一種泌尿生殖系統疾病的治療系統的製作方法

2023-05-20 16:57:21

專利名稱：一種泌尿生殖系統疾病的治療系統的製作方法
技術領域：
本發明用於泌尿生殖系統疾病的治療，尤其涉及多肽和二聚體用於泌尿生殖系統疾病的治療。

背景技術：
泌尿生殖系統疾病通常累及男女兩性，包括泌尿系統和生殖系統的感染和/或炎症。例如，根據美國國家少兒健康和發育研究所(NICHD)的統計，「大多數女性一生中至少患過一種類型的陰道炎」《陰道炎》(Vaginitis)，發表於《美國國家少兒健康和發育研究所-在線刊物》(National Institute of Child Health and HumanDevelopment-Publications On-line)，2000年1月12日修定，)。導致陰道炎的原因包括從細菌、真菌和病毒感染到乳液、噴霧或者貼身衣物所含的化學物質的刺激。同樣地，對於有細菌和真菌感染的女性，這些感染因素經常來自肛門區，從此處經過會陰到達陰道或尿道。
常見的一類陰道炎是念珠菌或酵母菌感染，主要由白色念珠菌感染引起。念珠菌屬於人體正常菌群，存在於皮膚、口腔和消化道(Robbins，《疾病的病理學基礎》第五版(pathologic Basis ofDisease 5th ed)，Saunders公司，費城(1994)p.354)，女性陰道也可有少量存在。它們最適合的生長環境是諸如陰道或口腔的溫暖潮溼環境。念珠菌通常不致病，但當環境改變時，例如女性絕經後、懷孕期、或應激時發生體內激素水平的改變，會過度繁殖造成酵母菌感染。此情況也可見於免疫抑制或身體機能受損的個體，如接受化療、服用免疫抑制劑的病人，或愛滋病患者。
目前對於念珠菌感染的治療包括非處方藥物，其活性成分如布康唑硝酸鹽(Femstat)、克黴唑(Gyne-Lotrimin及其它)、咪康唑(Monistat及其它)和噻康唑(Vagistat)。這些藥物作為陰道感染的局部用藥，可以裂解念珠菌的細胞壁。其它類似的治療包括處方藥物，其活性成分來自與氟康唑(Diflucan)、三康唑(Terazol)和酮康唑(Nizoral)等同一系列。
雖然通常的觀點認為陰道炎與念珠菌有關，但據NICHD的調查(《陰道炎》(Vaginitis))，實際上細菌性陰道炎是育齡婦女最常見的陰道感染疾病。陰道內的細菌過度繁殖會導致與念珠菌性陰道炎相似的細菌性陰道炎，其治療藥物不同。
另一方面，男性陰莖也可以感染念珠菌，累及陰莖頭和包皮。陰莖頭包皮炎是陰莖頭和包皮的非特異性感染，由多種微生物引起，包括真菌(如念珠菌)和化膿性細菌(如葡萄球菌)(Robbins，《疾病的病理學基礎》第五版(Pathologic Basis of Disease 5th ed).，Saunders公司，費城(1994)p.1008)。
葡萄球菌為革蘭氏染色陽性細菌，通常存在於人體的皮膚和其它黏膜。特別值得一提的是金黃色葡萄球菌，為毒性致病源，可以引起皮膚損傷、心內膜炎、呼吸系統感染、食物中毒、甚至中毒性休克症候群等多種病症。對於採用高吸收性月經棉條的女性而言，金黃色葡萄球菌可以在陰道內形成菌落，並分泌一種稱為中毒性休克症候群毒素(TSST-1)的毒素。據FDA的統計，目前報導的大約半數中毒性休克症候群病例與月經期棉條關，多為年輕女性(《月經棉條與石棉、二惡英以及中毒性休克症候群》(Tampons andAsbestos，Dioxin，&Toxic Shock Syndrome)，FDA設備與放射健康中心(July 23，1999)，)。
金黃色葡萄球菌感染一般用甲氧西林(methicillin)治療。此藥雖然很有效，但金黃色葡萄球菌的一些菌株已經產生抗藥性，只有少數抗生素能有效治療耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)。常用於治療MRSA的抗生素之一是萬古黴素(vancomycin)。但是，現已發現對萬古黴素敏感性下降的金黃色葡萄球菌菌株(Khuishid，M.A.等，《對萬古黴素敏感性下降的金黃色葡萄球菌》(Staphylococcus aureus with Reduced susceptibility to Vancomycin)，發表於伊利諾斯1999《發病率與死亡率周報》(Morbidity andMortality Weekly Report)，48(51)1165-1167(2000)，)。抗藥性菌株的出現使應用其他方法用於治療細菌感染成為必要。
除真菌和細菌感染外，病毒性陰道炎也比較常見。此類感染大多通過性交傳播，包括單純皰疹病毒(HSV)或人類乳頭狀病毒(HPV)引起的感染。例如，HSV病毒，在生殖系統的入口處複製，也感染支配生殖器的神經。為了躲避機體免疫系統，HSV病毒潛伏在這些神經元中，在某些環境條件下活化，如應激、免疫抑制、放射或病毒感染等。目前治療HSV感染的藥物包括阿昔洛韋(acyclovir)、法昔洛韋(famciclovir)、或伐昔洛韋(valacyclovir)等。
對於泌尿系統，根據美國醫藥協會的調查數據，泌尿道感染(UTIs)是促使就醫的最常見疾患之一(《女性健康》-《尿道感染治療的患者指導》(Women’s Health，Urinary Tract infectionsAPatient’s Guide to Treatment)，《在線健康信息-AMA健康透視》(AMA Health Insight，On-line Health Information for Everyone)，1998年10月30日更新，。此類感染性疾患主要是由埃希氏大腸桿菌(E.coli.)引起，但念珠菌和葡萄球菌也有參與。同樣地，這些感染始於尿道，向膀胱發展引起膀胱炎。最後，病菌可沿輸尿管上行至雙腎，導致腎盂腎炎。男性和女性均可感染。
既然泌尿-生殖系統疾病不局限於單一病因，那麼目前的治療就需要針對特定病因採用不同的藥物。當然，要先確定病因。檢測病源需要時間，但更重要的是對女性要進行婦科檢查以確定是否有特異感染因素存在。
