水稻株型基因及其應用的製作方法

2023-05-07 07:06:16

專利名稱：：水稻株型基因及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明屬於生物
技術領域：
，更具體的，本發明涉及一種新的水稻株型基因及其應用。
背景技術：
：亞洲栽培稻(Oo^as加VcO—水稻是由她的祖先普通野生稻(Oyzan^pogo")經過長期的人工選擇馴化來的。最近美國學者克隆了控制野生稻的落粒基因幼4，該基因與水稻進化，控制著由野生稻的易落粒性馴化為較難落粒的栽培稻。野生稻具有匍匐生長、多分櫱的生長習性，這樣的株型不利於密植和高產栽培。野生稻的這種不利株型被古代人們作為一種改良目標，進行人工選擇和馴化，最終將野生稻的不利株型轉變為直立、較少分櫱的栽培稻，這樣的株型有利於密植、高產栽培。從野生稻的株型馴化成栽培稻的株型是水稻進化史上的最重要事件，但控制野生稻株型的相關基因至今還未見報導。由於株型特徵關係到植物的密植、高產或外觀，可對產量造成影響，因此本領域有必要研究調節植物株型的基因，從而為植物定向改良提供新的途徑。
發明內容本發明的目的在於提供一種水稻株型相關的PA7蛋白，其編碼基因，含有該編碼基因的載體和細胞，及其應用。在本發明的第一方面，提供一種分離的PA7蛋白，該蛋白是(a)SEQIDNO:2胺基酸序列的多肽；或(b)將SEQIDNO.2胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有與SEQIDNO:2所示的胺基酸序列相同功能的由(a)衍生的蛋白；(c)與SEQIDNO:2胺基酸序列有至少70。/。(較佳地80。/Q，更佳地90%，最佳地95%)相同性，且具有與SEQIDNO:2所示的胺基酸序列相同功能的由(a)衍生的蛋白。在本發明的第二方面，提供一種分離的多核苷酸，該多核苷酸選自下組-(i)編碼所述的PA7蛋白的多核苷酸；或(ii)與(i)中的多核苷酸互補的多核苷酸。在另一優選例中，該多核苷酸編碼含有SEQIDNO:2所示胺基酸序列的蛋白。在另一優選例中，該多核苷酸具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。在本發明的第三方面，提供一種載體，它含有所述的多核苷酸。在本發明的第四方面，提供一種遺傳工程化的宿主細胞，它含有所述的載體或基因組中整合有所述的多核苷酸。在本發明的第五方面，提供所述的PA7蛋白或其編碼基因的用途，用於調節植物的直立特性和/或分櫱特性；或用作鑑定植物的直立特性和/或分櫱特性的分子標記物；或用於製備鑑定植物的直立特性和/或分櫱特性的分子標記物；或用於作為轉錄激活因子，調控下遊基因的表達。在另一優選例中，所述的PA7蛋白或其編碼基因用於增加植物的分櫱數，或用於使植物匍匐生長。在另一優選例中，所述的植物是水稻。在本發明的第六方面，提供一種調節植物的直立特性和/或分櫱特性的方法，該方法包括調節所述植物中所述的PA7蛋白的表達或活性。在另一優選例中，提供一種增加植物的分櫱數或使植物匍匐生長的方法，所述方法包括提高所述植物中PA7蛋白的表達或活性。在另一優選例中，提供一種減少植物的分櫱數或使植物直立生長的方法，所述方法包括降低所述植物中PA7蛋白的表達或活性。在本發明的第七方面，提供一種鑑定植物的直立特性和/或分櫱特性的分子標記物，所述的分子標記物是引物對，具有SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。在本發明的第八方面，提供一種所述的PA7或其編碼基因的激動劑或拮抗劑。在本發明的第九方面，提供一種製備多分櫱或匍匐生長的植物的方法，它包括步驟(1)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有所述的PA7蛋白的編碼序列；(2)將植物細胞、組織或器官與步驟(l)中的農桿菌接觸，從而使所述PA7蛋白的編碼序列轉入植物細胞，並且整合到植物細胞的染色體上；(3)選擇出轉入所述PA7蛋白的編碼序列的植物細胞、組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細胞、組織或器官再生成植株。在本發明的第十方面，提供一種鑑定植物(如植物種子)的直立特性和/或分櫱特性的方法，所述的方法包括步驟(sl)以所述植物的基因組DNA為模板，以具有SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的核苷酸序列的引物進行PCR擴增，獲得擴增產物；(s2)將限制性內切酶WeI加入到所述的擴增產物中，分析酶切情況；其中，若擴增產物未被酶切，則所述植物具有多分櫱或匍匐生長的特性；若擴增產物被酶切，則所述植物具有少分櫱或直立生長的特性。本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。圖l顯示了野生稻i^47基因序歹ij(A)及其編碼的胺基酸序列(B)。圖2顯示了通過轉基因方法將野生稻i^47基因片段導入栽培水稻品種中，轉基因株系表現野生稻的株型。其中，對照為栽培稻品種"中花ll"，T781和T790是兩個轉入PA7的轉基因株系。圖3顯示了PA7蛋白特異性地定位在細胞核中，提示/M7為轉錄因子基因。