用bortezomib和表皮生長因子受體激酶抑制劑的組合治療的製作方法

2023-05-07 13:09:26 4

專利名稱：用bortezomib和表皮生長因子受體激酶抑制劑的組合治療的製作方法
背景技術：
本發明涉及用於治療癌症患者的組合物和方法。具體地，本發明涉及用於製備藥物的方法，所述藥物包含bortezomib和表皮生長因子受體(EGFR)激酶抑制劑。
癌症是各種各樣的細胞惡性腫瘤的通用名，其特徵為生長失控、缺少分化、和能夠侵襲局部組織並轉移的能力。這些惡性腫瘤以不同的發病率影響體內的每種組織和器官。
在過去的幾十年中已經開發了多種用於治療各種類型癌症的治療劑。最常用的抗癌劑類型包括DNA烷化劑(例如環磷醯胺，異環磷醯胺)，抗代謝物(例如氨甲蝶呤，葉酸拮抗劑，和5-氟尿嘧啶，嘧啶拮抗劑)，微管破壞劑(例如長春新鹼，長春鹼，紫杉醇)，DNA插入劑(例如阿黴素，柔紅黴素，順鉑)和激素療法(例如他莫昔芬，氟他胺)。
根據國家癌症協會的信息，在美國肺癌是癌症死亡的單一最大原因，並且在國家中造成近乎30％癌症死亡。根據世界健康組織的信息，每年全世界存在多於一百二十萬病例的肺癌和支氣管癌，導致每年約一百一十萬死亡。NSCLC是肺癌最普遍的形式，佔所有病例的約80％。對肺癌的治療選擇方案是外科手術，放射療法和化學療法，單獨使用或組合使用，這取決於癌症的形式和階段。對於晚期NSCLC，已經顯示有效的藥劑包括順鉑(Cisp；如platinol)，卡鉑，紫杉醇，多西他賽，託泊替康，伊立替康，長春瑞濱，吉西他濱(例如gemzar)和EGFR激酶抑制劑gefitinib和埃洛替尼(erlotinib)。鹽酸埃洛替尼(也稱為OSI-774或TarcevaTM)是喹唑啉，其抑制EGFR的酪氨酸激酶活性並誘導細胞凋亡和細胞周期停滯(Moyer，J.D.，等(1997)Cancer Res.574838-4848；Norman P.(2001)Curr.Opin.Investig.Drugs 2298-304)。含順鉑和含卡鉑的組合化學療法方案已經顯示產生目標應答率，其比用單一藥劑化學療法獲得的要高(Weick，J.K等(1991)J.Clin.Oncol.9(7)1157-1162)。已經報導紫杉醇在IV期患者中具有單一藥劑活性，應答率在21％-24％(Murphy W.L.等(1993)J.Natl.Cancer Inst.85(5)384-388)。紫杉醇組合已經顯示相對高的應答率，顯著的1年存活和肺癌症狀的減輕(Johnson D.H.等(1996)J.Clin.Oncol.14(7)2054-2060)。利用紫杉醇加上卡鉑療法，應答率在27％-53％，32％-54％的1年存活率。然而，這種治療的效力是這樣的以致於目前沒有特定的療法可以被認為是標準療法。
表皮生長因子受體(EGFR)激酶或其配體TGF-α的過表達與許多癌症時常相關，所述癌症包括乳腺癌、肺癌、直腸結腸癌和頭頸癌(SalomonD.S.，等(1995)Crit.Rev.Oncol.Hematol.19183-232；Wells，A.(2000)Signal，14-11)，並且據信其還對這些腫瘤的惡性生長起作用。也已經發現在EGFR基因中的特定缺失-突變增加了細胞致瘤性(Halatsch，M-E.等(2000)J.Neurosurg.92297-305；Archer，G.E.等(1999)Clin.Cancer Res.52646-2652)。EGFR刺激的信號途徑的活化促進了多個可能促進癌症的進程，例如增殖，血管生成，細胞遷移和侵襲，減少的細胞凋亡，和誘導藥物抗性。將直接抑制EGFR激酶活性的化合物用作抗腫瘤製劑的開發，以及將通過阻斷EGFR活化而降低EGFR激酶活性的抗體用作抗腫瘤製劑，是研究的熱點(de Bono J.S.和Rowinsky，E.K.(2002)Trends in Mol.Medicine 8S19-S26；Dancey，J.和Sausville，E.A.(2003)Nature Rev.DrugDiscovery 292-313)。一些研究已經證實或者公開當與某些其它抗癌劑或者化療劑或治療並用的時候，一些EGFR激酶抑制劑可以改善殺傷腫瘤細胞或者瘤。(例如Raben，D.等(2002)Semin.Oncol.2937-46；Herbst，R.S.等(2001)Expert Opin.Biol.Ther.1719-732；Magne，N等(2003)Clin.Can.Res.94735-4732；Magne，N.等(2002)British Journal of Cancer 86819-827；Torrance，C.J.等(2000)Nature Med.61024-1028；Gupta，R.A.和DuBois，R.N.(2000)Nature Med.6974-975；Tortora，等(2003)Clin.CancerRes.91566-1572；Solomon，B.等(2003)Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.55713-723；Krishnan，S.等(2003)Frontiers in Bioscience 8，el-13；Huang，S等(1999)Cancer Res.591935-1940；Contessa，J.N.等(1999)Clin.CancerRes.5405-411；Li，M.等Clin.(2002)Cancer Res.83570-3578；Ciardiello，F.等(2003)Clin.Cancer Res.91546-1556；Ciardiello，F.等(2000)Clin.Cancer Res.63739-3747；Grunwald，V.和Hidalgo，M.(2003)J.Nat.CancerInst.95851-867；Seymour L(2003)Current Opin.Investig.Drugs 4(6)658-666；Khalil，M.Y.等(2003)Expert Rev.Anticancer Ther.3367-380；Bulgaru，A.M.等(2003)Expert Rev.Anticancer Ther.3269-279；Dancey，J.和Sausville，E.A.(2003)Nature Rev.Drug Discovery 292-313；Kim，E.S.等(2001)Current Opinion Oncol.13506-513；Arteaga，C.L.和Johnson，D.H.(2001)Current Opinion Oncol.13491-498；Ciardiello，F.等(2000)Clin.Cancer Res.62053-2063；專利公開號US 2003/0108545；US2002/0076408；和US 2003/0157104；以及國際專利公開號WO 99/60023；WO01/12227；WO 02/055106；WO 03/088971；WO 01/34574；WO 01/76586；WO 02/05791；和WO 02/089842)。
另外新的具有針對肺和其它腫瘤細胞的傑出的細胞毒性的化合物是bortezomib(Adams，J.et al.(2003)Drug Discovery Today 8(7)307-315；Lenz，H.J.(2003)Cancer Treat.Rev.29(Suppl.1)41-48)。Bortezomib(也已知為Velcade或PS-341)是小分子蛋白酶體抑制劑，近來被FDA批准治療難治的多發性骨髓瘤。已經報導了bortezomib在NSCLC細胞系中具有活性，在此發現其誘導濃度和時間依賴性G2/M細胞周期停滯(Ling，Y-H.et al.(2003)Clin.Cancer Res.9(3)1145-1154)。這伴隨著關鍵細胞調節分子(p53，p21)的穩定化，胱天蛋白酶途徑的活化和最終細胞凋亡。在體內，已經在NSCLC異種移植物中，以及在人NSCLC異種移植物模型中發現其活性，在I期和II期試驗中在具有難控制NSCLC的患者中發現臨床活性(Mack，P.C.et al(2003)lung cancer 41(Suppl.1)S89-S96)。正在進行III期隨機試驗，以比較單獨bortezomib相比於bortezomib聯合標準多西他賽作為NSCLC二線療法的功效。
抗瘤藥物應該理想地選擇性殺傷癌細胞，具有相對於其對非惡性腫瘤細胞毒性而言更為寬泛的治療指數。即使長時間暴露於該藥物，其同樣保留針對惡性腫瘤細胞的效力。遺憾的是，沒有一種目前的化療具有這種理想的特性。相反，多數具有非常窄的治療指數。此外，癌細胞暴露於輕微亞致死濃度的化療劑通常會形成對該藥劑的抗性，形成對一些其它抗瘤製劑的交叉抗性也是很常見的。
因此，需要治療瘤形成和其它增生疾病的更有效的療法。用於提高目前藥物治療效力的策略涉及改變它們的給藥時間表，以及與其它抗癌劑或者生化調節劑結合使用。眾所周知的聯合治療是一種這樣的方法其可以產生相對於單獨使用每一種治療性相關劑量的製劑更好的效力和減少的副作用。在一些情況下，藥物組合的效力是加成性的(組合的效力基本上等於每種藥物單獨效力的總和)，但在其他情形中，效力是增效性的(組合的效力大於每種藥物單獨給藥的效力的總和)。
然而，仍急需對NSCLC和其它癌症的改善治療。本發明提供了抗癌組合療法，其降低了效力所需的每種組分的劑量，從而降低了與每種藥劑相關的副作用，而同時保持或者增加了治療價值。在此描述的本發明提供了新的藥物組合，和使用該藥物組合來治療NSCLC和其它癌症的方法。
發明概述本發明提供製備藥物的方法，所述藥物用於治療腫瘤或腫瘤轉移，所述方法特徵在於使用治療有效量的EGFR激酶抑制劑和bortezomib的組合。優選地，意欲將治療有效量的EGFR激酶抑制劑和bortezomib的組合，結合或不結合另外的藥劑或治療，如其它的抗癌藥物或輻射療法同時或順序地給藥於患者。
本發明還包含藥物組合物，其由EGFR激酶抑制劑和bortezomib組合以及藥用載體組成。
可以用於實施本發明的優選的EGFR激酶抑制劑的實例是化合物鹽酸埃洛替尼(erlotinib HCl)(也已知為TarcevaTM)。
附圖簡述

圖1NSCLC細胞系對埃洛替尼和bortezomib的敏感性。