隨著抗生素和其它藥物應用的增加，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌這類的微生物就越容易對目前所用藥物產生抗藥性。這樣，就持續需要新的廣譜抗菌藥物。


發明內容
本發明用於治療泌尿生殖系統疾病，它的一個方面涉及的由單一或多種肽組成的用於泌尿生殖系統疾病的治療體系，其中多肽的胺基酸序列有KPV(序列號1號)，MEHFRWG(序列號2號)，HFRWGK(序列號3號)，SYSMEHFRWGLPV(序列號4號)。單個或多個多肽也可以通過上述胺基酸序列形成二聚體。泌尿生殖系統疾病包括感染、炎症，或者二者兼有。在本發明的一個優選實施例中，泌尿-生殖系統疾病包括陰道、外陰、尿道、陰莖和/或直腸的感染和/或炎症。在另一個優選實施例中，單一或多種多肽溶於載體內。在第三個優選實例中，一種或多種多肽與棉條結合，以避免中毒性休克症候群。在第四個優選實施例中，一種或多種多肽與避孕工具相結合，以防止性傳播疾病或感染。在第五個實施例中，一種或多種多肽與栓劑結合，以便於插入陰道或肛門。在本發明的第六個實施例中，一種或多種多肽溶於液體載體中，以用於陰道灌注。



圖1α-MSH和/或其衍生物對金黃色葡萄球菌生長的抑制效應。
圖2α-MSH和/或其衍生物對尿激酶(UK)誘導的金黃色葡萄球菌生長的影響。
圖3α-MSH和/或其衍生物對白色念珠菌(C.albicans)生長的抑制效應。
圖4α-MSH和/或其衍生物與氟康唑抗真菌活性的比較。
圖5A-5Dα-MSH和/或其衍生物對白色念珠菌芽管形成的抑制效應。
圖6α-MSH和/或其衍生物抗念珠菌的強化中性粒細胞殺傷力的效應。
圖7、8、9α-MSH和/或其衍生物抑制白色念珠菌生長的機制。
圖10-13α-MSH和/或其衍生物對慢性感染細胞內病毒複製和表達的抑制效應。
圖14α-MSH和/或其衍生物抑制病毒複製、表達和活化的機制。
圖15α-MSH和/或其衍生物對急性感染細胞內病毒複製和表達的抑制效應。
圖16用於本發明一方面的一種KPV二聚體形式的化學結構示例。

具體實施例方式 以下所引用的文獻在此作為參考文獻。本發明是關於採用α-黑素細胞刺激素(α-MSH)和/或其衍生物治療泌尿生殖系統疾病的一種方法和系統。α-MSH是經典的由13個胺基酸組成的肽(序列號4號)，由較大的前體分子——前黑阿皮素原經翻譯後修飾產生。它與同是來自前黑阿皮素原的促腎上腺皮質激素(ACTH)的1-13胺基酸序列相同。許多種細胞均可分泌α-MSH，包括垂體細胞、單核細胞、黑素細胞和角化細胞。α-MSH可見於大鼠皮膚、人體表皮以及正常和垂體切除術大鼠消化道的黏膜屏障(可參閱Eberie，A.N.，《促黑激素》(The Melanotrophins)，瑞士巴塞爾Karger(1998)；Lipton，J.m.等，《α-MSH神經免疫調質的抗炎影響》(Anti-inflammatory influence of the Neuroimmunomodulatorα-MSH)，《今日免疫學》(Immunol.Today)18，140-145(1997)；Thody，A.J.等，《α-MSH的免疫反應性，在正常和垂體切除大鼠消化道的分布》(Immunoreactiveα-Melanocyte Stimulating Hormone，Its Distribution in the Gastrointestinal Tract of Intact andHypophysectomized Rats)，《生命科學》(Life.Sci.)18，2127-2132(1981))。
現已知道α-MSH及其衍生物具有很強的解熱和抗炎特性，而且毒性極低。它可以降低宿主細胞的離體前炎症介質的產生，並且可以降低動物炎症模型的局部和全身反應。例如，α-MSH的核心序列(4-10)(序列號2號)具有學習和記憶行為效應，但解熱和抗炎活性很低。相反，解熱和抗炎活性的活化信息序列位於α-MSH的C-末端胺基酸序列，即賴氨酸-脯氨酸-纈氨酸(「Lys-Pro-Val」或「KPV」)(序列號1號)。此三肽在體和離體情況下與母體分子有相同的活性。α-MSH和/或其衍生物的抗炎活性在下述兩項專利有闡述，並包括在所列的參考中美國專利第5,028,592號，1991年7月2日提交於Lipton，J.M.，題為《Lys Pro Val解熱和抗炎成分及其使用方法》(Antipyretic and Anti-inflammatory Lys Pro ValCompositions and Method of Use)；美國專利第5,157,023號，1992年10月20日提交於Lipton，J.M.，題為《Lys Pro Val解熱和抗炎成分及其使用方法》(Antipyretic and Anti-inflammatory Lys Pro ValCompositions and Method of Use)。(參閱Catania，A.等，《α-MSH對宿主機體反應的調節》(α-Melanocyte Stimulating Hormone in theModulation of Host Reactions)，《內分泌綜述》(endocr.Rev.)14，564-576(1993)；Lipton，J.M.等，《α-MSH神經免疫調質的抗炎影響》(Anti-inflammatory influence of the Neuroimmunomodulatorα-MSH)，《今日免疫學》(Immunol.Today)18，140-145(1997)；Rajora，N.等，《α-MSH產生受體及其對新喋呤的影響，在人單核/巨噬細胞系》(α-MSH Production Receptors and Influence onNeopterin，in a human Monocyte/macrophage Cell Line)，《白血病生物學雜誌》(J.Leukoc.Biol.)59，248-253(1996)；Star，R.A.