圖4顯示了通過分子標記選擇將野生稻的/M7基因片段導入栽培稻品種(特青，TQ)中，培育的近等基因系NIL(/^7)表現野生稻的株型。具體實施方式本發明人經過廣泛的研究，應用分子標記技術首次從野生稻中獲得一種株型相關的基因，其為一種轉錄因子新基因，具有調控下遊基因表達的作用，本發明人將之命名為水稻株型基因(/M7)。該基因的表達可使得水稻匍匐生長，且分櫱多；該基因的功能位點發生突變使蛋白失去功能後，水稻可直立生長，且分櫱少。因此該基因可以作為鑑定植物株型的分子標記，並且在植物株型控制和高產育種中具有廣泛的應用前景。如本文所用，"分離的"是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。如本文所用，"分離的水稻株型蛋白"、"分離的PA7蛋白"或"分離的PA7多肽"是指PA7蛋白基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的普通技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化PA7蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯醯胺凝膠上能產生單一的主帶。如本文所用，術語"含有"，"具有"或"包括"包括了"包含"、"主要由......構成(製成)"、"基本上由……構成"、和"由……構成"。如本文所用，所述的"多分櫱"的植物是指一種植物，其在適當的生長條件下生長至一定階段(如成熟階段)時，比在相同條件下生長的同類植物的分櫱數顯著多(如多20%;較佳地多40%，更佳地多60%或更多)。所述的"少分櫱"的植物是指一種植物，其在適當的生長條件下生長至一定階段時，比在相同條件下生長的同類植物的分櫱數顯著少(如少20%;較佳地少40%，更佳地少60%或更少)。本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選的是重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發明還包括PA7蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語"片段"、"衍生物"和"類似物"是指基本上保持本發明的PA7蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性胺基酸殘基(優選保守性胺基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的胺基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個胺基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的胺基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據本文的定義，這些片段、衍生物和類似物屬於本領域熟練技術人員公知的範圍。在本發明中，術語"PA7蛋白"指具有SEQIDNO:2序列的多肽。該術語還包括與SEQIDNO:2序列的蛋白相同功能的、SEQIDNO:2序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為l-50個，較佳地l-30個，更佳地l-20個，最佳地1-10個，還更佳如l-8個或l-5個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括PA7蛋白的活性片段和活性衍生物。多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與PA7蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗PA7蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。所述的同源序列是指具有與SEQIDN0:2序列有至少50%，較佳地至少60%，70%，80%，更佳地至少85%，90%,95%相同性的多肽。本發明還提供了其他多肽，如包含PA7蛋白或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了PA7蛋白的可溶性片段。通常，該片段具有PA7蛋白序列的至少約20個連續胺基酸，通常至少約30個連續胺基酸，較佳地至少約50個連續胺基酸，更佳地至少約IOO個連續胺基酸，最佳地至少約150個連續胺基酸。本發明還提供PA7蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然PA7蛋白的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同於天然L-胺基酸的殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的胺基酸(如e、Y-胺基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽並不限於上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙醯化或羧基化。