表達hERG的穩定細胞系的製作方法

2023-05-07 20:12:31 2

專利名稱：表達hERG的穩定細胞系的製作方法
技術領域：
本發明主要涉及表達電壓門控的hERG鉀通道的穩定細胞系以及使用所述細胞對化合物測試其抑制hERG電流的能力的方法。
離子通道組成相對小的一組藥物靶標，部分因為離子通道篩選測定法難於自動操作並設計為高通量形式。然而，電生理學的新發展(P.B.Bennett等人，Trends in Biotech(2003)21(12)563-69；C.Wood等人，Drug DiscToday(2004)9(10)434-41)重新點燃了將離子通道作為藥物開發靶標的興趣。許多離子通道與遺傳性疾病有關，引起用於治療和預防疾病的離子通道調節劑的研究(D.Owen等人，Drug Disc World(2002)48-61)。
HERG是製藥業特別關注的離子通道，儘管更多地是由於安全性/毒理學問題而非開發調節劑的靶標而特別關注(ICH S7B Guidance forIndustry，Oct.2005；J.I.Vandenberg等人，Trends Pharm Sci(2001)22(5)240-46)。電壓門控的hERG鉀通道造成心臟動作電位快速激活的延遲整流鉀電流(IKr)。心電圖QT間期延長以及稱為Torsades de Pointes(「TdP」；見C.E.Chiang和D.M.Roden，J Am Coll Cardiol(2000)36(1)1-12.；D.M.Roden，N Eng J Med(2004)3501013-22.)的心率失常暗示了藥物與hERG鉀通道的相互作用。TdP是可以致命的，誘導TdP的危險導致了藥品的撤消和不批准。
已證明高通量篩選藥物候選物以確定其對hERG的可能作用是困難的，很大程度上是基於不能獲得以足夠的表面濃度表達hERG、並且是高通量離子流測量儀器的合適受試物的穩定細胞系。
現在我們發明了hERG表達細胞系，使用標準的自動化膜片鉗裝置，所述hERG表達細胞系以巨大的電流振幅可再現地形成穩定封接(seal)。本發明的細胞系產生了文獻中使用非高通量方法所報導的那些代表性IC50值。
本發明的一個方面是表達hERG、並能夠展示測試電流的穩定真核細胞系，所述測試電流在對照條件下在一小時內變化低於峰電流振幅的約20％。
本發明的另一方面是確定測試化合物抑制hERG電導活性的傾向的方法，所述方法包括將本發明的細胞與所述測試化合物接觸，在電生理條件下測量測試電流並確定在測試化合物存在下測試電流是否較低。
在本公開內容中引用的所有出版物在此以其整體引用作為參考。定義除非另外聲明，用於本申請(包括說明書和權利要求書)中的下列術語具有下面給定的定義。必須注意的是，除非上下文另外明確指出，如本說明書及所附的權利要求書中所用的，單數形式「一個」、「這個」包括複數指代。
「激動劑」指增強另一種化合物或受體位點的活性的化合物。
「拮抗劑」指降低或阻止另一種化合物或受體位點的作用的化合物。
術語「藥物候選物」指將測試在治療動物疾病狀態中的可能作用的化合物或製劑，無論所述藥物候選物是否具有任何已知的生物學活性。
如此處所用的術語「同源的」指在另一種受試者物種中執行基本相同的功能並與在本領域認為是相同蛋白質的不同形式的蛋白質共享重大的序列同一性，這些蛋白質主要區別在於其被發現的物種的不同。因此，將例如人ERG、小鼠ERG和大鼠ERG都視為彼此同源的。
「調節劑」指與靶標相互作用的分子。調節劑包括但不限於如在本文所定義的激動劑、拮抗劑等。「疾病」和「疾病狀態」指任何疾病、狀況、症狀、不適或適應症。
術語「細胞系」指永生化哺乳動物細胞克隆。「穩定的」細胞系是隨時間(例如每次倍增)基本表現一致特徵的細胞系。在本發明範圍內的穩定的細胞系提供了細胞的實質部分，所述細胞能夠提供高於約50MOhm的封接電阻(seal resistance)、高於約200pA的電流振幅，並提供了在對照條件下一小時內變化不高於約20％的電流振幅。
