用於對細胞進行空間分割以及篩選的組合物以及方法

2023-05-07 11:16:01

專利名稱：用於對細胞進行空間分割以及篩選的組合物以及方法
技術領域：
本發明提供了一種方法，用以在單獨的微型反應器中從變體細胞的文庫中對特定 的成員進行分離，其中對由所述的細胞編碼得到的生物分子所具有的表型進行評價，所述 的評價是以多種參數為基礎的，包括底物特異性以及動力學有效性。
背景技術：
酶越來越多的被用來作為催化劑用於工業，農業，醫藥產業以及科學研究中。由於 它們所具有的底物特異性，化學選擇性以及環境兼容性，酶在諸如下述的應用中提供了優 勢手性純化的醫藥品的合成，紡織品的加工，食品的加工，醫學的診斷以及治療，生物轉化 以及生物治理。在對高分子量聚合物進行修飾的方面，酶相較於傳統的化學加工而言所具 有的優越性已經被得以證實。對生物分子的遺傳變體的文庫所進行的評價，需要同時對所生成的所述生物分子 所具有的表型進行鑑定並且使所述的生物分子與編碼所述生物分子的文庫成員所具有的 基因型相互關聯起來，其目的在於對存在於所述文庫中的具有期望的性質的具體成員進行 識別，其中所述的生物分子例如是酶。通過這種方式，對期望的變體進行篩選並且對其進行 進一步的評價。定向進化已經被證實在下述情形中是格外成功的其中酶所具有的功能與 細胞的存活有直接的聯繫，即，對一種重要的活性進行的恢復，其中所述的活性已經從另外 一種野生型細胞中被刪除了。然而，當在所述的酶是糖基轉移酶(GTase)以及其他的轉移 酶的情形中時，這些本身不能夠提供一種可供篩選的表型的酶的進化要困難的多。儘管用 以對這種類型的酶進行進化的篩選策略確實存在，包括化學互補，噬菌體展示以及細菌細 胞表面展示，當前的方法不能夠提供一種容易得到的或者被歸納的策略，用以對多種多樣 的酶進行工程化處理。伴隨著對新的生物分子的需求的增長，對於新的策略存在迫切的需 求，其中所述的策略被用來對酶進行工程化處理，所述的酶具有改善的活性以及新的催化 功能。

發明內容
本發明提供了一種方法，用以在單獨的微型反應器中從變體細胞的文庫中對特定 的成員進行分離，其中對由所述的細胞編碼得到的生物分子所具有的表型或者活性進行評 價，所述的評價是以多種參數為基礎的，包括底物特異性以及動力學有效性。在一個方面，本發明涉及到用以對分泌產物的文庫進行篩選的組合物以及方法， 所述的篩選針對的是新的表型，包括具有改善的催化性質的酶或者改變的底物特異性的 酶，其中使用了微孔，用以對生成所述酶的細胞進行空間上的分割。在另外一個方面，本發明提供了用以在溶液相中實現生物分子的篩選的方法，例 如，定向進化的生物分子的篩選，所述的方法包括使一種細胞文庫沉積在一種微型裝置之 上，其中在所述的微型裝置中含有多個孔，所述的孔能夠對存在於溶液中的所述細胞進行 空間上的分割。所述的細胞以大約每孔一個細胞的水平分布，並且大量的細胞在所述的溶 液中分泌出至少一種生物分子的變體。將這些被分泌出來的生物分子的變體與至少一種光
4學信號底物進行接觸，每一種代表著一種期望的生物分子表型或者活性；並且以多種參數 為基礎，對由所述的細胞編碼得到的所述生物分子所具有的表型進行評價。在一些情形中， 所述的「光學信號底物」是一個或者多個單元的綜合體，例如，一種抗體或者其他的特異性 配體或者小分子標籤，它們與一種可探測性的標記物發生了直接的共軛。例如，在一個兩種 要素的反應中(例如，通過一種轉移酶催化的X+Y)，第一種要素，「Y」，受到一種抗體或者其 他配體的捕獲，其中所述的抗體或者其他配體被固定在一個表面例如一個培養板之上，並 且利用一種光學底物對所述的第二種要素，「X」，進行探測，其中所述的光學底物例如是一 種經過帶有螢光素標籤的抗體。在此之後，將分泌出一種期望的生物分子變體的所述細胞 從所述的微型裝置中分離出來。任選的，通過下述方式對所述的表型進行評價對一種或者多種光學信號隨時間 的變化進行探測，其中所述的光學信號是由存在於所述的細胞文庫之中的一種或者多種光 學信號底物產生的，其中這樣的變化代表著所述的生物分子的變體所具有的期望的生物 分子表型或者活性。本發明利用了各種不同的顯色底物，螢光底物，發光底物以及螢光共 振能量轉移(FRET)底物，用以對生物學活性進行測量。許多供體/受體螢光共振能量轉 移(FRET)對是可以通過商業購買獲得的。它們包括，但不局限於5_羧基四甲基若丹明 (TAMRA)/QSY-7( 二芳基若丹明的衍生物)；屍胺/曙紅；色氨酸/屍胺；螢光黃/德州粉紅 (若丹明)；萘/屍胺；屍胺/十八烷基若丹明(ODR)；硼-二吡咯亞甲基(BODIPY)/硼-二 吡咯亞甲基(BODIPY)；鋱/若丹明；屍胺/異硫氰酸螢光素(FITC)；嵌二萘(Pyrene)/香豆 素；5-(2_碘乙醯基氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(IAEDANS)/IAFBPE/Cy5 ；以及銪/Cy5。優 選的，所述的光學信號是一種螢光信號。在一個方面，在所述的微型裝置中以實時的方式或 者近似於實時的方式對所述的生物分子的表型或者活性進行監測，其中所述的監測是以所 述的螢光信號所具有的強度所發生的變化為基礎的。本發明提供的所述的生物分子是從由下述物質所組成的組中篩選出來的分泌得 到的分子，肽，多肽，酶例如蛋白酶，氧化還原酶，轉移酶，水解酶，氫化酶，裂解酶，異構酶， 連接酶，聚合酶，以及抗體，細胞因子，趨化因子，核酸，代謝產物，小分子(小於1千道爾頓) 以及合成分子。例如，所述的生物分子所具有的分子量超過大約100道爾頓(Da)並且小於 大約100000道爾頓。或者可供選擇的，所述的生物分子所具有的分子量超過大約600道爾 頓並且小於大約30000道爾頓；超過大約800道爾頓並且小於大約10000道爾頓；或者超過 大約900道爾頓並且小於大約1000道爾頓。在一種方法中，通過下述方式對所述的酶生物分子所具有的活性進行評價對所 述的酶或者其他的生物分子發揮作用的所述兩種或者多種要素的端點處進行探測。例如， 所述的酶將所述的要素連接在一起(例如，連接酶)或者對所述的要素進行分離(例如，裂 解酶)。正如上文中所描述的，探測是通過使用螢光共振能量轉移(FRET)對或者一種基於 捕獲的檢測來實現的，在所述的檢測中第一種要素是經過生物素化的(並且利用一種基於 親和素的試劑對其進行了捕獲)並且第二種要素被利用一種螢光素標籤進行了標記。所述 的要素(底物)在結合方面的增加或者減少反映出了所述的酶所具有的改變的結合特異性 /活性。本發明提供了對所述的生物分子所具有的表型進行的評價，其中所述的生物分子 是由所述的細胞編碼得到的，所述的評價是以多種參數為基礎的，其中所述的參數選自由下述的參數所組成的組中催化速率，反應特異性，動力學有效性，以及底物的結合親和性。 在另外一個方面，對速率或者底物耐受性，以及PH或者溫度耐受性進行了評價。優選的，所 述的參數是以平行的方式被進行評價的。本發明提供了對生物分子所進行的篩選，其中所述的生物分子是由細胞進行分泌 的。在一個方面，所述的細胞是真核細胞。優選的，所述的真核細胞是酵母細胞。或者可供 選擇的，所述的細胞是原核細胞。本發明同樣提供了一種微型裝置，所述的微型裝置中含有能夠對存在於溶液中的 所述細胞進行空間上的分割的孔，例如，在每一個孔內僅僅含有一個單一的細胞。優選的， 所述的孔所具有的直徑在大約10至大約100微米之間，例如，直徑為10微米，20微米，30 微米，50微米，或者75微米。在一個方面，本發明提供了一種將細胞從所述的微型裝置中進行的分離，其中所 述的細胞能夠分泌出一種期望的生物分子變體。優選的，通過利用玻璃毛細管的顯微操作 技術對所述的細胞進行分離。任選的，本發明提供了對所述的期望的生物分子進行的隨機 突變，用以進行進一步的篩選。用於進行隨機突變的適合的技術包括錯配聚合酶鏈式反應 (PCR)，密碼子盒式突變，脫氧核糖核酸(DNA)改組，交錯延伸方法(StEP)，化學突變以及增 變株的使用。或者可供選擇的，對所述的生物分子進行測序，用以識別所述的生物分子。被進行查看的生物分子包括酶。例如，所述的生物分子是一種突變的糖基轉移酶 (GTase)，碳水化合物加工酶，碳水化合物結合酶，糖苷酶，或者是一種結合有碳水化合物的 外源凝集素親和性蛋白質。優選的，所述的糖基轉移酶能夠與化學合成作用進行競爭，用於 進行複雜的碳水化合物的快速以及大規模的生產。或者可供選擇的，所述的生物分子是細 胞因子，趨化因子，抗體，或者其他分泌得到的細胞代謝產物。在另外一個方面，本發明提供了已有的糖基轉移酶的定向進化，從而對具有改變 的底物選擇性的更有潛力的催化劑進行識別。更為具體的，本發明提供了對突變的糖基轉 移酶的識別，其中所述的糖基轉移酶能夠與化學合成作用進行競爭，用於對糖共軛物進行 快速以及大規模的生產，其中所述的糖共軛物是用於治療目的的，包括基於碳水化合物的 癌症疫苗以及含有碳水化合物的抗生素。本發明所具有的其他特徵以及優點將通過下述對於其優選實施方式的說明並且 通過所述的權利要求而變得顯而易見。在本發明中引用的全部參考文獻均被引入作為參考。


