放線菌來源的amp脫氨酶及其應用的製作方法

2023-05-07 03:54:41 1

專利名稱：放線菌來源的amp脫氨酶及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及AMP脫氨酶。具體而言，本發明涉及微生物來源的AMP脫氨酶及其應用。
背景技術：
AMP脫氨酶又稱為腺苷脫氨酶、AMP氨基水解酶等，催化水解腺苷酸使其脫去氨基生成肌苷酸和氨的反應。AMP脫氨酶廣泛存在於動物活體組織中，目前已從不同種的多種組織中分離出來(藤島鐵郎和吉野宏，Amino Acid-Nucleic Acid，第16號，45-55(1967)，非專利文獻1；Magdale』naRosinova』等，Collection Czechoslov.Chem.Commun.第43卷，2324-2329(1978)，非專利文獻2；特開昭55-120788號公報，專利文獻1)。另一方面，主要從工業利用的觀點出發，人們廣泛進行了微生物來源的AMP脫氨酶的研究。關於絲狀菌來源的AMP脫氨酶的研究尤其多，部分AMP脫氨酶，例如蜂蜜麴黴菌(Aspergillus melleus)來源的AMP脫氨酶等，試圖用於工業以增強酵母提取物的味道。
專利文獻1特開昭55-120788號公報非專利文獻1藤島鐵郎和吉野宏，Amino Acid-Nucleic Acid，第16號，45-55(1967)非專利文獻2Magdalc』na Rosinova等，Collection Czechoslov.Chem.Commun.第43卷，2324-2329(1978)發明內容目前，在酵母提取物的製備過程中，一般使用核酸酶和AMP脫氨酶來增強味道。通常，核酸酶的最適溫度是約65℃。另一方面，目前使用的蜂蜜麴黴菌(Aspergillus melleus)來源的AMP脫氨酶的最適溫度是約50℃。因此，製備中，高溫下使兩種酶同時作用是不可能的。必須分別進行核酸酶處理和AMP脫氨酶處理。如果，AMP脫氨酶有良好的耐熱性，就能與核酸酶同時作用，從而可縮短製備工序。此外，由於用這兩種酶的處理過程可在高溫下進行，所以製備過程中處理溫度不必暫時降到AMP脫氨酶的反應溫度約50℃，可有效防止雜菌的汙染。如此，特別在工業應用上，耐熱性AMP脫氨酶有許多優勢，迫切希望能發現這樣的酶。
基於以上背景，本發明人等篩選了微生物，作為AMP脫氨酶的來源。結果發現，鏈黴菌屬的放線菌能生產出熱穩定性高的AMP脫氨酶。此外還發現，鼠灰鏈黴菌(Streptomyces murinus)產生的AMP脫氨酶熱穩定性尤其好。
獲得以上發現後，本發明人等試圖鑑定該酶(鼠灰鏈黴菌來源的AMP脫氨酶)。結果如後面的實施例所述，成功鑑定了該酶，明確了其胺基酸序列和鹼基序列。基於該成果，可以以重組體形式生產該酶。此外，應用基因重組技術可提高該酶的生產性，並對酶本身進行改良。
本發明是基於以上成果而完成的，提供以下內容[1]具有以下性質的AMP脫氨酶(1)；(2)在65℃以下的溫度穩定(醋酸緩衝液(pH5.6)中)；(3)分子量為48000±2000(凝膠過濾測定)、60000±3000(SDS-PAGE測定)；(4)最適pH在5.6左右((McIlvaine)緩衝液中)；[2]具有以下性質的放線菌來源的AMP脫氨酶(1)；(2)在65℃以下的溫度穩定(醋酸緩衝液(pH5.6)中)。
根據[2]中所述的AMP脫氨酶，其中放線菌是屬於鏈黴菌屬的放線菌。
根據[2]中所述的AMP脫氨酶，其中放線菌選自鼠灰鏈黴菌(Streptomyces murinus)、纖維黃鏈黴菌(Streptmyces celluloflavus)、灰鏈黴菌(Streptmyces griseus)。
一種酵母提取物的製備方法，它包括使[1]～[4]中任一項所述的AMP脫氨酶作用的步驟。
一種調味料的製備方法，其中，使[1]～[4]中任一項所述的AMP脫氨酶作用於5′-核苷酸，使5′-核苷酸脫醯胺化。
一種AMP脫氨酶的製備方法，其特徵在於，在營養培養基中培養鏈黴菌屬的放線菌，在培養液中生成[1]中所述的AMP脫氨酶，將其收集。
根據[7]中所述的製備方法，其中放線菌選自鼠灰鏈黴菌(Streptomyces murinus)、纖維黃鏈黴菌(Streptmyces celluloflavus)、灰鏈黴菌(Streptmyces griseus)。
含有以下(a)或(b)的分離的AMP脫氨酶(a)具有序列號1的胺基酸序列的蛋白質；(b)具有序列號1的部分胺基酸序列修改了的胺基酸序列，作為AMP脫氨酶發揮作用的蛋白質。
一種分離的核酸分子，它編碼[9]所述的AMP脫氨酶。
根據[10]所述的分離的核酸分子，它具有以下(a)～(c)中任一項的鹼基序列(a)序列號3～5中任一項的鹼基序列；(b)(a)中部分鹼基被修改了的鹼基序列，且對作為AMP脫氨酶發揮作用的蛋白質進行編碼的鹼基序列；(c)在嚴格條件下同與(a)或(b)的鹼基序列互補的鹼基序列進行雜交的鹼基序列，且對作為AMP脫氨酶發揮作用的蛋白質進行編碼的鹼基序列。
一種載體，它持有[9]～[11]中任一項所述的核酸分子。
一種轉化體，它導入了[9]～[11]中任一項所述的核酸分子。
一種AMP脫氨酶的生產方法，它包括以下步驟(1)及(2)(1)在能產生上述核酸分子編碼的蛋白質的條件下培養[13]中所述的轉化體的步驟；及(2)回收所產生的蛋白質的步驟。
本發明的AMP脫氨酶熱穩定性良好，在較高溫度的條件下也可發揮作用。因此，可以在雜菌汙染危險小的狀況下進行酶促反應。此外，可與在高溫下發揮作用的其它酶，例如在酵母提取物的製備過程中使用的核酸酶等，同時作用，從而使製備工序簡化、縮短。


圖1是比較了蜂蜜麴黴菌(Aspergillus melleus)和鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)產生的AMP脫氨酶的熱穩定性的圖。橫軸表示反應溫度，縱軸表示殘存的脫氨酶活性(％)。
圖2是比較了蜂蜜麴黴菌(Aspergillus melleus)和鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)產生的AMP脫氨酶的磷酸酶活性/脫氨酶活性(P/D)的表。
圖3是比較了蜂蜜麴黴菌(Aspergillus melleus)和鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)產生的AMP脫氨酶的IMP轉換率的圖。
圖4是表示酵母提取物的製備過程中，鼠灰鏈酶菌(Streptomycesmurinus)來源的AMP脫氨酶發揮作用時的IMP轉換率的圖。(a)是與現行的製備方法同樣地分別進行核酸酶處理和脫氨酶處理時的測定結果。(b)是核酸酶處理與脫氨酶處理同時進行時的結果。
圖5是表示鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)來源的AMP脫氨酶純化過程中的色譜結果。(a)是用HiPrepTM16/10 ButylFF的色譜結果圖，(b)是用Superose 12的色譜結果。
圖6圖6(a)是一個表，總結了鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)來源的AMP脫氨酶純化過程中總酶活性量、總蛋白質量、比活性和收率。圖6(b)是用SDS-PAGE(CBB染色)分析純化酶的結果。泳道II是樣品(純化的酶)。泳道I是蛋白質分子量標記的條帶。從高分子量開始順次是磷酸化酶b(M.W.97400)、牛血清白蛋白(M.W.66267)、醛縮酶(M.W.42400)、碳酸酐酶(M.W.30000)、胰蛋白酶抑制劑(M.W.20100)、溶菌酶(M.W.14400)的條帶。
圖7圖7(a)是表示鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)來源的AMP脫氨酶的反應溫度與活性的關係的圖。表示將65℃反應時的活性值設為100％時的相對活性(％)。圖7(b)是表示鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)來源的AMP脫氨酶的熱穩定性的圖。
圖8圖8(a)是表示鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)來源的AMP脫氨酶的pH與活性的關係的圖。表示將pH5.6時反應的活性值設為100％時的相對活性(％)。圖8(b)是表示鼠灰鏈酶菌(Streptomycesmurinus)來源的AMP脫氨酶的pH穩定性的圖。
圖9是總結了鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)來源的AMP脫氨酶的底物特異性的表。表示將AMP的酶活性設為100％時的相對活性。
圖10是用色譜聚焦分析鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)來源的AMP脫氨酶的結果圖。
圖11是總結了鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)來源的AMP脫氨酶的各種性質的表。為了進行比較，顯示了桔青黴(Penicilliumcitrinum)來源的核酸酶和蜂蜜麴黴菌(Aspergillus meleus)來源的AMP脫氨酶的最適pH等。
圖12是比較了灰鏈黴菌灰色亞種(Streptomyces griseus subsp.griseus)、灰鏈黴菌(Streptomyces griseus)及纖維黃鏈黴菌(Streptomycescelluloflavus)產生的AMP脫氨酶的熱穩定性及底物特異性的表。
圖13是分析鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)來源的AMP脫氨酶的N末端胺基酸序列及內部胺基酸序列的結果。
圖14是鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)來源的AMP脫氨酶的限制性內切酶圖譜。
圖15是穿梭載體pSV1的構建流程圖。
圖16是AMP脫氨酶表達載體pSVSAD的構建流程圖。
圖17是表示導入了AMP脫氨酶基因的轉化體SAD-1產生的AMP脫氨酶的活性測定結果的表。表中ND表示「未檢測出」。
圖18是表示轉化體(SAD-1)產生的AMP脫氨酶的熱穩定性的圖。橫軸表示反應溫度，縱軸表示殘存的脫氨酶活性(％)。
圖19是總結了轉化體(SAD-1)來源的AMP脫氨酶的底物特異性的表。表示將AMP的酶活性設為100％時的相對活性。
圖20表示轉化體(SAD-1)來源的AMP脫氨酶的SDS-PAGE(CBB染色)分析結果。泳道II是對照樣品(宿主培養上清)，泳道III是樣品(轉化體培養上清)。泳道I是蛋白質分子量標記的條帶。從高分子量開始順次是磷酸化酶b(M.W.97000)、牛血清白蛋白(M.W.66000)、卵清蛋白(M.W.45000)、碳酸酐酶(M.W.30000)、胰蛋白酶抑制劑(M.W.20100)的條帶。
圖21是表示成功鑑定出的放線菌來源的AMP脫氨酶的胺基酸序列及其編碼序列(包括啟動子區域和終止子區域)的圖。
