能夠產生抗豬呼吸和生殖系統疾病致病性病毒的免疫應答的疫苗的製作方法

2023-05-20 16:51:26 1

專利名稱：能夠產生抗豬呼吸和生殖系統疾病致病性病毒的免疫應答的疫苗的製作方法
此申請是現已放棄的1992年10月30日申請的系列申請NO.07/969，071的部分後續申請。
本發明涉及一種能夠保護豬免受呼吸系統和生殖系統病毒致病的疫苗，一種防止豬患呼吸和生殖系統疾病的方法，一種生產疫苗的方法，和從一種引起豬呼吸和生殖系統疾病的病毒中獲得的DNA。
近年來，北美和歐洲的豬群易於受到呼吸和生殖系統病毒新毒株的感染(見A.A.S.P.，1991年9月/10月，PP.7-11;TheVeterinaryRecord，1992年2月1日，PP.87-89;Ibid.，1991年11月30日，PP.495-496;Ibid.，1991年10月26日，p.370;Ibid.，1991年10月19日，PP.367-368;Ibid.，1991年8月3日，PP.102-103;Ibid.，1991年7月6日;Ibid.，1991年6月22日，p.578;Ibid.，1991年6月15日，p.574;Ibid.，1991年6月8日，p.536;Ibid.，1991年6月1日，p.511;Ibid.，1991年3月2日，p.213)。所鑑別出的第一個新毒株是一種與所謂的神秘豬病(MSD)或「蘭耳朵症候群」相關的病毒，這種病目前稱作豬不育和呼吸症候群(SIRS)或豬生殖和呼吸症候群(PRRS)。在歐洲，這種病也一直稱作豬流行性流產和呼吸症候群(PEARS)、蘭色流產病、蘭耳朵病(英國)、abortusblau(荷蘭)和SeuchenhafterSpatabortderSchweine(德國)，而且該相應的病毒命名為「Lelystad病毒」。在美國，此病也叫作Wabash症候群，神秘豬病(MPD)和豬疫。有時與PRRS相關的一種疾病是增生性間質性肺炎(PIP)。
在英國、德國、比利時和荷蘭發現有「蘭耳朵病」的暴發流行。在英國的流行曾導致豬展的取消。PRRS的症狀包括食慾不佳(厭食)，低燒(發熱)，四肢紫紺(耳朵顯著呈蘭色)，死產，流產，受影響的同窩仔高死率，小豬先天虛弱和Prematureforrowing。由受影響種豬生育的小豬大多數在48小時內死亡。PRRS臨床症狀包括輕度感冒樣症狀，呼吸急促(「聲重」)，和一種彌散性間質性肺炎。PRRS病毒從與感染動物接觸後有大約2周的潛伏期。這種病毒似乎是一種包裹的RNA動脈病毒(arterivirus)(Ibid.，1992年2月1日)。這種病毒曾在豬肺泡巨噬細胞和CL2621細胞中(Benfieldetal，J.Vet.DiagnInvest.，4127-133，1992;Collinsetal，SwineInfertilityandRespiratorySyndrome/MysterySwineDisease.Proc.，MinnesotaSwineConferenceforVeterinarians，PP.200-205，1991)，和在MARC-145細胞(Joo，PRRSDiagnosis，Proc.，AllenD.LemanSwineConference，VeterinaryContinuingEducationandExtension，UniversityofMinnesota(1993)，2053-55)中成功地生長。Wensvoort等人(MysterySwineDiseaseintheNetherlandsTheIsolationofLelystadVirus.Vet.Quart.13121-130，1991)曾報導了成功地培養了一種能引起SIRS的病毒。
PRRS在美國的出現曾對豬牧業帶來了不利的影響。在加拿大，PRRS的特徵是牝豬的厭食和發熱持續2周，後期流產，死產率增加，小豬先天虛弱和快速腹式呼吸及腹瀉之後繼發新生期死亡。已公開了一些關於引起PRRS的病毒的分離，PRRS感染的診斷方法和抗PRRS病毒疫苗製備方面的工作(見加拿大專利公開NO.2，076，744;PCT國際專利公開NO.WO93/03760;PCT國際專利公開NO.WO.93/06211;和PCT國際專利公開NO.WO93/07898)。
在尋找PRRS致病因素過程中發現的第二個毒株可以引起一種現在稱作增生性和壞死性肺炎(PNP)的疾病。PNP的症狀和引起該症狀的病毒病因學似乎與PRRS及其相應病毒相似，但存在可鑑別的差異。例如，引起PNP的病毒已確信是一種非經典成非典型的豬感冒A病毒(aSIV)。
PNP的主要臨床症狀是發熱、呼吸困難和腹式呼吸。此病影響到不同年齡的豬，但大多數症狀出現在4到16周齡之間的豬上。受影響豬的肺瀰漫性變紅，呈「肉樣」稠度(Collins，A.A.S.P.，1991年9月/10月，PP.7-11)。相對而言，受PRRS影響的豬沒有表現出明顯的發熱，而呼吸症狀主要出現在有肺損傷的新生豬中(小於3周齡)，其特徵是一種彌散性間質性肺炎。
腦心肌炎病毒(EMCV)是引起嚴重間質性肺炎並發嚴重間質性、壞死性和鈣化性心肌炎的另一種病毒。實驗發現EMCV在受影響牝豬中引起生殖系統疾病(Kim等人，J.Vet.Diagn.Invest.，1101-104(1989);Links等人，Aust.Vet.J.，63∶150-152(1986);Love等人，Aust.Vet.J.，63∶128-129(1986))。
近來，在美國中西部地區發現致病性更強形式的PRRS在3-8周齡豬中的發病率有所增加。典型的是，健康的3-5周齡豬在5-7天之後衰弱和發展為疾病。通過常規的病毒鑑別方法對受感染豬組織的檢查已表明豬流感病毒(SIV)、假性狂犬病病毒(PRV)、和豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae)與這種新型的PRRS無關。
本發明主要是涉及一種疫苗，該疫苗能保護豬免受能引起這種新的、更強致病性PRRS的致病因素影響，還涉及這種疫苗的生產和給藥方法，以及編碼能引起這種新型PRRS的感染因子部分基因組的DNA。不過，應當確信在本發明的研製過程中所得到的知識將有益於產生防止豬患任何和/或所有豬呼吸和生殖系統疾病的疫苗和方法。例如，本發明人已經鑑別出與以往公開的PRRS病毒病理學不同的至少一種PRRS病毒的病理學特徵(見下表1)。因此，本發明不一定必須局限於與引起這種新型PRRS的感染因子相關的疫苗和方法，本發明已將該感染因子命名為PRRS病毒(PRRSV)「Iowa株」。
然後，在現有技術中涉及到抗這些豬病毒的有效疫苗的製備曾表現出了悲觀和懷疑態度(TheVeterinaryRecord，1991年10月26日)。現有技術中有人相信人流感疫苗可以產生抗PRRS和PNP作用的保護作用(例如，見Ibid.，1991年7月6日)。儘管如此，一般行政管理部門不主張在食用動物中使用人疫苗，因此，這種方法在實際應用過程中是不可行的(Ibid)。
這些豬生殖和呼吸系統疾病以及如同發生過的它們的一些新變型已經並且將繼續對豬飼養業產生不利的影響。令人驚奇的是在美國和世界各地動物疫苗的市場要比人疫苗的市場大。因此，除了通過防止畜牧業動物患病而帶來的巨大公共衛生效益之外，研製新的獸醫用疫苗還存在一種經濟上的動力。
因此，本發明的一個目的是提供一種新的疫苗，該疫苗能保護豬免受可引起豬呼吸和生殖系統疾病的病毒感染。
本發明的另一個目的還提供了一種能防止豬受PRRSVIowa株感染的疫苗。
本發明的另一個目的是提供了一種疫苗，該疫苗可以產生抗一種能引起豬呼吸和生殖疾病的病毒、尤其是抗PRRSVIowa株的有效免疫應答。
本發明的另一個目的是提供一種防止豬受能引起豬呼吸和生殖系統疾病的病毒感染、尤其是防止豬受PRRSVIowa株感染的新方法。
本發明的另一個目的是提供一種能在豬中產生抗豬呼吸和生殖系統疾病致病性病毒、尤其是抗PRRSVIowa株的有效免疫應答的新方法。
本發明的另一個目的是提供一種抗體，該抗體可與能引起豬呼吸和生殖系統疾病的病毒發生免疫結合，尤其是抗PRRSVIowa株。
本發明的另一個目的是提供一種抗體，該抗體可以與能防止豬受豬呼吸和生殖系統疾病的病毒感染的一種疫苗進行免疫結合。
本發明的另一個目的是提供一種抗體，該抗體可以與一種能防止豬受PRRSVIowa株感染的疫苗發生免疫結合。
本發明的另一個目的是提供一種對患有豬呼吸和生殖系統疾病、尤其是患有因PRRSVIowa株引起疾病的豬的治療方法。
本發明的另一個目的是提供一種對接觸過豬呼吸和生殖系統疾病致病性病毒、尤其是PRRSVIowa株的豬的治療方法。
本發明的另一個目的是提供一種用於檢測可引起豬呼吸和生殖系統疾病(尤其是因PRRSVIowa株引起的疾病)的病毒的診斷藥盒。
本發明的另一個目的是提供一種從引起豬呼吸和生殖系統疾病的病毒或感染因子的，特別是從PRRSV的Iowa株的基因組中分離出來的多聚核苷酸。
本發明的另一個目的是提供一種多聚核苷酸，該多聚核苷酸可以編碼引起豬呼吸和生殖系統疾病的一種病毒或感染因子、尤其是PRRSV的Iowa株的一種或多種蛋白質。
本發明的另一個目的是提供一種多聚核苷酸，該多聚核苷酸可以編碼來源於豬呼吸和生殖系統疾病致病性病毒或感染因子、尤其是PRRSV的Iowa株的一種或多種抗原肽。
本發明的另一個目的是提供一種使用合適細胞系培養豬生殖和呼吸系統病毒或感染因子的一種新方法。
本發明的另一個目的是提供一種使用合適細胞系培養PRRSV的Iowa株的新方法。
本發明的這些和其他目的將通過下面優選實施方案的描述而變得顯而易見，這些實施方案描述了一種能保護豬免受豬呼吸和生殖系統疾病致病性病毒或感染因子感染的疫苗，一種能夠對引起這種豬病的病毒或感染因子產生有效免疫應答的組合物，一種保護豬免受引起這種豬病的病毒或感染因子感染的方法，和編碼引起一種呼吸和生殖系統疾病的病毒或感染因子的一部分基因組的DNA。


圖1是生產一種改進的活疫苗的流程圖;
圖2是一種生產滅活疫苗的方法流程圖;
圖3是一種概括性的生產一種亞單位疫苗的方法流程圖;
圖4是一種概括製備基因工程疫苗的過程流程圖;
圖5和6展示了用從PRRSVIowa株感染的豬中分離的感染因子樣本感染10天後的普通豬肺的組織切片;
圖7展示了感染9天後限菌豬肺的組織切片，所說的感染是用從PRRSVIowa株感染的豬中分離的感染因子樣本進行感染。
圖8展示了用從PRRSV的Iowa株感染的豬中分離的感染因子樣本感染35天後限菌豬的心臟損傷情況;
圖9展示了表現有廣泛合體細胞的支氣管肺泡洗出培養物，它是從感染後9天的限菌豬製備的，所說的感染是用從Iowa株PRRSV(ISU-12;見下面的實驗Ⅰ，(Ⅱ)(C)部分)感染的豬中分離的感染因子的肺過濾樣本進行感染;
圖10是一種包裹病毒顆粒的電子顯微照片，大約70nm的直徑大小，表面小刺較短，此顆粒發現於用Iowa株PRRSV感染因子感染的豬肺泡巨噬細胞培養物中;
圖11是一種多形的、包裹病毒顆粒的電子顯微照片，大約80×320nm大小，並有抗體包裹，此顆粒是從用Iowa株PRRSV感染的豬肺泡巨噬細胞培養物中發現的。
圖12(A)-(C)是展示豬肺泡巨噬細胞(SAM)培養物的一系列照片未感染的(A)，用ISU-12感染的那些培養物中的CPE(B)和用ISU-12感染的那些培養物中的IFA(C)(見下面的實驗Ⅱ);
圖13(A)-(D)是展示PSP-36細胞培養物的一系列照片未感染的(A)，用ISU-12感染後四天的那些培養物中的CPE(B)，用ISU-12感染後5天的那些培養物中的CPE(C)，和用ISU-984，(分離的代表Iowa株PRRSV的第二種病毒)感染5天後的那些培養物中的CPE(D);
圖14(A)-(D)是展示ISU-12感染的PSP-36細胞中IFA的一系列照片未感染的(A)，用ISU-12感染2.5天後並用恢復期血清染色(B)，用ISU-12感染2.5天後並用抗PRRSV多克隆抗體染色(C)和用ISU-12感染感染並用抗PRRSV單克隆抗體染色(D);
圖15是通放射免疫沉澱(RIP)測定的PSP-36細胞中繁殖的ISU-12的一種蛋白測定情況∶泳道1和2是假感染的PSP-36細胞，用抗PRRSV多克隆血清(1)和恢復血清(2)免疫沉澱;泳道3和4是病毒感染的PSP-36細胞，用抗PRRSV多克隆血清(3)和恢復血清(4)免疫沉澱;
圖16是表示構建可引起PRRS的感染株之cDNAλ文庫的一般方法流程圖;
圖17是表示通過特異雜交鑑別Iowa株PRRSV相關感染因子之可靠性cDNA克隆的一般方法流程圖;
圖18(A)-(C)是表示ISU-12核苷酸序列的開放讀框架(ORF′S)，(A);亞基因組mRNA′S，其中方框中的L表示引導序列和(A)n表示基因組3′-末端的多聚(A)尾(B);和用於獲得ISU-123′-末端核苷酸序列的λcDNA克隆，其中以實心標棒表示已測序的區和以虛影標棒表示測序的區(C);
圖19代表Iowa株PRRSV相關感染因子基因組的1938-bp3′-末端序列;
圖20表示由圖19的DNA序列編碼的推斷胺基酸序列;其下面給出的是核苷酸序列;
圖21是Iowa株PRRSV(ISU-12)相關感染因子與Lelystad病毒兩者之間有關其開放閱讀框架-5(ORF-5)部分的核苷酸序列比較;
圖22是ISU-12病毒的ORF-6與Lelystad病毒的ORF-6的核苷酸序列比較;
圖23是ISU-12病毒的ORF-7與Lelystad病毒的ORF-7之間的核苷酸序列比較;
圖24是ISU-12病毒的與Lelystad病毒之間的3′-非翻譯核苷酸序列比較;
圖25表示未感的Trichoplusian卵細胞勻漿(HI-FIVETM，Invitrogen，San Diego，California);
圖26表示用一種含有ISU-12ORF-6基因的具有細胞致病效應的重組杆狀病毒感染的HI-FIVE細胞;
圖27表示用一種含有ISU-12ORF-7基因的具有細胞致病作用的重組杆狀病毒感染的HI-FIVE細胞;
圖28表示用一種含有ISU-12ORF-6基因的重組杆狀病毒感染的HI-FIVE細胞，將其用抗ISU-12的豬抗血清染色，然後用螢光結合的抗豬IgG染色，其中昆蟲細胞正產生一種由ISU-12ORF-6基因編碼的重組蛋白;
圖29表示用一種含有ISU-12ORF-7基因的重組杆狀病毒感染的HI-FIVE細胞，將其用抗ISU-12的豬抗血清染色，然後用螢光結合的抗豬IgG染色，其中昆蟲細胞正產生由ISU-12ORF-7基因編碼的重組蛋白;
圖30表示用ISU-12特異引物對ORF-5(泳道E)，ORF-6(泳道M)和ORF-7(泳道NP)進行PCR擴增的結果，其中泳道SM包括分子量標準，
圖31表示在用BamHI和EcoRI限制酶切割質粒DNA之後，表達含有ISU-12基因組之ORF-5(泳道E)，ORF-6(泳道M)或ORF-7(泳道NP)的重組杆狀病毒轉移載體PVL1393的結果;泳道SM包括分子量標準;
圖32表示ISU-12mRNA的Northern印跡分析;
