包含肉毒桿菌神經毒素的治療組合物的製作方法

2023-05-07 10:00:01 1

專利名稱：包含肉毒桿菌神經毒素的治療組合物的製作方法
包含肉毒桿菌神經毒素的治療組合物本申請是申請日為2005年7月19日、發明名稱為「包含肉毒桿菌神經毒素的治療 組合物」、申請號為200580(^8206. 4的申請的分案申請。本發明涉及包含源自肉毒梭狀芽孢桿菌(Clostridium botulinum)的肉毒桿菌神 經毒素的藥物組合物，該神經毒素不含天然存在於肉毒桿菌神經毒素絡合物中的絡合蛋白 質，或者涉及包含經化學修飾或經遺傳學操作修飾的肉毒桿菌神經毒素的藥物組合物，所 述經修飾的肉毒桿菌毒素不含與肉毒桿菌神經毒素天然形成絡合物的絡合蛋白質。而且， 本發明的藥物組合物具有良好的穩定性，且不用人血清白蛋白就能有利地配製。人起源的白蛋白已經大量用作存在於藥物組合物中的蛋白活性成分的載體和穩 定劑。白蛋白已經被證明能通過減少活性成分的粘連和變性來穩定組合物中蛋白質性質的 活性成分。而且，該白蛋白注射到人類患者不具有免疫原性。然而，在藥物組合物中使用白蛋白存在顯著的缺點。已認為白蛋白對某些穩定 的病毒、朊病毒或其它傳染性或致病化合物的傳播起作用，例如人類可傳染海綿狀腦病 (TSE)。結果是，對包含人血清白蛋白藥物組合物的調節性研究不斷增加。相似地，已經將 明膠用在包含蛋白質活性成分的一些藥物組合物中作為白蛋白替代物。作為哺乳動物起源 的蛋白質，明膠也引起病原體傳播的相同的危險。因此，需要哺乳動物起源的蛋白質穩定劑 的替換物。肉毒桿菌毒素絡合物由梭狀芽孢桿菌蛋白質的混合物組成。它們是具有不同分子 量的血凝素，無毒的、非血凝的蛋白質(Mr約120，000)和神經毒素(Mr約150，000)。它們 形成酸穩定的絡合物，在食物中毒時該絡合物是形成口服毒性的原因。與純神經毒素相反， 該絡合物抵抗胃腸道中的攻擊性環境，使得神經毒素的腸內吸收成為可能，且其通過血流 和淋巴系統到達靶細胞，引起了神經遞質釋放的阻斷。接著產生肌肉麻痺和各種自律功能 的停止。中毒患者死於呼吸肌衰竭。由於神經毒素在胃腸道中降解從而不經歷腸吸收，所 以攝取之後是無毒的。對於胃腸外給藥，由於絡合物在組織中分解成各種組分，且只有神經 毒素被靶細胞吸收，所以神經毒素和該絡合物的治療作用沒有差別。目前，兩種包含A型肉毒桿菌神經毒素的產品被批准用於治療眼瞼痙攣、偏側顏 面痙攣和痙攣性斜頸Β0Τ0Χ 和DYSP0RT 。當前技術發展水平是將肉毒桿菌神經毒素 直接注射到張力障礙的或痙攣的肌肉中，在生理學PH值下從絡合物中釋放神經毒素，從而 產生所需的藥理學作用。當前正進行治療其它神經系統病症的臨床試驗(例如痙攣狀態、 偏頭痛、腰(背)痛、頸椎棘突病症、多涎症)。A型肉毒桿菌毒素絡合物(Mr 900, 000)被 批准用於治療各種各種肌張力障礙。被批准的產品還用於化妝適應症例如多汗症和顯著的 皺紋。其它的肉毒梭狀芽孢桿菌毒素絡合物(B、C1、D、E、F、G型)和通過化學修飾或遺傳 學操作而從肉毒梭狀芽孢桿菌毒素衍生的毒素也適合於這些治療。BOTOX 和DYSP0RT 都以凍幹形式提供給臨床醫生用於在使用前重新配製。 不幸的是，並不是每一個患者和適應症需要相同的劑量。結果是，重新配製的組合物常常被 冷凍或冷藏供以後使用。已經評價了這些隨後重新配製的組合物的效能穩定性。業已發現 當重新配製和冷凍下貯存12小時後，BOTOX 至少喪失44%的效能。而且，當重新配製的組合物在 _70°C冷凍時，喪失 70% 的效能。Gartlan，Μ. G.，和 Hoffman，H. Τ. Crystalline preparation of botulinum toxin type A(Botox) !Degradation in potency with storage. ,Otolaryngology-Head and Neck Surgery 102(2) :135-140 (1992)。該不穩定性 導致了顯著的劑量變化和產品浪費。因此，本發明的目的是研製和生產穩定的肉毒桿菌毒 素液體和凍幹製劑，其比現存製劑具有更好的操作特性。已經研製了包含肉毒桿菌神經毒素(A、B、C1、D、E、F或G型)的新的藥物組合物， 其不含血凝素和其它外源性蛋白。這減少了藥物組合物的總蛋白含量而沒有降低毒素的 量。我們在抗原研究中發現，所有類型的純神經毒素與A型商購產品和B到G型絡合物相 反，不誘導或者至多非常小地誘導抗體的形成。當治療使用這種新研製藥物(純的A、B、C1、 D、Ε、F或G型神經毒素)時，即使重複給藥之後也沒有因抗體引起的治療失敗。然而，如上面特別指出的，製劑產生了問題。