用於治療帕金森病的多巴胺能神經元和具有增殖能力的前體細胞的製作方法

2023-05-21 10:54:11 4

專利名稱：用於治療帕金森病的多巴胺能神經元和具有增殖能力的前體細胞的製作方法
本申請是申請日為2002年6月20日、申請號為CN02815144.5、發明名稱為「用於治療帕金森病的多巴胺能神經元和具有增殖能力的前體細胞」的中國專利申請的分案申請。
相關申請的參考本申請要求提交於2001年6月21日的美國實用專利申請09/888,309和提交於2002年5月28日的10/157,288的優先權。為了在獲得許可的美國和其它管轄區域進行申請的目的，這裡全文引用了上述兩個優先權申請以及國際專利申請WO01/51616和WO 01/88104作為參考。
背景對於適合於人類服用的細胞系的衍生和擴展的新的研究有希望引導出一個美好的新的醫療世界。如果科學繼續從神經元和神經元前體細胞的細胞生物學的重要的新發現中受益，那麼毀滅性的和以前難以治療的病症就可能產生獲得再生藥物的希望。
病症中需要臨床治療的是那些有關神經功能異常的疾病。在這些疾病的列表中接近頂部的是帕金森病，一種自發的、緩慢發展的、中樞神經系統退化性的疾病，特徵為運動緩慢和減少、肌肉僵硬、靜止震顫和姿勢不穩。由黑質、藍斑以及其它腦幹多巴胺能細胞中著色的神經元的持續惡化產生的症狀，導致神經遞質多巴胺的缺失。帕金森病在中年以上的人群中是第四種最常見的神經退化疾病，影響0.4％的年過40歲的人，和1％的年過65歲的人。不管所提出的年齡，對於那些受折磨的患者該疾病常常造成毀滅性的結果。
造成神經系統的痛苦如此難以對付的原因是常常遭受到的破壞是不可逆的。對於這些疾病主要希望是發展能夠重建神經網絡的細胞群體，並使神經系統的功能恢復協調。有趣的證據顯示胎兒多巴胺能神經元移植可恢復帕金森病的化學異常。但是非常缺乏適當的組織。
由於這個原因，在神經祖細胞方面具有濃厚的興趣。各種類型的譜系-限制前體細胞更新它們自己並駐留於中樞神經系統的選擇性的位點(Kalyanl等，BiochemCell Biol，61051，1998)。推斷的神經限制前體(Mayer-Proschel等，Neuron，19773，1997)細胞表達神經細胞粘著分子的聚唾液酸化(polysialylated)同種型(PS-NCAM)。據說它們具有產生各種類型神經元的能力，但不產生神經膠質細胞。另一方面，推斷的神經膠質限制前體(Rao等，Dev.Biol，18848，1997)明顯地具有形成神經膠質而不是神經元的能力。推斷的來自胎兒或成人組織的神經前體進一步描述於美國專利5,852,832；5,654,183；5,849,553；以及5,968,829；以及WO09/50526和WO 99/01159中。
不幸的是，尚未顯示從神經組織中分離的祖細胞具有足夠的複製能力以產生用於人類臨床治療所必需的細胞數量。
另一個來源是從早期的胚胎組織中分離的多能細胞。在25年前胚胎幹(ES)細胞最初分離自小鼠的胚胎(G.R.Martin，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.787634，1981)。人們認為ES細胞能夠產生相同種類的實際上任何組織類型的子代。Li.Smith等(Cur.Biol.8971，1998)報導了通過譜系選擇從小鼠ES細胞產生神經元前體。Bjorklund等報導了從小鼠ES細胞生產功能性多巴胺能神經元(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.192344，2002)。
僅僅最近才分離出人的ES細胞(Thomson等，Science 282114，1998)。人ES細胞需要非常不同的條件來保持它們處於未分化的狀態，或指導它們沿著具體的分化途徑進行分化(美國專利6,090,622和6,200,806；澳大利亞專利AU 729377，和PCT出版物WO 01/51616)。由於這一原因，如何從人的ES細胞製備相對同源的細胞群體了解得非常少。
PCT出版物WO 01/88104(Carpenter，Geron Corporation)描述了通過分化人ES細胞獲得的神經祖細胞群體。獲得的群體中超過90％的呈NCAM陽性，35％呈β-微管蛋白陽性，和75％呈A2B5陽性。Zhang等(Nature Biotech.191129，2001)隨後報導了神經前體從人的ES細胞的分化。
迫切需要生產用於某些臨床病症的治療的進一步優化的神經細胞群體的技術。
綜述本發明提供了有效生產已從多能細胞分化為神經譜系細胞的靈長類細胞的系統。本發明的前體和末端分化的細胞可用於許多重要的應用，包括藥物試驗和恢復神經系統功能的藥物的生產。
本發明的一個方面是包括高比例的具有神經譜系特徵的細胞的細胞群體，例如神經元細胞和它們的前體。這些細胞可基於表型標記鑑別，例如A2B5、NCAM、MAP-2、幹蛋白、β-微管蛋白III以及本發明後面列出的其它標記，和通過特徵形態學和功能標準鑑別。
本發明的另一個方面是製備含有來自多能細胞的神經細胞的群體的方法，這些多能細胞例如胚胎幹細胞、胚胎生殖細胞、初級胚胎組織、或來自具有分化(或被改編)為含有神經表型的細胞的能力的胎兒或成人組織的幹細胞。該方法包括用可溶性因子和有助於具有某些所需特性的神經細胞生長的環境條件的組合培養細胞。本發明包括優化用於分化多能幹細胞為神經細胞的分化方法的策略，其中候選因子根據功能分組，並且所述幹細胞或它們的子代用各種組合的因子組培養。鑑別對於生產所欲細胞類型重要的組，然後將每個組的各個成分一個一個地除去以確定所需的最小量的組合物。
通過例證，多能幹細胞可通過在含有添加了例如頭蛋白和促濾泡素抑制素的一種或多種TGF-β超家族拮抗物的固體表面上直接分化進行生產。另外，多能幹細胞可培養為叢聚的或胚狀體。各種成熟程度的神經細胞的富集包括在含有添加了促細胞分裂原或生長因子(例如EGF和FGF)的培養基中培養，同時或隨後以各種優化的組合添加神經營養蛋白(例如NT-3或BDNF)和其它因子(例如EPO)。在某些情況下使用的分化因子的列表在以下概括的描述和說明實施例中列出。任選地，專業人員還可使用進一步促進細胞富集的物理分離技術或操縱技術。
根據本發明製備的成熟的神經元及其前體可表徵為細胞群體的子代或一個已建立的細胞系，成熟的神經元及其前體從這一細胞系衍生。這可通過諸如標準DNA指紋分析等一些適當的技術顯示基本上與親本群體一致的神經細胞的基因組得以證實。另外，可通過檢查神經細胞衍生過程中的記錄建立這一關係。神經細胞衍生自親本細胞群體的特徵在一些方面是重要的。特別地，未分化的細胞群體可用於生產具有共有基因組的附加細胞—或者另一批神經細胞，或者可用於治療的另一種細胞類型—例如能夠使患者預先耐受(pretolerize)神經異源移植的組織相容性類型的群體。
在本發明的一個實施例中，神經細胞從如所描述的分化為神經元前體細胞的人多能細胞製備，然後在培養物中傳代。使用胚胎幹細胞作為起始細胞類型，促進快速發展的群體的產生，儘管如此該群體仍然保持最終分化為功能神經元的全部活性—或者當用缺乏促細胞分裂原的神經營養蛋白培養時，或者當給予適當的受檢者時。某些前體細胞群體在培養物中具有進行至少10、20或40倍群體加倍的能力，而當進一步分化時不會丟失它們形成高度富集的神經元群體的能力。根據使用的條件，可生產前體群體，該群體具有分化為分化為高比例的酪氨酸羥化酶陽性細胞的能力。這種表型與多巴胺能神經元一致，是治療帕金森病所希望的。