圖2埃洛替尼和bortezomib對四種人NSCLC細胞系的組合細胞毒性功效(組合Index(CI))。
圖3埃洛替尼和bortezomib對H358支氣管肺泡細胞系的組合功效。A)針對時間作圖的部分細胞計數(fractional cell count)，B)對三個時間周期的細胞凋亡百分比。
發明詳述術語「癌」在動物中指的是存在這樣的細胞，該細胞具有致癌細胞的典型特性，例如增殖失控，永生化，轉移潛能，快速生長和增殖率，和某些形態學特性。通常，癌細胞的形式是腫瘤，但是這樣的細胞可以單獨存在於動物中，或者作為獨立的細胞在血流中循環，如白血病細胞。
除非其它指明，本發明使用的「不正常細胞生長」指的是細胞生長獨立於正常的調控機制(例如喪失接觸抑制)。其包括下列情況的不正常生長(1)腫瘤細胞(腫瘤)，其通過表達突變的酪氨酸激酶或者過表達酪氨酸激酶受體而增殖；(2)其它增殖疾病的良性和惡性細胞，其中發生異常的酪氨酸激酶活化；(4)任何通過受體酪氨酸激酶而增殖的腫瘤；(5)任何通過異常絲氨酸/蘇氨酸激酶活化而增殖的腫瘤；和(6)其它增殖疾病的良性和惡性細胞，其中發生異常的絲氨酸/蘇氨酸激酶活化。
除非其它指明，本發明使用的術語「治療」表示在患者中部分或者全部逆轉、減輕、抑制進程、或者預防腫瘤生長、腫瘤轉移或者其它致癌細胞或致腫瘤細胞。本發明使用的術語「治療」，除非其它指明，指的是治療的行為。
當短語「治療方法」或其等效語應用於例如癌症時，其指的這樣的行動的步驟或者過程，該行動經過設計以在動物中降低或者消除癌細胞的數量，或者緩解癌症的症狀。癌症或者其它增殖疾病的「治療方法」不必定意味著所述的癌細胞或者其它疾病事實上會被消除了；所述細胞的數量或者疾病事實上會被降低；或者癌症或者其它疾病的症狀事實上會被緩解。通常，即使成功可能性很小，也會進行癌症的治療方法，然而考慮到動物的用藥史和預計的生存期，所述方法就其總體的作用過程來說對該動物是有益的。
術語「治療有效的藥劑」指的是這樣的組合物，其將會誘導被研究者、獸醫、醫生或者其它臨床醫師所研究的組織、系統、動物或者人的生物或者醫學應答。
術語「製備藥物的方法」涉及製備用於如本文所述的適應症、特別是用於腫瘤、腫瘤轉移或通常的癌症的藥物。該術語涉及在指定的適應症中的所謂的「瑞士類型」的權利要求形式。
術語「治療有效量」或者「有效量」指的是將會誘導被研究者、獸醫、醫生或者其它臨床醫師所研究的組織、系統、動物或者人的生物或者醫學應答的受試化合物或者組合的量。
本發明使用的術語「EGFR激酶抑制劑」指的是任何目前在本領域熟知的或者將來會被鑑定的EGFR激酶抑制劑，並且包括任何在給藥於患者時導致患者中與EGF受體活化相關的生物活性抑制的化學個體，其包括任何另外產生自其天然配體結合EGFR的下遊生物學效應。這樣的EGFR激酶抑制劑包括任何可以阻斷EGFR活化的試劑或者任何與在患者中治療癌症相關的EGFR活化的下遊生物學效應。這樣的抑制劑可以通過直接結合到受體的細胞內結構域和抑制其激酶活性而發揮作用。或者，這樣的抑制劑可以通過佔據EGFR受體的配體結合位點或者部分、從而使得受體難以接近其天然配體從而阻止或者降低了其正常生物學活性而發揮作用。或者，該抑制劑可以通過調節EGFR多肽的二聚化、EGFR多肽與其它蛋白質的相互作用、或者增強EGFR的泛化作用和細胞內降解而起作用。EGFR激酶抑制劑包括但不限於低分子量抑制劑、抗體或者抗體片段、反義構建體、小抑制性RNAs(即dsRNA的RNA幹擾；RNAi)，和核酶。在一個優選的實施方案中，EGFR激酶抑制劑是特異結合到人EGFR的小的有機分子或者抗體。
本發明使用的術語「EGFR激酶抑制劑」指的是任何目前在本領域熟知的或者將來會被鑑定的EGFR激酶抑制劑，並且包括任何在給藥於患者時導致患者中與EGF受體活化相關的生物活性抑制的化學個體，其包括任何另外產生自其天然配體結合EGFR的下遊生物學效應。這樣的EGFR激酶抑制劑包括任何可以阻斷EGFR活化的試劑或者任何與在患者中治療癌症相關的EGFR活化的下遊生物學效應。這樣的抑制劑可以通過直接結合到受體的細胞內結構域和抑制其激酶活性而發揮作用。或者，這樣的抑制劑可以通過佔據EGFR受體的配體結合位點或者部分、從而使得受體難以接近其天然配體從而阻止或者降低了其正常生物學活性而發揮作用。或者，該抑制劑可以通過調節EGFR多肽的二聚化、EGFR多肽與其它蛋白質的相互作用、或者增強EGFR的泛化作用和細胞內降解而起作用。EGFR激酶抑制劑包括但不限於低分子量抑制劑、抗體或者抗體片段、反義構建體、小抑制性RNAs(即dsRNA的RNA幹擾；RNAi)，和核酶。在一個優選的實施方案中，EGFR激酶抑制劑是特異結合到人EGFR的小的有機分子或者抗體。
EGFR激酶抑制劑包括例如喹唑啉EGFR激酶抑制劑，吡啶並-嘧啶EGFR激酶抑制劑，嘧啶並-嘧啶EGFR激酶抑制劑，吡咯並-嘧啶EGFR激酶抑制劑，吡唑並-嘧啶EGFR激酶抑制劑，苯基氨基-嘧啶EGFR激酶抑制劑，羥吲哚EGFR激酶抑制劑，吲哚並咔唑EGFR激酶抑制劑，酞嗪EGFR激酶抑制劑，異黃酮EGFR激酶抑制劑，quinalone EGFR激酶抑制劑和tyrphostin EGFR激酶抑制劑，如描述在下述專利出版物中的那些，和它們的所有藥用鹽和溶劑化物國際專利公開號WO 96/33980，WO96/30347，WO 97/30034，WO 97/30044，WO 97/38994，WO 97/49688，WO 98/02434，WO 97/38983，WO 95/19774，WO 95/19970，WO 97/13771，WO 98/02437，WO 98/02438，WO 97/32881，WO 98/33798，WO 97/32880，WO 97/3288，WO 97/02266，WO 97/27199，WO 98/07726，WO 97/34895，WO 96/31510，WO 98/14449，WO 98/14450，WO 98/14451，WO 95/09847，WO 97/19065，WO 98/17662，WO 99/35146，WO 99/35132，WO 99/07701，和WO 92/20642；歐洲專利申請號EP 520722，EP 566226，EP 787772，EP 837063，和EP 682027；美國專利號5,747,498，5,789,427，5,650,415，和5,656,643；以及德國專利申請號DE 19629652。其它低分子量EGFR激酶抑制劑的非限制性實例包括Traxler，P.，1998，Exp.Opin.Ther.Patents8(12)1599-1625中描述的那些。
用於本文，「EGFR激酶抑制劑」優選是式1的化合物
其中m是1，2，或3；每個R1獨立地選自氫，滷素，羥基，氨基，羥基氨基，羧基，(C1-C4)烷氧基羰基，硝基，胍基，脲基，氨基甲醯基，氰基，三氟甲基，(R6)2N-羰基，和苯基-W-烷基，其中W選自單鍵，O，S和NH；或每個R1獨立選自氰基-(C1-C4)-烷基和R9，其中R9選自R5，R5O，(R6)2N，R7C(＝O)，R5ONH，A和R5Y；R5是(C1-C4)烷基；R6是氫或R5，其中R5相同或不同；R7是R5，R5O或(R6)2N；A選自哌啶子基-，嗎啉代，吡咯烷子基和4-R6-哌嗪-1-基，咪唑-1-基，4-吡啶酮-1-基，羧基-(C1-C4)-烷基，苯氧基，苯基，苯硫基，(C2-C4)-鏈烯基，(R6)2-N-羰基-(C1-C4)-烷基；和Y選自S，SO，SO2；(R6)2N中的烷基部分任選地被滷素或R9取代，其中R9如上所定義，R5和R5O中的烷基部分任選地被滷素，R6O或R9取代，其中R9和R6如上所定義，其中得到的基團任選地被滷素或R9所取代，條件是氮，氧或硫原子和其它雜原子不能附於相同的碳原子上，另外的條件是不超過三個″R9″單元可包括R1；或每個R1獨立地選自R5-磺醯基氨基，苯二醯亞氨基-(C1-C4)-烷基磺醯基氨基，苯甲醯氨基，苯磺醯基氨基，3-苯基脲基，2-氧吡咯烷-1-基，2，5-二氧吡咯烷-1-基，和R10-(C2-C4)-烷醯基氨基，其中R10選自滷素，R6O，(C2-C4)-烷醯基氧基，R7C(＝O)，和(R6)2N；其中所述苯甲醯氨基或苯磺醯基氨基或苯基或苯氧基或苯胺基或R1中的苯硫基取代基可任選具有一個或兩個滷素，(C1-C4)烷基，氰基，甲磺醯基或(C1-C4)-烷氧基取代基；或任何兩個R1與它們所附著的碳原子一起包括5-8元環，所述環包含至少一個或兩個雜原子，所述雜原子選自氧，硫或氮；其中烷基和烷氧基或烷基氨基的烷基部分可以是直鏈的，或如果由至少3個碳組成，可以是支鏈的或環形的；R2選自氫和任選取代的(C1-C6)-烷基；n是1或2，每個R3獨立選自氫，(C1-C6)-烷基，氨基，滷素，羥基；R4是疊氮基或R11-乙炔基，其中R11選自氫，任選取代的(C1-C6)烷基，其中取代基選自氫，氨基，羥基，R5O，R5NH和(R5)2N。
更具體地，依照本發明的EGFR激酶抑制劑涉及式1的化合物，其中m，n，R1和R3如上所定義，R2是氫和R4是R11-乙炔基，其中R11選自氫，任選取代的(C1-C6)-烷基，其中取代基選自氫，氨基，羥基，R5O，R5NH和(R5)2N或R4是疊氮基。
依照本發明的EGFR激酶抑制劑還涉及式1的化合物，其中n如上所定義，m是1或2，每個R1獨立選自氫，羥基，氨基，羥基氨基，羧基，硝基，氨基甲醯基，脲基；R6O，(C2-C4)-烷醯基氧基，HOC(＝O)，A和(R6)2N，R6OKO，R6OKNH，CN和苯基；R5NH任選取代的滷素，(C2-C4)-烷醯基氧基，R6O，R7C(＝O)，(R6)2N，A，R6OKO，R6OKNH，C6H5Y，CN；(R6)2N(C＝O)，R5ONH，R5S，(C1-C4)-烷基磺醯基氨基，苯二醯亞氨基-(C1-C4)-烷基磺醯基氨基，3-苯基脲基，2-氧吡咯烷-1-基，2，5-二氧吡咯烷-1-基，滷素-(C2-C4)-烷醯基氨基，羥基-(C2-C4)-烷醯基氨基，(C2-C4)-烷醯基氧基-(C2-C4)-烷醯基氨基，(C1-C4)-烷氧基-(C2-C4)-烷醯基氨基，羧基-(C2-C4)-烷醯基氨基，(C1-C4)-烷氧基羰基-(C2-C4)-烷醯基氨基，氨基甲醯基-(C2-C4)-烷醯基氨基，N-(C1-C4)lkyl氨基甲醯基-(C2-C4)-烷醯基氨基，N，N-二-[(C1-C4)-烷基]氨基甲醯基-(C2-C4)-烷醯基氨基，氨基-(C2-C4)-烷醯基氨基，(C1-C4)-烷基-氨基-(C2-C4)-烷醯基氨基，二-(C1-C4)-烷基-氨基-(C2-C4)-烷醯基氨基，和其中R1中的所述苯基或苯氧基或苯胺基取代基可任選具有1或2個滷素，(C1-C4)-烷基或(C1-C4)烷氧基取代基；或任何兩個R1與它們所附著的碳一起包括5-8元環，所述環包含至少一個或兩個雜原子，所述雜原子選自氧，硫或氮；其中烷基和烷氧基或烷基氨基的烷基部分可以是直鏈的，或如果由至少3個碳組成，可以是支鏈的或環形的；每個R3獨立選自氫，甲基，乙基，氨基，滷素和羥基；R4是R11-乙炔基，其中R11是氫。
