用於改善肝臟代謝的組合物和診斷方法

2023-05-21 01:35:16 6

專利名稱：用於改善肝臟代謝的組合物和診斷方法
技術領域：
本發明涉及一種用於支持並改善肝臟代謝，尤其是與脂肪肝有關的肝臟代謝的組 合物，所述組合物包含乳清蛋白質。此外，本發明涉及基於代謝圖譜分析來確定脂肪肝的診 斷方法。
背景技術：
腹部肥胖與代謝症候群的發展密切相關。減輕體重是目前已知的減輕代謝症候群 的幾種有效治療方法之一。不過，代謝症候群並不一定是肥胖導致的。另一方面，並非所有 的肥胖人群都會發展出代謝症候群。脂肪肝在代謝症候群的發展中的重要性只是最近幾年 才被意識到。已經表明，肝臟中的脂肪累積是區分發展代謝症候群的個體與未發展代謝症候群
(Kotronen,A. and Yki-JarvinenjH. ,Fatty Liver. A Novel Component of the metabolic Syndrome,Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2007 ; (2007年8 月 9 日上 線)。一旦脂肪化，肝臟則為胰島素抵抗，並且過度產生主要的心血管危險因素，如C-反應 蛋白(CRP)、極低密度脂蛋白(VLDL)和纖溶酶原激活物抑制劑-I(PAI-I) (Yki-Jarvinen, H. Fat in the liver and insulin resistance, Ann Med. 2005 ；37 (5) :347—356) 。]lfc^t，il 過減輕體重來改善胰島素抵抗仍然是非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)的治療的基礎。此外， 預防和治療肝臟脂肪累積的手段受限。而且，關於調節脂肪肝的機制了解相對較少。因而， 一直需要在分子水平上更好地理解脂肪肝的複雜性，並找到有效且相關的手段和特定的化 合物和/或藥劑以控制、減輕、緩解或預防脂肪肝的形成和/或發作。乳清蛋白質與鈣的組合已經顯示出在飲食誘發的肥胖症模型中能夠減輕體重和 脂肪組織的增長(Ρ Ιν ,Τ. K. , Korpela, R.，Huttunen，M. , Vapaatalo, H. , Mervaala, Ε. Μ.， High-calcium diet with whey proteinattenuates body-weight gain in high-fat-fed C57B 1/6J mice, Br. J. Nutrition, 007,98 =900-907) 已經進行的一些研究是關於例如乳 清蛋白質與鈣的組合用於體重調節顯示出通過在進食後「關閉」食慾而降低體脂或維持較 低體重的潛力。但背景技術未提出任何指示，即乳清蛋白質與飲食中鈣的組合既不能在能 量限制下促進體重減輕，因而也不具有減輕脂肪肝的有利效果。在本領域中已知有一些脂質代謝改善劑，例如甘油糖脂(NisshinSugar Manufacturing Co Ltd, JP 2005314256)、大豆蛋白的酶促消化產物(Fuji Oil Co Ltd, W02003026685)和奶源性鹼性蛋白或鹼性肽片段(SnowBrand Milk Prod.，JP 2002212097)。這樣的藥劑和包含所述藥劑的食品和飲料據認為可用於預防和改善與生活 方式有關的疾病，如脂肪肝、高脂血症、高膽固醇血症、動脈硬化、肥胖等等，但無益處的明 確證據。此外，在出版物WO 2007/069744(Ajinomoto Co. ,Inc.)中描述了用於改善與脂質 代謝有關的基因表達的藥劑，其包含三種支鏈胺基酸異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸作為活性 成分。此外，WO 2006/070873 (Ajinomoto, Co.，Inc.)描述了顯示出低脂聯素血症、高脂血症、高血壓、血管病、脂肪肝、肝纖維化或肥胖症的預防或治療效果的食物或飲料產品，其包 含脂聯素誘導劑或脂聯素分泌促進劑，包含選自亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、半胱氨 酸、丙氨酸及其混合物的胺基酸。