本發明的細胞可用於篩選神經細胞毒性的化合物、調節神經元細胞功能的能力、或輔助神經元衍生和增殖的能力。
本發明的細胞還可用於在一個個體中重建或添加神經系統的功能，其中該給予該個體本發明的分離的細胞或細胞群體。為了這一目的，該分離的細胞或細胞群體被配製成為一種用於治療影響神經系統的疾病的藥物。
這些和本發明其它的實施例將在隨後的描述中揭示。
附1是顯示神經元細胞的螢光顯微照相，該神經元細胞是通過在使用分化因子的混合物的固體基質上直接分化ES細胞獲得的。顯示的三個區域都取自包含神經營養蛋白和TNF-β超家族拮抗物頭蛋白和促濾泡素抑制素的處理。觀察到許多細胞對於神經元標記物β-微管蛋白-III進行神經元加工和著色。MAP-2陽性細胞，同時也對酪氨酸羥化酶(一種多巴胺能神經元標記物)呈陽性的細胞比例高達約15％。
圖2顯示通過直接分化從hES細胞製備神經元的情況。當未分化的細胞在層粘連蛋白上鋪板並用TGF-β超家族拮抗物頭蛋白(N)和促濾泡素抑制素(F)(A組)培養時β-微管蛋白陽性神經元的產量很高。在幹細胞因子存在而促細胞分裂原不存在的情況下(處理F，B組)產量被進一步提高。視黃酸提高了產生的神經元的數量(C組)，但是減少了神經元對酪氨酸羥化酶(TH)陽性染色的比例(D組)。
圖3顯示製備神經元的情況，其中通過培養hES形成胚狀體引發分化。然後該細胞在促細胞分裂原中培養，進行不同的胰蛋白酶消化，然後在含有促細胞分裂原或神經營養因子混合物的培養基中多次傳代。當促細胞分裂原和神經營養蛋白一起使用時，細胞可傳代約40倍(A組)，保持增殖的能力和分化為成熟神經元的能力(B組)。
圖4顯示在表皮生長因子(EGF)、鹼性成纖維細胞生長因子(FGF-2)、腦衍生神經營養因子(BDNF)和神經營養蛋白3(NT)的混合物中傳代細胞，產生神經前體群體，該前體群體依據分化產生TH-陽性細胞佔群體中所有細胞的約7％的細胞群體(A組)。用於前體細胞末端分化的混合物還可改進TH-陽性細胞的生產(B組)。
詳細描述人們已經發現當多能幹細胞在選擇的分化試劑存在的情況下培養時，衍生出含有相當高比例的其有成熟神經細胞或其前體的表型特徵的細胞的細胞群體。這些細胞適合用於藥物篩選和與神經系統異常有關的病症的治療。
本發明包含的系統通過從一個已建立的人胚胎幹(hES)細胞系獲得的細胞群體說明。可通過下文描述的一些技術引發分化，例如形成胚狀體，或通過在一個具有一種或多種TGF-β超家族拮抗物存在的適當的基質上培養hES細胞。獲得前體細胞，該前體細胞屬於神經元譜系，並且它可進一步分化為成熟神經元。
如圖3(A)中所顯示的，從hES細胞形成的神經元前體可在培養基中被傳代約40倍。值得注意的是，如圖3(B)所顯示的，甚至在多次傳代後，這些細胞仍保持了分化為成熟神經元的全部能力。以前在人的神經細胞的培養中，沒有利用這種增殖能力和分化能力強有力的結合。
根據本發明獲得的成熟神經元延伸了這種細胞類型的特徵，顯示對於神經元-特異性標記物如神經絲和MAP-2的著色，並且如通過對突觸小泡蛋白染色檢測到的，顯示突觸形成的證據。這些細胞對各種神經遞質物質做出反應，並且如在標準膜片鉗系統中測定的具有動作電位。在所有這些方面中，該細胞明顯具有全部的神經功能。
特別的重要性是該系統可被調節以優化能夠產生具有醫療重要特性的神經元的前體的比例的能力。

圖1顯示了對於酪氨酸羥化酶染色為陽性的神經元，這是多巴胺能神經元的特徵。這種類型的細胞對於帕金森病的治療的特別需要的，但是以前沒有描述過其它來源可提供具有足夠豐度的適當種類的細胞。如圖4中所顯示的，在含有促細胞分裂原EGF和FGF-2，以及神經營養蛋白BDNF和NT-3的培養基中傳代前體細胞，產生能夠產生TH-陽性細胞佔群體全部細胞的約7％的增殖細胞群體。
既然本發明的多能幹細胞和一些譜系-限制性前體在培養基中大量增殖，本公開描述的系統提供了神經元細胞無限制的供給。可在未分化的多能幹細胞水平上，或在屬於神經前體的水平上發生大規模的擴展。本發明的細胞在研究、藥物開發和CNS異常的治療上具有重要的用途。
定義為了本公開的目的，術語「神經祖細胞」或「神經前體細胞」是指能夠產生或者是神經元細胞(例如神經元前體或成熟神經元)或者是神經膠質細胞(例如膠質前體、成熟星形膠質細胞或成熟少突神經膠質細胞)的子代的細胞。典型地，當它們自身體外培養時，它們不產生其它胚胎胚層的子代，除非以某種方式去分化或重編程序。
「神經元祖細胞」或「神經元前體細胞」是能夠產生成熟神經元子代的細胞。這些細胞也可能或不可能具有產生神經膠質細胞的能力。一個「神經膠質祖細胞」或「神經膠質前體細胞」是能夠產生成熟星形膠質細胞或成熟少突神經膠質細胞子代的細胞。這些細胞也可能或不可能具有產生神經元細胞的能力。
一種「分化試劑」，如本公開中所使用的，是指一種化合物的收集，該化合物用於本發明的培養系統中以產生神經譜系的分化細胞(包括前體細胞和末端分化的細胞)。對於化合物的作用方式無意限制。例如，該試劑可通過誘導或輔助表型變化、促進具有特殊表型的細胞生長或延緩其它細胞的生長、或與其它試劑合作通過未知機制發揮作用來輔助分化過程。
原型「靈長類多能幹細胞」(pPS細胞)是衍生自受精後任一時間的胚前期、胚胎或胎兒的多能細胞，並具有能夠在適當的條件下生產一些不同的細胞類型的子代的特徵，該不同細胞類型是所有三個胚層(內胚層，中胚層和外胚層)的衍生物，根據標準的本領域已接受的檢驗，例如在8-12周大的SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力。包含於pPS細胞定義的是各種類型的胚胎細胞，例如人胚胎幹(hES)細胞，和人胚胎生殖細胞(hEG)。該pPS細胞較佳地不是衍生自惡性來源。細胞是整倍體的是理想的(但不總是必需的)。
當群體中大部分的幹細胞和它們的衍生物顯示未分化細胞的形態特徵時pPS細胞培養物被描述為「未分化的」，將他們與胚胎或成人來源的分化細胞相區別。應理解群體內未分化細胞的集落常常為鄰近的分化細胞所包圍。
「飼養細胞」或「飼養者」是用於描述與另一種類型的細胞共培養的一種類型的細胞的術語，以提供一種環境，在這種環境種第二種類型的細胞可以生長。據說pPS細胞群體「基本上不含」飼養細胞，如果在分裂後這些細胞生長至少一輪，其中沒有加入新鮮的飼養細胞以支持pPS細胞的生長。
術語「胚狀體」指當pPS細胞在單層培養物上過量生長或保持在懸浮培養物中時出現的分化的和未分化的細胞的聚集體。胚狀體是典型地來自幾個胚層的不同細胞類型的混合物，可通過形態學標準和使用免疫細胞化學可檢測的細胞標記物區別。
「生長環境」是一種感興趣的細胞可以在其中體外增殖、分化或成熟的環境。環境的特徵包括培養細胞的培養基，可存在任何生長因子或分化誘導因子，以及如果存在的話一種支撐結構(例如在固體表面上的基質)。
當一個多核苷酸通過任何適當的人工操作手段轉移到細胞時，或者其中細胞是遺傳了該多核苷酸的最初改變的細胞的子代，細胞被稱做「遺傳改變」、「轉染」或「遺傳轉化」。該多核苷酸常常包含編碼感興趣的蛋白質的可轉錄的序列，它能使細胞以提高的水平表達蛋白質。如果改變的細胞的子代具有相同的改變那麼遺傳改變是「可遺傳的」。