更具體地，依照本發明的EGFR激酶抑制劑涉及式1的化合物，其中m，n，R1，R2和R3如上所定義，和每個R1獨立選自氫，羥基，氨基，羥基氨基，硝基，氨基甲醯基，脲基，R5任選被滷素，R6O，HOC(＝O)，H2NC(＝O)取代；R5O任選被滷素，R6O，(C2-C4)-烷醯基氧基，HOC(＝O)，(R6)2N，A，苯基取代；R5NH，(R5)2N，R5NH2，(R5)2NH，R5NHC(＝O)，(R5)2NC(＝O)，R5S，苯基-(C2-C4)-烷氧基，和其中在R1中的所述苯基取代基可任選具有一個或兩個滷素，R5或R5O取代基；或任何兩個R1與它們所附著的碳一起包括5-8元環，所述環包含至少一個或兩個雜原子，所述雜原子選自氧，硫或氮；和其中烷基和烷氧基或烷基氨基中的烷基部分可以是直鏈的，或如果由至少3個碳組成，可以是支鏈的或環形的。
可以依照本發明使用的低分子量EGFR激酶抑制劑的具體優選實例包括[6，7-二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基苯基)胺(也叫作OSI-774，埃洛替尼，或者TarcevaTM(鹽酸埃洛替尼)；OSIPharmaceuticals/Genentech/Roche)(美國專利號5,747,498；國際專利公開號WO 01/34574，和Moyer，J.D.等(1997)Cancer Res.574838-4848)；CI-1033(先前已知為PD183805；Pfizer)(Sherwood等，1999，Proc.Am.Assoc.Cancer Res.40723)；PD-158780(Pfizer)；AG-1478(University ofCalifornia)；CGP-59326(Novartis)；PKI-166(Novartis)；EKB-569(Wyeth)；GW-2016(也叫作GW-572016或者lapatinib ditosylate；GSK)；和gefitinib(也叫作ZD1839或者IressaTM；Astrazeneca)(Woodburn等，1997，Proc.Am.Assoc.Cancer Res.38633)。可以依照本發明使用的特別優選的低分子量EGFR激酶抑制劑是[6，7-二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基苯基)胺(即埃洛替尼)，其鹽酸鹽(即鹽酸埃洛替尼，TarcevaTM)，或者其它鹽形式(例如甲磺酸埃洛替尼)。
最優選的，依照本發明的EGFR激酶抑制劑涉及化合物鹽酸埃洛替尼(也已知為TarcevaTM)。
優選的基於抗體的EGFR激酶抑制劑包括任何能夠部分或者全部阻斷EGFR被其天然配體活化的抗EGFR抗體或者抗體片段。基於抗體的EGFR激酶抑制劑的非限制性實例包括在Modjtahedi，H.，等，1993，Br.J.Cancer67247-253；Teramoto，T.，等，1996，Cancer 77639-645；Goldstein等，1995，Clin.Cancer Res.11311-1318；Huang，S.M.，等，1999，Cancer Res.1559(8)1935-40；和Yang，X.，等，1999，Cancer Res.591236-1243.中描述的那些。因此EGFR激酶抑制劑可以是單克隆抗體Mab E7.6.3(Yang，X.D.等(1999)Cancer Res.591236-43)，或者Mab C225(ATCC登記號HB-8508)，或者其具有結合特異性的抗體或者抗體片段。合適的單克隆抗體EGFR激酶抑制劑包括但不限於，IMC-C225(也叫作cetuximab或者ErbituxTM；Imclone Systems)，ABX-EGF(Abgenix)，EMD 72000(MerckKgaA，Darmstadt)，RH3(York Medical Bioscience Inc.)，和MDX-447(Medarex/Merck KgaA)。
額外的基於抗體的EGFR激酶抑制劑可以通過將適當抗原或者表位施用於宿主動物而根據已知的方法而產生，所述的宿主動物選自例如豬，牛，馬，兔，山羊，綿羊，和小鼠及其他。各種本領域已知的佐劑可以被用於提高抗體生產。
儘管實施本發明的有用抗體可以是多克隆的，優選單克隆抗體。針對EGFR的單克隆抗體可以使用任何技術製備和分離，所述的技術通過連續細胞系培養提供抗體分子製備。用於製備和分離的技術包括但不限於最初由Kohler和Milstein(Nature，1975，256495-497)描述的雜交瘤技術；人B-細胞雜交瘤技術(Kosbor等，1983，Immunology Today 472；Cote等，1983，Proc.Nati.Acad.Sci.USA 802026-2030)；和EBV雜交瘤技術(Cole et al，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。
或者，描述單鏈抗體生產的技術(見例如美國專利號4,946,778)可以被修改來生產抗EGFR單鏈抗體。在實施本發明中有用的基於抗體的EGFR激酶抑制劑還包括抗EGFR抗體片段，包括但不限於F(ab′)2片段，其是由胃蛋白酶消化完整的抗體分子產生的，和Fab片段，其是通過還原F(ab′)2片段的二硫鍵而產生的。或者可以構建Fab和/或scFv表達文庫(見例如，Huse等，1989，Science 2461275-1281)以容許快速鑑定對EGFR具有所需特異性的片段。
用於製備和分離單克隆抗體和抗體片段的技術在本領域為人熟知，並且描述在Harlow和Lane，1988，AntibodiesA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，和在J.W.Goding，1986，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，Academic Press，London.中。人源化抗EGFR抗體和抗體片段也可以通過已知的技術製備，所述技術如那些描述在Vaughn，T.J.等，1998，Nature Biotech.16535-539及其引用的文獻中的那些，並且這些抗體或其片段在本發明實施中同樣有用。
本發明使用的EGFR激酶抑制劑可備選地基於反義寡核苷酸構建體。包括反義RNA分子和反義DNA分子的反義寡核苷酸可以通過結合其上來直接阻斷EGFR mRNA的翻譯，並從而防止蛋白翻譯或者增加mRNA降解，因而減少了EGFR激酶蛋白質水平，和因此減少其在細胞內的活性。例如可以通過如常規的磷酸二酯技術合成至少約15個鹼基的反義寡核苷酸，其互補於編碼EGFR的mRNA轉錄序列的獨特區域，通過例如靜脈內注射或者輸液給藥。使用反義技術用來特異抑制其序列已知的基因的基因表達的技術為本領域熟知。(例如見美國專利號6,566,135；6,566,131；6,365,354；6,410,323；6,107,091；6,046,321；和5,981,732)。
小抑制性RNAs(siRNAs)也可以作為EGFR激酶抑制劑用於本發明。EGFR基因表達可以通過用小雙鏈RNA(dsRNA)、或者引起小雙鏈RNA產生的載體或構建體來接觸腫瘤、受試者或者細胞而降低，從而EGFR的表達被特異地抑制(即RNA幹擾或者RNAi)。對於序列已知的基因，選擇合適dsRNA或者dsRNA-編碼載體的方法在本領域為人熟知。(例如見Tuschi，T.，等(1999)Genes Dev.13(24)3191-3197；Elbashir，S.M.等(2001)Nature 411494-498；Hannon，G.J.(2002)Nature 418244-251；McManus，M.T.和Sharp，P.A.(2002)Nature Reviews Genetics 3737-747；Bremmelkamp，T.R.等(2002)Science 296550-553；美國專利號6,573,099和6,506,559；和國際專利公開號WO 01/36646，WO 99/32619，和WO01/68836)。
核酶也可以作為EGFR激酶抑制劑用於本發明。核酶是能夠催化RNA特異切割的酶RNA分子。核酶作用的機理涉及核酶分子與互補靶RNA的序列特異性雜交，而後被核酸內解切割。特異並有效地催化EGFR mRNA序列的核酸內解切割的工程化的錘頭基序核酶分子因此在本發明的範圍內有用。任何可能RNA靶中的特異核酶切割位點通過掃描靶分子找尋核酶切割位點而被最初鑑定，其通常包括下列序列GUA，GUU，和GUC。一旦鑑定出來後，可以評價相應於含有切割位點的靶基因區域的大約15-20個核糖核苷酸的短RNA序列的預測結構特徵，例如二級結構，這可以導致寡核苷酸序列不合適。也可以通過測試其與互補寡核苷酸的雜交可接近性來評價候選靶的合適性，例如使用核酶保護測試。
可以通過已知的方法來製備用作EGFR激酶抑制劑的反義寡核苷酸和核酶。這些包括用於化學合成的技術例如諸如固相亞磷醯胺化學合成。或者，可以通過體外或者體內轉錄編碼RNA分子的DNA序列來產生反義RNA分子。這樣的DNA序列可以被整合到各種各樣的載體內，所述載體整合合適RNA聚合酶啟動子如T7或者SP6聚合酶啟動子。作為一種增加細胞內穩定性和半衰期的手段，可以引入對本發明寡核苷酸的多種修飾。可能的修飾包括但不限於將核糖核苷酸或者脫氧核糖核苷酸的側翼序列加到所述分子的5』和/或3』末端，或者在寡核苷酸骨架中使用硫代磷酸酯(phosphorothioate)或者2′-O-甲基而不是磷酸二酯酶鍵。