如此處所用的術語「子代」和「後代」指通過培養或生長本發明的細胞而獲得的細胞。如此處所用的術語「衍生細胞」指通過修飾、融合、轉染、轉化或改變本發明的細胞而獲得的細胞。例如，可以通過以質粒或病毒轉染本發明的細胞、通過將其融合為雜交瘤細胞等產生衍生細胞。
術語「電生理學測量法」或「膜片鉗實驗」指實驗程序，其中，將部分或全部細胞膜(一般在分離的細胞中)的電勢保持在預先確定的電壓、然後經過一次或多次電壓改變，在此期間或此後測量通過膜的電流。在此所用的hERG測量實驗中，首先把在其表面表達hERG的細胞電壓鉗制於-80mV的保持電位，從100毫秒脈衝至-40mV、隨後於20mV1000毫秒(預脈衝)和於-40mV500毫秒(測試脈衝)計算漏減(leak subtraction)。以滲漏電流校正後，將於-40mV測量的hERG電流作為最高峰(測試脈衝的開始)。可以應用所述方案的變通方案。在測試脈衝期間測量由於藥物與hERG鉀通道相互作用導致的hERG電流抑制，並記錄為「測試電流」。在本發明的細胞系中，測試電流在對照條件下持續直至一小時變化低於約20％。術語「膜片鉗設備」指適於實施這類測量的任何儀器或裝置，例如標準膜片鉗、IonWorks HT、IonWorks Quattro、PatchXpress 7000A等。
「受試者」包括哺乳動物和鳥類。「哺乳動物」指哺乳動物綱的任何成員，包括但不限於人；非人類靈長動物，例如黑猩猩以及其他猿和猴種；畜牧動物例如牛、馬、綿羊、山羊和豬；家畜例如兔、狗和貓；實驗室動物，包括齧齒動物，例如大鼠、小鼠和豚鼠等。術語「受試者」不表示特定年齡或性別。
疾病狀態的「治療」包括(i)預防疾病狀態，即，使得可能暴露於或傾向於疾病狀態、但是尚未經歷或表現該疾病狀態症狀的受試者不出現該疾病狀態的臨床症狀；(ii)抑制疾病狀態，即，阻止疾病狀態或其臨床症狀的進展；或(iii)緩解疾病狀態，即，引起疾病狀態或其臨床症狀的暫時或持續退化。
在此確認的所有專利和出版物在此以其整體引用作為參考。
一般方法本發明提供表達hERG並適於用於自動化高通量電生理學測定法的細胞系、以及使用這類細胞對化合物篩選可能的hERG抑制活性的方法。
由於其適合懸浮生長的事實，將本發明的細胞系設計用於平面膜片電生理學系統。它們已經被用於像IonWorks HT平面膜片系統和PatchXpress 7000A這類系統，但是也可以用於其他裝置或系統。
可以使用Ex-cell301(JRH，目錄號JRH-14331)、10％胎牛血清(Gibco，目錄號16140-089)和0.25mg/ml遺傳黴素(Gibco，目錄號10131-035)懸浮培養細胞系。優選於35±2℃(補充5％CO2)以50-100ml的體積在1升搖瓶中於90-100轉/分鐘(rpm)(2英寸搖動振幅)培養細胞。為了最佳性能，將細胞滴定度(titer)保持在約105至約106個細胞/ml之間。
可以通過標準方法(例如在細胞裂解後通過蛋白質印跡)驗證hERG的表達。hERG電流的表達可以依賴於細胞培養條件而變化。
可以使用標準膜片鉗方法評價細胞系的穩定性，所述標準膜片鉗方法包括鉗制從該細胞系獲得的細胞，將其脈衝，並在多個時間點測量引起的電流。在本發明的穩定的細胞系中，電流在對照條件下一小時內變化不超過20％。
對於貼壁細胞，移動通常需要使用解離試劑，例如添加胰蛋白酶或VerseneTM的培養基。對於適應懸浮的細胞，一般不需要解離試劑。在實驗使用之前將細胞重懸於電生理學記錄溶液中。
於測試化合物存在或不存在下對本發明的細胞實施hERG電流測量。對於篩選目的，記錄測試化合物將hERG電流抑制約50％或更高的濃度就足夠了。