JP 2004300114(Fuji Oil Co.，日本)描述了一種寡肽混合物，該混合物通過在內 切蛋白酶或外切蛋白酶存在下分解大豆並利用疏水性樹脂進行處理而得到，所述疏水性樹 脂強烈地控制來自肝細胞的載脂蛋白B的分泌。根據該出版物，提出了所述混合物可用於 治療和預防例如肥胖症、脂肪肝、動脈粥樣硬化、高膽固醇血症、高甘油三酯血症、糖尿病、 高血壓、慢性腎炎、肝硬化和阻塞性黃疸。脂質是高度多樣化的分子，除了起到能量存儲的作用之外還作為信號分子和結構 分子發揮重要作用。至關重要的是鑑別在肝臟中累積的各種脂質物種以理解肝臟的胰島素 抵抗的複雜過程。Puri等指出，在人類的NAFLD中，甘油三酯(TAG)和甘油二酯(DAG)的水 平增加，而卵磷脂(PC)的總量減少(Puri P,Bailiie RA,Wiest MM,Mirshahi F,Choudhury J,Cheung 0,Sargeant C,Contos MJ,Sanyal AJ. ,A lipidomic analysis of nonalcoholic fatty liver disease，H印atology，2007，46 (4) 1081-1090)。具體而言，神經醯胺連同 TAG 和DAG的累積似乎指示了脂肪肝的發展。在ob/ob小鼠中已經發現TAG和DAG，二醯基磷酸甘油酯和特定的神經醯胺(CER) 物種的上調和鞘磷脂類(SM)的下調(Yetukuri，L. Katajamaa, M.，Medina-Gomez, G,
Sep-panen-Laakso, Τ. ,Vidal-Puig,A. ,0resic,M. ,Bioinformatics strategies for lipidomics analysis characterization of obesity related hepatic steatosis,BMC Systems Biol. ,2007,1 :12)。此外，這些採用基因引起的肥胖的胰島素抵抗的ob/ob小鼠 模型沒有顯示出任何作用機制，而且不是非常類似人類的脂類組學研究的實驗模型。需要開發針對代謝症候群的治療和預防。這種治療和預防應當旨在維持健康的肝 髒代謝，而且並不間接實現減輕體重。因此，必須開發一種對於脂肪肝的直接治療，其旨在 改善肝臟代謝並預防代謝症候群的發展。此外，由於有效的生物標記物和樣品基質的選擇的複雜性，特別需要找到用於脂 肪肝和代謝症候群的特異性生物標記物。此外還需要開發不需要非必要的如肝活檢等侵入 性取樣的生物標記物。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種用於預防和/或治療脂肪肝的組合物，所述組合物 包含乳清蛋白質。此外，本發明的另一個主要目的是在分子水平上更好地理解與脂肪肝有 關的機制和關鍵代謝物及其變化，並提供針對脂肪肝的特定治療和生物標記物。本發明提供一種用於預防和/或治療脂肪肝的包含乳清蛋白質的組合物。此外，本發明提供一種支持並改善肝臟代謝的方法，其中所述方法包括對需要該 治療的對象施用包含乳清蛋白質的組合物。而且，本發明還提供診斷對象的脂肪肝的方法，所述方法包括測定取自所述對象 的血樣中的與肝臟代謝有關的至少一種代謝物的量，由此所述代謝物的異常量指示肝臟代 謝的狀態。本發明提供針對脂肪肝的治療，其旨在改善肝臟的脂質代謝，並且並不間接實現減少體重。本發明還提供用於脂肪肝和健康的肝臟脂質代謝的生物標記物。所述生物標記物 可從血液、血清或血漿中測定，無需對肝臟活檢。所公開的生物標記物提供了肝臟代謝的完整描述。肝臟代謝的機制複雜，因而生 物標記物仍然應當提供肝臟代謝狀況的詳細描述。本文中公開的診斷方法正好提供了這 個。