作為蛋白質性質的活性成分，肉毒杆 菌毒素非常不穩定。而且，肉毒桿菌毒素絡合物極易由於表面變性、熱和鹼性條件而變性。由於通常含有酶，肉毒桿菌毒素(它們是細胞內肽酶)的生物活性依賴於、至少部 分依賴於它們的三維構象。因此，可通過熱、各種化學物質、表面拉伸和表面乾燥將肉毒杆 菌毒素解毒。另外，眾所周知，在被批准的適應症中使用的稀釋毒素濃度導致毒素迅速的解 毒作用，除非有適當的穩定劑存在。而且，毒素穩定性是貯存的重要因素。所以穩定劑是必 需的。迄今為止，通過製備成哺乳動物衍生蛋白的白蛋白和明膠已經獲得了穩定性。如上 述指出的，哺乳動物衍生蛋白增加了從供體攜帶的某些穩定的病毒、朊病毒或其它傳染性 或致病性化合物汙染毒素的風險。此外，凍幹的條件，包括PH值、溫度、稀釋和真空壓力造成毒素解毒。迄今為止，哺 乳動物衍生蛋白例如明膠和血清白蛋白已經成功用於穩定肉毒桿菌毒素，並且是標準的穩 定劑。例如，包含商業上可獲得的肉毒桿菌毒素的藥物組合物BOTOX (可從 Allergan, Inc.，of Irvine，California購得)由純化的A型肉毒桿菌毒素、白蛋白和氯化 鈉組成，其以無菌、真空乾燥的形式包裝。每瓶BOTOX 包含無菌、真空乾燥形式的約100 單位(U)的A型肉毒梭狀芽孢桿菌毒素絡合物、0. 5毫克人血清白蛋白和0. 9毫克氯化鈉， 不含防腐劑。現有技術中有很多穩定蛋白質組合物的嘗試。Carpender等人，Interactions of Stabilizing Additives with Proteins During Freeze—Thawing and Freeze—Drying, International Symposium on Biological Product Freeze—Drying and Formulation, 24-260ctober 1990 ；Karger(1992), 225-239 與僅與白蛋白凍幹之後的毒性相比(> 75%至> 90%恢復率(recovery))，將纖 維二糖作為賦形劑與白蛋白和氯化鈉聯合使用，凍乾結晶性A型肉毒桿菌毒素與這些賦形 劑之後證明毒性降解(10%恢復率)。Goodnough等人，Stabilization of Botulinum Toxin Type A During Lyophilization, App&Envir.Micro. 58(10)3426—3428(199 。而且，已知包含糖類(例如葡萄糖或葡萄糖聚合物)或碳水化合物的蛋白質製劑 是不穩定的，因為蛋白質和葡萄糖已被證實有相互作用並進行Maillard降解，這些都歸因 於葡萄糖和葡萄糖聚合物的還原性質。相反，醇，例如肌醇、甘露醇是非還原性的，已經長期 用於凍幹過程中穩定蛋白質的防凍賦形劑。
根據肉毒桿菌毒素的不穩定性和伴隨哺乳動物衍生穩定劑和多糖的風險，適當的 蛋白質穩定劑將是製劑科學工作者持續的目標。鍵本發明的目的是提供藥物組合物中哺乳動物衍生蛋白的非蛋白質性質的替代物， 所述藥物組合物中包含經化學修飾或遺傳學操作從肉毒桿菌毒素衍生的肉毒桿菌毒素或 者毒素。當注射到人類患者時，該新製劑必須具有低的，優選忽略不計的免疫原性。因此我們認為我們的發明要包含的特別可概括為下述語句藥物組合物包含源自A、B、C1、D、E、F或G型肉毒梭狀芽孢桿菌的肉毒桿菌神經毒 素或兩種或更多種肉毒桿菌神經毒素的混合物，和非蛋白質性質的穩定劑，其中的神經毒 素或神經毒素混合物不含與肉毒桿菌神經毒素天然形成絡合物的絡合蛋白，所述穩定劑在 水溶液中保留了肉毒桿菌神經毒素的生物活性。這樣的藥物組合物，其中肉毒桿菌神經毒素經化學修飾或經遺傳學操作修飾，或 者是其混合物；這樣的藥物組合物，其中非蛋白質性質的穩定劑選自透明質酸、聚乙烯吡咯烷酮 和聚乙二醇中的一種或多種；這樣的藥物組合物，包含pH緩衝劑；這樣的藥物組合物，其中pH緩衝劑是醋酸鈉；這樣的藥物組合物，包含防凍劑；這樣的藥物組合物，其中防凍劑是多元醇；這樣的藥物組合物，其中多元醇選自肌醇、甘露醇和山梨醇中的一種或多種；這樣的藥物組合物，是冷凍乾燥的；這樣的藥物組合物，其中非蛋白質性質試劑是透明質酸且其中的組合物是冷凍幹 燥的；這樣的藥物組合物，包含透明質酸且其中的組合物是冷凍乾燥的；這樣的藥物組合物，以治療肉毒桿菌神經毒素療法或治療所適應的病症的有效量 向動物，包括人類給藥；這樣的藥物組合物，其中，肉毒桿菌神經毒素療法或治療所適應的病症選自化妝 病症、眼瞼痙攣、偏側顏面痙攣、痙攣性斜頸、痙攣狀態、肌張力障礙、偏頭痛、腰(背)痛、頸 椎棘突病症、斜視、多汗症和多涎症；這樣的藥物組合物，其中，化妝病症是顯著的皺紋；以及和肉毒桿菌神經毒素製劑包含源自A、B、C1、D、E、F或G型肉毒梭狀芽孢桿菌 的肉毒桿菌神經毒素或兩種或更多種肉毒桿菌神經毒素的混合物，其中的神經毒素或神經 毒素混合物不含與肉毒桿菌神經毒素天然形成絡合物的絡合蛋白，和非蛋白質性質的穩定 劑，該穩定劑在水溶液中保留了肉毒桿菌神經毒素的生物活性；這樣的肉毒桿菌神經毒素製劑，其中肉毒桿菌神經毒素經化學修飾或經遺傳學操 作修飾，或者是其混合物；這樣的肉毒桿菌神經毒素製劑，其中非蛋白質性質穩定劑選自透明質酸、聚乙烯 吡咯烷酮和聚乙二醇中的一種或多種；這樣的肉毒桿菌神經毒素製劑，其中水溶液包含pH緩衝劑；