在本發明方法的實踐中，將來自本發明細胞系的細胞與測試化合物接觸或暴露於測試化合物(任選地包括陽性和陰性對照化合物)，並通過確定在電生理學測量期間對電流的影響(如果有任何影響)而測量對hERG活性的抑制程度。因此，例如，人們可以將本發明的細胞應用於膜片鉗設備基質，並將個別細胞與測試化合物接觸。測試化合物可以以多個濃度使用、或可以以預先確定的濃度使用(例如10μM、20μM、50μM等)。一般將化合物溶解於電生理學記錄溶液中。然後如在此所述將細胞膜片鉗制並脈衝，並檢測測試電流。將引起測試電流實質性降低的化合物視為在該濃度抑制hERG活性。優選地，將測試電流與一個或多個對照比較，所述對照可以是應用測試化合物之前的本發明的相同細胞，或者可以是基本相同的細胞(例如，來自相同細胞培養物)並受試於陽性和/或陰性對照化合物。
效用本發明的細胞系可用於以穩定的產量提供hERG的細胞表面表達，並作為使用電生理學方法進行高通量hERG活性篩選的合適基質(substrate)。因此，使用本發明的細胞系，人們可以快速並有效地對藥物候選物篩選其與hERG的可能的相互作用。本發明的方法可用於藥物候選物及其他化合物的高通量篩選，以確定其對hERG的相互作用和/或調節、及其少許潛在的心臟毒性。
實施例提供下列製劑及實施例以使本領域技術人員更清楚地理解並實施本發明。不應將其理解為限制本發明的範圍，而是僅僅作為其說明和代表。
細胞培養基成分包括Ex-cell 301(JRH，目錄號JRH-14331)、10％胎牛血清(Gibco，目錄號16140-089)及0.25mg/ml遺傳黴素(Gibco，目錄號10131-035)。於35±2℃(補充5％CO2)以50-100ml的體積在1升搖瓶中於90-100rpm(2英寸搖動振幅)培養細胞。為了最佳性能，將細胞滴定度保持在約105至約106細胞/ml之間。
標準和自動化膜片鉗(PatchXpress 7000A)二者的電生理學記錄溶液包括內部緩衝液(mM，除非另外指出，來自Sigma)140KCl(目錄號P-9541)、6EGTA(目錄號E-3889)、5Hepes(目錄號H-3784)、5MgCl2(目錄號M-1028)、5ATP-Na2(目錄號A-2383)，以KOH(J.T.Baker，目錄號3143-01)調至pH7.2；外部緩衝液(mM，除非另外指出，來自Sigma)150NaCl(目錄號S-3014)、10Hepes(目錄號H-3784)、4KCl(目錄號P-9541)、1.2CaCl2(目錄號C-3306)、1MgCl2(目錄號M-1028)以HCL(J.T.Baker，目錄號5619-02)調至pH7.4。膜片基片包括MolecularDevices Corp供應的PatchPlatesTM(目錄號9000-0688)和SealChipsTM(1-SealChip16-K)。
電生理學電壓脈衝方案保持電壓為-80mV，從100毫秒脈衝至-40mV、隨後為於20mV(預脈衝)1000毫秒、以及於-40mV(測試脈衝)500毫秒計算漏減。以滲漏電流校正後於-40mV測量hERG電流作為峰(測試脈衝的開始)。
IC50曲線的產生及統計在Excel Fit(版本3，ID-BS)中以FourParameter Logistical Model或Sigmoidal Dose Response Model，Equation205擬合濃度-反應曲線。抑制分數(I化合物/I對照)＝1/(1+[化合物]/IC50)nH，其中I為電流，IC50為將電流抑制50％所需的化合物濃度，且nH為Hill係數。