圖1顯示了肥胖對照組、體重下降(酪蛋白=CPI，乳清+Ca = WPI)和瘦型對照組 小鼠(η = 10/組)的最終體重和體脂。棒圖表示平均值士SEM值。沒有共同字母的平均 值不同，P < 0. 05。圖2顯示了不同組(瘦型對照組；肥胖；體重減輕(酪蛋白=CPI)；體重減輕(乳 清+Ca = ffPi))的小鼠肝臟中的代謝圖譜的PLS/DA得分圖。圖3顯示了 PLS/DA負載。A 基於LVl負載的排名前10的脂質，和靠前的低排名 脂質。B 基於LV2負載的排名前10的脂質，和靠前的低排名脂質。圖4顯示了瘦型對照組和肥胖對照組之間具有最高比率的10種代謝物和具有最 低比率的10種代謝物的倍數變化。圖5顯示了與WPI和CPI組相比的前15個上調和下調的代謝物。圖6顯示了血清中的代謝圖譜的PLS/DA得分圖(瘦型對照組；肥胖；體重減輕 (酪蛋白=CPI)；體重減輕(乳清+Ca = WPI))。
具體實施例方式本發明提供一種用於改善和維持健康的肝臟代謝的包含乳清蛋白質的組合物，且 可用於治療和/或預防脂肪肝。脂肪肝與肥胖症和代謝症候群密切相關，因而也與胰島素 抵抗和II型糖尿病密切相關。脂肪肝的治療因而可用於患有代謝症候群的患者。代謝綜 合徵傳統上使用旨在減輕患者體重的方案或藥物進行治療。本發明的組合物使得能夠進行 下述治療，即不是旨在減輕體重而是改善肝臟的代謝。因此，所述組合物可用於治療患有脂 肪肝和代謝症候群的體重正常或苗條的患者。本發明的組合物還可優選包含鈣。已經發現，乳清蛋白質與鈣的組合對於治療脂 肪肝是特別有用的。所述組合物還可包含其他的改善和維持健康的成分，如益生素和益生兀。本發明基於令人驚訝的發現，即乳清蛋白質飲食可明顯改善肝臟代謝圖譜。代謝 圖譜的改善顯示，乳清蛋白質飲食對肝臟的健康直接起作用。改善的代謝圖譜對於治療和 預防脂肪肝極為重要。本發明因而提供了恢復和維持健康的肝臟代謝的方法。健康的肝臟代謝對於預防和治療代謝症候群是必要的。本發明提供了針對所有患 有代謝症候群的患者的治療，因為該治療直接針對肝臟的脂質代謝而不是旨在減輕體重。 因而，患有代謝症候群而未患肥胖症的對象組如今可用本文中提供的方法治療。本發明的組合物改善了肝臟的代謝圖譜。因此，重要的是可以在該治療之前，尤其 是該治療期間監測脂質代謝。本發明因而還提供了用於監測肝臟的脂質代謝的方法。
本發明的另一個方面是用來自體樣的代謝生物標記物監測肝臟代謝。由此提供了 診斷對象脂肪肝的方法，其中所述方法包括測定取自所述對象的體樣中的與肝臟代謝有關 的至少一種代謝物的量，由此所述代謝物的異常量指示肝臟代謝的狀態。優選的是，所述體 樣是血樣，並且同時測定多種代謝物的量。令人驚訝的發現是，可由從血樣所分離出的血清 監測並追蹤肝臟代謝(脂肪肝)，而無需活檢取樣。因此，提供了通過由血樣測定代謝生物 標記物來確定脂肪肝的狀態的方法。本文中所提供的方法可用於確定脂肪肝或治療期間用 於監測疾病的發展。代謝生物標記物可通過收集脂類組學圖譜、水溶性代謝物圖譜或脂類組學圖譜與 水溶性代謝物圖譜的組合而確認。代謝圖譜分析是對非水溶性代謝物(脂質)和水溶性代謝物的大規模研究。代謝 圖譜可通過下述技術獲得例如電噴霧離子化(ESI (+/-))、質譜(MS)、液相色譜和質譜聯 用(LC/MS)以及全二維氣相色譜與高速飛行時間質譜聯用(GCxGC-TOF)。代謝物之間的關 系通常由多變量方法表徵。這使得能夠由單一樣品同時分析幾種甚至大量的代謝物，從而 獲得「脂質圖譜」、「水溶性代謝物圖譜」或「代謝物組學圖譜」(即，脂質和水溶性代謝物的 組合)。這些結果隨後可應用統計建模方法而用於鑑別脂肪肝典型的代謝圖譜。初級代謝物是選定的一組代謝物，其是能量代謝途徑如TCA循環和磷酸戊糖途徑 中的關鍵代謝物。脂類組學圖譜和水溶性代謝物圖譜的組合提供了準確可靠的針對脂肪肝的生物 標記物。如今已經驚訝地發現，通過調節減重飲食中的蛋白質來源和鈣的含量，能夠顯著 改善全面的脂類組學圖譜和初級代謝物圖譜(實施例2)。此外，乳清蛋白質和鈣在能量限 制過程中顯著促進了體重和脂肪的減少，並降低了脂肪的吸收(實施例1，圖1)。此外，已經驚人地顯示出，體重減輕改善了肝臟脂質圖譜，清楚表明肝臟的甘油三 酯、磷脂和神經醯胺含量的顯著變化。當體重減輕伴隨乳清蛋白質飲食時，肝臟代謝物圖譜 的改善甚至比體重減輕而無乳清蛋白質時更為顯著。與高脂飲食誘發的肥胖症有關的肝臟脂質圖譜的主要變化是TAG的量增多和主 要的磷脂(如磷脂醯乙醇胺和卵磷脂)的量減少(實施例2，圖3A)。