這樣的肉毒桿菌神經毒素製劑，其中pH緩衝劑是醋酸鈉；這樣的肉毒桿菌神經毒素製劑，不含哺乳動物衍生蛋白質性質的穩定劑；這樣的肉毒桿菌神經毒素製劑，其中該製劑不含哺乳動物衍生蛋白質性質的穩定 齊U，白蛋白和明膠；這樣的肉毒桿菌神經毒素製劑，其中非蛋白質性質穩定劑是透明質酸且其中的組 合物是冷凍乾燥的；這樣的肉毒桿菌神經毒素製劑，包含透明質酸且其中的組合物是冷凍乾燥的；以及穩定源自A、B、C1、D、E、F或G型肉毒梭狀芽孢桿菌的肉毒桿菌神經毒素或兩 種或更多種肉毒桿菌神經毒素混合物的方法，其中的神經毒素或神經毒素混合物不含與肉 毒桿菌神經毒素天然形成絡合物的絡合蛋白，包括將該神經毒素與在水溶液中保留該神經 毒素生物活性有效量的非蛋白質性質穩定劑混合；這樣的方法，其中，肉毒桿菌神經毒素經化學修飾或經遺傳學操作修飾，或者是其 混合物；這樣的方法，其中非蛋白質性質穩定劑選自透明質酸、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二 醇中的一種或多種；這樣的方法，其中水溶液包含pH緩衝劑；這樣的方法，其中pH緩衝劑是醋酸鈉；這樣的方法，其中水溶液包含防凍劑；這樣的方法，其中水溶液是冷凍乾燥的；這樣的方法，其中非蛋白質性質穩定劑是透明質酸且其中的組合物是冷凍乾燥 的；這樣的方法，包含透明質酸且其中的組合物是冷凍乾燥的；以及治療肉毒桿菌神經毒素療法或治療所適應的病症的方法，包括將包含源自A、 B、Cl、D、E、F或G型肉毒梭狀芽孢桿菌的肉毒桿菌神經毒素或兩種或更多種肉毒桿菌神經 毒素的混合物的組合物向有此需求的人，或動物給藥的步驟，其中的神經毒素或神經毒素 混合物不含與肉毒桿菌神經毒素天然形成絡合物的絡合蛋白，並與在水中保留該神經毒素 生物活性的非蛋白質性質穩定劑混合；這樣的方法，其中肉毒桿菌神經毒素經化學修飾或經遺傳學操作修飾，或者是其 混合物；這樣的方法，其中非蛋白質性質穩定劑選自透明質酸、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二 醇中的一種或多種；這樣的方法，其中水溶液包含pH緩衝劑；這樣的方法，其中pH緩衝劑是醋酸鈉；這樣的方法，其中水溶液防凍劑；這樣的方法，其中防凍劑是多元醇；這樣的方法，其中多元醇選自肌醇、甘露醇和山梨醇中的一種或多種；這樣的方法，其中非蛋白質性質穩定劑是透明質酸，且其中的組合物是冷凍乾燥 的；這樣的方法，其中水溶液包含透明質酸且其中的組合物是冷凍乾燥的；
這樣的方法，其中肉毒桿菌神經毒素療法或治療所適應的病症選自化妝病症、眼 瞼痙攣、偏側顏面痙攣、痙攣性斜頸、痙攣狀態、偏頭痛、腰(背)痛、頸椎棘突病症、斜視、多 汗症、多涎症和肌張力障礙；這樣的方法，其中化妝病症是顯著的皺紋；以及肉毒桿菌神經毒素製劑用於治療化妝病症的用途；以及肉毒桿菌神經毒素製劑在製備治療肉毒桿菌神經毒素療法所適應的病症的 藥物中的應用。定義如本文所用，下列詞語和術語具有如下定義。「藥物組合物」是一種製劑，其中活性成分，即本申請中的肉毒桿菌毒素，或本發明 的血凝素蛋白質游離的肉毒桿菌毒素，或通過化學修飾或遺傳學操作修飾從肉毒桿菌毒素 衍生的毒素，由哺乳動物衍生蛋白之外的物質穩定。該藥物組合物可適於診斷或治療性向 人類患者給藥(即，肌內或皮下注射)。所述的藥物組合物可以是凍幹的或真空乾燥的，重 新配製的，或溶液形式。所述的肉毒桿菌毒素活性成分可以是A、B、Cl、D、E、F或G血清型 肉毒桿菌毒素中的一種，所有這些肉毒桿菌毒素可進一步修飾為不含天然神經毒素中存在 的絡合蛋白或通過遺傳學操作修飾。「治療性製劑」是指本發明製劑治療/減輕病症諸如外周肌肉活動過度(即痙攣 狀態)適應症的能力。「穩定(Stabilizing) 」、「穩定(stabilizes) 」或「穩定(stabilization) 」是指存 在於重新配製或水溶液藥物組合物中的活性成分、即肉毒桿菌毒素或通過化學修飾或遺傳 學操作修飾從肉毒桿菌毒素衍生的毒素具有高於該生物活性肉毒桿菌毒素摻入藥物組合 物之前所具有的毒性的約20%到約100%。