圖22圖21的繼續。
圖23成功鑑定出的放線菌來源的AMP脫氨酶的胺基酸序列(不包含信號肽)。
圖24成功鑑定出的放線菌來源的AMP脫氨酶的胺基酸序列(包含信號肽)。
圖25成功鑑定出的編碼放線菌來源的AMP脫氨酶的序列(包括啟動子區域和終止子區域)。
圖26圖25的繼續。
圖27成功鑑定出的編碼放線菌來源的AMP脫氨酶的基因的啟動子區域的序列。
圖28成功鑑定出的放線菌來源的AMP脫氨酶的結構基因的序列。
圖29成功鑑定出的編碼放線菌來源的AMP脫氨酶的基因的終止子區域的序列。
具體實施例方式
本發明的第一方面涉及AMP脫氨酶。本發明的AMP脫氨酶來源於放線菌。本發明的AMP脫氨酶的來源並不限定於放線菌的特定種類。本發明人等的研究結果證明，鼠灰鏈黴菌(Streptomyces murinus)以及纖維黃鏈黴菌(Streptmyces celluloflavus)和灰鏈黴菌(Streptmyces griseus)產生的AMP脫氨酶具備高耐熱性。
本發明的AMP脫氨酶催化下面的反應(性質(1))。由此可知，本發明的AMP脫氨酶作用於5′-腺苷酸(AMP)。如後面的實施例所示，本發明的一種實施方案，鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)來源的AMP脫氨酶對5』-dAMP(5』-脫氧腺苷酸)、ADP(腺苷5′-二磷酸)、ATP(腺苷5′-三磷酸)也有良好的作用。因此，本發明的AMP脫氨酶不僅適用於以AMP為底物的反應，而且適用於以它們中任何一種作底物的反應。
另一方面，本發明的AMP脫氨酶熱穩定性良好，在65℃以下的溫度穩定(性質(2))。這裡所講的「在65℃以下的溫度穩定」是指，將用醋酸緩衝液調成pH5.6的酶溶液在65℃處理30分鐘時，以未處理時的酶活性為標準(100％)，殘存5％以上，優選10％以上，更優選30％以上，更進一步優選50％以上，最優選90％以上的活性(在低於65℃溫度條件下進行同樣處理時，通常殘存活性更高)。由於具備如此優良的熱穩定性，即使在高溫下(例如60℃、65℃、70℃)，本發明的AMP脫氨酶也能很好的發揮作用。
如後面的實施例所述，作為具備以上性質的AMP脫氨酶之一，本發明人等發現了鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)產生的酶，並成功地純化了該酶。對所得AMP脫氨酶進行詳細研究時發現，它具有以下性質。
(3)通過凝膠過濾測定時其分子量為48000±2000。通過SDS-PAGE測定時其分子量為60000±3000。
(4)最適pH在5.6左右((McIlvaine)緩衝液中)；(5)起效pH在約4.5～約8.5((McIlvaine)緩衝液中)(6)穩定pH在約6.0～約8.5((McIlvaine)緩衝液中)(7)反應溫度在約40℃～約70℃(醋酸緩衝液中(pH5.6))(8)最適溫度在65℃左右(醋酸緩衝液中(pH5.6))(9)溫度穩定性在65℃以下穩定(醋酸緩衝液中(pH5.6))起效pH的範圍是，以最適pH下AMP脫氨酶活性為基準(100％)時相對活性大約50％以上的範圍。另一方面，穩定pH的範圍是，未處理、最適pH下AMP脫氨酶活性為基準(100％)時，殘存活性在大約50％以上的範圍。
關於熱穩定性，用醋酸緩衝液調成pH5.6的酶溶液在65℃處理30分鐘時，以未處理時的酶活性為基準(100％)，殘存約90％的活性。即使處理溫度上升到70℃，也可保持約55％的活性。
此外，反應溫度的範圍是以最適溫度下AMP脫氨酶活性為基準(100％)時相對活性大約70％以上的範圍。
另一方面，對底物特異性進行研究時發現，鼠灰鏈酶菌(Streptomycesmurinus)來源的AMP脫氨酶對3』-AMP、5』-dAMP、ADP、ATP、腺苷、及cAMP(環腺苷3，』5』-一磷酸)也起效，但對2』-AMP、腺嘌呤、5』GMP、5』-UMP、及5』-CMP無效。特別對5』-dAMP、ADP、ATP能發揮良好作用。對腺苷的作用較弱，為5』-AMP作用的1/10以下。
此外，未檢測出磷酸酶活性。與此相對，蜂蜜麴黴菌(Aspergillusmelleus)來源的以往的AMP脫氨酶可檢測出夾雜的磷酸酶活性。在混雜的磷酸酶活性極少這一點上，鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)來源的AMP脫氨酶與以往的AMP脫氨酶顯著不同。
若混雜有磷酸酶，AMP脫氨酶作用於5′-AMP而產生的呈味成分肌苷酸進一步分解成肌苷，從而喪失呈味性，因此，極少混雜磷酸酶的鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)來源的AMP脫氨酶在產業上有利。
總之，鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)來源的AMP脫氨酶具有以上的性質(3)～(8)、熱穩定性、底物特異性、及混雜的磷酸酶極少等特徵。
需要指出的是，作為一個原則，在熱穩定性等各種實驗中AMP脫氨酶活性用後面的實施例中所示的方法(脫氨酶活性測定方法)進行測定。
本發明的第二方面涉及AMP脫氨酶的製備方法(調製方法)，其特徵在於，它包括以下步驟a)培養鏈黴菌屬的放線菌的培養步驟；b)從上述培養步驟後的培養液中純化AMP脫氨酶的純化步驟。
步驟a中使用的放線菌的種類無特殊限定，只要是可以預想能生產出熱穩定性良好的AMP脫氨酶即可。例如，可使用鼠灰鏈黴菌(Streptomyces murinus)、纖維黃鏈黴菌(Streptmyces celluloflavus)和灰鏈黴菌(Streptmyces griseus)。可應用常規方法進行放線菌的培養。也可應用包含葡萄糖、蔗糖、龍膽二糖、可溶性澱粉、甘油、糊精、糖漿、有機酸等碳源；硫酸銨、碳酸銨、磷酸銨、醋酸銨或蛋白腖、酵母提取物、玉米漿、酪蛋白水解物、麩、肉提取物等氮源的培養基；必要時可應用包含鉀鹽、鎂鹽、鈉鹽、磷酸鹽、錳鹽、鐵鹽、鋅鹽等無機氯化物(無機離子)的培養基。可向培養基中添加維生素、胺基酸等以促進放線菌的生長。培養基的pH調整為，例如5.0～8.0，優選5.5～7.5。培養溫度在，例如15℃～50℃，優選20℃～40℃，更優選25℃～35℃。培養時間無特殊限定，例如1日以上，3日以上，5日以上。培養方法可利用，例如振蕩培養法、通過發酵罐進行的需氧深部培養法。
上述各種培養條件等可根據培養對象作適當調整，只要是能生產本發明的AMP脫氨酶的生產條件即可，其條件等不受限定。
可從將放線菌培養了預期時間的培養液中或菌體中回收AMP脫氨酶。從培養液中回收時，例如將培養上清過濾、離心除去不溶物後，可通過聯合應用硫酸銨沉澱等鹽析、透析、各種色譜等進行分離、純化，獲得AMP脫氨酶。優選，通過硫酸銨沉澱等鹽析分級後，進行疏水性色譜及凝膠過濾。
另一方面，當從菌體內回收時，例如可以通過加壓處理、超聲波處理等將菌體破碎後，與上面同樣進行分離、純化，獲得AMP脫氨酶。通過過濾、離心等預先從培養液回收菌體後，也可進行上述一系列工序(菌體的破碎、分離、純化)。
需指出的是，作為原則，各純化工序中，以AMP脫氨酶活性為指標進行分級，繼續下面的步驟。
本發明的第三方面涉及上述本發明的AMP脫氨酶的應用。本發明的AMP脫氨酶與常規的AMP脫氨酶(即，目前應用的蜂蜜麴黴菌(Aspergillusmelleus)等來源的AMP脫氨酶)有同樣的各種應用。但是，利用耐熱性良好這一特徵，更適於優選在高溫下進行反應的應用。這裡「優選在高溫下進行反應的應用」是指，從製備效率和雜菌汙染等觀點考慮，優選使AMP脫氨酶在高溫下進行反應的應用。其具體例包括酵母提取物的製備。酵母提取物的製備過程中，通常通過核酸酶處理和AMP脫氨酶處理來增強味道(味道改善)。若使用熱穩定性良好的本發明的AMP脫氨酶，可與在高溫下實施的核酸酶處理同時進行AMP脫氨酶處理。這樣，可使製備過程簡化、短程化，同時可有效防止酶處理過程中的雜菌汙染。
利用本發明的AMP脫氨酶的酵母提取物的製備方法中，作為一優選實施方案，實施如下步驟，即向酵母溶菌液中添加核酸酶和AMP脫氨酶，高溫下作用。可按常規方法製備酵母溶菌液。例如，對10％啤酒酵母或麵包酵母等的懸浮液(pH7.0)進行加熱處理，添加市售的溶菌酶YL-NL「AMANO」或YL-15(均為AMANO ENZYME公司製品)溶菌，製備酵母溶菌液。可從不同的製造商(例如AMANO ENZYME公司)獲得核酸酶，可從中適當選擇適宜應用的。也可應用按常規方法從微生物等中製備出的核酸酶。也可並用多種核酸酶。核酸酶與AMP脫氨酶的添加量可以根據使用的酶的種類和活性值而適當設定。工作溫度設為核酸酶與AMP脫氨酶均工作的溫度。例如，60℃～80℃、優選65℃～75℃、更優選約70℃進行反應。
(分離的AMP脫氨酶)如後面的實施例所示，本發明人等成功地鑑定出鼠灰鏈酶菌來源的AMP脫氨酶的胺基酸序列及編碼該序列的基因序列。由此，可利用重組體生產AMP脫氨酶。
本發明的其它方面涉及基於以上成果的分離的AMP脫氨酶。本發明的AMP脫氨酶含有例如具有序列號1中胺基酸序列的蛋白質。如後面的實施例所示，可以驗證該蛋白質實際上具有AMP脫氨酶活性。另外，包括信號肽的序列示於序列號2中。
本發明的一實施方案提供AMP脫氨酶，它含有與具有序列號1或2中胺基酸序列的蛋白質比較時其功能相同，但其部分胺基酸序列不同的蛋白質(以下稱作「同源蛋白質」)。所謂「部分胺基酸序列不同」代表性地指由於構成胺基酸序列的1～數個胺基酸缺失、置換，或者1～數個胺基酸附加、插入，或者它們聯合造成胺基酸序列發生突變(變化)。這裡胺基酸序列不同的允許範圍是只要其保持AMP脫氨酶的功能，即反應的功能(稱為「AMP脫氨酶活性」)即可。只要能滿足該條件，對胺基酸序列不同的位置無特殊限定，也可多個位置不同。這裡所說的多個是指，例如不滿全部胺基酸約30％的數目，優選不滿約20％的數目，更優選不滿約10％的數目，更進一步優選不滿約5％的數目，最優選不滿約1％的數目。也就是說，同源蛋白質與序列號1或2中的胺基酸序列有，例如約70％以上，優選約80％以上，更優選約90％以上，更進一步優選約95％以上，最優選約99％以上的同源性。
優選通過在非必須胺基酸殘基(與AMP脫氨酶活性無關的胺基酸殘基)發生置換的保守的胺基酸置換獲得同源蛋白質。這裡「保守的胺基酸置換」是指將某胺基酸殘基置換成具有同樣性質側鏈的胺基酸殘基。胺基酸殘基依其側鏈可分為鹼性側鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈(例如，天門冬氨酸、穀氨酸)、不帶電荷的極性側鏈(例如，甘氨酸、門冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支側鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)這樣的多個族類。保守的胺基酸置換優選為同一家族內的胺基酸殘基間的置換。