等，《α-MSH對巨噬細胞一氧化氮合成酶自分泌調節的證明》(Evidence ofAutocrine Modulation of Macrophage Nitric Oxide Synthase byα-MSH)，Proc.Nat』l.Acad.Sci.(USA).92，8015-8020(1995)；Lipton，J.M.等，《神經肽α-MSH在急慢性全身性炎症的抗炎作用》(Anti-inflammatory Effects of the Neuropeptideα-MSH in AcuteChronic and systemic inflammation)，Ann.N.Y. Acad.Sci.741，137-148(1994)；Fajora，N.等，《α-MSH調節大腦炎症實驗模型的局部和循環腫瘤壞死因子-α》(α-MSH Modulation Local and CirculatingTumor Necrosis Factorαin Experimental Brain Inflammation)，《神經科學雜誌》(J.Neurosci.)17，2181-2186(1995)；Richards，D.B.等，《α-MSH(11-13)(lys-pro-val)對兔發熱的作用》(Effects ofα-MSH(11-13)(lysine-proline-valine)on Fever in the Rabbit)，《肽物質》5，815-817(1984)；Hiltz，M.E.等，《神經肽α-MSH COOH末端片斷的抗炎活性》(Anti-inflammatory of a COOH-teminalFragment of the Neuropeptideα-MSH)，FASEB雜誌3，2282-2284(1989)。
除了抗炎和解熱功能外，本發明的另一方面涉及α-MSH和/或其衍生物的抗微生物和抗感染活性。如下所述，α-MSH和/或其衍生物有重要的抗感染用途，包括如下的應用降低微生物生存力，降低酵母菌長芽，在不損害中性粒細胞對微生物的殺傷能力的情況下殺傷微生物，治療與微生物感染有關的炎症而不降低微生物的殺傷力，增加微生物細胞內cAMP的積累，抑制病毒性致病源的複製與表達。
在本發明的首選實施例中，這些抗微生物或抗感染活性最主要與C-末端胺基酸序列-KPV有關。此三肽與α-MSH及其衍生物在很大濃度範圍內均有效，包括通常存在於人體漿液的皮摩爾濃度。
正如在技術背景部分中所討論的，泌尿生殖系統疾病並不局限於單一病因。從細菌、真菌到病毒在內的多種微生物和感染因素可以單獨或聯合引起多種病症，包括陰道炎、外陰炎、尿道炎、陰莖頭包皮炎、念珠菌病、行傳播疾病以及中毒性休克症候群。α-MSH和/或其衍生物可局部用於上述疾病狀態的感染和/或炎症部位以達到治療目的，可利用現有技術的施藥方法。例如，α-MSH及其衍生物可以溶於一些溶液中，諸如磷酸鹽緩衝液、透明質酸、甲基纖維素、羧甲基纖維素或乙醇。還可以用一般的載體，如油膏、油脂、膠體、可溶性彈丸、氣溶膠噴霧、栓劑、灌注所用液體溶劑或者具吸收性的物質，攜帶α-MSH和/或其衍生物作為活性成分治療泌尿生殖系統疾病。這些載體可用敷料器施用於感染或炎症部位，敷料器可以是注射器或類注射器式的器具、繃帶、導管、帶活塞的管子、塗藥用抹刀或其它類型的平面敷料器、保險套、海綿、棉籤、或手指。
更明確地說，本發明的一個優選實施例是將α-MSH和/或其衍生物溶於以液體基底的載體。然後將溶有α-MSH和/或其衍生物的載體儲存於密封加壓箱內。打開釋放閥門或通過其它方式將載體從密封加壓箱內釋放時，會形成氣溶膠泡沫並被裝進注射器和注射器類的器具。接著，注射器部分插入陰道，其內容物也就釋放入陰道腔內。注射器或注射器類的器具及其開口也可以有不同的大小、形狀和長度，以插入不同的泌尿生殖區，如尿道或肛門。
本發明的另一個優選實施例為包含載體的栓劑。此載體如膠體或甘油在常溫下為固體或半固體，但是插入陰道或肛門後在體溫下便融化。載體融化後，攜帶所溶的α-MSH和/或其衍生物至泌尿生殖系統疾病的發病部位。
我們採用油脂、油膏、膠體、噴霧、泡沫材料或止痛香膏等形式將α-MSH和/或其衍生物塗於外陰、陰莖頭和陰莖包皮等外生殖器部分。其組分為本技術領域所熟知。
在本發明的另一方面，還可以在棉條的生產加工過程中用α-MSH和/或其衍生物進行處理。這樣棉條中存在α-MSH和/或其衍生物，可以抑制分泌中毒性休克症候群(TSST-1)的微生物的生長，如金黃色葡萄球菌。此種棉條的加工處理技術為本領域現有技術所熟知。採用α-MSH和/或其衍生物處理的棉條吸收性材料進行治療，一種方法是將棉條的吸收性材料浸泡於含有α-MSH和/或其衍生物的溶液，然後予以乾燥。可供選擇的另一種方法，是將α-MSH以乾燥粉末形式噴灑到棉條的吸收性材料上。
在本發明的另一方面，α-MSH和/或其衍生物可通過避孕工具轉運至感染部位，這些避孕工具包括保險套、隔膜、海綿或其它用於防止懷孕或性傳播疾病的屏障型工具。α-MSH和/或其衍生物可溶於保險套所用的潤滑劑以及與隔膜共同使用的膠質或泡沫材料，或者溶於與保險套、隔膜或海綿共用的任何類型的殺精子溶液。
在本發明的另一方面，α-MSH和/或其衍生物可溶於灌注用的液體。這些液體可以通過灌注被轉運至陰道以治療感染和/或炎症。
下述實施例闡明了α-MSH和/或其衍生物抗感染的效力及其應用。實施例中所用的微生物學、分子生物學以及細胞培養的方法沒有在文中詳細說明，但在科研文獻中有大量的報導。本領域技術人員熟知這些方法。
下述實施例中所用的肽類包括α-MSH(1-13)(序列號4號)、(4-10)(序列號002號)、(6-13)(序列號003號)、和(11-13)(序列號1號)，均有乙醯化的N末端和醯胺化的C末端，以及促腎上腺皮質激素ACTH(1-39)和(18-39)(CLIP)。這些肽類由固相肽合成方法製備，經保留相的高效液相色普法純化。部分實施例還包括胺基酸序列CKPV(序列號8號)的二聚體(KPV二聚體)，此二聚體同樣也有乙醯化的N末端和醯胺化的C末端。圖16顯示了KPV二聚體的化學結構。在上述任意一種多肽的N末端加半胱氨酸，並使兩個多肽的半胱氨酸形成二硫鍵，即可得到二聚體。同源二聚體和異源二聚體均可由此方法獲得。