「防凍劑」是指賦形劑，其使存在於重新配製或水溶液藥物組合物中的活性成分、 即肉毒桿菌毒素或通過化學修飾或遺傳學操作修飾從肉毒桿菌毒素衍生的毒素具有高於 該生物活性肉毒桿菌毒素在被冷凍乾燥為藥物組合物之前所具有的毒性的約20%到約 100%。「 pH緩衝劑"是指能夠將組合物、溶液等的pH值調節為某一值或某一 pH範圍的 化學物質。「多元醇"是指包含多於一個羥基官能團而不包含羰基官能團(例如，糖類化合 物中的)的脂肪族或環脂肪族碳水化合物。「不含哺乳動物衍生蛋白穩定劑"是指組合物或製劑不包含可檢測量的衍生自 哺乳動物蛋白質的穩定劑。「化學修飾"是指本領域已知的方法，該方法通過化學反應等修飾任何血清型天 然肉毒桿菌毒素；它尤其是指對肉毒桿菌毒素胺基酸的取代、刪除、插入、增加或遺傳翻譯 後修飾。「遺傳學操作"是指本領域已知的方法，該方法通過修飾編碼肉毒桿菌毒素或各 自的核酸如DNA或RNA的基因而修飾任何血清型的天然肉毒桿菌毒素。碰本發明描述了包含穩定的神經毒素的藥物組合物，該組合物可通過摻入非蛋白質性質的穩定劑配製不含哺乳動物衍生蛋白或供體池白蛋白的形式，尤其通過摻入透明質酸 或聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇或其兩種或更多種混合物而製備。本發明涉及用透明質酸或 聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇或其兩種或多種混合物配製肉毒桿菌毒素組合物的研製。這樣 的組合物是具有顯著穩定性的更安全的組合物。幸運地，本發明組合物的特性在於不在哺乳動物衍生蛋白質性質的穩定劑中配製 肉毒桿菌毒素或通過化學修飾或遺傳學操作從肉毒桿菌毒素衍生的毒素。已經確定透明質 酸或聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇成分或其混合物，特別是摻入PH緩衝劑，尤其是醋酸鈉緩 衝劑，和/或防凍劑的那些組成可增加本發明藥物組合物的穩定性和有用的貯存期限。而且，本發明藥物組合物和製劑優選不僅不含哺乳動物衍生蛋白質性質的穩定劑 而且不含任何的穩定蛋白質。本發明不限於藥物組合物，還指穩定肉毒桿菌毒素組合物或經化學修飾或遺傳學 操作從肉毒桿菌毒素衍生的毒素組合物的方法。通過將透明質酸或聚乙烯吡咯烷酮或聚乙 二醇或其混合物摻入到組合物中，肉毒桿菌毒素或經化學修飾或遺傳學操作從肉毒桿菌毒 素衍生的毒素得到了穩定。此外，將PH緩衝劑摻入到藥物組合物中增強了穩定性，由此穩 定PH並促進重新配製毒素的貯存期限和/或通過向藥物組合物中摻入防凍劑，從而增加冷 凍乾燥穩定性和貯存期限。優選pH緩衝劑的性質和量能夠將本發明組合物或製劑的pH值穩定或調節到約4 至約7. 5的範圍。適當的pH緩衝劑可以是檸檬酸鹽、磷酸鹽和尤其是醋酸鹽緩衝系統，特 別是醋酸鈉緩衝系統。令人驚奇地是，已經發現如果本發明組合物或製劑使用了醋酸鹽緩 衝劑且所述組合物或製劑是冷凍乾燥的，在冷凍乾燥過程中可將醋酸鹽從組合物或製劑中 除去；重新配製或融化組合物或製劑之後具有近似中性的PH值(在約6. 5到約7. 5的範圍 內)。當將所述組合物或製劑向有此需求的人或患者給藥時，尤其當注射到肌肉中時是有利 的，因為該(近似)中性的肉毒桿菌毒素組合物或製劑引起的疼痛比具有酸性PH值、例如 4的組合物或製劑小。本發明一個詳細的實施方案可是適於向人類患者注射的藥物組合物，其中包含肉 毒桿菌毒素或經化學修飾或遺傳學操作從肉毒桿菌毒素衍生的毒素，以及透明質酸或聚乙 烯吡咯烷酮或聚乙二醇，該組合物任選被適當的PH緩衝劑、尤其被醋酸鈉緩衝劑，和/或防 凍劑多元醇PH穩定。該藥物組合物適於向人類患者給藥以獲得治療效果，並且所述神經毒素可以是A、 B、C1、D、E、F和G血清型肉毒桿菌毒素，優選不含存在於天然神經毒素中的絡合蛋白的肉毒 桿菌毒素或經化學修飾或遺傳學操作修飾的神經毒素。該經修飾的神經毒素也不含與肉毒 桿菌神經毒素天然形成絡合物的絡合蛋白。經化學修飾或遺傳學操作從肉毒桿菌神經毒素衍生的神經毒素可以位於神經毒 素蛋白的每一部分，例如在神經毒素分子的重鏈部分和/或輕鏈部分。可以存在一種或多 種修飾。優選地，從肉毒桿菌神經毒素衍生的神經毒素的重鏈包含一種或多種修飾，與天然 神經毒素相比，該修飾可降低或增加神經毒素與神經細胞的結合的親和力。該經修飾的神 經毒素可包含至少一種神經毒素、並優選神經毒素的重鏈上的胺基酸的取代和/或刪除和 /或插入和/或增加和/或遺傳翻譯後修飾。