實施例1表達hERG的CHO-K1細胞系(A)如下產生穩定表達高水平功能性hERG通道的CHO-K1細胞。首先，以編碼(CMV-啟動子-藍色螢光蛋白-IRES-潮黴素抗性標記)盒的質粒轉染野生型CHO-K1細胞。兩個不同的loxP位點定位於該構建體上，一個在CMV-啟動子和藍色螢光蛋白(cyan fluorescence protein)ORF之間，且一個在潮黴素抗性標記3』末端。從生長在潮黴素中的隨機CHO細胞轉染子中，基於其高水平的藍色螢光蛋白表達而選擇一個細胞系。這些水平經過多個世代保持穩定；基因組DNA印跡法證實出現了單個染色體整合事件。然後通過CRE重組酶介導的交換將(loxP-hERG-IRES-新黴素抗性標記-loxP)盒重組至所述受體細胞系。通過i)不存在藍色螢光蛋白，ii)對潮黴素敏感，以及iii)成功的基因組DNA PCR證實所選CHO細胞克隆中的正確重組事件，所述基因組DNA PCR使用定位於CMV啟動子中的正向引物及hERG-ORF中的反向引物。五百萬個細胞的轉染及後來的選擇產生16個滿足上述三條標準的克隆。擴增這些克隆，並且通過蛋白質印跡分析hERG蛋白質的表達以及在Ionworks儀器上分析hERG離子通道活性。然後使得到的一個細胞系(「CHO crelox hERG UG#7」)適應於懸浮生長。通過在Ex-cell 301培養基、5％FBS、0.25mg/ml G418中將細胞稀釋到75萬/ml而製備起始懸浮培養物。該培養物培養24小時，並達到約106個細胞/ml的密度。然後將其在新鮮培養基中稀釋至20萬細胞/ml，並培養72小時以達到106細胞/ml的密度。將此稀釋-轉移重複四次，在此點認為細胞適應於懸浮培養。在布達佩斯條約(Budapest Treaty)規定下，於2005年6月22日將所述細胞系(CHO crelox hERG UG#7)以保藏號PTA-6812保藏於美國典型培養物保藏中心(ATCC)。
實施例2表達hERG的細胞的評價使用IonWorks HT儀器對細胞系的描述已經記錄於H.Guthrie等人，(2005).「A Place for High Throughput Electrophysiology in CardiacSafetyGenerating a Novel hERG Cell Line and Screening Early withIonWorks HT.」J Biomol Screening(2005)10(8)832-40。
使用PatchXpress 7000A儀器對細胞系的描述已經記錄於L.Guo和H.Guthrie(2005).「The Role of Automated Electrophysiology in thePrediction of QT Prolongation.」J Pharmacol Toxicol Methods52(1)123-35。
實施例3
hERG活性的高通量篩選細胞系CHO crelox hERG UG#7展示800pA的平均電流振幅，＞80％的封接成功率(seal rate success)、100-200MOhm之間的封接以及高於80％的總體成功記錄，並獲選用於化合物文庫篩選。篩選三百種化合物以發現在施用30μM化合物之後將hERG電流抑制＞50％的那些化合物。將來自若干計劃的化合物用於篩選，儘管本實驗是盲法實施的，在使用標準膜片鉗研究時已經知道其中某些化合物阻滯hERG通道。在96孔板上製備三個化合物板，並將各板運行兩次，每板大約90種化合物(將各化合物測試四次)。採用384孔PatchPlate，在一個八小時工作日內完成300種化合物單點篩選。使用化合物板的一次運行佔用大約40分鐘。總體而言，各化合物用於八個PatchPlate孔，通常使得一個濃度下三至八個成功細胞(數據點)。
篩選期間，將各化合物濃度篩選兩次以保證每個數據點的足夠數量的細胞。由於成功率的變異性，八孔的冗餘是必要的。因此對於各化合物可以使n值具有從一到八的範圍。因為細胞系內細胞與細胞間的變異性，重複的PatchPlate孔也是重要的。

圖1顯示在(非連續的)九個實驗日以CHOcrelox hERG UG#7細胞系觀察到的變異性。在此期間，在最初的細胞系評價之後，該細胞系產生650pA的平均電流振幅，所述平均電流振幅從該研究的細胞系評價期所觀察到的800pA降低至此。電流穩定性是高的並且接近90％。儘管用於這些實驗的重複可能增加了我們的篩選時間，但是在指定篩選時間內產生了足夠數據。使用組合了Population Patch ClampTM技術的新的IonWorks Quattro技術(PatchPlate孔中記錄孔數量增加)，將消除這裡實行的冗餘。