在下文實施例中顯示的數據證實共給藥bortezomib和EGFR激酶抑制劑對治療患有晚期癌症，如NSCLC，結腸直腸癌或胰腺癌是有效的。因此，本發明提供了製備藥物的方法，所述藥物用於治療患者的腫瘤或腫瘤轉移，所述方法特徵在於使用治療有效量的EGFR激酶抑制劑和bortezomib組合。
優選地，這樣的組合用於對患者同時或順序給藥。在該方法中，在患者中存在的癌症可以是下文涉及的那些癌症的任何一種，包括NSCLC，結腸直腸癌或胰腺癌。在優選的實施方案中，當順序給藥化合物時，將bortezomib在EGFR激酶抑制劑之前給藥。在一個實施方案中，被治療的腫瘤或腫瘤轉移是結腸直腸腫瘤或腫瘤轉移。
在本發明的任一個方法中，同時給藥藥劑可以通過同時分開給藥藥劑或作為固定的組合來一起給藥來實現。另外，在本發明的任一個方法中，可以以任何順序來順序給藥藥劑。
另外，優選地，使用一種或多種其它的細胞毒性劑、化療劑或抗癌劑，或增強這些藥劑功效的化合物。
在本發明的上下文中，額外的其它的細胞毒性劑、化療劑或抗癌劑，或增強這些藥劑功效的化合物包括，例如烷化劑或者具有烷化作用的製劑如環磷醯胺(CTX；如cytoxan)，苯丁酸氮芥(CHL；如leukeran)，順鉑(Cisp；如platinol)，白消安(如myleran)，美法侖，卡莫昔汀(BCNU)，鏈脲黴素，曲他胺(TEM)，絲裂黴素C等；抗代謝物類，例如甲氨蝶呤(MTX)，依託泊苷(VP16；如vepesid)，6-巰嘌呤(6MP)，6-硫鳥嘌呤(6-thiocguanine)(6TG)，阿糖胞苷(Ara-C)，5-氟尿嘧啶(5-FU)，卡培他濱(如Xeloda)，達卡巴嗪(DTIC)，等等；抗生素類例如放線菌素D，多柔比星(DXR；如adriamycin)，柔紅黴素(daunomycin)，博來黴素，普卡黴素等等；生物鹼類，例如長春花生物鹼類例如長春新鹼(VCR)，長春鹼，等等；和其它抗腫瘤藥劑例如紫杉醇(如taxol)和紫杉醇衍生物，細胞增殖抑制劑(cytostatic agents)，糖皮質激素如地塞米松(DEX；如decadron)和皮質甾類例如波尼松，核苷酶抑制劑例如羥基脲，胺基酸耗竭酶(amino acid depleting enzymes)例如天冬醯胺酶，甲醯四氫葉酸(leucovorin)，亞葉酸(folinic acid)，雷替曲塞(raltitrexed)，和其它葉酸衍生物，和類似的不同的抗腫瘤劑。還可以將下列藥劑用作附加藥劑arnifostine(如ethyol)，放線菌素D，二氯甲二乙胺(氮芥)，鏈佐星，環磷醯胺，lornustine(CCNU)，多柔比星脂(如doxil)，柔紅黴素脂(如daunoxome)，丙卡巴肼，絲裂黴素，多西他賽(如taxotere)，阿地白介素，卡鉑，克拉屈濱，喜樹鹼，CPT11(伊立替康)，10-羥基7-乙基-喜樹鹼(SN38)，氟尿苷，氟達拉濱，異環磷醯胺，伊達比星，美鈉，幹擾素α，幹擾素β，米託蒽醌，託泊替康，亮丙立德，甲地孕酮，美法侖，巰嘌呤，普卡黴素，米託坦，培門冬酶，噴司他丁，哌泊溴烷，普卡黴素，他莫昔芬，替尼泊苷，睪內酯，硫鳥嘌呤，塞替派，尿嘧啶氮芥，長春瑞濱，苯丁酸氮芥。
本發明還提供製備藥物的方法，所述藥物用於治療腫瘤或腫瘤轉移，所述方法特徵在於使用治療有效量的EGFR激酶抑制劑和bortezomib組合，並且用於同時或順序給藥於患者，其中另外，使用一種或多種抗激素藥劑。如本文所用，術語「抗-激素劑」包括天然的或者合成的有機或者肽化合物，其調節或者抑制激素對腫瘤的作用。
抗激素劑包括例如類固醇受體拮抗劑，抗雌激素類例如他莫昔芬，雷洛昔芬，芳香酶抑制4(5)-咪唑，其它芳香酶抑制劑，42-羥基他莫昔芬，曲沃昔芬，keoxifene，LY 117018，奧那斯酮，和託瑞米芬(如Fareston)；抗雄激素類例如氟他胺，尼魯米特，比卡魯胺，亮丙立德，和戈舍瑞林；以及上述任何製劑的藥用鹽、酸或者衍生物；糖蛋白激素的激動劑和/或拮抗劑例如促卵泡激素(FSH)，促甲狀腺激素(TSH)和促黃體激素(LH)和LHRH(促黃體激素釋放激素)；LHRH激動劑戈舍瑞林醋酸酯，可作為Zoladex(AstraZeneca)商購；LHRH拮抗劑D-丙氨醯胺N-乙醯基-3-(2-萘基)-D-丙氨醯-4-氯-D-苯丙氨醯-3-(3-吡啶基)-D-丙氨醯-L-絲氨醯-N6-(3-吡啶基羰基)-L-賴氨醯-N6-(3-吡啶基羰基)-D-賴氨醯-L-亮氨醯-N6-(1-甲基乙基)-L-賴氨醯-L-脯氨酸(如Antide，Ares-Serono)；LHRH拮抗劑醋酸加尼瑞克；甾體抗雄激素類醋酸環丙孕酮(CPA)和醋酸甲地孕酮，可以作為Megace(Bristol-Myers Oncology)商購；非甾體抗雄激素氟他胺(2-甲基-N-[4，20-硝基-3-(三氟甲基)苯丙醯胺]，可以作為Eulexin(Schering Corp.)商購；非甾體抗雄激素尼魯米特，(5，5-二甲基-3-[4-硝基-3-(三氟甲基-4′-硝基苯基)-4，4-二甲基-咪唑烷-二酮]；和其它非許可受體的拮抗劑，例如RAR，RXR，TR，VDR等等的拮抗劑。
化療方案中使用上述細胞毒性和其它抗癌劑在癌症治療領域已經被很好的表徵，並且其在這裡的應用也要考慮對耐藥性和效果的監測以及考慮對給藥途徑和劑量的控制，進行一定程度的調節。例如，細胞毒性劑的實際劑量可以是變化的，這要取決於通過使用組織培養方法確定的患者的培養細胞應答。通常，相比於在沒有額外其它製劑時使用的量，所述的劑量將減少。
有效細胞毒性製劑的典型的劑量可以在製備商推薦的範圍內，並且當通過體外應答或者動物模型中的應答表明時，其可以被降低達大約一個數量級的濃度或者量。因此，實際的劑量將取決於醫師的判斷，患者的情況，和治療方法的效果，所述的治療方法基於初級培養的惡性腫瘤細胞或者組織培養的組織樣品的體外應答，或者在適當動物模型中觀察到的應答。
在本發明的上下文中，在上述的另外其它細胞毒性的、化療的或者抗癌劑中，選自吉西他濱，順鉑和卡鉑的化合物的任一種或組合是優選的。
本發明還提供製備藥物的方法，所述藥物用於治療患者的腫瘤或腫瘤轉移，所述方法特徵在於，使用治療有效量的EGFR激酶抑制劑和bortezomib組合，用於同時或順序對患者給藥，其中另外使用一種或多種血管生成抑制劑。
抗血管生成製劑包括例如VEGFR抑制劑如SU-5416和SU-6668(Sugen Inc.of South San Francisco，Calif.，USA)，或者如這裡所描述的例如國際申請號WO 99/24440，WO 99/62890，WO 95/21613，WO 99/61422，WO 98/50356，WO 99/10349，WO 97/32856，WO 97/22596，WO 98/54093，WO 98/02438，WO 99/16755，和WO 98/02437，和美國專利號5,883,113，5,886,020，5,792,783，5,834,504和6,235,764；VEGF抑制劑例如IM862(Cytran Inc.of Kirkland，Wash.，USA)；angiozyme，一種來自核酶的合成的核酶(Boulder，Colo.)；和VEGF的抗體，例如貝伐單抗(如AvastinTMGenentech，South San Francisco，CA)，VEGF的重組人源化抗體；整合蛋白受體拮抗劑和整合蛋白拮抗劑，例如αvβ3，αvβ5和αvβ6整合蛋白，及其亞型，例如西侖吉肽(EMD 121974)，或者抗整合蛋白抗體例如諸如αvβ3特異的人源化抗體(如Vitaxin)；因子如IFN-α(美國專利號41530,901，4,503,035，和5,231,176)；血管抑素(angiostatin)和纖維蛋白溶酶原片段(例如kringle 1-4，kringle 5，kringle 1-3(O』Reilly，M.S.等(1994)Cell 79315-328；Cao等(1996)J.Biol.Chem.27129461-29467；Cao等(1997)J.Biol.Chem.27222924-22928)；內皮他丁(O』Reilly，M.S.等(1997)Cell 88277；和國際專利公開號.WO 97/15666)；血小板反應蛋白(TSP-1；Frazier，(1991)Curr.Opin.Cell Biol.3792)；血小板因子4(PF4)；纖維蛋白溶酶原激活劑/尿激酶抑制劑；尿激酶受體拮抗劑；肝素酶；煙麴黴素類似物如TNP-4701；蘇拉明和蘇拉明類似物；血管抑素類固醇；bFGF拮抗劑；flk-1和flt-1拮抗劑；抗血管生成劑如MMP-2(基質-金屬蛋白酶2)抑制劑和MMP-9(基質-金屬蛋白酶9)抑制劑。有用的基質金屬蛋白酶抑制劑的實例描述在國際專利公開號WO 96/33172，WO96/27583，WO 98/07697，WO 98/03516，WO 98/34918，WO 98/34915，WO98/33768，WO 98/30566，WO 90/05719，WO 99/52910，WO 99/52889，WO99/29667，和WO 99/07675，歐洲專利公開號818,442，780,386，1,004,578，606,046，和931,788；英國專利公開號9912961，和美國專利號5,863,949和5,861,510中。優選的MMP-2和MMP-9抑制劑是具有很少或者沒有MMP-1抑制活性的那些。更優選地，是相對於其它基質-金屬蛋白酶(即MMP-1，MMP-3，MMP-4，MMP-5，MMP-6，MMP-7，MMP-8，MMP-10，MMP-11，MMP-12，和MMP-13)選擇性抑制MMP-2和/或MMP-9的那些。
本發明還提供製備藥物的方法，所述藥物用於治療患者的腫瘤或腫瘤轉移，所述方法特徵在於使用治療有效量的EGFR激酶抑制劑和bortezomib組合，用於對患者同時或順序給藥，其中另外使用一種或多種腫瘤細胞促凋亡劑或者凋亡刺激製劑。
本發明還提供製備藥物的方法，所述藥物用於治療患者的腫瘤或腫瘤轉移，所述方法特徵在於使用治療有效量的EGFR激酶抑制劑和bortezomib組合，用於對患者同時或順序給藥，其中另外使用一種或多種信號轉導抑制劑。
