟(b)在彼此 相差4個小時之內進行。如本文所證明的，通過施用MANF多肽增強了多巴胺能神經元的保持、存活或生 長。在患有帕金森氏病的患者中中腦的多巴胺能神經元死亡。因此，本發明提供了對於帕 金森氏病的治療方法。此外，本發明包括MANF多肽在治療其中存在或預期有多巴胺能神經 元損失的神經系統的障礙或疾病中的用途。
MANF涉及多巴胺能神經元存活的發現使得MANF用於各種診斷測試和鑑別促進多 巴胺能神經元存活的藥物的分析(assay)中。MANF的表達還可以作為用於確定個人是否具 有神經退行性障礙的風險的診斷工具。這種診斷方法可以導致根據患者的基因型定製藥物 治療(稱為藥物基因組學)，包括預測患者的反應(例如，在施用化合物或藥物時增加療效 或降低不希望的副作用)。本發明的第五方面特徵在於通過與一種或多種另外的治療劑結合施用MANF來增 強多巴胺能神經元的存活的方法。在某些實施方式中，這種治療劑是⑶NF、⑶NF、MANF2或 其組合。在一個實施方式中，向人的大腦黑質區域施用MANF。在進一步的實施方式中，在將 細胞移植到大腦之前、其過程中或之後，向人類大腦黑質區域施用MANF。在另外的實施方式 中，如本文所述與一種或多種額外的治療劑結合施用MANF。黑質是中腦的異質部分，其將大 腦腳(足(foot))與被蓋(tegmentum)(覆蓋物(covering))分開，且是基底神經節系統的 主要部分。它由差異很大的兩個神經集合(緻密部(pars compacta)和鄰近的多巴胺能神 經團)及另一個由網狀部(pars reticulata)和外側部(pars lateralis)構成的集合組 成。後兩者連同蒼白球核(pallidal nuclei)是基底神經節核的部分。黑質緻密部和周圍 組織負責大腦中多巴胺的產生。在再另一方面，本發明特徵在於用於確定候選化合物是否調節MANF介導的促進 多巴胺能神經元存活的活性的方法，包括(a)提供MANF多肽；(b)將MANF多肽與候選化合 物接觸；和(c)測量MANF生物活性，其中，相對於沒有與該化合物接觸的MANF多肽的生物 活性，MANF生物活性的改變表明候選化合物調節MANF生物活性。MANF多肽可以在細胞中 或在無細胞分析系統中。在另一方面，本發明特徵在於確定候選化合物是否可用於減少神經變性的方法， 該方法包括以下步驟(a)提供MANF多肽；(ii)將多肽與候選化合物接觸；和(c)測量 MANF多肽的結合，其中，MANF多肽的結合表明該候選化合物可用於減少神經變性。本發明特徵還在於用於識別加強或模擬MANF生物活性的因子的篩選方法。在這 些增強劑的篩選方法中，使用標準技術測試候選化合物增加MANF表達的能力、穩定性或生 物活性。結合MANF的候選化合物可以作為增效劑發揮作用。模擬物(例如，結合MANF受 體的化合物)是能夠在缺乏MANF多肽的情況下發揮作用的化合物。「基本上純化的」指多肽(例如，MANF多肽)已經與其天然伴隨的組分分離。通常 情況下，當多肽為至少60重量％不含與其天然伴隨的蛋白質和自然存在的有機分子時，該 多肽是基本上純化。優選地，多肽是至少75重量％，更優選至少90重量％，和最優選至少 99重量％純的。例如，可以通過天然來源(例如，神經細胞)提取，通過編碼多肽的重組核 酸的表達，或通過化學合成該蛋白質獲得基本上純化的多肽。可以通過任何適當的方法，例 如，柱色譜、聚丙烯醯胺凝膠電泳或HPLC分析測量純度。當多肽與在其自然狀態伴隨的那些汙染物分離時，該多肽基本上不含天然關聯的 組分。因此，化學合成的或在不同於其天然起源的細胞的細胞系統中產生的多肽基本上不 含其天然關聯的組分。因此，基本上純化的多肽包括那些在真核生物中天然存在但在大腸 桿菌或其他原核生物中合成的多肽。「多肽」或「蛋白質」指任何兩個以上胺基酸的鏈，無論是否翻譯後修飾(如糖基化 或磷酸化)。
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「藥學上可接受的賦形劑」指所治療的哺乳動物生理上可接受的而同時保持與它 一起施用的多肽的治療性能的賦形劑、載體或稀釋劑。一種示例性的藥學上可接受的載體 是生理鹽溶液。其他生理上可接受的載體及其製劑是本領域技術人員已知的，且在例如， Remington :The Science and Practice of Pharmacy,(第 20版)主編A. R. Gennaro A R., 2000，Lippencott Williams & Wilkins 中有描述。化合物具有「促進多巴胺能神經元存活的活性」是，相對於不存在該化合物的情況 下的多巴胺能神經元的存活，該化合物的存在在多巴胺能神經元存活檢測(如本文描述的 這一種)中增加多巴胺能神經元存活至少兩倍。多巴胺能神經元的存活的增加可以是至少 3倍，更優選至少4倍，最優選至少5倍。該檢測可以是體外檢測或體內檢測。如前所示(Commissiong等人，美國申請公布2002/0182198或序列號10/102沈5)， 中腦源的細胞系(稱為「VMCL-1」)分泌隨之促進多巴胺能神經元分化和存活的因子。這種 細胞系在無血清的培養基中健壯地生長。此外，由這些細胞製備的CM包含一種或多種多巴 胺能神經元存活因子，其增加中腦多巴胺能神經元的存活至少3倍，並且也促進其發育。Commissiong等人還說明了由VMCL-I細胞系純化MANF。如下分離蛋白質。製備 3升體積的VMCL-I條件培養基，並進行柱色譜的5個連續步驟。在各個純化步驟，在上文 提到的生物檢測中測試各柱級分(fraction)的生物活性。在5天時間內，以M小時的間 隔完成各個級分對於多巴胺能神經元存活的效應的評估，並評為1-10分。第五純化步驟 之後，通過SDS-PAGE分析生物活性級分和相鄰的非活性級分。SDS-PAGE的分析結果顯示 了活性級分的泳道中20kDa的範圍內明顯的蛋白帶。切取「活性」帶，並使其經受胰蛋白 酶消化，通過質譜分析確定上述背景的各肽的分子量和序列。對下面的兩個肽序列進行識 別DVTFSPATIE和QIDLSTVDL。資料庫的檢索確認了人的富含精氨酸的蛋白質與其小鼠種 間同源體(orthologue)的匹配。小鼠EST序列編碼的預測蛋白質與預測的人類蛋白質大 約95%相同。大鼠EST資料庫的檢索發現兩個序列，一個(dbEST Id =4408547 ；EST名稱 EST348489)在胺基酸水平具有與人類和小鼠蛋白質顯著的同源性。該全長大鼠序列不在 GenBank資料庫中。此外，Commissiong等人發現，人類ARP經切割以使得富含精氨酸的氨基末端與羧 基末端分離，從而產生人原MANF。切割的羧基末端片段包含信號肽，導致人類MANF從細胞 分泌。蛋白質治療在本發明的一個方面中，向受試者施用MANF或其生物功能片段以預防性地治療 受試者或治療患有神經病的受試者。例如，在某些實施方式中，治療受試者以提高多巴胺能 神經元的保持和/或促進其生長。本文在下文中公開了設想用於本發明方法中的各種劑量 製劑。在各種不同的實施方式中，本發明中的治療途徑包括將重組MANF多肽直接施用 到潛在的或實際的細胞損失的位點(例如，通過注射)或全身性施用(例如，通過任何常規 重組蛋白質施用技術)。在一個實施方式中，施用是向大腦黑質區域和/或腹側中腦區域。本發明的另外的實施方式涉及結合藥學上可接受的載體施用藥物組合物以獲得 上面討論的任何治療效果。這種藥物組合可以由MANF多肽、MANF多肽的抗體和/或MANF多肽的模擬物和激動劑組成。在本發明的各種實施方式中，向受試者施用分泌和/或未分泌形式的MANF以提高 多巴胺神經元的生長或存活。分泌形式和未分泌形式的MANF(統稱為MANF多肽)具有神 經營養活性，並可用作治療神經退行性疾病(如帕金森氏病)和用於在向人類移植期間或 之後提高多巴胺能神經元的存活的神經營養因子。MANF多肽也可以用來提高用於移植的神 經元的體外產生。在另一種用途中，MANF多肽可用於鑑別調節或模擬MANF的促進多巴胺 能神經元存活的活性的化合物。MANF多肽也可以用來鑑別MANF受體。如下更詳細描述這 些用途中的每一種。發現MANF作為促進多巴胺能神經元存活的神經營養因子使得其能夠用於神經退 行性疾病(如帕金森氏病)的藥物治療。在一個實施方式中，提供了通過增加黑質的GABA能末端的GABA釋放治療帕金森 氏病的方法，該方法包括向患有帕金森氏病的受試者施用有效量的MANF。在進一步的實施 方式中，施用包括共施用本文所述的一種或多種另外的治療劑。在更進一步的實施方式中， 提供了通過拮抗穀氨酸對於DA神經元的興奮性毒性作用治療帕金森氏病的方法，包括向 患有帕金森氏病的受試者施用有效量的MANF，或者MANF和本文公開的一種或多種另外的 治療藥物。在另一實施方式中，在細胞移植的位點向受試者施用MANF多肽。可以在細胞移 植之前、其過程中或之後施用MANF多肽。優選地，這兩個步驟是在彼此間隔的大約4小時 之內進行。如果合適的話，可以在細胞移植之前和/或之後，以各種不同時間間隔向受試 者重複施用MANF多肽。這種保護性的MANF多肽施用可以在細胞移植後幾個月甚至幾年 進行。用於本發明的各個方面的移植方法和組合物包括美國專利申請公布20080058221、 20080050728,20080014246,2007027593 中所公開的那些。例如，向帕金森氏病的動物模型(腦損傷誘導的嚙齒類動物)施用MANF導致顯著 的治療效果。腦的多巴胺能神經元被神經毒素6-羥基多巴胺(6-0HDA)損害，所述神經毒素 接近黑質中的多巴胺能神經元注射，並通過多巴胺轉運蛋白(DAT)選擇性地攝取進入多巴 胺能神經元。6-0HDA選擇性地破壞大腦注射側的多巴胺能神經元。DA的釋放產生的不平 衡導致動物向大腦的完整側旋轉(Mendez和Firm，1975)。表1顯示載體(VEH)和用⑶NF 或MANF治療之間的旋轉(turn)圈數的區別表1
120分鐘內的圈數 20 士 45 950士150 50 士 75 150 士 55結果表明，施用MANF減少了監測的120分鐘內的累計旋轉。旋轉越多，紋狀體中 腦誘導損傷的效應越嚴重。除了向人或其他哺乳動物的施用，MANF多肽也可以用於在神經元移植前的任何時 間的生產過程中提高它們的存活的培養中。在一個例子中，將待移植的細胞懸浮於也包括 促進存活量的MANF多肽的藥物載體中。也可以在該過程的較早時候(例如，因為神經元是組VEH+VEHVEH+6-0HDAGDNF+6-0HDAMANF+6-0HDA首先分化的)向培養物施用MANF多肽。可以理解，神經元不必是原代多巴胺能神經元。可 以在神經元的產生和保持過程中，在MANF多肽的存在下培養在體外或體內由幹細胞分化 的神經元(例如，多巴胺能神經元)或能夠產生神經元的其他細胞。為了向細胞加入MANF多肽以防止神經細胞死亡，優選從可以表達該蛋白質的培 養細胞系統獲得足夠量的重組MANF多肽。優選的MANF多肽是人MANF，但也可以使用來自 其他動物(如豬、大鼠、小鼠、狗、狒狒、母牛等)的MANF多肽。然後可以使用適當的包裝或 施用系統實現該蛋白質向受影響的組織的遞送。或者，可以使用和施用小分子類似物以作 為MANF激動劑發揮作用並以這種方式產生所需的生理效應。基因治療從廣義上講，基因治療尋求將新的遺傳物質向患者的細胞轉移，由此對患者產生 治療益處。這些益處包括對大範圍的各種疾病、障礙或其他狀況的治療或預防。本發明提供了一種通過施用包含轉基因的重組嗜神經病毒載體向受試者的CNS 遞送轉基因的方法，其中，輸送在遠離施用位點的位點處有利於轉基因表達的條件下進行。 輸送也可以導致施用位點的轉基因表達。例如，美國專利申請號20090069261公開了本領 域已知的基因治療方法，本文通過引用完整引入。除非特別表明相反，轉基因的表達不限於多肽或蛋白質的翻譯，且還包括轉基因 多核苷酸的複製和/或轉錄。在另一方面中，本發明提供了向患諸如帕金森氏病的障礙的哺乳動物中CNS的靶 細胞(其為神經元或神經膠質細胞)輸送治療性轉基因產物的方法。體外基因治療方法包括分離細胞的修飾，其然後經注入、嫁接或以其他方式移植 到患者中。參見，例如，美國專利4，868，116,5, 399，346和5，460，959。體內基因治療尋求 在體內直接靶向於患者宿主組織。可用作基因轉移載體的病毒包括乳多空病毒、腺病毒、牛痘病毒、腺相關病毒、皰 疹病毒和逆轉錄病毒。適當的逆轉錄病毒包括HIV、SIV、FIV、EIAV, MoMLV。優選的用於治療中樞神經系統的障礙的病毒是慢病毒和腺相關病毒。這兩種類型 的病毒都能夠無需細胞分裂整合進入基因組，並且這兩種類型已經在對於神經系統、特別 是中樞神經系統的適應症的臨床前動物研究中測試。AAV的製備方法在本領域中已有描述，例如，美國專利5，677，158、美國專利 6，309，634和美國專利6，451，306描述向中樞神經系統遞送MV的例子。在本發明的方法中，可以使用任何血清型的AAV。在某些實施方式中，可以使用 任何血清型的AAV，只要載體能夠在因疾病受損的大腦中發生逆行軸突運輸(retrograde axonal transport)或在非損傷大腦中發生軸突運輸。用於本發明的某些實施方式中的 病毒載體的血清型選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、MV5、AAV6、AAV7和AAV8 (參見，例如，Gao 等人 O002)PNAS，99 :11854-11859 ；和 Viral Vectors for Gene Therapy =Methods and Protocols, ed. Machida, Humana Press, 2003) 可以使用在本文所列出的這些以外的其他 血清型。此外，準型AAV載體也可以用於本文所述的方法中。準型AAV載體是那些在第二 AAV血清型的衣殼中含有一個AAV血清型的基因組的AAV載體；例如，包含AAV2衣殼和AAVl 基因組的AAV載體，或包含AAV5衣殼和AAV2基因組的AAV載體(Auricchio等人，Q001) Hum. Mol. Genet.，10(26) :3075-81)。