圖33A和33B表示從Iowa株PRRSV其他分離物(ISU-22，ISU-55，ISU-79，ISU-1894和ISU-3927)中獲得的mRNA的Northern印跡;和
圖34是3周齡、PRRSV-血清陰性、無特異性致病原(SPF)豬的平均肉眼肺損傷分級(按受影響肺的百分數表示)的條形圖，此組豬以本發明一種實施例的疫苗進行鼻內(IN)或肌肉內(IM)給藥，還給出了一組對照豬的條形圖(NV/cHALL)。
本發明中，「豬呼吸和生殖系統疾病」是指上述的疾病PRRS、PNP和EMCV，由Iowa株PRRSV引起的疾病，和已經出現並且將繼續出現的這些疾病的密切相關的變異疾病。
「防止豬患由豬呼吸和生殖系統致病病毒或感染因子所致疾病」的疫苗，如果在給不受影響的獲得使用這種疫苗之後，則不會出現肺損傷或疾病症狀，或者不如感染的不受保護豬的損傷或症狀嚴重，而如果給變影響豬使用這種疫苗之後，肺損傷或疾病的症狀會消失或不如感染的不受保護豬的肺損傷或症狀嚴重。不受影響的豬是指從未接觸過豬呼吸和生殖系統疾病感染因子、或即使接觸過豬呼吸和生殖系統疾病感染因子但沒有表現出疾病症狀的豬。受影響的豬是指表現出疾病症狀的豬。可以對豬呼吸和生殖系統疾病的症狀進行定量或分級(如，體溫/發熱、肺損傷[肺感染組織的百分數])或半定量(如，呼吸窘迫的嚴重程度[下面詳細解釋])
「豬呼吸和生殖系統病毒或感染因子」可引起如上所述的豬呼吸和生殖系統疾病。
引起新的、毒力更強形PRRS的因子已命名為「Iowa」株PRRSV。由「Iowa」株PRSS病毒的某些分離物引起的疾病與其他豬呼吸和生殖系統疾病的症狀相似但比其更嚴重。臨床症狀包括嗜眠、呼吸窘迫、「聲重」(強迫呼氣)、發燒、毛髮粗糙、打噴嚏、咳嗽、眼睛浮腫、和偶髮結膜炎。損傷可以包括肉眼和/或顯微鏡下肺損傷和心肌炎。感染因子可以是單一病毒，或與一種或多種其他的感染因子(如，其他病毒或(細菌)相結合。另外，還發現了毒力差和無毒力形的Iowa毒株，它可以引起一系列的上述症狀或根本不引起症狀，但是仍然可以根據本發明使用它提供一種保護以抵抗豬呼吸和生殖系統疾病。
在各種豬病中的組織損傷是不同的。下面的表Ⅰ對與豬病毒引起的一些疾病相關損傷的生理學觀察和病理學進行了比較
表Ⅰ
豬病毒性肺炎比較病理學
損傷PRRS(p)PRRS(o)SIVPNPPRCVPPMVIowa
II型++++++++++++++++
Inter增厚++++++++++++
肺泡滲出物+++++++++++++++
氣管壞死--++++++++++++-
合胞體-+++/-+++++++
腦炎++++---+++
心肌炎+/-++----+++
其中「PRRS(p)」代表PRRS病毒的公開病理學，「PRRS(o)」代表本發明人觀察到的PRRS病毒的病理學，「SIV」代表豬流感A病毒，「PRCV」代表豬呼吸冠病毒(coronavirus)，「PPMV」代表豬副粘液病毒，「Iowa」是指由本發明人所發現的PRRSV新毒株，「Ⅱ型」是指Ⅱ型肺細胞(它在感染豬中繁殖)，「Inter.」是指間質性，「氣管環死」是指末端氣管壞死，符號(-)以及(+)至(++++)是指如下的相對嚴重程度分級
(-)陰性(未發現)
(+)輕度(剛超過觀察界限之上)
(++)中度
(+++)嚴重
(++++)最嚴重
本發明人已在美國的中西部鑑別出與PRRS相關的PRRSVIowa株。尚未清楚與自然界存在的Iowa株PRRSV相關的疾病是由於一種特異病毒引起，還是由於一種病毒與一種(或多種)其他感染因子結合所致。不過，斑塊純化的Iowa株PRRSV樣本似乎是一種單一的特異性病毒。因此，「該Iowa株PRRSV」是指一種特異性的斑塊純化病毒或一種從感染動物中獲得的或含有一種病毒與一種(或多種)其他感染因子結合物的組織勻漿，而且用Iowa株PRRSV感染的豬表現出如上所述由Iowa株PRRSV所致的一種或多種疾病症狀特徵。
最近的資料表明PRRSV的Iowa株與引起常見PRRS的感染因子有所不同。例如，在表現有PRRSV的Iowa株所致疾病症狀的感染豬中觀察到的損傷比在用常見的以往所述PRRS病毒單獨感染的豬中觀察到的損傷更嚴重，而且患有因PRRSV的Iowa株所致疾病的豬其流感病毒也是血清陰性，包括與PNP相關的病毒也是血清陰性。
關於圖1-4，提供了製備本發明所包括的各種類型疫苗的方法流程圖。所提供的圖1-4的流程圖是為了舉例說明製備本發明疫苗的方法，並不是為了以任何方式限制本發明。
在圖1-4中詳述的每個方法的第一步是鑑別易於感染豬呼吸和生殖系統病毒或感染因子的細胞學。(為了簡化有關疫苗製備的討論，該術語「病毒」含義是指與豬呼吸和生殖系統疾病相關的病毒和/或其他感染因子)。然後製備敏感宿主細胞的主細胞原液(MCS)。將敏感宿主細胞繼續由MCS傳代。從MCS′和MCS+n之間的傳代細胞製備工作細胞原液(MCS)。
在MCS和MCS+n之間，優選在WCS的敏感宿主細胞學上繁殖一種主要種病毒。從表現出與有意義病毒所致之相應疾病症狀的感染豬採取的合適、優選勻漿的組織樣本中通過本領域已知的方法分離粗製病毒。用粗製病毒感染合適的宿主細胞、優選WCS樣本，然後培養。進一步通過本領域已知的方法從感染的、培養的宿主細胞分離和斑塊純化疫苗病毒。優選的是對用於製備疫苗的病毒進行二次斑塊純化。
然後通過本領域已知的方法從斑塊純化的病毒製備主要種病毒(MSV)。然後將MSV(X)在WCS中通過MSV(X+1)，MSV(X+2)，MSV(X+3)，和MSV(X+4)病毒傳代進行至少四次傳代。MSV(X+4)被認為是工作種病毒。優選的是，用於本發明的豬研究和疫苗生產的病毒傳代是MSV(X+5)，第五代傳代的產物。
將工作種病毒與工作細胞原液一起通過已知的方以足夠的量進行培養以製備原型疫苗，優選MSV((X+5)。該原型疫苗可以是適用於獸醫學領域的任何類型。合適的類型包括修飾的活或減毒疫苗(圖1)，滅活的或殺傷的疫苗(圖2)，亞單位疫苗(圖3)，基因工程疫苗(圖4)，和在獸醫疫苗領域中承認的其他類型疫苗。可以通過化學處理或加熱等，以一種普通技術熟練人員已知的方式將殺傷的疫苗滅活。
在圖1-4的每個圖所述方法中，製備原型疫苗之後，通過本領域已知的方法建立豬激發模型和臨床檢測方法。例如，在進行實際疫苗接種/激發研究之前，必須以症狀臨床檢測結果，體徵等概念定義所要預防和/或治療的疾病。如上所述，已經以疾病症狀和體徵的方式對與PRRSV的Iowa株相關的感染因子進行了定義。對與PRRSVIowa株相關的感染因子的分析臨床分析描述見下面的實施例。
在對疾病進行充分定義和特徵化之後，可以給豬施用一種原型疫苗，然後使該豬接觸能致病的病毒或感染因子。在本領域中已知該方法稱為「激發」該豬及其免疫系統。在觀察到接觸病毒或感染因子的激發豬的應答以及分析了該原型疫苗保護豬的能力之後，通過本領域已知的方法進行了效能研究。然後通過本領域已知的方法以分別的步驟建立效能檢測方法，從而產生了準生產系列。
在如圖1所述製備一種修飾活疫苗的過程中，一旦製備一種原型疫苗，首先應當建立最佳的細胞生長條件和病毒產生條件，然後通過本領域已知的方法製備一種預試驗生產(productionoutline)。一旦完成預試驗生產，進一步通過本領域已知的方法製備準生產系列。準生產系列是指一種有希望原型疫苗的大規模生產，它表明了可以生產具有統一標準之系列的能力。製備一種原型活疫苗的一種方法是將病毒感染的細胞(優選主要種病毒感染的細胞)進行一次或多次凍融循環以溶解細胞。可以將冷凍和融化的感染細胞培養物凍幹(冷凍乾燥)以增加其儲存的保藏能力。將其再加水後，該物質可以用作活疫苗。
用於製備滅活疫苗的準許可系列的建立方法(圖2)類似於用來製備修飾活疫苗所用的方法，只有一點基本的修改。使細胞生長條件和病毒產生條件最佳化後，還必須使病毒滅活方案最佳化，才可以製備合適的預試驗生產。病毒滅活方案及其最佳化一般對於本領域的技術人員是已知的，並且可以依據所研究的特定病毒以已知或可預知的方式變化。
亞單位疫苗的製備(圖3)不同於修飾活疫苗或滅活疫苗的製備。在製備原型疫苗之前，必須鑑別出疫苗病毒的保護性或抗原性成份。這種保護性或抗原性成份包括可以在豬中引起特別強的保護性或免疫應答的病毒衣殼蛋白的特定胺基酸片段或碎片(優選是至少5個胺基酸長，特別優選是至少10個胺基酸長);單個或多個病毒衣殼蛋白本身，其寡聚物，和構成病毒亞結構或此亞結構的可鑑別部分或單位的病毒衣殼蛋白的高級聯合;存在於病毒表面之上或附近或存在於病毒亞結構如病毒粒子之中的寡聚糖苷、糖脂或糖蛋白;與病毒相連的脂蛋白或脂基，等。可以通過本領域已知的方法鑑別這些成份。一旦鑑別出，則通過本領域已知的方法進一步純化和/或克隆病毒的保護性或抗原部分(「亞單位」)。
用於亞單位疫苗的準生產系列製備(圖3)除某些修改之外類似於用於滅活疫苗(圖2)的方法。例如，如果該亞單位是通過重組基因技術產生的，可以通過本領域中技術人員已知的方法(見，如，Maniatisetal，「MolecularCloning∶ALaboratoryManual，」ColdSpringHarborLaboratory(1989)，ColdSpringHarbor，Massachusetts一書的相關章節)最佳地表達克隆的亞單位。另一方面，如果所使用的亞單位代表病毒的完整結構特徵，如完整衣殼蛋白，那麼必須使從病毒中將其分離的方法最佳化。在另一種情況中，使滅活方案最佳化之後，可以在製備預試驗生產之前使亞單位純化方案最佳化。
基因工程疫苗(圖4)是以用於製備其他疫苗的一般方法的修改方法開始的。在斑塊純化之後，可以通過本領域中已知的方法，優選通過使用PSP-36或巨噬細胞作為宿主的常規細胞培養方法從合適的組織勻漿中分離野生型病毒。
通過本領域中已知的方法，優選使用商業上可購買的RNA分離藥盒(例如，從Stratagene，LaJolla，California購買的藥盒)，通過胍異硫氰酸鹽方法從生物學上純化的病毒或感染因子中提取RNA，並且通過本領域中的已知方法，優選通過在CsCl梯度中超速離心進行純化。可以通過寡聚(dT)-纖維素柱層析進一步純化或濃縮RNA。
然後將病毒基因組通過本領域中已知的方法(見Maniatis等人，同上)克隆到一種合適的宿主中，並對病毒基因組進行分析以確定該基因組中產生病毒抗原部分的基本區域。之後的方法一般與用於修飾的活疫苗、滅活疫苗或亞單位疫苗的方法相同。
本發明疫苗可以保護豬以抵抗可引起豬呼吸和生殖系統疾病的病毒或感染因子。優選的是，本發明疫苗保護豬以抵抗與PRRSVIowa株相關感染因子。儘管如此，本發明的疫苗還可以期望保護豬抵抗因接觸PRRSVIowa相關感染因子的密切相關變異體而帶來的感染。
相當少的病毒可適用於產生活病毒疫苗。活病毒疫苗的優點是可以在疫苗的受體中激活所有可能的免疫應答，包括系統的、局部的、體液的和細胞介導的免疫應答。活病毒疫苗的缺點是有活的外來因子汙染的可能，如SV40病毒和牛病毒性腹瀉病毒，牛胎血清的一種常見汙染物。這種危險，加上病毒可能會在田間轉為毒性或涉及到胎兒、幼小動物和其他種時沒有被減毒的危險性，遠遠超過了活疫苗的優點之所在。
可以通過用滅活劑如福馬林或疏水溶劑、酸等處理病毒，通過用紫外線或X-線照射、通過加熱等製備滅活的病毒疫苗。滅活是以本領域中可理解的方式進行的。如果一種病毒不能感染易受感染的細胞，該病毒則認為是滅活的。例如，在化學滅活方法中，用足夠量或濃度的滅活劑以足夠高的(或低的，因滅活劑而定)的溫度或PH對含有病毒的合適病毒樣本或血清樣本處理足夠長的時間以滅活該病毒。在足以滅活該病毒的溫度下和足夠長時間下加熱滅活該病毒。照射滅活是使用一定波長的光或其他能量以足以滅活病毒的時間進行。用於人體的滅活疫苗的例子包括流感疫苗、脊髓灰質炎疫苗、狂犬病疫苗和B型肝炎疫苗。用於豬的滅活疫苗的成功和有效舉例是豬細小病毒疫苗。
通過上述圖3中討論的方法從半純化的病毒亞單位製備亞單位病毒疫苗。例如，已經製備出從流感病毒中分離的血凝素和從流感病毒分離的神經氨酸酶表面抗原，並表現出比完整病毒小的毒性。或者，也可以從高度純化的病毒亞單位製備亞單位疫苗。用於人的疫苗例子是人B型肝炎病毒的22-nm表面抗原。人皰疹複合病毒亞單位和用於人的亞單位和用於人的亞單位疫苗的許多其他例子是已知的。
在自然界中可以發現減毒病毒疫苗，而且該疫苗可以有自然發生的基因缺失，或者，也可以通過幾種已知方法，如在細胞培養物成組織培養物中進行連續傳代，製備該疫苗。也可以通過基因缺失或基因突變使病毒減毒。
通過本領域中已知的技術產生基因工程疫苗。這些技術包括使用重組DNA的技術和使用活病毒的技術。例如，可以識別出特定的病毒基因，該基因編碼能在豬中誘導較強免疫或預防性應答的蛋白。可以將這種識別的基因克隆到蛋白表達載體如杆狀病毒載體中，並用於感染合適的宿主細胞(見，如，O′Reillyetal，「BaculovirusExpressionVectorsALabManual，」FreemanScCo.(1992))。培養宿主細胞，從而表達所需的疫苗蛋白，可以將其純化到一種所需的水平，然後用於預防豬患呼吸和生殖系統疾病。
基因工程蛋白可以在昆蟲細胞、酵母細胞或哺乳動物細胞中表達。可以將通過常規方法純化和/或分離的基因工程蛋白直接接種到動物中，以使其預防豬呼吸和生殖系統疾病。將從豬生殖和呼吸系統疾病感染因子或病毒中獲得的包裹蛋白用於疫苗中以誘導中和性抗體。將從豬生殖和呼吸系統疾病感染因子或病毒獲得的核蛋白用於疫苗中以誘導細胞免疫。
優選的是，本發明用一種含有從PRRSV之Iowa株獲得的多核酸的轉移載體轉化一種昆蟲細胞系(HI-FIVE)。優選的是，本發明的轉移載體包含有線性化的杆狀病毒DNA和含有從PRRSV之Iowa株獲得的多核酸的質粒。可以用線性化杆狀病毒DNA和質粒共轉染該宿主細胞系，以便製備重組杆狀病毒，特別優選的是，本發明的多核酸可編碼PRRSV之Iowa株的一種或多種蛋白。
或者，也可以將從豬呼吸和生殖系統疾病感染因子或病毒獲得的編碼一種和/或多種包裹蛋白和/或核蛋白的RNA或DNA插入到活載體中，如痘病毒或腺病毒中，並用其作為疫苗。
因此，本發明進一步涉及從引起呼吸和生殖系統疾病的病毒之部分基因組中分離的多核酸，優選的是從PRRSV之Iowa株的部分基因組分離的多核酸。該術語「多核酸」是指來源於感染因子的RNA或DNA，以及與該RNA或DNA對應或互補的RNA和cDNA。該多核酸可以用作產生本發明疫苗的一種工具，用作篩選或鑑別感染動物的工具，和用作識別相關病毒和感染因子的工具。
在本發明的一個實施例中，該多核酸編碼可引起呼吸和生殖系統疾病的病毒的一種或多種蛋白，優選是編碼病毒膜(包裹)蛋白和衣殼蛋白(核蛋白)之一或二者。特別優選的是，本發明的多核酸是來源於基因組3′-端的一個2kb片段，並且它編碼一種或多種由PRRSVIowa株之基因組的ORF-5和ORF-6編碼的包裹蛋白和/或由該基因組的ORF-7編碼的核蛋白。最優選的是，該多核酸是從與PRRSV之Iowa株相關的感染因子基因組分離的;例如，從下面的實驗Ⅰ-Ⅲ中所述的因子(ISU-12)分離，並且它選自於由ORF5(SEQIDNO13)，ORF6(SEQIDNO15)，ORF7(SEQIDNO18)和ISU-12基因組的1938-bp3′-末端序列(SEQIDNO8)組成的組。