在此，兩個胺基酸序列或兩個核酸序列(以下使用「兩個序列」作為包括這些序列的術語)間的同源性(％)可例如按下面的程序測定。首先，排列兩個序列使之最適於比較(例如，可在第一個序列中導入缺口(gap)以適於與第二個序列比對)。當第一個序列中特定位置的分子(胺基酸殘基或核苷酸)與第二個序列中對應位置的分子相同時，那麼在該位置的分子相同。兩個序列的同源性(％)是一個兩個序列中共通的相同位置數目的函數(即同源性(％)＝相同位置數/位置總數×100)。優選地，為了兩個序列最佳比對而導入的缺口數及其長度也要考慮到。
兩個序列的比較及同源性的確定可應用數學運算法則完成。具體地可用於序列比較的數學運算法則有Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-68中記載的Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-77中修改了的運算法則，但不限定於此。該運算法則整合到Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-10中記載的NBLAST程序和XBLAST程序中(version2.0)。為了獲得與本發明的核酸同源的核苷酸序列，例如可利用NBLAST程序，以score＝100、wordlength＝12進行BLAST核苷酸檢索。為了獲得與本發明的蛋白質同源的胺基酸序列，例如可利用XBLAST程序，以score＝50、wordlength＝3進行BLAST多肽檢索。為了獲得用於比較的缺口比對，可利用Altschul等(1997)AminoAcids Research 25(17)3389-3402中記載的Gapped BLAST。利用BLAST及Gapped BLAST時可應用相應程序(例如，XBLAST及NBLAST)中預設的參數。詳細而言，可參照http://www.ncbi.nlm.nih.gov。可能用於序列比較的其它數學運算法則的例子有Myers和Miller(1988)Comput ApplBiosci.411-17中記載的運算法則。該運算法則整合到例如GENESTREAM網絡伺服器(IGH Montpellier、法國)或ISREC伺服器中可利用的ALIGN程序中。胺基酸序列的比較中利用ALIGN程序的時候，例如可以使用PAM 120殘基質量表，設定缺口長度罰分(penalty)＝12、缺口罰分＝4。
兩個胺基酸序列的同源性的確定可應用GCG軟體包的GAP程序，使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣，缺口權重＝12、10、8、6、或4，缺口長度權重＝2、3、或4。兩個核酸序列的同源度的確定可應用GCG軟體包(可應用http://www.gcg.com)的GAP程序，缺口權重＝50，缺口長度權重＝3。
本發明的AMP脫氨酶(包括同源蛋白質)中，對於那些天然放線菌中含有的酶而言，可從該放線菌中通過提取、純化等操作進行製備。另外，也可根據本說明書或附加的序列表中公開的序列信息，應用基因工程學技術製備本發明的AMP脫氨酶(包括同源蛋白質)。例如，用編碼本發明AMP脫氨酶的DNA轉化適當的宿主細胞，通過回收轉化體表達的蛋白質而進行製備。可根據目的而適當純化回收的蛋白質。作為重組蛋白質進行製備時，可進行各種修飾。例如，將編碼本發明AMP脫氨酶的DNA與其它適當的DNA插入到同一載體，若應用該載體生產重組蛋白質，可獲得本發明的AMP脫氨酶連接了其它肽乃至蛋白質的重組蛋白質。此外，也可進行添加糖鏈和/或脂質的修飾，或者在N末端或C末端進行加工的修飾。通過以上修飾，可使重組蛋白質的提取、純化簡化，或添加生物學功能等。
這裡，與本發明的AMP脫氨酶相關的使用時的「分離」是指，從其原本環境(例如天然物質時的天然環境)中取出的狀態，即通過人為處理，使其以不同於原來的存在狀態而存在。
分離狀態的AMP脫氨酶通常不包括產生菌的菌體成分。優選，雜質成分(雜質蛋白質、利用重組DNA技術生產時來源於宿主的其它成分、培養液成分等)的含有量極少。本發明的分離的AMP脫氨酶，雜質蛋白質的含量例如在總蛋白量的50％以下，優選40％以下，更優選30％以下，更進一步優選20％以下。
(編碼AMP脫氨酶的核酸分子)本發明的其它方面涉及編碼AMP脫氨酶的核酸分子。
本說明書中術語「核酸」包括DNA(包括cDNA和基因組DNA)、RNA(包括mRNA)、DNA類似物和RNA類似物。本發明的核酸的形式沒有限定，即單鏈和雙鏈均可。優選雙鏈DNA。另外，要考慮密碼子的簡併。也就是說，可含有任意鹼基序列，只要能得到目的蛋白質作為其表達產物即可。
本說明書中「編碼特定蛋白質的核酸」是指，當表達它時可獲得該特定蛋白質的核酸。不僅包括有與該蛋白質的胺基酸序列相對應的鹼基序列的核酸，而且也包括在這樣的核酸中添加了不編碼胺基酸序列的序列的核酸(例如包含1個或多個內含子的DNA)。
本說明書中的術語「分離的核酸」是指，當是天然存在的核酸時，代表性地指，從天然狀態下與之共存的其它核酸中分離出來的核酸。但是，也可包含部分其它核酸成分，例如天然狀態下與之比鄰的核酸序列等。
當利用例如cDNA分子等基因重組技術生產核酸時，「分離的核酸」是指優選實質上不包含細胞成分和培養液等狀態的核酸。同樣，當通過化學合成生產核酸時，「分離的核酸」是指優選實質上不包含dNTP等前體(原材料)和合成過程中使用的化學物質等狀態的核酸。
核酸既可作為載體或組成物的一部分存在，也可作為外源性分子存在於細胞內，只要是以人為操作的結果存在即為「分離的核酸」。
只要沒有特殊指出，本說明書中僅是描述「核酸」時是指分離狀態的核酸。
本發明的核酸分子編碼上述本發明的AMP脫氨酶。也就是說，本發明的核酸分子編碼具有序列號1或2中胺基酸序列的蛋白質或其同源蛋白質。本發明的核酸分子的一具體實施方案是具有序列號3中鹼基序列的DNA。該鹼基序列是成功鑑定出的編碼AMP脫氨酶基因的DNA，包括5′非翻譯區(啟動子區域)和3′非翻譯區(終止子區域)。由於該DNA中原本即有啟動子和終止子與結構基因的組合(天然狀態的組合)，所以當利用該DNA進行AMP脫氨酶生產時，可期待良好的基因表達。因此，可構建高效的AMP脫氨酶生產體系。
本發明的其它實施方案提供由序列號3中鹼基序列組成，缺失其5′非翻譯區或其一部分，以及3′非翻譯區或其一部分中任何一個以上的DNA。所講DNA的具體例包括具有序列號4或5的鹼基序列的DNA。序列號4的鹼基序列是成功鑑定出的編碼AMP脫氨酶的結構基因(包括編碼信號肽的區域)的DNA。同樣，序列號5的鹼基序列是成功鑑定出的編碼AMP脫氨酶的結構基因(不包括編碼信號肽的區域)的DNA。
本發明的核酸，可參照本說明書中或附加的序列表公開的序列信息，利用標準的基因工程學技術、分子生物學技術、生物化學技術等，製備成分離狀態。
例如，本發明的核酸，可以該核酸的鹼基序列或其互補序列的全部或部分作探針，利用雜交技術，從放線菌基因組DNA文庫中分離出來。此外，可應用設計的與該核酸的鹼基序列的一部分特異雜交的合成寡核苷酸引物，利用核酸擴增反應(例如PCR)，從放線菌基因組DNA文庫或放線菌基因組或放線菌核酸提取物中擴增和分離。通常，寡核苷酸引物可應用市售的自動化DNA合成裝置等容易地合成。
可根據使用的文庫種類而選用斑點雜交法或者菌落雜交法等(參照Molecular Cloning，Third Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork等)。例如，當利用應用質粒構建的文庫時，可利用菌落雜交法。可應用有本發明核酸特異序列的探針篩選攜有目的核酸的克隆。當選擇了目的克隆後，可以該克隆攜有的核酸為模板，通過應用目的核酸序列特異的引物進行PCR法等，作為擴增產物而獲得本發明的核酸。
可以將所得克隆攜有的核酸亞克隆到適當的載體中供以後應用。如此，可進行例如轉化用的重組載體的構建，或適於解讀鹼基序列的質粒的構建。
本發明的其它實施方案提供一種核酸，當與序列號3～5任一項中的鹼基序列比較時，其編碼的蛋白質功能相同，但其部分鹼基序列不同的核酸(以下稱作「同源核酸」)。作為同源核酸的例子包括，其鹼基序列以序列號3～5的鹼基序列為基準，包含1個或數個鹼基的置換、缺失、插入、附加或逆位，且編碼具有AMP脫氨酶活性蛋白質的DNA。鹼基的置換、缺失等可發生在數個位點。這裡的「數個」是指，該核酸編碼的蛋白質的立體結構中，因胺基酸殘基的位置和種類的不同而異，例如2～40鹼基、優選2～20鹼基，更優選2～10鹼基。
上述鹼基的置換、缺失、插入、附加或逆位等突變中，也包括天然產生的突變，例如基於攜有AMP脫氨酶基因的微生物的個體差異、種屬不同等的突變。
作為同源核酸的其它例子還包括以SNP代表的因核苷酸多態性而造成的上述鹼基的差異。
上述同源核酸，可通過導入突變而獲得，例如通過限制性內切酶處理、核酸外切酶和DNA連接酶等處理、位點特異性突變導入法(MolecularCloning，Third Edition，Chapter 13，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)和隨機突變導入法(Molecular Cloning，Third Edition，Chapter13，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)等。此外，也可通過紫外線照射等其它方法而獲得同源核酸。還可利用公知的突變處理方法而獲得，例如通過紫外處理攜有AMP脫氨酶基因的放線菌，其後分離改變的基因等。
同源核酸的製備方法的具體例如下。從攜有同源核酸的天然放線菌中提取基因組(染色體)DNA，用適當的限制性內切酶處理後，用本發明的核酸分子(例如具有序列號3中鹼基序列的DNA)或其一部分作探針進行篩選，選擇、分離嚴格條件下進行雜交的DNA。當可利用包含攜有同源核酸克隆的基因組(染色體)DNA文庫時，可通過用本發明的核酸分子(例如具有序列號3中鹼基序列的DNA)或其一部分作探針，在嚴格條件下篩選該文庫來獲得。
本發明的其它實施方案涉及具有與序列號3～5鹼基序列互補鹼基序列的核酸。
本發明的其它實施方案提供與序列號3～5鹼基序列、或其中任何一種的互補鹼基序列至少有約60％、70％、80％、90％、95％、99％、或99.9％同源鹼基序列的核酸。同源性越高越好。
本發明的其它實施方案涉及具有與序列號3～5鹼基序列或與其同源鹼基序列互補的鹼基序列在嚴格條件下進行雜交的鹼基序列的核酸。這裡「嚴格條件下」是指形成所謂特異雜交，而不形成非特異雜交的條件。這樣的嚴格條件是本領域技術人員公知的，例如可參照Molecular Cloning(Third Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)及Currentprotocols in molecular biology(edited by Frederick M.Ausubel et al.，1987)設定。作為嚴格條件，例如用雜交液(50％甲醯胺，10×SSC(0.15M NaCl，15mM檸檬酸鈉，pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml變性鮭魚精子DNA、50mM磷酸緩衝液(pH7.5))在約42℃～約50℃下進行孵育，其後用0.1×SSC、0.1％SDS，在約65℃～約70℃下洗滌的條件。更優選的嚴格條件包括，例如應用50％甲醯胺，5×SSC(0.15M NaCl，15mM檸檬酸鈉，pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml變性鮭魚精子DNA、50mM磷酸緩衝液(pH7.5))作為雜交液的條件。