AAV載體源自對於哺乳動物非致病的單鏈(ss)DNA細小病毒(在Muzyscka(1992) Curr. Top. Microb. Immunol.，158 :97-129中綜述)。簡言之，基於AAV的載體除去佔基因 組的96%的rep和cap病毒基因，從而留下兩個側翼145鹼基對(bp)的反向末端重複序 列(ITR)，其用於啟動病毒DNA複製、包裝和整合。在缺乏輔助病毒的情況下，野生型AAV以 優先的位點特異性在染色體19ql3. 3整合到人類宿主細胞基因組中，或它可以保持游離地 (episomally)表達。單一的AAV顆粒可以容納最高51Λ的ssDNA，因此為轉基因和調控元 件留下大約4. 51Λ，這通常是足夠的。但是，例如，美國專利6，544, 785描述的反式剪接系統 (trans-splicing system)可能接近此限制的兩倍。特殊和優選的逆轉錄病毒類型包括可以轉導細胞並且無需細胞分裂整合進入其 基因組中的慢病毒。因此，優選地，載體是複製缺陷型慢病毒顆粒。這樣的慢病毒顆粒可 以由包含5'慢病毒LTR、tRNA結合位點、包裝信號、可操作地與編碼所述融合蛋白的多核 苷酸信號連接的啟動子、第二鏈DNA合成的起源和3'慢病毒LTR的慢病毒載體產生。US 20020037281 (使用慢病毒載體轉導神經細胞的方法)和US20020037281 (對於神經退行性 疾病的慢病毒介導的生長因子基因療法)描述了用於製備和體內施用慢病毒至神經細胞 的方法。可以使用不需要向本領域普通技術人員進行詳細解釋的常規技術完成用於本發 明的MANF的重組表達的載體構建。然而，為了回顧，普通技術人員可能希望參考Maniatis 等人，in Molecular Cloning :ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (NY 1982)。可以產生用於本發明的嵌合表達構建體，例如，通過PCR擴增所需的片段(信號序 列和MANF編碼序列)並在重疊PCR中將它們融合。因為幾種優選的信號序列相對較短，用 於擴增MANF編碼序列的5' PCR引物可能包括編碼信號序列的序列以及TATA盒和其他調 控元件。簡單地說，重組表達載體的構建採用標準連接(ligation)技術。對於確認構建的 載體中的準確序列的分析，基因使用例如，Messing等人的方法(Nucleic Acids Res.，9 309-, 1981)，Maxam 等人的方法(Methods in Enzymology, 65 :499,1980)，或本領域的技術 人員已知的其他合適的方法測序。基因的表達在轉錄、翻譯或翻譯後水平進行控制。轉錄啟始是基因表達中的早期 和重要事件。這取決於啟動子和增強子序列，且受與這些序列相互作用的特定細胞因子的 影響。許多基因的轉錄單位由啟動子和在某些情況下由增強子或調控元件組成(Banerji 等人，Cell 27 :299(1981) ；Corden 等人，Science 209 :1406(1980)；及 Breathnach 和 Chambon, Ann. Rev. Biochem. 50 :349(1981))。對於逆轉錄病毒，參與逆轉錄病毒基因 組複製的控制元件位於長末端重複序列(LTR)中(Weiss等人，編著，The molecular biology of tumor viruses :RNA tumor viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, (NY 1982))。鼠莫洛尼氏白血病毒(MLV)和勞氏肉瘤病毒(RSV)LTR含有啟動子和增強 子序列(Jolly 等人，Nucleic Acids Res. 11 :1855(1983) ；Capecchi 等人，Enhancer and eukaryotic gene expression, Gulzman and Shenk，編著，第 101—102 頁，Cold Spring Harbor Laboratories (NY 1991))。顯示長期活性並且為組織特異性甚至細胞特異性的 啟動子用於某些具體實施方式
。啟動子的非限制性的例子包括但不限於，巨細胞病毒
9(CMV)啟動子(Kaplitt 等人(1994) Nat. Genet. 8 :148-154)、CMV/ 人 β 3-球蛋白啟動 子(Mandel 等人(1998) J. Neurosci. 18 :4271-4284)、GFAP 啟動子(Xu 等人 Q001)Gene Ther. 8 =1323-1332) U. 8kb的神經元特異性烯醇酶(NSE)啟動子(Klein等人(1998)Exp. Neurol. 150 :183-194)、雞 β 肌動蛋白(CBA)啟動子(Miyazaki (1989)Gene 79 :269-277)、 β-葡萄糖醛酸酶(GUSB)啟動子(Shipley 等人(1991) Genetics 10 :1009-1018)和泛素 啟動子(如美國專利6，667，174中描述的那些由人泛素A、人泛素B和人泛素C分離的那 些)。為了延長表達，其他調控元件可能另外可操作地與轉基因連接，例如，土撥鼠肝炎病毒 後調控元件(WPRE) (Donello 等人(1998) J. Virol. 72 =5085-5092)或牛生長激素(BGH)多 腺苷酸化位點。也描述了許多非病毒啟動子的啟動子和增強子區域(khmidt等人，Nature 314 285(1985) ；Rossi 和 decrombrugghe, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5590-5594(1987))。 保持和提高靜止細胞中轉基因的表達的方法包括使用啟動子，包括膠原蛋白I型(1和 2) (Prockop 和 Kivirikko, N. Eng. J. Med. 311 :376(1984) ；Smith 和 Niles, Biochem. 19 1820(1980) ；de Wet 等人，J. Biol. Chem.，258 14385 (1983))、SV40 和 LTR 啟動子。根據本發明的一個實施方式，啟動子是選自泛素啟動子、CMV啟動子、JeT啟動子 (美國專利6，555，674)、SV40啟動子和延伸因子Ia啟動子(EFl-α)的組成型啟動子。誘 導型/阻抑啟動子的例子包括Tet-0n、Tet-Off、雷帕黴素誘導啟動子、Mxl。除了使用病毒和非病毒啟動子來驅動轉基因表達外，增強子序列可以用來提高 轉基因表達的水平。增強子不僅可以提高其原始基因的轉錄活性，也可以提高某些外源 基因的轉錄活性(Armelor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70:2702(1973))。例如，在本發明 中，膠原蛋白增強子序列可以與膠原蛋白啟動子2(1) —起使用以提高轉基因表達。此外， SV40病毒中發現的增強子元件可用於提高轉基因表達。這種增強子序列由Gruss等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:943(1981) ；Benoist 和 Chambon，Nature 290 :304 (1981)，及 Fromm和Berg，J. Mol. App 1. Genetics, 1 :457 (1982)所描述的72個鹼基對重複序列構成， 本文通過引用引入所有這些文獻。當這種重複序列與各種啟動子串聯存在時，它可以增加 許多不同的病毒和細胞基因的轉錄(Moreau等人，Nucleic Acids Res. 9 :6047 (1981))。進一步的表達增強序列包括但不限於土撥鼠肝炎病毒後轉錄調控元件、WPRE、 SP163、大鼠胰島素(Insulinil)內含子或其他內含子、CMV增強子和雞[β]_球蛋白絕緣 子(insulator)或其他絕緣子。為了長期穩定的表達，也可以使用細胞因子調節啟動子活性而增加轉基因表 達。已報告幾種細胞因子調節膠原蛋白2(1)和LTR啟動子的轉基因表達(Chua等人， connective Tissue Res.，25 161—170 (1990) ；Elias 等人，Annals N. Y. Acad. Sci. ,580 233-244(1990)) ；Seliger 等人，J. Immunol. 141 :2138-2144(1988)及 Seliger 等人， J. Virology 62:619-621(1988))。例如，轉化生長因子(TGF)、白細胞介素(IL)-I和幹擾 素(INF)下調各種啟動子(如LTR)驅動的轉基因的表達。腫瘤壞死因子(TNF)和TGF 1 上調，並可能用於控制，由啟動子驅動的轉基因的表達。可能證明有用的其他細胞因子包括 鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)和表皮生長因子(EGF)。具有膠原蛋白增強子序列的膠原蛋白啟動子(Coll(E))也可用於通過進一步抑 制對於可能在治療的大腦中產生的載體的任何免疫反應(無論其免疫保護狀態)來提高轉基因表達。此外，可以在載體組合物遞送後立即向治療的宿主施用抗炎藥物包括類固醇類 (如地塞米松)，並優選繼續施用直至任何細胞因子介導的炎性反應消退。也可以施用免疫 抑制劑(如環孢菌素)以降低下調LTR啟動子和Coll (E)啟動子-增強子並降低轉基因表 達的幹擾素的產生。載體可以包括進一步的序列(例如，編碼Cre重組酶蛋白質的序列)和LoxP序列。 確保neublastin的臨時表達的進一步方式是通過使用Cre-LoxP系統，其在向細胞施用Cre 重組酶(Daewoong等人，Nature Biotechnology 19 =929-933)時或通過將編碼重組酶的基 因整合進入病毒構建體中(Pluck，Int J Exp Path, 77 =269-278)導致插入的DNA序列部分 的切除。與LoxP位點和結構基因(在本案中為neublastin) —起在病毒構建體中併入重 組酶基因經常導致結構基因的表達持續大約5天的時間。在說明性的實施方式中，AAV是AAV2或AAV1。許多血清型(特別是AAV2)的腺相 關的病毒已被廣泛研究，並鑑定為基因治療載體。本領域的技術人員熟悉功能性的基於AAV 的基因治療載體的製備。可以在公開文獻的廣泛部分中發現用於向人類受試者施用的AAV 生產、純化和製備的各種方法的眾多說明(參見，例如，Viral Vectors for Gene Therapy Methods and Protocols，編著 Machida，Humana Press，2003)。另外，美國專利 6，180，613 和6，503，888描述了靶向於CNS細胞的基於AAV的基因療法。另外的示例性的AAV載體是 編碼人類蛋白質的重組AAV2/l、AAV2/2、AAV2/5、AAV2/7和AAV2/8血清型載體。對於一些CNS基因治療的應用，可能需要控制轉錄活性。為此，可以通過包括例如 如在 Haberma 等人(1998) Gene Ther. 5 :1604-16011 ；和 Ye 等人(1995)kience 283 :88-91 中描述的各種調控元件和藥物響應啟動子而獲得用病毒載體的基因表達的藥理調節。在本發明的方法中，可以通過將神經元的終端軸突端與包含攜帶轉基因的病毒 載體的組合物接觸來施用病毒載體，從而使病毒顆粒被細胞吞噬並在細胞內沿軸突向轉 運(逆行地)到神經元的細胞體；允許治療性的轉基因產物進行表達，其中治療性的轉基 因產物因而緩解受試者的病狀。在某些實施方式中，組合物中的載體濃度至少為(a)5、6、 7、8、8·4、9、9· 3、10、15、20、25 或 50(1012gp/ml) ； (b)5、6、7、8、8. 4、9、9. 3、10、15、20、25 或 50(X109tu/ml)；或(c)5、6、7、8、8. 4、9、9· 3、10、15、20、25 或 50 (X1010iu/ml)。在本發明的另外的方法中，可以通過將神經元的細胞體與包含攜帶轉基因的病毒 載體的組合物接觸來施用病毒載體，從而使病毒顆粒被細胞吞噬，允許治療性的轉基因產 物表達並在細胞內順行地沿軸突向神經元的軸突末端轉運，其中治療性的轉基因產物因而 緩解受試者的病狀。在某些實施方式中，組合物中的載體濃度至少為(a)5、6、7、8、8.4、9、 9.3、10、15、20、25 或 50(1012gp/ml) ； (b)5、6、7、8、8. 4、9、9. 3、10、15、20、25 或 50(X109tu/ ml)；或(c)5、6、7、8、8. 4、9、9. 3、10、15、20、25 或 50(10lcliu/ml)。對人大腦中的結構的確認，參見，例如，The Human Brain Surface， Three-Dimensional Sectional Anatomy With MRI, and Blood Supply,第 2 版，Deuteron
Springer Vela, 1999 ；Atlas of the Human Brain, MaiAcademic
Press ； 1997 ；禾口 Co_Planar Sterotaxic Atlas of the Human Brain :3-Dimensional Proportional System :An Approach to Cerebral Imaging, Tamarack 等人主編，Thyme Medical Pub.，1988。對於小鼠大腦中的結構的確認，參見，例如，The Mouse Brain in MerotaxicCoordinates，第2版，Academic Press，2000。圖1示意地顯示脊髓和它的四個亞部頸椎、胸椎、腰椎和骶椎。另外的重要參數是輸送進入靶組織的MANF的劑量。在這方面，「單位劑量」 一般 指MANF組合物的Neurturin/毫升的濃度。對於病毒載體，MANF濃度可以由病毒顆粒數/ 毫升神經營養組合物定義。理想情況下，為了使用病毒表達載體遞送MANF，各單位劑量的 MANF包含2. 5至25 μ L的MANF組合物，其中，該組合物包括在藥學上可接受的流體中的病 毒表達載體，並提供每毫升MANF組合物101°直至IO15的MANF表達病毒顆粒。這種高效價 尤其可用於腺相關病毒。對於慢病毒，效價一般較低，例如，如在實施例中所述確定的每毫 升IO8至101°轉導單位(TU/毫升)。在優選的實施方式中，施用位點是大腦的紋狀體，特別是尾狀核(caudate)和/或 殼核(putamen)。進入殼核的注射可以標記位於大腦的各種距離區域的目標位點，例如，蒼 白球、杏仁核、底丘腦核或黑質。蒼白球中細胞的轉導通常導致丘腦中細胞的逆行標記。在 優選的實施方式中，目標位點或(其中一個)是黑質。注射也可以進入紋狀體和黑質。在給定的目標位點，載體系統可以轉導目標細胞。目標細胞可能是在神經組織中 發現的細胞，如神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞、小膠質細胞或室管膜細胞。在優選的 實施方式中，目標細胞是神經元，尤其是TH陽性神經元。優選地通過直接注射施用載體系統。注射到大腦(尤其是紋狀體)的方法是 本領域公知的(Bilang-Bleuel 等人(1997) Proc. Acad. Natl. Sci. USA 94 :8818-8823 ； Choi-Lundberg等人(1998) Exp. Neurol. 154 :261-275 ；Choi-Lundberg等人(1997)kience 275 :838-841 ；及 Mandel 等人(1997)) Proc. Acad. Natl. Sci. USA 94:14083-14088)。可以