在本申請文件中，由來源於病毒或感染因子的RNA和/或DNA編碼的蛋白或肽，如果其多核酸與編碼免疫原蛋白或肽的多核酸具有90%或更大的同源性，則認為是「免疫學上等同的」。在本申請中的「同源性」是指兩種或多種病毒或感染因子之間相同核苷酸或胺基酸序列的百分率。因此，本發明的另一方面還包括一種與從呼吸和生殖系統疾病致病性病毒基因組獲得的多核苷酸、優選與從PRRSVIowa株相關感染因子的基因組獲得的多核酸具有至少90%同源性的分離的多核酸。
可以通過本文所述方法或本領域中普通技術人員已知的方法，用該病毒基因組的相當短片段的多核酸(大約20bp或更長)來篩選或鑑別感染的動物、和/或識別相關的病毒。因此，本發明的另一方面還包括一種基本上由從呼吸和生殖系統疾病致病性病毒部分基因組獲得的分離片段組成的分離的(而且如果需要，是純化的)多核酸，優選從PRRSV之Iowa株相關感染因子的部分基因組獲得的多核酸，它至少有20個核苷酸長，優選是20至100個核苷酸長。特別優選的是，該分離的多核酸片段是從ISU-12基因組的1938-bp3′-末端序列(SEQIDNO8)獲得的，而最優選的是，它選自於由SEQIDNO1，SEQIDNO2，SEQIDNO3，SEQIDNO4，SEQIDNO5，SEQIDNO6和SEQIDNO7組成的組。
可以通過用一種或多種合適的限制酶消化對應於(互補於)病毒多核酸的cDNA而獲得本發明的分離的多核酸片段，或者使用商業上可獲得的自動多核苷酸合成儀來合成該多核酸。
在本發明的另一個實施方案中，該多核酸編碼一種或多種來源於呼吸和生殖系統疾病性病毒的抗原肽，優選編碼一種或多種來源於PRRSV之Iowa株相關感染因子的抗原肽。如上所述，本發明的多核酸編碼來源於呼吸和生殖系統疾病致病性病毒的一種蛋白的抗原部分，優選編碼來源於PRRSV之Iowa株相關感染因子的蛋白抗原部分，該蛋白抗原部分至少有5個胺基酸長度，特別優選至少10個胺基酸長度。測定該蛋白的抗原部分的方法對於本領域中的那些普通技術人員是已知的。
本發明還涉及由PRRSV之Iowa株的一種或多種ORF編碼的蛋白，優選的是，該蛋白是由選自於下面一組的多核酸序列編碼的，所說的一組序列是SEQIDNo8，SEQIDNo13，SEQIDNo15，SEQIDNo18和SEQIDNo19(還參見SEQIDNo9-12);本發明的蛋白和抗原肽可用於血清學檢驗以篩選接觸過PRRSV、尤其是接觸過PRRSV之Iowa株的豬。
本發明還進一步涉及引起豬生殖和呼吸系統疾病的病毒或感染因子的生物學純樣本，所說的生殖和呼吸系統疾病其特徵是昏睡、呼吸窘迫、被迫呼氣、發熱、毛髮粗糙、打噴嚏、咳嗽、眼睛水腫和偶髮結膜炎。本發明的病毒或感染因子的生物學純樣本的進一步特徵是它可以引起具有下列組織學損傷的豬生殖和呼吸系統疾病肉眼和/或顯微鏡下肺損傷、Ⅱ型肺細胞、心肌炎、腦炎、肺泡滲出物形成和合胞體形成。術語「生物學純的」是指其中所有子代樣本都來源於一個單一父代的病毒或感染因子樣本。通常「生物學純」樣本是在細胞培養中通過三次斑塊純化而獲得的。特別是本發明的生物學純病毒或感染因子是豬生殖和呼吸系統症候群的Iowa病毒株，其樣本已根據布達佩斯條約在美國典型培養物保藏中心(12301ParklawnDrive，Rockville，Maryland20852，U.S.A.)以入藏號VR2385，VR2386，-，-，-和-保藏。
對PRRSV的Iowa株也可以通過對其mRNA的Norther印跡分析進行特徵化。例如，PRRSV的Iowa株可以含有7或9個mRNA，也可以在其中有缺失。特別是，正如下面實驗中所述的，PRRSV的Iowa株的mRNA可以含有多達4個缺失。
本發明還涉及一種預防豬患病毒感染的組合物，它包括一定量的本發明疫苗，所說的一定量是指能有效地激發對引起豬生殖和呼吸系統疾病的病毒的免疫應答，組合物還包括一種生理學上可接受的載體。
有效量的本發明疫苗是指能夠激發對該疫苗的足夠免疫應答的量，以保護曾接觸過引起豬生殖和呼吸系統疾病或相關疾病的病毒的豬。優選的是，對豬的保護程度應當是所要預防的疾病的一種至所有異常生理症狀或效應(如肺損傷)需得到顯著的減少。
該組合物可以是單劑量給藥或重複劑量給藥。劑量單位可以含有，如，1-1，000微克的基於病毒的抗原(疫苗)，但不應含有足以能引起付作用或感染生理症狀量的基於病毒的抗原。確定有效抗原成份合適劑量的方法在本領域中是已知的。
含有本發明疫苗的組合物可以與佐劑聯合給藥。佐劑是指一種在與本發明疫苗結合使用時可以增加對本發明疫苗免疫應答的物質。佐劑可以與疫苗在相同時間和相同部位給藥，或者在不同時間給藥，例如，作為一種加強劑給藥。較好的是佐劑也可以以疫苗給藥的方式、位點或部位不同的方式、位點或部位對動物給藥。佐劑包括氫氧化鋁、硫酸鋁鉀、從大腸桿菌分離的熱不穩定性或熱穩定性腸毒素、霍亂毒素或其B亞單位、白喉毒素、破傷風毒素、百日咳毒素、佛氏不完全佐劑、佛氏完全佐劑等等。對於毒素類佐劑、如白喉毒素、破傷風毒素和百日咳毒素，可以在使用之前進行滅活，例如用甲醛處理滅活。
本發明還涉及保護豬免受豬呼吸和生殖系統疾病致病病毒感染的方法，包括給需要預防這種病毒感染的豬使用有效量的疫苗以激發抵抗這種病毒的免疫應答。所說的「保護豬免受感染」以抵抗豬呼吸和生殖系統病毒或感染因子，其含義是指將本疫苗給豬施用後，該豬與對照(未感染的)豬比較表現出減少的(不太嚴重的)或沒有與相應疾病相關的臨床症狀(如發熱)。可以對臨床症狀進行定量(如，發燒、抗體量、和/或肺損傷)，或半定量(如，呼吸窘迫的嚴重程度)。
在本發明中，已建立了用於測定受影響豬中呼吸窘迫的系統。本發明的臨床呼吸評分系統按如下等級評價受影響豬的呼吸窘迫
0＝無疾病;正常呼吸
1＝當豬緊張應激時(被迫的大量和/或加速呼吸)輕度呼吸困難和呼吸急促
2＝當豬在休息狀態時輕度呼吸困難和呼吸急促
3＝當豬在應激狀態時中度呼吸困難和呼吸急促
4＝當豬在休息狀態時中度呼吸困難和呼吸急促
5＝當豬在緊張應激時嚴重呼吸困難和呼吸急促
6＝當豬在休息狀態下嚴重呼吸困難和呼吸急促
在這種臨床呼吸評分系統中，「0」分是正常，並表示該豬沒有受到豬呼吸和生殖系統疾病的影響。「3」分表示中度的呼吸疾病，而「6」分表示非常嚴重的呼吸疾病。如果以疫苗或組合物給藥激發的一組豬表現出其平均臨床呼吸得分低於沒有給以疫苗或組合物激發的一組相同的豬，那麼則認為一定量的本疫苗或組合物是有效的。(當一頭豬接觸一定濃度的足以在未接種疫苗動物中引起疾病的感染因子時，被認為是「被激發的」)。
優選的，本發明疫苗組合物是在尚未接觸能引起生殖或呼吸系統疾病的病毒時直接給豬施用。本疫苗可以口服或非腸道給藥。非腸道途徑給藥的例子包括真皮內、肌肉內、靜脈內、腹膜內、皮下和鼻內途徑給藥。
如果以溶液形式給藥，本疫苗可以製備成水溶液、糖漿、酏劑或酊劑的形式。這種製劑在本領域中是已知的，可以通過將抗原和其他合適的添加劑溶解在合適的溶劑系統中而製備。這種溶劑包括水、鹽、水、乙醇、乙二醇、甘油、A1液等。本領域已知的添加劑包括人工色素、調味劑、甜味劑和抗微生物防腐劑，如硫汞撒(乙基汞硫代水楊酸鈉)。例如，可以加入部分水解的明膠、山梨醇或細胞培養基來使該溶液穩定，並且可以通過本領域已知的方法，使用本領域中已知的試劑如磷酸氫鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫鉀和/或磷酸二氫鉀來緩衝該溶液。
液體製劑還可以包括懸浮液和乳濁液。對於懸浮液的製備，例如，使用一種膠體磨;對於乳濁液的製備，例如使用一種勻化器，在本領域中是已知的。
設計用於注射入體液系統內的非腸道劑型需要合適的等滲性和緩衝到豬體液體相應水平的PH。非腸道劑型在使用前也必須滅菌。
如需要可用氯化鈉和其他鹽調節等滲性。可以使用其他溶劑，如乙醇或丙二醇來增加組合物成份的溶解度和溶液的穩定性。在本製劑中可以使用的另一些添加劑包括葡萄糖、常用抗氧劑和常用螯合劑如乙二胺四乙酸(EDTA)。
本發明還涉及生產本疫苗的方法，包括下列步驟
(A)收集可引起豬呼吸和生殖系統疾病的病毒或感染因子，和
(B)以選自下列一組中的一種方式處理該病毒或感染因子(ⅰ)斑塊純化該病毒或感染因子，(ⅱ)在足以滅活該病毒或感染因子的溫度和時間條件下加熱該病毒或感染因子，(ⅲ)將病毒或感染因子與一足夠滅活該病毒或感染因子量的化學滅活劑接觸或混和，(ⅳ)將該病毒或感染因子分解成相應的亞單作並分離出至少一種亞單位，和(ⅴ)合成或分離編碼該病毒或感染因子表面蛋白的多核酸，用該多核酸感染合適的宿主細胞，培養該宿主細胞，並從培養物中分離該表面蛋白。
優選的是，通過下列步驟從培養基中收集該病毒或感染因子(ⅰ)沉澱感染的宿主細胞，(ⅱ)溶解沉澱的細胞，和(ⅲ)在進行下一處理步驟之前離心該病毒或感染因子。特別優選的是，在收集之前先將用該病毒或感染因子感染的宿主細胞在合適的培養基中進行培養。
優選的是，在培養感染的宿主細胞之後，向培養基中加入足夠沉澱感染細胞量的常用聚(乙二醇)(PEG)溶液來沉澱感染的宿主細胞。可以通過離心進一步純化沉澱的感染細胞。然後通過本領域中普通技術人員已知的方法溶解該沉澱的細胞。優選的是，通過反覆冷凍和融化(特別優選的是進行三次冷凍和融化循環)來溶解該細胞。溶解的沉澱細胞釋放出病毒，然後進行收集，優選是通過離心收集。可以通過在CsCl梯度中離心來分離和純化該病毒，然後從CsCl梯度中回收含有合適病毒的帶。
或者，也可以將感染的細胞培養物冷凍和融化以溶解細胞。可以用冷凍和融化的細胞培養物直接用作活疫苗。不過優選的是，將冷凍和融化的細胞培養物進行凍幹(用於保存)，然後使用時加水製成疫苗。
該培養基可以含有足以允許該病毒感染細胞生長之濃度的，本領域中認可的緩衝鹽水、基本營養源和合適的碳源和氮源。合適的培養基包括Dulbecco′s最低基礎培養基(DMEM)、Eagle′s最低基礎培養基(MEM)Han′s培養基、199培養基、胎牛血清和其他支持病毒感染細胞生長的等同培養基。該培養基可以補充胎牛血清(達10%)和/或L-穀氨醯胺(達2mM)，或其他合適的添加成份，如常規的生長補充成份和/或抗生素。優選的培養基是DMEM。
優選的是，可以從在合適細胞系中培養的病毒或感染因子製備本發明疫苗。該細胞系優選是PSP-36或能被病毒感染並能培養的等同細胞系，等同於PSP-36的一種代表性細胞系是細胞系PSP-36-SAH，它已經根據布達佩斯條約在美國典型培養物保藏中心(12301ParklawnDrive，Rockville，Maryland20852，U.S.A.)於1992年10月28日保藏，保藏號為CRL1117.1。另一種等同細胞系是MA-104，可從WhittakerBioproducts，Inc.(Walkersville)，Maryland)購買到。初步結果表明與PRRSV的Iowa株相關的感染因子可以在豬陀螺狀細胞中培養。斑塊純化之後，與PRRSV之Iowa株相關的感染因子引起損傷，其特徵列於上表Ⅰ的「Iowa」條下，如圖5-8所示。
因此，本發明還涉及一種培養病毒或感染因子的方法，優選的是在選自由PSP-36和能被病毒感染並能培養的等同細胞系組成的組中的一種細胞系中培養。根據本發明培養病毒成感染因子的方法包括感染細胞系PSP-36或一種能被引起豬呼吸和生殖系統疾病的病毒或感染因子所感染並能培養的等同細胞系，然後在合適的培養基中培養感染的細胞系。
優選的是，該病毒或感染因子是PRRSV的Iowa株，或其引起選自PRRS、PNP和相關疾病一組中的疾病。特別優選的是，本疫苗是從PRRSV的Iowa株製備，並在PSP-36細胞中培養的。
該細胞系MA-104是從猴腎細胞獲得的，並且是上皮樣細胞。MA-104細胞在含有Dulbecco′s最低基礎培養基和10%FBS(胎牛血清)的培養盤中形成一個融合單層。當單層形成時，用從一種感染豬的合適組織(如肺和/或心臟)獲得的10%勻漿組織樣本接種該細胞。優選的是含有合適的抗生素，以允許病毒和宿主細胞的生長而抑制除宿主細胞外的其他細胞(如細菌或酵母)的生長和/或存活。
PSP-366和MA-104兩種細胞都可以使PRRS病毒的某些分離物生長至高滴度(超過107TCID50/ml)。PSP-36和MA-104細胞也能使與PRRSV的Iowa株相關的感染因子生長。MA-104細胞還可以使輪狀病毒(rotaviruses)、脊髓灰質炎病毒、和其它病毒生長。
CL2621細胞據信是一種非豬來源的上皮細胞，並且是專買的(Boehringer-Mannheim)。與PSP-36和MA-104不同的是某些引起PRRS的病毒樣本尚未在CL2621細胞中成功地培養(Bauristaetal，AmericanAssociationofSwinePractitionersNewsletter，432，1992)。
CL2621的基本特徵是它是非豬來源的，並且是上皮樣的細胞，在MEM培養基中生長。不過，Benfield等人(J.Vet.Diagn.Invest.，1992;4127-133)曾報導了可用CL2621細胞繁殖PRRS病毒，而用MA-104細胞控制脊髓灰質炎病毒的繁殖，因此推論出CL2621與MA-104不相同，並且推論相同的細胞也許不能繁殖兩種病毒。
與PRRSV的Iowa株相關的感染因子一般不能在除PSP-36、PSP-36-SAH和MA-104以外的其他細胞系中生長。儘管如此，如上所述，曾報導某些引起PRRS的病毒在CL2621和初級豬肺泡巨噬細胞中生長，而PRRS病毒的某些株不在PSP-36、MA-104或CL2621細胞中生長。
可以用本發明疫苗製備一種可以為接觸過病毒或感染因子的患者(本申請中是豬)提供免疫抵抗力的抗體。本發明所包括的抗體在免疫學上可與下面兩種的任何一種結合(1)一種保護豬以抵抗可引起呼吸和生殖系統疾病的病毒或感染因子的疫苗或(2)豬呼吸和生殖系統病毒或感染因子本身。還可以用本發明抗體作為一種診斷試劑以確定豬是否曾接觸過呼吸和生殖系統病毒或感染因子，而且可用於製備本發明疫苗。可以通過已知方法用該抗體製備免疫親合柱，並且可以用這種免疫親合柱分離病毒或感染因子，或其蛋白。
為了激發抗這種疫苗或病毒的抗體，應當用用於製備該疫苗的蛋白免疫合適的宿主動物如小鼠、兔子或用於這種接種的其他動物。然後用一種上述類型的疫苗免疫(注射)該宿主動物，可以選擇性地使用一種免疫增強劑(佐劑)，如上所述的那些。優選以特定的間隔時間進一步免疫該宿主動物1至5次，時間間隔優選是每1至4周，最優選是每2周。然後處死該宿主動物，收集其血液。通過已知方法從收集的全血中分離血清。該血清含有抗該疫苗的抗體。還可以通過已知的方法純化抗體以提供免疫球蛋G(IgG)抗體。