無論該藥物組合物除了包含神經毒素活性成分之外是否僅包含透明質酸或聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇穩定劑，在約+8°C到約_20°C的溫度下貯存6個月、1年、2年、3年和 /或4年期間該組合物保留其效能基本不變。另外，所述組合物重新配製後可具有約20% 到約100%的效能或百分恢復率。本發明範圍之內的藥物組合物可包含神經毒素和透明質酸。透明質酸穩定了神經 毒素。當重新配製或注射時，本文公開的藥物組合物可具有約4到7.5的pH值。本發明組 合物中的透明質酸優選以0. 1到IOmg的量與本發明的肉毒桿菌毒素混合，尤其是在每ml 200U/ml肉毒桿菌毒素溶液中Img透明質酸。更優選，該溶液還包含Ι-lOOmM、尤其是IOmM 醋酸鈉緩衝劑。在另一優選實施方案中，組合物可包含多元醇作為防凍劑。可使用的多元醇的實 例包括，例如肌醇、甘露醇和其它非還原性醇。應當認為本發明組合物或製劑不包含經常用作防凍劑的海藻糖或麥芽三糖或相 關的糖或多羥基化合物。本發明藥物組合物中的聚乙烯吡咯烷酮優選以10到500mg的量與本發明的肉毒 桿菌毒素混合，尤其是在每ml 200U/ml肉毒桿菌毒素溶液中IOOmg聚乙烯吡咯烷酮。更優 選地，該溶液還包含Ι-lOOmM、尤其是IOmM醋酸鈉緩衝劑。本發明藥物組合物中的聚乙二醇優選以10到500mg的量與本發明的肉毒桿菌毒 素混合，尤其是在每ml 200U/ml肉毒桿菌毒素溶液中IOOmg聚乙二醇。更優選地，該溶液 還包含Ι-lOOmM、尤其是IOmM醋酸鈉緩衝劑。因此，本發明包括將肉毒桿菌毒素配製成藥物組合物，該藥物組合物包含透明質 酸穩定劑或聚乙烯吡咯烷酮穩定劑或聚乙二醇穩定劑。另外，該藥物組合物可包含醋酸鈉 緩衝劑系統和/或醇性防凍劑。提供下述實施例僅用於舉例說明，而不意欲限制。本發明製劑或藥物組合物對治療肉毒桿菌神經毒素療法或治療適應的病症有用。 一方面其可用於治療化妝病症如皺紋和顯著的皺紋。另一方面其可用於治療選自眼瞼痙 攣、偏側顏面痙攣、痙攣性斜頸、痙攣狀態、偏頭痛、腰(背)痛、頸椎棘突障礙、斜視、多汗 症、多涎症和張力障礙的病症。而且，本發明製劑或組合物還用於製備治療肉毒桿菌神經毒 素療法所適應病症的藥物，該病症優選選自化妝病症、眼瞼痙攣、偏側顏面痙攣、痙攣性斜 頸、痙攣狀態、偏頭痛、腰(背)痛、頸椎棘突障礙、斜視、多汗症、多涎症和張力障礙。此外， 本發明製劑或組合物可治療的其它醫學適應症是良性絞痛(benign cramping)、特發性震 顫、mykomia、神經性肌肉肥大、palantal肌陣攣、脊髓肌陣攣、聯帶運動/第VII對顱神經障 礙、Duanne' s眼球退縮症候群、眼球震顫症、用於角膜保護的治療性瞼下垂症、振動幻覺、 痙攣性發聲困難、肉芽瘤、puberophonia、後聲門狹窄、rebalancing、口吃、TEP failure、原 發性聲音震顫、發聲抽動、環咽肌、夜磨牙症、咀嚼肌肥大、病態肥胖症、弛緩不能、肛(門) 裂、肛門痙攣、頑固性呃逆、嚴重便秘、肛門直腸疼痛、胃輕癱、良性肛門病症、食管憩室病、 奧狄(氏)括約肌、進食時流淚、唾液腺囊腫、流涎、垂涎、腮腺瘻、弗萊(氏)症候群、多涎、 detrusor-spincter dyssnergia、膀胱活動過度、陰道痙攣、尿瀦留、超常增生、良性增生、 緊張性頭痛、頸源性頭痛、肌盤膜痛(cervicogenic pain)、眼瞼開放失用、繼發於面神經麻 痺的聯帶運動、聲門封閉性口吃、體臭、內在鼻炎。實施例本發明的肉毒桿菌毒素製劑及其藥物組合物和用其治療的方法「作為整體的主 題」已被證明具有獨特和有利的性質，如本文所請求保護的是非顯而易見的。肉毒桿菌毒素 製劑及其藥物組合物在標準的公認可靠的試驗操作中已顯示出了下列有價值的性質和特 徵實施例1 肉毒桿菌毒素製品通過以DasGupta&^ithyamoorthy操作為基礎的方法獲得了來自A型肉毒梭狀芽 孢桿菌的純神經毒素。在201發酵罐內的由2%脈蛋白腖、酵母提取液、葡萄糖和 0.05%巰基乙醇酸鈉組成的培養基中培養A型肉毒梭狀芽孢桿菌。生長72小時以後，加入 3N硫酸(最終PH = 3. 5)使毒素沉澱。用0. 2M磷酸鈉緩衝劑在pH 6.0下提取沉澱出的和 離心了的生物量。通過硫酸魚精蛋白沉澱除去核酸以後，加入硫酸銨使毒素沉澱。將已經被50mM 磷酸鈉在PH 6. ο下溶解和透析了的沉澱物在相同PH下結合到DEAE-Sephadex 柱上， 並用150mM NaCl洗脫。接著在QAE-Sephadex 柱上層析，該色譜柱已經用PH 7. 9的 50mM Tris/HCl緩衝劑平衡。經由NaCl梯度洗脫毒素。在最後一步中，毒素在pH 7. 0的 SP-SephadeX 上層析。在這種情況下，用NaCl梯度(0-300mM)從柱子上洗脫出結合的毒 素。用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析純化的毒素，其顯示出純度為95+/-5%。 在小鼠LD50試驗中測定生物活性一個LD50單位對應於4. 8pg蛋白。實施例2 包含透明質酸的成品藥物組合物將實施例1的純化的神經毒素用於製備溶液，該溶液每毫升蒸餾水包含200U肉毒 桿菌毒素製品和Img透明質酸。將該溶液分裝到小玻璃瓶中。