修飾還包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。在本發明中，"PA7蛋白保守性變異蛋白(多肽)"指與SEQIDNO:2的胺基酸序列相比，有至多20個，較佳地至多10個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行胺基酸替換而產生，且保留與SEQIDNO:2序列的蛋白相同的功能。然而，在SEQIDNO:2序列的關鍵功能位點上胺基酸序列是保守的，例如SEQIDNO:2序列中第152位的胺基酸是Thr，其不能被Ser替換。表1tableseeoriginaldocumentpage9tableseeoriginaldocumentpage10本發明還提供了編碼本發明PA7蛋白或其保守性變異多肽的多核苷酸序列。本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQIDNO:2所示的編碼區序列相同或者是簡併的變異體。如本文所用，"簡併的變異體"在本發明中是指編碼具有SEQIDNO:2的蛋白質，但與SEQIDNO:2所示的編碼區序列有差別的核酸序列。編碼SEQIDNO:2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。術語"編碼多肽的多核苷酸"可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的胺基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。本發明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50%，較佳地至少70%，進一步較佳地至少80%，更佳地至少90%相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，"嚴格條件"是指(l)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2XSSC,0.1%SDS，60°C;或(2)雜交時加有變性劑，如50。/。(v/v)甲醯胺，0.1%小牛血清/0.1。/。Fico11，42。C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在70%以上，較佳地至少80%以上，更佳地至少90%以上，更好是95%以上時才發生雜交。並且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQIDNO:2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。本發明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，"核酸片段"的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用於核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼PA7蛋白的多聚核苷酸。作為本發明的優選方式，提供一種鑑定植物的直立特性和/或分櫱特性的分子標記物，所述的分子標記物是引物，所述引物可擴增PA7蛋白的關鍵功能位點區域的編碼序列，從而可通過鑑定該編碼序列得知植物的直立特性和/或分櫱特性。優選的，所述的引物具有SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。因此，一種鑑定植物的直立特性和/或分櫱特性的方法包括(sl)以所述植物的基因組DNA為模板，以具有SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的核苷酸序列的引物進行PCR擴增，獲得擴增產物；(s2)將限制性內切酶￡7^1加入到所述的擴增產物中，分析酶切情況；其中，若擴增產物未被酶切，則所述植物具有多分櫱或匍匐生長的特性；若擴增產物被酶切，則所述植物具有少分櫱或直立生長的特性。觀察擴增產物是否被酶切可通過常規的方法進行，一種簡單的方法是利用凝膠電泳技術，通過觀察酶切產物電泳後產生的條帶數，從而得知是否發生有效的酶切，該技術是本領域人員熟知的。本發明的PA7蛋白核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然後再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然後可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或PA7蛋白編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述多肽的方法。通過常規的重組DNA技術(Science，1984;224:1431)，可利用本發明的多聚核苷酸序列來表達或生產重組的PA7蛋白。一般來說有以下步驟-(1).