信號傳導抑制劑包括如erbB2受體抑制劑，例如有機分子，或者結合到erbB2受體的抗體如曲妥單抗(如Herceptin)；其它蛋白酪氨酸激酶抑制劑如imitinib(如Gleevec)；ras抑制劑；raf抑制劑；MEK抑制劑；mTOR抑制劑；細胞周蛋白依賴性激酶抑制劑；蛋白激酶C抑制劑；和PDK-1抑制劑(見Dancey，J.和Sausville，E.A.(2003)Nature Rev.DrugDiscovery 292-313，描述了這些抑制劑的一些實例，和它們在治療癌症的臨床試驗中的應用)。
ErbB2受體抑制劑包括例如ErbB2受體抑制劑諸如GW-282974(GlaxoWellcome plc)，單克隆抗體例如AR-209(Aronex Pharmaceuticals Inc.ofThe Woodlands，Tex.，USA)，和描述在以下國際公開號中的erbB2抑制劑WO 98/02434，WO 99/35146，WO 99/35132，WO 98/02437，WO97/13760，和WO 95/19970，以及美國專利號5,587,458，5,877,305，6,465,449和6,541,481。
本發明還提供製備藥物的方法，所述藥物用於治療患者的腫瘤或腫瘤轉移，所述方法特徵在於使用治療有效量的EGFR激酶抑制劑和bortezomib組合，用於對患者同時或順序給藥，其中另外使用抗-HER2抗體或其免疫治療性活性片段。
本發明還提供製備藥物的方法，所述藥物用於治療患者的腫瘤或腫瘤轉移，所述方法特徵在於使用治療有效量的EGFR激酶抑制劑和bortezomib組合，用於對患者同時或順序給藥，其中另外使用一種或多種抗增殖劑。
額外的抗增殖劑包括例如酶法呢基(farnesyl)蛋白轉移酶的抑制劑和受體酪氨酸激酶PDGFR的抑制劑，包括在美國專利號6,080,769，6,194,438，6,258,824，6,586,447，6,071,935，6,495,564，6,150,377，6,596,735和6,479,513，以及國際專利公開WO01/40217中公開和要求保護的那些。
本發明還提供製備藥物的方法，所述藥物用於治療患者的腫瘤或腫瘤轉移，所述方法特徵在於使用治療有效量的EGFR激酶抑制劑和bortezomib組合，用於對患者同時或順序給藥，其中另外使用COX II(環加氧酶II)抑制劑。有用的COX-II抑制劑的實例包括alecoxib(如CelebrexTM)，伐地考昔，和羅非考昔。
本發明還提供製備藥物的方法，所述藥物用於治療患者的腫瘤或腫瘤轉移，所述方法特徵在於使用治療有效量的EGFR激酶抑制劑和bortezomib組合，用於對患者同時或順序給藥，其中另外進行有效量的電離輻射的治療，和/或使用放射性藥物。
輻射源對被治療患者來說可以是外部或者內部的。當輻射源對患者是外部的時候，該治療被稱為外部光束放射療法(EBRT)。當輻射源對患者是內部時，該治療被稱為近距放射治療法(BT)。在本發明上下文中使用的放射性原子可以選自包含但不僅限於下列物質的組鐳，銫-137，銥-192，鋂-241，金-198，鈷-57，銅-67，鎝-99，碘-123，碘-131，和銦-111。當本發明的EGFR激酶抑制劑為抗體時，用這樣的放射性同位素標記該抗體也是可能的。
放射療法是用於控制無法切除或者不宜手術的腫瘤和/或腫瘤轉移的標準治療。當將放療與化療聯合時已經觀察到了改善的結果。放療基於這樣的原理將高劑量的放射遞送到靶區域會導致腫瘤和正常組織中繁殖細胞的死亡。放射劑量方案通常以放射吸收劑量(Gy)、時間和分級來定義，並且必須由腫瘤學家仔細定義。患者接受的放射量取決於不同的考慮，但是最重要的兩個考慮是腫瘤相對於其它身體重要結構和器官的位置，和腫瘤擴展的程度。患者所要經歷的放射治療的典型療程為在1周-6周時間的治療計劃，給藥的患者全部劑量為10-80Gy，每一天為約1.8-2.0Gy的單一部分，一周5天。在本發明的優選實施方案中，當用本發明的治療與放射治療聯合治療人類患者的腫瘤的時候，會產生協同效果。換句話說，當聯合放射療法，任選另外聯合化學或抗癌劑，通過含有本發明組合的藥劑增強了對腫瘤生長的抑制。輔助放射治療的參數在，例如，國際專利公開WO99/60023中。
本發明還提供製備藥物的方法，所述藥物用於治療患者的腫瘤或腫瘤轉移，所述方法特徵在於使用治療有效量的EGFR激酶抑制劑和bortezomib組合，用於對患者同時或順序給藥，其中另外使用一種或多種能增強抗腫瘤免疫應答的藥劑。
能夠增強抗腫瘤免疫應答的藥劑包括例如CTLA4(細胞毒性淋巴細胞抗原4)抗體(如MDX-CTLA4)，和其它能夠阻斷CTLA4的藥劑。具體能應用於本發明的CTLA4抗體包括美國專利號6,682,736中描述的那些。
本發明還提供製備藥物的方法，所述藥物用於減少由治療腫瘤或腫瘤轉移所引起的副作用，所述方法特徵在於使用治療有效量的EGFR激酶抑制劑或bortezomib組合，用於對患者同時或順序給藥，所述的量對於產生加成的，或超加成的或協同的抗腫瘤功效是有效的，並且對於抑制腫瘤的生長也是有效的。
本發明還提供了治療癌症的方法，包括給藥需要這種治療的受試者以(i).第一個有效量的EGFR激酶抑制劑，或其藥用鹽；和(ii).第二個有效量的bortezomib。在該方法中，癌症可以是下文涉及的那些癌症的任何一種，包括肺癌和NSCLC。
本發明還提供了治療癌症的方法，包括給藥需要這種治療的受試者以(i).第一個低於治療量(sub-therapeutic first amount)的EGFR激酶抑制劑，或其藥用鹽；和(ii).第二個低於治療量(sub-therapeutic second amount)的bortezomib。在該方法中，癌症可以是下文涉及的那些癌症的任何一種，包括肺癌和NSCLC。
在前述方法中，第一和第二量的給藥順序可以是同時的或順序的，即可以在給藥EGFR激酶抑制劑之前、給藥EGFR抑制劑之後或給藥EGFR激酶抑制劑同時來給藥bortezomib。在優選的實施方案中，在給藥EGFR激酶抑制劑之前給藥bortezomib。
另外，本發明提供藥物組合物，其在藥用載體中包含EGFR抑制劑和bortezomib。
本發明還提供藥物組合物，特別用於癌症，其包含(i)第一有效量的EGFR激酶抑制劑，或其藥用鹽；和(ii)第二有效量的bortezomib。該組合物任選包含藥用載體和/或賦形劑。
本發明還提供藥物組合物，特別用於癌症，其包含(i)第一低於治療量的EGFR激酶抑制劑埃洛替尼，或其藥用鹽；(ii)第二低於治療量的bortezomib。該組合物任選包括藥用載體和/或賦形劑。
優選地，EGFR激酶抑制劑是埃洛替尼。
本發明使用的術語「患者」優選指的是因任何目的需要EGFR激酶抑制劑治療的人，更優選需要該治療來治療癌症、或者癌前狀態或者損傷的人。但是，該術語「患者」也可以指非人動物，其中，優選哺乳動物如狗，貓，馬，牛，豬，綿羊，以及非人靈長類動物，這些動物需要EGFR激酶抑制劑治療。
在優選的實施方案中，患者是需要治療癌症，或者前癌病症或損傷的人。所述的癌症優選是任何可通過給予EGFR激酶抑制劑部分或者全部治療的癌症。所述的癌症可以是例如肺癌，非小細胞肺(NSCL)癌，支氣管肺泡細胞肺癌(bronchioloalviolar cell lung cancer)，骨癌，胰腺癌，皮膚癌，頭或頸癌，皮膚或者眼球內黑素瘤，子宮癌，卵巢癌，直腸癌，肛門區癌，胃癌(stomach cancer)，胃癌(gastric cancer)，結腸癌，乳腺癌，子宮癌，輸卵管癌，子宮內膜癌，宮頸癌，陰道癌，外陰癌，霍奇金病，食道癌，小腸癌，內分泌系統癌，甲狀腺癌，甲狀旁腺癌，腎上腺癌，軟組織肉瘤，尿道癌，陰莖癌，前列腺癌，膀胱癌，腎或輸尿管癌，腎細胞癌，腎盂癌，間皮瘤，肝細胞癌，膽管癌(biliary cancer)，慢性或者急性白血病，淋巴細胞淋巴瘤，中樞神經系統(CNS)瘤，脊椎瘤，腦幹膠質瘤，多形性成神經膠質細胞瘤，星形細胞瘤，神經鞘瘤，室管膜細胞瘤，成神經管細胞瘤，腦脊膜瘤，鱗狀細胞癌，垂體腺瘤，包括任何上述癌症的頑疾，或一種或者多種上述癌症的組合。癌前病症或者損傷包括例如由下列組成的組口腔白斑，光化性角化病(日光性角化病)，結腸或者直腸的癌前息肉，胃上皮發育不良，腺瘤發育不良，遺傳性息肉結腸癌症候群(HNPCC)，巴雷特食管，膀胱發育不良，和前癌頸病(precancerous cervicalconditions)。優選地，所述的癌症是結腸癌，並且最優選為結腸直腸癌。還優選地，所述癌症是肺癌，最優選非小細胞肺癌(NSCL)。還優選地，所述癌症是胰腺癌。
在本發明中「共同給藥」和「共同施用」bortezomib和EGFR激酶抑制劑(此後將這兩種組分稱為「兩種活性劑」)指的是當將所述兩種活性劑作為被設計以獲得組合治療療效的合適劑量方案的一部分，上述兩種活性劑分開或者一起地任一種地給予。因此，可以將這兩種活性劑或者作為相同藥物組合物的部分或者作為分開的藥物組合物給予。bortezomib可以先於、同時或者後於EGFR激酶抑制劑的給予，或者以其某種組合給予。當以重複的間隔將EGFR激酶抑制劑給予患者時，例如在一個標準療程中，可以將bortezomib先於、同時、或者後於EGFR激酶抑制劑的每次給予，或者以其某種組合，或者以相對於EGFR激酶抑制劑治療的不同間隔，或者以單一劑量先於、在期間的任何時間、或者後於EGFR激酶抑制劑療程給予。
通常將EGFR激酶抑制劑以這樣的劑量方案給予患者，該方案提供了對待治療患者最有效的癌症的治療(同時從效力和安全角度考慮)，如本領域已知的和例如國際專利公開號WO01/34574所公開。在進行本發明治療方法的時候，EGFR激酶抑制劑可以以任何本領域已知的有效方式進行給予，例如經口，局部，靜脈內，腹膜內，肌肉內，關節內，皮下，鼻內，眼內，陰道，直腸或者真皮內途徑，這取決於所要治療癌症的種類，所使用EGFR激酶抑制劑的類型(例如小分子，抗體，RNAi，或者反義構建體)，處方醫生的醫學判斷依據，如基於，例如，已經公開的臨床研究結果。