一般技術分子遺傳學和遺傳基因工程的一般方法描述於最近出版的《分子克隆實驗手冊(Molecular CloningA Laboratory Manual)》(Sambrook等，Cold Spring Harbor)；《哺乳動物的基因轉移載體(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cell)》(Miller Calos編)；和《分子生物學現代流程(Current Protocols in MolecularBiology)》(F.M.Ausubel等編，Wiley Sons)。細胞生物學、蛋白質化學和抗體技術可在《蛋白質科學現代方案(Current Protocol in Protein Science)》(J.E.Colligan等編，Wiley Sons)；《細胞生物學現代方案(Current Protocol inCell Biology)》(J.S.Bonifacino等，Wiley Sons)和《免疫學現代方案(CurrentProtocol in Immunology)》(J.E.Colligan等編，Wiley Sons)中發現。
細胞培養方法通常描述於最近出版的《動物細胞培養基礎技術手冊(Cultureof Animal CellsA Manual of Basic Technique)》(R.I.Freshney編，Wiley Sons)；《細胞培養一般技術(General Techniques of Cell Cul ture)》(M.A.Harrison I.F.Rae，Cambridge Univ.Press)，以及《胚胎幹細胞方法和流程(EmbryonicStem CellsMethods and Protocols)》(K.Turksen編，Humana Press)。
關於神經系統異常的詳細描述、以及各種類型的神經細胞、標記物和相關可溶因子的特徵，讀者可參考《CNS 再生基礎科學和臨床進展(CNS RegenerationBasic Science and Clinical Advances)》，M.H.Tuszynski J.H.Kordower編，Academic Press，1999。神經細胞的管理和飼養描述於《神經元細胞和分子生物學(The NeuronCell and Molecular Biology)》第三版，I.B.Levitan L.K.Kaczmarek，Oxford U.Press，2001；《組織培養中的神經元(The Neuron in TissueCulture)》，L.W.Haynes編，John Wiley Son Ltd，1999。
幹細胞的來源本發明可使用各種類型的幹細胞進行。具體適用於本發明的是衍生自懷孕後形成的組織的靈長類多能幹(pPS)細胞，例如胚泡、或胎兒或取自懷孕過程中的任何時間的胚胎組織。如下文所描述的，非限制性的例子是胚胎幹細胞或胚胎生殖細胞的初級培養物或已建立的細胞系。本發明的技術還可用初級胚胎或胎兒組織直接進行，直接從初級胚胎細胞衍生神經細胞，而不需要最初建立一個未分化的細胞系。
胚胎幹細胞可從靈長類成員的胚泡中分離(美國專利5,843,780；Thomson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 927844，1995)。可使用Thomson等(美國專利6,200,806；Science 2821145，1998；Curr.Top.Dev.Biol.38133 ff.，1998)和Reubinoff等(Nature Biotech.18399，2000)描述的技術從人的胚泡細胞中製備人的胚胎幹(hES)細胞。與hES細胞等價的細胞類型包括它們的多能衍生物，例如原始外胚層樣(EPL)細胞，描述於WO 01/51610(Bresagen)。
人胚胎生殖(hEG)細胞可從存在於取自末次月經後約8-11周的人胎兒材料中的原生殖細胞製備。適當的製備方法描述於Shamblott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9513726，1998和美國專利6,090,622。
使用促進增殖而不是促進分化的培養條件，PPS細胞可在培養物中連續繁殖。典型的含血清的ES培養基用80％的DMDM(如敲除DMEM(Knockout DMEM)，Gibco)、20％的或者限定的胎牛血清(FBS，Hyclone)或者血清替代物(WO 98/30679)、1％的非必需胺基酸、1mM的L-穀氨醯胺和0.1mM的β-巰基乙醇製備。當使用前，加入人的bFGF至4ng/ml(WO 99/20741，Geron公司)。
常規地，ES細胞在一層飼養細胞上培養，典型地一個混合的細胞群體衍生自胚胎或胎兒組織(美國專利6,200,806)。在Geron的科學家發現即使沒有飼養細胞pPS細胞也能保持未分化的狀態。可在細胞外的基質上(例如Matrigel或層粘連蛋白)支撐不含飼養細胞的培養物，並在含有支持細胞的增殖而不支持分化的因子的營養培養基中培養。典型的是通過用分泌這種因子的細胞預培養獲得調整的培養基，例如照射初級小鼠胚胎成纖維細胞(或衍生自人胚胎幹細胞的成纖維細胞樣細胞)，在調整前和調整後添加8ng/ml的鹼性FGF。在顯微鏡下，ES細胞出現高的核/胞質比、顯著的核仁和緊密的群體形成，典型地表達例如SSEA 3和4的特徵表型標記物。在國際專利申請WO 99/20741和WO 01/51616中提供了關於胚胎幹細胞的管理和飼養的進一步詳細的描述。
描述於本發明的一些技術還可用於保持或推進從胎兒或成體組織獲得的神經細胞或神經前體的分化(美國專利5,852,832；5,654,183；5,849,553；和5,968,829；和WO 09/50526和WO 99/01159)。除非特別指出，本發明可使用任何脊椎動物種類的細胞進行，包括人、非-人靈長類、家畜和其它非-人哺乳動物。
製備神經前體和末端分化細胞的材料和步驟本發明的神經祖細胞和成熟神經元可通過使用適當的分化示例分化幹細胞。
典型地，分化過程是在含有適當的基質和添加了分化試劑的營養培養基的培養環境中進行。適當的基質包括包被有正電荷的固體表面，例子為聚-L-賴氨酸和聚鳥氨酸。基質可用細胞外基質成分包被，例子為粘連蛋白和層粘連蛋白。其它允許的細胞外基質包括Matrigel(來自Engelbreth-Holm-Swarm腫瘤細胞的細胞外基質)。還有適當的基質是組合基質，例如聚-賴氨酸結合粘連蛋白、層粘連蛋白或二者都結合。
本發明的神經譜系細胞是在支持所欲的細胞類型增殖或存活的培養基上培養的。常常需要使用提供如游離胺基酸而不是血清的營養素的限定的培養基。向培養基中添加開發用於神經細胞持續培養的添加劑也是有益的。例子是N2和B27添加劑，從Gibco商業購得。
沿神經分化途徑發展細胞通過包含於培養基中得以促進，該培養基是一種增加所欲的細胞類型生長的分化試劑的混合物。這可能涉及指導細胞或它們的子代接受分化的細胞類型的表型特徵，促進具有所欲表型的細胞的生長或抑制其它細胞類型的生長。為了實施本發明通常不需要理解試劑的作用方式。
適當的分化試劑包括各種類型的生長因子，例如表皮生長因子(EGF)、轉化生長因子α(TGF-α)、任何類型的成纖維細胞生長因子(例子為FGF-4、FGF8，和鹼性成纖維細胞生長因子＝bFGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、胰島素樣生長因子1(IGF-1和其它)、高濃度的胰島素、sonic hedgehog、神經營養蛋白家族的成員(例如神經生長因子＝NGF、神經營養蛋白3＝NT-3、腦衍生神經營養因子＝BDNF)、骨形態發生蛋白(特別是BMP-2和BMP-4)、視黃酸(RA)和於gp130混合的受體的配體(例如LIF、CNTF和IL-6)。還有其它適當的分化試劑是另一種與前面提到的因子的各個細胞-表面受體結合的配體和抗體。典型地，使用了許多分化試劑，它們可含有2、3、4或更多上文列出的或下文實施例中所描述的試劑。