(載體)本發明的其它方面涉及含有本發明核酸的載體。本說明書中的術語「載體」是指能將插入到其中的核酸輸送到細胞等靶標內的核酸性分子。
本發明載體的製備可通過將本發明的核酸(典型為DNA)重組到已存的載體中或經過改變的載體內進行。原則上可應用任何載體作為原材料，只要其能保持本發明的核酸即可，但也可根據使用目的(克隆、多肽的表達)、或考慮宿主細胞的種類而選擇適當的載體。
轉化用的載體，典型地，包括AMP脫氨酶基因(例如具有序列號4中鹼基序列的DNA)、啟動子和終止子。為了實現啟動子對結構基因的正確轉錄，從上遊向下遊依次排列啟動子、AMP脫氨酶基因和終止子。
本發明的載體優選表達載體。「表達載體」是指，能將插入到其中的核酸導入到目的細胞(宿主細胞)內，且能在該細胞內表達的載體。表達載體通常包含核酸表達所必要的啟動子序列和促進表達的增強子序列等。可使用包含選擇標記的表達載體。應用這種表達載體時，可利用選擇標記驗證是否導入了表達載體(及其程度)。
本發明的核酸向載體內的插入、選擇標記基因的插入(必要時)、啟動子的插入(必要時)等可使用標準的重組DNA技術(例如可參照Molecular Cloning，Third Edition，1.84，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，應用限制性內切酶和DNA連接酶的眾所周知的方法)。當構建攜有包含啟動子區域的DNA(例如具有序列號3中鹼基序列的DNA)的載體時，可以分別準備該DNA的啟動子區域和其它區域，分別將它們重組到載體中，從而構建重組載體。這種情況下，以正確發揮啟動子功能為條件，可在載體內二者(啟動子區域與其它區域)間插入其它的序列。此外，可以首先構建攜帶啟動子區域的載體，其後再連接其它區域。
以上重組載體可用於宿主的轉化。也就是說，應用以上重組載體，可製備導入了本發明核酸分子的轉化體。
(轉化體及其應用)轉化用載體可用於宿主的轉化。也就是說，應用上述轉化用載體，可製備導入了本發明核酸分子的轉化體。
對供於轉化的宿主種類無特殊限定，鼠鏈酶菌(IFO14802等)、變鉛青鏈酶菌變鉛青鏈酶菌(TK24等)、灰鏈酶菌灰色亞種(Streptomycesgriseus subsp.griseus)、灰鏈酶菌(Streptomyces griseus)、纖維黃鏈酶菌(Streptomyces celluloflavus)、藍色鏈酶菌(Streptomyces coelicolor)、茂原鏈酶菌(Streptomyces mobaraensis)、除蟲鏈酶菌(Streptomyces avermitilis)等放線菌優選適於用作宿主。也可用大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Saccharomyces pombe)等作為宿主。
可用公知的方法將轉化用載體導入宿主(轉化)。例如，按照應用原生質菌體的D.A.Hopwood等的方法(PRACTICAL STREPTOMYCESGENETICS P.229-252(The John Innes Foundation、2000))進行。
轉化體可用於AMP脫氨酶的生產。具體而言，在可表達本發明的核酸編碼的蛋白質(AMP脫氨酶)的條件下培養導入了本發明的核酸的轉化體，可以使之產生AMP脫氨酶。根據所使用的宿主適當選用培養基。例如，可應用市售的各種培養基，或者向其中添加了脯氨酸、亮氨酸、硫胺素等促進轉化體生長、篩選、蛋白質表達等必要成分的培養基。
可從培養預期的時間後的培養液或菌體中回收目的蛋白質(AMP脫氨酶)。產生到菌體外時從培養液回收，此外從菌體內回收。從培養液回收時，可通過例如將培養上清過濾、離心除去不溶物後，聯合應用硫酸銨沉澱等鹽析、透析、各種色譜等進行分離、純化，獲得目的蛋白質。另一方面，當從菌體內回收時，可通過例如加壓處理、超聲波處理等將菌體破碎後，與上面同樣進行分離、純化，獲得目的蛋白質。也可通過過濾、離心等預先從培養液回收菌體後，進行上述一系列過程(菌體的破碎、分離、純化)。由於本發明的AMP脫氨酶通常產生在菌體外，所以其分離、純化比較容易。
以下，列舉實施例對本發明進行詳細說明，但本發明並不限定於這些實施例。
實施例1鼠灰鏈酶菌來源的AMP脫氨酶的純化1.實驗方法和材料以下實驗中使用菌株、酶液的製備方法、及酶活性的測定方法如下。
使用菌株
使用鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)IFO14802、灰鏈酶菌灰色亞種(Streptomyces griseus subsp.griseus)JCM4681、灰鏈黴菌(Streptomycesgriseus)IFO3355(NBRC3355)及纖維黃鏈酶菌(Streptomyces celluloflavus)IFO13780(NBRC13780)。鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)IFO14802如下保藏於國際保藏部門。
國際保藏部門名稱獨立行政法人產業技術綜合研究所 專利生物保存中心住所 305-8566 日本國茨城県つくば市東1丁目1番3號 中央第6保藏日2004年3月29日保藏序號FERM BP-08673酶液的製備方法
(1)蜂蜜麴黴菌(Aspergillus melleus)來源的酶液用水稀釋市售的AMP脫氨酶[脫氨酶(50,000u/mg品)](商標名，AMANO ENZYME公司製品)，作為酶液。
(2)鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)來源的酶液添加SolpeeNY 2％、Meast P1G 0.5％、NaCl 0.3％、KH2PO40.1％、食物添加MgSO40.05％、可溶性澱粉3％，調整成pH5.7，121℃滅菌30分鐘。接種鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)IFO 14802，27℃預培養1天，培養5天，製備成粗酶液。
(3)放線菌來源的酶液添加大豆粉A 2％、NaCl 0.3％、KH2PO40.1％、食物添加MgSO40.05％、可溶性澱粉3％，調整成pH5.7，121℃滅菌30分鐘。接種細菌，27℃預培養1天，培養5天，製備成粗酶液。
酶活性測定方法
(1)AMP脫氨酶活性測定方法以反應時OD265的減少為指標測定酶活性。將0.017M的5』AMP-2Na與1/15M磷酸鹽緩衝液(pH 5.6)以1∶2的比例混合，向1.5ml混合液中添加0.5ml樣品溶液作為反應液，37℃反應15分鐘。15分鐘後添加2％高氯酸溶液終止反應，然後取100μl。加水到5ml，測定OD265。同樣測定反應時間為0分的樣品作為對照。以上條件下，60分鐘吸光度差減少0.001時作為1單位。
(2)磷酸酶活性的測定方法將0.025M的5』IMP-2Na與0.036M巴比妥鈉-鹽酸緩衝液(pH 5.6)以1∶2的比例混合，向1.5ml混合液中添加0.5ml樣品溶液作為反應液，37℃反應30分鐘。反應終止後取200μl，用5ml的6％高氯酸溶液終止反應。加入0.05M的阿米酚溶液0.25ml混合後，加入0.067M鉬酸銨鹽溶液0.25ml混合，再加入水0.25ml混合。接著流水中放置15分鐘後，測定OD750。同樣測定反應時間為0分的樣品作為對照。以上條件下，30分鐘吸光度差增加0.001時作為1單位。
2.實驗結果(1)熱穩定性比較蜂蜜麴黴菌(Aspergillus melleus)及鼠灰鏈酶菌(Streptomycesmurinus)產生的AMP脫氨酶的熱穩定性。對於蜂蜜麴黴菌(Aspergillusmelleus)及鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)，在規定的溫度下處理用上述方法製備的1％酶溶液後，測定殘存的AMP脫氨酶活性(pH 5.6)。處理溫度為30℃、40℃、50℃、60℃、65℃、70℃、及75℃。另外，處理時間為30分鐘。
測定結果如圖1所示。結果表明鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)來源的AMP脫氨酶的熱穩定性非常良好。
(2)夾雜的磷酸酶測定蜂蜜麴黴菌(Aspergillus melleus)及鼠灰鏈酶菌(Streptomycesmurinus)夾雜的磷酸酶活性。從測定結果所得磷酸酶活性/脫氨酶活性(P/D)，如圖2的表所示。結果表明蜂蜜麴黴菌(Aspergillus melleus)存在夾雜的活性。另一方面，鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)中未檢測出磷酸酶活性。也就是說，該結果表明鼠灰鏈酶菌(Streptomycesmurinus)產生的AMP脫氨酶中夾雜的磷酸酶活性極低。
(3)IMP轉換反應通過HPLC檢測蜂蜜麴黴菌(Aspergillus melleus)及鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)產生的AMP脫氨酶的IMP轉換率。具體而言，用1/15M磷酸緩衝液(pH7.0)製備1.1％AMP溶液，向5ml1.1％AMP溶液中添加0.5ml酶溶液，50℃反應4小時，其後100℃加熱處理10分鐘，濾膜過濾(0.45μm)，通過HPLC進行分析。
測定結果如圖3所示。鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)產生的AMP脫氨酶的IMP轉換率(變化速度)與蜂蜜麴黴菌(Aspergillus melleus)來源的AMP脫氨酶相同。如上所述，鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)不存在夾雜磷酸酶活性，所以進行副產物的確定。結果，副產物的(次黃嘌呤)比率比蜂蜜麴黴菌(Aspergillus melleus)少(結果未示出)。
(4)實用化試驗進行下面的試驗(試驗1、試驗2)以驗證鼠灰鏈酶菌(Streptomycesmurinus)來源的AMP脫氨酶在實際的酵母提取物的製備過程中的有效性。
a)試驗1試驗1中，與現行的製備方法同樣，分別進行核酸酶處理和脫氨酶處理。具體而言，按以下順序進行處理，求出IMP轉換率。首先，向酵母溶菌液(YL-15、0.2％)中添加核酸酶「AMANO」G(AMANO ENZYME公司制、0.1％w/w酵母固體)，70℃、pH 5的條件下反應3小時。接下來，添加待測酵母(蜂蜜麴黴菌(Aspergillus melleus)來源的AMP脫氨酶試劑「Deamizyme(50,000u/mg產品)」(商標名，AMANO ENZYME公司制、0.01～0.04％w/w酵母固體)，或者由鼠灰鏈酶菌(Streptomycesmurinus)製備的粗酶溶液)，50℃、pH 6的條件下反應5小時。接著進行熱處理後，進行HPLC分析。鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)來源的AMP脫氨酶的添加量取其活性值與「Deamizyme(50,000u/mg產品)」(商標名，AMANO ENZYME公司制)的添加量活性值相同的量。