下述實施例中所闡述的統計學意義採用方差的單因素分析和斯氏t檢驗。概率大於0.05被認為是有顯著性差異的。
實施例I 本實施例目的在於闡明α-MSH和/或其衍生物的抗微生物特性，這裡選取金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)為例。
金黃色葡萄球菌培養物(ATCC 29213)由Ospedale Maggiore diMilano微生物學系提供。金黃色葡萄球菌(於Hank平衡鹽溶液中1×106/毫升)在α-MSH(1-13)(序列號4號)、α-MSH(11-13)(序列號1號)或KPV二聚體存在或缺如的情況下，37℃培養2小時，肽的濃度為10-15-10-4M。隨後細胞在冷蒸餾水中衝洗，並用HBSS稀釋至100個生物體/毫升。將一微升的等分試樣塗於血漿瓊脂板，37℃培養24小時。然後根據所形成的菌落評估微生物的生存力。另一實驗中是在細菌濃度為105/100毫升的培養液中加入不同的肽段和500單位的尿激酶(金黃色葡萄球菌的生長促進劑)，並且在37℃水浴中振蕩培養4小時。
圖1表明α-MSH(1-13)(序列號4號)、α-MSH(11-13)(序列號1號)和KPV二聚體均抑制金黃色葡萄球菌菌落的形成。此抑制效應在很大濃度範圍內均可發生，並在10-12-10-4M的濃度範圍內有顯著性差異(p＞0.01)。圖2說明了濃度為10-6摩爾/升的α-MSH(1-13)(序列號4號)和α-MSH(11-13)(序列號1號)明顯抑制尿激酶的生長促進作用。這樣，α-MSH或其衍生物可以抑制金黃色葡萄球菌的生長，此細菌會引起中毒性休克綜合症，該病徵與月經棉條使用、陰道炎、泌尿道感染、以及陰莖頭包皮炎有關。
實施例II 本實施例的目的在於闡明α-MSH和/或其衍生物的抗真菌特性，這裡選取的實驗菌株是白色念珠菌(Candida albicans)。
白色念珠菌的臨床隔離株由Ospedale Maggiore di Milano微生物學系提供。白色念珠菌的培養在沙氏瓊脂斜面板上進行，並周期性地轉移到沙氏瓊脂板上，28℃培養48小時。為了製備靜止期酵母菌，從瓊脂板上挑取菌落，將其轉移到30毫升沙氏葡糖液體培養基中，32℃培養72小時。將所得細胞以1000xg離心10分鐘，用蒸餾水衝洗沉積細胞兩次。然後計數細胞個數，並懸浮於Hank平衡鹽溶液(HBSS)中至需要的濃度。通過0.01％的甲基藍外排實驗，以此確定細菌的生存力。結果顯示其生存能力大於98％。
在HBSS中密度為1×106/毫升時，這些真菌在α-MSH(1-13)(序列號4號)、α-MSH(11-13)(序列號1號)或KPV二聚體存在或缺如的情況下，37℃培養2小時，肽的濃度為10-15-10-4M。隨後用冷蒸餾水衝洗細胞，並用HBSS稀釋至100個生物體/毫升。將一毫升的等分樣品塗於血漿瓊脂板上，37℃培養48小時。微生物的生存力根據所形成的菌落估計。
圖3表明α-MSH(1-13)(序列號4號)、α-MSH(11-13)(序列號1號)和KPV二聚體在10-12-10-4M濃度範圍內均抑制白色念珠菌菌落形成的能力(與對照相比p＜0.01)。此結果說明，α-MSH或其衍生物能夠抑制白色念珠菌的生長，此真菌是已知導致念珠菌病、陰道炎、尿道炎和陰莖頭包皮炎的因素。
實施例III 本實施例的目的在於比較α-MSH和/或其衍生物與氟康唑(fluconazole)的抗菌活性，後者是已被承認的抗真菌藥物。
檢測α-MSH(1-13)(序列號4號)、(4-10)(序列號2號)、(6-13)(序列號3號)、(11-13)(序列號1號)和ACTH(1-39)、(18-39)以及氟康唑在10-6-10-4M濃度下的抗白色念珠菌的能力，方法同實施例II。圖4表明，與氟康唑相比，α-MSH(11-13)(序列號1號)、(4-10)(序列號2號)、(6-13)(序列號3號)和(1-13)(序列號4號)抗白色念珠菌是非常有效的，其抑制活性與等摩爾濃度的氟康唑是類似的。相比之下，具有行為效應但極少抗炎活性的核心α-MSH序列(4-10)(序列號2號)產生了近50％的對菌落形成單位抑制效應。雖然此抑制效應具有顯著性(與對照相比p＜0.01)，但是明顯弱於含有KPV信號序列的α-MSH片斷，這些KPV信號序列包括α-MSH(6-13)(序列號3號)、(11-13)(序列號1號)(p＜0.01)，或者母體分子α-MSH(1-13)(p＜0.05)。圖4也表明ACTH(1-39)及其片斷(18-39)不能降低白色念珠菌的生存力。甚至在10-4M濃度下(圖中未顯示)，ACTH肽段也同樣無效。
由此本實施例說明α-MSH或其衍生物在抑制白色念珠菌生長方面與氟康唑同樣有效。
實施例IV 本實施例的目的在於闡明α-MSH及其衍生物對白色念珠菌出芽或芽管形成的抑制作用。芽管形成是白色念珠菌感染髮病機理的重要方面，包括粘附於宿主上皮和內皮細胞的過程，從橢圓形的芽生孢子到各種絲狀體的形態轉變，如芽管、假菌絲、菌絲。(Gow，N.A.，《白色念珠菌芽管的生長》(Germ Tube Growth of Candidaalbicans)，《當代醫學真菌話題》(Curr.Topics Med.Myco.)8，43-55(1997))。
蒸餾水衝洗培養所得的靜止期白色念珠菌兩次，然後將菌體懸浮於HBSS中，密度為2×106/毫升。於此菌液中加入10％的滅活馬血清(由英國Paisley GIBCO/BRL提供)，37℃振蕩培養45分鐘，可以誘導白色念珠菌菌絲的生長。HBSS衝洗菌體兩次以去除馬血清，然後在濃度為10-6M的α-MSH(1-13)(序列號4號)、(6-13)(序列號3號)或(11-13)(序列號1號)存在的條件下，37℃繼續培養60分鐘，並不斷振蕩。採用血細胞計數器在光學顯微鏡下計算出絲狀菌體的百分比。此實驗以重複三次，至少計數了200個細胞。採用裝配在Axioskop Zeiss顯微鏡上的MC100相機拍攝顯微照片。