在一種分化方法中，pPS細胞在一個適當的基質上直接鋪板，例如粘著的玻璃或塑料表面，例如用聚賴氨酸包被、具有或不具有例如纖連蛋白和層粘連蛋白的神經元-友好基質蛋白的蓋玻片。然後該細胞培養於適當的營養基中，該營養基適合於促進向神經細胞的分化。這被稱做「直接分化」方法，它進一步描述於國際專利申請WO 01/51616和具有優先權的美國專利申請09/888,309。TGF-β超家族拮抗物例如頭蛋白和促濾泡素抑制素在指導神經分化和增加帶有通過直接分化獲得的神經細胞的表型特徵的細胞比例中特別有用(實施例4)。
在另一種分化方法中，pPS細胞首先通過形成細胞簇預分化為異源細胞群體。在一個典型的變化中，通過在懸浮液中培養pPS細胞形成胚狀體。任選地，前面列出的一種或多種分化試劑(例如視黃酸)可包含於培養基中以促進胚狀體內的分化。胚狀體達到足夠大小或成熟後(典型地3-4天)，它們在分化培養的基質上鋪板。胚狀體可直接鋪板於基質上而不分散細胞。這使得神經細胞前體移出胚狀體併到達細胞外基質上。在一些步驟中，該細胞首先培養於促細胞分裂原混合物中，例如EGF、bFGF、PDGF和IGF-1，然後在促細胞分裂原和神經營養蛋白的組合物中傳代以選擇出神經祖細胞。
本發明包括鑑別有效產生具體神經表型的因子組合物的策略。根據對來自其它組織或種類的神經細胞的已知作用，已知的受體結合活性，與其它已知功能的因子的結構同源性或其它適當的標準，將已知或懷疑增強神經分化或生長的各種因子分為各種功能類別。各個類別中的因子以適當的工作濃度集合。然後以各種組合，用各個因子類別一起培養細胞，並且評估因子促進前體細胞或所欲類型的成熟神經元生長的能力。鑑別必需的因子類別，當這些因子缺乏時導致混合物丟失其促進所欲表型的能力。一旦鑑定了必需因子並除去其它因子，那麼通過除去單一的成分仔細分析各個類別直到鑑定出最低限度的混合物。實施例4中舉例說明了這一策略的實施。
如果需要，分化的細胞可被分類以富集某些群體。例如，細胞可用與神經細胞的標記物特徵(例如NCAM)結合的抗體或配體接觸，隨後使用適當的免疫技術，例如固項吸附或螢光-活化細胞分類，分離特異性識別的細胞。還適合的是差別鋪板或收穫技術，其中使用所欲細胞類型的粘附或可釋放性從一個異源群體的其它細胞中分離所欲的細胞。
已經發現神經前體表型可使用促細胞分裂原(例如bFGF和EGF)的組合，加之一種或多種神經營養蛋白(例如BDNF、NT-3或二者)，在增殖培養物中傳代。這在實施例2、4和5中舉例說明。根據本方法，該細胞可被傳代達40倍(圖3)，而保持增殖的能力和製成成熟神經元的能力。
假定定向祖細胞在人的治療中具有特別的價值，因為它們操作起來更具有彈性，並且將保持遷移到靶組織的更大的能力並以功能相容的形式整合。祖細胞可在如實施例5中說明的固體表面上或懸浮液培養物中生長，在那裡它們傾向於形成簇或球形結構。通過舉例說明當接近融合時使用胰蛋白酶收集神經祖細胞。然後細胞以約一半的密度在無粘著力的加樣孔中接種，並培養於含有10ng/ml的BDNF、NT-3、EGF和bGFG的補充培養基中，每周更換3次。
在神經祖細胞衍生或保持過程中培養基其它成分的明智選擇可影響它們能產生的成熟細胞的範圍和特徵。如實施例4中所描述的，在神經祖細胞直接分化過程中包含於培養基中的視黃酸提高了最終分化時產生的MAP-2細胞的比例-但是降低了與多巴胺能神經元有關的對酪氨酸羥化酶(TH)呈陽性的細胞的比例。另一方面，人們發現在神經祖細胞形成過程中包含於培養基中的紅細胞生成素(EPO)或提高環狀AMP水平的試劑增強了形成TH陽性神經元的能力。另外，細胞可用活化EPO途徑的某些抗體或拮抗物培養，或細胞可在適度的含氧量低的條件下培養(低O2水平指3-6％)。使用EPO增加多巴胺能表型的形成描述於實施例3中。
根據這些步驟中的任一步驟製備的神經前體細胞可進一步分化為成熟成熟神經元。完全分化的細胞是本發明的各種應用所希望的，例如體外評估和篩選各種化合物對神經組織的作用。對於使完全分化的細胞表徵產生完全分化的細胞的神經祖細胞的功能性也是有用的。
可通過使用成熟因子培養神經前體細胞形成成熟神經元，成熟因子例如毛喉素(或其它提高細胞內cAMP水平的化合物，例如霍亂毒素、異丁基甲基黃嘌呤、二丁基腺苷環狀一磷酸)、c-試劑盒配體(c-kit ligand)、視黃酸或來自神經營養蛋白家族的任何因子或因子組合物。特別有效的是神經營養蛋白-3(NT-3)與腦衍生神經營養因子(BDNF)結合。其它候選物是GDNF、BMP-2和BMP-4。另外，可通過除去一些或全部促進神經前體增殖的因子增進成熟，例如EGF FGF或其它頂先用於維持培養的促神經分裂素。
進一步的合理修改本發明的神經細胞前體群體具有相當大的增殖能力。如果需要，可通過提高細胞中端粒酶逆轉錄酶(TERT)的水平，或者通過從內源基因提高轉錄，或通過導入轉基因進一步增強複製能力。特別適合的是國際專利申請WO 98/14592提出的人端粒酶(hTERT)催化成分。人的細胞中端粒酶的轉染和表達描述於Bodnar等，Science279349，1998和Jiang等，Nat.Genet.21111，1999。根據標準方法，遺傳改變的細胞可通過TR-PCR評估hTERT的表達，端粒酶的活性(TRAP測定)，hTERT的免疫細胞化學染色或複製能力。
為了在治療和其它應用中使用，常常需要前體或成熟神經細胞的群體為基本上游離的未分化的pPS細胞。從群體中減少未分化的幹細胞的一條途徑是用載體轉染它們，在這個載體中一個在啟動子控制下的效應基因引起未分化的細胞優先表達。適當的啟動子包括TERT啟動子和OCT-4啟動子。效應基因可直接溶解於細胞(例如編碼一種毒素或編程性細胞死亡的介質)。另外，效應基因可使細胞對外部試劑的毒性效應敏感，例如一種抗體或一種前體藥物。典型的例子是單純皰疹胸苷激酶(tK)基因，它引起它被表達的細胞對鳥嘌呤的敏感。適當的pTERT-tK構建物描述於國際專利申請WO 98/14593(Morin等)中。
神經前體和末端分化的細胞的特徵細胞可依據許多表型標準進行表徵，例如形態學特徵、表達的細胞標記物的檢測或定量、酶活、或神經遞質及它們的受體和電生理機能。
包含於本發明的某些細胞具有神經細胞或神經膠質細胞的形態學特徵。這些特徵為那些熟練評估這種細胞存在的技術人員是容易地理解。例如，神經元的特徵是小細胞體，多數具有軸突和樹突。本發明的細胞還可根據它們是否表達各種神經細胞的表型標記物特徵進行表徵。
感興趣的標記物包括但不限於β-微管蛋白III、微管相關蛋白2(MAP-2)、或神經絲，神經元的特徵；存在於星形膠質細胞中的膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)；半乳糖腦苷(GalC)或髓磷脂鹼性蛋白(MBP)，少突神經膠質細胞的特徵；Oct-4，未分化的hES細胞的特徵；和幹蛋白，神經前體和其它細胞的特徵。已經描述了A2B5(一種糖脂)和聚唾液酸化(polysialylated)的神經細胞粘著分子(簡寫為NCAM)。而當研究神經譜系細胞時，A2B5和NCAM是指示標記物，應理解有時這些標記物可在其它細胞類型上顯示，例如肝或肌肉細胞。以前認為β-微管蛋白III對神經細胞是特異性的，但已發現hES細胞的亞群體也呈β-微管蛋白III陽性。MAP-2對於全部各種類型的分化神經元是更加嚴格的標記物。根據本發明製備的某些細胞群體含有至少30％、50％、75％、90％或更多的對這些標記物具有檢驗陽性的細胞，這些標記物或者是單一的或者是以各種組合存在。