附圖1是一種方法的示意圖，其中所述的方法被用來對具有新的功能或者改進的 功能的酶進行識別。酵母細胞在所述的微型反應器內分泌目標蛋白質。由於每一個細胞被 容納在其特有的孔內，每一個孔對應著一個單一的文庫成員。經過本發明所述的篩選之後， 所述的細胞被得以回收並且被用在下一輪的篩選中或者被用來進行所述編碼蛋白質的識 別。附圖2是一個示意圖，是對粘液素類型的氧-連接的多糖進行的描述。附圖3是一個示意圖，是對底物進行的描述，其中所述的底物被用來進行菸草 蝕刻病毒(TEV)的蛋白酶催化活性的探測，所述的底物含有一個二吡咯亞甲基二氟化硼(BODIPY)螢光團(F)以及一個四甲基若丹明(TAMRA)猝光劑(Q)。附圖4是一個示意圖，表示的是用來進行多肽N-乙醯基_ α -半乳糖基氨基轉移 酶(PPGalNAcTase)-Tl的催化活性的探測的底物。附圖5是一系列的圖表；㈧是一個示意圖，是對一種範例性的抗腫瘤疫苗進行的 描述；(B)是一個示意圖，表示的是一種範例性的抗寄生蟲疫苗；(C)是一個示意圖，是對一 種範例性的抗微生物疫苗進行的描述；並且(D)是一個示意圖，是對一種範例性的抗微生 物試劑進行的描述。附圖6是一個圖表，所述的圖表表示出的是對下述的糖基轉移酶所進行的結構的 比較BTG，MurG,以及 GtfB。附圖7是一個示意圖，表示的是用於酶工程學以及催化劑發展的定向進化。附圖8A是一個示意圖，描述的是一種使蛋白質與分泌蛋白質的所述細胞相互關 聯的方法，在所述的方法中，底物/產物被捕獲至與其發生接觸的玻璃表面之上；(B)是一 個裝置的照片，在所述的裝置中含有直徑在50至100微米之間的孔；(C)是一個蛋白質微 陣列的顯微鏡照片，所述的蛋白質微陣列是分泌產物的蛋白質微陣列，其中所述的分泌產 物來自於巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)細胞；並且(D)是存在於微孔之中的巴斯德 畢赤酵母(Pichia pastoris)細胞的顯微鏡照片。附圖9是一個標準曲線的顯微鏡照片，用於對不同的細胞類型之間的蛋白質 分泌水平進行比較，其中所述的細胞類型例如是，雜種細胞，巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)，以及分泌細胞因子的外周血單核細胞(PBMC)。附圖10是一系列的顯微鏡照片，證實的是使用一種顯微操作器進行的細胞回收。附圖11是一個圖表，表示的是一種用以探測微孔中的酶的轉換的方法，其中所述 的方法是經由一種胰島素斷裂檢測來實現的。附圖12是一系列的顯微鏡照片，證實的是在微孔內利用10微克/毫升的異硫氰 基螢光素(FTC)-酪蛋白對增加濃度(0. 05微克/毫升，0. 5微克/毫升，以及5微克/毫 升)的胰島素進行1小時的培養之後所得到的螢光信號的強度。附圖13是一系列的顯微鏡照片，描述的是在微孔內利用10微克/毫升的異硫氰 基螢光素(FTC)-酪蛋白對0. 5微克/毫升的胰島素進行1小時以及18小時的培養之後所 得到的螢光信號的強度。附圖14是一個圖表，表示的是一種用以探測微孔中的酶的轉化的方法，其中所述 的方法是經由一種人鼻病毒-3C(HRV-3C)蛋白酶檢測來實現的。附圖15是一系列的顯微鏡照片，表示的是在室溫(RT)條件下，在100微克/毫升 的螢光共振能量轉移(FRET)肽的培養之後，所述的人鼻病毒-3C(HRV-3C)蛋白酶檢測所得 到的結果，其中所述的培養是在含有培養基(YPD培養基)的1倍的反應緩衝液中進行的。
具體實施例方式由於酶所具有的底物特異性，化學選擇性以及環境兼容性，它們在諸如下述方面 的應用中提供了優勢手性純化的醫藥品的合成方面，其中所述的醫藥品被用來進行醫學 診斷以及治療。的確，這樣的酶可以被利用在所述的寡糖以及糖共軛物的合成之中，其中所 述的寡糖以及糖共軛物具有多種多樣的醫學應用，包括抗腫瘤疫苗(作用於，例如，神經節苷脂(GM3)，一種與惡性黑素瘤相關的鞘糖脂)抗寄生蟲疫苗(作用於，例如，瘧疾糖基磷脂 醯環己六醇(糖基磷脂醯肌醇錨定區))，抗微生物疫苗(作用於，例如，莢膜多糖抗原流行 性感冒嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)血清型b (HIB))，以及其他的抗微生物試劑。 範例性的抗腫瘤疫苗，抗寄生蟲疫苗，抗微生物疫苗，以及抗微生物試劑分別在附圖5A-5D 中進行了表示。糖基化的生物分子的使用不僅僅需要在結構與功能之間的相互關係方面的 深入知識，同樣需要獲取用於大規模的臨床使用的精確的結構。儘管許多野生型的酶(即，那些胺基酸序列與在天然存在的有機體中發現的氨基 酸序列相同的酶)可以在不進行任何修飾的條件下被進行使用，在許多情形中一種酶所具 有的物理性質或者它的化學活性不能夠與一種期望的應用相兼容。可能是令人期望的新的 物理性質可能包括，例如，熱穩定性，對非水性溶劑、鹽類、金屬、抑制劑、蛋白酶、極端PH值 的抗性以及類似的性質。降低酶的大小，廢除其對於輔助因子或者其他蛋白質的依賴，改善 其在所述的宿主菌株中的表達以及其他類似的變化對於一種特定的應用而言同樣可能是 令人期望的。改進的化學活性可能包括，例如，增加的催化速率，底物親和性以及特異性，區 域選擇性，對映選擇性，降低的產物抑制作用，或者一種改變的PH活性曲線。除此之外，對 一種或者多種酶所具有的作為一種代謝途徑的一部分而共同發揮功效的性質進行改變同 樣可能是令人期望的。伴隨著對於具有改善的活性以及新的催化功能的酶的需求的增長，已經研發出新 的方法，用以從一種蛋白質變體的池中對一種期望的催化劑進行分離。定向進化已經被證 實在下述情形中是格外成功的其中酶所具有的功能與細胞的存活有直接的聯繫，即，對一 種重要的活性進行的恢復，其中所述的活性已經從另外一種野生型細胞中被刪除了。然而， 當在所述的酶是糖基轉移酶(GTase)以及其他的轉移酶的情形中時，這些本身不能夠提供 一種可供篩選的表型的酶的進化要困難的多。在這裡所描述的本發明之前，沒有方法能夠 提供一種容易得到的或者被歸納的策略，用於對多種多樣的酶進行工程化處理。所述的經過分離的生物分子是經過純化的天然存在的、合成製造的、或者重組的 化合物，例如，多肽，核酸，小分子，或者其他的試劑。純化的化合物為具有至少60%重量 (乾重)的目標化合物的化合物。優選的，所述的製品具有至少75%、更優選的至少90%、 並且最為優選的至少99 %重量的目標化合物。可以通過任何適宜的標準方法對純度進行測 量，所述的方法例如是，通過柱層析法，聚丙烯醯胺凝膠電泳法，或者高效液相色譜(HPLC) 分析。「純化的」或者「本質上純化的」意味著一種生物分子或者所述生物分子的生物學活 性部分中本質上不含有來源於所述的細胞或者組織來源的細胞物質或者其他的汙染性大 分子，其中所述的汙染性大分子例如是多糖，核酸，或者蛋白質，所述的細胞或者組織來源 指的是獲得所述的生物分子的細胞或者組織。所述的術語「本質上純化的」同樣包括這樣 的一種生物分子，在所述的生物分子中本質上不含有化學前體或者化學合成時的其他化學 試劑。所述的語言「本質上不含有細胞物質」包括這樣的生物分子製品，所述的生物分子制 品是與所述細胞的細胞組分分離的，其中所述的生物分子是從所述的細胞中分離出來的。用於酶工程學以及催化劑研發的定向進化在附圖7中表示出的是用於酶工程學以及催化劑研發的定向進化發明的示意圖。 本發明提供了通過一種已有的酶骨架突變/生成新的活性的能力，這種能力是通過重複輪 回的突變以及篩選來實現的。正如將在下文中詳細描述的，存在許多技術用於對所期望的
8生物分子進行隨機的突變，用於進一步的篩選。同樣存在許多合適的方法用於進行篩選。本 領域技術人員將能夠理解，可以根據所述的生物分子所能夠獲得的結構信息的量來選擇一 種具體的技術，其中所述的生物分子例如是一種目標蛋白質。當選擇了一種單獨的技術時， 在維持高通量的同時，對存在於基因型以及表型之間的聯繫進行維持，是至關重要的。篩選策略在這裡所描述的發明提供了一種可自動化的、高通量的方法，用以對一種細胞編 碼得到的生物分子所具有的表型進行評價，其中所述的評價是以多種參數為基礎的，所述 的參數包括底物特異性以及動力學有效性。這種一般性的策略允許使用天然底物或者具有 最低的混亂程度的底物對多種多樣的酶進行體外篩選。所述的目標酶是通過所述的細胞機 構製造得到的。或者可供選擇的，本發明同樣提供了在溶液中對其他分泌得到的生物分子 所進行的篩選，所述的篩選針對的是一種期望的表型，其中所述的生物分子包括細胞因子， 趨化因子，抗體，以及代謝產物。對生物分子的遺傳變體的文庫所進行的評價，需要同時對所生成的所述生物分子 所具有的表型進行鑑定並且使所述的生物分子與編碼所述生物分子的文庫成員所具有的 基因型相互關聯起來，其目的在於對存在於所述文庫中的具有期望的性質(催化速率，反 應特異性，底物結合親和性)的具體成員進行識別，其中所述的生物分子例如是酶。通過這 種方式，對期望的變體進行篩選並且對其進行進一步的評價。對所述的生物分子所具有的 表型與生成其的所述細胞所具有的基因型之間進行的相互關聯是具有挑戰性的。本發明提 供了一種方法，用以在單獨的微型反應器內從變體細胞的文庫中對特定的成員進行分離， 其中對由所述的細胞分泌出的生物分子所具有的表型進行評價，所述的評價是以多種參數 為基礎的，包括底物特異性以及動力學有效性。對所述的文庫成員所進行的空間分割允許 對每一種進行平行的評價，並且從所述的微型反應器中對表現出期望特徵的成員進行後續 的回收，用於進行進一步的分析。這種技術的一種重要的應用在於對多種多樣的酶進行的 定向進化，其中所述的酶被用來進行生物分子的體外構建。一個例子是一種用於對變異的 糖基轉移酶進行識別的方法，其中所述的糖基轉移酶利用完全的化學控制將糖從活化的供 體分子轉移到適宜的受體中去。這樣的酶能夠與化學合成方法進行競爭，用來進行複雜的 碳水化合物的快速並且大規模的生產。當對來自於一個酶的變體文庫中的酶進行進化時，一種用以將一種令人期望的表 型與基因型進行聯繫的簡單策略是必要的。對存在於各個間隔內的文庫成員所進行的空 間分割允許對具有獨特性質的所述變體進行識別，而不需要進行底物的吸收或者表面的吸 附。出於那樣的原因，在這裡所描述的本發明使用微製造的小室對細胞文庫進行分 離，其中所述的細胞例如是酵母細胞，所述的細胞中的每一個均分泌一種目標蛋白質的變 異版本(附圖1)。通過軟光刻法以及複製成形來製造所述的可模壓的厚板，其中所述的厚 板是利用聚二甲基矽氧烷製成的並且是一種具有生物兼容性的材料，所述的材料是無毒的 並且是具有氣體滲透性的。