給予的EGFR激酶抑制劑的量和給予EGFR激酶抑制劑的時機取決於被治療患者的類型(種類，性別，年齡，重量，等等)和狀態，被治療疾病或者病症的嚴重度，和給藥途徑。例如，可以以劑量範圍0.001-100mg/kg體重每天或者每周以單獨或者分開的劑量，或者通過連續輸液將小分子EGFR激酶抑制劑給予患者(見例如國際專利公開號WO01/34574)。特別是，可以以5-200mg每天或者100-1600mg每周的單獨或者分開的劑量範圍，或者通過連續輸液將鹽酸埃洛替尼給予患者。優選劑量是150mg/天。可以以0.1-100mg/kg體重每天/或者每周的單獨或者分開的劑量範圍，或者通過連續輸液將基於抗體EGFR激酶抑制劑，或者反義、RNAi或者核酶構建體給予患者。在一些情況下，低於前述劑量範圍下限的劑量水平可以是足夠的，而在另一些情況下，可以使用更大的劑量而不引起任何有害的副作用，條件是這些更大的劑量在全天給予前首先被分成幾個小劑量。
EGFR激酶抑制劑和bortezomib可以分別或者同時以相同或者不同的路徑、以廣泛種類的各種劑型給予。例如EGFR激酶抑制劑優選口服或者腸胃外給予，而bortezomib優選腸胃外給予。當EGFR激酶抑制劑是鹽酸埃洛替尼(TarcevaTM)的時候，優選口服給予。
EGFR激酶抑制劑可以與多種藥用惰性載體以下列形式給予片劑、膠囊、糖錠、錠劑、硬糖、粉末、噴霧劑、乳膏劑、油膏、栓劑、膠凍、凝膠、糊劑、洗劑、軟膏、酏劑、糖漿等等。這些劑型的給予可以以單一或多個劑量進行。載體包括固體稀釋劑或者填充劑，無菌水性介質和各種非毒性有機溶劑等等。口服藥物組合物可以是適當甜化和/或者增香化的。
EGFR激酶抑制劑和bortezomib可以連同各種藥用惰性載體以下列各種形式結合噴霧劑、乳膏劑、油膏、栓劑、膠凍、凝膠、糊劑、洗劑、軟膏等等。這樣的劑型可以以單個或者多個劑量給予。載體包括固體稀釋劑或者填充劑，無菌水性介質和各種非毒性有機溶劑等等。
應該對所有含有蛋白EGFR激酶抑制劑的製劑進行選擇以避免所述抑制劑變性和/或降解和喪失生物活性。
製備包含EGFR激酶抑制劑的藥物組合物的方法在本領域是已知的，並描述在例如國際專利公開號WO01/34574。製備包含bortezomib的藥物組合物的方法在本領域也是已知的(例如，Singh，N.P.和Verma，K.B.(2002)Archive Oncol.10(4)279-280)。鑑於本發明的教導，從上述引用的出版物和從其他已知的參考文獻的教導，如Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，第18版(1990)，製備包含EGRF激酶抑制劑和bortezomib的藥物組合物的方法是明顯的。
對於口服給予EGFR激酶抑制劑，含有一種或者兩種所述活性劑的片劑與各種賦形劑中任何一種結合，賦形劑例如微晶纖維素，檸檬酸鈉，碳酸鈣，磷酸氫鈣和甘氨酸，以及各種崩解劑例如澱粉(並且優選玉米、馬鈴薯或者木薯澱粉)，藻酸和某些複合矽酸鹽，以及粒化粘合劑例如聚乙烯吡咯烷酮，蔗糖，明膠和阿拉伯膠。另外，潤滑劑例如硬脂酸鎂，月桂硫酸鈉，和滑石通常對於片劑化目的是有用的。類似類型的固體組合物還可以被用作明膠膠囊的填充劑；在這一點，優選的材料還包括半乳糖或者乳糖以及高分子量的聚乙二醇。當口服給予需要水性懸液和/或酏劑的時候，EGFR激酶抑制劑可以與多種甜化或者增香化製劑，著色物質或者染料結合使用，如果需要，也有乳化和/或懸浮劑，連同稀釋劑如水、乙醇、丙二醇、甘油和其各種可能的組合。
對於腸胃外給予任何一種或者兩種所述的活性劑，可以使用芝麻油或者花生油中的溶液，或者使用水性丙二醇中的溶液，以及含有所述活性劑或其相應的水溶性鹽的無菌水溶液。該無菌水溶液被優選適當地緩衝並還優選賦予等滲，例如，用充足的鹽水或者葡萄糖。這些特別的水溶液特別適於靜脈內、肌肉內、皮下和腹膜內注射用。油性溶液適用於關節內、肌肉內和皮下注射用。所有這些溶液在無菌條件下的製備通過本領域技術人員熟知的標準製藥技術可以很容易地實現。應該對任何給予蛋白EGFR激酶抑制劑的腸胃外製劑進行選擇以避免所述抑制劑變性和喪失生物活性。
另外，依照標準製藥實踐，可以通過以下方式局部給予一種或者兩種所述的活性劑例如乳膏劑、洗劑、膠凍、凝膠、糊劑、油膏、軟膏等等。例如，可以製備含有大約0.1％(w/v)-大約5％(w/v)濃度的EGFR激酶抑制劑或者bortezomib的局部製劑。
為獸醫用途，可以將所述的活性劑以上述任何形式和任何途徑分別或者一起給予動物。在一個優選的實施方案中，以膠囊、丸劑、片劑，浸液的形式通過注射或者作為植入物給予EGFR激酶抑制劑。作為備選，可以將EGFR激酶抑制劑與動物飼料一起給予，為此目的，可以製備濃縮的飼料添加劑或者預混和物以用於正常動物飼養。bortezomib優選通過注射或者作為植入物以浸液(liquid drench)形式給予。依照標準的獸醫實踐，以常規方法製備這樣的製劑。
本發明還提供了含有單一容器的試劑盒，所述容器包含EGFR激酶抑制劑和bortezomib兩者。本發明還提供了這樣的試劑盒，其含有第一容器和第二容器，所述第一容器包含EGFR激酶抑制劑，所述第二容器含有bortezomib。在優選的實施方案中，所述的試劑盒容器還可以進一步包括藥用載體。該試劑盒還可以包含無菌稀釋劑，其被優選儲存在一個單獨的附加容器中。所述試劑盒還可以包括一個包裝說明書(package insert)，其包含列印的說明書，用於指導將組合治療用作治療癌症的方法。
本發明還包括藥物組合物，其由結合了藥用載體的EGFR激酶抑制劑和bortezomib組成。
優選地，所述組合物由藥用載體和非毒性的治療有效量的EGFR激酶抑制劑化合物和bortezomib組合組成(包括每種組分的其藥用鹽)。
而且，在該優選的實施方案中，本發明包括用於治療疾病的藥物組合物，其應用導致贅生性細胞、良性或惡性腫瘤生長的抑制、或轉移的抑制，其包含藥用載體和非毒性的治療有效量的EGFR激酶抑制劑化合物和bortezomib組合(包括每種組分的其藥用鹽)。
術語「藥用鹽」指的是從藥用非毒性的鹼或者酸製備出的鹽。當本發明的化合物是酸性的時候，其相應的鹽可以從藥用非毒性鹼中方便地製備，包括無機鹼和有機鹼。從這樣的無機鹼衍生的鹽包括鋁、銨、鈣、銅(銅和亞銅)、鐵、亞鐵、鋰、鎂、錳(錳和亞錳)、鉀、鈉、鋅等鹽。特別優選的是銨、鈣、鎂、鉀和鈉鹽。衍生自藥用有機非毒性鹼的鹽包括伯胺、仲胺和叔胺的鹽，以及環胺和取代的胺如天然存在的和合成取代的胺的鹽。其它可以形成鹽的藥用有機非毒性鹼包括離子交換樹例如諸如精氨酸，甜菜鹼，咖啡鹼，膽鹼，N′，N′-二苄乙二胺，二乙胺，2-二乙氨基乙醇，2-二甲氨基乙醇，乙醇胺，乙二胺，N-乙基嗎啉，N-乙基哌啶，葡糖胺，氨基葡糖，組氨酸，哈胺(hydrabamine)，異丙胺，賴氨酸，甲基葡糖胺，嗎啉，哌嗪，哌啶，聚胺樹脂，普魯卡因，嘌呤，可可鹼，triethylameine，三甲胺，三丙胺，氨基丁三醇(tromethamine)等等。
當本發明的化合物是鹼性時，其相應的鹽可以很方便地從藥用非毒性酸來製備，所述酸包括無機和有機酸。這樣的酸包括例如乙酸，苯磺酸，安息香酸，樟腦磺酸，檸檬酸，乙磺酸，富馬酸，，葡糖酸，穀氨酸，氫溴酸，氫氯酸，羥乙磺酸，乳酸，馬來酸，蘋果酸，扁桃酸，甲磺酸，粘酸，硝酸，pamoic，泛酸，磷酸，琥珀酸，硫酸，酒石酸，p-甲苯磺酸等等。特別優選的是檸檬酸，氫溴酸，氫氯酸，馬來酸，磷酸，硫酸和酒石酸。
本發明的藥物組合物含有作為活性成分的EGFR激酶抑制劑化合物和bortezomib組合(包括其每種組分的藥用鹽)，藥用載體，和任選的其它治療組分或者助劑。其它的治療劑可以包括如上列出的那些細胞毒性的、化療的或者抗癌劑，或者提高這些藥劑的效果的試劑。所述的組合物包括適用於口服、直腸、局部和腸胃外給藥(包括皮下、肌肉內和靜脈內)的組合物，儘管任何給定情況中最合適的途徑將取決於特定的宿主，以及活性成分將被給藥針對的疾病的性質和嚴重程度。所述的藥物組合物可以以單位劑型方便地給出，並且以製藥領域所熟知的任何方法製備。
在實踐中，依照常規藥物組合技術，可以將本發明的由EGFR激酶抑制劑化合物和bortezomib組合(包括其每種組分的藥用鹽)代表的化合物作為活性組分與藥物載體緊密摻合。該載體可以採取廣泛種類的形式，這取決於需要給藥的製劑的類型，例如經口或者腸胃外(包括靜脈內)。因此，本發明的藥物組合物可以呈現為適於口服的離散單位如膠囊，扁囊劑或者片劑，每種都含有預定量的活性成分。此外，所述的組合物可以呈現為粉末、顆粒、溶液、水性液體中的懸液、非水性液體，水包油乳劑，或者油包水液體乳劑。除了上面舉出的常規劑型外，EGFR激酶抑制劑化合物和bortezomib組合(包括其每種組分的藥用鹽)還可以通過緩釋方式和/或者遞送裝置給藥。可以通過任何一種藥學方法製備組合組合物。通常，這樣的方法包括將活性成分與組成一種或者多種必需組分的載體相關聯的步驟。通常，通過均勻化和緊密摻合活性組分與液體載體或細碎的固體載體或兩者來製備所述的組合物。隨後可以將產品方便地定型成所需的形式。
因此，本發明的藥物組合物可以含有藥用載體和EGFR激酶抑制劑化合物和bortezomib組合(包括其每種組分的藥用鹽)。EGFR激酶抑制劑化合物和bortezomib組合(包括其每種組分的藥用鹽)也可以與一種或者多種其它治療活性化合物被包含在藥物組合物中。其它的治療活性化合物可以包括如上面列出的那些細胞毒性的、化療的或者抗癌劑，或者增強這些藥劑效果的製劑。
因此本發明的一個實施方案中，藥物組合物可以含有組合以抗癌劑的EGFR激酶抑制劑化合物和bortezomib，其中所述的抗癌劑是一種選自由下列各項組成的組的成員烷基化藥物，抗代謝物，微管抑制劑，鬼臼毒素，抗生素，亞硝基脲，激素治療，激酶抑制劑，腫瘤細胞凋亡活化劑，和抗血管生成劑。
使用的藥物載體可以是例如固體、液體、或者氣體。固體的實例包括乳糖、石膏粉、蔗糖、滑石、明膠、瓊脂、果膠、阿拉伯膠、硬脂酸鎂、和硬脂酸。液體載體的實例是糖漿、花生油、橄欖油和水。氣體載體的實例包括二氧化碳和氮氣。
在製備用於口服劑型的組合物中，可以使用任何方便的藥物介質。例如水，二元醇，油，醇類，增香劑，防腐劑，著色劑等等可以被用於形成口服液體製劑例如懸液，酏劑和溶液，而載體例如澱粉，糖，微晶纖維素，稀釋劑，粒化劑，潤滑劑，粘合劑，崩解劑等可以被用於形成口服固體製劑例如粉末、膠囊和片劑。因為其容易給藥，片劑和膠囊是優選的口服劑型，從而使用固體藥物載體。任選地，片劑可以用標準的水性或者非水性技術包衣。