用本發明的編碼PA7蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；(3),從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。本發明中，PA7蛋白多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語"重組表達載體"指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其他載體。總之，只要能在宿主體內複製和穩定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特徵是通常含有複製起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。一種適用的表達載體例如pCAMIA1301。本領域的技術人員熟知的方法能用於構建含PA7蛋白編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用於選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新黴素抗性以及綠色螢光蛋白(GFP)，或用於大腸桿菌的卡那黴素或氨苄青黴素抗性。包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用於轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如植物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈黴菌屬、農桿菌；真菌細胞如酵母；植物細胞(尤其是非生殖植物細胞)等。本發明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個鹼基對，作用於啟動子以增強基因的轉錄。本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術迸行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期後收穫，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCh。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉澱法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。轉化植物也可使用農桿菌轉化或基因槍轉化等方法，例如葉盤法、水稻幼胚轉化法等。對於轉化的植物細胞、組織或器官可以用常規方法再生成植株，從而獲得性狀發生改變的植物。獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適於宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度後，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但並不限於常規的復性處理、用蛋白沉澱劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。重組的PA7蛋白有多方面的用途。例如用於篩選促進或對抗PA7蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達的重組PA7蛋白篩選多肽庫可用於尋找有價值的能抑制或刺激PA7蛋白功能的多肽分子。本發明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA晶片(又稱為"基因晶片")上，用於分析組織中基因的差異表達分析。用PA7蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測PA7蛋白的轉錄產物。本發明還涉及一種通過調節植物的直立特性和/或分櫱特性改良植物的方法，該方法包括調節所述植物中/l47基因的表達或活性。促進還是抑制屍」7的表達或活性主要取決於植物所需改良的性狀而定。當需要增加植物的分櫱數或使植物匍匐生長，可通過提高所述植物中i^7基因的表達或活性來實現；當需要減少植物的分櫱數或使植物直立生長的方法，則可通過降低所述植物中i^7基因的表達或活性來實現。增加i^7基因表達的方法是本領域周知的。例如，可通過轉入攜帶PA7編碼基因的表達構建物使植株過表達PA7;或可通過用強啟動子驅動從而增強iM7基因或其同源基因的表達；或者通過增強子(如水稻waxy基因第一內含子、Actin基因第一內含子等)來增強該i^7基因的表達。適用於本發明方法的強啟動子包括但不限於35s啟動子、水稻、玉米的Ubi啟動子等。抑制A47基因表達的方法也是本領域周知的。例如，可通過反義或RNA幹擾(RNAi)或基因敲除的技術來實現。作為本發明的一種優選方式，獲得PA7高表達的植株的方法如下(1)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有所述的PA7蛋白的編碼序列；(2)將植物細胞、組織或器官與步驟(l)中的農桿菌接觸，從而使所述PA7蛋白的編碼序列轉入植物細胞，並且整合到植物細胞的染色體上；(3)選擇出轉入所述PA7蛋白的編碼序列的植物細胞、組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細胞、組織或器官再生成植株。