給予立體定位注射。如上所述，對於組織(如大腦)中的傳導，有必要使用非常小的體積，所以通過超 離心濃縮病毒製劑。產生的製劑應該具有至少108t. u. /ml，優選IO8至101Qt. u. /ml，更優選 至少109t.u./ml。(如實施例2所述，效價表示為每毫升的轉導單位(t. u./ml))。已發現， 可以通過增加注射位點的數量並降低注射速度獲得改善的轉基因表達的分散(Horellou 和Mallet (1997)，如上)。通常使用1至10個注射位點，更通常為2至6個。對於包含 l-5X109t. u. /ml的劑量，注射速度通常為0. 1至10 μ 1/分鐘，通常為大約1 μ 1/分鐘。通過微注射、輸注、劃痕標記(scrape loading)、電穿孔或其他適於通過手術切口 直接將組合物輸送直接進入輸送位點組織的方法，向目標組織中的各個輸送細胞位點輸送 MANF組合物。緩慢完成輸送，如經過大約5-10分鐘的時間(取決於待輸送的MANF組合物 的總體積)。修飾在本發明的另一方面中，在向受試者施用之前修飾MANF。本發明的修飾蛋白質可能具有胺基酸的缺失和/或替換；因此，具有缺失的蛋白 質、具有替換的蛋白質和具有缺失和替換的蛋白質是修飾的蛋白質。在某些實施方式中， 這些修飾的蛋白質可能進一步包括插入或添加的胺基酸，如具有融合蛋白或具有連接物 (linker)的蛋白質。替換或取代變體通常包含在蛋白質內的一個或多個位點一種胺基酸替換或取代 另一種胺基酸，並可經設計以調節多肽的一種或多種性能，特別是降低其免疫原性/抗原 性，減少在受試者中的任何副作用，或增加其療效。這種替換優選是保守的，也就是說，一種胺基酸被一種類似形狀和電荷的胺基酸取代。保守的替換是本領域公知的，且包括，例如， 以下變化丙氨酸變為絲氨酸，精氨酸變為賴氨酸，天冬醯胺(asparagine)替換為穀氨醯 胺(glutamine)或組氨酸，天冬氨酸(aspartate)替換為穀氨酸(glutamate)，半胱氨酸替 換為絲氨酸，穀氨醯胺替換為天冬醯胺，穀氨酸替換為天冬氨酸，甘氨酸替換為脯氨酸，組 氨酸替換為天冬醯胺或穀氨醯胺，異亮氨酸替換為亮氨酸或纈氨酸，亮氨酸替換為纈氨酸 或異亮氨酸，賴氨酸替換為精氨酸，蛋氨酸替換為亮氨酸或異亮氨酸，苯丙氨酸替換為酪氨 酸、亮氨酸或蛋氨酸，絲氨酸替換為蘇氨酸，蘇氨酸替換為絲氨酸，色氨酸替換為酪氨酸，酪 氨酸替換為色氨酸或苯丙氨酸，和纈氨酸替換為異亮氨酸或亮氨酸。多肽的抗原區域可能 被取代為較低抗原性的區域；較低抗原性的區域可能含有與天然蛋白質中相應的殘基相同 的殘基，但也包含一些保守替換和/或非保守替換。除了缺失或替換，修飾的蛋白質可能具有殘基插入，其通常包括在多肽中添加至 少一個殘基。這可能包括靶向肽或多肽或只是單一殘基的插入。如下討論稱為融合蛋白的 末端添加。術語「生物學功能相當的」在本領域很容易理解，並在本文進一步詳細定義。因此， 倘若蛋白質的生物活性得到保持，可以包括具有大約70%至大約80%、或大約81%至大約 90%，或甚至大約91%至大約99%的與天然多肽的胺基酸相同或功能相當的胺基酸的序 列。修飾的蛋白質可能與其天然對應物是生物學功能相當的。在各種實施方式中，以治療 有效量施用MANF的生物學功能等價物。也可以理解，胺基酸和核酸序列可能包括額外的殘基，如另外的N-或C-末端氨基 酸或5'或3'序列，但仍然基本上是本文公開的一個序列所示的，只要該序列符合上文提 出的標準，包括保持與蛋白表達有關的生物學蛋白活性。末端序列的添加特別適用於可能 例如包括位於編碼區的5'或3'部分側翼的各種非編碼序列或可能包括已知出現於基因 中的各種內部序列(即內含子)的核酸序列。以下是基於蛋白質胺基酸的改變以產生等價物、或甚至是改進的第二代分子的討 論。例如，特定胺基酸可以替換蛋白質結構中的其他胺基酸，而沒有與結構(如底物分子的 結合位點)的相互作用的結合能力方面明顯的損失。由於是蛋白質的相互作用能力和性 質限定蛋白質的生物學功能活性，可以在蛋白質序列和其基礎的DNA編碼序列中進行某些 胺基酸替換，但仍然產生具有相似性質的蛋白質。因此，發明人設想可以如下討論的在基因 的DNA序列中進行各種變化而生物學效用或活性方面沒有明顯的損失。表1顯示編碼特定 胺基酸的密碼子。如果滿足下面的「同源性標準」之一，則蛋白質性分子(proteinaceous molecule)與第二蛋白質分子具有「同源性」，或被認為與第二蛋白質分子「同源」 1)蛋白 質性分子的至少30%與第二蛋白質性分子在相同位置具有序列一致性；幻在與第二蛋白 質性分子的相同位置和相對於第二蛋白質性分子在不相同的殘基處(如本文所述的，其中 至少30%是保守性差異)存在某些序列一致性；或幻蛋白質性分子的至少30%與第二蛋 白質性分子具有序列一致性，但在相同的殘基之間具有可能的非相同殘基的間隙。本文中 所使用的，術語「同源的」可能同樣適用於蛋白質性分子的區域而不是整個分子。如果術語 「同源性」或「同源的」由數值來限定，例如「50%同源性」或「50%同源的」，那麼對於1)、 2)和幻的同源性標準，由「至少30%」調整為「至少50%」。因此，可以設想在兩種蛋白質 性分子或蛋白質性分子的部分之間可能存在至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或更高的同源性。在作出這樣的改變時，可以考慮親水指數(hydropathic index)。本領域中 通常理解親水胺基酸指數在賦予蛋白質相互作用的生物學功能方面的重要性(Kyte & Doolittle, 1982) 0現在公認，胺基酸的相對親水性質對所獲得的蛋白質的二級結構有影 響，蛋白質的二級結構隨之限定蛋白質與其他分子(例如，酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原 等)的相互作用。本領域中也可以理解，可以有效地基於親水性進行相似胺基酸的替換。本文通 過引用引入的美國專利4，554，101表明，受其相鄰胺基酸的親水性控制的蛋白質的最大 局部平均親水性與蛋白質的生物學性質相關。如美國專利4，554，101中詳細描述的，將 以下親水值分配給胺基酸殘基精氨酸(+3. 0)，賴氨酸(+3. 0)，天冬氨酸(+3.0士0. 1)，谷 氨酸(+3. O士0. 1)，絲氨酸(+0. 3)，天冬醯胺(+0. 2)，穀氨醯胺(+0. 2)，甘氨酸(0)，蘇氨 酸("0. 4)，脯氨酸(_0.5士0. 1)，丙氨酸(-0. 5)，組氨酸(-0. 5)，半胱氨酸(-1. 0)，蛋氨酸 (-1. 3)，纈氨酸(-1. 5)，亮氨酸(-1. 8)，異亮氨酸(-1. 8)，酪氨酸(-2. 3)，苯丙氨酸(-2. 5)， 色氨酸("3. 4)。可以理解，胺基酸可以替換為具有類似親水性值的另一種胺基酸，且仍然產生生 物學等效和免疫等效的蛋白質。在這樣的變化中，優選親水性值在士0.2以內的胺基酸的 替換，特別優選那些在士0. 1以內的胺基酸的替換，甚至更特別優選在士0. 5以內的胺基酸 的替換。如上所述，胺基酸替換一般是基於胺基酸側鏈取代基的相對相似性，例如，它們的 疏水性、親水性、電荷、大小等。考慮各種上述特徵的示例性的替換是本領域的技術人員公 知的，且包括精氨酸與賴氨酸，穀氨酸與天冬氨酸、絲氨酸和蘇氨酸，穀氨醯胺與天冬醯 胺，及纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸。製備本發明的修飾多肽的另一個實施方式是使用肽模擬物。模擬物是模擬蛋白質 二級結構元件的含肽分子。參見，例如，Johnson(199 。使用肽模擬物的根本理由是蛋白 質的肽骨架主要定向胺基酸側鏈以促進分子間的相互作用(如抗體和抗原的相互作用)。 預計肽模擬物允許類似於天然分子的分子相互作用。可以結合上述概述原理使用這些原 理，以工程設計具有天然蛋白質的許多自然屬性但在某些情況下具有改變的甚至提高的特 徵的第二代修飾蛋白質分子。a.融合蛋白一種特別種類的插入變體是包含MANF或其生物學功能變體的融合蛋白。這種分 子一般具有在N-或C-末端與第二多肽的全部或部分連接的天然分子的全部或基本部分。 例如，融合通常採用來自其他物種的前導序列，以允許異源宿主中的蛋白質的重組表達。另 一種有用的融合包括添加免疫活性的功能域(如抗體表位或其他標記)，以促進融合蛋白 的靶定或純化。6xHis和GST (穀胱甘肽S轉移酶)作為標記的用途是公知的。在融合接合 點(fusion junction)或其附近包含切割位點有助於在純化後除去外來的多肽。其他有用 的融合包括功能域(例如來自酶如水解酶、糖基化功能域、細胞靶向信號或跨膜區域的活 性位點)的連接。b.結合的(conjugated)蛋白質在本發明的一個方面中，將MANF或其生物功能片段結合。例如，在各種實施方式
14中，本發明還提供了結合的多肽，例如連接至少一種物質以形成偶聯物的翻譯的蛋白質、多 肽和肽。特別有用的是抗體偶聯物，其中，抗體部分將所述物質靶向於特定的位點。為了提 高抗體分子作為診斷或治療劑的效力，通常連接或共價結合或複合至少一個所需的分子或 部分。這樣的分子或部分可能是但不限於至少一種效應物或報告分子。效應物分子包括具 有需要的活性(如細胞生長活性或細胞毒性活性)的分子。已連接到抗體上的效應物分子 的非限制的例子包括生長劑、毒素、抗腫瘤劑、治療性的酶、放射標記的核苷酸、抗病毒劑、 螯合劑、細胞因子、生長因子和寡核苷酸或多核苷酸。相比之下，報告分子被定義為可以使 用分析方法檢測到的任何部分。已偶聯到抗體上的報告分子的非限制性的例子包括酶、放 射性標記(radiolabel)、半抗原、螢光標記、磷光分子、化學發光分子、發色團、螢光分子、光 親和分子、有色微粒或配體(如生物素)。抗體偶聯物的某些例子是其中抗體與可檢測的標記連接的那些偶聯物。「可檢測 的標記」是由於其特定的功能性質和/或化學特徵可檢測的化合物和/或成分，它們的使用 使得其連接的抗體可被檢測和/或如果需要的話進一步定量。另一個這樣的例子是形成包 含與細胞毒性或抗細胞劑連接的抗體，並可以被稱為「免疫毒素」。i.連接劑/偶合劑在本發明的另一方面中，MANF或一種或多種其生物功能性片段在如上所述的融合 中或通過如下的連接劑或耦合劑結合。可用於結合MANF的連接劑類型的例子包括但不限 於腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽連接劑。可以選擇例如，容易被低PH值切割或容易被蛋白 酶如組織蛋白酶(如組織蛋白酶B、C和D)切割的連接劑。例如，多個肽或多肽可通過生物 可釋放的鍵(如可選擇性切割的連接劑或胺基酸序列)結合。例如，設想包括優先位於或在 腫瘤環境中具有活性的酶的切割位點的肽連接劑。這種肽連接劑的示例性的形式是指那些 被尿激酶、血纖維蛋白溶酶、凝血酶，因子IXa、因子fci或金屬蛋白酶(metallaproteinase) (如膠原酶、明膠酶或基質降解素(stromelysin)切割的肽連接劑。可選擇地，肽或多肽可 以與輔劑結合。胺基酸(如可選擇性切割的連接劑、合成連接劑或其他胺基酸序列)可用 於分離蛋白質性部分。4.蛋白質純化雖然本發明的某些實施方式包括重組蛋白，但本發明也涉及用於純化蛋白質(包 括內源性多肽和肽及重組多肽和肽)的方法和過程。一般來說，這些技術在一個層面上包 括多肽和非多肽成分的細胞環境的粗分級分離。在已經將該多肽與其他蛋白質分離後，可 以使用色譜和電泳技術進一步純化目標多肽以實現部分或完全純化(或均質性的純化)。 尤其適合於純肽製備的分析方法為離子交換色譜法、排阻色譜法、聚丙烯醯胺凝膠電泳、等 電聚焦。純化肽的特別有效的方法是快速蛋白液相色譜或甚至高效液相色譜法。此外，實 施這種技術的條件可能影響純化分子的特性如功能活性。本發明的某些方面涉及編碼的蛋白質或肽的純化，且在特別的實施方式中，涉及 編碼的蛋白質或肽的實質純化。本文所用的術語「純化的蛋白質或肽」意圖指可與其他組 分分離的組合物，其中，相對於其天然獲得的狀態的蛋白質或肽被以任何水平純化。因此， 純化的蛋白質或肽也指脫離其可能自然存在的環境的蛋白質或肽。「基本上純化的」蛋白質 或肽—般來說，「純化的」指已經經過分級分離以除去各種其他組分的蛋白質或肽的組