_0] ^mm 3 ^mmmmmmmwmm^mm^m將實施例1的純化了的神經毒素用於製備溶液，該溶液每毫升蒸餾水包含200U肉 毒桿菌毒素製品和Img透明質酸，並通過添加IOmM醋酸鈉緩衝劑而調節至pH 4. 5,5. 0和 5.5。將該溶液分裝到小玻璃瓶中。實施例4 肉毒桿菌毒素製品的穩定性測定製備實施例2的製劑，並與在人血清白蛋白(HSA)中配製的肉毒桿菌毒素進行比 較。配製以後，這兩種製品都具有相同的活性。在對和48小時時，實施例2製劑的穩定性 與HAS製劑的穩定性相一致，兩個樣品中存在的最初活性損失了不到5%。實施例5 在不同pH下進行肉毒桿菌毒素製品的穩定性測定製備實施例3的製劑，並與在人血清白蛋白(HSA)中配製的肉毒桿菌毒素進行比 較。配製以後，在每個PH點處的剛配製好的製品(instant preparation)和HAS製品都具 有相同的活性。PH 4. 5的製品到第6天顯示出活性損失了大約50%。pH 5. 0和5. 5的制 品到第6天損失了所有的活性。實施例6 在不同pH和凍幹條件下進行肉毒桿菌毒素製劑的穩定性測定製備實施例3的製劑，並與在人血清白蛋白(HSA)中配製的肉毒桿菌毒素進行比 較。配製以後，PH 4. 5的剛配製好的製品與HAS製品具有相同的活性。更重要的是，在凍 幹條件下沒有檢測到活性損失。實施例7 包含聚乙烯吡咯烷酮的成品藥物組合物
將實施例1的純化的神經毒素用於製備溶液，該溶液每毫升蒸餾水包含200U肉毒 桿菌毒素製品和IOOmg聚乙烯吡咯烷酮。將該溶液分裝到小玻璃瓶中。實施例8 包含聚乙烯吡咯烷酮和醋酸鈉緩衝劑的成品藥物組合物將實施例1的純化的神經毒素用於製備溶液，該溶液每毫升蒸餾水包含200U肉毒 桿菌毒素製品和IOOmg聚乙烯吡咯烷酮，並通過添加IOmM醋酸鈉緩衝劑調節至pH 4.5,5.0 和5. 5。將該溶液分裝到小玻璃瓶中。實施例8A 包含聚乙烯吡咯烷酮、甘露醇和醋酸鈉緩衝劑的成品藥物組合物將實施例1的純化的神經毒素用於製備溶液，該溶液每毫升蒸餾水包含200U肉毒 桿菌毒素製品、IOOmg聚乙烯吡咯烷酮和20mg甘露醇，並通過添加IOmM醋酸鈉緩衝劑調節 至pH 4. 5,5. 0和5. 5。將該溶液分裝到小玻璃瓶中。實施例8B 包含聚乙烯吡咯烷酮、山梨糖醇和醋酸鈉緩衝劑的成品藥物組合物將實施例1的純化了的神經毒素用於製備溶液，該溶液每毫升蒸餾水包含200U肉 毒桿菌毒素製品、IOOmg聚乙烯吡咯烷酮和20mg山梨糖醇，並通過添加IOmM醋酸鈉緩衝劑 調節至pH 4. 5、5. 0和5. 5。將該溶液分裝到小玻璃瓶中。棚列9 :_木幹髓胃吿丨丨口口口牛雕製備實施例7的製劑，並與在人血清白蛋白(HSA)中配製的肉毒桿菌毒素進行比 較。配製以後，這兩種製品都具有相同的活性。實施例10 在不同pH下進行肉毒桿菌毒素製品的穩定性測定製備實施例8的製劑，並與在人血清白蛋白(HSA)中配製的肉毒桿菌毒素進行比 較。配製以後，在每個PH點處的剛配製好的製品和HAS製品都具有相同的活性。pH 4. 5和 5. 0的製品以及HAS製品在製劑M小時內沒有顯示出活性損失。在M小時內，pH 5. 5的 製品相對於HAS製品和其它製品損失了 20%的活性。實施例IOA 在不同pH下進行肉毒桿菌毒素製品的穩定性測定製備實施例8A的製劑，並與在人血清白蛋白(HSA)中配製的肉毒桿菌毒素進行比 較。配製以後，在每個PH點處的剛配製好的製品和HAS製品都具有相同的活性。pH 4.5、 5. 0和5. 5的製品以及HAS製品在配製M小時內沒有顯示出活性損失。實施例IOB 在不同pH下進行肉毒桿菌毒素製品的穩定性測定製備實施例8B的製劑，並與在人血清白蛋白(HSA)中配製的肉毒桿菌毒素進行比 較。配製以後，在每個PH點處的剛配製好的製品和HAS製品都具有相同的活性。pH 4.5、 5. 0和5. 5的製品以及HAS製品在配製M小時內沒有顯示出活性損失。實施例11 在不同PH和凍幹條件下進行肉毒桿菌毒素製品的穩定性測定製備實施例8的製劑，並與在人血清白蛋白(HSA)中配製的肉毒桿菌毒素進行比 較。配製以後，在每個PH點處的剛配製好的製品和HAS製品都具有相同的活性。更重要的 是，直至6個月，所有凍幹製劑檢測到活性損失都小於10%。實施例IlA 在不同pH和凍幹條件下進行肉毒桿菌毒素製品的穩定性測定製備實施例8A的製劑，並與在人血清白蛋白(HSA)中配製的肉毒桿菌毒素進行比 較。配製以後，在每個PH點處的剛配製好的製品和HAS製品都具有相同的活性。更重要的 是，直至6個月，所有凍幹製劑檢測到活性損失都小於10%。實施例IlB 在不同pH和凍幹條件下進行肉毒桿菌毒素製品的穩定性測定