一些TAG物種在肥胖 組中相比於瘦型組增大了甚至10倍至20倍。此外，某些神經醯胺也在具有通過倍數變化 計算出的最大增加的物種中。本發現表明存在或不存在乳清蛋白質飲食時體重的減輕與TAG水平的減少和鞘 磷脂、膽留醇酯和磷脂醯絲氨酸水平的增多有關。可最佳地區分體重減輕組和肥胖組的代 謝物的變化是特定的TAG和神經醯胺物種的減少及鞘磷脂、膽留醇酯和磷脂醯絲氨酸的增 多(圖3B)。然而，當體重減輕伴隨乳清蛋白質飲食(乳清+Ca = WPI)時，相比於對照組飲食 的體重減輕(CPI)，幾種磷脂物種如磷脂醯乙醇胺和鞘磷脂的水平增加，而TAG和糖解代謝 物的水平減少(圖5)。乳清+Ca(WPI)治療顯著地調節了初級代謝。體重減輕組之間的代謝物水平的直 接比較令人驚異地揭示出，使用WPI飲食的體重減輕與TCA循環和磷酸戊糖途徑代謝物水 平的增加有關。相比於對照組飲食的體重減輕(CPI)，WPI飲食還增加了幾種磷脂物種(如磷脂醯乙醇胺和鞘磷脂)的水平，並減少了 TAG和糖解代謝物(圖5)。令人驚訝的是，乳清+Ca (WPI)飲食還對血清代謝物圖譜具有顯著影響(實施例3， 圖6)。因此，有力地表明了用於全面的代謝圖譜分析和對具體的生理狀態建模的有效的非 侵入性方法。不需要對肝臟進行活檢取樣的方法在此處稱為「非侵入性方法」。例如，血樣 在此處被視為非侵入性取樣法。血樣可以在常規的健康檢查時採集，並且可以在任何醫學 實驗室中進行。在本發明中，「乳清蛋白質」指的是源自乳清的蛋白質、源自乳清的肽片段、源自乳 清的蛋白質分離物、源自乳清的蛋白質水解產物、乳清成分和/或它們的組合物或混合物。 乳清蛋白質是球狀蛋白的集合，可從乳清(由牛奶製造奶酪的副產物)中分離得到。其通 常是乳球蛋白(約65%)、α-乳清蛋白(約25%)和血清白蛋白(約8%)的混合 物。乳清蛋白質包含高水平的必需胺基酸和非必需胺基酸。在商業規模上，有數種方法可用於製造富含乳清蛋白質的產品、從乳清中除去乳 清蛋白質和純化主要的和次要的乳清蛋白質。源自乳清的蛋白質分離物通常包含牛血清白 蛋白、α-乳球蛋白、β-乳球蛋白、κ-酪蛋白片段、乳鐵蛋白等等。根據本發明，包含乳清蛋白質的組合物可以為食品、保健食品和藥物的形式。此 外，可以將組合物和施用物製造為使得其可以作為例如日常飲食的便利的一部分或補充物 而消耗的形式。因此，本發明的組合物可以如此口服施用，即，以片劑、膠囊或粉末的形式。另外， 本發明的組合物可以作為食品或營養品(如乳製品)口服施用，或作為醫藥產品口服施用。術語「食品」意在涵蓋所有的可以為固體、膠狀或液體的可消耗的產品，並涵蓋現 成的產品和單獨使用本發明的組合物或組合使用本發明的組合物與常規食品或成分而制 得的產品。食品例如可以是乳品加工業或飲料加工業的產品。因此，在製造食品或藥物產品時可以將本發明的組合物添加至食品或藥物中。本 發明的組合物還可以添加至成品食品中。所討論的食品因而對脂肪肝具有所希望的效果， 由此還對代謝症候群具有所希望的效果。各種食品、食材和/或藥物產品以及動物飼料的形式不做具體限定。適宜的食品 和/或營養品的實例包括乳製品、飲料、果汁、湯或兒童食品。本發明的組合物和產品主要適合用於成人和嬰幼兒。這些產品的積極效果也有利 於動物，尤其是寵物和畜禽。這些動物的實例包括狗、貓、兔、馬、牛、豬、山羊、綿羊和家禽。下列實施例描述了本發明。這些實施例不應解釋為以任何方式限制權利要求。
實施例實施例1.體重和脂肪含量將八周齡的雄性C57BI/6J小鼠(η= 40，Harlan，Horst，The Netherlands)在標準 實驗動物實驗室中在每個籠子內安置5隻，照明自早上6:30至下午6:30，溫度為22士 1°C。 小鼠隨意接受食物和自來水。在給餵正常飲食(Harlan Tekland 2018，Harlan Holding, Inc, Wilmington, DE, USA)的為期一周的適應期後，三十隻小鼠(25. 5士0. 3g)接受高脂飲 食(60 %的能量來自脂肪；蛋白質23. 4 %，碳水化合物26. 6 %，脂肪35.3%，纖維6. 5 % ；蛋 白質=Alacid 714酸酪蛋白，NZMP，Auckland，New Zealand)。