15合物，且該組合物基本上保留其表達的生物活性。使用術語「基本上純化的」的情況下，此 名稱指其中該蛋白質或肽形成組合物的主要組分的組合物，如構成組合物中的蛋白質的大 約50%、大約60%、大約70%、大約80%、大約90%、大約95%、大約96%、大約97%、大約 98 %、大約99 %、大約99. 2 %、大約99. 4 %、大約99. 6 %、大約99. 8 %、大約99. 9 %或更多。根據本公開，本領域的技術人員了解各種定量蛋白質或肽的純化程度的方法。這 些包括，例如，通過SDS/PAGE分析確定活性級分的特定活性或評估級分中的多肽的量。評 估級分純度的優選方法是計算該級分的特定活性，從而將它與初始提取物的活性進行比 較，並由此計算純度水平，本文由「_倍純化數」評估。當然，用於表示活性的量的實際單位 取決於選擇在純化後進行的特定分析方法以及表達的蛋白質或肽是否顯示可檢測的活性。適用於蛋白質純化的各種技術是本領域的技術人員公知的。這些包括，例如，用硫 酸銨、PEG、抗體等沉澱或通過熱變性接著離心，色譜步驟如離子交換、凝膠過濾、反相、羥基 磷灰石和親合色譜法的，等電聚焦，凝膠電泳及這些和其他技術的組合。如本領域中一般所 知的，據信可以改變進行各種純化步驟的順序，或者可以省略某些步驟，且仍然導致製備基 本上純化的蛋白質或肽的合適方法。一般不要求蛋白質或肽總是以其最純化的狀態提供。事實上，預期低於基本純化 的產物在某些實施方式中具有效用。可以通過結合使用較少的純化步驟或通過利用相同的 通用純化方案的不同形式完成部分純化。例如，可以理解，利用高效液相儀進行的陽離子交 換柱色譜通常會導致比利用低壓色譜系統的同樣技術更大「倍」的純化。顯示出較低的相對 純化程度的方法可能在蛋白質產物的總體回收或在保持表達蛋白質的活性方面具有優勢。已知多肽的遷移可以隨SDS/PAGE的不同條件變化，有時是顯著地變化(Capaldi 等人，1977)。因此，可以理解，在不同的電泳條件下，純化或部分純化的表達產物的表觀分 子量可能發生變化。本發明還考慮肽標籤結合本發明的方法和組合物使用。標籤利用了兩個多肽之間 的相互作用。參與相互作用的多肽之一的一部分可以用作標籤。例如，穀胱甘肽S轉移酶 (GST)的結合區域可以用作標籤，以使得穀胱甘肽珠可用於富集含有該GST標籤的化合物。 也可以使用表位標籤(其為由抗體或T細胞受體識別的胺基酸區域)。該標記可以由可操 作地連接編碼修飾蛋白質的核酸片段以使得融合蛋白質由該核酸分子編碼的核酸片段編 碼。其他合適的融合蛋白是那些具有β-半乳糖苷酶、泛素、六聚組氨酸(hexahistidine) (6xHis)等的融合蛋白。此外，在某些實施方式中，用螢光標籤(例如，GFP、eGFP)標記MANF 或其生物功能片段，它們是常規已知的且用於蛋白質的檢測和監測中。藥物組合物本文所述的治療性蛋白質的藥物組合物在本發明的範圍之內。在本發明的一個方 面中，向受試者施用包含MANF或MANF和一種或多種另外的治療劑的藥物組合物以發揮預 防或治療效果。這種組合物包含治療或預防有效量的MANF或其功能片段。這種另外的一 種或多種治療藥物的例子包括但不限於作為「神經營養因子」的蛋白質或編碼作為「神經營 養因子」的蛋白質的核酸。神經營養因子是促進分化，保持成熟的表型和提供營養支持的 生長因子，從而促進神經元的生長和存活。神經營養因子位於神經系統中或受神經支配的 組織中。以下已被描述為神經營養因子鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)、酸性成纖維細 胞生長因子(aFGF)、睫狀神經營養因子(CNTF)、神經生長因子(NGF)、腦源性神經營養因子(BDNF)、神經膠質源性神經營養因子(⑶NF)、神經營養素(neurotrophin)-3(NT;3)、NT4/5、 胰島素樣生長因子(IGF-I)、IGF-II, NT-4、IL-I β、TNFa、轉化生長因子β (TGF-β、 TGF-β 1)、MANF (NTN)、persephin (PSP)、artemin 和 AL-1。神經營養因子的用途是本領域 的技術人員公知的，且可以在例如，美國專利申請公布20010011126、美國專利6，284, 540, 6，280，732,6, 274，624,6, 221，676中發現，本文通過引用引入。如在美國專利6，111，075中 所公開的，Par4的用途是本領域的技術人員公知的，本文通過引用引入。在各種實施方式 中，預期治療神經障礙的方法在本發明的範圍內，其中，與一種或多種神經營養因子一起向 受試者共同施用MANF或其功能片段。在本發明的各種實施方式中，包含MANF或其功能片段的藥物組合物可能進一步 包含用於修飾、維持或保留例如組合物的PH值、克分子滲透壓濃度、粘性、透明度、顏色、等 滲性、氣味、無菌性、穩定性、解離或釋放速率、吸附或滲透的製劑材料。合適的製劑材料包 括但不限於胺基酸(如甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、精氨酸和賴氨酸)、抗菌劑、抗氧化劑 (如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)、緩衝劑(如硼酸、重碳酸、Tris-HCl、檸檬酸、磷 酸、其他有機酸)、填充劑(如甘露醇或甘氨酸)、螯合劑[如乙二胺四乙酸(EDTA)]、絡合 劑(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-環糊精和羥丙基-β-環糊精)、填料、單糖、二糖和其 他碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)、蛋白質(如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)、 顏料、調味劑和稀釋劑、乳化劑、親水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)、低分子量多肽、成鹽 的抗衡離子(如鈉)、防腐劑(如苯扎氯銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、尼泊金甲酯、 尼泊金丙酯、洗必泰、山梨酸或過氧化氫)、溶劑(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)、糖醇(如甘 露醇或山梨醇)、懸浮劑、表面活性劑或潤溼劑(如pluronics、PEG、山梨聚糖酯、聚山梨醇 酯(如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)、三硝基甲苯(triton)、氨基丁三醇、卵磷脂、膽固醇、 tyloxapal)、穩定性促進劑(蔗糖或山梨醇)、張性促進劑(如鹼金屬滷化物(優選氯化鈉 或氯化鉀)、甘露醇、山梨醇)、輸送載體、稀釋劑、賦形劑和/或藥物佐劑(Remington' s Pharmaceutical Sciences，第 18片反，A. R. Gennaro編輯，Mack Publishing Company，1990)。藥物組合物可以包含一種或多種惰性賦形劑，其中包括水、緩衝水溶液、表面活性 劑、揮發性液體、澱粉、多元醇、成粒劑、微晶纖維素、稀釋劑、潤滑劑、酸、鹼、鹽、乳劑(如油 /水乳劑)、油(如礦物油和植物油)、潤溼劑、螯合劑、抗氧化劑、無菌溶液、絡合劑、崩解劑 等。緩衝溶液通常處於生理PH值，更特別地通常被緩衝到目標組織的pH值。優選的賦形劑有水、磷酸緩衝鹽溶液、商品名為Miglyol 840 (來自Huls America, Inc. Piscataway, N. J.)的中鏈脂肪酸丙二醇二酯、商品名為Miglyol 812(來 自Huls)的中鏈脂肪酸甘油三酯、商品名為Vertrel M5 (來自Ε. I. DuPont de Nemours and Co. Inc. Wilmington, Del.)的全氟二甲基環丁烷、商品名為八氟環丁 烷(octafluorocyclobutane)(來自 PCR Gainsville, Fla.)的全氟環丁烷、商品名為 EG 400 (來自 BASF Parsippany, N. J.)的聚乙 二醇、薄荷醇(來自 Pluess-MaufTer International Stanford, Conn·)、商品名為 Iauroglycol (來自 Gattefosse)的丙二酉享單 月桂酸酯、商品名為I^anscutol(來自Gattefosse)的二甘醇單乙醚、商品名為Labrafac Hydro WL 1219 (來自feittefosse)的中鏈脂肪酸的聚二醇化的甘油酯、醇類(如乙醇、甲醇 和異丙醇)、可獲得的桉樹油(來自Pluses-Mauffer International)及其混合物。本發明的化合物包括胺基酸衍生物。優選的表面活性劑可以是化合物的鈉鹽形式，其可以包括單鈉鹽形式。可以基於需要的性能(包括聚合的高速度、適於輸送的小的最 終微粒大小、良好的聚合產率、穩定性(包括凍融和保存期穩定性)、改善的表面張力性質 和潤滑性質)選擇合適的鈉鹽表面活性劑。可用於形成本發明的藥物組合物和劑型的表面活性劑包括但不限於親水性表面 活性劑、親脂性表面活性劑及其混合物。也就是說，可使用親水性表面活性劑的混合物，可 使用親脂性表面活性劑的混合物，或可使用至少一種親水性表面活性劑和至少一種親脂性 表面活性劑的混合物。其他合適的水性載體包括但不限於林格氏溶液(Ringer' s solution)和等滲氯 化鈉。水性懸浮液可以包括懸浮劑(如纖維素衍生物、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮和黃蓍 膠)和潤溼劑劑(如卵磷脂)。用於水性懸浮液的合適的防腐劑包括對羥基苯甲酸乙酯和 正丙酯。可用於形成本發明的藥物組合物和劑型的螯合劑包括但不限於乙二胺四乙酸 (EDTA)、乙二胺四乙酸二鈉、依地酸鈣二鈉、乙二胺四乙酸三鈉、白蛋白、轉鐵蛋白、去鐵敏 (desferoxamine)、得其jf芬(desferal)、甲磺酸去鐵胺(deferoxamine Mesylate)、乙二胺四 乙酸四鈉和乙二胺四乙酸二鉀、偏矽酸鈉或其中任何螯合劑的組合。可用於形成本發明的藥物組合物和劑型的潤滑劑包括但不限於硬脂酸鈣、硬脂酸 鎂、礦物油、輕礦物油、甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇、其他二醇類、硬脂酸、十二烷基硫酸 鈉、滑石粉、氫化植物油(如花生油、棉籽油、葵花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油)、硬 脂酸鋅、油酸乙酯、月桂酸乙酯、瓊脂或其混合物。可用於形成本發明的藥物組合物和劑型的增稠劑包括但不限於肉豆蔻酸異丙酯、 棕櫚酸異丙酯、新戊酸異癸酯(isodecyl neopentanoate)、角鯊烯、礦物油、C12-C15苯甲酸 酯和氫化聚異丁烯。特別優選的是那些不會破壞最終產品中的其他化合物的試劑，如非離 子型增稠劑。本領域的技術人員容易選擇另外的增稠劑。也可以加入其他物質，如抗菌劑，以防止儲存過程中的變質，即抑制如酵母菌和黴 菌的微生物的生長。合適的抗菌劑一般選自對羥基苯甲酸的甲基酯和丙基酯(即尼泊金甲 酯和尼泊金丙酯)、苯甲酸鈉、山梨酸、咪唑烷脲(imidurea)、purite、過氧化物、過硼酸鹽 及其組合。可用於形成本發明的藥物組合物和劑型的防腐劑包括但不限於purite、過氧 化物、過硼酸鹽、咪唑烷基脲、雙咪唑烷基脲(diazolidinyl urea)、苯氧乙醇、alkonium chlorides (包括苯扎氯銨)、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯和對羥基苯甲酸丙酯。製劑在各種實施方式中，本文公開的一種或多種治療藥物的製劑在本發明的範圍之 內。例如，在各種實施方式中，腸胃外製劑可以是液體溶液或懸浮液的形式；對於口服施用， 製劑可以是片劑或膠囊的形式；和對於鼻內製劑，可以為粉末、滴鼻劑或氣溶膠的形式。本領域中公知的用於製劑製備的方法可以在以下文獻中發現，例如，Remington The Science and Practice of Pharmacy (第 20 版)，編輯 A. R. Gennaro AR. , 2000, Lippencott Williams & Wilkins。例如，用於腸胃外給藥的製劑可包含作為賦形劑的無 菌水或鹽水，聚亞烷基二醇如聚乙二醇、植物來源的油或氫化萘、生物相容性生物降解性交 酯聚合物、或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可用於控制本發明的藥物的釋放。用於因子的其他潛在可用的腸胃外給藥系統包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物顆粒、滲透泵、可植入的輸 注系統和脂質體。用於吸入的製劑可包含賦形劑(例如乳糖)，或可以是包含例如聚氧乙 烯-9-月桂基醚、甘氨膽酸鹽(glycocholate)和脫氧膽酸鹽(deoxycholate)的水溶液，或 可以是用於以鼻滴劑形式施用的油性溶液或作為鼻內應用的凝膠。本發明的因子可以作為唯一的活性劑使用，或可以與他活性成分(例如可能有助 於神經疾病中的多巴胺能神經元存活的其他生長因子、或肽酶或蛋白酶抑制劑)結合使 用。本發明製劑中存在的因子的濃度隨多種要素(包括待施用的劑量和施用途徑)變 化。一般來說，可以在用於腸胃外施用的含有大約0. 至10% w/v的多肽的水性生 理緩衝溶液中提供本發明的因子。一般劑量範圍為每天大約lmg/kg至大約lg/kg體重。在某些實施方式中，劑量範圍為每天大約0.01mg/kg至100mg/kg體重。待施用的 優選劑量可能取決於待處理的病理生理狀態的類型和發展程度、患者的總體健康情況、制 劑的構成和給藥途徑。短語「藥學上的或藥理學上可接受的」指當在合適的情況下向動物(例如，人類) 施用時不產生有害反應、過敏反應或其他不良反應的分子實體和組合物。包含至少一種 IL-I受體拮抗劑或另外的活性成分的藥物組合物的製備是本領域的技術人員根據本公開 已知的，如 Remington' s Pharmaceutical Sciences,第 18 版 Mack Printing Company, 1990(本文通過引用引入)中例示的。此外，對於動物(如人類)的施用，可以理解，製備 應該滿足FDA的生物標準局(FDA Office of Biological Standards)規定的無菌性、致熱 性、一般安全性和純度標準。本文所用的「藥學上可接受的載體」包括任何和所有溶劑、分散介質、塗料、表面活 性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如，抗菌劑、抗真菌劑)、等滲劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、藥物、 藥物穩定劑、凝膠、粘合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、芳香劑、染料、諸如此類的物 質及其組合，這是本領域的技術人員已知的(參見，例如，Remington' s Pharmaceutical Sciences，第 18 版.Mack Printing Company，1990，第 1289-1329 頁，通過引用引入)。除 非任何常規的載體與活性成分不相容，否則可設想其在治療或藥物組合物中使用。治療劑可能包含不同類型的載體，取決於它是否以固體、液體或氣溶膠的形式施 用，以及它是否需要無菌以用於如注射的施用途徑。在各種實施方式中，本發明的治療性組合物可以經以下途徑施用眼內、靜脈內、 皮內、動脈內、腹膜內、顱內、局部、肌肉內、腹膜內、皮下、囊內、經黏膜、口服、局部、本地、吸 入(例如，氣溶膠吸入)、注射、輸注、連續輸注、直接浸浴目標細胞的局部灌注、通過導管、 通過灌洗、以乳膏形式(in cremes)、以液體組合物(如脂質體)、或通過本領域的技術人 員已知的其他方法或前述方法的任何組合(參見，例如，Remington' s Pharmaceutical Sciences，18 版 Mack Printing Company，1990，本文引入作為參考)。通過將合適溶劑中的所需量的活性化合物與所需要的上面列舉的各種其他成分 合併，接著過濾消毒來製備無菌注射溶液。一般地，通過將各種滅菌活性成分摻入其中包含 基本分散介質和/或其他成分的無菌載體中製備分散系。在用於製備無菌注射溶液、懸浮 液或乳液的無菌粉末的情況下，製備的優選方法是真空乾燥或冷凍乾燥技術，其由其先前