列於本公開的和本領域已知的組織-特異性標記物可使用任何適當的免疫技術檢測—例如用於細胞表面標記物的流式免疫細胞化學，用於細胞內或細胞表面標記物的免疫組織學(例如，固定細胞或組織切片的免疫組織學)，細胞提取物的蛋白質印跡分析，和用於細胞提取物或分泌進入培養基的產物的酶-聯免疫分析。如果任選地在細胞固定後，和任選地使用標記的第二抗體或其它偶聯物(例如生物素-抗生物素蛋白偶聯物)擴增標記物，在標準免疫細胞化學或流式細胞儀分析中明顯的可檢測數量的抗體將與抗原結合，那麼通過細胞的抗原的表達被稱做「可檢測的抗體」。
組織特異性基因產物的表達還可通過RNA印跡分析、斑點印跡雜交分析，或使用標準擴增方法中的序列特異性引物通過逆轉錄酶引發的聚合酶鏈反應(RT-PCR)在mRNA水平上檢測。關於更詳細的描述參見美國專利5,843,780。列於本公開中的具體的標記物的序列數據可從公共資料庫例如GenBank(URL www.ncbi.nlm.nih.gov80/entrez)獲得。根據本公開描述的分析方法中的一種，如果在一個典型的控制試驗中根據標準步驟進行對細胞樣品的分析產生明顯可鑑別的雜交或擴增產物，那麼在mRNA水平上的表達被稱做「可檢測的」。如果表達水平至少為2倍，和較佳地大於對照細胞10或50倍，例如未分化的pPS細胞、成纖維細胞或其它無關的細胞，那麼當在蛋白質或mRNA水平上檢測時，組織特異性標記物的表達被認為是陽性的。
還是神經細胞的特徵的是，具體是末端分化的細胞，涉及生物合成、釋放和神經遞質的再攝取的受體和酶，和涉及有關突觸傳遞的去極化和復極化事件的離子通道。突觸形成的證據可通過突觸小泡蛋白的染色獲得。某些神經遞質的感受性的證據可通過檢測γ-氨基丁酸(GABA)、穀氨酸、多巴胺、3，4-二羥苯丙氨酸(DOPA)、去甲腎上腺素、乙醯膽鹼和血清素的受體獲得。
本發明具體的神經前體細胞群體的分化(例如使用NT-3和BDNF)可產生至少為20％、30％或40％的MAP-2陽性的細胞群體。一個基本的比例，如5％、10％、25％或更多的NCAM或MAP-2陽性的細胞(在細胞計數的基礎上)將能夠合成神經遞質，例如乙醯膽鹼、甘氨酸、穀氨酸、去甲腎上腺素、血清素或GABA。本發明的某些細胞群體含有NCAM或MAP-2陽性細胞，通過免疫細胞化學或mRNA表達測定，該細胞中1％、5％、10％或更多對酪氨酸羥化酶(TH)呈陽性—或者作為NCAM或MAP-2陽性細胞的百分比，或者存在於群體中的所有細胞。本領域中通常認為TH是多巴胺能細胞的標記物。
為了進一步闡明存在於分化群體中的成熟神經元，可根據功能標準測定細胞。例如，可使用任何標準技術、對神經遞質的反應、或已知影響體內神經元的其它環境條件測定鈣通量。首先，通過形態學標準、或通過例如NCAM的標記物鑑別群體中的神經元樣細胞。然後神經遞質或條件應用於細胞，並監測反應。還可對細胞運用標準膜片鉗技術，以測定是否有動作電位的證據，以及外加電勢和反應之間的滯後時間是怎樣的。
這裡衍生自已建立的pPS細胞系的本發明的細胞群體和分離的細胞可表徵為具有與它們衍生自的細胞系相同的基因組。這意味著在pPS細胞和神經細胞之間染色體DNA將具有超過90％的同一性，如果神經細胞是通過正常的有絲分裂過程從未分化的細胞系獲得的，那麼這是可以推斷的。既然保留了所有非-操作的遺傳因子，用重組方法以導入一個轉基因(例如TERT)或敲除一個內源基因處理的神經細胞仍被認為與它們衍生自的細胞系具有相同的基因組。
神經前體和末端分化的細胞的應用本發明提供了生產大量的神經前體細胞和成熟神經元和神經膠質細胞的方法。這些細胞群體可用於重要的研究、開發和商業目的。
本發明的細胞可用於製備cDNA文庫，該cDNA文庫相對地沒有為來自其它譜系的細胞中優選表達的cDNA所汙染。例如，通過在1000rpm離心5分鐘收集多能神經祖細胞，然後製備mRNA，逆轉錄，並任選地減去來自成熟神經元、星形膠質細胞、或少突神經膠質細胞或未分化的星形膠質細胞的cDNA。神經元的表達模式可通過顯微排列分析與其它細胞類型相比較，通常參考Fritz等，Science 288316，2000；《微陣列生物晶片技術(Microarray Biochip Technology)》，LShi，www.Gene-Chips.com。
本發明分化的細胞還可用於製備抗體，該抗體對多能神經祖細胞、屬於神經元或神經膠質細胞譜系的細胞和成熟神經元、星形膠質細胞和少突神經膠質細胞的標記物具有特異性。可以免疫原性的形式用本發明的細胞注射脊椎動物製備多克隆抗體。單克降抗體的生產描述於如Harrow和Lane(1988)，美國專利4,491,632，4,472,500和4,444,887，和《酶法(Methods in Enzymology)》73B3(1981)的標準參考書中。
商業興趣的應用包括使用細胞篩選小分子藥物，和製備含有用於臨床治療的神經元的藥物組合物。
藥物篩選本發明的神經前體細胞可用於篩選影響神經前體細胞和它們的各種子代的特徵的因子(如溶劑、小分子藥物、肽、多核苷酸)或環境條件(例如培養條件或操作)。
在一些應用中，pPS細胞(未分化的或分化的)用於篩選促進神經細胞成熟或促進這種細胞在長期培養中增殖和保持的因子。例如，通過在不同的加樣孔中向細胞中加入候選成熟因子或生長因子檢驗它們，然後測定獲得的任何表型變化，根據所需的標準進一步培養和使用細胞。
本發明的其它篩選應用涉及檢驗藥物化合物對神經組織或神經傳導的影響。進行篩選可能或者是由於設計的化合物具有對神經細胞的藥物作用，或者是由於設計的化合物在別處有作用，可能對神經系統具有意想不到的副作用。可使用本發明的任何神經前體細胞或末端分化的細胞進行篩選，例如多巴胺能、5』-羥色胺能、膽鹼能、感覺和運動神經元、少突神經膠質細胞和星形膠質細胞。
讀者通常參考標準教科書《藥物研究的體外方法(In vitro Methods inPharmaceutical Research)》，Academic Press，1997，和美國專利5,030,015。候選藥物化合物活性的評估通常包括將本發明分化的細胞與候選化合物結合，或者單獨的或者與其它藥物結合。研究者測定可歸因於化合物的細胞的形態、標記物表型或功能活性的任何變化(與未處理的細胞或用無活性的化合物處理的細胞比較)，然後把化合物的作用與觀察到的變化聯繫起來。
首先通過對細胞生活力、存活、形態和某些標記物和受體的表達的影響確定細胞毒性。藥物對染色體DNA的影響可通過測定DNA合成或修復確定。尤其是在細胞周期中以不定期的次數，或者在超出細胞複製所需要的水平上，[3H]-胸苷或BrdU的摻入與藥物的作用一致。副作用還可包括通過中期擴散測定的姊妹染色單體交換的異常比率。關於進一步詳細的描述讀者可參考A.Vickers的《藥物研究的體外方法(In vitro Methods in Pharmaceutical Research)》375-410頁，Academic Press1997)。
細胞功能的作用可使用任何標準分析觀察神經細胞的表型或活性進行評估，例如受體結合、神經遞質合成、釋放或吸收、電生理和神經元突起和髓鞘的生長一或者在細胞培養物中或者在一個適當的模型中。例如，藥物改變突觸性接觸和可塑性的能力可通過突觸或突觸小泡蛋白的免疫細胞化學染色在培養物中測定。電生理可通過測定IPSP和EPSP(抑制和刺激突觸後電位)進行評估。另外，使用雙電極系統，刺激一個細胞，評估系統中第二個細胞的反應。有候選藥物存在的系統的行為與藥物不存在的系統的行為進行比較，並與藥物影響突觸性接觸或細胞可塑性的能力聯繫起來。