其餘十隻小鼠在整個研究期間繼續給餵正常飲食(隨意)(瘦型對照組)。在給餵高脂飲食的14周的增重期之後，殺死 一組小鼠(肥胖組，η = 10)，其餘的小鼠接受能量限制飲食7周。在能量限制期間，小鼠獲 得在隨意給餵期間所進食的能量的70%。在能量限制期之初，將體重相匹配的小鼠分成兩 組(WPI和CPI)。WPI組接受高脂飲食(蛋白質23. 1%，碳水化合物26. 2%，脂肪35. 0%, 纖維6. 5% )，該飲食含有1. 8%的CaCO3,並且所有的蛋白質(能量的18% )來自乳清蛋白 質分離物(Alacen 895, NZMP, Auckland, New Zealand)。CPI組如在增重期時一樣繼續接 受同樣的高脂飲食(60%的能量來自脂肪；Alacid 714蛋白質23.4%，碳水化合物26.6%， 脂肪35. 3%，纖維6. 5% )。體重在增重期期間每周監測一次，在能量限制期期間每周監測兩次。每天監測食 料的消耗。在增重期和能量限制期結束時通過雙能X線骨密度儀(DEXA，Lunar PIXSmus, GE Healthcare, Chalfont St. Giles, UK)分析體脂含量。結果乳清蛋白質和鈣在能量限制期期間促進了體重和脂肪的減少並降低了脂 肪的吸收。在增重期結束時，高脂飼餵的小鼠的重量明顯大於正常飲食餵養的對照組小鼠 (41. 5 士 1. Og對34. 3 士 1. 3g，ρ < 0. 001)(圖1)。肥胖組小鼠相比於瘦型對照組具有顯著 更多的脂肪組織(43. 1 士 1.0%對25. 5士 1.0，ρ < 0. 001)。為期7周的能量限制使得WPI 組的體重減少至瘦型對照組的水平(P 0. 05對瘦型)，但是CPI組 中體重的減輕在統計學上並不顯著。WPI還減少了比CPI飲食減輕的重量更多的脂肪墊重 量。實施例2.代謝圖譜分析樣品製備在治療期結束時，用C02/02(95% /5% )使小鼠昏迷，然後實施斷頭。取 出肝臟，用鹽水洗滌，吸乾並稱重。組織樣品在液氮中迅速冷凍，在試驗前存儲於-80°C。來自脂類組學分析的脂質根據Lipid Maps (http://www. lipidmaps. org)命名。例 如，具有16:0脂肪酸鏈的溶血卵磷脂命名為單醯基-甘油磷脂醯膽鹼GPCho (16:0/0:0)。 在脂肪酸組成未測定的情況中，標記碳原子和雙鍵的總數。例如，卵磷脂物種 GPCho (16:0/20:4)表示為GPCho (364)。然而，GPCho (364)還可以表示其他分子物種，例 如 GPCho (204/160)或 GPCho (182/182)。脂類組學肝臟組織樣品(η = 10/組)、10 μ 1的包含GPCho (17:0/17:0)、 GPEtn(lp: 0/17:0)(甘油磷酸乙醇胺)、GPCho (17:0/0:0)、Cer (dl8 1/17 0)(神經醯胺) 和TG(17:0/17:0/17:0)(甘油三酯)的內標混合物和200 μ 1的氯仿甲醇(2 1)使用 球磨機在2ml的Eppendorf管中通過使用玻璃球進行均質化。加入氯化鈉溶液(0. 15M， 50 μ 1)，樣品旋轉2分鐘。在1小時提取時間之後，將樣品以IOOOOrpm離心3分鐘，將下層 的100 μ 1等分試樣取入玻璃插管(insert)中並與10 μ 1的包含GPCho (16 1/16 1-D6)、 GPCho (16:1/0:0-D3)和 TG (16 0/16 0/16 0-13C3)的混合物混合。使樣品通過配備有Acquity UPLCTM BEH C181 X 50mm柱(具有1. 7 μ m顆粒)的 Acquity UPLC 系統，利用Q-Tof Premier質譜儀對肝臟組織提取物進行檢驗。柱溫為 50 0C ο 溶劑體系由水(1% IM NH4Ac, 0. 1% HC00H)和乙腈 / 異丙醇(5:2,1% IM NH4Ac, 0. 1% HC00H)構成，流速為0. 200ml/分鐘。使用正離子模式的電噴霧離子化(ESI+)檢測 化合物。於m/z 300至1200收集數據，掃描時間為0.2秒。源溫和去溶劑化溫度分別為 120°C 禾口 250 0C ο