一些材料所具有的硬度將不允許其進行共形接觸，並且因此將 所述的微孔密封在底物之上，用來以平行的方式對生成的所述抗體所具有的特異性進行測 試，其中所述的材料例如是聚苯乙烯。然而，聚二甲基矽氧烷(PDMS)是一種適合用於這種 技術的材料，因為它沒有毒性，它是具有氣體滲透性的，並且它可以輕易的被壓縮從而形成一種緊密的，但是具有可逆性的，與一種剛性底物所形成的密封。這樣的一種密封能夠延緩 或者防止存在於所述的可模壓的厚板之中的任何的液體和/或細胞發生滲漏或者漏出。被限制在微孔內並且利用載玻片進行密封的細胞(這樣一來可以利用的總體的 介質被限定到所述的微孔所具有的體積)被粗略的以每個孔中一個細胞的水平分配在一 種裝置中，其中在所述的裝置中含有直徑為50微米的孔。附圖8C描述的是一種來自於單 個的巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)細胞的蛋白質微陣列，而附圖8D表示出的是能夠 分泌出在8C中的所述蛋白質微陣列的細胞。使表達一種人類Fc的巴斯德畢赤酵母細胞在 YPD培養基上進行過夜生長。之後將細胞粗略的以每孔一個細胞的水平裝載於一個聚二甲 基矽氧烷(PDMS)微型裝置中，其中在所述的微型裝置中含有50微米的孔。將所述的微型 裝置與一個載玻片進行接觸，其中所述的載玻片經過了山羊抗人類Fc抗體的預處理，用以 對所分泌的Fc進行捕獲。上述經過分泌的蛋白質在90分鐘的時間內被捕獲並且使用一種 Cy5共軛的山羊抗人類免疫球蛋白H+免疫球蛋白L抗體對上述得到的陣列進行讀取。利用 一種作用於酵母細胞表面的螢光素染料對存在於所述的微孔之中的所述巴斯德畢赤酵母 細胞進行成像。附圖9表示出的是與其他的細胞類型相比較而言巴斯德畢赤酵母所分泌的 蛋白質水平如何，其中所述的其他的細胞類型例如是雜種細胞，以及分泌細胞因子的外周 血單核細胞(PBMC)。使用經過純化的人類Fc生成這種標準曲線，並且將觀察到的所述的強 度數值用來對所述分泌物的確定的濃度進行指定，其中所述的分泌物是從各個細胞中捕獲 得到的。在巴斯德畢赤酵母細胞中觀察到的被分泌蛋白質所具有的劑量大大超出了所述檢 測的探測極限並且應當在微孔中提供了足夠的濃度水平，用以進行所述補充的酶底物的轉 換。這些試驗證實了探測分泌產物的能力，其中所述的分泌產物來自於各個酵母細胞。同 樣可以參見，Love等人於2006年在Nat. Biotechnol《自然生物技術》24(6) :703_707中發 表的文章；WO 2007/035633。在一種特定的實施例中，利用酶底物對一種被隔離的酵母細胞文庫進行查看，其 中在發生成功的酶的轉換時所述的酶底物能夠產生一種螢光信號。由於所述的信號所具有 的強度與產物的形成直接相關，除了底物特異性之外，對文庫成員直接進行酶動力學方面 的比較，其中所述的比較是經由實時螢光性監測的方式來實現的。使用顯微操作技術對來 自於螢光性孔內的克隆物進行回收並且將其用於下一輪的進化以及篩選之中。在附圖10 中表示出的是使用一種顯微操作器進行的細胞的回收。經過利用一種顯微操作器進行的回 收之後，酵母的存活能力為40-60%。用於對酶進行改進的突變技術能夠編碼胺基酸的變化的突變可以被有效的用來生成新的酶活性。可以使用本 領域技術人員已知的任何方法來獲得所述的基因，例如，通過從一種給定的有機體的基因 組文庫中進行克隆物的分離的方法，通過對基因組脫氧核糖核酸(DNA)或者信使核糖核酸 (mRNA)的來源進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增的方法，或者通過來自於一種表達克隆物文 庫的方法，其中所述的克隆物來自於一種DNA的異源混合物，所述的DNA異源混合物來自於 未經過培養的環境微生物(參見美國專利No. 5958672)。對於本領域技術人員而言，存在許 多種熟知的方法，用以對編碼所述酶以及其他的非催化性蛋白質以及肽的基因進行突變。 這些方法同時包括有理數的(rational)技術(例如，通過定點突變來生成點突變體或者點 突變組)以及隨機的技術(例如，隨機突變，組合突變以及重組)。一種有理數的設計，被稱為蛋白質自動化設計，利用一種運算法則對可能實現一種期望的摺疊的蛋白質序列進行客 觀的預測。一種類型的技術是那些依賴於點突變的技術，例如，錯配聚合酶鏈式反應以及寡 核苷酸定向突變(參見Cadwell以及Joyce於1992年在PCR Methods Applic.《聚合酶 鏈式反應的方法以及應用》2 28-33中發表的文章；Kegler-Ebo DM等人於1994年在Nuc Acids Res《核酸研究》22(9) 1593-1599中發表的文章)。這些方法導致了一種酶文庫的 生成，在所述的酶文庫中含有這樣的成員，所述的成員在一種給定的蛋白質中的一個具體 位置上具有20種不同的胺基酸中的任意一種。隨機方法包括，例如，化學突變(參見Singer以及Kusmierek於1982年在Annu Rev Biochem《生物化學年度回顧》51 :655_93中發表的文章)，遞歸集成突變(參見Arkin 以及Youvan於1992年在Proc Natl Acad Sci USA《美國科學院院刊》89 (16) :7811_5中 發表的文章；Delagrave等人於1993年在Protein Eng《蛋白質工程》6 (3) :327_31中發表 的文章)，指數集成突變(參見Delagrave以及Youvan於1993年在Biotechnology《生物 技術》11(13) 1548-52中發表的文章)，順序隨機突變(參見Chen以及Arnold於1991年 在Biotechnology《生物技術》9 (11) 1073-7中發表的文章；Chen以及Arnold於1993年 在Proc Natl Acad Sci USA《美國科學院院刊》90 (12) :5618_22中發表的文章)，DNA改組 (參見 Stemmer 於 1994 年在 Proc Natl Acad Sci USA《美國科學院院刊》91 (22) 10747-51 中發表的文章；Stemmer於1994年在Nature《自然》370 (6488) :389_91中發表的文章)以 及類似的方法。重組是一種有效的隨機突變技術，其中DNA發生分解並且在新的組合中進 行了重新的結合。DNA改組，是已知的最佳重組方法，允許在多個需要被組合的基因中形成 有效的突變(參見Stemmer WPC等人於1994年在Nature《自然》370 :389_391中發表的 文章)。交錯延伸方法(StEP)是一種簡單並且有效的方法，用以對多核苷酸序列進行體外 的突變以及重組(參見Zhao H等人於1998年在Nature Biotechnol《自然生物技術》16: 258-261中發表的文章)。其他的突變技術包括化學突變以及所述的增變株的使用(參見 Lai Y等人於2004年在Biotech Bioeng《生物技術與生物工程》86 622~627中發表的文 章；Coia G等人於1997年在Gene《基因》201 203-209中發表的文章)。這些技術可以被 進行單獨的使用或者組合的使用，用以製造突變體。將表達所期望的酶或者蛋白質的DNA從所述的表達文庫中分離出來並且對其進 行測序。通過對所述的突變步驟以及篩選步驟的重複，新的酶以及其他的蛋白質被人工的 建立起來。這種重複的過程被認為是定向進化。所述的目標基因不必要在質粒上被進行表 達。在一個方面，經過在所述的宿主染色體內的整合之後，它們被進行表達，或者作為一種 基因的染色體拷貝的突變結果而使它們進行表達。在另外一個方面，在不存在突變的情況 下建立高複雜性的表達文庫。這可以通過對來自於一種來源的DNA進行克隆以及表達的方 式來完成，其中在所述的來源中已經含有大量不同的序列，所述的DNA例如是高異源性的 基因組DNA，其來自於環境微生物的混合物。表達文庫的活性篩選在本發明中描述的所述方法允許對所述的生物分子進行功能方面的檢測。在一個 方面，對於所期望的生物學活性的篩選是通過使用核酸適配體來實現的，其中所述的核酸 適配體即，能夠與一種特異性的靶向分子進行結合的寡核酸或者肽分子。在另外一個方面，對於所期望的生物學活性的篩選是通過使用一種溶液相的基於螢光共振能量轉移(FRET) 的檢測來實現的，所述的檢測是利用螢光團性質的底物在所述的微型裝置的微孔內進行 的。在另外一個方面，生物學活性是經由固體支撐的螢光性(或者螢光共振能量轉移)來 進行檢測的，其中使用抗體將底物/產物捕獲在與其發生接觸的所述的玻璃表面之上。優 選的，一種或者多種所述的底物是螢光性的。在另外一個方面，對於所期望的生物學活性的 篩選是經由固體支撐的親和性捕獲來實現的，其中一種或者多種底物被進行了進一步的衍 生，其中所述的衍生是使用一種化學反應或者酶反應(即，「點擊化學」，轉肽酶標籤，BirA 生物素化，等等)利用一種螢光團來實現的。或者可供選擇的，使用一種固體支撐的基於抗 體的螢光性讀數器對所述的生物分子所具有的功能進行檢測，其中兩種底物均具有親和性 標籤，並且在一種夾心酶聯免疫吸附檢測(ELISA)形式中對所述的產物進行探測。優選的， 所述的二級抗體與一種螢光團發生了共軛。在一個方面，對所期望的生物學活性所進行的篩選是通過下述方式來完成的將 表達所述酶的所述宿主細胞與一種顯色性化合物或者螢光性化合物進行接觸，並且對在所 述的細胞內或者在它們周圍所發生的顏色的生成進行監測，其中所述的顯色性化合物或者 螢光性化合物是適合用於所述的酶反應之中的。在美國專利No. 5914245描述的所述固相 檢測中，這些化合物被稱為光學信號底物，因為當它們與活化的酶或者與一種所述酶反應 中的產物發生接觸時，能夠在吸光率、反射比、螢光性或者發光性方面產生一種可以測量的 變化。本發明提供了各種不同的顯色性、螢光性、發光性以及螢光共振能量轉移(FRET) 底物，用以對生物學活性進行測量。