19的無菌過濾液體介質產生活性成分加任何另外的所需成分的粉末。如果必要，液體介質應 該適當地緩衝，且液體稀釋劑在注射之前首先用足夠的鹽水或葡萄糖賦予等滲性。還考慮 製備用於直接注射的高度濃縮的組合物，其中，設想使用二甲亞碸作為溶劑以產生極快速 的滲透，從而向小的區域遞送高濃度活性劑。組合物在製造和儲存條件下必須是穩定的，並防止微生物(諸如細菌和真菌)的 汙染作用。可以理解，內毒素汙染應在安全水平下保持最小，例如，低於0. 5ng/mg的蛋白 質。用於穩定本發明的固體蛋白質製劑的方法是增加純化的(如凍幹的)蛋白質的物 理穩定性。這會抑制通過疏水相互作用以及通過共價鍵路徑(其可能隨蛋白質展開而增 加)的聚集。在這種情況下的穩定製劑通常包括聚合物基的製劑，例如可生物降解的水凝 膠製劑/遞送系統。如上所述，水在蛋白質結構、功能和穩定性中的關鍵作用是公知的。通 常情況下，蛋白質在除去大量水的固態中是相對穩定的。然而，固體治療性蛋白製劑可能在 高溼度下儲存時或在由緩釋組合物或裝置遞送的過程中成為水合的。蛋白質的穩定性一般 會隨著水化增加而降低。水在固體蛋白質聚集中也可以發揮重要作用，例如，通過增加導致 反應基團的更高易接近性的蛋白質柔性，通過為反應物提供流動相和通過在幾種有害過程 (如β-消除和水解)中作為反應物。包含大約6%至的水的蛋白質製劑是最不穩定的。低於這個水平，結合水的 活動性和蛋白質內部運動低。超過這個水平，水流動性和蛋白質活動接近完全水化的水平。 在幾種系統中已觀察到隨水化增加而提高的對於固相聚集的敏感性，直到某一點。然而，在 較高的水含量下，由於稀釋效應而觀察到較少的聚集。在特別的實施方式中，通過在組合物中使用延遲吸收的試劑(例如，單硬脂酸鋁、 明膠或其組合)可以導致可注射組合物的延長的吸收。在各種實施例中，包含本發明的治療劑的製劑包含穩定或遞送載體。本文中的術 語「載體(vehicle) 」指防止降解和/或增加半衰期、降低毒性、降低免疫原性或增加治療性 蛋白的生物活性的分子。示例性的載體包括Fc域以及線型聚合物(如聚乙二醇(PEG)、聚 賴氨酸、葡聚糖等)、支鏈聚合物(例如，參見，1981年9月15日授權的Denkenwalter等人 的美國專利4，289, 872 ；1993年7月20日授權的Tam的美國專利5，229, 490 ；1993年10月 28日公布的Frechet等人的WO 93/21259)、脂質、膽固醇類(如類固醇)、碳水化合物或寡 糖、或結合補救受體(salvage receptor)的任何天然或合成的蛋白質、多肽或肽。在一個實施方式中，本發明提供通過肽的N-末端、C-末端或一個胺基酸殘基的側 鏈連接到至少一種載體(FnF2)上的至少一種肽。也可使用多種載體，例如，在各個末端的 多個Fe，或在一個末端的Fc和另一末端或側鏈的PEG基團。Fc域是優選的載體。Fc域可以與肽的N或C末端或同時與N和C末端融合。參 見，例如WO 97/34631和WO 96/3M78。在這種Fc變體中，可以除去天然Fc上提供不是本 發明的融合分子所需的結構特徵或功能活性的一個或多個位點。可以通過例如，替換或刪 除殘基，向該位點插入殘基，或截除包含該位點的部分而除去這些位點。插入的或替換的殘 基也可以是改變的胺基酸，如肽模擬物或D-胺基酸。Fc變體可能由於許多原因而是需要 的，下面描述其中的幾種。可選擇的載體是能夠結合目標細胞上的受體或目標分子的蛋白質、多肽、肽、抗體、抗體片段或小分子(如，肽模擬化合物)。例如，可以使用1998年4月14日授權的 Presta等人的美國專利5，739，277中描述的多肽作為載體。也可以通過結合Fcfoi補救受 體的噬菌體展示選擇肽。這種補救受體結合的化合物也包括在「載體」的含義之內，並在本 發明的範圍之內。為了增加半衰期(例如，通過避免蛋白酶識別的序列)和降低免疫原性 (例如，如在抗體人化中發現的，通過有利於非免疫原性的序列)應選擇這種載體。在某些實施方式中，載體是聚乙二醇(PEG)。PEG可以具有任何合宜的分子量，且 可能是直鏈的或分支的。PEG的平均分子量範圍優選為大約2千道爾頓(「kDa」)至大約 IOOkDa,更優選大約5kDa至大約50kDa，最優選大約5kDa至大約lOkDa。在另一實施方式 中，PEG的平均分子量為大約IOkDa至大約20kDa，或20kDa至30kDa或30kDa至40kDa或 40kDa至50kDa。PEG基團一般通過PEG部分的反應性基團(如醛基、氨基、巰基或酯基)與 本發明化合物上的反應性基團(如醛基、氨基或酯基)的醯化或還原烷基化反應連接到本 發明的化合物上。合成肽的聚乙二醇化的有用策略包括通過在溶液中形成結合鍵而將各攜帶彼此 相互反應的特定官能團的肽和PEG部分結合。可以使用本領域已知的常規固相合成方法很 容易地製備肽。肽在特定的位點用合適的官能團「預活化」。在與PEG部分反應前，純化並 完全鑑定前體。肽與PEG的連接通常發生在水相中，並可以很容易地通過反相分析高效液 相色譜進行監測。可以通過製備高效液相色譜很容易地純化聚乙二醇化的肽，並通過分析 高效液相色譜、胺基酸分析和雷射解吸質譜鑑定。多糖聚合物是可用於蛋白質修飾的另一種水溶性聚合物類型。葡聚糖是由主要通 過al-6鍵連接的單個葡萄糖亞單位組成的多糖聚合物。可獲得許多分子量範圍的葡聚糖 本身，並可以容易地獲得大約IkDa至大約70kDa的分子量。葡聚糖是本身作為載體或與另 一種載體(例如，Fe)組合用於本發明中的合適的水溶性聚合物。參見，例如，WO 96/11953 和TO 96/05309。已報告了結合治療性或診斷性免疫球蛋白的葡聚糖的用途，參見，例如， 歐洲專利公布0 315 456，本文通過引用引入。當葡聚糖根據本發明用作載體時，優選大約 IkDa至大約20kDa的葡聚糖。劑量向動物施用的本發明的組合物的實際劑量可以通過身體和生理因素確定，如體 重、狀況的嚴重性、治療的疾病種類、以前或同時存在的治療性幹預、患者的特發病和給藥 途徑。負責用藥的醫生在任何情況下確定組合物中的活性成分的濃度和用於受試者個人的 適當劑量。在某些實施方式中，藥物組合物可包含，例如，至少大約0. 的活性化合物。在 其他實施方式中，活性化合物可能佔單位重量的大約2%至大約75%、或大約25%至大約 60%，例如，其中可導出的任何範圍。在其它非限制的例子中，劑量還可能包含每次給藥大 約1納克/千克/體重、大約5納克/千克/體重、大約10納克/千克/體重、大約50納 克/千克/體重、大約100納克/千克/體重、大約200納克/千克/體重、大約350納克/ 千克/體重、大約500納克/千克/體重、1微克/千克/體重、大約5微克/千克/體重、 大約10微克/千克/體重、大約50微克/千克/體重、大約100微克/千克/體重、大約 200微克/千克/體重、大約350微克/千克/體重、大約500微克/千克/體重、大約1毫 克/千克/體重、大約5毫克/千克/體重、大約10毫克/千克/體重、大約50毫克/千克/體重、大約100毫克/千克/體重、大約200毫克/千克/體重、大約350毫克/千克/ 體重、大約500毫克/千克/體重至大約1000毫克/千克/體重或更多，及其中可導出的 任何範圍。在從本文的列出的數值可導出的範圍的非限制性的例子中，可以根據上述的數 值施用大約5毫克/千克/體重至大約100毫克/千克/體重、大約5微克/千克/體重 至大約500毫克/千克/體重等。在進一步的實施方式中，組合物可能包括各種抗氧化劑以延緩一種或多種成分的 氧化。此外，可以通過防腐劑(如各種抗菌劑和抗真菌劑，包括但不限於對羥基苯甲酸酯 (如尼泊金甲酯、尼泊金丙酯)、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其組合)產生對微生物作 用的預防。在本發明的另外的實施方式中，治療方法包括在特定時間段(如治療有效時間 段)施用本發明的治療劑(例如，MANF，或MANF與一種或多種另外的神經營養因子的組 合)。在某些實施方式中，特別考慮本發明的施用製劑或編碼MANF或其生物功能片段的核 酸。在某些實施方式中，設想該時間段是脊髓損傷時間的1小時至脊髓損傷後的72小時內 的時間。在另外的實施方式中，該時間段在脊髓損傷後的1小時至72小時開始。在再進 一步的實施方式中，該時間段在長度上為M小時至72小時或在長度上為3至6天。設想 治療可以在損傷發生的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23,24 小時或 1、2、3、4、5、6、7 天或 1、2、3、4、5 周或 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 個月之 內或之後實施。此外，設想治療可以為持續實施1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24 小時或 1、2、3、4、5、6、7 天或 1、2、3、4、5 周或 1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12 個月或更長時間。設想長期施用持續 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55 分鐘或 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 小時或更 長。還設想多次施用。在某些實施方式中，給予施用至少兩次(重複至少一次)。可以向受試者施用不同量的治療劑。在某些實施方式中，所施用的本發明的製劑 (例如，蛋白質或核酸)的量為每小時每千克體重1至1000納克。在其他實施方式中，該量 為每小時每千克體重1至100納克或每小時每千克體重1至10納克。設想劑量可以是每小 時每千克體重 1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、 190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、 380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、 570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、 760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、 950、960、970、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、 2500、3000、3500、4000、4500、5000納克(納克/千克/小時)。也設想劑量還可能是至少 和/或不超過那些相同的量。基因轉移如上所述，基因療法是另一種潛在的治療途徑，其中將編碼MANF多肽的基因的正 常拷貝(或編碼MANF有義RNA的多核苷酸)引入細胞中以成功地產生MANF多肽。必須以 其中基因可以被吸收並編碼足夠的蛋白質以提供有效的促進多巴胺能神經元存活的活性 的形式將基因輸送到那些細胞中。具有對於神經細胞合適的趨向性的逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體或其他病毒載體可以用作治療性MANF構建體的基因轉移系統。許多用於此目的的有用 載體通常是已知的(Miller，Human Gene Therapy 15-14,1990 ；Friedman, Science 244 1275-1281，1989 ；Eglitis 禾口 Anderson，BioTechniques 6 :608-614,1988 ；Tolstoshev 和 Anderson, Curr. Opin.Biotech. 1 :55-61,1990 ；Sharp, The Lancet 337 :1277-1278,1991 ； Cometta 等人，Nuc 1. Acid Res. and Mol. Biol. 36 :311-322,1987 ；Anderson, Science 226 401-409,1984 ；Moen, Blood Cells 17 :407-416,1991 ；Miller 等人，Biotech. 7 :980-990, 1989 ；Le Gal La Salle 等人，Science 259 :988-990,1993 ；及 Johnson，Chest 107 77S-83S，1995)。逆轉錄病毒載體尤其得到充分發展，並已用於臨床環境(Rosenberg等 人，N. Engl. J. Med. 323 :370,1990 ；Anderson 等人，美國專利 5，399，346)。非病毒的方法 也可用於將治療性的D NA引入所需的細胞中。例如，可以通過以下方法將編碼MANF的 多核苷酸引入細胞中脂質轉染法(Feigner等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413， 1987 ；Ono 等人，Neurosci. Lett. 117 259,1990 ；Brigham 等人，Am. J. Med. Sci. 298 278，1989 ；Staubinger 等人，Meth. Enzymol. 101 :512，1983)、脫唾液酸血清類粘蛋白 (asialorosonucoid)-聚賴氨酸偶聯(Wu 等人，J. Biol. Chem. 263 :14621,1988 ；Wu 等人， J. Biol. Chem. 264 16985，1989)或較不優選地，手術條件下的微注射(Wolff等人，Science 247 :1465,1990)。也可以使用在體外感染需要的非病毒方式實現基因轉移。這包括磷酸鈣、DEAE葡 聚糖、電穿孔和原生質體融合。脂質體也可能對於遞送DNA進入細胞是潛在有益的。雖然 這些方法是可用的，但其中很多是低效率的。在所描述的構建體中，MANF或前MANF cDNA表達可由任何合適的啟動子(例如， 人類巨細胞病毒(CMV)、猿病毒40 (SV40)或金屬硫蛋白啟動子)引導，並受任何合適的哺乳 動物調控元件調節。例如，如果需要，已知優先引導神經細胞中的基因表達的增強子可用於 引導MANF肽的表達。可使用的增強子可以包括但不限於那些鑑定為在其表達中為組織或 細胞特異性的增強子。可以修飾RNA分子以增加細胞內的穩定性和半衰期。可能的修飾包括但不 限於，在分子的5'和/或3'末端添加側翼序列或在分子骨架內使用硫代磷酸酯 (phosphorothioate)或2' 0_甲基而不是磷酸二酯酶連接。通過包含不易被內源性核酸 內切酶識別的非傳統的鹼基(如肌苷、Q核苷(queosine)和懷丁苷(wybutosine)以及腺 嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿苷的乙醯基、甲基、硫代和類似修飾形式)可以將這一 概念擴展至所有這些分子。組合的此外，任何基於MANF的治療劑與一種或多種另外的治療劑結合，包括但不限 於MANF2 (參見美國專利申請公布20060084619)、⑶NF、幹擾素Y、神經生長因子、表皮 生長因子(EGF)、鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)、神經原素(neurogenin)、腦源性神經 營養因子(BDNF)、甲狀腺激素、骨形態發生蛋白(BMP)、白血病抑制因子(LIF)、音蝟因子 (sonic hedgehog)、神經膠質細胞源性神經營養因子(⑶NF)、血管內皮生長因子(VEGF)、 白細胞介素、幹擾素、幹細胞因子(SCF)、活化素(activin)、抑制素、趨化因子、視黃酸 (retinoic acid)和睫狀神經營養因子(CNTF)或其組合。美國專利申請公布20080057028、 200700擬848、20070077649公開了用於本發明的方法和組合物的另外的治療劑和方法的例