在30μM，160種化合物阻滯hERG電流＞50％。使用八點濃度反應以IonWorks HT系統重新篩選這樣鑑定的160種化合物。每次運行與陽性(氟哌啶醇)和陰性(含0.1％DMSO的PBS)對照一起篩選五種藥物。以IonWorks HT產生的平均氟哌啶醇IC50為0.74+0.36μM(來自31個實驗)。在不同實驗條件下於37℃以不同細胞系收集的關於氟哌啶醇的傳統膜片鉗數據從0.025至0.12μM變化。這160種化合物篩選佔用五天以完成在16個PatchPlate孔中測試的單個濃度。如前所討論的，化合物測試中的冗餘是為了保證產生大量數據點以建立數據集的可靠性。由於該子集中所有化合物均經過標準膜片鉗測試，為進一步評價，選擇來源於一個計劃的一個數據集。傳統膜片鉗數據與IonWorks HT數據正相關(Spearman r＝0.53，p＜0.004)。在IonWorks HT上產生hERG IC50值＞30μM的化合物具有20.2+10.0μM(SD)的平均標準膜片鉗IC50值。在略微不同的條件下收集標準膜片鉗值，所述略微不同的條件包括全細胞結構(相對於穿孔膜片)、電壓脈衝方案、記錄溶液、細胞系(CHO-hERG)、溫度(37℃)和分析方法。一些化合物表現對IonWorks HT系統較低效，而一些甚至略高效。然而，兩組的平均IC50值沒有表現出統計學差異。
儘管以其具體實施方案對本發明進行了描述，但是本領域技術人員應當理解，可以進行多種改變並且可以用等同物替代而不背離本發明的實質精神或範圍。另外，可以進行許多修改以使具體情況、材料、物質組成、方法、工序或步驟適應於本發明的客觀精神和範圍。確定所有這些修改在此處所附的權利要求的範圍內。
權利要求
1.穩定的真核細胞系，所述細胞系表達hERG並在對照條件下顯示出測試電流的變化低於20％。
2.權利要求1的細胞系，其基本由CHO crelox-hERG UG#7、ATCCPTA-6812、或其子代、衍生細胞或後代組成。
3.權利要求1的細胞系，其基本由ATCC PTA-6812、或其子代、衍生細胞或後代組成。
4.確定測試化合物抑制hERG的能力的方法，所述方法包括a)提供穩定的真核細胞，所述細胞表達hERG，並在對照條件下於膜片鉗設備中的連續電生理學測量中顯示出測試電流的變化低於20％；b)將所述細胞與測試化合物接觸；c)在膜片鉗設備中測量測試電流；並d)確定在所述測試化合物存在下測試電流是否降低。
5.權利要求4的方法，其中所述穩定的真核細胞包括CHOcrelox-hERG UG#7(ATCC PTA-6812)。
6.權利要求4的方法，其中在將所述細胞與所述測試化合物接觸之前和之後比較所述細胞中的所述測試電流。
7.權利要求4的方法，其中在所述測試化合物不存在時將所述細胞中的所述測試電流與基本相同的細胞中的測試電流比較。
8.權利要求4的方法，其中將所述細胞中的所述測試電流與基本相同的細胞中的測試電流比較，所述基本相同的細胞已經與已知不具有hERG抑制作用的化合物接觸。
9.權利要求4的方法，其中將所述細胞中的所述測試電流與基本相同的細胞中的測試電流比較，所述基本相同的細胞已經與已知顯示出不可接受水平的hERG抑制的化合物接觸。
全文摘要
提供了表達hERG並在電生理學測試條件下顯示穩定電流的穩定的真核細胞系。
文檔編號C12N15/12GK1986783SQ20061016924
公開日2007年6月27日 申請日期2006年12月21日 優先權日2005年12月21日
發明者P·迪特裡希, U·古布勒, H·格思裡, B·科克 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司