製備實施例8B的製劑，並與在人血清白蛋白(HSA)中配製的肉毒桿菌毒素進行比 較。配製以後，在每個PH點處的剛配製好的製品和HAS製品都具有相同的活性。更重要的 是，直至6個月，所有凍幹製劑檢測到活性損失都小於10%。實施例12 包含聚乙二醇的成品藥物組合物將實施例1的純化的神經毒素用於製備溶液，該溶液每毫升蒸餾水包含200U肉毒 桿菌毒素製品和IOOmg聚乙二醇。將該溶液分裝到小玻璃瓶中。^MM 12A 句,含聚乙二醇和甘iS醇的成品藥物_合物將實施例1的純化的神經毒素用於製備溶液，該溶液每毫升蒸餾水包含200U肉毒 桿菌毒素製品、IOOmg聚乙二醇和20mg甘露醇。將該溶液分裝到小玻璃瓶中。^MM 12B 句,含聚乙二醇和山梨籟醇的成品藥物_合物將實施例1的純化的神經毒素用於製備溶液，該溶液每毫升蒸餾水包含200U肉毒 桿菌毒素製品、IOOmg聚乙二醇和20mg山梨糖醇。將該溶液分裝到小玻璃瓶中。棚列13 :_木幹髓胃_隨對牛雕製備實施例12的製劑，並與在人血清白蛋白(HSA)中配製的肉毒桿菌毒素進行比 較。配製以後，這兩種製品都具有相同的活性。棚列14 :_木幹髓胃_隨對牛雕製備實施例12A和12B的製劑，並與在人血清白蛋白(HSA)中配製的肉毒桿菌毒 素進行比較。配製以後，剛配製好的製品和HAS製品都具有相同的活性。在配製對小時內， 剛配製好的製品以及HAS製品都顯示出活性損失小於20%。實施例15 肉毒桿菌毒素藥物組合物的應用一名50歲的女性尋求眼瞼痙攣的治療。將包含透明質酸的實施例3的介於約IOU 到約20U之間的肉毒桿菌毒素製品肌內注射給予患者。在1-7天之內，眼瞼痙攣的症狀減 輕了，並且症狀的減輕持續了至少約2個月到約6個月。實施例16 肉毒桿菌毒素藥物組合物的應用一名50歲的女性尋求眼瞼痙攣的治療。將包含聚乙烯吡咯烷酮的實施例8的介 於約IOU到約20U之間的肉毒桿菌毒素製品肌內注射給予患者。在1-7天之內，眼瞼痙攣 的症狀減輕了，並且症狀的減輕持續了至少約2個月到約6個月。實施例17 肉毒桿菌毒素藥物組合物的應用一名50歲的女性尋求眼瞼痙攣的治療。將包含聚乙二醇的實施例12的介於約 IOU到約20U之間的肉毒桿菌毒素製品肌內注射給予患者。在1-7天之內，眼瞼痙攣的症狀 減輕了，並且症狀的減輕持續了至少約2個月到約6個月。實施例18 肉毒桿菌毒素藥物組合物的應用一名50歲的女性尋求眼瞼痙攣的治療。將包含聚乙二醇的實施例12A的介於約 IOU到約20U之間的肉毒桿菌毒素製品肌內注射給予患者。在1-7天之內，眼瞼痙攣的症狀 減輕了，並且症狀的減輕持續了至少約2個月到約6個月。實施例19 肉毒桿菌毒素藥物組合物的應用一名50歲的女性尋求眼瞼痙攣的治療。將包含聚乙二醇的實施例12B的介於約 IOU到約20U之間的肉毒桿菌毒素製品肌內注射給予患者。在1-7天之內，眼瞼痙攣的症狀 減輕了，並且症狀的減輕持續了至少約2個月到約6個月。
權利要求
1.藥物組合物，它包含源自A型肉毒梭狀芽孢桿菌的肉毒桿菌神經毒素，和保留水溶 液中肉毒桿菌神經毒素的生物活性的非蛋白質性質穩定劑，其中，所述的神經毒素不含與 肉毒桿菌神經毒素天然形成絡合物的絡合蛋白質，所述穩定劑是聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二 醇，並且其中所述組合物不含哺乳動物衍生的蛋白質性質的穩定劑。
2.權利要求1的藥物組合物，它包含pH緩衝劑。
3.權利要求2的藥物組合物，其中所述pH緩衝劑是醋酸鈉。
4.權利要求1的藥物組合物，它包含防凍劑。
5.權利要求4的藥物組合物，其中所述防凍劑是多元醇。
6.權利要求5的藥物組合物，其中所述多元醇選自肌醇、甘露醇和山梨醇中的一種或 多種。
7.權利要求4的藥物組合物，其是冷凍乾燥的。
8.權利要求1的藥物組合物，其中所述非蛋白質性質穩定劑是聚乙烯吡咯烷酮或聚乙 二醇且其中的組合物是冷凍乾燥的。
9.權利要求3的藥物組合物，它包含聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇且其中的組合物是冷 凍乾燥的。