其中，可採用任何適當的常規手段，包括試劑、溫度、壓力條件等來實施此方法。本發明還包括PA7蛋白或其編碼基因的拮抗劑或激動劑。由於PA7的拮抗劑或激動劑可調節PA7的活性或表達，因此，所述的PA7的拮抗劑或激動劑也可通過對PA7的影響來調節植物的直立特性和/或分櫱特性，從而達到使植物性狀改良的目的。所述的PA7的拮抗劑是指任何可降低PA7蛋白的活性、降低PA7基因或蛋白的穩定性、下調PA7蛋白的表達、減少PA7蛋白有效作用時間、或抑制PA7基因的轉錄和翻譯的物質，這些物質均可用於本發明，作為調節植物生長有用的物質。所述的PA7的激動劑是指任何可提高PA7蛋白的活性、維持PA7基因或蛋白的穩定性、促進PA7蛋白的表達、延長PA7蛋白的有效作用時間、或促進PA7基因的轉錄和翻譯的物質，這些物質均可用於本發明，作為調節植物的直立特性和/或分櫱特性有用的物質。在本發明的一個實例中，提供了一種PA7基因，其全長的開放閱讀框(ORF)序列如SEQIDNO:l所示，編碼一個含有167個胺基酸的蛋白質(SEQIDNO:2)。野生稻和栽培稻中的序列分析表明，在栽培稻中7^7基因的編碼區有二個鹼基發生替換，其中一個引起蛋白序列上一個胺基酸的替換(SEQIDNO:2中第152位T—S)，從而引起由野生稻的株型進化為栽培稻的株型；通過轉基因方法將野生稻的PJ7片段導入栽培稻中可恢復野生稻的株型。本發明的主要優點在於首次從野生稻中發現水稻株型基因(/M7)，該基因的揭示可以為水稻直立特性和/或分櫱特性的改良提供新的途徑。本發明人的研究還表明，該基因是一種轉錄激活因子，從而其具有轉錄激活因子相關的特性，即可用於調控下遊基因的表達。另外，/M7基因也將在其它植物包括小麥、玉米、高梁等的定向育種中起重要作用，具有廣泛的應用前景。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。實施例1/M7基因的克隆栽培稻的祖先普通野生稻具有匍匐生長、多分櫱的株型，而亞洲栽培稻品種"特青"的株型為直立、較少分櫱。本發明人用海南野生稻作為供體親本、用特青作為輪迴親本，構建雜交組合，並進行多代回交。用回交群體定位了一個控制野生稻株型的基因，命名為屍Z7。進一步利用圖位克隆技術克隆了該基因。序列比較分析表明，野生稻與栽培稻特青在/^7基因的編碼區存在2個鹼基的變異，l個(第99位，在野生稻中為A，在栽培稻中為G)未造成胺基酸改變，而另1個(第454位，在野生稻中為A，在栽培稻中為T)變異造成一個胺基酸的替換，由野生稻的蘇氨酸(T152)變為栽培稻的絲氨酸(S)，引起該基因的功能變異，從而引起由野生稻的株型進化為栽培稻的株型。野生稻株型的/^47基因的序列如SEQIDNO:l(圖1A)所示，編碼一個全新的功能未知的新蛋白，其序列如SEQIDNO:2(圖1B)所示。進一步研究發現，在水稻基因組中沒有PA7的同源拷貝。戶J7基因的全長ORF(openreading-frame)長度為504bp，編碼167個胺基酸的蛋白。蛋白序列分析表明PA7蛋白為鋅指蛋白，推測為一個轉錄因子，為了證明該推測，本發明人進行了亞細胞定位，將綠色螢光蛋白GFP與PA7常規方法融合構建35S::GFP-PA7載體，然後用基因槍轟擊洋蔥表皮細胞，用共聚焦顯微鏡觀察螢光表達。結果如圖3所示，可見PA7蛋白特異性地定位在細胞核中，提示PA7為轉錄因子。結合實施例5的轉錄激活活性分析實驗進一步證實了PA7是一個轉錄因子基因。實施例2iM7的分子標記輔助選擇育種實驗本實施例中，根據/M7基因的序列，設計PCR寡核苷酸引物(SEQIDNO:3和SEQIDNO:4)，用Taq酶進行PCR擴增普通野生稻(海南野生稻)與亞洲栽培稻品種(特青或其它栽培稻品種)的DNA，用限制性內切酶5/iel酶切擴增產物，經過1。/。瓊脂糖凝膠電泳檢測普通野生稻與亞洲栽培稻品種之間存在的DNA多態性(差異)。如擴增產物電泳條帶l條，則為野生稻品種；如擴增產物電泳條帶2條，則為特青或其它栽培稻品種(酶切位點在SEQIDNO:l第99-105位)。因此該引物可以作為特異性鑑別野生稻屍^7基因與栽培稻/M7基因的分子標記。在野生稻與栽培稻品種的雜交後代群體中，用該分子標記可以快速地將攜帶/M7基因的個體挑選出，達到改良株型的目的。5'端寡核苷酸引物序列為(SEQIDNO:3):5'-TCTCCGCCGGTGGAGCTGTC-3';3'端寡核苷酸引物序列為(SEQIDNO:4):5'-GGAGGCGATGGGCATGGACG-3'。實施例3i^7水稻轉基因實驗本實施例採用表達載體pCAMBIA1301(購自CAMBIA)作為水稻轉基因載體。該載體編碼一個細菌複製起點(ori)、卡那黴素抗性基因(KarO、潮黴素抗性基因(Hyg，、NOS基因的終止信號序列以及限制性內切酶克隆位點(MCS)。在限制性內切酶克隆位點可插入i^7基因組片段構建成轉基因質粒。1./^7基因組片段的轉基因質粒的構建在該實施例中，以野生稻基因組DNA為模板，用W7的DNA序列的5'和3'端的PCR寡核苷酸為引物(SEQIDNO:5和SEQIDNO:6)，用高保真T叫酶pfuTaq進行擴增，獲得2.677kb的屍J7基因組片段擴增產物。