23子。組合物可以單獨施用或與至少一種其他試劑(如穩定化合物)結合施用，其可在 任何無菌、生物相容性藥用載體(包括但不限於鹽水、緩衝鹽水、葡萄糖和水)中施用。可 以向患者單獨施用該組合物，或結合其他試劑、藥物或激素施用。雖然人類MANF優選用於本文所述的方法中，但已經在許多物種(包括大鼠、小鼠 和牛)中鑑定了 MANF。本領域的技術人員可以認識到，可以使用標準方法很容易地進行來 自其他動物的MANF的鑑定。任何具有促進多巴胺能神經細胞的存活的活性的並且由與編 碼人ARP的cDNA雜交的核酸編碼的蛋白質被認為是本發明的一部分。下面的實施例是為了舉例說明本發明。它們並不以任何方式限制本發明。實施例1 :VMCL_1細胞的產生和分析如下製備VMCL-I細胞系。在含有10% (ν/ν)胎牛血清的培養基中培養其中大約 2-3%是成神經膠質細胞的大鼠Ε14中腦細胞12小時，隨後在包含鹼性成纖維細胞生長因 子(bFGF)作為有絲分裂原的無血清培養基擴增。超過15 DIV後，觀察到幾個增殖的、神經 膠質樣細胞的島。在分離和傳代後，該細胞(本文稱為VMCL-I細胞)在無血清或含血清 的生長培養基中快速增殖。隨後的免疫細胞化學分析表明，它們對於兩種星形細胞標記物 (GFAP和波形蛋白)染色為陽性，並對於少突膠質細胞或神經細胞系(包括A2B5、04、feilC 和MAP2)的標記物為陰性。我們已在ATCC保藏了該VMCL-I細胞系(保藏號PTA_2479 ；保 藏日期2000年9月18日)。由VMCL-I細胞製備的無血清CM，導致培養物中的E14中腦多巴胺能神經元的存活 和分化增加。這些作用類似於由原代中腦1型星形膠質細胞獲得的CM施加的作用。中腦 區域特異性的基因 U^i^n，wnt-l、en-l、en-2、pax-2、pax-5*pax-8)的表達在 VMCL-1 細 胞和E14腹側中腦源的原代1型星形膠質細胞之間是類似的。在這二者中，Wnt-I表達強 烈，而en-Ι較不強烈，從而支持其預期的中腦源表達模式。染色體分析表明，70%細胞為異 倍體，且其中50%為四倍體。在超過25次傳代後，觀察到增殖能力沒有明顯下降。該細胞 系的性質與永生的1型星形膠質細胞是一致的。VMCL-I細胞具有明顯的非神經元的、神經膠質樣形態，但缺乏培養中的1型星形 膠質細胞典型的大的扁平形狀。免疫細胞化學分析表明，它們對於GFAP和波形蛋白染色 為陽性，並對於MAP2、A2B5和04為陰性。因此，這些細胞不是少突膠質細胞譜系。基於與 A2B5的陰性反應及其形態特徵，它們也不是2型星形膠質細胞。雖然，如上所述，這些細胞 缺乏培養中的原代1型星形膠質細胞的典型形態特徵，但由免疫細胞化學證據支持的分類 是1型星形膠質細胞。實施例2 =VMCL-ICM對於培養中的E14多巴胺能神經元的作用以0、5、20和50% ν/ν的比率測試VMCL-1CM影響培養中的Ε14中腦多巴胺能神經 元的存活和發育的能力。用10%胎牛血清(FBS)啟動(prime)培養12小時，然後在無血 清培養基中生長，直到它們在7DIV後染色並分析。CM對於多巴胺能神經元存活的提高具 有劑量依賴性的作用。CM增加存活5倍。相反，非多巴胺能神經元存活沒有顯著增加。這 種假定因子的生物學作用的特徵完全不同於源自B49膠質瘤細胞系的CM(GDNF源)的特徵 (Lin 等人，Science 260 :1130-1132) 實施例3 =VMCL-I細胞的基因表達分析
為進一步研究VMCL-I細胞系和原代培養的星形膠質細胞之間的相似性，我們測 量了作為中腦區域的特徵的6種標記基因的表達。wnt-1、en-1、en_2、pax-2、pax-5和pax_8 的分析顯示，除pax-2外，所有基因在E13和E14腹側中腦神經組織中表達，pax-2在E13神 經組織中表達但不在E14神經組織中。原代星形膠質細胞和VMCL-I細胞以相當於E13和 E14腹側中腦神經組織中的表達水平來表達wnt-Ι。雖然相對於E13和E14腹側中腦神經 組織中的表達為較低的水平，但en-Ι的表達程度在原代星形膠質細胞和VMCL-I細胞中是 相似的。相反，在原代星形膠質細胞或VMCL-I中en-2、pax-5和pax-8不表達。Pax_2在 E13而不是E14腹側中腦中和在原代星形膠質細胞而不是在VMCL-I中表達。實施例4 =VMCL-I細胞的染色體分析在34個細胞中進行染色體計數。其中，9個具有42的計數，這對於大鼠是二倍體 的數目。在25個為異倍體的細胞中，12/25或48%是在四倍體範圍之內。超二倍體03-48 的計數)和亞二倍體(39-41的計數)細胞各佔群體的20%，而12%的細胞具有結構重排 的染色體。VMCL-I CM增加培養中的多巴胺能神經元的存活的選擇性作用提供了對於這種細 胞系產生的分子的潛在的臨床用途。在50% ν/ν的濃度下缺乏VMCL-I CM的毒性作用表明 活性的、假定的神經營養因子沒有毒性。VMCL-I CM發揮的作用幾乎精確地與由中腦原代1 型星形膠質細胞製備的CM的作用對應。由以下觀察強烈地表明來自VMCL-I的假定因子對 於多巴胺能神經元的高度特異性沒有顯著增加總體神經元存活率，而多巴胺能神經元的 存活率提高5倍。這表明，原代1型星形膠質細胞表達GDNF mRNA，但沒有通過蛋白質印跡 在CM中以50pg的靈敏度檢測到GDNF蛋白。此外，它表明，在本實驗條件下，由最佳濃度的 ⑶NF介導的多巴胺能神經元存活率的增加從來沒有超過2倍。這些觀察單獨地表明，造成 VMCL-I CM的神經營養作用的因子不是⑶NF。實施例5 1型星形膠質細胞-條件培養基的產生過濾E16 1型星形膠質細胞CM(IOL)，並施加到先前用pH值7. 6的含有0.2M氯 化鈉的 20mM Tris-HCl (Mailinckrodt Chemical Co. Paris,Ky.)平衡的肝素瓊脂糖 CL-6B 柱(床體積80毫升)上。用平衡緩衝液衝洗後，用20mM Tris-HCl pH 7. 6中的0. 2M-2M NaCl的線性梯度GOO毫升總體積，流速為100毫升/小時)從柱洗脫結合的蛋白質。使 用 Pharmacia LKB 級分收集器收集級分，並在 280nm(Sargent-Welch PU 8600UV/VIS 分光 光度計)測量吸光度。從各個級分採集ImL的等分試樣，匯集為4個等分試樣的組G毫升 總體積)，並使用Centricon-10. RTM膜濃縮器(Millipore, Bedford, Mass)脫鹽。用確定 成分的培養基按1 4稀釋樣品，並生物測試多巴胺能活性。匯集活性級分(80毫升總體 積)，然後施加到已用PH值7. 4的50mM甲酸銨預平衡的G-75 Sephadex. RTM柱(70x2. 5cm， Pharmacia Biotechnology Ltd. ,Cambridge,UK)上。用同樣的緩衝液(流速 75 毫升 / 小 時)分離蛋白質，並在^Onm處測量吸光度。從各級分採集ImL的等分試樣，匯集為4個等 分試樣的組G毫升總體積)，通過凍幹法濃縮，並在ImL蒸餾水體積中重構。然後用確定成 分的培養基按14稀釋樣品用於多巴胺能生物測試。那些具有神經營養活性的樣品進一 步按單個級分進行生物測試。VMCL-ICM的重要區別特徵在於與培養中存在的GABA能、5-羥色胺能和其他神經 元表型的存活相比，它主要促進多巴胺能神經元的存活。GDNF也具有這種特異性。但是，大量測試結果表明，該VMCL-I源的化合物不是GDNF。實施例6 具有促進多巴胺能神經元存活活性的蛋白質的分離和純化如下進行純化方案。所用的所有的鹽具有最高純度，並由Sigma Chemical Co獲 得。所有的緩衝液為新鮮製備，並通過0. 2 μ M的過濾器(來自Millipore的GP快速真空 驅動系統)過濾。第1步肝素瓊脂糖柱色譜法)在室溫下用等體積的pH值7. 2的磷酸鈉緩衝液稀釋3升VMCL-I條件培養液，過 濾，並用漲PREP/SCALE-TFF 2. 5平方英尺筒(Millipore)濃縮至550毫升體積。將濃縮 的材料加載到由2x5mL HiTrap H印arin柱(Pharmacia Biotech)裝配並用至少IOOmL的 IOmM的pH值7. 2的磷酸鈉緩衝液(緩衝液A)預平衡的10毫升肝素瓊脂糖柱上。加載完 成後，用IOOmL緩衝液A衝洗柱。以各大約3毫升體積用緩衝液B (緩衝液A加IM氯化鈉) 洗脫總共10個級分。取出300L的樣品用於分析。步驟2 =Superose 12 柱色譜 )匯集第1步的所有級分，然後使用Centricon Plus-20濃縮器(5，000MWC0， Millipore)濃縮至 4. 5mL，加載到用 Superose 12 介質(製備級，Sigma Chemical Co.)填 充的16x600mm凝膠過濾柱上，並用至少300mL的含有0. 6M氯化鈉的pH值7. 2的20mM磷 酸鈉緩衝液(GF緩衝液)預平衡。在GF緩衝液進行蛋白質洗脫。收集2毫升級分，並分析 活性。在84毫升GF緩衝液通過柱之後，活性蛋白質在15毫升有體積中洗脫，並且根據用 蛋白質標準物(Bio-Rad)獲得的柱校準數據，對應於大約20-30kDa的洗脫區域。第3步陶瓷羥基磷灰石柱色譜(室溫；FPLC系統)匯集步驟2中對應於20_30kDa的洗脫區域的活性級分，並使用Centricon Plus-20濃縮器(5，000麗CO)濃縮至7. 5毫升，在4°C下相對於2升pH值7. 2的IOmM磷 酸鈉緩衝液(緩衝液A)滲析過夜，並加載(通過Superloop)到用緩衝液A平衡的ImL預 填充陶瓷羥基磷灰石柱(I型，Bio-Rad)上。在用緩衝液A衝洗掉過量的未結合蛋白質(通 流(flow-through))之後，應用O至100%的含有1. OM NaCl的線性梯度緩衝液A。收集1 毫升的級分並分析活性。在對應於0.4-0. 8M氯化鈉濃度的梯度區域內活性蛋白質洗脫為 寬峰。步驟4 陰離子交換柱色譜(室溫；FPLC系統)匯集對應於寬峰的級分(總體積=15毫升)，並使用Centricon Plus-20濃縮器 (5，000 MWC0)濃縮至6毫升，在4°C下相對於2升的pH值7. 5的20mM Tris HCl緩衝液(緩 衝液A)滲析過夜，加載(通過Superloop)到1毫升的陰離子交換FPLC柱(Uno，Bio-Rad) 上，並用緩衝液A平衡。在用緩衝液A衝洗掉過量的未結合蛋白質之後，應用O至100%的 IM NaCl (於緩衝液A中)的線性梯度。收集1毫升的級分，並分析活性。在通流(即未結 合蛋白質的級分)中發現活性蛋白質。步驟5 =BioSil 125柱色譜法(室溫；HPLC系統)使用Centricon Plus-20濃縮器(5，000 MWC0)將步驟4的活性蛋白質級分(7毫 升的總體積)濃縮至接近零體積(大約1 μ L)，並在0. 6毫升的pH值7. 2的IOmM磷酸鈉 緩衝液中重構。將重構的材料(70 μ L，分析試驗)加載到用pH值7. 2的20mM磷酸鈉緩衝 液(GF緩衝液)平衡的BioSil 125高效液相色譜凝膠過濾柱(Bio-Rad)上。使用HP 1100系列HPLC系統(Hewlett-Packard)進行色譜法。以120 μ L級分收集洗脫液，並分析活性 和蛋白質含量(SDS-PAGE)。在與從柱洗脫的^Onm的主吸收峰相關的級分中發現活性，根 據SDS-PAGE分析所述級分代表45kDa的蛋白質。然而，在45_kDa的蛋白質峰的旁邊級分 (side fraction)中沒有發現活性，從而表明活性可能是由於與45kDa蛋白質共洗脫的另 一種蛋白質的存在，但濃度為可能在12%的SDS-PAGE銀染凝膠中無法檢測到的非常低的 濃度。因此，使用Centricon-3濃縮器(Millipore)進一步濃縮來自第5步的剩餘濃縮物 質至80 μ L的體積，且加載60 μ L，並在與上述的分析試驗相同的條件下在柱上分離。從各 120 μ L的洗脫液級分取出8 μ L的等分試樣，並通過與銀染相結合的SDS-PAGE (12%凝膠) 進行分析。這一分析表明，另外兩種其他蛋白質(具有大約18和20kDa的分子量)與活性 級分相關聯，並與主要的45-kDa蛋白質共洗脫。活性級分相對於IL的pH值8. 0的醋酸銨 緩衝液滲析，並合併以產生兩個集合(pool)P-I和P-2，使得P-I包含20kDa的蛋白 質和45kDa的蛋白質，和P-2包含18kDa的蛋白質和45kDa的蛋白質。用SpeedVac真空濃 縮器(Savant)乾燥各個集合，並分別在pH 6. 9的15 μ L的0. IM醋酸銨緩衝液中重構。從 各個樣品取出等分試樣，並測試活性。此外，1 μ L等分試樣進行12%的SDS-PAGE分析接著 進行銀染。上述分析的結果清楚地表明了 P-I而不是Ρ-2包含所需的促進存活的活性。在 接下來的步驟中，在SpeedVac上乾燥P-I和P_2，(各)在10 μ L的新製備SDS-PAGE還原 性樣品緩衝液(Bio-Rad)中重構，在沸水浴中孵育1分鐘，並加載到12%的SDS-PAGE凝膠 上。電泳完成後，在室溫下將凝膠於甲醇/醋酸/水溶液(50 10 40)中固定40分鐘， 用超純水(nanopure water)清洗3次，並在室溫下用GelCode藍染色試劑(Pierce)染色 過夜。染色完成後，用超純水從凝膠洗掉GelCode溶液，用刀片從凝膠切除對應於45kDa蛋 白質(P-1和P-幻和20kDa蛋白質(RP-I)的可見蛋白質帶。含有相應帶的各凝膠片被 放置在1. 5ml的離心管中直到膠內消化的時間。