使用MZmine軟體0. 60版(Kata-jamaa和Oresic，2005)處理數據，使用內部譜庫 或以串聯質譜法(Yetukuri等，2007)鑑別代謝物。初級代謝物將20mg的冷凍肝臟組織(η = 10/組)稱取到Eppendorf管中， 然後加入200 μ 1甲醇(_80°C )和10 μ I13C標記的內標。樣品利用MicroDismembrator S (Sartorius, Germany)通過使用玻璃珠(0. 5至0. 75mm)在3000rpm均質化3分鐘。均質 化的樣品立即在80°C煮3分鐘，然後在IOOOOrpm均質化5分鐘。收集上清液，並在氮氣流 下蒸發至幹。在100 μ 1的超純水中將樣品復原。用HPLC-MS/MS法分析肝臟提取物以定量分析磷和TCA循環化合物。系統由在高 ρΗ下工作的HT-Alliance HPLC(Waters, Milford, ΜΑ)構成。分析物通過陰離子交換色譜 聯合柱後ASRS Ultra II 2mm離子抑制器(Dionex，Sunnyvale，CA)解析，並利用在電噴霧 負離子模式下工作的Quattro Micro三重四極質譜儀(Waters，Mil-ford，MA)檢測。分析 柱是 IonPac ASll (2 X 250mm, Dionex, Sunnyvale, CA)，保護柱為 IonPac AGl 1(2 X 50mm, Dionex, Sunnyvale, CA)。流速為250 μ 1分鐘，注入體積為5 μ 1。柱溫為35°C，自動取樣器 為10°C。使用水(99%至52% )和300mM的Na0H(l. 0%至48% )的梯度混合物。化合物在多反應監測(MRM)模式下檢測其最佳靈敏度和選擇性。將來自酵母批式 流加培養的13C標記的代謝物的小份等分試樣用作內標。定量測定磷酸己糖(葡糖-6-磷 酸酯(G6P)、果糖-磷酸酯(F6P)、甘露糖-6-磷酸酯(M6P)和6-葡糖-1-磷酸酯(6G1P))、 磷酸戊糖(核糖-5-磷酸酯(R5P)和核酮糖-5-磷酸酯(Ri5P))、果糖二磷酸酯(FBP)、甘 油-2-磷酸酯(G2P)和3-磷酸甘油酸酯(3PG)、磷酸烯醇丙酮酸酯(PEP)、6_磷酸葡萄糖酸 酯(6PG)、琥珀酸酯(SUC)、蘋果酸酯(MAL)、α -酮戊二酸酯(AKG)、草醯乙酸酯(OXA)、檸檬 酸酯(CIT)、異檸檬酸酯(ICI)、乙醛酸酯(GLY)和丙酮酸酯(PYR)。數據用MassLynx 4. 1軟體處理，基於12C分析物及13C標記類似物的響應求算內部 校準曲線。數據分析偏最小二乘判別分析(PLS/DA)和PLS分析用作建模方法進行脂類組學 和初級代謝物數據的聚類回歸。PLS/DA是模式識別技術，用於使數據集的變化與組的成員 相關聯。所產生的投影模型給出了著眼於最大分離(「判別」)的隱變量(LV)。鄰接塊交 叉驗證法和Q2分數用於開發模型。計算VIP (變量投影重要性)值以鑑別對於特定組的聚 類最為重要的分子物種。使用 Matlab 7. 2 版(Mathworks，Natick，MA)和 PLS Toolbox4. 0 版Matlab包(Eigenvector Research, ffenatchee, WA)進行多變量分析。利用雙側t檢驗 進行所選定的分子物種的水平之間的比較。使用PLS回歸分析和鄰接塊交叉驗證關聯代謝物和血糖。結果脂類組學和初級代謝物圖譜通過飲食誘發的肥胖和體重減輕發生顯著改 變。脂類組學圖譜包括391種鑑別的脂質物種，初級代謝物分析對13種代謝物(G6P、F6P、 M6P、FBP、3PG、R5P、SUC, MAL, CIT、PYR、PEP、6PG、FUM)進行了量化。對組合的脂類組學和 初級代謝物的數據的PLS-DA分析揭示了組之間的明顯差異(圖2)。具體而言，第一隱變 量(LVl)揭示了與體重差異有關的變化，而沿著第二隱變量(LV2)的差異則對於體重減輕 和飲食影響更具特異性。乳清+Ca(WPI)飲食的效果如所示的明顯強於體重減輕的效果，並 使該組更接近於瘦型對照組。不過，治療產生了不同於瘦型對照組的顯著的代謝變化。肥胖增大了 TAG的量並降低了主要磷脂的水平。