圖5A至5D表明α-MSH(1-13)(序列號4號)或(11-13)(序列號1號)可以抑制由馬血清誘導的白色念珠菌芽管形成。α-MSH(1-13)(序列號4號)使絲狀菌體數目降低28-32％，α-MSH(11-13)(序列號1號)導致絲狀菌體數目降低54-58％。雖然圖中未顯示，α-MSH(6-13)(序列號3號)同樣可以引起絲狀菌體數目降低近50％。由此說明α-MSH或其衍生物通過抑制芽管形成可以抑制念珠菌發病機理的一種模式。
實施例V 對病原體殺傷力的降低是感染期間應用皮質類固醇和其它非甾體類消炎藥物治療的負面作用(Stevens，D.L.，《非甾體類消炎藥物(NSAIDs)是否能促進細菌性感染髮展為中毒性休克症候群》(Could Nonsteriodal Anti-inflammatory Drugs(NSAIDs)EnhanceProgression of Bacterial Infections to Toxic Shoc Syndrome？)，《臨床感染性疾病》(Clin.Infect.Dis.)21，977-80(1997)；Capsoni，F.等，《皮質類固醇對中性粒細胞功能的影響抑制抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(ADCC)》(Effect of Corticosteriods on NeutrophilFunctionInhibition of Antibody-dependent Cell-MediatedCytotoxicity(ADDC))，《免疫藥理學雜誌》(J.Immunopharmacol.)5，217-30(1983))。本實施例闡明α-MSH和/或其衍生物抑制感染源的生長，而且不降低中性粒細胞抗感染的能力。本實施例進一步表明α-MSH和/或其衍生物確實可以增強中性粒細胞殺傷感染源的能力。
來自健康志願者的靜脈血(20毫升)肝素抗凝處理後，加入右旋糖苷沉澱劑並採用Ficoll-Hypaque(購於美國密蘇裡州聖路易斯的Sigma化學製劑公司)離心機離心分離中性粒細胞。低滲休克下紅細胞溶解，中性粒細胞則至少佔細胞懸浮液的97％。由胎盤蘭排除法得到的細胞生存力大於98％。中性粒細胞再懸浮於HBSS中，以用於實驗。
將白色念珠菌(1×106)與AB型血清置於37℃振蕩水浴中調理30分鐘。隨後，在單純培養基上或含有濃度為10-15-10-4M的α-MSH(1-13)(序列號4號)或α-MSH(11-13)(序列號1號)培養基上與中性粒細胞一起培養，于振蕩水浴中37℃培養2小時。2小時後，將培養管置於冰上以中斷生長，衝洗細胞外生物體兩次，並4℃離心(1000xg)。於懸浮液中加入2.5％的脫氧膽酸鈉溶液，振蕩試管5分鐘。然後加入冷蒸餾水得到密度為106個細胞/毫升的菌液，再在HBSS中按1/100地比例依次稀釋兩次，從而得到密度為100個細胞/毫升的菌液。從此菌液中取一毫升的等分樣品塗於血瓊脂板，37℃培養48小時。48小時後選取三分之一計數菌落形成單位，並採用五個不同個體來源的血漿重複計數。
圖6表明α-MSH(1-13)(序列號4號)和(11-13)(序列號1號)在10-12-10-4M濃度範圍內(p＜0.01)確實能夠增強中性粒細胞對白色念珠菌的殺傷力。同時圖6表明它們在很大的濃度範圍內都可以促進中性粒細胞的殺傷力，即使是在相當於人血漿α-MSH濃度的皮摩爾濃度條件下。
由此本實施例說明α-MSH或其衍生物可以同時抗感染和炎症，此特性也適用於念珠菌病、陰道炎、尿道炎、陰莖頭包皮炎或痔瘡。
實施例VI 本實施例提示α-MSH和/或其衍生物的抗微生物特性的一般細胞機制，以及抗真菌特性的特殊機制。
經甲苯/乙醇滲透作用的白色念珠菌(106/毫升)，在10-6M濃度的α-MSH(1-13)(序列號4號)、(11-13)(序列號1號)或毛喉萜(forskolin)(已知能夠增加細胞內cAMP)存在或缺失的條件下，37℃下振蕩培養。三分鐘後加入用冰冷卻的乙醇以中止反應。cAMP水平由市售酶免疫試劑盒(購於英國Amersham)測定兩次，在測定之前根據產品說明通過液相方法對反應體系進行抽提。在另一個相關實驗中，白色念珠菌暴露於濃度為25、50和1×10-5M的雙脫氧腺苷(ddAdo，Sigma)2小時，再與α-MSH或其衍生物作用2小時。雙脫氧腺苷是蛋白抑制劑，抑制腺苷酸環化酶。採用與實施例II相同的方法測定毛喉萜和雙脫氧腺苷對白色念珠菌菌落形成的影響。
圖7表明α-MSH(1-13)(序列號4號)和(11-13)(序列號1號)可提高白色念珠菌內cAMP含量，其cAMP的增加量與等摩爾毛喉萜誘導的增加量的數量級相同。圖8顯示與α-MSH(1-13)(序列號4號)和(11-13)(序列號1號)一樣，毛喉萜也明顯抑制白色念珠菌生長(與對照相比p＜0.01)。圖9表明雙脫氧腺苷能過扭轉α-MSH(1-13)(序列號4號)和(11-13)(序列號1號)對白色念珠菌生長的影響。
本實施例說明α-MSH及其衍生物抑制白色念珠菌和其它微生物生長的作用最可能是通過增加cAMP水平實現的，cAMP含量的提高抑制mRNA和蛋白合成(參閱Bhattacharya A.等，《cAMP對白色念珠菌RNA和蛋白合成的作用》(Effect of Cyclic AMP on RNAand Protein Synthesis in Candida albicans)，《生化與生理研究通訊》(Biochem.Biophysics.Res.Commun.)771483-44(1997))。