μ實施例7 通過 nESI-MS/MS 對膠內酶切片段(In-Gel Digested Fragments)的分 析在室溫下，用30%的乙腈(aq.)中的IOOmM的碳酸氫銨孵育蛋白質凝膠帶1小時， 以去除膠狀考馬斯亮藍染色。多次更換脫色溶液，直至完全除去染料。然後，用去離子水 (大約200 μ L)覆蓋凝膠塊，並振搖10分鐘。在乙腈中對凝膠塊脫水，並在去除過量液體後， 用離心蒸發器完全乾燥。用含有200ng改性胰蛋白酶(ftOmega，Madison, Wis.)的20 μ L 的50mM碳酸氫銨(pH 8. 3)對凝膠帶再水化。用pH 8.3的50mM碳酸氫銨(大約50 μ L) 覆蓋凝膠塊，並在37°C下孵育過夜。然後將消化溶液轉移到乾淨的Eppendorf管中，並在 50-100 μ L的5%醋酸(aq.)中超聲處理凝膠塊30分鐘。提取溶液與消化溶液合併，並用 離心蒸發器蒸發至乾燥。首先使用Voyager Elite STR MALDI-T0FMS 儀(Applied Biosystems Inc., Framingham, Mass.)，通過的基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOFMS)分析膠 內消化提取物。將提取物溶解於5yL的50%乙腈、醋酸中。二羥基苯甲酸用作基質，並 以正離子、反射模式獲得圖譜。各樣品的大約五分之一用於這一分析。這些圖譜提供了消化 提取物中肽的質量，其然後用來搜索內部、非冗餘蛋白質序列資料庫，這一過程稱為肽質量 指紋識別。樣品的剩餘部分用於通過納電噴霧電離(nanoelectrospray ionization)-串聯質譜(nESI-MS/MQ的肽序列分析。首先使用C18 ZipTips(Millipore)對提取物脫鹽， 並重新溶於75%甲醇(aq.)、0. 醋酸(5yL)中。大約一半的樣品被加載到納電噴霧玻 璃毛細管(Micromass)中。使用Qltar-四極管飛行時間混合質譜儀(PE SCIEX, Concord, ON)進行nESI-MS/MS分析。以正離子模式進行所有的MS/MS分析。碰撞氣為氮氣和碰撞能 量為40-60eV。通常在兩分鐘的時間內每秒獲得MS/MS圖譜。MS/MS圖譜用來使用部分序 列標籤檢索內部的非冗餘蛋白質序列資料庫(即，只有肽質量和一些碎片離子用於檢索數 據庫)。如果蛋白質沒有通過該程序鑑定，那麼儘可能完全地從MS/MS譜圖確定兩種或多種 肽的胺基酸序列。這些序列用於在NCBI的蛋白質、核酸和EST序列資料庫中進行BLAST檢 索。實施例8 =MANF (ARP的分泌形式)的鑑定為了使ARP成為對於產生所觀察的VMCL-I CM神經營養活性的至少一部分的因 子，必須從細胞釋放蛋白質。但是，預測的ARP的氨基端具有鹼性負荷(basic charge)( — 種有利於在細胞核內保留的性質)。儘管如此，我們假設也存在分泌形式。在Goo等人(Moleculesand Cells 9 =564-568,1999)的出版物中，確認了編碼果 蠅(Drosophila melanogaster)的ARP樣蛋白的基因，同時使用酵母信號序列捕獲技術篩 選cDNA文庫。這種cDNA編碼的推定的ARP樣蛋白質缺乏富含精氨酸的氨基末端。分泌果 蠅的ARP樣蛋白，使用SignalP程序，我們鑑定了果蠅的ARP樣蛋白質的信號肽(殘基1-22) 和丙氨酸22和亮氨酸23之間的信號肽酶切割位點，從而提供了另外的證據。基於人類ARP和果蠅ARP樣蛋白之間的比對，我們推測，人類ARP具有信號序列和 信號肽酶切割位點。因此，我們使用SignalP程序來分析缺乏富含精氨酸的氨基末端(氨 基酸1-55)的人類ARP ；這種多肽現在被稱為前MANF。在該實施例中，位置56的蛋氨酸為 起始密碼子。SignalP程序預測了由SEQ ID NO 2的殘基1_21構成的信號肽及丙氨酸21 和亮氨酸22之間的切割位點，其與從果蠅的ARP樣蛋白得到的分析結果一致。部分基於我們對果蠅的ARP樣蛋白(GenBank登錄號AFU^L1)和人類的ARP的 分析，我們預測，翻譯可以在人類ARP的1位的蛋氨酸或56位的蛋氨酸開始。在後一種情 況下，含有信號肽的蛋白質(前MANF)能夠以MANF的形成從細胞分泌，其中，該蛋白質作為 神經營養因子發揮作用。但是，我們關於MANF存在的發現沒有排除含有富含精氨酸的氨基 末端區域的ARP的細胞內功能。實施例9 大腸桿菌中表達的MANF的生物活性使用含有編碼人MANF的pTriEx的核苷酸，在大腸桿菌細菌細胞中進行重組蛋白 的表達。從350毫升細菌細胞培養物中獲得總共4毫克純化的重組MANF，其鑑定通過質譜 測序確認。測試這種蛋白質保護多巴胺神經元的能力。在大腸桿菌中表達的MANF能夠以 VMCL-I條件培養基同樣的程度保護多巴胺神經元免於細胞死亡。實施例10 對於HEK293細胞中表達的真核MANF的劑量-反應使用含有20%的多巴胺能神經元的多巴胺能細胞培養分析系統測試人 獻順(99%純，在冊1(293細胞中產生)相對於多巴胺能神經元的存活的劑量關係。通過二 氧化碳麻醉處死E14懷孕大鼠。將軀幹浸泡在70%乙醇中，進行剖腹手術(Iaporatomy)， 除去子宮囊，並轉移至含有20毫升冷HBSS (pH 7.4)的50毫升管中。依次將各子宮囊轉 移到含有15毫升冷HBSS的10釐米的皮氏培養皿中。完整除去胎兒，完整分離各個大腦，
28並轉移到含有15毫升冷HBSS的新10釐米皮氏培養皿中。在中腦曲的頂部切開中央腹側 中腦(VM)，以獲得堆積密度為1. Oxl細胞/mm3的1. Omm3的組織塊。將VM組織轉移到含有 10毫升冷PCMlO的15毫升管中。用PCMlO (具有2mM穀氨醯胺、5毫克/毫升胰島素、5毫 克/毫升轉鐵蛋白、5毫克/毫升亞硒酸鈉的DMEM/F12，20nM孕酮，30nM甲狀腺素，10%胎 牛血清)清洗匯集的VM組織(三次清洗)，接著在無血清培養基(PCM0;除了缺乏胎牛血 清之外，與PCMlO相同)中單次洗滌，並在37°C下在含有木瓜蛋白酶(10U/mL)的2. 0毫升 PCMO中消化15分鐘。然後用PCMlO衝洗組織(3x5毫升)以滅活蛋白酶的活性。使用設置 為500 μ L的Ρ-1000，在2. 0毫升PCMO中進行研磨。終點是沒有組織團塊跡象的乳狀懸浮 液。將分散的細胞離心(1，000rpm，2分鐘，4°C )，計數，然後以6. 25x10s細胞/mL的密度再 懸浮於PCMlO中。在這個階段測試細胞存活率，通常是> 95%。將細胞作為25 μ L的微島(MI)小滴(1. 56χ104細胞/MI)接種在塗有聚D-賴氨 酸的8孔腔室培養玻片上。25 μ L的MI小滴佔據12. 5mm2的面積。MI的平均、最終平均細 胞密度因此為1. 25x10s細胞/cm2。MI中心的平均細胞密度大約是2. 0xl05/cm2，在MI邊緣 落到< 1. OxlO4的水平。在37°C、5% CO2中在100%溼度下孵育MI45分鐘，以使細胞附著 在塗覆的表面上。附著之後，向每孔中加入375 μ L的PCM10，並細胞進行血清啟動4小時。 在啟動結束時，吸取100%的PCM10，並用不含血清的PCMO取代。如下製備MANF。將人前-MANF克隆到pTriEx表達載體中。在HEK293細胞中進行 重組蛋白的表達。從800毫升HEK293細胞條件培養基獲得20微克純化的缺乏信號序列的 重組MANF。其鑑定通過質譜測序分析確認。在第一、第三和第五天用標示量的MANF處理培養物。固定培養物，並使用載體ABC 法或間接免疫螢光在DIV6或DIV7進行染色。早在DIV3時，在測試的MANF的不同濃度之間存在顯著性的差異(AN0VA，P < 0. 001)。使用Tukey分析方法的配對比較表明250和500pg/ml及1. 0和10ng/nL的 MANF顯著不同於對照(P ⑶NF > BDNF，表明MANF的兩個較低濃度相對於低劑量的BDNF或GDNF對多巴胺神經元更具有選擇 性。在最高劑量下，效力的次序為⑶NF > MANF > BDNF。一般來說，BDNF往往效力最強， 但保護多巴胺神經元的特異性最低。在較低濃度時，MANF往往對於保護多巴胺神經元最具 有選擇性。但是，在一個實施方式中，設想MANF與GDNF和/或BDNF共同施用，以實現增強 的有益效果。實施例12 對MANF的響應的選擇性測試MANF保護其他腦區的神經元的能力。沒有觀察到對大鼠小腦顆粒神經元、結 節感覺神經元或交感去甲腎上腺素能神經元的保護作用。同樣，在腹側中腦培養中，在MANF 證明對多巴胺神經元有保護作用的培養中似乎沒有對於GABA能和5-羥色胺能神經元的活 性。與上述結果相反，MANF對培養中的背根神經節細胞亞群有保護作用。背根神經節由至 少3個神經元的亞群組成。已經證明，NGF、BDNF和NT-3，神經營養因子家族的所有神經營 養素成員，各對於這些神經元的不同亞群發揮作用。因此，MANF對於背根神經節神經元的 這一亞群的作用是與神經營養因子的一般神經保護性質一致。
實施例13 =MANF多克隆抗體的產生如下製備多克隆抗體。在大腸桿菌中製備His標記的全長MANF。每隻兔每次注射 200ug的純化MANF蛋白質進行6次抗原注射(在第1、21、35、49、63和70天各一次)。在 第84天收集血清(100毫升血清/兔)。蛋白質印跡分析用於測試MANF-pAb的活性。相對較高量的MANF(720ng)用於 MANF-pAb活性的初步測試，其在1 12，800的稀釋度時保持活性。在接下來的測試中， MANF的稀釋度固定為5000，且MANF的量在1，000至15. 6ng之間變化。很容易檢測到最低 15. 6ng的MANF量。在BDNF和⑶NF的交叉反應性的測試中，結果表明，即使以3倍的MANF 量(32ng)，MANF-pAb仍不與BDNF或GDNF交叉反應。用以下方法獲得上述結果。中腦培養如前所述(Shimoda等人，Brain Res. 586 :319-323,1992 ；Takeshima 等人， J. Neurosci. 14 :4769-4779,1994 ；Takeshima 等人，Neuroscience. 60 :809-823,1994 ； Takeshima 等人，J. Neurosci. Meth. 67 :27-41,1996)，從定時懷孕的 Sprague-Dawley 大鼠 (Taconic Farms ； Germantown, N. Y.)製備中腦神經細胞培養物。收集切開的組織，並根據 實驗目的匯集於加氧的冷)HBSS中或包含10%胎牛血清(Biofluids Laboratories, Rockville, Md.)的培養基中。在妊娠第14天(即E14)，通過暴露於二氧化碳中處死懷孕 大鼠，用70%乙醇清潔腹部區域，進行剖腹手術，收集胎鼠，並匯集於冷的無Ca2+或Mg2+的 Dulbecco磷酸鹽緩衝鹽水(DPBQ(pH7.4)中。然後除去完整大腦，在間腦和中腦之間進行 切開，從中央切開頂蓋並橫向展開。分離包括中腦多巴胺能區域的1.0mm3的中間組織塊。 切開的組織塊集中於冷的G°C)、加氧的培養基中。無需預先消化磨碎組織。可選擇地，在 37°C下，在含有10U/mL的木瓜蛋白酶(Sigma Chemical Co.)的L-15生長培養基中孵育細 胞15分鐘，用培養基(3x2mL)清洗，並僅使用針和注射器磨碎。將分散的細胞轉移到1. 5 毫升Eppendorf管中(1. O毫升/管)，並以600g離心2分鐘。使用較長時間的較高離心速 度導致培養物的碎片汙染，從而導致細胞的亞最佳生長。仔細吸取培養基，且細胞再懸浮於 新鮮培養基中並使用血球計計數。在2小時內完成從剖腹手術至接種的所有程序。在典型 的實驗中，10-15胎鼠的一窩產生1. OxlO5細胞/胎或1. OxlO6-L 5xl06細胞/窩。中腦微島培養為了製備中腦微島培養物，如上所述製備細胞，並以5. OxlO5mL的最終密度再懸 浮。使用100 μ L吸液管將懸浮液的25uL小滴(1. 56X104細胞)接種在塗有聚-D-賴氨酸 (50ug/mL)的8孔腔室培養玻片上。小滴的面積為大約12. 5mm2，達到最終的平均細胞密度 1.0xl05/Cm2。均勻地分散小滴，垂直撤回吸液管尖端，以免拖尾。微島培養物佔據的面積在 培養過程中保持均一。在37°C、5% CO2中在100%溼度下孵育培養物30分鐘，以使細胞粘 附，然後向每孔添加375uL的生長培養基。在第一個12小時後更換培養基，之後每隔一天 更換大約一半的培養基。細胞存活力測試雙色螢光細胞存活力檢測試劑盒(活的/死的存活力/細胞毒性檢測試劑盒， #L-3224，Molecular Probes, Inc. ,Eugene, Oreg.)用於在接種之前和在培養中鑑定活的和 死的細胞。活的和死的細胞分別發出綠色和紅色螢光，從而給出存活力的兩種陽性指標。用DPBS稀釋溴乙啡錠同型二聚體(ethidium homodimer)和鈣黃綠素-AM，以分別給出3. 8 μ M 和2. 0μ M的最終濃度。在接種之前完成細胞存活力的評價。室溫下在蓋有蓋玻片的黑暗 的溼潤容器中，在載玻片上與等體積的染料(通常是20 μ L) —起孵育細胞懸浮液15分鐘， 然後使用FITC光學器件以螢光光學顯微鏡檢查。恰在接種前細胞存活率為大約95%。培養基使用的無血清培養基由等體積的Dulbecco氏改良Eagle培養基(DMEM)和Ham' s F-12(Gibco, Grand Island, N. Y. ；320-1320AJ)、1. 0 毫克 / 毫升牛白蛋白部分 V(Sigma Chemical Co. ；A4161)、0· 1 μ g/毫升載脂-轉鐵蛋白(apo-transferrin) (Sigma ；T-7786)、 5 μ g/ 毫升胰島素(Sigma ；1-1882)、30nM 的 L-甲狀腺素(Sigma ；T-0397)、20nM 孕酮 (Sigma ；P-6149)、30nM 亞硒酸鈉(Sigma ；S-5261)、4. 5mM 穀氨醯胺(Gibco，320-5039AF)、 100U/mL 的青黴素和 100μ g/mL 鏈黴素(Gibco ；P-100-1-91)組成。由VMCL-I細胞系製備條件培養基在由VMCL-I細胞系製備條件培養基時，將2. OxlO6細胞接種於15釐米未塗覆的 培養皿中，20毫升含有1.0%胎牛血清的培養基中。在80%匯合時，吸取培養基並用無血 清培養基清洗細胞一次。加入20毫升無白蛋白的無血清N2培養基，並且使得適應繼續48 小時。在這段時間內，細胞通常擴增到100%匯合。吸取培養基，匯集於50毫升的管中，離 心(15，OOOrpm進行20分鐘)，且隨後匯集在1. 0升塑料瓶中。