本發明還包括抗本發明疫苗和/或病毒的單克隆抗體。可以通過Kohler等人(Nature，Vol.256(1975)，495-497頁)的方法製備單克隆抗體。基本的方法是，將從免疫宿主動物(上述)脾臟完整細胞製劑中獲得的免疫細胞通過常規方法與骨髓瘤細胞融合以產生雜交瘤。培養雜交瘤，並用攜帶有感染因子(病毒或疫苗)的液體或接種物篩選所產生的培養液。將雜交瘤引入到宿主動物的腹膜內產生該雜交瘤的腹膜生長物。收集宿主動物的腹水溶液可以提供一種由雜交瘤產生的抗該感染因子的單克隆抗體樣本。也可以將從雜交瘤細胞培養物獲得的上清液用作該單克隆抗體的來源，並通過本領域中普通技術人員已知的方法分離。優選的是，本發明的抗體是IgG或IgM型的免疫球蛋白。
本發明還涉及一種患有呼吸和生殖系統疾病的豬的治療方法，包括給需要治療的豬使用有效量的在生理可接受載體中的抗體，該抗體可與引起豬呼吸和生殖系統疾病的病毒免疫結合，或與能保護豬抵抗豬呼吸和生殖系統病毒感染的疫苗免疫結合。
本發明方法還涉及一種用於檢測可引起豬呼吸系統疾病、豬生殖系統疾病或豬生殖和呼吸系統疾病的病毒的診斷藥盒，它包括上述的本發明抗體和一種指示與所說抗體發生陽性免疫反應的診斷試劑。
本發明的診斷藥盒優選是基於對已知免疫螢光檢測(IFA)、免疫過氧化物酶檢測(IPA)和酶聯免疫吸附檢測(ELISA)方法的修改。
在IFA中，用丙酮和甲醇溶液固定感染的細胞，將感染豬的恢復期血清抗體與感染細胞一起孵育，優選在37℃下保溫約30分鐘。出現的陽性免疫反應是該抗體可結合病毒感染的細胞，但不能被進一步的洗滌步驟(通常用PBS緩衝液洗3次)洗掉。然後加入用螢光試劑(FITC)標記的第二種抗體(一種抗-抗體)並孵育，優選是30分鐘。陽性免疫反應可引起第二種抗體與第一種抗體的結合，洗滌後被保留下來，並產生螢光信號，對該信號可以進行檢測和半定量。陰性免疫反應可產生很小或不產生抗體與感染細胞的結合。因此，螢光標記的第二抗體不能夠結合，螢光標記被洗掉，與合適的陽性對照相比較檢測出很小或沒有螢光。
IPA和ELISA藥盒與IFA藥盒相似類，不同的是用一種特異性酶替代螢光試劑來標記第二抗體。因此，當加入一種結合到第二抗體上的酶的合適底物時，可產生一種著色產物，這種產物可以通過例如比色法進行檢測和定量。
在進行下面實施例的描述過程中本發明的其他特徵將更為顯而易見，這些實施例只是為了說明本發明，而不是傾向於限制本發明。
實驗1
在實施例1中，對5-8周齡豬的地方性肺炎進行了研究。在豬中觀察到的PRRSV之Iowa株的顯微鏡損傷與病毒病因學是一致的。(因此，在下文中，為了使討論更簡便，該術語「病毒」和「病毒的」是指本發明上述含義中的病毒或感染因子，或其特徵)。使用從感染豬中分離的並通過0.22μm濾器過濾的肺勻漿將該疾病實驗性地轉移到普通和限菌豬上。沒有表現出常見的豬病毒性呼吸病理改變。在細胞培養物中通過電子顯微鏡觀察到兩種類型的病毒顆粒。一種類型大約直徑是70nm，並且被包裹，具有短的表面小刺。另一種類型是被包裹的、細長的和多形的，大小為80×320nm，並且有抗體包裹。
(Ⅰ)機料和方法
(A)從感染有自然發生肺炎的豬獲得的材料
從SorthwesternIowa的一個有900頭包括從種豬產仔到肉食豬的豬群中選三頭感染的6周齡豬取其組織進行研究。對該豬群的早期觀察發終斷級5到7天之後，50-70%的類似感染豬變得食慾不佳，毛髮粗糙，昏睡，咳嗽，發熱和「聲重」。大約10-25%的感染豬有結膜炎。大部分感染豬在7-10天內恢復，但是，10-15%由於二次細菌感染導致嚴重的發育不全，而不適合於作為肉食出售。在此豬群中疾病開始暴發時就出現豬生殖系統疾病，包括死產率增加，乾癟胎兒，和不育症，但隨著時間的推遲會慢慢消失。在哺乳期發生的呼吸系統疾病會一直持續下去。
在從4頭不同的6周齡豬獲得的福馬林固定組織中觀察到以增生性細支氣管炎和肺泡炎為特徵的肺損傷。試圖分離SIV、假性狂犬病病毒(PRV)和腦心肌炎(EMCV)沒有成功。對於冷凍肺切片，免疫螢光檢查豬流感病毒(SIV)、假性狂犬病病毒(PRV)和豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae)是陰性。從鼻腔中分離出了D型出血敗血性巴斯德菌(Pasteurollamultocida)，而從肺中分離出了豬副流感嗜血桿菌(Haemophilusparasuis)。
從該豬群中進一步獲得已斷奶10天的5頭急性發作的5-6周齡豬。所有的豬體溫至少40.5℃。對這些豬進行屍檢，收集從具有大多數表現為典型疾毒性肺炎肉眼損傷的豬中獲得的肺組織樣本，並製備該樣本以用於立即接種到沒有常見特異性病原體(SPF)的豬中。對從全部5頭急性發作的5-6周齡豬中獲得的肺、肝、腎、脾、腦、和心臟組織樣本進行普通細菌和病毒病原體的培養。收集相同組織的切片，在10%中性緩衝的碎爾馬林中固定以進行組織病理學檢查。
(B)在普通豬中的實驗性傳染
(1)實驗豬
從沒有支原體、PRV、豬呼吸冠狀病毒(PRCV)、和可傳染性胃腸炎病毒(TGEV)的豬群中獲得十六頭5周齡的豬。將8頭豬置於兩個分離的4×5米的房間裡，該房間有混凝土地板和自動通風設施。給豬餵18%蛋白玉米大豆定量餐和隨意的水。
(2)實驗設計
在對患有自然發生的肺炎的豬進行屍檢後後馬上在Dulbecco′s修飾的Eagle′s最低基礎培養基中製備10%肺勻漿，以1000xg離心10分鐘澄清，然後再以10，000xg離心10分鐘。使澄清的上清液通過0.22μm濾器過濾。用5ml過濾的肺勻漿通過鼻內接種8頭豬。用從正常未感染的限菌豬中按上述製備的5ml過濾肺勻漿鼻內接種8頭對照豬。
每天監測臨床症狀和溫度並記錄。分別在接種後(DPI)5、7、10和15天時使每組中的一頭豬進行安死術，並屍檢。在屍檢時收集組織以用於需氧和厭氧細菌分離法，支原體分離，檢測有關豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae)、SIV、PRV、副流感病毒3型(PI-3)和牛呼吸合胞體病毒(BRSV)的抗原，以及用於病毒分離。在10%中性緩衝的福馬林中固定組織以用於組織病理學檢查。在使之死亡的時候用福馬林浸泡以固定肺。
(C)在限菌豬中的實驗性傳染
(1)實驗豬
將8頭初乳即斷奶的、剖腹產的(CDCD)雜交種1天齡限菌豬隨機分入兩個隔室(每個隔室4隻豬)。以一種鐵強化的、無菌、罐裝液體牛奶代用品(SPF-LAC，Pet-AgInc，Elgin，Illinois)飼養這些豬。
(2)實驗設計
用過濾的(0.22μm)肺勻漿鼻內(3ml)和口服(1ml)接種3天齡的四隻主要豬。該過濾物是從感染後(DPI)7天收集的實驗感染的普通豬肺製備的。用從正常限菌豬中製備的肺勻漿接種四頭對照豬。
分別在感染後(DPI)5、9、28和35天殺死每組中的一頭豬。收集肺、肝、腎、腦、脾、胸腺、鼻甲、心臟和小腸組織，並用10%中性緩衝的福馬林固定以用於組織病理學檢查。收集肺、腦、脾和心臟用於病毒分離。收集肺、肝、和脾用於細菌分離。將肺組織立即收集到Friis培養基中用於支原體分離或在-70℃冷凍。
(D)微生物檢測
(1)病毒分離
將以1000xg澄清的組織懸浮液(10%W/V)接種到細胞單層上並觀察細胞病作用。使用初級胎豬腎培養物、初級豬肺泡巨噬細胞培養物和建立的細胞系PK15、牛鼻甲、幼倉鼠腎(BHK)、Vero和豬試驗物(ST)試圖分離病毒。從感染的和對照的限菌豬中製備直接支氣管肺泡洗出培養物。通過間接免疫螢光使用抗豬細小病毒(PPV)、SIV、牛病毒性腹瀉病毒、血細胞凝集腦脊髓炎病毒(HEV)、TGEV和EMCV的參考限菌超免疫或恢復期豬血清以試圖檢測病毒，通過尿囊內接種10天齡胚胎雞卵使過濾物盲目地傳代三次，每次傳代之後測定尿囊液的血細胞凝集活性。
(2)支原體分離
將肺懸浮液接種到支原體肉湯培養基Friis(Friis(1975)，ActaVet.Scand.，27，337)、BHI-TS、D-TS(Rossetal(1971)，JournalofBacteriology，103，707)和BHL(Yamamoto等人(1982)，Proc.Int.PigVet.SocietyCongress，P.94)中。當出現明顯生長或在第3、7、14和21天時對培養物進行傳代培養，並通過外免疫螢光進行鑑別。(DelGiudiceetal(1967)，JournalofBacteriology，93，1205)。
(3)細菌分離
將鼻甲試抹樣本接種到兩個血液瓊脂平板上以及接種到 MacConkey，Tergitol-7和PMD(以用於分離P.multocida)瓊脂上。在CO2和H2的厭氧環境下於37℃下保溫一個血液瓊脂幹板。用一種表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)滋養菌落在第二種平板上交叉找線，並與其他平板在37℃通氣下保溫。
肺組織是完全以鼻甲試抹物形式平板培養的。在2個血液瓊脂平板(需氧和厭氧)和一個Tergitol-7平板上培養肝和脾組織。所有細菌分離物通過標準方法進行鑑別。
(Biberstein(1990)，InDiagnosticProceduresinVeterinaryBacteriologyandMycology，ed.Carteretal，5thed.，pp.129-142，AcademicPressInc.，SanDiego，Cal.;andCarter(1990)InDiagnosticProceduresinVeterinaryBacteriologyandMycology，ed.CarterG.R.andColeJ.R.，5thed.，pp.129-142，AcademicPressInc.，SanDiego，Cal.).
(4)血清學
用血清中和試驗測定抗PRV、TGEV和EMCV的血清抗體。用血液凝集抑制試驗檢測抗EMCV和HEV的血清抗體。用間接免疫螢光試驗檢測抗BRSV、PI-3、SIV和TGEV的血清抗體。測定限菌血清中的抗PRRSV抗體。通過使用細胞系CL2621的間接免疫螢光檢測來測定PRRSV抗體。
(Ⅱ)結果
(A)自然發生肺炎
從急性發作的豬獲得的肺沒有完全損壞。肉眼觀察，肺組織有中度小葉間水腫，並且多發性地形成涉及所有肺葉的肺不張融合線性區。顱側和中肺葉有5-15%的顱前側實變。
病理組織學檢表明有中度、急性擴散性增生性細支氣管炎和肺泡炎。發現有輕度的多發性淋巴漿細胞心肌炎。在其他器官中沒有發現損傷。
試圖從原始發作期以及後來從豬群中獲得的急性發作的豬中分離腺病毒、PRV、SIV、HEV、豬呼吸冠狀病毒(PRCV)、豬細小病毒(PPV)、EMCV和腸道病毒，結果病毒分離為陰性。對冷凍肺切片進行免疫螢光檢查沒有發現豬肺炎為支原體、SIV、豬呼吸合胞體病毒(BRSV)、副流感病毒-3(PI-3)、PRV或TGEV抗原。
上述(Ⅰ)(A)部分中的5頭普通SPF豬之一來源的血清在1∶20稀釋度時通過間接免疫螢光發現它可與PRRSV發生陽性免疫反應。從這種豬的鼻甲和肺中分別分離出了D型出血敗血性巴斯德菌(Pasteurellamultocida)和豬副流感嗜血桿菌(HaemophilusParasuis)。選擇用於勻漿和接種的急性受影響的豬肺中沒有分離出需氧或厭氧細菌(見方法和材料，上述的(C)(2)部分)。
(B)普通豬研究
感染後7天(7DPI)，所有的主要豬發燒40-41.1℃，並且有中度呼吸窘迫。這些豬食慾不佳和嗜睡，感染後15天，這些豬恢復。
肺臟的肉眼觀察變化其特徵是沒有完全衰弱、輕度小葉間水腫和表現有涉及20-40%肺的多發性肺不張灰褐色線性區。
對感染後7天的肺組織顯微鏡檢查發現有斑塊間質性肺炎，其特徵是Ⅱ型肺細胞增生，在肺泡腔中有炎性細胞和壞死血細胞碎片混合聚集，並且在肺泡間隔有世噬細胞和淋巴細胞浸潤。肺泡腔內含有蛋白性液體。有時，在肺泡腔和間隔中發現合胞體樣細胞。
圖5表示的是用蘇木素-曙紅染色的感染後10天普通豬的肺組織切片。在肺泡空間(箭頭頂部)中有廣泛性的Ⅱ型肺細胞增殖(箭頭)和壞死細胞碎片。在第10天觀察到的損傷狀況和表現與第7天所觀察的結果相似。
圖6表示的是用蘇木素-曙紅染色的感染後10天普通豬的肺組織切片。在肺泡空間有合胞體樣細胞(箭頭)存在。與第7天相比在第10天觀察到的Ⅱ型肺細胞增殖更明顯，合胞體更多。
在感染後15天損傷及表現出中等嚴重，但豬的臨床症狀表現為正常。從肺中沒有分離出細菌或支原體。試圖分離EMCV、PRV、PRCV、腺病毒和SIV病毒，結果為陰性。對冷凍肺切片的免疫螢光檢查沒有發現BRSV、PI-3病毒、PRV、SIV、TGEV或豬肺炎支原體抗原。
在對照豬中沒有發現肉眼或顯微鏡損傷。
(C)限菌豬研究
在感染後5天所有接種的主要豬表現了嚴重的呼吸窘迫和「聲重」。體溫是40.5℃或更高，並且這些豬食慾不佳和嗜睡。感染後8天這些豬臨床症狀改善，感染後15天表現為臨床正常。沒有豬死亡。用保持為臨慶正常的正常肺勻漿過濾物接種對照豬。
感染5天後的肉眼觀察損傷其特徵是肺臟沒有完全衰弱、輕度多發性紅褐色肺不張和輕度小葉間水腫。顯微鏡下，有輕度擴散性間質性肺炎，伴有肺泡間隔的單核細胞浸潤多病灶區和中度的Ⅱ型肺細胞增生。在肺泡腔中有炎性細胞、壞死細胞碎片和蛋白性液聚集。在其他器官中沒有發現損傷。
感染後9天，肺臟沒有衰退、有中度小葉間水腫和堅實的紅褐色肺不張多發性1-3cm區。圖7表示的是用蘇木素-曙紅染色的感染9天後限菌豬的肺組織切片。有中度的Ⅱ型肺細胞增生(箭頭頂部)和合胞體樣細胞形成(箭頭)。顯微鏡下，該損傷類似於感染後5天觀察到的結果，不同的是Ⅱ型肺細胞增殖更明顯，在肺泡間隔和腔內有中等數量的合胞體樣細胞。腎臟中腎小管擴張，有些含有淋巴漿細胞滲出物和細胞碎片。
感染後28天，有20%的涉及頂葉和中葉的顱前側兩邊肺不張，而其他肺葉有局部的1-2cm肺不張區。顯微鏡下，肺損傷類似於感染後9天觀察到的結果。另外，還有輕度的細支氣管周圍和小動脈周圍淋巴漿細胞聚焦。輕度至中度的淋巴細胞和漿細胞浸潤多發性地存在於脈絡叢、腦脊膜、心肌和鼻甲中。
圖8表示的是感染後35天，肺損傷嚴重程度減輕，但多發性淋巴漿細胞性心肌炎明顯。試圖分離PRV、SIV、腺病毒、EMCV、HEV、PPV、腸病毒和PRCV，沒有成功。在豬肺泡巨噬細胞中觀察到細胞病效應，其特徵是細胞變圓、溶解和細胞死亡。在圖9中表示的是表現有廣泛合胞體的直接支氣管肺泡洗出培養物，這些結果在從對照豬中製備的類似培養物中沒有觀察到。通過負染色免疫電子顯微鏡檢查這些培養物發現有兩種類型的病毒樣顆粒。一種類型如圖10所示是大約直徑70nm，被包裹的，並有短的表面小刺。另一種類型，如圖11所示，是包裹的，多形的，大約80×320nm，並有抗體包裹。從肺、肝、脾或腦組織中沒有分離出細菌。
在感染後28天和35天收集的血清對SIV、EMCV、PRV、TGEV、BRSV、HEV或PI-3病毒沒有抗體滴度這些血清對抗PRRS病毒的抗體呈陽性(1∶1280)。
在整個研究過程中對照豬保持正常，在任何組織中沒有肉眼或顯微鏡下的損傷。從對照豬中沒有分離出細菌或病毒。
(Ⅲ)討論
從自然發生地區性肺炎的豬獲得的肺臟過濾物在實驗性接種到普通和限菌豬中時會引起肺和心臟損傷。在自然發生和實驗性疾病中觀察到的損傷在病毒病因學方面是一致的。