實施例VII 本實施例闡明α-MSH或其衍生物抑制人體細胞內病毒複製的能力，或者更確切地說，闡明α-MSH抑制慢性感染的人單核細胞內HIV-1病毒的複製和表達。
HIV-1慢性感染的幼單核細胞U1細胞系是潛伏型單核細胞HIV感染的體外模型。這些細胞攜帶兩套整合的HIV原病毒拷貝，HIV的基本表達較低。但是，根據RNA轉錄、p24抗原或逆轉錄酶釋放等測定的病毒複製可以被不同的刺激活化，如TNF-α、IL-6、IL-10、PMA或細胞擁擠狀態。
上述細胞置於由完全培養基(含有10毫摩爾Hepes的RPMI1640培養基)、包含2毫摩爾L-穀氨酸(Sigma-Aldrich)、10％熱滅活的FCS(美國猶他州Logan的Hyclone實驗室提供)、100單位/毫升的青黴素和100微克/毫升的鏈黴素(紐約，Grand Island，Gibco實驗室提供)，組成的培養基中維持對數期生長，以觀察α-MSH和/或其衍生物對HIV複製的影響。首次的試驗性實驗用來確定上述培養條件下的最佳細胞密度、刺激物濃度HIV-1 p24抗原生成的動力學。在使用前，用HBSS衝洗細胞三次以去除細胞外病毒。然後在濃度為10-15-10-4摩爾範圍的α-MSH(1-13)(序列號4號)或(11-13)(序列號1號)存在或缺乏的條件下，將細胞以2×105/毫升的密度(1毫升的最終體積)鋪於24孔的平底培養皿，培養皿中只有培養基或加入TNF-α(10毫微克/毫升)(英國英格蘭牛津R&D系統提供)。
在進一步的實驗中，U1細胞中單獨加入濃度為10-5M的α-MSH(11-13)(序列號1號)，這些細胞是經過TNF-α(10毫微克/毫升)、IL-6(20毫微克/毫升)、IL-10(20毫微克/毫升)(英國英格蘭牛津的R&D系統提供)、PMA(1毫微克/毫升)(Sigma-Aldrich)或細胞擁擠刺激的。將密度為2×105/毫升的U1細胞在37℃、5％CO2的條件下不更換培養基培養7天，細胞即可達到擁擠狀態。由細胞因子或PMA激活的培養只能持續48小時。然後離心以分離上清液，採用市售ELISA試劑盒(美國紐約Buffalo的細胞實驗產品有限公司生產)檢測p24抗原，採用市售逆轉錄酶ELISA反向分析試劑盒(瑞典Lund Innovagen生產)檢測逆轉錄酶的釋放。對於所有這些實驗，在第一天加入α-MSH(11-13)(序列號1號)，每一種條件下的結果的測定均重複三次。
圖10表明α-MSH(1-13)(序列號4號)和(11-13)(序列號1號)在較大濃度範圍內明顯抑制TNF-α刺激的U1細胞的p24抗原釋放。對於上述二種肽最有效的濃度均是10-5M，分別產生52.7％和56.0％的抑制效應。圖11表明α-MSH(11-13)(序列號1號)也抑制IL-6、IL-10、PMA或細胞擁擠狀態誘導的U1細胞的p24抗原和逆轉錄酶釋放。此外，圖12表明，根據Northern印記分析的測定結果，α-MSH(11-13)(序列號1號)還可以抑制PMA刺激的U1細胞的剪切和未剪切HIV-1 RNA的轉錄。
由此本實施例說明α-MSH或其衍生物能夠抑制由TNF-α、IL-6和IL-10途徑誘導的病毒基因的轉錄。
實施例VIII 本實施例進一步闡明了α-MSH抑制病毒複製和活化的能力，或者更確切地說，闡明了向U1細胞中加入α-MSH的中和性抗體明顯增加p24抗原的釋放。
U1細胞的培養方法與實施例VII中所述的類似。採用親和純化的兔抗α-MSH抗體(瑞典，Malmo，Euro-Diagnostica提供)阻斷U1細胞內源性α-MSH的產生，此抗體對介質以1∶250稀釋。對照抗體選用同等稀釋度的兔IgG。抗α-MSH抗體和對照抗體處理的細胞(2×105/毫升)在培養基或PMA(1毫微克/毫升)中共同培養。37℃培養48小時後，分離上清液並檢測p24抗原的釋放。在擁擠狀態實驗中，U1細胞的培養同上述方法，抗α-MSH抗體和對照IgG在第一天加入，第七天收集上清液。
圖13表明在靜止狀態、PMA誘導狀態、或U1細胞擁擠狀態，阻斷α-MSH會明顯增加p24抗原的釋放。本實施例強有力地提示病毒複製受α-MSH的影響。
實施例IX 本實施例闡明了α-MSH和/或其衍生物抑制病毒複製和表達的機制，或者更確切地說，闡明了α-MSH或其衍生物抑制TNF-α誘導的NF-κB活化和結合的機制。
取20×106個U1細胞(在完整培養基中密度為2×105/毫升)製備核提取物，以測定NF-κB活性水平，其中U1細胞先在濃度為10-5M的α-MSH(11-13)(序列號1號)存在或缺失的條件下用TNF-α(20毫微克/毫升)刺激4小時。用冷PBS衝洗細胞一次，緩衝液A(10毫摩爾Hepes(pH7.9)，1.5毫摩爾MgCl2，10毫摩爾KCl，0.5毫摩爾PMSF和0.5毫摩爾DTT)衝洗兩次，離心，置於冰上，在加入0.1％NP-40的緩衝液A中培養10分鐘。隨後，棄去上清液，核碎片懸浮於15微升的緩衝液C(20毫摩爾Hepes(pH7.9)，1.5毫摩爾MgCl2，0.42摩爾KCl，0.2毫摩爾EDTA，25％甘油，0.5毫摩爾PMSF和0.5毫摩爾DTT)中，冰上培養15分鐘，混勻，離心。用75微升標定的緩衝液D(20毫摩爾Hepes(pH7.9)，0.05毫摩爾KCl，0.2毫摩爾EDTA，20％甘油，0.5毫摩爾PMSF和0.5毫摩爾DTT)稀釋上清液，-80℃保存。結合反應於室溫下進行10分鐘，反應體系中含有10微克核提取蛋白和0.5毫微克32P標記的NF-κB(30,000cpm/微升)或者AP1混合於緩衝液A(12毫摩爾Tris-HCl(pH7.8)，60毫摩爾KCl，0.2毫摩爾EDTA和0.3毫摩爾DTT)，再加入10％甘油、2微克/毫升牛血清白蛋白和1微克/毫升單鏈DNA(Pharmacia Biotech)。此研究中用於NF-κB的寡核苷酸有+GAT CCA AGG GGA CTT TCC GCTGGG GAC TTT CCA TG，和-GAT CCA TGG AAA GTC CCC AGCGGA AAG TCC CCT TG。每一個寡核苷酸退火與其互補結合，並且用多聚核苷酸酶在末端標記32P-γ-ATP。為了確定特定鏈，在與標記探針溫浴之前，核提取物先與100倍過量的未標記探針溫浴五分鐘。然後，混合物在1x TBE條件下，於5％(30∶1)聚丙烯醯胺凝膠上進行電泳，再將凝膠乾燥，進行放射自顯影。