治療用途本發明還對可能是由於功能上的先天性障礙、疾病的影響或外傷的結果造成的需要這種治療的受檢者提供了使用神經前體細胞恢復一定程度的中樞神經系統(CNS)功能的用途。
為了確定用於治療給予的神經前體細胞的適用性，首先可在適當的動物模型中檢驗該細胞。首先，評估細胞體內存活和保持它們的表型的能力。神經前體細胞在可觀察的位點，例如在腦腔中或脊髓中給予免疫缺乏的動物(例如裸鼠、或通過化學或輻射致使免疫缺乏的動物)。在幾天到幾周或更多的一段時間後收集組織，並評估是否pPS衍生細胞仍然存在。
這可通過給予表達被預標記(例如用BrdU或[3H]-胸苷)的可檢測的標記物(例如綠色螢光蛋白、或β-半乳糖苷酶)的細胞進行；或通過構成細胞標記物的隨後檢測(例如使用人特異性抗體)進行。在嚙齒類動物模型中檢驗神經前體細胞時，給予的細胞的存在和表型可使用人特異性抗體通過免疫組織化學或ELISA評估，或使用引起對人的多核苷酸序列具有特異性的擴增的引物和雜交條件通過RT-PCR分析評估。在本公開的其它地方提供了用於在mRNA或蛋白質水平上評估基因表達的適當的標記物。
用於檢驗神經系統功能的各種動物模型描述於《CNS再生基礎科學和臨床進展(CNS RegenerationBasic Science and Clinical Advances)》，M.H.Tuszynski和Kordower編，Academic Press，1999。帕金森病可通過外傷誘導黑質紋狀體損傷，從而阻礙腦中主要的多巴胺途徑在大鼠中建立模型。另一種標準動物模型是在具有MPTP(1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶)的小鼠或非人靈長類的黑質中多巴胺能神經元的化學損傷。在Furns等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 804546，1983；Freed等，Appl.Neurophysiol.4716，1984；和Bjorklund等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 192344，2002中提供了例證。
在需要治療的人類患者中，本發明分化的細胞還可用於組織重建或再生。這些細胞以允許它們移植或遷移到預定的組織位點並重建或再生功能缺乏區域的方式給予。通過例證，依據所治療的疾病，神經幹細胞直接移植到中樞神經系統的實質或鞘內位點。使用單一的細胞懸浮液或密度為25,000-500,000細胞/μL的小的聚集體進行移植(美國專利5,968,829)。包含於本發明的某些神經祖細胞設計用於神經系統急性或慢性損傷的治療。例如，興奮性神經毒性為各種條件所影響，這些條件包括癲癇、中風、局部缺血和阿爾茨海默病。可配製多巴胺能神經元用於治療帕金森病，GABA能神經元用於治療亨庭頓氏病，和運動神經元用於治療脊髓損傷或肌萎縮性側索硬化(ALS)。
根據本發明，神經祖細胞和末端分化的細胞可以藥物組合物的形式供給，該組合物含有在充分消毒的條件下製備的用於人的給予的等滲的賦形劑。關於藥物配製的一般原則讀者可參考由G.Morstyn和W.Sheridan編的《細胞療法幹細胞移植，基因療法和細胞免疫療法(Cell TherapyStem Cell Transplantation，GeneTherapy，and Cellular Immunotherapy)》，劍橋大學出版社，1996；和《造血幹細胞療法(Hematopoietic Stem Cell Therapy)》，E.D.Ball，J.Lister和P.Law，Churchill Livingstone，2000。
該組合物可任選地包裝於適當的容器中，該容器上寫出了對於所需目的的用法說明，例如CNS功能的重建以改善某些神經異常。
提供下面的實施例用於進一步無限制地說明本發明具體的實施例。
實施例實施例1胚胎幹細胞分化為成熟神經元如以前所描述的(AU 729377；WO 01/51616)，從不含飼養細胞的培養物中獲得人胚胎幹細胞(hES)。如下生產胚狀體。hES細胞的融合的單層培養物通過在1mg/ml的膠原酶中培養5-20分鐘獲得，隨後從平板上刮下細胞。然後細胞被分離成簇，並在包含80％的KO(「敲除」)DMEM(Gibco)和20％的非-加熱-滅活的FBS(Hyclone)，添加有1％的非必需胺基酸，1mM的穀氨醯胺，0.1mM的β-巰基乙醇的培養基中的非-粘著細胞培養平板(Costar)中鋪板。細胞在每孔2ml的培養基中(6孔平板)以1∶1或1∶2的比例接種。
在懸浮液中4天後，在添加了10ng/mL的人EGF、10ng/mL的人bFGF、1ng/mL的PDGF-AA和1ng/mL的人IGF-1的限定的培養基中，胚狀體在纖連細胞包被的平板上鋪板。胚狀體粘著到平板上，並且細胞開始遷移到塑料上，形成單細胞層。
3天後，觀察到許多具有神經元形態的細胞。神經前體被鑑別為對BrdU摻入、幹蛋白染色和譜系特異性分化標記物缺乏呈陽性的細胞。推定的神經元和神經膠質祖細胞被鑑定為對聚唾液酸化的NCAM和A2B5呈陽性。如通過流式細胞儀測定的，41-60％的細胞表達NCAM，20-66％的細胞表達A2B5。發現NCAM-陽性細胞的亞群體表達β-微管蛋白III和MAP-2。這裡沒有與例如GFAP或GalC的神經膠質標記物的協同定位。A2B5陽性細胞似乎生產神經元和神經膠質。A2B5細胞的亞群體表達β-微管蛋白III或MAP-2，而另一個分離的亞群體表達GFAP。具有神經元形態的一些細胞對A2B5和NCAM進行雙重染色。NCAM陽性和A2B5陽性群體含有的神經元都遠比神經膠質多。
通過在不含促細胞分裂原，但是含有10ng/mL的神經營養蛋白-3(NT-3)和10ng/mL的腦衍生神經營養因子(BDNF)的培養基中將細胞重複鋪板進一步分化細胞群體。約7天後觀察到具有大量突起的神經元。衍生自保存於視黃酸(RA)的胚狀體的培養物比那些衍生自保存於不含RA的胚狀體的培養物(約5％)顯示更多的MAP-2陽性細胞(約26％)。觀察到GFAP陽性細胞呈斑點狀。鑑別到GalC陽性細胞，但是該細胞大而扁平而不具有複雜的突起。
評估神經遞質合成的存在。鑑定到GABA-免疫活性細胞共表達β-微管蛋白III或MAP-2，並具有神經元細胞的形態特徵。鑑定到偶爾有些GABA-陽性細胞不共表達神經元標記物，但卻具有星形膠質細胞樣形態。鑑定到神經元細胞表達酪氨酸羥化酶(TH)和MAP-2。通過用突出小泡蛋白抗體染色鑑定到突出的形成。
在從人的ES細胞的H9細胞系分化的培養物中觀察TH染色。胚狀體保存於10μM的視黃酸中4天，然後在EGF、鹼性FGF、PDGF和IGF中、在纖連蛋白包被的平板上鋪板3天。接著它們在添加了10ng/mL的NT-3和10ng/mL的BDNF的N2培養基中的層粘連蛋白上傳代，並使之進一步分化14天。分化的細胞用4％的多聚甲醛在室溫下固定20分鐘，然後使用抗體對TH顯影，TH是多巴胺能細胞的標記物。
實施例2多巴胺能細胞的富集群體胚狀體培養於具有10μm的視黃酸的懸浮液中4天，然後鋪板於添加了EGF、bFGF、PDGF和IGF-1的限定的培養基中3-4天。接著，通過磁珠分選或免疫淘選將細胞分離為A2B5-陽性或NCAM-陽性富集的群體。