將該擴增產物重組進PMD18-T載體上(TaKaRa，Japan),並對多個重組子進行測序，以驗證序列的正確性。該重組的過渡質粒載體稱為/^7-PMD。5'端寡核苷酸引物序列為(SEQIDNO:5):5'-GCCCGTTCGGATTTAAGTTCTA-3';3'端引物序列為(SEQIDNO:6):5,-GCCAGTCCCTATGTGGTGTTCT-3，。分別用屍Wl和尺戸I消化屍J7-PMD和載體pCAMIA1301,將iM7-PMD消化後的2.677kb目的片段連接到載體pCAMIA1301。連接物轉化大腸桿菌菌株DH5a，在含有Kan(50)ag/ml)的LB培養基上篩選轉化子，挑選單菌落提取質粒，用PWl和^^I酶解挑選出有2.677kb片段插入的克隆，並用M13通用引物測序檢驗核苷酸序列是否正確。這樣成功構建pCAMIA1301-屍」7質粒。2.P」7轉化水稻pCAMIA1301-屍J7質粒通過凍融法導入農桿菌菌株EHA105(參見Hood，E.E.等，TransgenicRes.，1993，2，208-218)。每200|^1EHA105感受態細胞加0.5-lpg(約10nl)質粒DNA混勻，依次於冰上、液氮和37。C水浴中各放置5分鐘；用新鮮的YEB液體培養基稀釋至lml，於28。C振搖培養2-4小時；取200pl塗布於含抗生素Kan(50pg/ml)的YEB平板上，28'C培養2-3天。長出的菌落在含抗生素Kan的YEB平板上劃單菌，連續劃3次。從YEB平板上挑取農桿菌單菌落接種到3ml含抗生素Kan的YEB液體培養基中於28。C振搖培養過夜，第2天按1%接種量轉接入50ml含抗生素Kan的AB液體培養基中所述的條件中，200rpm繼續振搖培養至OD6。。為0.6至0.8左右時，將新鮮的農桿菌菌液於5000rpm、4卩離心5分鐘，收集並重懸於1/3體積的AAM液體培養基中，此時即可用於轉化水稻各種受體材料。本實施例採用常規的農桿菌轉化方法轉化栽培水稻品種"中花ll"的幼胚愈傷。取授粉後12-15天的中花11未成熟種子經70%乙醇浸泡1分鐘後，於NaClO溶液中(與水1:3混合，力B2-3滴吐溫20)消毒90分鐘以上，用無菌水衝洗4-5次，然後用解剖刀和攝子挑出幼胚並接種於N6D2培養基上誘導愈傷組織，在26土1。C、避光條件下培育，4天後可用於轉化。將幼胚愈傷浸泡入新鮮的AAM農桿菌菌液中並不時搖動，20分鐘後將水稻材料移出，在無菌濾紙上吸去過多的菌液，隨即轉移到N6D2C培養基上，於26'C共培養3天。共培養時，在共培養培養基中加入乙醯丁香酮作為農桿菌W基因活化物，使用濃度為100nmol/L。3天後，從共培養培養基上取出愈傷組織，切去胚芽並轉入選擇培養基N6D2Sl(含Hyg25mg/l)進行選擇培養。7-12天後將抗性愈傷組織轉到N6D2S2(含Hyg50mg/l)選擇培養基上繼續篩選。10-12天後生長旺盛的抗性愈傷組織轉移到預分化培養基上培養一周左右，再移至分化培養基上分化(12小時光照/天)。再生的小苗在1/2MSoH培養基上生根壯苗，隨後移入人工氣候室盆土栽培。獲得的再生植株移栽成活後以除草劑再次篩選轉化植株；陽性植株提取葉片總DNA，經PCR進一步鑑定轉化植株。用轉基因T2代觀察水稻株型表型，驗證iM7基因功能。以上涉及的培養基參見《分子克隆實驗室指南》。結果，通過轉基因方法將野生稻的/M7基因組片段導入栽培稻品種中，獲得了野生稻的株型，見圖2，表明PA7是水稻株型相關的基因。實施例4將包含/^7的野生稻染色體片段導入特青的遺傳背景中的影響本發明人選育了屍」7的近等基因系NIL(屍J7)，即將包含iM7的很短的野生稻染色體片段導入特青(TQ)的遺傳背景中。具體是將海南野生稻與栽培稻品種特青雜交，再用特青作為輪迴親本連續進行4次回交，用分子標記從回交群體中選擇出包含野生稻屍^7短片段的而遺傳背景(基因型)為特青的近等基因系NIL(Pv47)(Nearlyisogenicline，NIL)。結果如圖4所示，NIL(/M7)的株型類似野生稻，表明屍^7是控制野生稻株型的關鍵基因。因此，可以通過/l47的分子設計來改良水稻的株型，達到高產育種的目標，可見i^7基因在水稻株型和高產育種中具有廣泛的應用前景。實施例5PA7的轉錄激活活性分析實驗用MatchmakerGAL4酵母雙雜交系統3(購自Clontech)對PA7的轉錄激活進行分析。構建陽性對照載體pAD，將pGADT7(Clontech)自帶的NLS和AD用5flmM和^/I酶切後連到pGBKT7(Clontech)的5am/n和Sa/I位點上獲得。然後用PCR方法(以SEQIDNO:7和SEQIDNO:8為引物)擴增PA7的全長ORF，構建至廿pGBKT7載體上的五caRI和屍M上，形成pGBKT7-PA7載體。5'端寡核苷酸引物序列為(SEQIDNO:7):5，-AAGAATTCATGGATCCCTCATCGGCTTC-3';3'端引物序列為(SEQIDNO:8):5'-AACTGCAGCTAGAGGCCGAGCTCGAGGA-3'。用同樣方法分別構建PA7的N端和C端的載體。在編碼N端l-69胺基酸的核苷酸序列兩端設計引物(SEQIDNO:9和SEQIDNO:10)，進行PCR擴增，PCR產物插入到pGBKT7載體的內切酶五co/I和屍M位點上，構建pGBKT7-PA7-Nterminal載體。