圖14表明TNF-α明顯增強NF-κB的結合活性，但是與濃度為10-5M的α-MSH(11-13)(序列號1號)共同培養明顯降低NF-κB的活化。但是α-MSH(11-13)(序列號1號)並不改變靜止細胞NF-κB的活化。此現象說明α-MSH和/或其衍生物通過調控NF-κB的結合而抑制病毒複製和表達。
病毒物質的複製通常依賴被感染細胞的活化狀態，受病毒和宿主的相互作用調控。這些宿主因素可能包括TNF-α和其它細胞因子，如白介素。與HIV-1感染和活化類似，單純皰疹病毒(HSV)在宿主細胞因子作用下也可以從潛伏狀態活化。例如，TNF-α和IL-6，但不包括IL-1和IL-3，已經確定可以活化HSV感染。用抗IL-6抗體中和IL-6可明顯抑制HSV的活化，相比之下中和α或β幹擾素卻沒有影響。(參閱Baker，M.等，《白介素-6和單純皰疹病毒1型的關係對行為和免疫病理的提示》(The Relationshipbetween Interleukin-6 dnd Herpes Simple virus Type-1Implications forBehavior and Immunopathology)，《大腦行為免疫》(BrainBehav.Immunol.)13(3)201-11(1999)；Noisakran S.等，《體外移植的潛伏感染的三叉神經節中HSV-1活化過程中淋巴細胞延遲動力學》(Lymphocytes Delay Kinetics of HSV-1 Reactivation fromin vitro Explanes of Latent Infected Trigeminal Ganglia)，《神經免疫學雜誌》(J.Neuroimmunol.)95(1-2)126-35(1999)；Walev，I.等，《TNF-α對小鼠三叉神經節內潛伏單純皰疹病毒的復活和複製的增強作用》(Enhancement by TNF-αof Reactivation andReplication of Latent Herpes Simplex Virus from Trigeminal Ganglia ofMice)，《病毒學文獻》(Arch.Virol.)140(6)987-92(1995)；Domk-Optize，I.等，《內源性毒素刺激巨噬細胞導致持續單純皰疹病毒感染的復活》(Stimulation of Macrophages by Endotoxin Results inthe Reactivation of a Persistent Herpes Simplex Virus Infection)，《斯堪地那維亞免疫雜誌》(Scand.J.Immunol.)32(2)69-75(1990)；Fauci，A.S.，《HIV所致疾病發病機理中宿主因子的作用》(HostFactors in the Pathogenesis of HIV-induced Disease)，《自然》(Nature)384529(1996))。
TNF-α或包括HSV在內的病毒感染可以導致IκB的靶向損害，後者又可活化NF-κB的核轉位。核轉位促進NF-κB與DNA操縱子的結合，從而促進大量炎症因子的轉錄，包括TNF-α、IL-6和其它細胞因子。這些細胞因子的表達又進一步復活其它HSV感染的細胞以產生HSV病毒(參閱Patel，A.等，《單純皰疹病毒I型對持續NF-κB核轉位的誘導提高病毒複製的效率》(HerpesSimplex Virus Type-1 Induction of Persistent NF-κB NuclearTranlocation Increases the Efficiency of Virus Replication)，《病毒學》(Virology)247(2)212-22(1998))。
因此，α-MSH和/或其衍生物通過阻斷NF-κB的結合抑制更多活化HSV的炎症性細胞因子的表達。本實施例以及實施例VII-VIII表明α-MSH和/或其衍生物抑制病毒複製、表達和復活，此作用是通過抑制機體細胞因子或其它病毒感染誘發的NF-κB的結合而實現的。
實施例X 本實施例闡明α-MSH和/或其衍生物抑制急性感染人體細胞內病毒複製的能力，或者更確切地說，闡明α-MSH抑制實際感染的人外周血單核細胞(PBMCs)內HIV-1複製和表達的能力。
採用Ficoll-Hypaque密度梯度離心分離來自正常個體的PBMCs。單核細胞由Percoll梯度分離，然後選取24孔組織培養板，在加入20％FCS的RPMI完全培養基內使其分化7天，成為巨噬細胞(MDM)，細胞密度為106/毫升。用嗜單核細胞的HIVBα-1株(1∶10)感染MDM，過夜。未稀釋的病毒群包含107個感染單位/毫升。24小時後，衝洗MDM並將其重新懸浮於完整介質中。一周更換三次，連續三周。採用市售ELISA Retrosys RT試劑盒(瑞典lund Innovagen生產)，感染後每周測定反轉錄酶的釋放量。HIV感染時及其後的每一天加入10-5M的α-MSH(11-13)(序列號1號)，直到最後採樣。
圖15表明α-MSH明顯抑制急性感染的MDM中逆轉錄酶的釋放。此抑制效應在第6天更顯著，但第21天仍有統計學意義。
由此本實施例說明感染部位的病毒複製可以被α-MSH和/或其衍生物抑制。所以，通常性傳播疾病，尤其是HIV，可以通過α-MSH和/或其衍生物與避孕工具的結合運用而被抑制，避孕工具如用於性交的保險套、隔膜、海綿和/或性交後所用的含α-MSH和/或其衍生物的栓劑、油脂、油膏、凝膠或氣溶膠泡沫。
實施例XI 本實施例闡明α-MSH和/或其衍生物的生物學功能相當物。