免疫-選擇的細胞保存於添加了10ng/mL的NT-3和10ng/mL的BDNF的限定的培養基中。14天後，25±4％的NCAM-分選的細胞為MAP-2陽性—其中1.9±0.8％的細胞為GABA-陽性，3±1％的細胞對酪氨酸羥化酶(TH)呈陽性用於多巴胺合成的速度限制酶，常常被認為是多巴胺合成細胞的代表。
在對於NCAM分選的細胞群體中，NCAM陽性的細胞不表達神經膠質標記物，例如GFAP或GalC。這些資料表明含有神經元限制前體的群體可從hES細胞培養物直接分離，基本上不含神經膠質前體雜質。
另一方面，對於A2B5分選的細胞具有產生神經元和星形膠質細胞的能力。富集後，細胞放入添加了NT-3和BDNF的限定的培養基中，並使之分化14天。鋪板後最初1-2天內，A2B5富集群體中的細胞開始延伸突觸。兩周後，細胞呈現成熟神經元的形態，並且32±3％的細胞為MAP-2陽性。重要的是，3±1％的MAP-2細胞為TH-陽性，而只有0.6±0.3％具有GABA免疫反應性。這些資料表明可從含有星形膠質細胞和神經元的祖細胞的hES細胞中獲得細胞群體，包括合成多巴胺的細胞群體。
關於獲得TH-表達神經元的條件的進一步詳細的說明如下。胚狀體通過在1mg/mL的膠原酶中培養(37℃，5-20分鐘)傳代32次時從H7細胞系的融合hES細胞產生，刮削培養皿，並將細胞放入非-粘著培養平板中(Costar)。獲得的EB培養於含有FBS和10μM的全-反(all-trans)視黃酸的培養基中的懸浮液中。4天後，收集聚集體並使之沉澱於離心管中。然後吸出上清液，並且聚集體在增殖培養基中(添加N2的DMEM/F12 1∶1，半強度B27，10ng/mL的EGF(RD系統)，10ng/mL的bFGF(Gibco)，1ng/mL的PDGF-AA(R和D系統)，和1ng/mL的IGF(R和D系統))的聚L-賴氨酸和纖連蛋白包被的平板上鋪板。
使EB附著並增殖3天；然後通過胰蛋白酶消化約1分鐘(Sigma)收集並以1.5×105個細胞/孔的密度鋪板於增殖培養基中的聚L-賴氨酸和層粘連蛋白包被的4-孔分室玻片上1天。然後將培養基改為Neural Basal培養基，該培養基添加了B27，以及下面的生長混合物之一·10ng/mL的bFGF(Gibco)，10ng/mL的BDNF，和10ng/mL的NT-3·10ng/mL的bFGF，5000ng/mL的sonic hedgehog，和100ng/mL的FGF8b·僅10ng/mL的bFGF細胞保存於這些條件下6天，隔天飼養。在第7天，培養基改為具有B27的NeuralBasal培養基，添加了如下的混合物之一·10ng/mL的BDNF，10ng/Mld NT-3·1μM的cAMP，200μM的抗壞血酸·1μM的Camp，200μM的抗壞血酸，10ng/mL的BDNF，10ng/mL的NT-3培養物隔天飼養直到第12天，這時固定它們並用抗-TH或MAP-2進行標記用於免疫細胞化學。標記物的表達通過使用40X的物鏡計數3個孔的每一個孔中的4個區域定量。
結果顯示於表1中。最初培養於bFGF、BDNF和NT-3的產生最高比例的TH陽性細胞。
實施例3通過用促紅細胞生成素培養提高多巴胺能細胞的比例在後來的實驗中，胚狀體在聚賴氨酸纖連蛋白包被的加樣孔上鋪板，並用10ng/mL的EGF、1ng/mL的PDGF-AA、10ng/mL的bFGF和1ng/mL的IGF-1培養。第四天，向混合物中添加5U/mL的EPO、700μM的cAMP，或二者。細胞被重新鋪板，並用10ng/mL的BDNF、10ng/mL的NT-3，和任選的EPO、cAMP和200μM的抗壞血酸處理7天。結果顯示於表2中。在這個試驗中培養物中MAP-2陽性的總的細胞比例異常地低。
這些數據提供了最初的證據，即在神經前體細胞衍生的過程中加入cAMP和EPO提高了最終獲得的表達酪氨酸羥化酶的神經元的百分比。Studer等報導在EPO存在或低氧分壓的情況下中腦前體的增殖或分化產生較高數量的多巴胺能神經元(J.Neurosci.207377，2000)。人們認為EPO在含氧量低的條件下具有神經保護作用，推動多能祖細胞趨向神經元通路(Shingo等，J.Neurosci，219733，2001)。這一作用可能是Janus激酶-2和核因子卡巴(NF-KB)之間通訊、Bcl-x(L)表達的正調節、或AP-1(Jun/Fos)通路的活化的結果。在pPS衍生的神經細胞中通過其它方法調節這些通路可模擬EPO的作用。
實施例4hES細胞直接分化為多巴胺能神經元這一研究評估用於分化人的ES細胞成為神經元而不形成胚狀體的各種例子。
開發了一種策略，其中根據同源性和/或功能的重複性將檢驗因子分成幾組(表3)。分組因子提高了組內相關活性在ES細胞群體上將被引發的可能性。假設混合物中的某些因子將引發分化級聯。當分化進行並細胞的受體表達特徵改變時，它們將開始對混合物中的其它因子作出反應。
在整個治療期間持續地提供複雜的因子混合物避免精確地限定如何和何時改變細胞的反應的需要。當混合物被鑑定引起所欲的分化過程時，它可被系統地簡化以獲得最小量的最佳的混合物。進一步檢驗後，最少量的處理可能最終包括一個、兩個、三個或更多所列出的因子，根據依據經驗確定的步驟同時或者依次使用。
如下進行試驗。通過培養於膠原酶IV 5-10分鐘收穫人ES細胞系的單層培養物，然後從平板上刮落細胞。通過研磨將細胞分離，並使其幾乎鋪滿用減少了生長因子的Matrigel預處理的96孔組織培養平板，該平板置於敲除DMEM(Knock DMEN)培養基(Gibco BRL)中，培養基中含有用小鼠胚胎飼養細胞調節了24小時的敲除血清替換物(Knockout Serum Replacement)(Gibco BRL)。鋪板1天後，該培養基為添加了0.5mM的穀氨醯胺、B27補充物(Gibco BRL)和如下文描述的檢驗因子組的神經基礎(Neurobasal)(NB)培養基(Gibco BRL)取代。每天用含有穀氨醯胺、B27和檢驗因子的新鮮神經基礎培養基飼養細胞，飼養11天。
11天後，通過在胰蛋白酶中培養5-10分鐘收穫細胞，在用層粘連蛋白預處理的96孔組織培養平板上以1∶6的稀釋重新鋪板，並每天用含有穀氨醯胺、B27和檢驗因子的新鮮神經基礎培養基再飼養5天。細胞在4％的多聚甲醛中固定20分鐘，並用抗體對早期神經元標記物-β-微管蛋白-III、晚期神經元標記物-MAP-2和酪氨酸羥化酶—一種與多巴胺能神經元有關的酶進行染色。細胞核用DAPI標記，並通過目視檢查定量。結果顯示於表4中。
在另一個試驗中，細胞象前面一樣培養於添加有穀氨醯胺、B27和檢驗因子組的神經基礎培養基中，在第8天時用胰蛋白酶收穫，並重新鋪板5天。結果顯示於表5中。
一些處理範例誘導神經元的直接分化。包括第5組因子的處理(頭蛋白和促濾泡素抑制素)是最有效的。
圖1顯示了使用處理B、處理D和處理F獲得、並對β-微管蛋白-III染色的直接分化的細胞的典型區域。根據形態學和β-微管蛋白-III染色，大約5-12％的細胞是神經元。根據MAP-2染色，其中大約1/3是成熟的神經元。神經元總量的大約2-5％(5-15％的MAP-2陽性神經元)也對酪氨酸羥化酶染色，這與多巴胺能表型一致。
進行隨後的試驗以進一步說明某些因子混合物的作用和分化動力學。