通常情況下，螢光團能夠在一種波長條件下吸收電磁 能量並且在另外一種波長條件下放射出電磁能量。代表性的螢光團包括，但不局限於，1， 5 5- (2-碘乙醯基氨基乙基)氨基萘-1-磺酸；1，8-ANS ；4-甲基傘形酮；5-羧基-2，7- 二 氯螢光素；5-羧基螢光素(5-FAM) ；5-羧基萘基螢光素；5-羧基四甲基若丹明(5-TAMRA)； 5-FAM(5-羧基螢光素)；5-HAT(羥色胺)；5-羥色胺(HAT) ；5-R0X(羧基-X-若丹明)； 5-TAMRA(5-羧基四甲基若丹明)；6-羧基若丹明6G ；6-CR 6G ；6-JOE ；7-氨基-4-甲基香 豆素；7-氨基放線菌素D (7-AAD) ；7-羥基-4-甲基香豆素；9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖 啶；ABQ ；酸性品紅；ACMA(9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶)；吖啶橙；吖啶紅；吖啶黃；叮啶 黃；Acriflavin Feulgen SITSA ；水母素(發光蛋白質)；AFP-自動螢光蛋白_(Quantum Biotechnologies)參見sgGFP(超級發光綠色螢光蛋白)，SgBFP(超級發光藍色螢光蛋 白)；Alexa Fluor 350. TM. ；Alexa Fluor 430. TM. ；Alexa Fluor 488. TM. ；Alexa Fluor 532. TM. ；Alexa Fluor 546. TM. ；Alexa Fluor 568. TM. ；Alexa Fluor 594. TM. ；Alexa Fluor 633. TM. ；Alexa Fluor 647. TM. ；Alexa Fluor 660. TM. ；Alexa Fluor 680. TM.； 茜素氨羧絡合劑；茜素紅；別藻藍蛋白(APC) ；AMC，AMCA-S;AMCA(氨基甲基香豆素)；氨 基甲基香豆素-X ；氨基放線菌素D ；氨基香豆素；氨基甲基香豆素(AMCA) ； Anilin Blue； anthrocyl stearate ；APC(別藻藍蛋白)；別藻藍蛋白-Cy7 ；APTRA-BTC ；APTS ；陽離子豔紅 4G ；鹼性橙 R ；還原紅 6B ；陽離子黃 7GLL ；阿的平；ATTO-TAG. TM. CBQCA ；ATTO-TAG. TM. FQ ； 金胺；Aurophosphine G ；Aurophosphine ；BAO 9(雙氨基苯基惡二唑)；BCECF(高 pH)； BCECF(低pH)；硫酸黃連素；β -內醯胺酶；BFP藍色螢光蛋白轉換的綠色螢光蛋白(GFP) (Υ66Η)；藍色螢光蛋白；藍色螢光蛋白/綠色螢光蛋白螢光共振能量轉移(BFP/GFP FRET)；Bimane ；二苯甲醯胺；二苯甲亞醯胺(赫斯特螢光染料)(Hoechst) ；bis-BTC ；布蘭科福爾 螢光增白劑FFG ；布蘭科福爾螢光增白劑SV ；Β0Β0. TM. -1 ；Β0Β0. TM. -3 ；氟硼熒492/515 ； 氟硼熒493/503 ；氟硼熒500/510 ；氟硼熒505/515 ；氟硼熒530/10 ；氟硼熒542/563 ；氟 硼熒18/568 ；氟硼熒564/517 ；氟硼熒576/589 ；氟硼熒581/591 ；氟硼熒630/650-X ；氟 硼熒665/676;氟硼熒FI;氟硼熒FI ATP ；氟硼熒FI-神經鞘氨醇；氟硼熒R6G SE ；氟硼 熒TMR ；氟硼熒TMR-X共軛物；氟硼熒TMR-X，SE ；氟硼熒TR ；氟硼熒TR ATP ；氟硼熒TR-X SE ；BO-PRO. TM. -1 ；BO-PRO. TM. -3 ；Brilliant Sulphoflavin FF ；BTC ；BTC-5N ；鈣黃綠素； 鈣黃綠素藍；鈣紅TM.；鈣綠；鈣綠-1 Ca. sup. 2+染料；鈣綠-2 Ca. sup. 2+ ；鈣綠_5NCa. sup. 2+ ；鈣綠-C18 Ca. sup. 2+ ； 丐橙；Calcofluor White ；羧基 _X_ 若丹明(5-R0X)； Cascade Blue. TM. ；Cascade Yellow ；兒茶酚胺；CCF2 (GeneBlazer) ；CFDA ；CFP-青色熒 光蛋白；青色螢光蛋白/黃色螢光蛋白螢光共振能量轉移(CFP/YFP FRET)；葉綠素；色黴 素A ；色黴素A ；CL-NERF ；CMFDA ；腔腸素；腔腸素cp ；腔腸素f ；腔腸素fcp ；腔腸素h ；腔腸 素hep ；腔腸素ip ；腔腸素η ；腔腸素0 ；香豆素鬼筆菌；C-藻青素；CPM甲基香豆素；CTC ； CTC 氰基甲；Cy2. TM. ；Cy3. 18. ；Cy3. 5. TM. ；Cy3. TM. ；Cy5. 18 ；Cy5. 5. TM. ；Cy5. TM. ；Cy7. TM.；青綠色螢光蛋白；環狀AMP螢光傳感器(FiCRhR) ；Dabcyl ；丹磺醯；丹磺醯胺；丹磺醯 屍胺；丹磺醯氯；丹磺醯基DHPE ；丹磺醯氟；4』，6-聯脒基-2-苯基吲哚(DAPI) ；Dapoxyl ； Dapoxy 2 ；Dapoxyl 3，DCFDA ;DCFH(二氯二氫螢光素雙乙酸鹽)；DDA0 ;DHR(二氫若丹 明 123) ；Di-4-ANEPPS ;Di-8-ANEPPS(無比例)；DiA(4_Di-16_ASP) ；二氯二氫螢光素雙 乙酸鹽(DCFH)；吲哚一羰菁染料(DiD)-親脂性示蹤劑；噴哚一羰菁染料(DiIClS (5))； DIDS ；二氫若丹明 123 (DHR) ；Dil (DilC18 (3)) ；二硝基苯酚；DiO(Di0C18 (3))；吲哚三羰花 青(DiR)；吲哚三羰花青(DiR) (DiIC18(7)) ；DM-NEFR(高 pH) ；2，4_ 二硝基苯酚(DNP)； 多巴胺；DsRed ；DTAF ；DY-630-NHS ；DY-635-NHS ；增強型藍色螢光蛋白(EBFP)；增強型青 色螢光蛋白(ECFP)；增強型綠色螢光蛋白(EGFP) ；ELF 97 ；曙紅；赤蘚紅；赤蘚紅ITC ；溴 化乙錠；溴乙啡錠二聚體-I(EthD-I)；吖啶橙；EukoLight ；三氯化銪；增強型黃色螢光蛋 白(EYFP)；固藍；FDA5Feulgen(鹼性副品紅)；FIF(甲醛化作用誘導的螢光素)；異硫氰 基螢光素(FITC) ；Flazo Orange ;Fluo_3 ;Fluo_4 ；螢光素(異硫氰基螢光素)；二乙酸 螢光素；螢光翡翠綠；螢光金(羥芪巴脒)；紅色螢光金；FluorX ；FM 1-43. TM. ；FM 4-46 ； Fura Red. TM.(高pH) ；Fura Red. TM. /Fluo-3 ；Fura-2 ；Fura-2/BCECF ；Genacryl Pink 3G ； Genacryl Yellow 5GF ；GeneBlazer(CCF2)；綠色螢光蛋白(S65T)；紅色轉換的綠色螢光 蛋白(rsGFP)；綠色螢光蛋白野生型；非紫外線(UV)激發(野生型綠色螢光蛋白)；綠色 螢光蛋白野生型；紫外線激發(野生型綠色螢光蛋白)；GFPuV;Gl0Xalic Acid;粒藍；血 卟啉；赫斯特螢光染料33258 ；赫斯特螢光染料33342 ；赫斯特螢光染料34580 ；HPTS ；羥 基香豆素；羥芪巴脒(螢光金)；羥色胺；吲哚-1，高鈣；吲哚-1，低鈣；吲哚一羰菁染料 (DiD) ； Intrawhite Cf ； JC-I J0-J0-1 J0-RP0-1 ；LaserPro ；Laurodan ；LDS 751 (DNA)； LDS 751 (RNA)；雷可福螢光增白劑PAF ；雷可福螢光增白劑SF ；雷可福螢光增白劑WS ；麗 絲胺若丹明；麗絲胺若丹明B ；鈣黃綠素/溴乙啡錠二聚體；L0L0-1 ；L0-PR0-1 ；Lucifer Yellow ；溶酶體示蹤劑藍色螢光探針；溶酶體示蹤劑藍白色螢光探針；溶酶體示蹤劑綠色 螢光探針；溶酶體示蹤劑紅色螢光探針；溶酶體示蹤劑黃色螢光探針；溶酶體傳感器藍 色螢光探針；溶酶體傳感器綠色螢光探針；溶酶體黃色/藍色螢光探針；Mag Green ；蘇丹紅(根皮紅 B) ；Mag-Fura Red ；Mag-Fura-2 ；Mag-Fura-5 ；Mag-Indo-I ；鎂綠；鎂橙；孔 雀綠；海藍；Maxilon Brilliant Flavin 10 GFF ；MaxiIon Brilliant Flavin 8 GFF ； Merocyanin ；甲氧基香豆素；Mitotracker Green M ；Mitotracker Orange ；Mitotracker Red ；光輝黴素；單溴二胺；單溴二胺(mBBr-GSH)；單氯二胺；MPS(甲基綠派若寧均二苯 代乙烯)；NBD ；NBD Amine ；尼羅紅；Nitrobenzoxadidole ；去甲腎上腺素；核快紅；核黃； Nylosan Brilliant lavin E8G ；俄勒岡州綠；俄勒岡州綠488-X ；俄勒岡州綠TM.；俄勒岡 州綠TM. 488 ；俄勒岡州綠TM. 500 ；俄勒岡州綠TM. 514 ；海水藍；鹼性副品紅(Feulgen)； PBFI ；PE-Cy5 ；PE_Cy7 ；PerCP ；PerCP-Cy5. 