b)試驗2試驗2中同時進行核酸酶處理和脫氨酶處理。具體而言，按以下順序進行處理，求出IMP轉換率。首先，向酵母溶菌液(YL-15、0.2％)中添加核酸酶「AMANO」G(AMANO ENZYME公司制、0.1％w/w酵母固體)及待測酵母(蜂蜜麴黴菌(Aspergillus melleus)來源的AMP脫氨酶試劑「Deamizyme(50,000u/mg產品)」(商標名，AMANO ENZYME公司制、0.01～0.04％w/w酵母固體)，或者由鼠灰鏈酶菌(Streptomycesmurinus)製備的粗酶溶液)，70℃、pH 5的條件下反應規定時間(3小時或5小時)。接著進行熱處理後，進行HPLC分析。鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)來源的AMP脫氨酶的添加量取其活性值與Deamizyme(50,000u/mg產品)的添加量活性值相同的量。
試驗1的結果如圖4(a)所示。圖4(a)表明鼠灰鏈酶菌(Streptomycesmurinus)來源的AMP脫氨酶與蜂蜜麴黴菌(Aspergillus melleus)來源的AMP脫氨酶(Deamizyme50,000u/mg產品)具有同等的IMP轉換率。
另一方面，試驗2的結果如圖(b)所示。圖中3hrs是與鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)來源的AMP脫氨酶同時作用3小時時的測定結果，同樣5hrs是作用5個小時時的測定結果。需要指出的是，使用蜂蜜麴黴菌(Aspergillus melleus)來源的AMP脫氨酶(Deamizyme50,000u/mg產品)時(無論3小時的反應還是5小時的反應)沒有IMP的生成。如圖4(b)所表明的，使用鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)來源的AMP脫氨酶時，即使在高溫下與核酸酶同時作用也有IMP的生成。由此可以驗證，鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)來源的AMP脫氨酶與核酸酶同時進行反應是可能的。
(5)鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)來源的AMP脫氨酶的各種酶學性質嘗試按以下程序純化鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)來源的AMP脫氨酶。首先，按上述方法培養鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)(IFO14802)，用超濾膜(AIP1010)將產生的酶濃縮2倍，向濃縮液中加入水，進一步除去濃縮的低分子級分後，冷凍乾燥，作為粗酶。將粗酶溶解到純化水中，用48％的飽和硫酸銨進行沉澱。將沉澱級分溶解到20mM KPB(pH7.0)中，作為酶溶液。將所得酶溶液通過用含30％硫酸銨的20mM KPB(pH7.0)平衡過的HiPrepTM16/10ButylFF(Pharmacia制)。然後，用含30％～0％硫酸銨的20mM KPB(pH7.0)、硫酸銨30％～0％的濃度剃度進行洗脫。其後，進行濃縮，將活性級分供給Superose 12柱(Pharmacia制)進行凝膠過濾，用含150mM NaCl的50mM KPB pH7.0進行洗脫。收集活性級分(級分15和16)作為純化酶。HiPrepTM16/10ButylFF進行的色譜結果如圖5(a)所示，用Superose 12進行的色譜結果如圖5(b)所示。此外，各階段的總酶活性量、總蛋白質量、比活性及收率示於圖6(a)的表中。最後階段的比活性是粗酶的96倍。
將純化的酶進行SDS-PAGE(CBB染色)，驗證蛋白質的純度。SDS-PAGE的結果如圖6(b)所示。泳道II是樣品(純化酶)。顯示單一的條帶，表明純化酶的純度高。泳道I是蛋白質分子量標誌的條帶。從高分子量開始順次是磷酸化酶b(M.W.97400)、牛血清白蛋白(M.W.66267)、醛縮酶(M.W.42400)、碳酸酐酶(M.W.30000)、胰蛋白酶抑制劑(M.W.20100)、溶菌酶(M.W.14400)的條帶。
檢測反應溫度與所得純化酶活性的關係。測定結果如圖7(a)所示。圖7(a)的圖表表示以在65℃進行反應時的活性值作為100％時的相對活性(％)。圖7(a)的圖表表明在40℃～70℃的廣域範圍內有高活性。此外，即使在反應溫度達75℃時還有約50％的活性。這表明該酶在較廣範圍的溫度條件下也有良好的功效。
接下來，按以下程序檢測該酶的熱穩定性。用pH5.0的醋酸緩衝液將2.8μg(總蛋白量)酶溶液(0.15ml)調成pH 5.6後，在各溫度下(40℃、50℃、60℃、65℃、70℃、75℃)處理30分鐘，測定殘存活性(相對於未處理時的酶活性％)。測定結果如圖7(b)所示。65℃以下的處理條件下維持大約90％以上的活性。此外，即使在70℃進行處理時也維持大約55％的活性。這表明該酶有極優的熱穩定性。
下面，檢測pH與該酶活性的關係。測定結果如圖8(a)所示。圖8(a)的圖表表示以在pH5.6進行反應時的活性值作為100％時的相對活性(％)。pH在約4.5～約8.5的範圍內有比較高的反應性，在約5.0～約8.0的範圍內有約70％以上的反應性。此外，即使在pH9.0的條件下還有約40％的反應性。
接下來，按以下程序檢測該酶的pH穩定性。用pH3～8的(McIlvaine)緩衝液，pH8～10的(Atkins-pantin)緩衝液將2.8μg(總蛋白量)酶溶液(0.15ml)調成各條件的pH，30℃放置30分鐘後，測定殘存活性(相對於pH7.0處理時的酶活性％)。測定結果如圖8(b)所示。結果表明，pH在約6.0～約8.5的範圍內維持比較高的活性，在約6.5～約8.0的範圍內維持約80％以上的活性。
(6)鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)來源的AMP脫氨酶的底物特異性據報導金黴素鏈酶菌(Streptomyces aureofaciens)來源的腺苷脫氨酶有廣泛的底物特性，例如具有AMP催化能力等(非專利文獻2)。基於該考慮，為了確認上述方法獲得的鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)來源的脫氨酶是AMP脫氨酶(AMP-deaminase)還是腺苷脫氨酶(Adenosine-deaminase)，檢測了其底物特異性。結果如圖9的表所示。圖中表示以對5』AMP的酶活性為100％時的相對活性。該酶對5』AMP最有效。此外，對3』AMP、5』dAMP、ADP、ATP、腺苷(Adenosine)及3′5′-cyclic AMP也起效，但對2』AMP、腺嘌呤(adenine)沒有一點作用。特別對5』dAMP、ADP及ATP作用良好。從以上結果可以確認，用上述方法獲得的鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)來源的脫氨酶是AMP脫氨酶。此外，該酶也可用於以5』dAMP、ADP及ATP作底物進行的反應中。
(7)鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)來源的AMP脫氨酶的各種酶學性質通過色譜聚焦來獲得上述方法獲得的鼠灰鏈酶菌(Streptomycesmurinus)來源的AMP脫氨酶的等電點。使用MonoP柱(Pharmacia制)，分別用0.075MTris一醋酸緩衝液(pH9.3)將起始緩衝液(Start Buffer)、用鹽酸將洗脫緩衝液(Poly buffer 96)調成pH4.0，最終體積達100ml。此外，進行3ml的預梯度(Pre-gradient)、30ml的梯度洗脫(gradient eluent)、30ml的洗脫(eluent)。色譜聚焦的結果如圖10所示。從結果認為同功酶至少2個(pI 8.12、7.02)，主要級分的等電點為8.12。包括以上結果所得等電點，鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)來源的AMP脫氨酶的各種性質總結於圖11的表中。如表中所示，鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)來源的AMP脫氨酶，其凝膠過濾的分子量大約48000±2000(SDS-PAGE的分子量60000±3000)、最適pH約5.6、最適溫度約65℃、等電點8.12、Km值0.95mM、Vmax為3.5×107μmol/min/mg。
(8)從鏈黴菌屬尋找AMP脫氨酶的生產菌以上的研究結果顯示，屬於鏈黴菌屬的放線菌之一的鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)產生耐熱性AMP脫氨酶，所以預測從鏈黴菌屬的其它株也有可能獲得耐熱性AMP脫氨酶。於是，從AMANO ENZYME保存菌株中的鏈黴菌屬中篩選AMP脫氨酶生產菌。結果發現灰鏈黴菌灰色亞種(Streptomyces griseus subsp.griseus)、灰鏈黴菌(Streptomycesgriseus)、及纖維黃鏈酶菌(Streptomyces celluloflavuys)3株是生產AMP脫氨酶的菌株。檢測了這3株菌生產的AMP脫氨酶的熱穩定性和底物特異性。結果如圖12所示。熱穩定性試驗中使用培養所得粗酶溶液，處理條件為65℃、30分鐘。以未處理時的活性為100％，求出殘存活性。至於底物特異性(對腺苷的特異性)，是以用AMP為底物時的活性值為100％時的相對活性。
如圖12所示，上述3株菌株，其熱穩定性比蜂蜜麴黴菌(Aspergillusmelleus)來源的脫氨酶好。該結果提示，鏈黴菌屬的放線菌產生的脫氨酶通常有熱穩定性高的傾向。以上3株產生的脫氨酶對AMP的作用比腺苷的好，所以可以確認是AMP脫氨酶。
實施例2鼠灰鏈酶菌來源的AMP脫氨酶的鑑定1.胺基酸序列分析按上述實施例的程序培養鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)IFO14802，得到純化酶。但是純化到應用HiPrepTM16/10ButylFF(Pharmacia)的丁基瓊脂糖(Butyl Sepharose)柱為止。應用凝膠PAG Mini「DAIICHI」10/20(第一化學藥品)，對分級樣品進行SDS-PAGE。用加入0.01％SDS的Towbin緩衝液(Tris 25mM、甘氨酸192mM、甲醇5％)作電轉緩衝液，將電泳後的凝膠轉移到PVDF膜上。電轉的條件是，應用緩衝液槽型電轉裝置，恆壓20V、4℃條件下進行18小時。電轉後進行CBB(考馬斯亮藍R-250)(Fluka)染色，切出相當於該酶的條帶，作為N末端胺基酸序列分析用的樣品。同樣，對電泳後的凝膠進行CBB染色，切出相當於該酶的條帶，作為分析內部胺基酸序列用的樣品。對這些樣品進行胺基酸序列分析的結果如圖13所示。