通常每批5mL的CM經使用 0. 22 μ m過濾器過濾消毒，在-70°c下儲存5毫升的等分試樣，並用於在與較大存儲的CM匯 集之前測定神經營養效力。如果需要，VMCL-ICM可以使用本領域的技術人員已知的標準工 業細胞培養技術大批量製備。1型星形膠質細胞的條件培養基的產生如下製備1類星形膠質細胞。在冷的DPBS中切開E16大鼠胚胎腦幹，並將中腦區 域轉移到星形膠質細胞培養基(DMEM/Ham' s F_12，1 1，15% FBS，4. OmM的穀氨醯胺， 30nM亞硒酸鈉，青黴素和鏈黴素)中。使用配備註射器的18號針頭通過在2毫升的新鮮培 養基中研磨分散細胞。在離心機中以2，OOOrpm離心細胞5分鐘，再懸浮於培養基中，且再 次研磨。分散最後的細胞團，並在15毫升的培養基中以IxlO6細胞/75cm2的密度接種。在 37°C下在5%二氧化碳和95%空氣的氣氛中孵育細胞M小時，並通過吸取除去未粘附的細 胞。培養細胞另外9天，然後劇烈搖動培養瓶16小時，以除去任何汙染的細胞類型。用DPBS 洗滌星形膠質細胞單層三次，用胰酶消化並重新接種(IxlO6細胞/瓶的密度)。這時，將一 小部分的細胞接種到8孔腔室玻片(Nunc Inc. ,Naperville, 111.)上；如對於燒瓶培養所 述對這些同類培養進行處理。在匯合時，用含有7. 5% FBS的培養基更換培養基，且細胞孵 育48小時。在下一步交換中，添加確定的無血清培養基(DMEM/Ham' s F-12，1 1,4. OmM 穀氨醯胺，30nM亞硒酸鈉，青黴素100U/ml和鏈黴素100U/ml)，且細胞孵育另外的48個小 時。更換培養基，且5天後收穫條件培養基，並與亮肽素(IOmM =Bachem, Torrance，Calif.) 和4-(2-氨乙基)-苯磺醯氟化鹽酸鹽(l.OmMJCN Biochemicals, Aurora, Ohio)混合，以 抑制蛋白水解。在收穫的時間，對在腔室玻片上培養的星形膠質細胞單層進行免疫染色以 評估培養表型。VMCL-I細胞的培養在培養VMCL-I和製備VMCL-ICM時，將2. OxlO6細胞接種於15釐米的未塗覆的培養皿中，20毫升的最初包含10%胎牛血清的生長培養基中。在80%匯合時，吸取培養基， 並用無血清培養基洗滌細胞一次。通常加入20毫升無白蛋白的無血清培養基，並且使得適 應繼續48小時。N2培養基被證明特別適合用於收集條件培養基。在這48小時過程中，細 胞通常會擴增到100%匯合。吸取培養基，匯集於50毫升的管中，離心(15，OOOrpm進行20 分鐘)，並匯集在1. 0升塑料瓶中。大約5mL的各批CM使用0. 22mm過濾器除菌，在_70°C 下儲存5毫升的等分試樣，並用於在與較大存儲的CM匯集之前測定神經營養效力。VMCL-I 細胞系現已傳代超過50次。免疫細胞化學對於MAP2和TH免疫細胞化學，用冷DPBS洗滌培養物(h250uL)，使用PBS中的 4% 甲醛固定 10 分鐘，在-20°C 下使用 CH3C00H/95 % KOH 滲透(permeabilize) 5 分 鍾，然後用PBS洗滌(3x250uL)。用PBS中的牛血清白蛋白(BSA-PBS)阻斷非特異性結 合 15 分鐘。將抗 TH 抗體(50uL) (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, Ind.)或抗 MAP2 抗體(Boehringer-Mannheim)應用於各孔，並在室溫下在黑暗的潮溼盒中孵育載玻片2小 時。使用小鼠血清以與抗TH抗體相同的稀釋度進行對照染色。用PBS清洗(h250uL)後， 應用抗鼠IgG-FITC(50uL)，並孵育載玻片另外的1小時。用PBS清洗(h250uL)後，吸取 過量的液體，除去腔室壁，並應用單滴的VectaSiield封固介質(Vector Laboratories, Burlingame, Calif.)，接著應用覆蓋玻璃，其用指甲油密封。在一些實驗中，使用生物素化 的二級抗體識別TH，並使用生物素化的過氧化物酶-抗生物素蛋白複合物(ABC試劑盒； Vector Laboratories)開發鎳增強的二氨基聯苯胺(DAB)反應。對於膠質纖維酸性蛋白(GFAP，Boehringer-Mannheim,#814369)，在 _20°C下使 用5% CH3C00H/95% C2H5OH —步完成固定和滲透。後續過程與那些用於顯現TH的過程相 同。對於A2B5和04，用冷DPBS洗滌(h250uL)培養物，並用1 % BSA-PBS封閉10分鐘。將 A2B5抗體(50uL)應用於各孔，並孵育1小時。在用DPBS洗滌(h250uL)後，應用二級抗 體(抗-IgM-FITC) 30分鐘。然後用DPBS Ox250uL)洗滌細胞。為了反染色細胞核，在室溫 下，細胞與在IOmM碳酸氫鈉中的0. 5yg/毫升的核酸染料H33258(Hoechst，Kansas City, Mo.) 一起孵育15分鐘，然後在PBS中衝洗分鐘。在最後用冷的DPBSOx250uL)洗滌 之後，如上所述封固。RT-PCR 分析使用RNA-STAT試劑(TeliTesLUniversity of Maryland,Baltimore,Md.)從大鼠 E13或E14腹側中腦組織或從IxlO9星形膠質細胞或IxIO9VMCL-I細胞提取總RNA。從RNA 生成第一鏈cDNA，並使用製造商的程序通過聚合酶鏈反應擴增。通過2%瓊脂糖凝膠電泳解析反應產物，以確定片段的大小和相對豐度。包括 b-肌動蛋白和GAPDH的PCR結果作為對照，以證實cDNA的相等加載。染色體分析在以1 100稀釋的補充有2. 5%FBS、D_葡萄糖(2. 5g/L)和ITS補充劑的DMEM/ F-12 1 1培養基中培養細胞。M小時後，用秋水仙鹼(IOyg/毫升)抑止分裂中期階 段的亞培養。細胞用胰酶消化，並進行低滲休克(75mM氯化鉀)。然後細胞經3次MeOH/ CH3COOH(3 1)的更換固定，並空氣乾燥。然後使用4% Geisma對細胞染色並顯微檢查。實施例14 帕金森氏病的6-羥多巴胺(6-0HDA)模型
接下來在帕金森氏病的齧齒動物模型中測試MANF，其中，通過神經毒素6_羥多巴 胺陽-OHDA)損傷大腦一側的多巴胺能神經元，6-羥多巴胺靠近黑質中的多巴胺能神經元 注射，並通過多巴胺轉運蛋白(DAT)選擇性地攝取到多巴胺能神經元中。6-0HDA選擇性地 破壞在大腦的注射側多巴胺能神經元。以兩周的間隔，通過全身注射D-安非他命或阿樸嗎 啡(這兩者都導致大腦中多巴胺的釋放)激發實驗動物。在大腦的無損傷側釋放更多的多 巴胺。DA釋放的這種不平衡導致動物向大腦的完整側旋轉(Mendez和Firm，1975)。該行為 效應可以是劇烈的。動物有時可能沿封閉的圓圈高速地旋轉，相當於追逐自己的尾巴。每 分鐘的旋轉數是DA釋放失衡的指標，從而表明實驗側的損傷程度。保護和誘導多巴胺能神 經元再生的藥物(如MANF、CDNF和GDNF)減少每分鐘旋轉次數，這是大腦損傷側的DA釋放 恢復的跡象。DA釋放的增加反過來表明大腦損傷側的多巴胺神經元的再生。在MANF公開之後，赫爾辛基大學(University of Helsinki)發現了 MANF同系物 MANF2(也稱為保守多巴胺能神經營養因子或⑶NF)。MANF在成體腦的腹側中腦中的表達使用定量RT-PCR確定成年哺乳動物大腦的10個區域中的MANF表達嗅球、海馬、 大腦皮層、紋狀體、丘腦(Thalamus)、腹側中腦、丘(Colliculus)、腦橋、延髓和小腦。在腹 側中腦發現MANF的最高水平表達，這是帕金森氏病中死亡的多巴胺能神經元所處的相同 大腦區域。這一結果表明，MANF可能是成人大腦中的生理神經營養因子。在黑質中MANF釋放GABA由黑質中的多巴胺能神經元記錄微小抑制性突觸後電流(mlPSC)。荷包牡丹鹼 (bicuculine) (10 μ M)完全阻斷mlPSC，這表明mlPSC是通過GABA-A受體機制介導的。 MANF (5ng/ml)導致mlPSC頻率的可逆地增加(Zhou等人，2006)，表明MANF增加與DA神經 元形成突觸的黑質中的突觸前GABA能末端的GABA釋放。對帕金森氏病提出的成因之一是穀氨酸對黑質中的多巴胺能神經元的興奮性毒 性作用。此外，mGluR涉及多巴胺能神經元的機能和神經保護藥物在大腦中的作用。這些 結果表明，MANF在帕金森氏病治療中的第二靶標是黑質中的突觸前GABA能末端，由抑制性 遞質GABA的釋放介導，抑制性遞質GABA拮抗穀氨酸對黑質中的多巴胺能神經元的興奮性 毒性作用。保藏申請人:已經將包含細胞系VMCL-I的至少25個瓶保藏於美國典型培養物保藏中 心，維吉尼亞州馬納薩斯，美國20110，ATCC保藏號PTA-2479。在2000年9月18日，在ATCC 保藏了這些細胞。VMCL-I的這一保藏將在ATCC保藏庫(這是公共保藏庫)保持30年或在 最近的請求之後5年或專利的有效期間，以時間最長的一個為準，且如果在此期間保藏失 活，則進行更換。另外，申請人已符合C. F. R. § § 1.801-1. 809的所有要求，包括提供樣品 的存活指標。申請人對於ATCC的保藏材料的可獲得性沒有限制。但是，申請人沒有權力免 除法律規定的對生物材料的轉移或其商業運輸的任何限制。申請人並沒有放棄追究對於授 權專利權利的任何侵害。其他的實施方式本文通過引用引入上面說明書提到的所有出版物和在專利。在不背離本發明的範 圍和精神的情況下，本發明的所述方法和系統的各種修飾和變化對於本領域的技術人員顯而易見的。實施例15 帕金森氏病(PD)的大鼠模型中的神經移植在這個實施例中，在帕金森氏病(PD)大鼠模型中測試MANF分子。如實施例14中 所描述的，在大鼠群體中建立單側6-0HDA損傷。在神經切除術3個星期之內，標準的行為 學測試用於確定成功損傷的大鼠的數目。使用標準化的解剖技術和程序，從定時懷孕的大鼠收穫用於移植的E14黑質組 織。在下列時間，測試黑質組織中細胞的存活力百分比1.解剖後立即和2.恰好移植前。 使用Molecular Probes的活細胞-死細胞試劑盒(目錄號L-3224)對分散的細胞進行存 活力測試。作出用於移植的黑質組織中的多巴胺能神經元的比例的評估。將切除神經的大鼠將分為3組(N >6)。在含有不同量的MANF的溶液中激發等量 的E14黑質組織，持續預定的時間段(Sortwell等人，2000)。每個小瓶含有500 μ 1待測試 的化合物。實驗將在接受測試物質的7天內進行。編碼的瓶用鋁箔包裹在大約4°C下保存 在冰箱中，直到使用。激發之後，將這些細胞移植到切除神經的新紋狀體中。經過在該工作的神經移植階段後的4-8周時間，測試動物的機能、行為恢復。然 後處死這些動物，以下源自3個實驗組的數據1.移植的神經元的存活百分比；2.移植的 多巴胺能神經元的存活百分比；和3.移植的多巴胺能神經元的發育程度，通過以下進行評 估a)多巴胺能神經元的大小(直徑)和b)神經軸突長出。實施例16 通過RT-PCR分析成年小鼠中的MANF表達在不同的解剖結構中，以及在發育的不同點分析小鼠組織(包括小鼠大腦)中的 MANF表達。使用擴增MANF片段的引物通過定量RT-PCR分析MANF表達。使用本領域公知 的標準方案，包括用於PCR循環的標準物和溫度。生成引物以擴增MANF的部分而產生長度 大於500bp的帶。結果如圖2顯示。成年小鼠大腦中的MANF表達的最高水平是在黑質致 密部(SNc)。這是大腦中的多巴胺神經元定位的位點。
權利要求
1.一種增強多巴胺能神經細胞的生長或存活的方法，包括與一種或多種另外的選自 以下的試劑組合向受試者施用治療有效量的成熟星形膠質細胞源性神經營養因子(MANF) MANF2、幹擾素Y、神經生長因子、表皮生長因子(EGF)、鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)、 神經原素、腦源性神經營養因子(BDNF)、甲狀腺激素、骨形態發生蛋白(BMP)、白血病抑 制因子(LIF)、音蝟因子、神經膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)、血管內皮生長因子 (VEGF)、白細胞介素、幹擾素、幹細胞因子(SCF)、活化素、抑制素、趨化因子、視黃酸和睫狀 神經營養因子(CNTF)及其組合。
2.一種增強多巴胺能神經細胞的生長或存活的方法，包括向受試者大腦的黑質區域施 用治療有效量的MANF。
3.一種增強多巴胺能神經細胞的生長或存活的方法，包括向受試者的腹側中腦區域施 用治療有效量的MANF。
4.根據權利要求2或3的方法，還包括施用一種或多種另外的選自以下的治療劑 MANF2、幹擾素Y、神經生長因子、表皮生長因子(EGF)、鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)、 神經原素、腦源性神經營養因子(BDNF)、甲狀腺激素、骨形態發生蛋白(BMP)、白血病抑 制因子(LIF)、音蝟因子、神經膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)、血管內皮生長因子 (VEGF)、白細胞介素、幹擾素、幹細胞因子(SCF)、活化素、抑制素、趨化因子、視黃酸和睫狀 神經營養因子(CNTF)及其組合。
5.根據權利要求4的方法，還包括向所述區域移植神經幹細胞。
6.根據權利要求1的方法，還包括向所述區域移植神經幹細胞。
7.一種治療帕金森氏病的方法，包括向患有帕金森氏病的患者施用有效量的MANF，從 而增加黑質中GABA能神經終端的GABA釋放。
8.一種治療帕金森氏病的方法，包括向患有帕金森氏病的患者施用有效量的MANF，從 而拮抗穀氨酸對多巴胺神經元的興奮性毒性作用。
9.病毒表達載體，包括包含能夠引導可操作地連接的多肽的表達的啟動子序列的多核 苷酸序列，所述多肽包括MANF多肽和能夠在哺乳動物細胞發揮功能的信號肽。
10.根據權利要求9的載體，所述載體選自HIV、SIV、FIV、EIAV、AAV、腺病毒、逆轉錄病 毒和皰疹病毒。
11.根據權利要求9的載體，其中，所述載體是複製缺陷型慢病毒顆粒。
12.—種治療中樞神經系統障礙的方法，所述方法包括向需要的個體的中樞神經系統 施用治療有效量的病毒表達載體，所述載體包括能夠引導可操作地連接的多肽的表達的啟 動子序列，所述多肽包括能夠在哺乳動物細胞中發揮功能的信號肽和人類、小鼠或大鼠的 MANF多肽。
全文摘要
本發明涉及治療神經病的方法和組合物。
文檔編號A61K38/17GK102083456SQ200980116306
公開日2011年6月1日 申請日期2009年3月25日 優先權日2008年3月25日
發明者J·康明辛格 申請人:阿姆拉特斯治療公司