圖2(A)顯示一個試驗的結果，其中TGF-β超家族拮抗物頭蛋白和促濾泡素抑制素用於不同的時間周期。H7細胞系的分會合hES細胞用處理D(除cAMP濃度為700μg外)處理15天。結果表明頭蛋白和促濾泡素抑制素都會促成神經元的分化，並相互協作。頭蛋白明顯地在約1周時(第5-8天)重要，而促濾泡素抑制素在約2周時(第13-15天)重要，最大化的生產成熟神經元而不是小的軸突。
圖2(B)顯示使用表4中含有TGF-β超家族拮抗物的處理混合物的神經元誘導的時程。圖2(C)進一步說明了頭蛋白和促濾泡素抑制素在直接分化中的作用。由第一個條形代表的hES細胞用組1、4、6、7、9、10和11的因子(表3)處理，其中具有700μM的Camp、5U/mL的EPO，加上30ng/mL的FGF-8(組2)。實際上，在缺乏頭蛋白和促濾泡素抑制素的情況下沒有形成β-微管蛋白陽性神經元。然而，僅頭蛋白和促濾泡素抑制素或與視黃酸結合通過神經元誘導的第一步直接誘導hES細胞。假定最初的頭蛋白/促濾泡素抑制素誘導產生神經祖細胞，隨後可通過加入其它因子誘導它形成神經元。
圖2(D)顯示從需要得到多巴胺能神經元的混合物中除去視黃酸(RA)的好處。細胞根據前面描述的處理F(左邊2個條形)或除去視黃酸(右邊2個條形)進行分化。包含視黃酸稍微提高了β-微管蛋白陽性神經元的百分比，但是降低了那些神經元對酪氨酸羥化酶的陽性著色的比例。
實施例5通過系列傳代神經前體的增殖再生本發明的神經祖細胞可在培養物中傳代和擴展，表明它們的一些獨特的和有益的特性。
在一個典型的實施例中，收穫人胚胎幹細胞並放置於懸浮培養物中以在含有20％的FBS加上10μM的視黃酸的基因敲除DMEM中形成胚狀體。4天後，胚狀體在DMEM/F12培養基中在聚-L-賴氨酸/層粘連蛋白包被的平板上鋪板，該DMEM/F12培養基添加了N2添加物、通常量的一半的B27、10ng/mL的人EGF、10ng/mL的人bFGF、1ng/mL的人PDGF-AA和1ng/mL的人IGF-1。
培養細胞3天，通過如下簡單的胰蛋白酶處理收穫細胞。0.53mM的EDTA(Gibco#25300-054)中的0.5mL的0.5％的胰蛋白酶鋪在6孔平板的各個孔中，然後立即從平板上除去。等待15秒鐘後(室溫)，將加有B27添加物的神經基礎培養基放置在加樣孔中，然後除去並離心以回收釋放的細胞(在細胞的1和10％之間)。
6孔平板用1mL/孔的15μg/mL的聚-L-賴氨酸(Sigma#1274)包被，隨後是1mL/孔的20μg/mL的人胎盤層粘連蛋白(Gibco # 23017-015)過夜。從不同的胰蛋白酶化獲得的細胞顆粒在含有B27添加物、10ng/mL的NT-3和10ng/mL的BDNF的神經基礎培養基中重懸浮，並以500,000-750,000細胞/孔在包被的孔上鋪板。
5天後，細胞通過完全胰蛋白酶化回收，計數，並以100,000-500,000細胞/孔在有各種因子混合物存在的新的聚-賴氨酸/層粘連蛋白包被的孔中重新鋪板。使用的濃度如下各種組合的10ng/mL的NT-3、10ng/mL的BDNF、10ng/mL的人EGF、10ng/mL的人bFGF、或10ng/mL的LIF。每周更換三次培養基，每次更換一半以飼養細胞。每7天，細胞被胰蛋白酶化，計數，並在含有相同因子的新鮮培養基中再次傳代。
圖3(A)顯示本試驗的生長曲線。僅在BDNF和NT-3中傳代的細胞約1周後停止了生長，主要分化成神經元。然而，向培養基中加入EGF和bFGF使細胞以前體的形式繼續增殖。這些細胞的標記物特徵顯示於表5中。
因此，在BDNF、NT-3、EGF和bFGF的組合物中傳代的細胞大量地表達神經祖細胞標記物幹蛋白和NCAM。
圖3(B)顯示當僅在BDNF和NT-3中這些細胞被誘導進行最終分化時獲得的結果。在BDNF、NT-3、EGF和bFGF的組合物中傳代的細胞在最終分化時產生更多的神經元，與在分化前較高比例的神經前體一致。
圖4(A)顯示對酪氨酸羥化酶染色陽性的細胞的比例。在檢驗的組合物中BDNF、NT-3、EGF和bFGF的組合物又一次提供了最佳的收穫量。
圖4(B)顯示甚至更多的TH-陽性神經元可通過誘導最終分化生產，這種分化不是僅由BDNF和NT-3誘導，還包括添加的因子，例如NT-4、神經生長因子、抗壞血酸、cAMP和多巴胺(以表3中顯示的濃度)。群體中相當於細胞總量的5％的細胞顯示多巴胺能標記物的表型。
來自H7 hES細胞系的神經祖細胞在含有B27添加物、30％的血清替代物和10％的DMSO的神經基礎培養基中在傳代10次時冷凍(5×105細胞/冷凍瓶)。約6個半月後細胞解凍。解凍的細胞具有許多與它們冷凍前相同的特徵60-80％的β-微管蛋白和MAP-2陽性，約5％的對酪氨酸羥化酶呈陽性。
在一個相關試驗中，細胞呈簇生長和傳代，而不是在培養基上。當接近融合時使用胰蛋白酶從6孔平板中收穫神經祖細胞(約3或4×105細胞/孔)。然後它們以約2.5×105細胞/孔在非粘著的加樣孔中接種，並培養於2mL的含有B27添加物、10ng/mL的BDNF、10ng/mL的EGF和10ng/mL的bFGF的神經基礎培養基中。隨後的一天通過更換一半培養基飼養細胞，並繼續培養4天。然後它們在含有10ng/mL的BDNF和10ng/mL的NT-3但不含有促細胞分裂原的培養基中分化。
本公開中描述的發明的適應是常規優化的問題，並且可在不偏離本發明的精神或下文權利要求的範圍的情況下進行。
權利要求
1.一種體外培養的分化的細胞群體，其特徵在於，所述細胞群體中至少約30％的MAP-2陽性細胞具有它們是靈長類多能幹(pPS)細胞子代的特徵，並具有一個或多個如下特性·它們表達酪氨酸羥化酶；·它們一經活化就釋放多巴胺。
2.一種體外培養的分化的細胞群體，其特徵在於，至少群體所有細胞的約5％具有它們是靈長類多能幹(pPS)細胞子代的特徵，並具有一個或多個如下特性·它們表達酪氨酸羥化酶；·它們一經活化就釋放多巴胺；·它們在帕金森病的黑質紋狀體損傷模型中提供臨床改善。
3.一種體外培養的神經元前體細胞群體，其特徵在於，所述細胞群體中至少約60％的細胞表達A2B5、聚唾液酸化的NCAM或幹蛋白，並用附加的神經營養蛋白3(NT-3)、腦衍生神經營養因子(BDNF)、神經營養蛋白4(NT-4)和神經生長因子(NGF)，但不加入促細胞分裂原培養7天，產生如權利要求1或權利要求2所述的分化的細胞群體。
4.如權利要求3所述的神經元前體細胞群體，其特徵在於，所述細胞群體能在培養物中至少進行20次群體加倍，並且在其20次加倍後，用NT-3、BDNF、NT-4和NGF但不加入促細胞分裂原培養時，保持形成如權利要求1或2所述的分化的細胞群體的能力。
5.一種製造神經細胞的系統，其特徵在於，所述系統包括權利要求1-4中任一項所述的細胞群體和獲得該細胞群體的未分化的pPS細胞系。
6.如權利要求1-4中任一項所述的細胞群體，其特徵在於，所述細胞群體屬於如權利要求5所述的一組細胞群體。
全文摘要
本公開提供了改進的從多能幹細胞獲得神經祖細胞和分化的神經元群體的方法。該技術可用於製造通過至少40次加倍增殖，但卻保持分化成為各種不同神經表型的能力的祖細胞。獲得的細胞群體含有高比例的對酪氨酸羥化酶著色的細胞，這是多巴胺能神經元的一個特徵。可大量生產本發明的神經祖細胞和末端分化的神經元以用於藥物篩選和臨床上重要的神經疾病，例如帕金森病的治療。
文檔編號C12N1/02GK101029302SQ20061010137
公開日2007年9月5日 申請日期2002年6月20日 優先權日2001年6月21日
發明者M·K·卡朋特, J·J·鄧漢姆, M·S·因諾庫馬, S·R·希斯 申請人:傑龍公司