沒有分離出普通的、以前鑑別出的豬病毒性呼吸系統致病原。觀察到有細胞病效應，其特徵是初級豬肺巨噬細胞培養的細胞溶解，與Yoon等人的PRRS病毒感染相一致(JournalofVeterinaryDiagnosticInvestigation，Vol.4(1992)，P.139)。不過，在本研究中觀察到的直接支氣管肺泡洗出培養物中的大量合胞體在以前有關PRRS的報告中沒有發現。
對感染細胞培養物的電子顯微鏡觀察發現有兩種病毒樣顆粒。一種70nm帶有短表面小刺的包裹病毒樣顆粒似乎與Benfield等人報告的PRRS病毒一致(JournalofVeterinaryDiagnosticInvestigation，Vol.4(1992)，P.117)，其他病毒樣顆粒似乎不同。沒有豬對SIV、PRV、TGEV(PRCV)或EMCV表現出抗體效價。但限菌豬對PRRS病毒的確表現出血清轉化。
實驗1中再產生的臨床疾病其特徵是在感染後5天內所有接種的限菌和普通豬中表現出中度至嚴重的呼吸窘迫。此實驗中的疾病比以前實驗(CollinsetalandYoonetal.，同上)中觀察到的疾病更嚴重。
Morin等人(CanadianVeterinaryJournal，Vol，31(1990)，P.837)描述的有關最近識別出的A型SIV變異體(aSIV或其相關疾病，同上)的末梢氣管上皮壞死和增生在實驗1中沒有發現。也沒有觀察到沿肺泡間隔有與aSIV(Morin等人，和Girard等人，同上)相關的纖維蛋白沉澱和透明膜。在實驗1中感染後15天以上的活豬中所觀察到的嚴重非化膿性心肌炎與aSIV(Morinetal，andGirardetal，同上)無關。該豬對SIV無血清轉化，並且通過在胚胎雞卵中傳代也未檢測出SIV。
在PRRS暴發流行和實驗性接種中觀察到的主要肺損傷是顯著的間質性單核細胞浸潤(Collins等人，Pol等人，同上)其他人尚未發現在實驗1的感染豬中發現的Ⅱ型肺細胞增生、合胞體細胞形成和心肌炎。在用實驗1的可過濾感染因子(我們將其命名為PRRSV的Iowa株)再產生的一致性損傷表明本研究中所述的疾病是一種特異性病毒因子或一種PRRS病毒與另一種感染因子聯合引起的。
實驗Ⅱ
(Ⅰ)材料和方法
(A)田間病例材料和歷史
在從因持續性嚴重的護理期肺炎而經歷過PRRS，並且在產下的最後42個同窩仔中只有20個豬存活的豬群中獲得1頭豬。將該豬殺死，收集肺組織樣本並用標準的、無菌勻漿技術使其勻漿。在Eagle′s最低基礎培養基(MEM)中製備肺勻漿液(10%W/V)，通過一種0.22mμ過濾器過濾，此勻漿液用作為接種物。
(B)細胞
從購自WhittakerBioproducts，Inc.(Walkersville，Maryland)的MA-104細胞製得一種傳代細胞系，命名為PSP-36。將PSP-36細胞的樣本分離繁殖，這種細胞系命名為PSP-36-SAH。將豬肺泡巨噬細胞和大約90個其他細胞系(下面的表Ⅱ中描述了它們的一些例子)用於病毒分離。
(C)病毒分離
將上述製備的肺勻漿液以2，000xg或3，000rpm4℃下離心15分鐘澄清。上清液通過一個0.22mμ濾器過濾。將過濾物接種到上述的(B)部分中的每個細胞系中。然後將培養物保持於有0-4%胎牛血清(FBS)和抗生素的合適培養基中。每天監測細胞系的細胞病效應(CPE)。如果在8或9天內沒觀察到CPE，再將培養物盲目傳代2-3次。如果發現可疑的CPE，使用抗ISU-12的恢復期豬抗血清以間接免疫螢光檢測(IFA)檢查該培養物。
(D)病毒效價
在含有2%FBS和1×抗生素的Dulbecco′s最低基礎培養基(DMEM)中製備ISU-12分離物的一系列10倍稀釋液。將每種稀釋液(0.2ml)雙份接種於PSP-36細胞和豬肺泡巨噬細胞培養物接種過的Lab-Tek室的每個孔中。感染後3天(DPI)，用冷的80%丙酮和20%甲醛溶液在4℃下固定該室15分鐘。然後使用恢復期ISU-12抗血清和抗PRRS病毒血清在IFA中對該室染色。
(E)間接免疫螢光檢測(IFA)
用ISU-12分離物感染PSP-36細胞和豬肺泡巨噬細胞培養物。在感染後20和48小時，用冷的80%丙酮和20%甲醇溶液在4℃固定該培養物15分鐘。使用從SouthDakotaStateUniversity，Brookings，SouthDakota購買的ISU-12恢復期血清，抗-PRRSV血清和抗-PRRSV單克隆抗體進行IFA。使用未感染的PSP-36細胞和巨噬細胞培養物作為對照。
(F)放射免疫沉澱測定(RIP)
用35S-甲硫氨酸和35S-半胱氨酸標記ISU-12分離物和假感染的PSP-36細胞。用0.5ml 104TCID5的ISU-12病毒感染存在於25cm3燒瓶中的3天齡PSP-36細胞。在感染後24小時，用甲硫氨酸和半胱氨酸含量缺乏的DMEM替代該培養基，並將培養物在37℃保溫1小時。然後用含100μci/ml35S-甲硫氨酸(35Met)和35S-半胱氨酸(35Cys)的新鮮甲硫氨酸和半胱氨酸含量不足的DMEM替代該培養基。加入35Met和35Cys之後5小時，用冷的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)(PH7.2)洗滌細胞三次，然後從燒瓶中刮出細胞，以1，000xg離心410分鐘沉澱。然後用溶解緩衝液使含有標記病毒蛋白的細胞沉澱物和假感染細胞沉澱物溶解，再按照Zhu等人(Am.J.Vet.Res.，51∶232-238(1990))的方法通過離心澄清細胞殘渣。將該溶解物與已在4℃下預先吸收有冷的正常PSP-36細胞溶解物過夜的ISU-12恢復期血清和抗-PRRS病毒血清一起孵育。
在室溫下加入瓊脂糖-蛋白A珠(從SigmaChemicalCo.，StLouis，Missouri購得)2小時，收集免疫長期複合物。然後用溶解緩衝液洗滌瓊脂糖-蛋白A珠的免疫複合物的混合物三次，再用蒸餾水洗滌三次。將混合物再懸浮於50ml樣本緩衝液中，按照Zhu等人所述(同上)在SDS-PAGE凝膠上跑帶。
(G)電子顯微鏡觀察(EM)
在一種25cm2瓶中用ISU-12病毒感染PSP-36細胞。在感染後48小時，用3%戊二醛(PH7.2)在4℃下固定感染細胞2小時。然後從瓶中刮出細胞，並通過離心沉澱。處理細胞沉澱物並嵌入塑料中。將嵌入塑料的細胞沉澱物切成薄片，染色，然後在透射電子顯微鏡下按照Poul等人所述(Am.j.Vet.Res.，38∶311-315(1976))進行觀察。
(Ⅱ)實驗性複製豬生殖和呼吸系統疾病
(A)實驗92.1SPF
將上述來源ISU-12的肺過濾物鼻內接種到6頭5周齡的無特異性致病菌(SPF)的豬體內。在接種後(DPI)3、5、10、28和43天時殺死豬。
(B)實驗92.3SPF
用感染有ISU-12肺過濾物的豬肺泡巨噬細胞物鼻內接種5周齡的6頭SPF雜交豬體內。在接種後(DPI)10天和28天殺死ISU-12接種的豬。
(C)實驗92.10SPF
用含有105TCID50/ml病毒的在PSP-36上繁殖的3ml ISU-12鼻內接種三頭5周齡豬。兩頭豬作為未接種對照。在接種後5、10、28天各殺死一頭實驗組豬。並在接種後5天和10天各殺死一頭對照豬。
(D)實驗92.12.SPF
將22頭5周齡的豬分成6組。在組Ⅰ中，用在PSP-36上繁殖的含有105TCID50/ml病毒的3ml斑塊純化的ISU-12(斑塊No.1)鼻內接種6頭豬(實驗組)。在組Ⅱ中，用對照細胞培養基接種6頭豬。在組Ⅲ(斑塊No.2)和組Ⅳ(斑塊No.3)的每組中，用斑塊純化的ISU-12接種2頭豬。在組Ⅴ中，用沒經斑塊純化的ISU-12接種3頭豬。在組Ⅵ中，用ISU-12組織過濾物接種3頭豬。
在接種後的5、10和25天各將組Ⅰ和組Ⅱ的每組殺死兩頭實驗豬和對照豬。在接種後10天殺死分別用斑塊No.2和No.3接種的兩頭豬。在接種後的5、10和25天各殺死組Ⅴ和Ⅵ中的一頭豬。
(E)顯微鏡檢查
在殺死時收集肺、腦、心臟和脾組織，用10%中性緩衝的福馬林固定，嵌入石蠟中，用蘇木素和曙紅染色。
(Ⅲ)結果
(A)病毒培育
(1)在豬肺泡巨噬細胞培養物中培育ISU-12分離物。
在用ISU-12肺過濾物感染的豬肺泡巨噬細胞培養物中於感染後2-3天開始觀察到細胞病效應(CPE)。CPE的特徵是巨噬細胞聚集和細胞溶解。在ISU-12感染的培養物中大約90%的巨噬細胞培養物於4-5DPI表現出CPE。圖12(A)表示在未感染的巨噬細胞培養物中沒有觀察到CPE。在巨噬細胞培養物中3次傳代的ISU-12病毒效價是104-105TCID50/ml。
如圖12(C)所示，使用從限菌豬中獲得的ISU-12恢復期血清通過IFA在ISU-12感染的豬肺泡巨噬細胞培養物的細胞漿中檢測出病毒抗原。在未接種的巨噬細胞培養物中未檢測出免疫螢光。
(2)在傳代細胞系中培育ISU-12分離物
在測試的大約90個細胞系中(見上述的「材料和方法」(B)部分)，在6個細胞系中表現出病毒複製，它們是PSP-36、PSP-36-SAH、MA-104、滑液細胞、肺泡巨噬細胞和豬鼻甲細胞。
圖13(B)表示的是在2DPI開始的CPE，其特徵是退化、細胞變圓和細胞聚集。在3-4DPI時，圓形細胞聚集數目增多，並且有些聚集塊發生融合。許多園型細胞脫離細胞單層，導致進一步的單層分裂。5DPI後，CPE變得十分廣泛，一般涉及到超過95%的單層。如圖13(A)所示，在對照PSP-36細胞中沒有觀察到CPE。ISU-12分離物在PSP-36細胞上於第11次細胞培養傳代時可生長至高效價，大約106-107TCID50/ml。
在用從實驗性接種了ISU-12肺過濾物的限菌豬中獲得的恢復期血清感染的細胞漿中檢測出了病毒抗原(見圖14(B))。在對照PSP-36細胞中未觀察到螢光(圖14(A))。
(Ⅲ)病毒特徵
(A)ISU-12與PRRS病毒的抗原相關性
通過在IFA中的明亮細胞質螢光顯色表明(見圖14(C))，抗PRRS病毒分離物VR-2332的單克隆抗體(購自Dr.Benfield，SouthDakotaStateUniversity，Brookings，SouthDakota)和抗PRRSV血清(從USDANationalVeterinaryServicesLaboratory，Ames.Iowa)可與ISU-12感染的PSP36細胞發生反應，但不與未感染的PSP36細胞發生反應。
(B)病毒蛋白
用抗-ISU-12恢復期血清和抗-PRRS病毒血清分析病毒蛋白。兩種血清識別至少4種蛋白，分子量分別是19、24、32和61kD(圖15)。在圖15中，用抗-ISU-12血清(泳道2和5)、抗PRRSV血清(泳道3和4)、抗-PRRSV單克隆抗體(泳道6)或兔抗-PRRSV血清(從Dr.Benfield，SouthDakotaStateUniversity，Brookings，SouthDakota獲得)免疫沉澱假感染的(泳道2和3)或ISU-12感染的(泳道4-7)。泳道1和8有分子量標記。這些蛋白在假感染的PSP-36細胞中不明顯。
(C)病毒結構
在ISU-12感染的PSP-36細胞中觀察到有55-85nm的典型病毒顆粒。這些病毒顆粒是包裹的，呈球形，並且存在於ISU-12感染的PSP-36細胞的細胞漿小囊中。
(Ⅳ)實驗性再現疾病
(A)實驗92.1SPF
將上述ISU-12來源的肺過濾物鼻內接種到六頭5周齡的無特異性致病菌(SPF)的豬上。在接種後(DPF)的3、5、10、28和43天殺死這些豬。在3DPI時，ISU-12豬表現出嚴重的呼吸窘迫和發燒。這些症狀持續0-14天。肉眼觀察肺損傷其特徵是60%的肺嚴重多發性灰褐色實變。還有中度的心肌肥大和腹水聚集。顯微鏡下變化的特徵的是嚴重的增生性間質性肺炎，伴有Ⅱ型肺細胞增生、合體細胞形成、肺泡有滲出物和輕度的間質增厚，有單核細胞。有輕度的非化膿性心肌炎、嚴重的腦炎和中度的淋巴漿細胞性腎炎。通過NVSL證實在10和28天處死的ISU-12實驗性豬對PRRS因子有血清轉化。
(B)實驗92.3SPF
所有的ISU-12接種的SPF豬在3天內都表現出嚴重的呼吸系統疾病，持續超過14天。內眼觀察的損傷特徵是肺部充血、水腫和明顯的多發性彌散性肝樣變。顯微鏡下觀察，有嚴重的增生性間質性肺炎、中度腎炎、中度心肌炎和輕度腦炎。通過NVSL證實在接種後10和28天處死的ISU-12接種的豬對PRRS有血清轉化。
(C)實驗92.10SPF
在5-22DPI發現的接種豬的臨床症狀包括嚴重的嗜睡和發燒、中度厭食和中度至重度呼吸窘迫。在整個實驗過程中這些豬有中度的流沚現象。在5DPI，顯微鏡下的損傷包括輕度增生性間質性肺炎和嚴重壞死化膿性扁桃腺炎。在10DPI觀察到中度多發性PIP。伴有Ⅱ型增生、肺泡滲出、多核巨大細胞和合體細胞形成。在10DPI還發現有中度多發性腦炎，伴有血管周圍套和神經膠質增生。在10DPI檢查出輕度門靜脈周圍淋巴巨噬細胞性肝炎，輕度非化膿性心肌炎和鼻炎。在26DPI，有嚴重的間質性肺炎，特徵是伴有單核細胞的明顯多發性間質增厚、中度多發性Ⅱ型肺細胞增生、中等量的混合性肺泡滲出物，和鬆散的細支管周圍淋巴細胞和巨噬細胞套。還發現有中度多發性心肌炎、輕度肝炎和輕度腎炎及扁桃腺炎。在10DPI時兩頭ISU-12接種的豬對PRRS有血清轉化。
在實驗過程中對照豬保持臨床正常，既沒表現出肉眼的損傷，也沒有顯微鏡下損傷。而它們對PRRS保持血清學陰性。
(D)實驗92.12SPF
如上述實驗92.10SPF所述，生物學上未克隆的ISU-12對SPF豬有致病性，並且引起間質性肺炎、心肌炎和腦炎。用ISU-12的三個生物學克隆(斑塊Nos.1、2和3)接種的豬會引起輕度間質性肺炎，但在這些豬中沒有檢查出有Ⅱ型肺細胞增生，肺泡滲出，心肌炎和/或腦炎的跡象。在10DPI時所有用ISU-12(包括克隆的或未克隆的)接種的豬對PRRS表現出血清轉化。對照豬保持不發生病毒感染和疾病。
(Ⅴ)概述
用從自然患病豬(ISU-12來源的肺和心臟過濾物(0.22mμ)在5周齡SPF豬上實驗性的再現了嚴重的肺炎。由PRRSV，(ISU-12)的Iowa株引起的肺炎其特徵在於間質性肺炎，Ⅱ型肺細胞增生，和合體細胞形成。在受影響的豬中觀察到心肌炎和腦炎。ISU-12可在豬肺泡巨噬細胞培養物和一種傳代細胞系PSP-36中產生細胞病效應(CPE)。通過間接免疫螢光在ISU-12-感染的培養物中檢測出了病毒抗原，但在未感染的細胞中未檢出。使用多克隆和單克隆抗體通過間接免疫螢光證實ISU-12與PRRS病毒株VR-2332有抗原相關性。不過，在用非斑塊純化的ISU-12感染的豬的顯微鏡下損傷中觀察到有所不同，從而表明在PSP-36中可能生長有另一種病毒或感染因子，而且說明其他病毒或感染因子可能是導致由PRRSV的Iowa株引起的疾病和損傷與在現有技術中報導的有關PRRS病毒引起的疾病不同而且更嚴重的原因之所在。所有用克隆或未克隆的ISU-12接種的豬在10DPI對PRRS表現出血清轉化。對照豬保持沒有病毒感染和疾病。
實驗Ⅲ
與豬呼吸和生殖系統症候群Iowa株相關的感染因子
3′-末端區的分子克隆和核苷酸序列
(Ⅰ)材料和方法
(A)病毒繁殖和純化