與高脂飲食誘發的肥胖有關的主要改變是TAG的量增多，主要磷脂(如磷脂醯乙醇胺和卵磷脂)的量減少(圖3A)。相比 於瘦型組，肥胖組中的一些TAG物種增加了甚至10至20倍。此外某些神經醯胺也在具有 最大增加的物種中。肥胖誘發的脂肪肝並不如此多地與代謝物的量下降有關。在丙酮酸酯 (PYR)和核糖-5-磷酸酯(R5P)以及某些鞘磷脂和其他的磷脂物種中觀察到最大的負倍數變化。體重減輕與TAG的水平減少和鞘磷脂、膽留醇酯及磷脂醯絲氨酸的水平增多有 關。可最佳地區分體重減輕組和肥胖組的代謝物的變化是特定的TAG和神經醯胺物種的減 少及鞘磷脂、膽留醇酯和磷脂醯絲氨酸的增多(圖3B)。乳清+Ca(WPI)治療顯著地調節了初級代謝。體重減輕組之間代謝物水平的直接 對比令人驚異地揭示出，使用WPI飲食的體重減輕與TCA循環和磷酸戊糖途徑代謝物水平 的增加有關。相比於對照組飲食的體重減輕(CPI)，WPI飲食還增加了數種磷脂物種(如磷 脂醯乙醇胺和鞘磷脂)的水平，並減少了 TAG和糖解代謝物(圖5)。實施例3.血清的代謝圖譜分析樣品製備通過加入等分試樣(10 μ 1)的內標混合物對血清樣品進行分析，所述 內標混合物包含等量的內標(GPCho (17:0/00)、GPCho (17:0/17:0)、GPEtn (17:0/17:0)、 GPGro (17 0/17 0) [rac], Cer (dl8 1/17 0), GPSer (17 0/17 0)和 GPA (17:0/17 0)(來 自 Avanti Polar Lipids)及 MG(170/00/00) [rac]、DG (17 0/170/00)[rac]和 TG (17:0/17:0/17 0)(來自 Larodan Fine Chemical))，並將 0· 05M 的氯化鈉(10 μ 1)加 入血清樣品(10μ1)中，脂質用氯仿/甲醇(2 1，100μ1)提取。旋轉(2分鐘)後， 靜置(1小時)，離心(10000RPM，3分鐘)，分離下層，將包含3種經標記的標準脂質的標 準混合物加入(10μ1)至提取物中。標準溶液包含10 μ g/ml (在氯仿甲醇2 1中) GPCho (16 0/0 0-D3)、GPCho (16 1/16 1-D6)和 TG (16 0/16 0/16 0-13C3)，所述物質均來 自Larodan Fine Chemicals。隨機確定用於LC/MS分析的樣品順序。以 Waters Q-Tof Premier 質譜儀聯用 Acquity Ultra Performance LC 分析脂 質提取物。柱保持在50°C，是Acquity UPLC BEHC1810X50mm(具有1. 7 μ m顆粒)。二元 溶劑體系包含A.水(1% IM NH4Ac, 0. 1 % HC00H)和B. LC/MS級(Rathburn)乙腈/異丙醇 (5 2,1% IM NH4AcjO. 1% HC00H) 梯度由 65% A/35% B 開始，用 6 分鐘達到 100% B， 在該狀態下再保持7分鐘。包括5分鐘再平衡步驟在內的總運行時間為18分鐘。流速為 0. 200ml/分鐘，注入量為0. 75 μ 1。樣品管理器的溫度設定為10°C。脂質圖譜分析、數據處理和脂質的鑑定以與實施例2相似的方式進行。通過GCxGC-TOF對水溶性代謝物的分析通過全二維氣相色譜與高速飛行時間質譜聯用(GCxGC-TOF)對水溶性代謝物 進行廣泛蹄選(ffelthagen W, Shellie R, Spranger J, Ristow M, Zimmermann R, Fiehn 0, Comprehensive two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry(GCxGC-TOF)for high resolution metabolomics :biomarker discovery on spleen tissue extracts of obese NZO compared to lean C57BL/6mice. Metabolomics 2005 ；1 65-73)。