5 ；PE-德州粉紅紅 613；根皮紅 B (蘇丹紅)； Phorwite AR ；Phorwite BKL ；Phorwite Rev ；Phorwite RPA ；磷化氫 3R ；光致抗蝕劑；藻紅 蛋白 BPE；藻紅蛋白 R [PE] ；PKH26(Sigma) ；PKH67 ；PMIA ；Pontochrome Blue Black ； POPO-I ； P0P0-3 ；PO-PRO-I ； P0-PR0-3 ；櫻草黃；活性黃；碘化丙啶(PI) ；PyMPO ；芘；派若 寧；派若寧 B ;Pyrozal Brilliant Flavin 7GF ； QSY 7;喹丫咽氮鹼；紅 61PE-德州 粉紅；試滷靈；RH 414 ；若丹明-2 ；若丹明；若丹明110 ；若丹明123 ；若丹明5GLD ；若丹 明6G;若丹明B;若丹明B 200;若丹明B extra ;若丹明BB ；若丹明BG ；若丹明綠；若丹 明Phallicidine ；若丹明Phalloidine ；若丹明紅；若丹明WT ；孟加拉紅；R-藻青素；R-藻 紅蛋白(PE)；紅色轉換的綠色螢光蛋白(rsGFP) ；S65A;S65C;S65L;S65T;藍寶石綠色熒 光蛋白；SBFI ；羥色胺；Sevron Brilliant Red 2B ；Sevron Brilliant Red 4G ；Sevron Brilliant Red B ；Sevron Orange ；Sevron Yellow L ；超級發光的藍色螢光蛋白.TM.； sgBFP. TM.(超級發光的藍色螢光蛋白)；超級發光的綠色螢光蛋白.TM. ；sgGFP. TM.(超級 發光的綠色螢光蛋白)；SITS;SITS(櫻草黃)；SITS(均二苯代乙烯異硫代硫酸)；SNAFL 鈣黃綠素；SNAFL-I ；SNAFL-2 ；SNARF鈣黃綠素；SNARFl ；鈉綠；光譜淡綠；光譜綠；光譜橙； 光譜紅；SPQ(6-甲氧基-N-(3-硫丙基)喹啉)；均二苯代乙烯；磺醯基若丹明B can C； 磺醯基若丹明 Extra ；SYTO11 ；SYTO12 ；SYTO13 ；SYTO14 ；SYTO15 ；SYTO16 ；SYTO17 ；SYTO18 ； SYT020 ；SYT021 ；SYT022 ；SYT023 ；SYT024 ；SYT025 ；SYT040 ；SYT041 ；SYT042 ；SYT043 ； SYT044 ；SYT045 ；SYT059 ；SYT060 ；SYT061 ；SYT062 ；SYT063 ；SYT064 ；SYT080 ；SYT081 ； SYT082 ； SYT083 ； SYT084 ； SYT085 ； SYTOX 藍；SYTOX 綠；SYTOX 橙；四環素；四甲基若丹明 (TRITC)；德州粉紅.TM.；德州粉紅-X. TM.共軛物；Thiadicarbocyanine (DiSC3)；噻嗪紅 R ；噻嗪橙；硫代香豆素5 ；硫代香豆素S ；硫代香豆素TCN ；Thiolyte ；ThioZole Orange ； Tinopol CBS(Calcofluor White) ；TMR；TO-PRO-I ；T0-PR0-3 ；T0-PR0-5 ；TOTO-I ；T0T0-3 ； Tricolor (PE-Cy5) ；TRITC四甲基若丹明硫氰酸鹽；不退色藍；不退色紅；Ultralite ； UranineB ；Uvitex SFC ；野生型綠色螢光蛋白；Wff 781 ；X-若丹明；XRITC ；二甲苯橙；Y66F ； Y66H ；Y66W ；黃綠色螢光蛋白；黃色螢光蛋白；Y0-PR0-1 ；Y0-PR0-3 ；YOYO-1 ；Y0Y0-3 ；Sybr Green，噻唑橙(內在的螯合染料)，半導體納米粒子例如量子點，或者被囚禁的螢光團(其 可以利用光或者其他的電磁能量來源而被活化)或者是它們的組合。
很多各種不同的適宜的供體(D)以及受體(A)螢光團是可以通過商業購買獲得 的，這些供體以及受體螢光團是適合被用在螢光共振能量轉移(FRET)中的。對於所述的探 針對所進行的選擇受到下述因素的影響系統的約束，以及在所期望的應用中所使用到的 肽所具有的長度以及序列。所述的肽所具有的長度以及序列將能夠對用於進行所述探針的 連接的標記位點產生影響。存在於所述的連接位點之間的距離將能夠對所述的供體/受體對的選擇產生影響，這歸因於所述的螢光共振能量轉移(FRET)所具有的距離依賴性。許多 供體/受體對是可以通過商業購買獲得的。這些包括，但不局限於，5-羧基四甲基若丹明 (TAMRA)/QSY-7( 二芳基若丹明的衍生物)；屍胺/曙紅；色氨酸/屍胺；螢光素/德州粉紅 (若丹明)；萘/屍胺；屍胺/十八烷基若丹明(ODR)；硼-二吡咯亞甲基(BODIPY)/硼-二 吡咯亞甲基(BODIPY)；鋱/若丹明；屍胺/異硫氰酸螢光素(FITC)；嵌二萘(Pyrene)/香豆 素；5-(2_碘乙醯基氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(IAEDANS)/IAFBPE/Cy5 ；以及銪/Cy5。生物 素或者其他的小親和性標籤被用來進行所述蛋白質的探測，其中所述的探測是經由抗-抗 生物素抗體或者帶有親和素/鏈黴親和素標籤的探測劑來實現的，其中所述的探測劑例如 是辣根過氧化物酶或者是一種螢光染料。在一個方面，指示劑化合物被用來對一種酶反應中的一個或者多個產物進行探 測，其中所述的探測是通過與所述的產物發生直接的或者間接的相互作用來實現的。任選 的，這些指示劑化合物是作為所述的光學信號底物溶液中的一部分而被包含在內的。例 如，美國專利No. 5914245中描述了一種脂肪酶檢測，所述的檢測能夠對脂肪酸與所述的熒 光性染料若丹明B之間的相互作用進行探測。可以利用指示劑化合物的其他檢測包括那 樣的一些檢測在其中有質子的生成的檢測，或者在一種酶反應的過程中會發生跨膜的質 子、電子或者離子轉移的檢測。可以通過在所述的底物溶液中容納各種不同的染料的方式 對這些活性進行探測。異硫氰酸螢光素(FITC)是一種螢光素衍生物，其被用於很多範圍 的應用之中，包括流式細胞術。被用來對PH的變化進行監測的範例性的螢光性指示劑染 料包括螢光素以及半萘酚羅丹熒以及它們在6-9的pH範圍內的衍生物以及LysoSensor， Oregon Green以及對甲氨基酚(Rhodol)以及它們在3-7的pH範圍內的衍生物。這些螢光 性的PH指示劑可以從Molecular Probes (Eugene, Oreg.)處獲得。顯色團染料包括百裡酚 藍(Thymol Blue)(大約在1. 2-2. 8以及8. 0-0. 6的pH範圍內是有效的)，甲基紅(Methyl Red) (pH 4. 2-6. 2)，溴百裡酚藍(Bromothymol Blue) (pH 6. 0-7. 6)以及酚紅(Phenol Red) (pH 6. 8-8. 2)，其中所述的顯色團染料所具有的最大吸收波長的變化是pH的函數。當所述 的PH變為更強的鹼性時，酚酞(pH 8. 2-10.0)由無色轉變為粉紅色。這些比色性的pH指示 劑可以從Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo.)處獲得。在酶學中存在許多使用pH指示劑來探 測酶活性的例子(參見Lowry等人於1951年在J Biol Chem《生物化學雜誌》193 :265_275 中發表的文章；Khalifah於1971年在J Biol Chem《生物化學雜誌》246(8) :2561_73中 發表的文章)。指示劑已經被用來對存在於溶液之中的各種不同的水解酶所具有的活性進 行檢測，其中所述的指示劑例如是百裡酚藍以及酚紅(參見Moris-Varas等人於1999年在 Bioorg Med Chem《生物有機化學與藥物化學》(10) :2183_8中發表的文章)。粘液素類型的氧_連接的糖基化作用在高等的真核細胞中存在的氧-連接的糖基化作用的最為豐富的形式被認為是 「粘液素類型」(參見Hang H以及Bertozzi C於2005年在Bioorg Med Chem《生物有機化 學與藥物化學》13(17) :5021-5034中發表的文章)。在粘液素的生物合成中的第一個步驟 是α-N-乙醯基氨基半乳糖胺(GalNAc)在絲氨酸或者蘇氨酸側鏈的羥基基團上的加成作 用從而形成了所述的Tn-抗原；這種轉移是通過所述的多肽N-乙醯基-α -半乳糖基氨基 轉移酶(ppGalNAcTase)來完成的(參見Ten Hagen等人於2003年在Glycobiol 13(1) 1R-16R中發表的文章)。所述的Tn-抗原進一步的通過下遊的糖基轉移酶被進行了精細加工從而生成了各種不同的粘液素類型的結構(附圖2)。到目前為止，已經識別出超過150 種含有粘液素類型的糖基化作用的糖蛋白，它們中有許多都參與了疾病的惡化(參見Hang 於2005年發表的文章)。一種這樣的例子是粘蛋白1 (MUCl)，一種已經被識別為腫瘤抗原 的糖蛋白，這是因為它在癌症上皮細胞內發生的增加的表達，所述的糖蛋白同時促進了癌 細胞的粘附作用以及腫瘤的入侵作用(參見Yu等人於2007年在J Biol Chem《生物化 學雜誌》282(1) :773-781中發表的文章；Kohlgraf等人於2003年在Cancer Res《癌症研 究》63(16) :5011-5020中發表的文章)。與癌症有關的粘液素具有高度的免疫原性並且可 以被用來作為免疫治療的靶向(參見Hanisch以及Ninkovic於2006年在Curr Prot Pep Sic《蛋白質與肽科學的當前研究進展》7 307中發表的文章；Tarp以及Clausen在Press Biochem Biophys Acta ^R^^iJCM )。同源性的粘液素類型的氧_連接的糖肽以及糖蛋白的合成所述的碳水化合物疫苗的研發需要獲取大量的同源性的糖肽以及糖蛋白(參見 Grogan等人於2002年在Annu Rev Biochem《生物化學年度回顧》71 :593_634中發表的文 章)。然而，對天然糖蛋白或者重組糖蛋白所進行的分離僅僅能夠生成有限劑量的異源性 的糖型結構，它們中的每一種能夠表現出不同的生物學性質(參見Freire等人於2006年 在Glycobiol 16(11) :1150中發表的文章)。