雖然這裡所述特定胺基酸序列是有效的，但對於熟悉本專業的技術人員來說，很容易做到替換或去除胺基酸而不改變肽類的有效性。進一步來說，α-MSH序列的穩定可以大幅度提高肽類活性，替換D-胺基酸構型為L型可以提高或降低肽類活性。例如，α-MSH的穩定類似物，[Nle4，D-Phe7]-α-MSH，其解熱作用是母體肽分子大約10倍有餘。此物質已知對黑素細胞和黑素瘤細胞有明顯的生物學活性。確切地說，在α-MSH(11-13)(序列號1號)的C-末端加入胺基酸能夠降低或加強解熱效應。加入甘氨酸形成10-13序列(序列號5號)，可以略微減弱其效應；形成9-13序列(序列號6號)，幾乎無解熱作用；而8-13序列(序列號7號)的解熱效應強於11-13序列(序列號1號)。已知Ac-[D-K11]-α-MSH11-13-NH2具有和α-MSH(11-13)(序列號1號)的L型三肽相同的總體效應。但是在三肽的12位以D-脯氨酸替換將導致其活性的喪失(參閱Holdeman，M.等，《一種有效α-MSH類似物的解熱活性》(Antipyretic Activity of a Potentα-MSH Analog)，《肽物質》(Peptides)6，273-5(1985)；Deeter，L.B.等，《兔中樞給予α-MSH片斷的解熱特性》(Antipyretic Properties of centrally Administeredα-MSH Fragments in the Rabbit)，《肽物質》(Peptides)9，1285-8(1989)；Hiltz，M.E.，《α-MSH(11-13)類似物的抗炎活性立體化學改變的影響》(Anti-inflammatory Activity ofα-MSH (11-13)AnalogsInfiuences of Alterations in Stereochemistry)，《肽物質》(Peptides)12，767-71(1991))。
生物學功能相當物也可通過替換具有近似親水值的胺基酸來獲得。例如，異亮氨酸和亮氨酸(親水指數分別是+4.5和+3.8)可以用來替換纈氨酸(親水指數為+4.2)，這樣仍可得到具有相似生物學功能的蛋白。可供選擇的另一種方法針對親水指數為負值的胺基酸，如賴氨酸(-3.9)可用精氨酸(-4.5)替換，等等。一般而言，和被替換胺基酸親水指數差別在單位+/-1範圍內的胺基酸能夠成功地進行替換。
此外，這些經修飾的α-MSH和/或其衍生物的類似物也能夠象圖16中所描述的KPV二聚體一樣形成二聚體。
實施例XII 女性經受著陰道、外陰和/或尿道的不適。醫生的檢查包括上述部位取材的培養。確定了包括任何感染和炎症在內的不適之後，醫生可以開處方，如適當的抗生素、抗真菌藥、抗病毒藥或消炎藥。此外，治療也可以包括劑量達到藥理學效應的α-MSH和/或其衍生物的局部應用，α-MSH和/或其衍生物由藥膏、油脂、膠體、可溶性藥丸、噴霧、栓劑、用於灌注的溶液、或者棉條吸收材料攜帶到達局部。根據醫生的判斷，局部治療可一次或多次使用，直到疾病治癒。
本實施例在醫生的判斷下適用，也可應用於有陰莖、睪丸和/或尿道不適的男性病人。此外，α-MSH和/或其衍生物的局部治療也可不在醫生的指導下進行，而以非處方藥物形式使用。
上述實施例I-XII闡明了α-MSH和/或其衍生物的抗感染活性和應用。其中引用數據的目的只是便於說明實施例，並不是把本發明局限於這些實施例範圍內。應該明了的是，對上述實施例的修改並不偏離本發明的精神。而且，這些實施例可單獨或聯合進行。
權利要求
1.在C-末端具有胺基酸序列KPV的多肽在製備用於治療泌尿生殖系統疾病的藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其中，所述的多肽包括至少一個D型胺基酸。
3.根據權利要求1所述的應用，其中，所述的胺基酸序列KPV位於所述多肽的C末端。
4.根據權利要求1所述的應用，其中，所述的多肽被N端乙醯化、或C端醯胺化、或者二者兼有。
5.根據權利要求1所述的應用，其中，所述的多肽通過載體施用。
6.根據權利要求1所述的應用，其中，所述的多肽作為膠體施用。
7.根據權利要求1所述的應用，其中，所述的多肽以膠體、藥膏、泡沫、止痛香膏、油脂、可溶性藥丸、氣溶膠噴霧、氣溶膠泡沫或灌注用的液體的形式施用。
8.根據權利要求1所述的應用，其中，所述的多肽通過一個敷料器施用。
9.根據權利要求8所述的應用，其中，所述的敷料器選自由注射器、繃帶、導管、塗藥用抹刀組成的組。
10.根據權利要求8所述的應用，其中，所述的敷料器的至少一部分插入陰道。
11.根據權利要求1所述的應用，其中，所述的生殖系統疾病由細菌性感染引起。
12.根據權利要求11所述的應用，其中，所述的細菌性感染由金黃色葡萄球菌引起。
13.根據權利要求1所述的應用，其中，所述的生殖系統疾病由真菌感染引起。
14.根據權利要求13所述的應用，其中，所述的真菌是念珠菌屬。
15.根據權利要求14所述的應用，其中，所述的真菌為白色念珠菌。
16.根據權利要求1所述的應用，其中，所述的生殖系統疾病由病毒感染引起。
全文摘要
本發明涉及用於治療泌尿生殖系統疾病的一種或多種多肽所形成的二聚體。泌尿生殖系統疾病包括感染、炎症、或者二者兼有。在本發明的一個優選實施例中，泌尿生殖系統疾病包括陰道、外陰、尿道、陰莖、和/或直腸的感染、和/或炎症。在本發明的另一個優選實施例中，一種或多種多肽溶於載體內。而另一個優選實施例中，一種或多種多肽與棉條結合，用來預防中毒性休克綜合症。在另一個優選實施例中，一種或多種多肽與避孕工具結合，以防止性傳播疾病或感染。在一個優選實施例中，一種或多種多肽與栓劑結合，以便於插入陰道或肛門。
文檔編號C07K7/08GK101249258SQ20071019454
公開日2008年8月27日 申請日期2000年3月23日 優先權日1999年3月24日
發明者詹姆斯·利普頓, 安娜·卡塔尼亞 申請人:曾根公司