使用的儀器是來自美國 Agilent Technologies 的 Leco Pegasus 4DGCxGC-T0F with Agilent 6890N GC 和來自瑞士 CTC Analytics AG 的 CombiPAL 自 動取樣器。調節器、二級爐和飛行時間質譜儀來自美國Lecolnc.。GC運行在分流模式(1:20)下，氦氣用作載氣，以1.5ml/分鐘恆定流動。第一 GC柱是相對非極性的RTX-5柱， IOmXO. 18mmX0. 20μπι，第二柱是極性 BPX-50，1. IOmX0. IOmmX0. 10 μ m。溫度程序如下 初始50°C，1分鐘-> 280°C，7°C /分鐘，1分鐘。二級爐設定為一級爐溫之上+30°C。二維 分離時間設定為3秒。所用的質量範圍是40至600amu，數據收集速度為100譜/秒。商業 質譜庫Palisade Complete 600K用於鑑定代謝物。 結果由血清鑑定了 129種代謝物(GCxGC-TOF平臺)，並鑑定了 537種脂質(UPLC/ MS(ESI+))。脂類組學和初級代謝物的數據的PLS-DA分析揭示了組之間的明顯差異，如圖 6所示，乳清+Ca(WPI)飲食對血清代謝物圖譜具有顯著影響。
權利要求
一種組合物，所述組合物包含用於預防和/或治療脂肪肝的乳清蛋白質。
2.如權利要求1所述的組合物，其中，所述預防和/或治療脂肪肝與下列的肥胖症、代 謝症候群、II型糖尿病和胰島素抵抗中的一個或多個相關。
3.如權利要求1或2所述的組合物，其中，所述組合物還包含鈣。
4.如權利要求1 3中任一項所述的組合物，其中，所述組合物還包含益生素和/或益 生元。
5.如權利要求1 4中任一項所述的組合物，其中，所述組合物是功能性食品的形式。
6.如權利要求5所述的組合物，其中，所述功能性食品是乳製品、飲料、果汁、湯或兒童 食品的形式。
7.如權利要求1 4中任一項所述的組合物，其中，所述組合物是促進健康的天然產品 的形式。
8.如權利要求7所述的組合物，其中，所述促進健康的天然產品是丸劑、片劑、粉末或 混合物的形式。
9.一種用於支持並改善肝臟代謝的方法，其中，所述方法包括對需要該治療的對象施 用包含乳清蛋白質的組合物。
10.一種診斷對象的脂肪肝的方法，其中，所述方法包括測定取自所述對象的血樣中的 與肝臟代謝有關的至少一種代謝物的量，由此所述代謝物的異常量指示肝臟代謝的狀態。
11.如權利要求10所述的方法，其中，同時測定多種所述代謝物的量。
12.如權利要求10或11所述的方法，其特徵在於所述代謝物已經通過收集脂質圖譜、 水溶性代謝物圖譜或脂質圖譜與水溶性代謝物圖譜的組合而確認。
13.如權利要求12所述的方法，其特徵在於對所收集的圖譜應用統計建模方法以識別 所述代謝物的異常量。
14.如權利要求12所述的方法，其特徵在於使用諸如氣相色譜或液相色譜與質譜聯用 的技術來收集所述圖譜。
15.如權利要求10 14中任一項所述的方法，其特徵在於由所述血樣分離出的血清或 血漿樣品測定所述代謝物。
16.如權利要求10 15中任一項所述的方法，其特徵在於所述方法用於在治療所述疾 病期間監測脂肪肝的發展。
17.如權利要求16所述的方法，其特徵在於所述治療包括將權利要求1所述的組合物 施用給需要該治療的患者。
全文摘要
有必要開發一種針對代謝症候群的治療，其旨在維持健康的肝臟代謝，而且並不間接實現減輕體重。本發明提供了一種用於支持並改善肝臟代謝，尤其是與脂肪肝有關的肝臟代謝的組合物，所述組合物包含乳清蛋白質。所述組合物還可包含Ca和健康改善成分，如益生素和益生元。所述組合物可以為食品、保健食品、食品增補劑或藥物的形式。此外，由於有效的生物標記物和樣品基質的選擇的複雜性，特別需要找到用於脂肪肝和代謝症候群的特異性生物標記物。本發明還涉及基於代謝組學圖譜分析來確定脂肪肝的診斷方法。對代謝組學圖譜使用統計建模方法以識別生物標記物。
文檔編號A61P1/16GK101918009SQ200880123769
公開日2010年12月15日 申請日期2008年12月31日 優先權日2008年1月4日
發明者麗塔·科爾佩拉, 埃羅·梅瓦拉, 塔魯·皮爾維 申請人:瓦利奧有限公司