在下文中，為了使討論更簡便，該術語「病毒」和「病毒性」是指本申請上述有關含義的病毒或感染因子，或該病毒或感染因子的特性。
用傳代的細胞系PSP-36分離和繁殖與PRRSV的Iowa株相關的ISU-12分離物。在PSP-36細胞上將ISU-12病毒斑塊純化3次。然後用斑塊純化的病毒感染PSP-36細胞。當超過70%的感染細胞表現出細胞病改變時，將該培養物冷凍和融化三次。以5，000xg在4℃下低速離心來澄清培養基。然後用7%PEG-8000和2.3%NaCl在4℃下過夜並攪拌來沉澱病毒，通過離心將沉澱物製成沉澱小丸。然後再將病毒小丸懸浮於2ml的tris-EDTA緩衝液中，鋪到CsCl梯度(1.1245-1.2858g/ml)頂層。以28，000rpm在20℃超速離心大約8小時，可觀察到密度為1.15-1.18g/ml的一條清楚帶，並收集之。通過IFA測定此帶的感染活性效價，發現此效價是106TCID50/ml。通過負染色電子顯微鏡(EM)還觀察到典型的病毒顆粒。
(B)分離病毒RNA
使用一種商業上購買的RNA分離藥盒(從Stratagene獲得)以CsCl梯度從含有病毒的帶中分離總RNA。然後根據柱子生廠廠家(Invitrogen)所述的方法通過寡聚(dT)-纖維素柱層析富集多聚(A)RNA。
(C)構建ISU-12cDNAλ文庫
圖16表示的是用於構建cDNAλ文庫的一般概要方法。使用具有-XhoⅠ限制位點的寡聚(dT)引物通過反轉錄來完成由mRNA合成第一股cDNA。核苷酸混合物含有普通的dATP、dGTP、dTTP和類似物5-甲基dCTP，它可以保護cDNA免受下一克隆步驟中所用的限制酶的影響。
用RNaseH和DNA聚合酶Ⅰ完成第二股cDNA合成。用T4DNA聚合酶使cDNA末端變鈍(平整末端)，用T4DNA連結酶將其連結到EcoRⅠ轉接體上，然後再用T4多核苷酸激酶激化(即磷酸化)。用XhoⅠ消化cDNA，並在瓊脂糖凝膠上對消化的cDNA大小進行選擇。選擇大於1kb大小的消化的cDNA，並通過商業上可買到的DNA純化藥盒(GENECLEAN，可從BIO101，Inc.，LaJolla，California購得)進行純化。
將純化的cDNA連接到λ噬菌體載體臂上，用XhoⅠ和EcoRⅠ粘性末端加工處理。將連結的載體裝配到含有λ提取物的感染性λ噬菌體中。用大腸桿菌細胞的SURE株(從Stratagene獲得)進行轉染，然後擴增該λ文庫並在XL-1藍色細胞系中滴定。
(D)通過鑑別性雜交篩選λ文庫
圖17表示的是通過鑑別性雜交來識別PIP病毒ISU-12株之確認可靠性克隆的一般概要步驟，並在下文中進行了描述。將λ文庫置於XL-1藍色細胞上，將斑塊移到尼龍膜上，共兩份，並通過慣用方法用0.5NNaOH變性。按照柱子生產廠家(Invitrogen)所述通過寡聚(dT)纖維素柱層析分離由病毒感染的PSP-36細胞和非感染的PSP-36細胞得到的信使RNA。
根據生產廠家(Amersham)所述在32.P-dCTP存在下使用隨機引物由分離自病毒感染的PSP-36細胞和正常PSP-36細胞的mRNA合成互補DNA探針。然後通過Sephadex G-50柱層析分別純化兩種探針(第一個是從病毒感染的PSP-36細胞合成，另一個是來自正常的、未感染的PSP-36細胞)。用該探針在42℃、50%甲醯胺中分別與雙份的尼龍膜雜交。分離能與從病毒感染細胞製備的探針雜交但不與從正常細胞製備的探針雜交的斑塊。藉助於G408輔助噬菌體通過體外切割獲得含有病毒cDNA插入物的噬菌體質粒。然後在XL-1藍色細胞上擴增獲得的噬菌體質粒(Phagemids)。通過Qiagen柱層析分離含有病毒cDNA插入物的質粒，並進一步測序。
(E)核苷酸測序和序列分析
通過Qiagen柱層析純化含有病毒性cDNA插入物的質粒，並用普通的和反向引物，以及各種內部寡聚核苷酸引物通過Sanger′s雙脫氧方法測序。序列是從至少三個分離克隆中獲得的。如果獲得的是模糊的序列數據則應對另外的克隆或區域進行測序。使用兩個計算機軟體程序GENWORKS(Intelligenetics，Inc.，MontainView，California)和MACVECTOR(InternationalBiotechnologies，Inc.，NewHaven，Connecticut)分別對核苷酸序列數據組合和分析。
(F)寡聚核苷酸引物
使用一種自動DNA合成儀(AppliedBiosystems)以單股DNA的形式合成寡聚核苷酸，並通過HPLC純化。合成寡聚核苷酸PP284(5′-CGGCCGTGTGGTTCTCGCCAAT-3′;SEQIDNO1)和PP285(5′-CCCCATTTCCCTCTAGCGACTG-3′;SEQIDNO2)用於PCR擴增。用這兩個引物從病毒基因組的最3′末端產生一個DNA探針以用於Northern印跡分析(見下面的討論)。合成寡聚核苷酸PP286(5′-GCCGCGGAACCATCAAGCAC-3′;SEQIDNO3)和PP287(5′-CAACTTGACGCTATGTGAGC-3′;SEQIDNO4)用於PCR擴增。用由這兩個引物產物的DNA探針進一步篩選λ文庫。用寡聚核苷酸PP288(5′-GCGGTCTGGATTGACGACAG-3′;SEQIDNO5)，PP289(5′-GACTGCTAGGGCTTCTGCAC-3′;SEQIDNO6)，PP386(5′-GCCATTCAGCTCACATAGCG-3′;SEQIDNO7)，PP286和PP287作為測序引物以獲得內部序列。
(G)Northern印跡分析
用引物PP284和PP285通過PCR對來自ISU-12 cDNA克隆的最3′末端的一個特異性DNA片段進行擴增。用商業上可買到的DNA純化藥盒(GENECLEAN，從Bio 101獲得)從瓊脂糖凝膠上切下DNA片段，並用32P-dCTP通過隨機引物續展(用一種從Amersham可得到的藥盒)進行標記。根據廠家(Stratagene)所述的方法使用一種商業上可購得的用於分離總RNA的藥盒，在感染後36小時從ISU-12感染的PSP-36細胞中分離總RNA。用6M乙二醛和DMSO使ISU-12亞基因組mRNA種變性，並在1%瓊脂糖凝膠上分離。(在下面的實驗Ⅷ中描述了改用1.5%瓊脂糖凝膠的類似方法的結果，並示於圖32中)。用一種POSIBLOTTM壓力點樣器(Stratagene)將分離的亞基因組mRNA轉移到尼龍膜上。在一種帶有滾瓶的雜交罐中於42℃和50%甲醯胺條件下進行雜交。
結果
(A)IUS-123′末端基因組的克隆、識別和測序
從來源於ISU-12-感染的PSP-36細胞的部分純化病毒構建一種寡聚(dT)-引導的cDNAλ文庫。在用基於Lelystad病毒序列的探針篩選cDNAλ文庫時遇到了麻煩。製備了三套引物。第一套(PP105和PP106;SEQIDNOS21-22)與位於病毒粒子基因區中的Lelystad基因組序列的位點14577至14596和14977至14995相對應。第二套(PP106和PP107，SEQIDNOS22-23)與ORF′S6和7旁側的Lelystad基因組序列的位點14977至14995和14054至14072相對應。第三套(PM541和PM542;SEQIDNOS24-25)與位於ORF-16區中的Lelystad基因組序列的位點11718至11737和11394至11413相對應。
PPl055′-CTCGTCAAGTATGGCCGGT-3′(SEQIDNO21)
PPl065′-GCCATTCGCCTGACTGTCA-3′(SEQIDNO22)
PPl075′-TTGACGAGGACTTCGGCTG-3′(SEQIDNO23)
PM5415′-GCTCTACCTGCAATTCTGTG-3′(SEQIDNO24)
PM5425′-GTGTATAGGACCGGCAACCG-3′(SEQIDNO25)
試圖用這三套引物從ISU-12感染因子中通過PCR產生探針全部未獲成功。不過，在用鑑別性雜交技術幾次嘗試之後，用從ISU-12-感染的PSP-36細胞和正常PSP-36細胞製備的探針分離出了可靠性的代表ISU-12-特異性cDNA的斑塊。涉及鑑別性雜交的方法步驟描述並列於圖17中。
開始識別出三個陽性斑塊(λ-4，λ-75和λ-91)。藉助於G408輔助噬菌體通過體外切割獲得存在於λ噬菌體中的含病毒性cDNA插入物的噬菌體質粒。通過限制性酶消化和末端序列測定來分析陽性克隆的插入物。通過與來源於PRRSVIowa株感染的PSP-36細胞的RNA雜交，但不與來自正常PSP-36細胞的RNA雜交這一現象進一步證實了cDNA克隆的特異性。然後用引物PP286，PP287通過PCP從克隆λ-75的5′-末端產生的DNA探針。用此探針進一步識別出陽性斑塊(λ-229，λ-268，λ-275，λ-281，λ-323，和λ-345)。所有用於獲得3′-末端核苷酸序列的λcDNA克隆示於圖18中。至少測定三個分離的克隆以減少任何錯誤。如果出現任何模糊的序列數據，則用另外的克隆和內部引物(PP288，PP289，PP286，PP287和PP386)來確定序列。該1938-bp3′-末端序列(SEQIDNO8)示於圖19中，而推斷出的胺基酸序列(SEQIDNO9-12)示於圖20中。
(B)一套嵌套亞基因組mRNA
在1%乙二醛/DMSO瓊脂糖凝膠上分離來源於病毒感染PSP-36細胞的總RNA，並在尼龍膜上點樣。用在病毒基因組最3′-末端區旁側的一套引物(PP284和PP285)通過PCR產生一種cDNA探針。該探針含有一個3′-非翻譯序列和大部分的ORF-7序列。Northerm印跡雜交結果表明從PRRSVIowa株感染的PSP-36細胞獲得的mRNA種類類型非常類似於Lelystad病毒(LV)、馬動脈炎病毒(EAV)、乳酸脫氫酶-升高病毒(LDV)和冠狀病毒的類型，其相同點在於病毒的複製需要有亞基因組mRNA′S的形成。
該結果還表明ISU-12-特異性亞基因組mRNA代表了一套3′-嵌套mRNA，因為Northern印跡探針只代表最3′末端序列。ISU-12病毒基因組RNA(14kb)和6個亞基因組mRNA(RNA2(3.0kb)，RNA3(2.5kb)，RNA4(2.2kb)，RNA5(1.8kb)，RNA6(1.3kb)和RNA7(0.98kb))的大小類似於LV的那些相應RNA大小(圖18)，只是在基因組和亞基因組RNA種類方面有所不同。在亞基因組mRNA的相對量方面也表現出不同，RNA7是最主要的亞基因組mRNA。
(C)對由亞基因組RNA編碼的開放閱讀框架進行分析
在SEQIDNO8中發現有三個大的ORFORF-5(nt239-901;SEQIDNO13)，ORF6(nt889-1403;SEQIDNO15)和ORF7(nt1403-1771;SEQIDNO18)。位於所得序列5′末端的ORF4在SEQIDNO8的1938-bp3′-末端序列中是不完整的。ORF5、6和7各具有一種編碼大於100個胺基酸的能力。ORF5和ORF6互相重疊10bp，而ORF6和ORF7互相重疊5bp。還發現了完全位於ORF7中的兩個較小ORF，分別只編碼37個胺基酸和43個胺基酸。另兩個短ORF與ORF5完全重疊。這兩個ORF的編碼能力分別只是29個胺基酸和44個胺基酸。通過Northern印跡分析表明沒有特異性的亞基因組mRNA與這些較小的ORF相關。ORF6和ORF7具信是分別編碼病毒膜蛋白和衣殼蛋白。
(D)用於引導接頭的一致序列
序列分析表明一種短的序列基本結構，AACC，可以作為在亞基因組mRNA中翻譯時加入引導序列的位點(連接點)。分別發現ORF6的連接點位於ATG起始密碼子的上遊21bP處，而ORF7的連接點位於ATG起始密碼子的上遊13bP處。在ORF5中沒有識別出AACC一致序列，不過在LV的ORF5中發現了此序列。在LDV和EAV中發現了類似的連接序列。
(E)3′-未翻譯序列和多聚(A)尾
與LV中的114nt，LDV中的80nt和EAV中的59nt相比，在ISU-12病毒基因組中識別出了接在ORF7的終止密碼子之後的150核苷酸長(150nt)的非翻譯序列。該多聚(A)尾的長度是至少13個核苷酸。在PIP病毒ISU-12、LV和LDV的多聚(A)尾臨近區中有一個相同序列，CCGG/AAATT-多聚(A)。
(F)ISU-12和LV基因組在ORF5、6和7以及在非翻譯序列方面的序列比較
圖21表示的是ISU-12和Lelystad病毒的基因組的ORF-5區的比較。圖22、23和24分別表示了相應的ORF-6區、ORF-7區和非翻譯序列的比較。
比較的結果列於下表Ⅲ。與上述一樣，如果一病毒與免疫原性病毒有90%或更大的同源性則認為是在免疫學上等同的。LV和ISU-12的ORF5、ORF6、ORF7和非翻譯序列之間的核苷酸序列同源性分別是60%、68%、60%和58%。因此，LV和ISU-12不是免疫原性等同的。
LV中的ORF5和6的大小分別比ISU-12中的ORF5和6小61nt和3nt。相對而言，LV中的ORF7大小比ISU-12中的ORF7大小要大15nt。而且，3′-末端非翻譯序列在長度上也不同(在ISU-12中是150nt，而在LV中只有114nt)。象LV一樣，除了ORF5之外，在PRRS病毒Iowa株分離物ISU-12的基因組中也識別出了該連接序列，AACC。ISU-12中ORF6的連接序列是在ATG起始密碼子的上遊21nt處，而LV中ORF6的連接序列是在ATG上遊28nt處。
實驗Ⅳ
Iowa株感染因子基因在昆蟲細胞中的表達
(A)生產重組杆狀病毒
使用基於ISU-12基因組核苷酸序列的引物通過PCR分別擴增ORF-5、ORF-6和ORF-7。用下列引物擴增ORF-5
5′-GGGGATCCGGTATTTGGCAATGTGTC-3′(SEQIDNO26)
3′-GGGAATTCGCCAAGAGCACCTTTTGTGG-5′(SEQIDNO27)
用下列引物擴增ORF-6
5′-GGGGATCCAGAGTTTCAGCGG-3′(SEQIDNO28)
3′-GGGAATTCGTGCACAGCTGATTGAC-5′(SEQIDNO29)
用下列引物擴增ORF-7
5′-GGGGATCCTTGTTAAATATGCC-3′(SEQIDNO30)
3′-GGGAATTCACCACGCATTC-5′(SEQIDNO31)
將擴增的DNA片段克隆到杆狀病毒轉移載體pVL1393(從Invitrogen獲得)中。將1μg的線性化杆狀病毒AcMNPVDNA(從Pharmingen，SanDiego.California購得)和2μgPCR擴增克隆的含cDNA載體構件與50μl的Lipofectin(Gibco)混合，並在22℃保溫15分鐘，以製備轉染混合物。
在接種HI-FIVE細胞之後1小時，用新鮮的Excell400昆蟲細胞培養基(從JRScientificCo.購得)替代該培養基，並一滴滴地加入轉染混合物。將所得到的混合物在28℃保溫6小時。之後，移去轉染培養基，加入新鮮的Excell400昆蟲細胞培養基。然後將所得到的混合物在28℃下保溫。