10.權利要求1的藥物組合物，以治療肉毒桿菌神經毒素療法或治療所適應病症的有 效量向動物，包括人給藥。
11.權利要求10的藥物組合物，其中所述肉毒桿菌神經毒素療法或治療所適應病症 選自化妝病症、眼瞼痙攣、偏側顏面痙攣、痙攣性斜頸、痙攣狀態、肌張力障礙、偏頭痛、腰背 痛、頸椎棘突病症、斜視、多汗症和多涎症。
12.權利要求11的藥物組合物，其中所述化妝病症是顯著的皺紋。
13.肉毒桿菌神經毒素製劑，它包含源自A型肉毒梭狀芽孢桿菌的肉毒桿菌神經毒素， 和保留水溶液中肉毒桿菌神經毒素的生物活性的非蛋白質性質穩定劑，其中，所述的神經 毒素不含與肉毒桿菌神經毒素天然形成絡合物的絡合蛋白質，所述穩定劑是聚乙烯吡咯烷 酮或聚乙二醇，並且其中所述製劑不含哺乳動物衍生的蛋白質性質的穩定劑。
14.權利要求13的肉毒桿菌神經毒素製劑，其中所述水溶液包含pH緩衝劑。
15.權利要求14的肉毒桿菌神經毒素製劑，其中所述pH緩衝劑是醋酸鈉。
16.權利要求14的肉毒桿菌神經毒素製劑，其中該製劑不含哺乳動物衍生的蛋白質性 質的穩定劑，白蛋白和明膠。
17.權利要求13的肉毒桿菌神經毒素製劑，其中所述非蛋白質性質穩定劑是聚乙烯吡 咯烷酮或聚乙二醇且其中的組合物是冷凍乾燥的。
18.權利要求15的肉毒桿菌神經毒素製劑，它包含聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇且其中 的組合物是冷凍乾燥的。
19.穩定源自A型肉毒梭狀芽孢桿菌的肉毒桿菌神經毒素的方法，其中，所述的神經毒 素不含與肉毒桿菌神經毒素天然形成絡合物的絡合蛋白質，包括將神經毒素與在水溶液中 有效保留神經毒素的生物活性的量的非蛋白質性質穩定劑混合。
20.權利要求19的方法，其中所述水溶液包含pH緩衝劑。
21.權利要求20的方法，其中所述pH緩衝劑是醋酸鈉。
22.權利要求19的方法，其中所述水溶液包含防凍劑。
23.權利要求22的方法，其中所述水溶液是冷凍乾燥的。
24.權利要求19的方法，其中所述非蛋白質性質穩定劑是聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇 且其中的組合物是冷凍乾燥的。
25.權利要求21的方法，它包含聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇且其中的組合物是冷凍幹 燥的。
26.源自A型肉毒梭狀芽孢桿菌的肉毒桿菌神經毒素在製備用於治療肉毒桿菌神經毒 素療法或治療所適應病症的藥物中的用途，其中，所述的神經毒素不含與肉毒桿菌神經毒 素天然形成絡合物的絡合蛋白質，並與保留水溶液中肉毒桿菌神經毒素的生物活性的非蛋 白質性質穩定劑混合，所述穩定劑是聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇，並且其中所述藥物不含 哺乳動物衍生的蛋白質性質的穩定劑。
27.權利要求沈的用途，其包含pH緩衝劑。
28.權利要求27的用途，其中所述pH緩衝劑是醋酸鈉。
29.權利要求沈的用途，其中所述水溶液包含防凍劑。
30.權利要求四的用途，其中所述防凍劑是多元醇。
31.權利要求30的用途，其中所述多元醇選自肌醇、甘露醇和山梨醇中的一種或多種。
32.權利要求沈的用途，其中所述非蛋白質性質穩定劑是聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二 醇，且其中的組合物是冷凍乾燥的。
33.權利要求觀的用途，其中所述水溶液包含聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇且其中的組 合物是冷凍乾燥的。
34.權利要求沈的用途，其中所述肉毒桿菌神經毒素療法或治療所適應的病症選自化 妝病症、眼瞼痙攣、偏側顏面痙攣、痙攣性斜頸、痙攣狀態、肌張力障礙、偏頭痛、腰背痛、頸 椎棘突障礙、斜視、多汗症和多涎症。
35.權利要求34的用途，其中所述化妝病症是顯著的皺紋。
36.權利要求13到18的至少一種的肉毒桿菌神經毒素製劑用於製備用於肉毒桿菌神 經毒素療法所適應病症的藥物的用途。
全文摘要
本發明涉及藥物組合物，該藥物組合物包含源自肉毒梭狀芽孢桿菌的肉毒桿菌神經毒素，該神經毒素不含天然存在於肉毒桿菌神經毒素絡合物中的絡合蛋白，或經化學修飾或遺傳學操作修飾。而且本發明的藥物組合物具有良好的穩定性，且不用人血清白蛋白就能有利地配製。
文檔編號A61P21/02GK102139099SQ20111007299
公開日2011年8月3日 申請日期2005年7月19日 優先權日2004年7月26日
發明者H·V·泰勒 申請人:莫茨藥物股份兩合公司