2.從鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)IFO14802提取基因組DNA按上述實施例的程序培養鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)IFO14802，用布氏漏鬥和吸濾燒瓶過濾培養液，獲得菌體。將菌體1g混懸到含4mg/ml溶菌酶(Roche Diagnostics)、2mg/ml無色肽酶(Achromopeptitase)(和光純藥)的10ml TE(10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA)溶液中混懸，30℃溶菌1小時。添加2.4ml 0.5mM EDTA溶液、260μl 10mg/ml蛋白酶E(科研化學)，再30℃溶菌5分鐘。接著加入1.4ml 10％SDS溶液，上下混合，37℃培養2小時。加入用含0.1M NaCl的TE溶液平衡過的12ml苯酚攪拌5分鐘後，再加入12ml氯仿，進一步攪拌5分鐘。其後離心(1,500g、室溫、5分鐘)獲得上清。該操作重複2次，向所得上清中添加72μl的10mg/ml RNase A(Sigma-AldrichJapan)，37℃下孵育1小時。添加4.5ml 5M NaCl，混合後添加11.25ml的30％聚乙二醇6000(和光純藥)溶液，混合，4℃放置一晚。用巴氏吸管吸取沉澱出的基因組DNA，用70％乙醇洗滌，風乾後，溶解到TE溶液中1ml中，獲得1mg/ml的基因組DNA溶液。
3.合成引物的設計考慮到上述內部胺基酸序列分析的結果，設計下面的合成引物(Invitrogen)。
引物IS-F 5』-TTC GGI GAG GTI ACI GCI CGI CAY MG-3』(序列號6)胺基酸序列N末端-F G E V T A R H R G-C末端引物IS-R 3』-CTY CGI CTR CTG CCI CTG CGI CTC AA-5』(序列導7)
胺基酸序列N末端-E A D D G D A E F R-C末端4.Southern雜交、菌落雜交用探針的製備以上面所得鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)IFO14802來源的基因組DNA為模板進行PCR反應。應用TaKaRa LA TaqTMwith GC buffer(寶酒造)，向反應體系中加入2μM上述合成引物IS-F、IS-R，50ng作為模板的基因組DNA。96℃孵育3分鐘後，進行96℃·45秒、66℃·1分鐘、72℃·3分鐘的35個循環的反應，最後72℃孵育10分鐘。瓊脂糖電泳後，用GENECLEANTMIII(BIO101)提取特異擴增的約240bp的DNA片段。將提取的DNA片段亞克隆到pGEMTM-T Easy(Promega)後，再次提取插入的DNA片段，然後用DIG High Prime(Roche Diagnostics)進行DIG標記，作為AMP脫氨酶基因的探針。
5.Southern雜交用任意的限制性內切酶完全消化基因組DNA，以每個泳道6μg的添加量進行瓊脂糖電泳。電泳結束後用0.25N HCl溶液處理30分鐘，用電泳中使用的緩衝液中和後，通過應用0.4N NaOH溶液的鹼性印跡印到Zeta-ProbeTM膜上(Bio-Rad)。用2016VacuGene(Pharmacia LKBbiotechnology)在真空度50cm·H2O下轉移90分鐘。印跡後，用2×SSC(NaCl 0.3M、檸檬酸鈉33.3mM)溶液洗膜，風乾後，80℃孵育30分鐘，將DNA固定到膜上。用上述探針對固定化了的膜進行Southern雜交，用DIG Nucleic Acid Detection Kit(Roche Diagnostics)進行檢測。如此，製備出該酶基因的限制性內切酶圖譜(圖14)。
6.菌落雜交用限制性內切酶Not I(寶酒造)完全消化12μg基因組DNA後，通過瓊脂糖電泳切出長度為3.8kbp的DNA片段，接著用GENECLEANTMIII(BIO 101)抽提，作為製備文庫用的插入物。同時，用Not I(寶酒造)完全消化pBluescriptII KS(+)(Stratagene)後，用鹼性磷酸酶(寶酒造)脫磷酸後作為製備文庫用的載體。用Ligation Kit ver.2(寶酒造)連接插入物與載體，用Hanahan的方法(J Mol Biol.1983 Jun 5；166(4)557-80，Hanahan D.，Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids)轉化大腸桿菌DH5感受態細胞(東洋紡績)。將所得克隆接種到LA平板(氨苄西林(Sigma-Aldrach Japan)100μg/ml)，使每塊板形成大約500個菌落，37℃培養一晚，使菌落生成。將所形成的總共大約9500個菌落轉到Nylon Membranes for Colony and Plaque Hybridization(Roche Diagnostics)上，將DNA固化到膜上。用前面所講的探針進行菌落雜交，用DIG NucleicAcid Detection Kit(Roche Diagnostics)檢測出顯示強信號的菌落。以上操作方法均按使用的試劑所附說明書使用。所得克隆命名為pSAD，它是包含鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)IFO14802來源的AMP脫氨酶基因的克隆。
7.AMP脫氨酶基因的鹼基序列的分析首先應用M13 Primer M4、M13 Primer RV(寶酒造)從插入物外側開始進行鹼基序列分分析。根據用分離的克隆和探針對DNA片段進行鹼基序列分析所明確的該酶基因序列，再度設計合成引物(Sigma Genosys)，進行鹼基序列分析。重複進行該操作，通過引物足跡(primer walking)分析全長DNA序列。使用BigDyeTMTerminator v3.1 Cycle Sequencing Kit和dGTP BigDyeTMTerminator v3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(Applied Biosystems Japan)進行鹼基序列分析，用ABI PRISMTM310Genetic Analyzer(Applied Biosystems Japan)進行分析。以下是用於鹼基序列分析的合成引物。
MAD-F15』-AAGCAACTCGCCGACCAG-3』(序列號8)MAD-F25』-TGGTCCATGCAGGACTTC-3』(序列號9)MAD-F35』-CTGGAGAACTACAGCCTC-3』(序列號10)MAD-F45』-CAGATCCTCGGCGTCAAG-3』(序列號11)MAD-F55』-CTCCAGTACGCCTTCCTG-3』(序列號12)MAD-F65』-GTCGGGTCCTGGACACCG-3』(序列號13)MAD-F75』-TATACCGTCCGGTAGGTC-3』(序列號14)MAD-F85』-GGACAGGAAGACGGACAC-3』(序列號15)MAD-F95』-GATTGGCCGAGAAGTACG-3』(序列號16)MAD-R15』-TGGTCGGCGAGTTGCTTG-3』(序列號17)
MAD-R25』-CAGGGACAGGACACTGAG-3』(序列號18)MAD-R35』-GATGTCGACATGGCCCTG-3』(序列號19)MAD-R45』-CCCAGTCGATCGCGTGAG-3』(序列號20)MAD-R55』-TGGTCGTTCCGTGAAGGC-3』(序列號21)MAD-R65』-CTCGAACGCCGCGAACGC-3』(序列號22)MAD-R75』-CTGGGTGTGCGCGATGTC-3』(序列號23)MAD-R85』-CACCATCATCGCCACCTG-3』(序列號24)分析結果鑑定的全部鹼基序列(序列號3)顯示於圖21～22及圖25～26中。此外，通過應用同源性檢索和模體檢索的注釋，明確了其啟動子區域、編碼區域(序列號4)和終止子區域(圖21～22)。啟動子區域的序列、編碼區域的序列和終止子區域的序列分別示於圖27、28和29中。根據鹼基序列而推斷的胺基酸序列示於圖23(不含信號肽，序列號1)、圖24(包含信號肽，序列號2)。
8.放線菌用載體pIJ702的獲得在以下的培養基條件下培養攜有質粒pIJ702的變鉛青鏈酶菌(Streptomyces lividans)3131(ATCC 35287)，30℃培養2天。
YEME培養基+0.5％甘氨酸+50μg/ml硫鏈絲菌素(和光純藥)酵母提取物3g蛋白腖5g麥芽提取物3g氯化鎂1g葡萄糖10g蔗糖 340g甘氨酸5g50mg/ml硫鏈絲菌素溶液(二甲基亞碸溶液)1ml/L(pH7.0)將培養後的培養基200ml離心(12,000g、4℃、10分鐘)，將所得菌體懸浮到TE-Sucrose(50mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM EDTA、25％Sucrose)10ml中。加入2ml含30mg/ml溶菌酶(Sigma-Aldrich Japan)的TE-Sucrose和4ml的0.25mM EDTA溶液，37℃孵育30分鐘。孵育後，加入2ml20％SDS溶液，再加入5ml 5M NaCl溶液，輕輕攪拌後，0℃孵育1晚。然後，離心(100,000g、4℃、40分鐘)，向所得上清中加入30％的聚乙二醇6000(和光純藥)溶液使得終濃度為10％，0℃孵育4.5小時。其後，離心(900g、4℃、5分鐘)，將沉澱溶解到含50mM NaCl的TE溶液中。隨後添加16.8g氯化銫和1.2ml溶解到TE溶液中濃度為10mg/ml的溴化乙錠溶液，離心(1,300g、室溫、15分鐘)，除去殘渣後，再次離心(230,000g、20℃、12小時)。離心後，在紫外照射下獲得質粒DNA層。接下來，用經TE溶液飽和的正丁醇萃取，除去溴化乙錠。萃取重複3次。用TE作透析外液對所得質粒DNA溶液進行透析，4℃、透析1晚。其後，用TE溶液飽和的苯酚抽提1次，氯仿/異戊基醇抽提2次。然後加入1/10體積的3M醋酸鈉(pH5.2)溶液和2倍體積的乙醇，-80℃靜置30分鐘。其後，離心(12,000g、4℃、15分鐘)，回收沉澱，用70％乙醇洗滌沉澱，使之乾燥。將之溶解到TE溶液200μl中。通過以上操作，最終獲得大約10μg量的DNA。