轉染5天後，收集培養基並澄清之。將10倍稀釋的上清液接種到HI-FIVE細胞上，並在室溫下保溫60分鐘。在棄去接種物之後，在細胞上鋪一層1.25%的瓊脂糖。在28℃下保溫4天。之後，選擇清楚的斑塊，並用無菌巴斯德吸管吸出。每一斑塊與1ml的Grace′s昆蟲培養基在-5ml的帶蓋塞的試管中混合，並置於冰箱中過夜以使病毒從瓊脂糖中釋放出。以2000xg離心該試管30分鐘以去除瓊脂糖，把上清液轉移到新的無菌試管中。重複斑塊純化步驟三次以避免可能的野生型病毒汙染。將純的重組克隆存放於-80℃下以用於進一步的研究。
(B)重組Iowa株感染因子蛋白的表達
用間接免疫螢光檢測和放射免疫沉澱試驗評價表達。
間接免疫螢光檢測用野生型杆狀病毒或重組杆狀病毒對在24孔細胞培養簇平板中的Hi-five昆蟲細胞(如圖25中所示)進行感染或者對其進行假感染。72小時之後，固定細胞，並用合適稀釋的豬抗-ISU-12多克隆抗體染色，接著用螢光素異硫氰酸鹽-標記的(FITC-標記的)抗豬IgG染色。如圖26-29中所示，在用重組病毒感染的細胞中檢測出了免疫螢光，而在假感染細胞或用野生型杆狀病毒接種的細胞中沒有螢光。例如，圖26表示了用含有ISU-12ORF-6基因的重組杆狀病毒(Baculo.PRRSV.6)感染的HI-FIVE細胞，它表現出了細胞病效應。圖27表示的是用另一種含有ISU-12ORF-7基因的重組杆狀病毒(Baculo.PRRSV.7)感染的HI-FIVE細胞，它也表現出了細胞病效應。用含有ORF-5的重組杆狀病毒(Baculo.PRRSV.5，數據未顯示出)獲得了類似結果。圖28和29表示的是分別用含ISU-12ORF-6基因和ISU-12ORF-7基因的重組杆狀病毒感染的HI-FIVE細胞，用豬抗ISU-12抗血清進行了染色，接著用螢光素結合的抗豬IgG染色，其中昆蟲細胞正在產生重組Iowa株感染因子蛋白。用含ORF-5的重組杆狀病毒獲得了類似的結果。
放射免疫沉澱用每種重組病毒(Baculo.PRRSV.5，Baculo.PRRSV.6和Baculo.PRRSV.7)進行放射免疫沉澱以進一步確定重組蛋白的抗原活性和可靠性。對HI-FIVE昆蟲細胞進行假感染，或者用每種重組杆狀病毒感染。感染兩天之後，加入不含甲硫氨酸的培養基。每種混合物保溫2小時，然後加入用35S-甲硫氨酸(Amersham)標記的蛋白，該混合物在28℃下再保溫4小時。通過三次冷凍和融化循環製備放射標記的細胞溶解物，用預免疫或免疫抗-ISU-12抗血清與細胞溶解物一起孵育。用蛋白A瓊脂糖沉澱免疫複合物並在煮沸之後於SDS-PAGE上分析。在80℃下將凝膠進行X-線拍片，並衝洗。用ORF-6(圖30)和ORF-7(圖31)產物檢測出了預期大小的帶。
實驗Ⅴ
對下表4中所述的PRRSV的其他樣本進行三次斑塊純化。通過將一種澄清的組織勻漿在PSP-36-SAH細胞上培養並選擇單個斑塊(假定一個斑塊是由單個病毒產生的)進行斑塊純化。然後培養選擇的斑塊，再次選擇單個斑塊，然後培養第三次。用從SouthDakotaStateUniversity，Brookings，SouthDakota購買的抗-PRRSV單克隆抗體進行IFA。
在下面的表5中列出了鑑別出的選擇用於進一步研究的某些分離樣本，並以其致病性和mRNA的數目描述了其特徵。
表4
PRRXV3X斑塊純化的分離物
PRRSV冷凍日期PRRS單克隆滴度
分離物 製備原液 IFA結果 TCID50/ml
ISU-22 9/15/92 + 105.57±0.15
ISU-28 9/15/92 + 105.14±0.28
ISU-12 9/17/92 + 104.33±0.21
ISU-3927 9/21/92 + 103.56±0.17
ISU-984 9/21/92 + 103.89±0.24
ISU-7229 9/22/92 + 103.45±0.20
ISU-92-11581 9/22/92 + 102.39±0.17
ISU-695 10/01/92 + 104.49±0.20
ISU-79 10/01/92 + 105.69±0.25
ISU-412 10/01/92 + 105.31±0.50
ISU-55 10/01/92 + 105.54±0.10
ISU-33 10/05/92 + 105.36±0.21
ISU-1894 10/27/92 + 105.18±0.33
ISU-04 10/27/92 + 105.78±0.24
ISU-51 2/07/93 + 104.59±0.15
ISU-30262 4/01/93 + 105.99±0.24
注所有病毒分離物是斑塊純化的和在PSP-36-SAH細胞上繁殖的
表5
＊＝某些表現出缺失的mRNA
每種未進行斑塊純化的ISU-12、斑塊純化的ISU-12、ISU-22、ISU-51、ISU-55和ISU-3027的樣品已根據布達佩斯條約的條款在美國典型培養物保藏中心(12301ParklawnDrive，Rockville，Naryland20852，U.S.A.)進行了保藏，保藏號分別是VR2385，VR2386，-，-，-和。
ISU-3927的mRNA在7個mRNA中有四個表現出缺失。ISU-3927的mRNA4、5、6和7與ISU-12的那些mRNA4、5、6和7相比遷移更快，因此，它們比ISU-12的那些mRNA要小。這些特性可能與ISU-3927的較低毒力有關。
在5周齡的CDCD豬中比較6種分離物的致病性。用105TCID50病毒接種15隻豬。在10 DPI時處死10隻豬，再在28 DPI時處死5隻豬。病毒分離物ISU-12，ISU-22和ISU-28是致病性最強的，而ISU-51和ISU-55致病性低。在以前的研究中，ISU-3927對5周齡的豬只有輕度的致病性。
由ISU-22和未斑塊純化的(也即;未斑塊純化的分離的感染因子)ISU-12引起的損傷比由斑塊純化病毒引起的損傷持續時間更長。斑塊純化的分離物可引起輕度的心肌炎和腦炎。未斑塊純化的分離物比相應斑塊純化的分離物引起更嚴重的疾病。
CDCD小豬可以作為評價候選疫苗致病性和功效的理想模型。分離物ISU-12、ISU-22和ISU-984可產生類似的損傷，並且根據對肉眼和顯微鏡下損傷的檢查，可用其來評價疫苗的功效。ISU-3927的毒力較小，但足夠用於評價抗PRRSV致病株的疫苗。
用斑塊純化ISU-12感染的豬在28天的一段時間內其體重增加比對照豬(用未感染的PSP-36細胞激發的)平均少9.9磅。初步結果表明在2-10DPI表現出淋巴細胞減少和中性白細胞增多。
只有那些用未斑塊純化的ISU-12感染的豬表現出明顯的腦炎。在用生物學克隆的(斑塊純化的)Iowa株分離物激發的任何豬中沒有觀察到鼻炎。相對而言，當用組織過濾物(未斑塊純化的分離物)作為接種物時鼻炎是嚴重的。
對用ISU-12未斑塊純化的、ISU-12斑塊純化的、ISU-22、ISU-984、ISU-3927和未感染的PSP-36細胞感染的CDCD豬的病理學和組織學概括於下表6-12中。在這些表中，肉眼肺損傷分級代表了肺實變的百分數(也即，患肺炎疾病表現出損傷的肺組織的百分數)。分級是以0-100%實變的水平為基礎的。「ND」是指肉眼肺損傷分級未確定。
在上表6中，「unpl.」是指未斑塊純化的，而「uninoc.」是指未接種的。
上表6中的結果表明ISU-12和ISU-22產生的損傷比其他的分離物產生的損傷持續時間更長。由ISU-12、ISU-22和ISU-984產生的損傷其嚴重程度相似。由ISU-3927產生的損傷其嚴重程度更輕，而比由其他分離物產生的損傷消失得更早。所有肉眼損傷在36DPI時消失。
下面表7-12中所列的病理學結果是以上表1中所列嚴重程度的相同分級為基礎的。在下面的表7-12中，「Int，thick」是指間質增厚，「alv.exud.」是指肺泡滲出，而「encephal.」是指腦炎。
在7DPI時，由ISU-12、ISU-22和ISU-984引起的肺損傷是嚴重的，並且互相類似。在7DPI時由ISU-3927引起的肺損傷只是輕度或中度嚴重。
在10DPI時，由ISU-12、ISU-22和ISU-984引起的肺損傷類似於在7DPI時的損傷，但其嚴重程度稍小。只有由未斑塊純化的ISU-12感染的豬表現出輕度的腦炎和心肌炎。在10DPI時，由ISU-3927引起的損傷幾乎消失。
在21DPI時，由未斑塊純化的ISU-12引起的心肌炎是嚴重的，而由ISU-12、ISU-22和ISU-984引起的心肌炎中度的。只有由未斑塊純化的ISU-12感染的豬在21DPI時表現出中度的腦炎。
在28DPI時，在由未斑塊純化的ISU-12和ISU-22感染的豬中肺損傷仍然是中度。這些分離物還可以在28DPI時產生嚴重的心肌炎。不過，由ISU-12、ISU-984和ISU-3927引起的肺損傷在28DPI時幾乎消失。
在36DPI時，所有損傷基本消失。在36DPI時每組中檢查一隻豬。
實驗Ⅵ
進行體內交叉中和研究。首先用一種選自ISU-12、ISU-22、ISU-984和ISU-3927的分離物鼻內接種CDCD豬，四周以後，用ISU-12激發該豬。在用ISU-12激發後8DPI時檢查肺損傷和其他疾病症狀。對照豬只用ISU-12激發。結果列於下表13中。
下表13中所列的病理學結果是以上表1中所列嚴重程度的相同分級為根據的。在下表13中，「Int.thick.」是指間質增厚，「alv.exud.」是指肺泡滲出，和「encephal.」是指腦炎。
上表13中的數據表明ISU-12可以保護豬抵抗由ISU-12引起的疾病的大部分症狀。ISU-984可提供保護作用以抵抗由ISU-12(它是已知PRRSV病毒毒力最強的株之一)引起的某些PRRS的症狀和臨床指徵。
但是，ISU-3927(PRRS病毒Iowa株的一種輕度致病性變異體)作為一種活疫苗可最大程度地保護所研究的分離物以抵抗用ISU-12的進一步激發。因此，ISU-3927在商業上有希望用作活疫苗。
實驗Ⅶ
用下面表14中所列的PRRSV Iowa株的分離物接種有10隻CDCD豬的組，或者用未感染的PSP-36細胞接種以作為對照。在用105TCID50的下表14中所列的每種病毒分離物鼻內激發時該豬大小為5周齡。在10DPI時處死該豬。
在下表14中提供了10DPI時平均肉眼肺損傷的評分，以表示分離物的致病性。並提供了標準偏差(SD)以表示平均肺損傷評分的統計學顯著性。

另外，根據上述的臨床呼吸評分系統(見下表16中的「臨床評分均數」)檢查每組豬的呼吸窘迫情況。「肉眼評分」是指上述的肉眼肺損傷評分。「Enceph.」，「myocard.」和「rhinitis」是指每組中分別表現出腦炎。心肌炎和鼻炎的豬的數目。「顯微評分」是指一種根據下述用於評價和比較肺組織間質性肺炎的顯微鏡下損傷的分級所得評分
0＝無疾病;正常肺組織
1＝輕度多發性顯微鏡下損傷
2＝輕度彌散性顯微鏡下損傷
3＝中度多發性顯微鏡下損傷
4＝中度彌散性顯微鏡下損傷
5＝嚴重多發性顯微鏡下損傷
6＝嚴重彌散性顯微鏡下損傷
在不表現出肉眼損傷的組織中可以觀察到顯微鏡下損傷。因此，除了肉眼肺損傷、呼吸窘迫、發熱等之外，「顯微評分」還為評價和比較這些分離物的致病性提供了另外的均數。
實驗Ⅷ
從用ISU-12、ISU-22、ISU-55、ISU-79、ISU-1894和ISU-3927中的每一種感染的PSP-36細胞中分離mRNA，並在一種1.5%瓊脂凝膠上進一步分離，以更好地分離亞基因組mRNA。發現了兩組遷移方式。
組Ⅰ包括分離物ISU-12、ISU-1894、ISU-3927和可能是，ISU-51。圖32表示了ISU-12的Northern印跡分析，而圖33表示的是ISU-1894、ISU-3927和ISU-51的Northern印跡分析。象Lelystad病毒一樣，在這些分離物的每種中發現了7個亞基因組mRNA(在圖32和33中標記的1-7)。該亞基因組mRNA(SgRNA)的大小類似於Lelystad病毒的亞基因組mRNA。
組Ⅱ包括分離物ISU-22，ISU-55和ISU-79。這些分離物的每一種有9個SgRNA，而不是7個。組Ⅱ中的SgRNA1、2、3、6和7與組Ⅰ中的那些相同，但在組Ⅰ的SgRNA3和6之間發現有兩個另外的SgRNA，在圖33中以箭頭表示。
初步結果表明在PSP-36細胞中可能除ISU-12之外組Ⅱ的病毒比組Ⅰ的分離物會更好地複製。不過，在某些情況下，與組Ⅱ的分離物相比，甚至ISU-12也會複製得很差。
實驗Ⅷ
在3周齡、PRRSV-血清學陰性的SPP豬中進行了豬生殖和呼吸系統綜合病毒(PRRSV)改性的活疫苗功效研究。該疫苗每2ml劑量中含有105.8TCID50的斑塊純化的PRRSV ISU-12(Iowa株)。有9隻豬通過鼻內途徑(IN)給一單劑量疫苗，7隻豬通過肌肉內途徑(IM)給一單劑量，而9隻豬作為未接種疫苗的激發對照(NV/CHALL)。在接種後35天激發疫苗和對照，然後在激發後10天對肉眼肺損傷評分(受影響肺的百分數)。
在圖34中以每個直方圖上的數字表示每組豬的平均肉眼肺損傷評分。通過肺損傷評分的減少評價疫苗的功效。兩個接種組表現出比非接種對照組有顯著低的(P＜0.01)肉眼肺損傷評分。在接種組之間未發現評分的顯著差異性。證明ISU-12 PRRSV疫苗在三周齡豬中以105.8TCID50劑量是有效的。
其他觀察
ISU-12病毒由於它對氯仿處理敏感，因此是一種包裹病毒。ISU-12的複製對5-溴脫氧尿核苷處理有抗性。因此，ISU-12不是一種DNA病毒。ISU-12缺乏血細胞凝集活性。
顯然，根據上述教導對本發明的許多修改和變化是可能的。因此應當明白，在下面的權利要求範圍內，本發明可以按除本文所具體描述之外的方式來實施。
序列表
(1)一般信息
(ⅰ)申請人
PAUL，PREMS.
HALBUR，PATRICKG.
MENG，XIANG-JIN
LUM，MELISSAA.
LYOO，YOUNGS.
(ⅱ)發明名稱
能夠產生抗豬呼吸和生殖系統疾病性病毒的免疫應答的疫苗，保護豬免受呼吸和生殖系病毒致病的方法
(ⅲ)序列數目28
(ⅳ)聯繫地址
(A)地址OBLON，SPIVAK，McCLELLAND，MAIER＆NEUSTADT，P.C.
(B)街道1755S.JeffersonDavisHighway，Suite400
(C)城市Arlington
(D)州Virginia
(E)國家U.S.A.
(F)郵編22202
(ⅴ)計算機閱讀形式
(A)媒介類型軟盤
(B)計算機IBMPC兼容
(C)閱讀系統PC-DOS/MS-DOS
(D)軟體PatentInRelease＃1.0，Version＃1.25
(ⅵ)目前的申請數據
(A)申請號US
(B)申清日
(C)分類
(ⅶ)優選申請數據
(A)申請號US07/969，071
(B)申請日1992年10月30日
(ⅷ)代理機構/代理人信息
(A)名稱Lovalleye，Jean-PaulM.P.