糖共軛物的化學合成提供了同源性的底物， 這是經由固相的肽合成(SPPS)來實現的，其中使用到一種被進行了適宜保護的糖基氨基 酸構建模塊(參見 MarcaurelIe 以及 Bertozzi 於 2002 年在 Glycobiol，12 (6) :69R_77R 中 發表的文章)。天然的化學連接以及表達的蛋白質連接同樣可以被用來建立糖位點，特別 是在較大的肽並且甚至是蛋白質中(參見Muir TW於2003年在Annu Rev Biochem《生物 化學年度回顧》72 249-289中發表的文章)。在這裡進行描述的本發明之前，完成這些合 成方法仍然需要一位經過特別訓練的藥劑師。本發明提供了酶的生成，其中所述的酶能夠 以一種製備型的比例進行有效的糖共軛物的合成，這對於針對它們的研究提供了很大的幫 助，其中所述的研究是出於治療目的的研究。糖基轉移酶的進化，用於進行所述的含有碳水化合物的天然產物的合成對糖蛋白以及糖脂所進行的識別導致了對它們作為免疫治療靶向的研究，其中所 述的糖蛋白以及糖脂在所述的癌症細胞的表面上發生了過表達(參見Slovin等人於2005 年在Immunol Cell Biol《免疫學與細胞生物學》83 (4) :418中發表的文章)。由於與腫瘤 有關的碳水化合物抗原通常情況下是以低水平以及各種不同的糖型結構來表達的，對具有 充足劑量的離散的糖共軛物所進行的分離是困難的，其中所述的糖共軛物被用來研發基於 碳水化合物的抗癌症疫苗。在這裡所描述的本發明之前，隨著所述的自動化裝配技術的出 現，用於所述的碳水化合物的化學合成的一般性方法已經得到了改進(參見Plante等人於 2003 ip^ Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry 《石mb^^ljUfg 生物化學進展》第58卷，第35-54頁中發表的文章)，但是仍然需要專門的醫師來完成所述 的大規模的保護基團的操作，這種操作是實現立體化學控制以及供體/受體兼容性的必要 元素。所述的糖共軛物的化學合成所具有的其他缺點包括在生成能夠滿足臨床需求的大 規模劑量時所具有的困難以及在對所述經過合成的材料進行純化方面所具有的困難。自然條件有效的進行了含有碳水化合物的化合物的製備，其中使用的是糖基轉移 酶(GTase)將糖從活化的供體分子(例如，UDP糖)向所述的適宜的受體(例如，蛋白質/肽，脂質，其他的糖類以及天然產物糖苷配基——聚酮類以及大環內酯類)進行了轉移， 這種轉移作用是具有絕對的化學控制/立體化學性質的。下述的糖基轉移酶使用三種不 同的供體對多種多樣的受體進行了糖基化作用，其中所述的供體中具有非常類似的摺疊 GtfB-葡萄糖向萬古黴素聚酮類中的轉移，BTG β-糖基轉移酶，以及MurG-GlcNAc在細胞 壁生物合成中的轉移。儘管大多數的糖基轉移酶具有高度的底物選擇性，相對較少的結構基序被用來對 很寬範圍的糖基化受體進行糖基化作用(參見Hu Y以及Walker S於2002年在Chem Biol 《生物化學》9 :1287-1296中發表的文章)。本發明提供了對已有酶的定向進化，用以對具有 改變的底物選擇性的更加有潛力的催化劑進行識別。更為具體的，本發明提供了對突變的 糖基轉移酶所進行的識別，其中所述的糖基轉移酶能夠與化學合成作用進行競爭，用以對 用於治療目的的糖共軛物進行快速並且大規模的生產，其中所述的用於治療目的的糖共軛 物包括基於碳水化合物的癌症疫苗。經過工程化處理的糖基轉移酶具有巨大的潛力可以被用於進行生物學有關的糖 共軛物的合成，所述的合成可以通過下述方式中的任何一種來實現對天然的糖基化作用 所具有的催化有效性進行的改進，或者導入非天然的糖殘基(參見Hancock等人於2006年 在Curr Opin Chem Biol《生物化學的當前觀點》10 (5) :509_519中發表的文章)。然而， 在這裡所描述的本發明之前，在通過定向進化對糖基轉移酶進行工程化處理的方面進行了 較少的嘗試，這在很大程度上歸因於用於對突變體進行篩選以及選擇的方法的缺乏，其中 所述的篩選以及選擇的方法是以糖基轉移酶所具有的活性為基礎的。近來的例子包括對 唾液酸轉移酶(參見Lairson等人於2006年在Nat. Chem. Biol.《天然生物化學》2 (12) 724-728中發表的文章)以及葡萄糖轉移酶(參見Williams等人於2007年在Nat. Chem. Biol.《天然生物化學》3(10) :657-662中發表的文章)的工程化處理，但是在這些情況下 所使用到的所述的篩選方法所具有的一般性是不清楚的。所述的第一種方法需要通過有能 力的克隆物對螢光性底物進行吸收，從而通過流式細胞術對它們進行分選，而所述的第二 種方法利用所述的螢光性分子本身作為所述的聚酮類受體。在這裡所描述的本發明提供了 一種一般性的策略，所述的策略允許使用天然底物或者具有最低的混亂程度的底物對多種 多樣的酶進行體外的篩選。M13噬菌體展示是一種方便的策略，用以在對酶的工程化處理以及篩選中對表型 與基因型進行聯繫，其中所述的酶不能夠提供基於細胞的表型(參見Hoess R於2001年在 Chem Rev《化學回顧》101 =3205-3218中發表的文章)在噬菌體展示的酶的進化中，將酶以 及底物以最接近的方式結合在所述的噬菌體表面之上，從而通過對所述產物的親和性捕獲 而達到所述文庫的去卷積作用。近來，已經研發出一種化學的直接方法，用以將所述的底物 連接到所述的噬菌體表面上，其中使用到了硒代半胱氨酸殘基(參見Love等人於2006年 在Chembiochem《化學與生物化學》7 (5) :753_756中發表的文章)。在那項研究中，所述的 細菌性的糖基轉移酶MurG以活化的形式在噬菌體上進行了表達；然而，一種MurG的成功 進化並未取得成功，這歸因於所述的結合噬菌體的酶沒有能力對結合噬菌體的底物進行利 用。在本發明中提供的所述新技術將所述的方法擴展至真核生物的酶，並且提供了經過改 進的方法，用以對突變的糖基轉移酶的文庫進行篩選。在本發明中描述的所述方法所具有的一項優點是既不用對所述的酶進行檢測，所述的底物也不需要被連接在任何類型的固體支撐物之上，其中所述的底物是針對那些酶 而言的底物，所述的固體支撐物例如是一種固體表面，另外一個細胞，等等。而且，本發明中 所述的方法是利用經過分泌的生物分子在溶液中完成的。本發明提供了對生物分子的篩 選，其中所述的生物分子是由單獨的細胞進行分泌的，而不是從小菌落中進行分泌的，其中 小菌落指的是細胞團。除此之外，可以通過利用玻璃毛細管的顯微操作技術從所述的裝置 中對分泌活性克隆物的細胞進行回收，並且隨後可以對其進行隨機突變用以進行進一步的 篩選，或者對其進行測序用以對所編碼的酶進行識別。在本發明中描述的所述方法所具有的另外一個區別性的特徵在於在所述的篩選 過程中，對每一個文庫成員所具有的多重特徵進行評價。不同於在噬菌體上進行的表面展 示方法，可以對存在於所述的微型反應器內的細菌細胞或者酵母、所述的酶轉換的速率進 行實施的監測，這種監測是以發生在所測量到的螢光強度上的變化為基礎的。使用兩種底 物來進行的競爭性檢測允許在所述的篩選過程中對底物的特異性或者選擇性進行直接的 監測，其中所述的兩種底物被利用不同的螢光團進行了修飾。與已有的技術相比，這些測量 方法能夠提供更大程度的克隆物的多樣性，其中所述的克隆物是被識別並且篩選出來用於 下一輪中的克隆物。應用生物催化作用是用以進行大批量的化學製劑、醫藥品以及食品成分的合成的一種 重要工具。然而，這種應用的數量以及多樣性受到了局限，這可能歸因於存在於酶的穩定 性、催化性質中的限制，即，轉換率，以及底物的範圍。一種生物催化劑的工具試劑盒的取得 將能夠幫助行業克服當前的局限並且能夠實現許多新的應用，從一步的酶轉化到多步的微 生物合成，這是經由代謝途徑的工程學來實現的。對所述的含有碳水化合物的天然產物的生物合成是行業內格外感興趣的，因為通 過傳統的方式對它們進行合成時需要冗長的保護基團的操作技術以及在糖基化供體/受 體兼容性方面的研究。來自於糖蛋白或者糖脂構建體的治療性的疫苗是用於進行癌症的免 疫治療的一種有前途的方式，其中所述的糖蛋白或者糖脂構建體在所述的惡性細胞的表面 上發生了過表達。新的大環內酯類抗生素的合成具有抗生素抗性的細菌感染的增加的發生率預示著對改進的構建體的需求，其 中所述的構建體用來對感染有腸球菌的患者進行治療。許多大環內酯類以及聚酮類抗生 素中含有碳水化合物，這些碳水化合物能夠參與對一種細胞靶向的識別並且因此對於活 性而言是必不可少的(參見Walsh C於2003年發表的Antibiotics :Actions，origins, resistance《抗生素的作用，來源，抗性》第1版；美國微生物學會出版社(Americal Society for Microbiology Press)華盛頓)。在所述的糖取代基上及其周圍對已有的糖肽類抗 生素所進行的修飾已經引發了新的治療劑的臨床試驗，其中所述的治療劑包括奧利萬星 (oritavancin)，所述的糖肽類抗生素例如是萬古黴素以及替考拉寧(參見Dong等人於 2002年在J Am Chem Soc《美國化學學會雜誌》124 =9064-9065中發表的文章)。糖基轉移 酶的適應作用將為針對治療試劑的研究提供新的材料，其中所述的糖基轉移酶作為催化劑 被用於多種多樣的碳水化合物與天然產物聚酮類、蛋白質以及脂質的連接反應之中。在本 發明中提供的所述方法能夠對酶進行識別，其中所述的酶能夠有效的對一定範圍的底物進行糖基化處理並且繼續進行所述催化劑的生成，其中所述的催化劑能夠與化學合成反應進 行競爭，用以對糖共軛物進行快速並且大規模的生產。實施例1. 