9.穿梭質粒pSV1的構建首先，準備用限制性內切酶Bam HI消化大腸桿菌用載體pUC19(寶酒造)的DNA片段，用Bcl I(寶酒造)消化放線菌用載體pIJ702所得含硫鏈絲菌素抗性基因(tsr)的DNA片段，用DNA Ligation Kit Ver.2(寶酒造)進行連接，製備成pUCTSR。接下來準備用Kpn I、Cla I(寶酒造)消化pUCTSR所得的DNA片段(長片段)和用Kpn I、Cla I(寶酒造)消化pIJ702所得DNA片段(短片段)，用DNA Ligation Kit Ver.2(寶酒造)將它們進行連接後，轉化大腸桿菌DH5株(東洋紡)中。所得轉化體攜有的將pUC19片段與pIJ702片段連接在一起的質粒，將之稱作穿梭載體pSV1，用於後面的操作(圖15)。
10.表達載體pSVSAD的構建用限制性內切酶Not I(寶酒造)消化攜有AMP脫氨酶基因的pSAD，準備該基因片段。另外準備用限制性內切酶Xba I消化穿梭質粒pSV1所得載體片段。用DNA Blunting Kit(寶酒造)使兩者末端平滑化，分別作為插入片段、載體片段。再用鹼性磷酸酶Alkaline Phosphatase(寶酒造)對pSV1來源的載體片段進行脫磷酸處理。用DNA Ligation Kit Ver.2(寶酒造)連接插入片段與載體後，轉化大腸桿菌DH5細胞株(東洋紡)。所得質粒作為表達載體pSVSAD，用於轉化(圖16)。
11.變鉛青鏈酶菌(Streptomyces lividans)TK24原生質體的製備變鉛青鏈酶菌(Streptomyces lividans)TK24來源於變鉛青鏈酶菌(Streptomyces lividans)66，具有鏈黴素抗性，由D.A.Hopwood(John InnesInstitute、Colney Lane、Norwich NR4 7UH、U.K.)提供。用YEME培養基(0.5％甘氨酸)培養變鉛青鏈酶菌(Streptomyces lividans)TK24，30℃、培養2天。200ml培養後的培養基離心(1,300g、室溫、10分鐘)，將所得菌體懸浮到72ml 0.35M蔗糖溶液中。接著將懸浮液離心(1,300g、室溫、10分鐘)，將菌體再懸浮到60ml含1mg/ml溶菌酶(Sigma-Aldrich Japan)的P緩衝液中，30℃、孵育2.5小時。孵育後，用脫脂棉將懸浮液過濾除去殘渣。然後將所得濾液離心(1,300g、室溫、10分鐘)，用P緩衝液25ml洗滌沉澱。該洗滌重複2次，然後將沉澱懸浮到1ml P緩衝液中，作為原生質體懸浮液。
P緩衝液TES[N-Tris(羥甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸]5.73g蔗糖 103g氯化鎂2.03g硫酸鉀0.5g氯化鈣3.68g微量元素溶液 2ml/L(pH7.4)獨立製備1％磷酸鉀溶液，使用前每100mlP緩衝液中加1ml該溶液。
微量元素溶液氯化鋅40mg氯化鐵200mg氯化銅10mg氯化錳10mg
四硼酸鈉 10mg鉬酸銨 10mg/L12.變鉛青鏈酶菌(Streptomyces lividans)TK24的轉化混合以下各溶液，使其總量達121μl。
含AMP脫氨酶表達質粒pSVSAD(4μg)的TE溶液1μl變鉛青鏈酶菌TK24原生質體 100μl0.35M蔗糖溶液 20l接下來，用吸液管添加1.5ml含20％聚乙二醇1000的P緩衝液，輕輕混合，室溫放置2分鐘。將該混合液離心(1,700g、室溫、10分鐘)，收集沉澱。用P緩衝液洗滌所得原生質體沉澱2次。再將團塊懸浮到0.3mlP緩衝液中後，每100l滴到R-2培養基中。然後，將在55℃保溫的R-2上層瓊脂糖培養基灌注到平板上，每板3ml，使原生質體分散到整個平板。在淨化臺中將平板乾燥2小時，直到上層瓊脂糖培養基固化。乾燥後30℃培養16小時，然後添加3ml含200g/ml硫鏈絲菌素的R-2上層瓊脂糖培養基覆蓋平板表面，乾燥2小時。再在30℃下將平板培養4天，獲得硫鏈絲菌素抗性的轉化體(SAD-1)。
分別如下製備R-2/A及R-2/B，然後混合它們製備成R-2培養基。含瓊脂的培養基作為R-2平板，含瓊脂糖的培養基作為R-2上層瓊脂糖培養基。製備平板時混合R-2/A、R-2/B，再以每200ml終體積1ml的比例混合1％KH2PO4。
R-2/A硫酸鉀 0.5g氯化鎂 20.2g氯化鉀 5.9g葡萄糖 20.0g脯氨酸 6.0g酪蛋白水解物0.2g微量元素溶液4.0ml瓊脂44.0g/L或瓊脂糖5.0g/L
R-2/BTES 11.5g酵母提取物10.0g蔗糖 203g/L(pH7.4)13.轉化體的培養按上面實施例的程序(酶液的製備方法)添加ソルピ一NY 2％、ミ一ストP1G 0.5％、KH2PO40.1％、MgSO40.05％、可溶性澱粉3％，調整成pH5.7，121℃滅菌30分鐘。接種轉化體SAD-1與轉化的宿主變鉛青鏈酶菌(Streptomyces lividans)TK24，30℃預培養2天，培養5天，取培養上清的一部分，作為以下測定AMP脫氨酶活性的樣品。
14.AMP脫氨酶活性測定按照實施例中所示的方法(酶活性的測定方法的欄目)測定上面所得樣品的酶活性。將0.017M的5』AMP-2Na與1/15M磷酸鹽緩衝液(pH5.6)以1∶2的比例混合，向1.5ml混合液中添加0.5ml樣品溶液作為反應液，37℃反應15分鐘。15分鐘後添加2％高氯酸溶液終止反應，然後取100μl。加水到5ml，測定OD265。同樣測定反應時間為0分的樣品作為對照。以下條件下，60分鐘吸光度差減少0.001時作為1單位。測定結果如圖17所示。在同樣條件下培養變鉛青鏈酶菌TK24的培養上清作為對照(Control)樣品。
從圖17可以看出，轉化體SAD-1的培養上清中有高AMP脫氨酶活性。從該結果可以驗證成功獲得了AMP脫氨酶基因。另外，提示實際上可應用該基因構建AMP脫氨酶生產體系。
15.轉化體(SAD-1)來源的AMP脫氨酶的熱穩定性測定轉化體(SAD-1)產生的AMP脫氨酶的熱穩定性。在規定的溫度下處理用上述方法製備的SAD-1培養上清，然後，測定殘存的AMP脫氨酶活性(pH 5.6)。處理溫度為30℃、40℃、50℃、60℃、65℃、70℃、及75℃。處理時間是30分鐘。
測定結果如圖18所示。結果表明與圖1所示的鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)來源的AMP脫氨酶有同樣的熱穩定性。
16.轉化體(SAD-1)來源的AMP脫氨酶的底物特異性為了確認上述方法獲得的轉化體(SAD-1)來源的脫氨酶是AMP脫氨酶(AMP-deaminase)還是腺苷脫氨酶(Adenosine-deaminase)，檢測其底物特異性。結果如圖19所示。圖中表示以對5』AMP的酶活性為100％時的相對活性。該酶對5』AMP最有效。此外，對3』AMP、5』dAMP、ADP、ATP、腺苷(Adenosine)及3′5′-cycilc AMP也起效，但對2』AMP、腺嘌呤(adenine)沒有一點作用。特別對5』dAMP、ADP及ATP作用良好。從以上結果可以確認，轉化體(SAD-1)來源的脫氨酶與鼠灰鏈酶菌(Streptomyces murinus)來源的AMP脫氨酶類似，是AMP脫氨酶。此外，該酶也可用於以5』dAMP、ADP及ATP作底物進行的反應中。
17.轉化體(SAD-1)來源的AMP脫氨酶的生產驗證將SAD-1的培養上清進行SDS-PAGE(CBB染色)，驗證轉化體對該酶的生產。SDS-PAGE的結果如圖20所示。泳道II是對照樣品(宿主培養上清)，泳道III是轉化體(SAD-1)培養上清。泳道III中存在泳道II中沒有的條帶，說明轉化體產生了新的酶蛋白質。泳道I是蛋白質分子量標記的條帶。從高分子量開始順次是磷酸化酶b(M.W.97000)、牛血清白蛋白(M.W.66,000)、卵清蛋白(M.W.45000)、碳酸酐酶(M.W.30000)、胰蛋白酶抑制劑(M.W.20100)的條帶。
如上所述，本發明人等成功克隆了編碼鼠灰鏈酶菌來源的AMP脫氨酶的基因。此外，應用放線菌的轉化體系，成功獲得了導入了該基因的轉化體，並驗證了該基因的表達。這些成果表明該酶可以重組體形式生產。因此，實現了穩定供給，並且可通過基因重組來提高該酶的生產性和對酶本身進行的改良。例如(1)利用具有高生產性的啟動子提高生產性能；(2)利用生產性能高的菌株作為宿主進行高生產性轉化體的製備，以及利用該轉化體構建高生產體系；(3)可以通過改變鹼基序列、胺基酸序列進行生產性能的提高、穩定性的提高，和/或底物特異性的改良等。
產業上利用的可能性本發明的AMP脫氨酶具有良好的熱穩定性。因此，適用於希望在高溫下進行反應的應用中。例如，在酵母提取物的製備過程中，作為增強味道用的酶；或者作為製備調味料5』-肌苷酸用的酶應用。
此外，通過利用作用於AMP以外的底物這一特性，本發明的AMP脫氨酶可在以ADP，ATP、5』d AMP等底物為原材料的各種反應中應用。
該發明不限定於上述發明的實施方式及實施例中的說明。只要不脫離權利要求範圍內，業內人士很容易想到的各種不同的實施方式也包括在本發明內。
本說明書中提到的論文、公開專利公報、專利公報等內容，其所有內容均在此引用作為參考。
序列表110天野酶株氏會社山下涼子森 茂治東本篤樹安藤啟一結城健介120放線菌來源的AMP脫氨酶及其應用130P0403301150JP P2004-1344641512004-04-2816024170PatentIn version 3.12101211491212PRT213鼠灰鏈酶菌4001Ala Pro Pro Pro Arg Gln Ala Thr Ala Ala Glu Ala Arg Thr Asp Ala1 5 10 15Tyr Leu Arg Ser Val Lys Asp Arg Pro Ala Ala Leu Arg Ala Phe Phe20 25 30Arg Gln Leu Pro Lys Gly Gly Asp Leu His Asn His Leu Ser Gly Ala35 40 45Val Asn Thr Asp Tyr Leu Ile Glu Leu Ala Ala Glu Asp Gly Leu Cys50 55 60Ile Asp Ala Thr Met Thr Ala Val Pro Ser Pro Cys Gly Pro Gly Thr
65 70 75 80Arg Pro Ala Ala Asp Ala Arg Thr Asp Arg Ala Phe His Asp Ala Ile85 90 95Val Arg Ala Trp Ser Met Gln Asp Phe Pro Pro Asp Glu Asn Gly His100 105 110Asp His Phe Phe Asp Thr Phe Gly Lys Phe Gly Glu Val Thr Trp Arg115 120 125His Arg Gly Lys Leu Leu Ala Gln Val Ala Asp Thr Val Val Ala Asn130 135 140Asn Gln Ser Tyr Leu Glu Thr Met Val Thr Pro Ala Ser Asp Gly Ala145 150 155 160Lys Gln Leu Ala Asp Gln Val Gly Trp Asp Ala Asp Leu Thr Ala Leu165 170 175His Arg Lys Leu Ala Ala Gly Gly Lys Leu Asp Lys Leu Val Ala Asp180 185 190Ala Arg Lys Glu Ala Asp Asp Gly Asp Ala Glu Phe Arg Ala Thr Glu195 200 205His Cys Gly Thr Ala Lys Ala Arg Pro Ala Cys Gly Leu Thr Val Arg210 215 220Trp Ile Ser Gln Ala Ser Arg Gly Ser Ser Pro Val Arg Val Phe Thr225 230 235 240Gln Leu Asp Leu Gly Met Arg Leu Ala Glu Ala Asp Ser Arg Phe Val