(B)登記號31，451
(C)檔案號4625-016-55XCIP
(ⅸ)電訊資料
(A)電話(703)413-3000
(B)傳真(703)413-2220
(C)電報248855OPATUR
(2)SEQIDNO1的資料
(ⅰ)序列特徵
(A)長度22鹼基對
(B)類型核酸
(C)鏈數未知
(D)拓撲類型未知
(ⅱ)分子類型cDNA
(ⅵ)來源
(A)生物豬生殖和呼吸系症候群病毒
(B)毒株Iowa
(C)個體分離物ISU-12
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO1
CGGCCGTGTGGTTCTCGCCAAT22
(2)SEQIDNO2的資料
(ⅰ)序列特徵
(A)長度22鹼基對
(B)類型核酸
(C)鏈數未知
(D)拓撲類型未知
(ⅱ)分子類型cDNA
(ⅵ)來源
(A)生物豬生殖和呼吸系症候群病毒
(B)毒株Iowa
(C)個體分離物ISU-12
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO2
CCCCATTTCCCTCTAGCGACTG22
(2)SEQIDNO3的資料
(ⅰ)序列特徵
(A)長度20鹼基對
(B)類型核酸
(C)鏈數未知
(D)拓撲類型未知
(ⅱ)分子類型cDNA
(ⅵ)來源
(A)生物豬生殖和呼吸系綜合症病毒
(B)毒株Iowa
(C)個體分離物ISU-12
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO3
GCCGCGGAACCATCAAGCAC20
(2)SEQIDNO4的資料
(ⅰ)序列特徵
(A)長度20鹼基對
(B)類型核酸
(C)鏈數未知
(D)拓撲類型未知
(ⅱ)分子類型cDNA
(ⅵ)來源
(A)生物豬生殖和呼吸系症候群病毒
(B)毒株Iowa
(C)個體分離物ISU-12
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO4
CAACTTGACGCTATGTGAGC20
(2)SEQIDNO5的資料
(ⅰ)序列特徵
(A)長度20鹼基對
(B)類型核酸
(C)鏈數未知
(D)拓撲類型未知
(ⅱ)分子類型cDNA
(ⅵ)來源
(A)生物豬生殖和呼吸系症候群病毒
(B)毒株Iowa
(C)個體分離物ISU-12
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO5
GCGGTCTGGATTGACGACAG20
(2)SEQIDNO6的資料
(ⅰ)序列特徵
(A)長度20鹼基對
(B)類型核酸
(C)鏈數未知
(D)拓撲類型未知
(ⅱ)分子類型cDNA
(ⅵ)來源
(A)生物豬生殖和呼吸系症候群病毒
(B)毒株Iowa
(C)個體分離物ISU-12
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO6
GACTGCTAGGGCTTCTGCAC20
(2)SEQIDNO7的資料
(ⅰ)序列特徵
(A)長度20鹼基對
(B)類型核酸
(C)鏈數未知
(D)拓撲類型未知
(ⅱ)分子類型cDNA
(ⅵ)來源
(A)生物豬生殖和呼吸系症候群病毒
(B)毒株Iowa
(C)個體分離物ISU-12
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO7
GCCATTCAGCTCACATAGCG20
(2)SEQIDNO8的資料
(ⅰ)序列特徵
(A)長度1938鹼基對
(B)類型核酸
(C)鏈數雙鏈
(D)拓撲類型未知
(ⅱ)分子類型cDNA
(ⅵ)來源
(A)生物豬生殖和呼吸系症候群病毒
(B)毒株Iowa
(C)個體分離物ISU-12
(ⅸ)特徵
(A)名稱/鍵CDS
(B)位置1..255
(ⅸ)特徵
(A)名稱/鍵CDS
(B)位置239..901
(ⅸ)特徵
(A)名稱/鍵CDS
(B)位置1403..1771
(ⅸ)特徵
(A)名稱/鍵CDS
(B)位置889..1410
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO8
(2)SEQIDNO9的資料
(ⅰ)序列特徵
(A)長度85胺基酸
(B)類型胺基酸
(C)拓撲類型線性
(ⅱ)分子類型蛋白質
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO9
(2)SEQIDNO10的資料
(ⅰ)序列特徵
(A)長度221胺基酸
(B)類型胺基酸
(C)拓撲類型線性
(ⅱ)分子類型蛋白質
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO10
(2)SEQIDNO11的資料
(ⅰ)序列特徵
(A)長度174胺基酸
(B)類型胺基酸
(C)拓撲類型線性
(ⅱ)分子類型蛋白質
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO11
(2)SEQIDNO12的資料
(ⅰ)序列特徵
(A)長度123胺基酸
(B)類型胺基酸
(C)拓撲線性
(ⅱ)分子類型蛋白質
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO12
(2)SEQIDNO13的資料
(ⅰ)序列特徵
(A)長度667鹼基對
(B)類型核酸
(C)鏈數未知
(D)拓撲未知
(ⅱ)分子類型cDNA
(ⅵ)來源
(A)生物豬生殖和呼吸系症候群病毒
(B)毒株Iowa
(C)個體分離物ISU-12
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO13
(2)SEQIDNO14的資料
(ⅰ)序列特徵
(A)長度605鹼基對
(B)類型核酸
(C)鏈數未知
(D)拓撲未知
(ⅱ)分子類型cDNA
(ⅵ)來源
(A)生物豬生殖和呼吸系症候群病毒
(B)毒株Lelystad
(C)個體分離物ISU-12
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO14
(2)SEQIDNO15的資料
(ⅰ)序列特徵
(A)長度526鹼基對
(B)類型核酸
(C)鏈數未知
(D)拓撲未知
(ⅱ)分子類型cDNA
(ⅵ)來源
(A)生物豬生殖和呼吸系症候群病毒
(B)毒株Iowa
(C)個體分離物ISU-12
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO15
(2)SEQIDNO16的資料
(ⅰ)序列特徵
(A)長度522鹼基對
(B)類型核酸
(C)鏈數未知
(D)拓撲未知
(ⅱ)分子類型cDNA
(ⅵ)來源
(A)生物豬生殖和呼吸系症候群病毒
(B)毒株Lelystad
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO16
(2)SEQIDNO17的資料
(ⅰ)序列特徵
(A)長度372鹼基對
(B)類型核酸
(C)鏈數未知
(D)拓撲未知
(ⅱ)分子類型cDNA
(ⅵ)來源
(A)生物豬生殖和呼吸系症候群病毒
(B)毒株Lelystad
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO17
(2)SEQIDNO21的資料
(ⅰ)序列特徵
(A)長度387鹼基對
(B)類型核酸
(C)鏈數未知
(D)拓撲類型未知
(ⅱ)分子類型cDNA
(ⅵ)未源
(A)生物豬生殖和呼吸系症候群病毒
(B)毒體Iowa
(C)個體分離物ISU-12
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO18
(2)SEQIDNO19的資料
(ⅰ)序列特徵
(A)長度164鹼基對
(B)類型核酸
(C)鏈數未知
(D)拓撲類型未知
(ⅱ)分子類型cDNA
(ⅵ)來源
(A)生物豬生殖和呼吸系症候群病毒
(B)毒株Iowa
(C)個體分離物ISU-12
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO19
(2)SEQIDNO20的資料
(ⅰ)序列特徵
(A)長度127鹼基對
(B)類型核酸
(C)鏈數未知
(D)拓撲類型未知
(ⅱ)分子類型cDNA
(ⅵ)來源
(A)生物豬生殖和呼吸系症候群病毒
(B)毒株Lelystad
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO20
(2)SEQIDNO21的資料
(ⅰ)序列特徵
(A)長度19鹼基對
(B)類型核酸
(C)鏈數單鏈
(D)拓撲類型線性
(ⅱ)分子類型其他核酸
(A)描述DNA(合成的)
(ⅵ)來源
(A)生物體豬生殖和呼吸系症候群病毒
(B)毒株Lelystad
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO21
CTCGTCAAGTATGGCCGGT19
(2)SEQIDNO22的資料
(ⅰ)序列特徵
(A)長度19鹼基對
(B)類型核酸
(C)鏈數單鏈
(D)拓撲類型線性
(ⅱ)分子類型其他核酸
(A)描述DNA(合成的)
(ⅵ)來源
(A)生物體豬生殖和呼吸系症候群病毒
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO22
GCCATTCGCCTGACTGTCA19
(2)SEQIDNO23的資料
(ⅰ)序列特徵
(A)長度19鹼基對
(B)類型核酸
(C)鏈數單鏈
(D)拓撲類型線性
(ⅱ)分子類型其他核酸
(A)描述DNA(合成的)
(ⅵ)來源
(A)生物體豬生殖和呼吸系症候群病毒
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO23
TTGACGAGGACTTCGGCTG19
(2)SEQIDNO24的資料
(ⅰ)序列特徵
(A)長度20鹼基對
(B)類型核酸
(C)鏈數單鏈
(D)拓撲類型線性
(ⅱ)分子類型其他核酸
(A)描述DNA(合成的)
(ⅵ)來源
(A)生物體豬生殖和呼吸系症候群病毒
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO24
GCTCTACCTGCAATTCTGTG20
(2)SEQIDNO25的資料
(ⅰ)序列特徵
(A)長度20鹼基對
(B)類型核酸
(C)鏈數單鏈
(D)拓撲類型線性
(ⅱ)分子類型其他核酸
(A)描述DNA(合成的)
(ⅵ)來源
(A)生物體豬生殖和呼吸系症候群病毒
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO25
GTGTATAGGACCGGCAACAG20
(2)SEQIDNO26的資料
(ⅰ)序列特徵
(A)長度26鹼基對
(B)類型核酸
(C)鏈數單鏈
(D)拓撲類型線性
(ⅱ)分子類型其他核酸
(A)生物體豬生殖和呼吸系症候群病毒
(B)毒株Iowa
(C)個體分離ISU-12
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO26
GGGGATCCGGTATTTGGCAATGTGTC26
(2)SEQIDNO27的資料
(ⅰ)序列特徵
(A)長度28鹼基對
(B)類型核酸
(C)鏈數單鏈
(D)拓撲類型線性
(ⅱ)分子類型其他核酸
(A)描述DNA(合成的)
(ⅵ)來源
(A)生物體豬生殖和呼吸系症候群病毒
(B)毒株Iowa
(C)個體分離IUS-12
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO27
GGTGTTTTCCACGAGAACCGCTTAAGGG28
(2)SEQIDNO28的資料
(ⅰ)序列特徵
(A)長度21鹼基對
(B)類型核酸
(C)鏈數單鏈
(D)拓撲類型線性
(ⅱ)分子類型其他核酸
(A)描述DNA(合成的)
(ⅵ)來源
(A)生物體豬生殖和呼吸系症候群病毒
(B)毒株Iowa
(C)個體分離IUS-12
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO28
GGGGATCCAGACGTTTCAGCGG21
(2)SEQIDNO29的資料
(ⅰ)序列特徵
(A)長度25鹼基對
(B)類型核酸
(C)鏈數單鏈
(D)拓撲類型線性
(ⅱ)分子類型其他核酸
(A)描述DNA(合成的)
(ⅵ)來源
(A)生物體豬生殖和呼吸系症候群病毒
(B)毒株Iowa
(C)個體分離IUS-12
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO29
CAGTTAGTCGACACGGTCTTAAGGG25
(2)SEQIDNO28的資料
(ⅰ)序列特徵
(A)長度22鹼基對
(B)類型核酸
(C)鏈數單鏈
(D)拓撲類型線性
(ⅱ)分子類型其他核酸
(A)描述DNA(合成的)
(ⅵ)來源
(A)生物體豬生殖和呼吸系症候群病毒
(B)毒株Iowa
(C)個體分離IUS-12
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO30
GGGGATCCTTGTTAAATATGCC22
(2)SEQIDNO31的資料
(ⅰ)序列特徵
(A)長度19鹼基對
(B)類型核酸
(C)鏈數單鏈
(D)拓撲類型線性
(ⅱ)分子類型其他核酸
(A)描述DNA(合成的)
(ⅵ)來源
(A)生物體豬生殖和呼吸系症候群病毒
(B)毒株Iowa
(C)個體分離IUS-12
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO31
CTTACGCACCACTTAAGGG19
權利要求
1、一種疫苗，它能在接觸過能引起豬生殖和呼吸系統疾病的病毒的豬中激發有效的免疫應答。
2、根據權利要求1的疫苗，其中所說的病毒導致一種具有下列症狀和臨床指徵特徵的疾病Ⅱ型肺細胞形成，心肌炎，腦炎，肺泡滲出物形成和合體細胞形成。
3、根據權利要求2的疫苗，其中所說的病毒導致的疾病還具有下述的症狀和臨床指徵特徵嗜睡，呼吸窘迫，被迫呼氣，發燒，毛髮粗糙，打噴嚏，咳嗽，和輕度的間質增厚。
4、根據權利要求3的疫苗，其中所說的疾病是由豬生殖和呼吸系統症候群病毒的Iowa株引起的。
5、根據權利要求1的疫苗，其中所說的疫苗是從在選自PSP-36，PSP-36-SAH和MA-104的細胞系中培養的病毒製備的。
6、一種生物學純的病毒樣本或感染因子樣本，它導致一種具有下述症狀和臨床指徵特徵的豬生殖和呼吸系統疾病Ⅱ型肺細胞形成，心肌炎，腦炎，肺泡滲出物形成和合體細胞形成。
7、根據權利要求6的生物學純病毒或感染因子，其特徵在於還具有下述的症狀和臨床指徵嗜睡，呼吸窘迫，被迫呼氣，發燒，毛髮粗糙，打噴嚏，咳嗽和輕度的間質增厚。
8、根據權利要求7的生物學純病毒，其中所說的生物學純樣本是與豬生殖和呼吸症候群病毒的Iowa毒株有關的感染因子，已於1992年10月28日寄存於美國典型培養物保藏中心，保藏號是VR2385和VR2386，還於1993年9月29日在該中心進行了保藏，保藏號為-，-，-和-。
9、一種預防豬受病毒感染的組合物，包括一定量的生理上可接受的載體中的權利要求1的疫苗，所說的一定量能有效地激發對豬生殖和呼吸系統疾病致病性病毒的免疫應答。
10、一種保護豬而抵抗一種豬生殖和呼吸系統疾病致疾性病毒感染的方法，包括給需要保護而抵抗所說病毒感染的豬使用一有效量的權利要求1疫苗。
11、根據權利要求10的方法，其中所說的疫苗是口服或非腸道給藥。
12、根據權利要求11的方法，其中所說的疫苗是肌肉內、皮內、靜脈內、腹膜內、皮下或鼻內給藥。
13、根據權利要求10的方法，其中所說的疫苗是給需要保護而抵抗所說病毒感染的母豬使用所說的疫苗。
14、一種製備權利要求1疫苗的方法，包括下列步驟
(A)收集足夠大量的能導致豬生殖和呼吸系統疾病的病毒或感染因子樣本，和
(B)以選自下面一組中的一種方式處理所說病毒或感染因子(ⅰ)斑塊純化病毒或感染因子，(ⅱ)在足夠滅活所說病毒或感染因子的溫度和時間下加熱所說病毒或感染因子，(ⅲ)將所說病毒或感染因子與足以滅活所說病毒或感染因子量的滅活化學藥品接觸或與之混合，(ⅳ)將所說病毒或感染因子分解成其相應的亞單位，並分離出至少一種所說的亞單位，和(ⅴ)合成或分離一種編碼所說病毒或感染因子表面蛋白的多聚核酸，用所說的多聚核酸感染一種合適的宿主細胞，用所說的宿主細胞，和從所說的培養物中分離表面蛋白。
15、根據權利要求14的方法，其中所說的病毒或感染因子是從下列一組的一種來源中收集的，這組來源包括培養基，用所說病毒或感染因子感染的細胞，和用所說病毒或感染因子感染的細胞與培養基一起。
16、一種如權利要求15的方法，在所說的收集步驟之前，還包括在一種合適的培養基中培養所說病毒或感染因子的步驟。
17、一種能與權利要求1的疫苗免疫結合的抗體。
18、一種患有呼吸和生殖系統疾病的豬的治療方法，包括給需要這種治療的豬使用一有效量的在生理上可接受的載體中的權利要求17的抗體。
19、一種用於檢測可導致豬呼吸系統疾病，豬生殖系統疾病或豬生殖和呼吸系統疾病病毒的診斷藥盒，包括權利要求17的抗體和一種能指示與所說抗體發生陽性免疫反應的診斷試劑。
20、一種分離的多核苷酸，它與從能導致豬呼吸和生殖系統疾病的病毒或感染因子的部分基因組中獲得的多核苷酸有至少90%的同源性。
21、根據權利要求20分離的多核苷酸，其中所說的病毒或感染因子與豬生殖和呼吸系統症候群的Iowa株有關。
22、根據權利要求21的分離的多核苷酸，基本上由選自下列一組中的一種序列構成SIQIDNO∶8，SEQIDNO∶10，SEQIDNO∶12，SEQIDNO∶15和SEQIDNO∶16。
23、一種由權利要求22的分離多核苷酸編碼的蛋白。
24、一種分離的多聚核酸，基本上由從豬呼吸和生殖系統致病性病毒或感染因子的基因組獲得的一種多核苷片段構成，它的長度是20至100核苷酸。
25、根據權利要求24的分離的多聚核苷酸，其中所說的病毒或感染因子是豬生殖和呼吸系統綜合病毒的Iowa株。
26、一種權利要求24的分離的多聚核苷酸片段，基本上由選自下列一組中的一種序列構成，這一組包括SEQIDNO∶1，SEQIDNO∶2，SEQIDNO∶3，SEQIDNO∶4，SEQIDNO∶5，SEQIDNO∶6和SEQIDNO∶7。
27、一種培養病毒的方法，包括用所說病毒和培養物感染選自由PSP-36，PSP-36-SAH，MA-104和能被所說病毒和培養物感染的等同細胞系組成的一組中的一種細胞系，和
在一種合適的培養基中培養所說的感染細胞系，
其中所說病毒導致一種豬呼吸和生殖系統疾病。
28、根據權利要求27的方法，其中所說的合適細胞系選自由PSP-36，PSP-36-SAH，MA-104組成的一組。
29、根據權利要求27的方法，其中所說的病毒是豬呼吸和生殖綜合症病毒的Iowa株，或它引起一種選自下列一組的疾病豬呼吸和生殖系統綜合症，增生和壞死性肺炎，和非典型性豬流感。
30、根據權利要求29的方法，其中所說的病毒是豬呼吸和生殖系統症候群病毒的Iowa株。
全文摘要
本發明涉及一種能夠保護豬免受呼吸系統和生殖系統病毒致病的疫苗，一種防止豬患呼吸和生殖系統疾病的方法，一種生產疫苗的方法，和從一種引起豬呼吸和生殖系統疾病的病毒中獲得的DNA。
文檔編號C12P21/02GK1096223SQ9312070
公開日1994年12月14日 申請日期1993年10月30日 優先權日1992年10月30日
發明者Ｐ·Ｓ·保爾, Ｐ·Ｇ·哈博, Ｘ·Ｊ·門格, Ｍ·Ａ·魯牧, Ｙ·Ｓ·理奧 申請人:衣阿華州立大學研究基金會公司, 索維動物保健公司