一種新技術的形成，所沭的技術被用來對具有改講的催化活件或者改 棚底皿鼎白_棚·細〒·下面的試驗是由下述的內容組成的(1)對一種技術進行的描述，所述的技術用 於對一種酵母細胞文庫進行空間分割，其中所述的酵母細胞能夠分泌一種目標酶，以及(2) 對來自於一種滅活變體中的細胞進行富集，用以確定所述的技術所具有的敏感性，其中所 述的細胞能夠表達一種活化的蛋白酶。簡要的說，將一種酵母細胞文庫裝載於具有50微米 的直徑的微孔內，其中所述的酵母細胞能夠分泌出一種目標蛋白質，這樣一來每一個孔中 平均含有一個文庫成員。利用酶底物以平行的方式對存在於所述的裝置中的每一個間隔進 行查看；成功的酶轉換會產生一種螢光性的信號。利用一種蛋白酶對所述的技術所具有的 可行性進行證明。孔的微製造陣列已經被用在多種多樣的生物學應用之中。已經證實微孔能夠被 有效的用來在所述的單一分子的水平上對酶學進行研究，並且具有50-100微米的直徑的 孔已經被用來對細胞進行分離，用以對在一種表面上捕獲到的分泌產物進行篩選(參見 Rondelez等人於2005年在Nat Biotechnol《自然生物技術》23 (3) :361_365中發表的文 章；Love等人於2006年在Nat Biotechnol《自然生物技術》24 (6) :703_707中發表的文 章)。屬於後面那種類型的微型裝置在一種通常的顯微鏡載玻片尺寸(l」x 3」)的腳本中 含有大約100000個孔，這使得在一臺光學顯微鏡上在一天的時間內使用10個這樣的裝置 對具有適度大小的文庫(IO6個成員)進行篩選是可能的。表達宿主的篩選本發明提供了對由細胞分泌的生物分子的篩選。在一個方面，所述的細胞是原核 細胞。或者可供選擇的，所述的細胞是真核細胞。優選的，所述的真核細胞是酵母細胞。一 種範例性的酵母細胞包括巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)。能夠分泌出質粒編碼的 蛋白質的酵母細胞被用來進行所述酶的表達，其中所述的酶被用來通過本發明中所述的 方法來進行進化。真核生物的表達宿主，例如酵母，在所述的多種多樣的酶的進化方面提 供了超越細菌性表達的優點，其中所述的酶包括多肽N-乙醯基-α -半乳糖基氨基轉移 酶(ppGalNAcTase)，因為它們含有進行適宜的蛋白質摺疊、分泌以及翻譯後的修飾所必需 的機構。對於使用微型裝置所進行的空間分割而言，酵母同樣具有一種理想的大小(大約 5-10微米的直徑)，所述的空間分割是以每孔一個細胞的比例進行的，其中每一個孔具有 50微米的直徑。除此之外，酵母快速的發生分裂，使得在幾小時內對一種文庫成員所具有的 基因型進行鑑定成為可能，其中所述的文庫成員來自於一個單獨的細胞。酵母細胞所具有的分泌被編碼的酶的能力相對於細胞周期而存在變化；在所述的 萌芽過程中，酵母在蛋白質的分泌方面最為有效。在一個方面，通過使用酵母的表面展示對 所述酵母在分泌方面存在的大程度的變化進行規避，或者對所述酵母無法分泌一種特定的 目標蛋白質的能力進行規避。酵母的表面展示已經被有效的用在多種多樣的抗體的進化反 應中，並且幾種活化的酶之前已經被展示在所述酵母的表面之上(參見Gai以及Wittrup 於2007年在Current Opinion in Structural Biology《結構生物學的當前觀點》17 (4) 467-473中發表的文章)。
利用一種模型酶對所述的技術進行的校驗首先利用所述的3C類型的半胱氨酸蛋白酶對上述發明的酶的篩選策略所具有的 可行性進行測試，其中所述的半胱氨酸蛋白酶來自於菸草蝕刻病毒(TEV)(參見Malcolm B 於1995年在Protein Sci《蛋白質科學》4(8) 1439-1445中發表的文章)。在菸草蝕刻病 毒(TEV)中的殘基151上的催化性的半胱氨酸上發生的突變產生了一種催化性質滅活的變 體，其中所述的突變從半胱氨酸變為了丙氨酸(參見Phan等人於2002年在J Biol Chem 《生物化學雜誌》277 (52) :50564-50572中發表的文章)。以各種不同的比例(1 10000， 1 100,1 10)將含有所述基因的載體進行混合，其中所述的基因是菸草蝕刻病毒(TEV) 蛋白酶的天然物種以及突變物種的基因，並且所述的載體混合物被用來建立一種模型文 庫，用於進行所述的催化活性物種的富集。按照上文中所概述的內容將利用所述的載體混 合物進行轉化的酵母細胞分割在孔內(附圖1)。使用對菸草蝕刻病毒(TEV)蛋白酶而言 的最適宜的識別位點(ENLYFQG;序列識別號1)對所述的檢測所具有的敏感度進行確定， 將其作為一種螢光共振能量轉移(FRET)底物的一部分(選項1 ；附圖3)(參見Malcolm於 1995年發表的文章；Behlke等人於2005年在Integrated DNA Technologies《綜合DNA技 術》中發表的文章Fluorescence and fluorescence applications《螢光性以及螢光性的 應用》)。在所述的穀氨酸以及甘氨酸殘基之間發生的肽的斷裂破壞了所述的分子內的螢光 共振能量轉移(FRET)的淬火併且生成了一種螢光信號。催化活性以及底物特異性的進化經過了克隆物的成功富集之後，開始進行用於所述的菸草蝕刻病毒(TEV)蛋白酶 的定向進化的模型試驗，其中所述的克隆物能夠表達活性催化劑。為了對所述的篩選能力 進行進一步的證明，使用錯配PCR(聚合酶鏈式反應)對所述的滅活的C151A突變體進行隨 機突變，用以恢復成為具有催化能力的變體，其中所述的篩選是以所述的催化活性為基礎 的。儘管活性將可能被得以重建，利用改變的變異作用對有能力的變體進行識別是可能的， 其中所述活性的重建是發生在殘基151上的所述變異作用的直接逆轉的結果。由於所具有 的對酶的動力學進行篩選的能力是可以預期的，對具有增強的催化活性的克隆物進行識別 是可能的，其中所述的增強是相較於野生型菸草蝕刻病毒(TEV)蛋白酶而言的。最終，可以 對一種變體文庫進行檢查，其中所述的變體文庫是通過所述的野生型菸草蝕刻病毒(TEV) 蛋白酶的突變作用而構建的，所述的突變作用被用來進行一種非天然底物的斷裂(選項 2(2，X為丙氨酸)附圖3)。經過每一輪的篩選之後，通過利用一種玻璃毛細管的顯微操作 技術將分泌活性克隆物的細胞從所述的裝置中回收。經過回收的克隆物將可以被進行隨機 突變用以進行進一步的篩選，或者被進行測序，用以對所編碼的酶進行識別。實施例2. —種具有改進的催化活性的突變的糖基轉移酶的進化下面的試驗是由多肽N-乙醯基- α -半乳糖基氨基轉移酶(ppGalNAcTase)突變 體的進化所構成的，其中所述的多肽N-乙醯基- α _半乳糖基氨基轉移酶(ppGalNAcTase) 具有增強的催化有效性以及改變的底物特異性。微型裝置被用來對多肽N-乙醯基-α -半 乳糖基氨基轉移酶-TKppGalNAcTase-Tl)突變體進行篩選，其中所述的突變體具有改進 的催化有效性。多肽N-乙醯基-α-半乳糖基氨基轉移酶(ppGalNAcTase)負責進行所述 的α-N-乙醯基氨基半乳糖胺(alpha-GalNAc)向絲氨酸/蘇氨酸殘基的轉移，從而形成了 所述的Tn-抗原，一種與腫瘤有關的碳水化合物表位。在這項篩選中被識別出來的突變體被用來進行所述的Tn-抗原的體外合成。一種鼠科動物多肽N-乙醯基-α -半乳糖基氨基轉移酶-Tl (ppGalNAcTase-Tl) 的新近的晶體結構表明，這種蛋白質能夠發生摺疊從而形成獨特的催化結構域以及外源 凝集素結構域(參見Fritz等人於2004年在Proc Natl Acad Sci《美國科學院院刊》 101(43) 15307-15312中發表的文章)。錯配聚合酶鏈式反應(PCR)被用來建立多肽N-乙 醯基-α -半乳糖基氨基轉移酶-Tl (ppGalNAcTase-Tl)的隨機文庫，其中所述的多肽N-乙 醯基-α-半乳糖基氨基轉移酶-TKppGalNAcTase-Tl)在其催化結構域內發生了突變。按 照之前所描述的對一種轉化體的文庫進行空間上的分割並且使用螢光性的底物對其進行 篩選(附圖4)。螢光性的多肽N-乙醯基-α -半乳糖基氨基轉移酶(ppGalNAcTase)底物的設計 以及合成一種經過螢光素修飾的UDP-糖類供體連同一種經過5-羧基四甲基若丹 明(TAMRA)修飾的肽受體一同，允許在經過糖基化作用之後在580納米下進行產物的 探測，這種探測歸因於存在於所述的兩種螢光團之間的螢光共振能量轉移(FRET)(參 見Behlke於2005年發表的文章)。根據關於多肽N-乙醯基-α _半乳糖基氨基轉移 酶-TKppGalNAcTase-Tl)以及其他被保留的糖基轉移酶所具有的UDP-糖類結合袋的結構 信息，按照先前針對UDP-N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)所進行的報導對一種UDP-N-乙醯基 氨基半乳糖胺(GalNAc)底物(3)進行合成，其中所述的底物在C-2處承載有螢光素(參見 Fritz於2004年發表的文章；Patenaude於2002年發表的文章；Helm等人於2003年在J Am Chem Soc《美國化學學會雜誌》125 :11168_11169中發表的文章)。使用可以商業購買 獲得的試劑，利用一種C-末端5-羧基四甲基若丹明(TAMRA)對含有一種最優化的底物序 列(GAGAFFPTPGPAGAGK ；序列識別號2)的受體肽4進行合成，其中所述的序列用於通過多 肽N-乙醯基-α -半乳糖基氨基轉移酶-Tl (ppGalNAcTase-Tl)而進行糖基化作用(參見 Gerken等人於2006年在J Biol Chem《生物化學雜誌》281 (43) :32403_32416中發表的文 章)。回收克隆物所具有的活性的確認經過足夠輪的文庫篩選以及擴增之後(通常情況下為4-6輪)，通過利用一種毛細 玻璃管的顯微操作技術將分泌活性克隆物的細胞從所述的裝置中回收出來，並且隨後對其 進行隨機突變用以進行進一步的篩選，或者對其進行測序用以對所編碼的酶進行識別。