在編碼C端70-167胺基酸的核苷酸序列兩端設計引物(SEQIDNO:ll和SEQIDNO:12)，進行PCR擴增，PCR產物插入到pGBKT7載體的內切酶五co/I和i^I位點上，構建pGBKT7-PA7-Cterminal載體。5'端寡核苷酸引物序列為(SEQIDNO:9):5，-AAGAATTCATGGATCCCTCATCGGCTTC-3，；3'端引物序列為(SEQIDNO:10):5，-AACTGCAGGTGCGCGTTCTGGTGGCCGC-3'。5'端寡核苷酸引物序列為(SEQIDNO:11):5'-AAGAATTCCGGAAGGAGCGCGTCGCCGG-3，;3'端引物序列為(SEQIDNO:12):5，-AACTGCAGCTAGAGGCCGAGCTCGAGGA-3，。各種載體轉化到酵母菌種AH109(購自Clontech)中，將生長過夜的菌種稀釋，塗在缺Trp胺基酸或缺少三種胺基酸(-Trp/-His/-Ade)的SD培育基(分子克隆實驗室指南)上，然後觀測菌種生長情況，決定PA7的轉錄激活活性。結果顯示，pGBKT7-PA7具有較強的轉錄激活活性，表明PA7是具有轉錄激活活性的轉錄因子。另外，只有PA7的C端也具有轉錄激活活性而PA7的N端卻沒有，表明PA7的轉錄激活域位於C端。實施例6PA7蛋白變體的功能採用常規的定點突變技術，本發明人將SEQIDNO:2所示的野生稻PA7胺基酸序列的第18位Leu替換為Ile，構成PA7蛋白變異體(PA7-M)。如前所述類似的方法，利用農桿菌將PA7-M編碼基因導入栽培稻品種中，測定該轉基因水稻的株型。結果發現，所述轉基因水稻表現野生稻的株型。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。中國科學院上海生命科學研究院水稻株型基因及其應用<130〉082683<160〉12<170〉Patentlnversion3.3<210〉1<211〉504<212〉DNA<213〉普通野生稻(0ryzarufipogon)1atggatccctcatcggcttcttggccggctccggcttctccgccggtggagctgtccctg60tccctgccggcggcggcggcgeigg肌ccgcgacgaggcagcgccgacggcgatcgtcgac120ggcaagc卿tgaggctgttcccgtgcctcttctgcgccaagacgttccgcaagtcgcag180gcgctcggcggccELccagaacgcgcaccggaaggagcgcgtcgccggcggcagctggaac240cccaacgtctacggcgscggcggcggatcagcgtccatgcccatcgcctcccatggcgtc300acggcggcggggagtagtacggcagccgacggccggtggtgcggcggcgctgccagcgac360gacgaca^cMcggcggcgcccatgccttccctcggctcaggctcggcggcgctcggcgcc420ggcgccggtttcgcttcgaccga犯ggggctctaccggcggcggcgtcgccggcgaggag棚cttgtcctcgagctcggcctctag504<210〉2<211〉167<212〉PRT普通野生稻(Oryzarufipogon)2MetAsp1GluLeuAlaAlaCysLeu50HisGin65ProAsnSerHisTrpCysProSerPro35PheAsnValGlyGlySerLeu20ThrCysAla丁yrVal100GlySerAlaSerTrp5SerLeuProAlaAlalieValAlaLysThr55HisArgLys70GlyAspGly85ThrAlaAlaAsp40PheGluGlyGlyProAla25GlyAla10AlaLysProAlaAlaArgGinValAlaAlaSerAspArgLysSerGin60ArgValAlaGly75GlySerAlaSer90SerSerThrAla105AspAspThrThrSerProProVal15AsnArgAspGlu30ArgLeuPhePro45AlaLeuGlyGlyGlySerTrpAsn80MetProlieAla95AlaAspGlyArg110AlaAlaProMet115120125ProSerLeuGlySerGlySerAlaAlaLeuGlyAlaGlyAlaGlyPhe130135140AlaSerThrGluArgGlySerThrGlyGlyGlyValAlaGlyGluGlu145150155160LeuValLeuGluLeuGlyLeu165320<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc一feature<223〉引物<400〉3tctccgccggtggagctgtc〈210〉4<211〉20<212〉DM人工序列<221〉misc—feature<223〉引物<400〉4ggaggcgatgggcatggacg<210〉5<211〉