含有本發明組合物的片劑可以任選地與一種或者多種附屬組分或者助劑通過壓制或者成型來製備。壓縮片劑可以通過用合適的機器通過壓縮製備，其活性組分為自由流動形式如粉末或顆粒，任選地與粘合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、表面活性成分或者分散劑混和。成型片劑可以通過在合適的機器中成型，粉化化合物的混合物用惰性液體稀釋劑溼潤。每種片劑優選含有大約0.05mg到大約5g的活性組分，並且每個扁囊劑或者膠囊優選含有大約0.05mg到大約5g的活性組分。
例如，用於口服給藥於人的製劑可以含有大約0.5mg到5g的活性劑，與合適的和便捷量的、可能從大約5％-大約95％全部組合物變化的載體物質混合。單位劑型通常含有從大約1mg到大約2g的活性組分，通常為25mg，50mg，100mg，200mg，300mg，400mg，500mg，600mg，800mg，或者1000mg。
本發明適用於腸胃外給藥的藥物組合物可以被製備為在水中的活性化合物的溶液或者懸液。可以包括合適的表面活性劑例如諸如羥丙基纖維素。分散體也可以在甘油、液體聚乙二醇、及其在油中的混和物中來製備。另外，防腐劑可以被加入其中以防止微生物的有害生長。
本發明的適合注射用的藥物組合物包括無菌的水性溶液或者分散體。此外，所述的組合物可以以無菌粉末的形式用於臨時製備這樣的無菌可注射溶液或者分散體。在所有情況下，最終的可注射形式必須是無菌的並且必須是有效的流體以方便注射。所述的藥物組合物必須在製備和儲存條件下是穩定的；因此，其優選應該以防止微生物如細菌和真菌的汙染作用的方式保存。所述的載體可以是溶劑或者分散介質，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油，丙二醇和液體聚乙二醇)，植物油及其適當的混合物。
本發明的藥物組合物可以以適用於局部使用的方式存在，例如諸如氣溶膠，乳膏劑，油膏，洗劑，撒粉，等。此外，所述的組合物可以是適用於經皮裝置的形式。這些製劑可以利用本發明的EGFR激酶抑制劑化合物和bortezomib組合(包括其每種組分的藥用鹽)，經由傳統方法製備。作為實例，通過混和親水物質和水，以及大約5重量％到大約10重量％的所述化合物來製備乳膏劑或者油膏，以製備具有所需稠度的乳膏劑或者油膏。
本發明的藥物組合物可以是適於直腸給藥的形式，其中的載體是固體。優選混和物形成單位劑量栓劑。合適的載體包括可可脂和其它本領域常用的物質。所述的栓劑可以通過首先將所述組合物與軟化的或者融化的載體混和並在模具中冷卻和成型來方便地形成。
除了上述的載體組分外，上面描述的藥物製劑，如果合適，可以包含一種或者多種另外的載體組分例如稀釋劑、緩衝劑，增香劑，粘合劑，表面活性劑，增稠劑，潤滑劑，防腐劑(包括抗氧化物)等等。另外，可以包括其它的助劑來使得所述製劑與目的受體的血液等滲。含有EGFR激酶抑制劑化合物和bortezomib組合(包括其每種組分的藥用鹽)的組合物也可以製備成粉末或者液體濃縮物形式。
本發明組合的化合物劑量水平可以近似地如本文所述，也可以如本領域對這些化合物的描述那樣。但是應該理解的是，對於任何具體患者的特定劑量水平將取決於許多因素，包括年齡、體重、總體健康、性別、飲食、給藥時間、給藥路徑、排洩率、藥物組合以及受治療的具體疾病的嚴重性。
經過以下的實驗細節將會更好的理解本發明。但是，本領域的技術人員應該清楚的理解所討論的具體的方法和結果僅僅是為了闡述本發明，而後附的權利要求會更完全地概括本發明，這些實驗細節不能被認為以任何方式限制了本發明。
實驗細節介紹在體外利用一組NSCLC細胞系研究了Erltinib和bortezomib組合的功效。該組合的基本原理是這兩種藥劑每種已經顯示臨床活性，沒有交叉毒性，它們在細胞周期的不同部分具有功效。而且，象IκB的蛋白體降解(Stevenson，J.P.et al.(2004)J.Clin.Oncol.22(14S)7145)，EGFR軸的活化已經顯示激活NF-κB途徑，我們假定通過抑制上遊和下遊靶目標，我們能夠激活更多的細胞毒性。
材料和方法化學品埃洛替尼由OSI Pharmaceuticals作為鹽酸埃洛替尼(TarcevaTM)提供，臨床級別的bortezomib獲自Montifiore Medical Center，NY，門診藥房。將兩種藥劑均溶解在DMSO中作為儲液，並用PBS稀釋到需要的濃度。單克隆抗體獲自Santa Cruz Biotechnology，Inc.(Santa Cruz，CA)，其它的化學品獲自Sigma-Aldrich Chemical Co.(St.Louis，MO)。
細胞培養和細胞毒性檢測7種非小細胞肺癌細胞系(H322，H358，H661，H460，H522，H1299，A549)獲自美國典型培養物保藏中心(Manassas，VA)。將所有的細胞培養在補充以10％胎牛血清的RPMI 1640，5％CO2和95％空氣的溼潤氣氛中。
將對數期生長的細胞連續暴露於各種濃度的埃洛替尼HCl和bortezomib達72小時，通過MTT檢測評估藥物誘導的細胞毒性，如先前所述(Ling，Y-H et al.(1993)Cancer Res.53(7)1583-1589)。
對於組合研究，將細胞暴露於埃洛替尼HCl或bortezomib，以伴隨或間隔24小時順序的方式，或者單獨或者組合給藥，從第一次暴露於藥物起72小時通過MTT檢測評估細胞存活。
細胞周期分析以伴隨或間隔24小時順序的方式，或者單獨或者組合地用埃洛替尼HCl或bortezomib處理細胞。從第一次暴露於藥物開始48小時收穫細胞，用75％乙醇在-20℃過夜固定，然後在室溫下與5μg/mL碘化丙錠(propidium iodide)和5μg/mL RNase I(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)溫育3小時。通過流式細胞儀(Epics Profile Analyzer；Coulter Co.，Miami，FL)測定細胞周期的不同階段的細胞數和凋亡細胞(sub-G1)。
蛋白印跡分析將細胞從培養物刮除，用PBS洗滌2次，然後於0-4℃懸浮在60-100μL含50mM Tris-HCl(pH 7.5)，250mM NaCl，1mM EDTA，1mM EGTA，1mM NaF，1mM苯基甲基磺醯氟，1mM DTT，20μg/mL亮抑酶肽，20μg/mL抑酶肽，0.1％Triton X-100含1％SDS的蛋白印跡裂解緩衝液中15分鐘。於0℃，1500x g離心10分鐘後，收集上清液，並在10％SDS-PAGE上分離蛋白質。電泳後，將蛋白印跡轉移到硝酸纖維素膜上。將膜用5％脫脂奶粉的TBST溶液封閉，並與相應的初級抗體於4℃過夜溫育。用TBST洗滌3次後，將膜在室溫下與辣根過氧化物酶-綴合的次級抗體溫育1小時，所述次級抗體用TBST稀釋(1∶1000)。通過增強的化學發光(cheiluminescence)反應系統(Amersham，Arlington Heights，IL)顯現檢測的蛋白信號。
統計所有結果是三次獨立實驗的平均值。將結果表示為平均值+/-標準偏差，並在適當的時候利用斯氏t-檢驗來比較平均值。
結果NSCLC細胞對埃洛替尼和bortezomib的敏感性在圖1中顯示埃洛替尼HCl和bortezomib對7種NSCLC細胞系的細胞毒性。檢測的7種NSCLC細胞系中僅2種對埃洛替尼敏感，其餘的IC50值高出10倍，或是抗性的。在另一方面，bortezomib具有較窄的活性範圍，其IC50為10-66nM。我們選擇了對埃洛替尼HCl敏感的2個細胞系(H322和H358)，和2個抗性的細胞系(A549和H1299)，以進一步研究兩種藥劑的組合。
埃洛替尼和bortezomib的合併的細胞毒性功效在圖2中顯示在人NSCLC細胞中埃洛替尼和bortezomib組合的組合指數。除了結果不明確的H358人支氣管肺泡細胞之外，埃洛替尼和bortezomib組合的細胞毒性既不是協同性的，也不是加成性的。由於兩種藥劑中支氣管肺泡細胞癌症患者中的臨床活性和來自協同性分析的不明確結果，我們進一步檢測在H358支氣管肺泡細胞中的組合。細胞計數和凋亡的時程分析證實同時提供的埃洛替尼和bortezomib組合具有比單獨任何一種藥劑更多的活性。然而，合併的功效不是加成性的(圖3)。
埃洛替尼對細胞周期和凋亡的功效我們檢測兩種藥劑對細胞周期和凋亡的功效。埃洛替尼導致細胞周期在G1期停滯，在更敏感的細胞中最顯著。該G1細胞周期停滯伴隨著敏感細胞而非抗性細胞中的凋亡的增加。在敏感和抗性細胞中關於基線EGFR表達沒有差別。埃洛替尼在敏感細胞和抗性細胞中抑制EGF-誘導的EGFR-磷酸化。
bortezomib對細胞周期和凋亡的功效如我們先前所報導，bortezomib誘導細胞周期停滯在G2/M期，並且細胞周期停滯伴隨凋亡的時間依賴性增加(Ling，Y-H.et al.(2003)Clin.Cancer Res.9(3)1145-1154)。與先前報導的具有突變p53的H322細胞系相比，bortezomib誘導的G2/M停滯和凋亡的功效在具有野生型的細胞系(A549)或無效p53的細胞系(H358，H1299)中更顯著。
埃洛替尼和bortezomib之間的時間表依賴性相互作用我們檢驗了以24小時間隔順序給藥的兩種藥物的組合的功效。將對數期生長的細胞暴露於單獨的埃洛替尼HCl和bortezomib藥物中，或暴露於同時給予或間隔24小時順序給予的兩者組合中，如上所述，在從第一次暴露於藥物48小時進行細胞周期分析。用bortezomib，接著用埃洛替尼HCl的順序療法具有與單獨bortezomib或同時暴露相似的細胞周期功效。然而，預先暴露於埃洛替尼24小時導致G1細胞周期停滯，並廢除了bortezomib的G2/M功效。預先暴露於埃洛替尼對這種拮抗效應在敏感細胞系(H322和H358)和抗性細胞(A549和H1299)中均觀察到，其中抗性細胞的程度較低，並且這種拮抗效應與由埃洛替尼誘導的G1停滯的程度成比例。這種細胞周期拮抗效應在H1299細胞中最不顯著，該細胞對埃洛替尼誘導的G1停滯最具抗性。
我們進一步檢驗了bortezomib誘導的細胞毒性和凋亡的這種細胞周期效應的結果。與單獨埃洛替尼處理相比，預先暴露於埃洛替尼導致增加的細胞存活，和減少的凋亡。再次，埃洛替尼敏感的H358以及抗性A549中均觀察到這種效應。不幸地是，與單獨bortezomib處理相比，通過伴隨暴露或相反的順序，即先bortezomib，然後接著是埃洛替尼，沒有觀察到增加的活性。