利 用天然、未經修飾的UDP-N-乙醯基氨基半乳糖胺(GalNAc)以及肽底物對所編碼的酶進行 測試，用以識別出那些最能夠進行所述Tn-抗原的體外合成的酶。具有這種能力的文庫成 員被用來對Tn-抗原進行大量的合成，用以進行進一步的研究，其中所述的研究針對的是 所述抗原所具有的免疫學性質以及在研發抗癌症疫苗方面所具有的可能的用途。經過分泌的酶或者在表面展示的酶可能不能夠對含有大體積螢光團的合成底物 進行利用，其中所述的大體積螢光團是被導入用以對酶的功能進行檢測的。在一個方面，存 在於每一種底物之中的所述螢光團所具有的位置是存在變化的，直至獲得了一種可以接受 的版本，其中所述的底物特別是所述的經過修飾的UDP-N-乙醯基氨基半乳糖胺(GalNAc)。 或者可供選擇的，經過疊氮官能團化的UDP糖類被常規性的用來進行體內的糖基化作用 的研究；所述的疊氮基團是一種有效的化學標籤，用於進行進一步的衍生化以及底物的探測(參見Campbell等人於2007年在Molecular Biosystems《分子生物系統》3(3) 187-194中發表的文章)。在另外一個方面，所述的多肽N-乙醯基-α -半乳糖基氨基轉移 酶(ppGalNAcTase)受體肽是利用生物素進行修飾的，從而允許在一種夾心類型的檢測中 利用一種外源凝集素或者抗體對發生耦合的產物進行捕獲以及隨後的探測。在一個方面， 所述的生物素標籤被用在親和色譜法中，其中在所述的親和色譜法中一同使用了一種結合 有親和素(也可以是鏈黴親和素以及中性親和素)的柱，其中所述的親和素是生物素的天 然螯合劑。或者可供選擇的，這種標籤被用在所述蛋白質的探測中，其中所述的探測是經由 抗生物素抗體或者帶有親和素/鏈黴親和素標籤的探測劑來實現的，其中所述的探測劑例 如是辣根過氧化物酶或者是一種螢光染料。具有改變的底物優先性的突變的多肽N-乙醯基-α-半乳糖基氨基轉移酶 (ppGalNAcTase)的進化對一種被保留的糖基轉移酶所進行的結構研究已經表明，所述酶所具有的具體殘 基與存在於所述的UDP糖類供體(C-3以及C-4)中的半族所發生的接觸能夠增強UDP-N-乙 醯基氨基半乳糖胺(GalNAc)所具有的特異性，這種特異性的增強是相對於UDP-N-乙醯基 葡萄糖胺(GlcNAc)而言的，其中所述的被保留的糖基轉移酶與多肽N-乙醯基-α-半乳糖 基氨基轉移酶-Tl (ppGalNAcTase-Tl)是高度相關的(參見Patenaude等人於2002年在 Nat Struct Biol《天然結構生物學》9 (9) :685_690中發表的文章；Fritz等人於2006年 在J Biol Chem《生物化學雜誌》281 (13) :8613_8619中發表的文章)。如上所述的利用一 種經過螢光素修飾的UDP-N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)供體對所述的突變的T 1變體文庫 所進行的篩選產生了這樣的克隆物，所述的克隆物能夠對這種非天然的底物進行轉移，並 且增加了對於所述的糖基轉移酶所具有的活性位點特異性的理解。向其他的粘液素類型的糖共軛物的合成的擴展通過對唾液酸基轉移酶ST6GalNAc_l進行的突變對上文中所描述的合成進行擴 展，用以製備所述的唾液酸基Tn-抗原(附圖2)，其中使用到所述的體外合成的Tn-抗原作 為底物。酶的研發使得能夠對這種類型的糖共軛物進行生物學的研究，其中所述的酶被用 來進行各種不同的粘液素類型的核心結構的體外合成，所述的糖共軛物被牽涉在各種不同 的疾病之中。^MM 3.——fl夷島素Iff裂粉測丨下述的試驗證實了在一種不含有細胞的微孔系統內對酶活性所進行的探測。在附 圖11中用圖表表示出的是一種用於在微孔內對酶的轉換進行探測的方法，其中所述的探 測是經由一種胰島素斷裂檢測來實現的。在微孔內，利用10微克/毫升的異硫氰基螢光 素_酪蛋白(FTC-casein)對增加濃度的(0. 05微克/毫升，0. 5微克/毫升，以及5微克/ 毫升)胰島素進行1小時的培養。正如附圖12中所表示出的，所觀察到的螢光性信號所具 有的強度取決於存在於所述的微孔之中的所述胰島素具有的濃度。在一項單獨的試驗中， 在微孔內利用10微克/毫升的異硫氰基螢光素_酪蛋白(FTC-casein)對0. 5微克/毫升 的胰島素進行培養，並且在1小時以及18小時時拍攝顯微鏡照片。正如附圖13中所表示 出的，所觀察到的螢光性信號所具有的強度取決於所述的培養時間。微孔之前已經被用來 對在微孔內分離的酶進行研究。參見，JP2004309405A1 ；以及Rondelez等人於2005年在 Nat Biotechnol《自然生物技術》23 (3) :361_365中發表的文章。
4.發牛在微孔中的分泌的_的轉換——ΚΛ-mm -3C(HRV-3C)蛋

下述試驗證明了一種酶對一種肽底物所進行的斷裂，從而利用一種明亮的螢光性 信號對含有活性酶的細胞進行識別，其中所述的酶即為由存在於本發明中所述的微型裝置 中的單獨的巴斯德畢赤酵母(酵母)細胞分泌得到的蛋白酶，所述的肽底物上帶有一種熒 光共振能量轉移(FRET)報告基因對。具體的，巴斯德畢赤酵母經過了遺傳工程化處理， 從而分泌出人類鼻病毒3C蛋白酶(HRV-3CP)，所述的蛋白酶能夠切斷一種肽底物的序列 (EDANS-A-L-E-V-L-F-Q/G-P-K-DABCYL ；序列識別號3)。在附圖14中用圖表表示的是一種 用以對存在於微孔中的酶的轉換進行探測的方法，其中所述的探測是經由人鼻病毒-3C蛋 白酶(HRV-3CP)檢測來實現的。將能夠分泌所述的人鼻病毒-3C蛋白酶(HRV-3CP)酶的巴 斯德畢赤酵母裝載於所述的微型裝置之中。在存在有所述的螢光共振能量轉移(FRET)肽 底物(EDANS-A-L-E-V-L-F-Q/G-P-K-DABCYL;序列識別號3)的條件下，在所述的微型裝置 中對所述的細胞進行18小時的培養，其中所述的肽底物是以100微克/毫升的水平在YPD 中提供的，在所述的YPD中補充有50毫摩的Tris，pH為7. 0，150毫摩的氯化鈉，以及1毫 摩的乙二胺四乙酸(EDTA)。所述被分泌的酶成功的切斷了所述的底物，生成了一種螢光性 的信號。存在於所述的附圖15的左側小組中的箭頭指向的是存在於孔中的細胞，所述的細 胞對應於在所述的附圖15的右側小組中很好的觀察到的明亮的螢光。
權利要求
1.一種用以實現溶液相的生物分子的篩選的方法，包括將一種細胞文庫沉積在一種微型裝置之上，其中在所述的微型裝置中含有能夠對存在 於溶液之中的所述細胞進行空間上的分割的孔，其中所述的細胞以大約每孔一個細胞的水 平被進行了分配，其中大量的細胞能夠在所述的溶液中分泌至少一種生物分子的變體；將所述的經過分泌的生物分子變體與至少一種光學信號底物進行接觸，每一種代表著 一種期望的生物分子的表型或者活性；以多種參數為基礎，對由所述的細胞編碼的所述生物分子所具有的表型進行評價，並且將所述的細胞從所述的微型裝置中分離出來，其中所述的細胞分泌出一種期望的生物 分子變體。
2.根據權利要求1中所述的方法，其中通過下述方式對所述的表型進行評價對一種 或者多種光學信號隨時間的變化進行探測，其中所述的光學信號是由存在於所述的細胞文 庫之中的一種或者多種光學信號底物產生的，其中這樣的變化代表著所述的生物分子的變 體所具有的期望的生物分子表型或者活性。
3.根據權利要求2中所述的方法，其中所述的光學信號是一種螢光性的信號。
4.根據權利要求3中所述的方法，其中在所述的微型裝置中以實時的方式或者近似於 實時的方式對所述的生物分子的表型或者活性進行監測，其中所述的監測是以所述的螢光 性信號所具有的強度所發生的變化為基礎的。
5.根據權利要求1中所述的方法，其中所述的生物分子選自由下述所組成的組中肽， 多肽，蛋白酶，氧化還原酶，轉移酶，水解酶，裂解酶，異構酶，連接酶，酶，抗體，細胞因子，趨 化因子，核酸，代謝產物，小分子(小於1千道爾頓)以及合成分子。
6.根據權利要求5中所述的方法，其中所述的生物分子所具有的分子量超過大約600 道爾頓並且小於大約100000道爾頓。
7.根據權利要求1中所述的方法，其中所述的參數選自由下述參數所組成的組中催 化速率，反應的特異性，動力學有效性，以及底物的結合親和性。
8.根據權利要求7中所述的方法，其中所述的參數是以平行的方式被進行評價的。
9.根據權利要求1中所述的方法，其中所述的細胞是真核細胞。
10.根據權利要求9中所述的方法，其中所述的真核細胞是酵母細胞。
11.根據權利要求1中所述的方法，其中所述的細胞具有存在於大約10微米至100微 米之間的直徑。
12.根據權利要求1中所述的方法，其中通過利用一種玻璃毛細管的顯微操作技術對 所述的細胞進行分離。
13.根據權利要求12中所述的方法，其中進一步的包括對所述的生物分子進行隨機突 變的步驟。
14.根據權利要求12中所述的方法，其中進一步的包括對所述的生物分子進行測序的步驟。
15.根據權利要求1中所述的方法，其中所述的生物分子是一種突變的糖基轉移酶 (GTase)或者是一種糖苷酶。
16.根據權利要求15中所述的方法，其中所述的糖基轉移酶能夠與化學合成方法進行競爭，用以對複雜的碳水化合物進行快速並且大規模的生產。
全文摘要
本發明提供了一種方法，用以在單獨的微型反應器中從變體細胞的文庫中對特定的成員進行分離，其中對由所述的細胞分泌出的生物分子所具有的表型進行評價，所述的評價是以多種參數為基礎的，包括底物特異性以及動力學有效性。
文檔編號C12M1/34GK102112624SQ200980129829
公開日2011年6月29日 申請日期2009年6月1日 優先權日2008年5月30日
發明者J·C·洛夫, K·洛夫 申請人:麻省理工學院