22〈212〉DNA人工序列<220〉raise—feature<223〉引物5gCCCgttCgg3ttt33gttCt3<210〉6<211〉22〈212〉DNA<213〉人工序列misc—feature<223〉引物<400〉6gccagtccctatgtggtgttct<210〉7<211〉28<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223〉引物<400〉7aagaattcatggatccctcatcggcttc<210〉8<211〉28腿人工序列<220〉<221〉misc一feature<223〉引物<400〉8織tgcagctag鄉ccgagctcgagga<210〉9<211〉28<212〉DNA〈213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223〉引物<400〉9aagaattcatggatccctcatcggcttc2810<211〉28〈212〉DNA人工序列<220〉misc一feature<223〉引物<400〉10aactgcaggtgcgcgttctggtggccgc<210〉11<211〉28<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc_feature引物11aagaattccggaaggagcgcgtcgccgg〈210〉12〈211〉28腿<213〉人工序列<220〉misc—feature<223〉引物<400〉12asctgC3gctag3ggccgagctcgagga2828權利要求1.一種分離的PA7蛋白，其特徵在於，該蛋白是(a)SEQIDNO2胺基酸序列的多肽；或(b)將SEQIDNO2胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有與SEQIDNO2所示的胺基酸序列相同功能的由(a)衍生的蛋白；或(c)與SEQIDNO2胺基酸序列有至少70％相同性，且具有與SEQIDNO2所示的胺基酸序列相同功能的由(a)衍生的蛋白。2.—種分離的多核苷酸，其特徵在於，該多核苷酸選自下組-(i)編碼權利要求1所述的PA7蛋白的多核苷酸；或(ii)與(i)中的多核苷酸互補的多核苷酸。3.—種載體，其特徵在於，它含有權利要求2所述的多核苷酸。4.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特徵在於，它含有權利要求3所述的載體或基因組中整合有權利要求2所述的多核苷酸。5.權利要求1所述的PA7蛋白或其編碼基因的用途，其特徵在於，用於調節植物的直立特性和/或分櫱特性'，或用作鑑定植物的直立特性和/或分櫱特性的分子標記物；或用於製備鑑定植物的直立特性和/或分櫱特性的分子標記物；或用於作為轉錄激活因子，調控下遊基因的表達。6.—種調節植物的直立特性和/或分櫱特性的方法，其特徵在於，該方法包括調節所述植物中如權利要求1所述的PA7蛋白的表達或活性。7.—種鑑定植物的直立特性和/或分櫱特性的分子標記物，其特徵在於，所述的分子標記物是引物對，具有SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。8.—種權利要求1所述的PA7或其編碼基因的激動劑或拮抗劑。9.一種製備多分櫱或匍匐生長的植物的方法，其特徵在於，它包括步驟(1)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有權利要求l所述的PA7蛋白的編碼序列；(2)將植物細胞、組織或器官與步驟(l)中的農桿菌接觸，從而使所述P八7蛋白的編碼序列轉入植物細胞，並且整合到植物細胞的染色體上；(3)選擇出轉入所述PA7蛋白的編碼序列的植物細胞、組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細胞、組織或器官再生成植株。10.—種鑑定植物的直立特性和/或分櫱特性的方法，其特徵在於，所述的方法包括步驟(sl)以所述植物的基因組DNA為模板，以具有SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的核苷酸序列的引物進行PCR擴增，獲得擴增產物；(s2)將限制性內切酶^el加入到所述的擴增產物中，分析酶切情況；其中，若擴增產物未被酶切，則所述植物具有多分櫱或匍匐生長的特性；若擴增產物被酶切，則所述植物具有少分櫱或直立生長的特性。全文摘要本發明公開了一種水稻株型蛋白及應用。所述的水稻株型蛋白是SEQIDNO2所示序列的蛋白或是與SEQIDNO2所示序列的蛋白具有相同功能的衍生蛋白。本發明還公開了所述水稻株型蛋白的編碼基因，含有所述編碼基因的載體和宿主細胞。本發明的水稻株型蛋白可用於調節植物的直立特性和/或分櫱特性，還可用作鑑定植物的直立特性和/或分櫱特性的分子標記物。本發明的水稻株型蛋白在植物株型和高產育種中具有廣泛的應用前景。文檔編號C12N15/11GK101575366SQ20081003704公開日2009年11月11日申請日期2008年5月7日優先權日2008年5月7日發明者敏施,朱美珍,林鴻宣,鍵金,高繼平申請人:中國科學院上海生命科學研究院