預暴露於埃洛替尼的拮抗作用獨立於p53穩定化p53也是一種應答於細胞應激而介導凋亡的重要的介質。在靜態細胞中，p53具有非常短的半衰期，並且被Mdm-2嚴格地介導。後者結合p53，並且通過其遍在蛋白連接酶功能把p53靶向蛋白酶體降解。細胞應激在p53上導致一系列的磷酸化事件，這由於p53活化導致從Mdm-2解離。p53活化的結果包括細胞周期停滯，DNA修復，和如果DNA修改不成功的話，發生凋亡。
我們先前已證實bortezomib抑制p53蛋白的降解，由bortezomib誘導的G2/M停滯可能與遍在蛋白化的p53蛋白積累有關。我們檢驗了埃洛替尼和bortezomib不同順序對p53的影響，以闡明通過預先暴露於埃洛替尼所觀察到的細胞周期拮抗作用。將具有野生型p53的A549細胞暴露於單獨的bortezomib或埃洛替尼中，或伴隨地或間隔24小時順序地暴露於兩者的組合中，通過蛋白印跡檢驗p53的表達。相比於陽性對照紫杉醇，暴露於bortezomib導致遍在蛋白化的p53積累。伴隨或順序暴露於埃洛替尼對bortezomib誘導的遍在蛋白化的p53積累沒有影響。該結果，結合我們在p53無效H358細胞中觀察到的相似的拮抗結果，證實預先暴露於埃洛替尼的拮抗效應獨立於bortezomib誘導的p53穩定化。
預先暴露於埃洛替尼防止bortezomib誘導的胱天蛋白酶3活化我們先前的工作證實bortezomib誘導活性氧類別(ROS)的產生，這對於bortezomib誘導的G2/M停滯和凋亡是必需的。這種ROS產生伴隨著線粒體電勢改變，細胞色素c釋放到細胞溶膠中，和效應物胱天蛋白酶包括胱天蛋白酶3的最終活化。我們檢驗了bortezomib和埃洛替尼的不同時間表(schedule)對胱天蛋白酶3活化和PARP切割的作用。預先暴露於埃洛替尼24小時抑制bortezomib誘導的胱天蛋白酶3活化和PARP切割。這在A549和H358細胞中均觀察到。
結論我們的結果強調在組合臨床活性生物藥劑前適當地臨床前研究的重要性。在具有NSCLC的患者中，埃洛替尼和bortezomib已經顯示具有臨床活性，並且這些藥劑不具有交叉毒性。我們觀察到在我們的NSCLC細胞組中，埃洛替尼的細胞毒性是選擇性的，而bortezomib具有更窄範圍的細胞毒性。在檢驗的4種細胞系的3種中，埃洛替尼和bortezomib既不是加成性的，也不是協同性的。在H358支氣管肺泡細胞中，該組合比單獨任何一種藥劑更有活性，但效果不是加成性的。
我們證實我們先前的報導，即bortezomib誘導G2/M細胞周期停滯，並且伴隨凋亡的時間依賴性增加(Ling，Y-H.et al.(2003)Clin.Cancer Res.9(3)1145-1154)。預先暴露於埃洛替尼導致G1細胞周期停滯，並且廢除了bortezomib的活性。埃洛替尼對遍在蛋白化的p53蛋白的穩定性沒有影響。然而，通過預先暴露於埃洛替尼抑制了bortezomib對胱天蛋白酶3的活化。在我們研究中觀察到的預先暴露於埃洛替尼的時間表依賴性拮抗效應強調了組合活性抗腫瘤藥物的治療時間表的重要性。
總之，本研究的結果證實了埃洛替尼和bortezomib組合比單獨任何一種藥劑在H358支氣管肺泡細胞中更有活性，因此可用於治療患有癌症的患者的某些NSCLC和其它腫瘤。在結合埃洛替尼和bortezomib時時間表的選擇是非常重要的，並且需要進一步的體內研究來進一步評估該組合。
通過參考結合所有的專利、公開的專利申請和本文公開的其它文獻都通過參考特別結合於此。
等價物本領域的技術人員使用不過是常規的實驗就會認識到或者能夠確定，許多於此處具體描述的本發明的具體實施方案的等價物。下面的權利要求的範圍意欲將這些等價物包含其中。
權利要求
1.藥物組合物，其包含在藥用載體中的EGFR激酶抑制劑和bortezomib。
2.權利要求1的藥物組合物，其中所述EGFR激酶抑制劑包括埃洛替尼。
3.權利要求2的藥物組合物，其中在所述組合物中的埃洛替尼以鹽酸鹽的形式存在。
4.權利要求1-3任一項的藥物組合物，其另外包含一種或多種另外的抗癌劑。
5.權利要求4的藥物組合物，其中所述另外的抗癌劑是選自下列各項的成員烷基化藥物，抗代謝物，微管抑制劑，鬼臼毒素，抗生素，亞硝基脲，激素療法，激酶抑制劑，腫瘤細胞凋亡的活化劑，和抗血管生成劑。
6.用於製備藥物的方法，所述藥物用於治療腫瘤或腫瘤轉移，所述方法特徵在於使用EGFR激酶抑制劑和bortezomib。
7.權利要求6的方法，其中所述藥物用於癌症。
8.權利要求6或7的方法，其中在相同的製劑中將EGFR激酶抑制劑和bortezomib共同給藥於患者。
9.權利要求6或7的方法，其中在不同的製劑中將EGFR激酶抑制劑和bortezomib共同給藥於患者。
10.權利要求6-9任一項的方法，其中通過相同的途徑將EGFR激酶抑制劑和bortezomib共同給藥於患者。
11.權利要求6-9任一項的方法，其中通過不同的途徑將EGFR激酶抑制劑和bortezomib共同給藥於患者。
12.權利要求6-11任一項的方法，其中通過胃腸外或口服給藥將EGFR激酶抑制劑給藥於患者。
13.權利要求6-12任一項的方法，其中通過胃腸外給藥將bortezomib給藥於患者。
14.權利要求6-13任一項的方法，其中被治療的腫瘤或腫瘤轉移選自肺癌，結腸直腸癌，NSCLC，支氣管肺泡細胞肺癌，骨癌，胰腺癌，皮膚癌，頭或頸癌，皮膚黑素瘤，眼球內黑素瘤，子宮癌，卵巢癌，直腸癌，肛門區癌，胃癌(stomach cancer)，胃癌(gastric cancer)，結腸癌，乳腺癌，子宮癌，輸卵管癌，子宮內膜癌，宮頸癌，陰道癌，外陰癌，霍奇金病，食道癌，小腸癌，內分泌系統癌，甲狀腺癌，甲狀旁腺癌，腎上腺癌，軟組織肉瘤，尿道癌，陰莖癌，前列腺癌，膀胱癌，腎癌，輸尿管癌，腎細胞癌，腎盂癌，間皮瘤，肝細胞癌，膽管癌，慢性白血病，急性白血病，淋巴細胞淋巴瘤，CNS瘤，脊椎癌，膠質瘤，腦幹膠質瘤，多形性成神經膠質細胞瘤，星形細胞瘤，神經鞘瘤，室管膜細胞瘤，成神經管細胞瘤，腦脊膜瘤，鱗狀細胞癌和垂體腺瘤腫瘤或腫瘤轉移。
15.權利要求6-14任一項的方法，其中所述腫瘤或腫瘤轉移是難治的。
16.權利要求6-15任一項的方法，其中所述被治療的腫瘤或腫瘤轉移是肺癌腫瘤或腫瘤轉移。
17.權利要求6-16任一項的方法，其中所述EGFR激酶抑制劑包括埃洛替尼。
18.權利要求6-17任一項的方法，其另外包括施用一種或多種其它抗癌劑。
19.權利要求6-18任一項的方法，其中所述其它的抗癌劑選自烷基化劑，環磷醯胺，苯丁酸氮芥，順鉑，卡鉑，奧沙利鉑，白消安，美法侖，卡莫司汀，鏈脲黴素，曲他胺，絲裂黴素C，抗代謝物，甲氨蝶呤，依託泊苷，6-巰嘌呤，6-硫鳥嘌呤(6-thiocguanine)，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶，卡培他濱，吉西他濱，達卡巴嗪，抗生素，放線菌素D，多柔比星，柔紅黴素，博來黴素，普卡黴素，生物鹼，長春鹼，紫杉醇，多西他賽，長春瑞濱，糖皮質激素，地塞米松，皮質甾類，波尼松，核苷酶抑制劑，羥基脲，胺基酸耗竭酶，天冬醯胺酶，託泊替康，伊立替康，甲醯四氫葉酸和葉酸衍生物。
20.製備藥物組合物的方法，所述藥物組合物用於治療患者中的腫瘤或腫瘤轉移，所述方法包括將bortezomib和EGFR激酶抑制劑結合。
21.權利要求20的方法，其中EGFR激酶抑制劑是埃洛替尼。
22.權利要求21的方法，其還包括將藥用載體與bortezomib和埃洛替尼結合。
23.試劑盒，其包含容器，所述容器包括bortezomib和EGFR激酶抑制劑。
24.權利要求23的試劑盒，其還包含無菌稀釋劑。
25.權利要求23或24的試劑盒，其中所述EGFR激酶抑制劑是埃洛替尼。
26.權利要求23-25任一項的試劑盒，其還包含包裝說明書，所述包裝說明書包括列印的說明，以指導患者使用bortezomib和埃洛替尼的組合治療作為治療患者中腫瘤、腫瘤轉移或其它癌症的方法。
27.權利要求1的組合物，其另外包含一種或多種其它的抗癌劑。
28.權利要求27的組合物，其中所述其它的抗癌劑是選自由下述各項組成的組的成員烷基化藥物，抗代謝物，微管抑制劑，鬼臼毒素，抗生素，亞硝基脲，激素療法，激酶抑制劑，腫瘤細胞凋亡的活化劑和抗血管生成劑。
29.治療癌症的方法，包括對需要這種治療的受試者給藥(i)第一有效量的EGFR激酶抑制劑，或其藥用鹽；和(ii)第二有效量的bortezomib。
30.治療癌症的方法，包括對需要這種治療的受試者給藥(i)第一低於治療量的EGFR激酶抑制劑，或其藥用鹽；和(ii)第二低於治療量的bortezomib。
31.權利要求29或30的治療癌症的方法，其中EGFR激酶抑制劑是埃洛替尼。
32.權利要求6的方法，其中被治療的腫瘤或腫瘤轉移是結腸直腸腫瘤或腫瘤轉移。
33.藥物組合物，特別用於癌症，所述藥物組合物包含(i)第一有效量的EGFR激酶抑制劑，或其藥用鹽；和(ii)第二有效量的bortezomib。
34.藥物組合物，特別用於癌症，所述藥物組合物包含(i)第一低於治療量的EGFR激酶抑制劑，或其藥用鹽；和(ii)第二低於治療量的bortezomib。
35.權利要求33或34的藥物組合物，其中所述EGFR激酶抑制劑是埃洛替尼。
36.EGFR激酶抑制劑和bortezomib，其用作藥物，特別用於癌症。
37.埃洛替尼和bortezomib，其用作藥物，特別用於癌症。
38.EGFR激酶抑制劑和bortezomib在製備用於治療腫瘤或腫瘤轉移的藥物中的應用。
39.權利要求38的應用，其中所述EGFR激酶抑制劑是埃洛替尼。
40.如此處所述的新的化合物，工藝，藥物組合物，方法和用途。
全文摘要
本發明提供製備藥物的方法，所述藥物用於治療患者的腫瘤或腫瘤轉移，所述方法特徵在於使用治療有效量的EGFR激酶抑制劑和bortezomib，結合或不結合另外的藥劑或治療，如其它的抗癌藥物或輻射療法。本發明還包含藥物組合物，其由EGFR激酶抑制劑和bortezomib組合以及藥用載體組成。可用於實施本發明的EGFR激酶抑制劑優選的實例是化合物鹽酸埃洛替尼(也已知為Tarceva
文檔編號A61P35/00GK101043892SQ200580035560
公開日2007年9月26日 申請日期2005年10月18日 優先權日2004年10月18日
發明者比拉勒·皮佩蒂 申請人:比拉勒·皮佩蒂