245 250 255Ala Val Asn Leu Val Gln Pro Glu Asp Trp Asp Ser Ser Leu Glu Asn260 265 270Tyr Ser Leu Gln Met Arg Met Val Gly Tyr Leu Arg Thr Val Tyr Pro275 280 285Lys Ala His Val Thr Leu His Ala Gly Glu Leu Trp Pro Gly Leu Val290 295 300Lys Pro Glu Ala Leu Lys Phe His Ile Ala Glu Ala Val Asp Ile Ala305 310 315 320His Thr Gln Aal Val Gly His Gly Val Asp Leu Val His Glu Asp Asn325 330 335Trp Gln Arg Thr Ala Arg Thr Met Ala Ala Arg Gln Ile Ala Val Glu340 345 350Val Pro Phe Ser Ser Asn Ala Gln Ile Leu Gly Val Lys Gly Ala Glu355 360 365His Pro Phe Thr Thr Tyr Arg Arg Tyr Gly Val Pro Val Val Leu Ala370 375 380Thr Asp Asp Pro Gly Val Ser Arg Ile Asp Ile Ser His Glu Tyr Gln385 390 395 400Tyr Ala Ala Ala Thr Tyr Gly Leu Gly Tyr Pro Glu Leu Lys Asp Leu405 410 415Ala Arg Ala Ser Leu Gln Tyr Ala Phe Leu Pro Gly Ala Ser Leu Trp
420 425 430Gln Gly Asn Pro Thr Ala Gln Gly Tyr His Pro Val Ala Ala Cys Arg435 440 445Ala Glu Arg Pro Gly Gln Pro Val His Ser Ala Ala Cys Arg Arg Leu450 455 460Leu Asp Gly Ser Ala Arg Ala Arg Leu Glu Trp Arg Gln Glu Ala Ala465 470 475 480Phe Ala Ala Phe Glu Arg Ala His Ala Arg Gly485 4902102211519212PRT213鼠灰鏈酶菌4002Met Leu Gly Thr Leu Ser Val Leu Ser Leu Leu Ser Ala Leu Pro Ala1 5 l0 15Ala Ala Gln Pro Ala Arg Ala Ala Ala Arg Pro Ala Ala Pro Pro Pro20 25 30Arg Gln Ala Thr Ala Ala Glu Ala Arg Thr Asp Ala Tyr Leu Arg Ser35 40 45Val Lys Asp Arg Pro Ala Ala Leu Arg Ala Phe Phe Arg Gln Leu Pro50 55 60Lys Gly Gly Asp Leu His Asn His Leu Ser Gly Ala Val Asn Thr Asp65 70 75 80
Tyr Leu Ile Glu Leu Ala Ala Glu Asp Gly Leu Cys Ile Asp Ala Thr85 90 95Met Thr Ala Val Pro Ser Pro Cys Gly Pro Gly Thr Arg Pro Ala Ala100 105 110Asp Ala Arg Thr Asp Arg Ala Phe His Asp Ala Ile Val Arg Ala Trp115 120 125Ser Met Gln Asp Phe Pro Pro Asp Glu Asn Gly His Asp His Phe Phe130 135 140Asp Thr Phe Gly Lys Phe Gly Glu Val Thr Trp Arg His Arg Gly Lys145 150 155 160Leu Leu Ala Gln Val Ala Asp Thr Val Val Ala Asn Asn Gln Ser Tyr165 170 175Leu Glu Thr Met Val Thr Pro Ala Ser Asp Gly Ala Lys Gln Leu Ala180 185 190Asp Gln Val Gly Trp Asp Ala Asp Leu Thr Ala Leu His Arg Lys Leu195 200 205Ala Ala Gly Gly Lys Leu Asp Lys Leu Val Ala Asp Ala Arg Lys Glu210 215 220Ala Asp Asp Gly Asp Ala Glu Phe Arg Ala Thr Glu His Cys Gly Thr225 230 235 240Ala Lys Ala Arg Pro Ala Cys Gly Leu Thr Val Arg Trp Ile Ser Gln245 250 255
Ala Ser Arg Gly Ser Ser Pro Val Arg Val Phe Thr Gln Leu Asp Leu260 265 270Gly Met Arg Leu Ala Glu Ala Asp Ser Arg Phe Val Ala Val Asn Leu275 280 285Val Gln Pro Glu Asp Trp Asp Ser Ser Leu Glu Asn Tyr Ser Leu Gln290 295 300Met Arg Met Val Gly Tyr Leu Arg Thr Val Tyr Pro Lys Ala His Val305 310 315 320Thr Leu His Ala Gly Glu Leu Trp Pro Gly Leu Val Lys Pro Glu Ala325 330 335Leu Lys Phe His Ile Ala Glu Ala Val Asp Ile Ala His Thr Gln Arg340 345 350Val Gly His Gly Val Asp Leu Val His Glu Asp Asn Trp Gln Arg Thr355 360 365Ala Arg Thr Met Ala Ala Arg Gln Ile Ala Val Glu Val Pro Phe Ser370 375 380Ser Asn Ala Gln Ile Leu Gly Val Lys Gly Ala Glu His Pro Phe Thr385 390 395 400Thr Tyr Arg Arg Tyr Gly Val Pro Val Val Leu Ala Thr Asp Asp Pro405 410 415Gly Val Ser Arg Ile Asp Ile Ser His Glu Tyr Gln Tyr Ala Ala Ala420 425 430
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223引物IS-R220
221混雜_特徵222(6)..(6)223n代表肌苷220
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223引物MAD-R840024caccatcatc gccacctg 18
權利要求
1.具有以下性質的AMP脫氨酶(1)；(2)在65℃以下的溫度、pH為5.6的醋酸緩衝液中穩定；(3)用凝膠過濾測定的分子量為48000±2000、用SDS-PAGE測定的分子量為60000±3000；(4)在McIlvaine緩衝液中的最適pH在5.6左右。
2.具有以下性質的放線菌來源的AMP脫氨酶(1)；(2)在65℃以下的溫度、pH為5.6的醋酸緩衝液中穩定。
3.根據權利要求2中所述的AMP脫氨酶，其中所述放線菌是屬於鏈黴菌屬的放線菌。
4.根據權利要求2中所述的AMP脫氨酶，其中所述放線菌選自鼠灰鏈黴菌、纖維黃鏈黴菌、灰鏈黴菌。
5.一種酵母提取物的製備方法，它包括使權利要求1～4中任一項所述的AMP脫氨酶作用的步驟。
6.一種調味料的製備方法，它包括使權利要求1～4中任一項所述的AMP脫氨酶作用於5′-核苷酸，使該5′-核苷酸脫醯胺化。
7.一種AMP脫氨酶的製備方法，其特徵在於，在營養培養基中培養鏈黴菌屬的放線菌，在培養液中生成權利要求1中所述的AMP脫氨酶，並收集它。
8.根據權利要求7所述的製備方法，其中所述放線菌選自鼠灰鏈黴菌、纖維黃鏈黴菌、灰鏈黴菌。
9.含有以下(a)或(b)的分離的AMP脫氨酶(a)具有序列號1的胺基酸序列的蛋白質；(b)具有改變了序列號1的部分胺基酸序列的胺基酸序列，並作為AMP脫氨酶發揮作用的蛋白質。
10.一種分離的核酸分子，它編碼權利要求9中所述的AMP脫氨酶。
11.根據權利要求10所述的分離的核酸分子，它具有以下(a)～(c)中任一項的鹼基序列(a)序列號3～5中任一項的鹼基序列；(b)(a)的鹼基序列的一部分被改變了的鹼基序列，且對作為AMP脫氨酶發揮作用的蛋白質進行編碼的鹼基序列；(c)嚴格條件下同與(a)或(b)的鹼基序列互補的鹼基序列進行雜交的鹼基序列，且對作為AMP脫氨酶發揮作用的蛋白質進行編碼的鹼基序列。
12.一種載體，它攜有權利要求9～11中任一項所述的核酸分子。
13.一種轉化體，它導入有權利要求9～11中任一項所述的核酸分子。
14.一種AMP脫氨酶的生產方法，它包括以下步驟(1)及(2)(1)在能產生所述核酸分子編碼的蛋白質的條件下培養權利要求13所述的轉化體的步驟；及(2)回收所產生的蛋白質的步驟。
全文摘要
以提供微生物來源的耐熱性AMP脫氨酶作為課題。公開具有以下性質的AMP脫氨酶(1)催化5′－腺苷酸+H
文檔編號C12N5/10GK1950501SQ200580013789
公開日2007年4月18日 申請日期2005年4月26日 優先權日2004年4月28日
發明者水口涼子, 森茂治, 東本篤樹, 安藤啟一, 結城健介 申請人:天野酶株式會社