核酸‑脂聚合物組合物的製作方法

2023-05-20 15:05:56

本申請是申請日為2008年8月6日、申請號為200880110306.5、發明名稱「核酸-脂聚合物組合物」的專利申請的分案申請。

本發明涉及包含核酸和脂聚合物的濃縮穩定製劑，還涉及所述製劑的製備方法和應用。因此，本發明涉及分子生物學和生物化學領域。

背景技術：

由於其更好的安全順應性、簡單的化學和經濟有效的製造，合成基因傳輸載體具有比病毒載體更顯著的優點。然而，由於合成載體與病毒載體相比較低的轉染效率，因而大多數對合成基因傳輸體系的開發致力於改善傳輸效率。結果，儘管在製劑穩定性、擴大規模和給藥靈活性中已經發現問題，但對合成傳輸體系的藥物開發卻幾乎沒有給予關注。自組裝為納米顆粒的含dna藥物常常顯示出較差的穩定性，特別是當製劑為水性懸浮液時。在這類製劑中，帶有合成載體的dna通常會隨時間進行而聚集，尤其在臨床設定中的最佳給藥所需的濃度時。這類製劑往往難以製備濃度>0.3mg/ml的dna，這限制了其商業應用，尤其是對於其中體積的約束會限制靈活給藥的局部輸送。dna聚集降低或消除了dna的活性並因此使組合物不適於在治療中使用。

所述物理不穩定性是轉染活性損失的基本原因之一。由於脂雙層的高曲率或脂質從dna物理解離而表現出的顆粒破裂或融合也已經被假定為基於陽離子脂質的基因傳輸複合物的不良穩定性和聚集的可能的根本原因。如傳輸載體的氧化性水解等化學修飾也可能促成顆粒不穩定性。

由於不良穩定性，早期臨床試驗需要在病床邊製備dna製劑。不具備製備和儲存濃度為最佳給藥所需的臨床產品的能力是病毒dna產品在廣泛臨床實踐和商業化中的主要障礙。這將需要培訓過藥物配方的醫師並提出實地質量控制措施。

凍幹法是一種有用的用於改善多種藥品的長期穩定性的方法。然而，該方法一般不適於乾燥帶有合成載體的dna複合物，這是因為如此易於改變所述dna複合物的物理化學性質並導致聚集和在復水(reconstitution)時轉染的損失。

已經嘗試了若干方法以避免製劑在凍幹過程中聚集和損傷。在某些情況下，在如低分子量糖、葡聚糖和聚乙二醇等冷凍保護劑的存在下凍幹dna複合物可以對產品提供更好的穩定性，但該方法似乎沒有改善給藥靈活性。出於這一目的通常最常用的方法是添加糖。已發現測試糖中許多會在某種程度上避免製劑的損傷和顆粒聚集，但該效果的品質隨糖的種類和所用的傳輸載體的不同而變化。

儘管凍幹提供了對製劑保存期的一定改善，生產凍幹dna產品所需要的條件使得僅能用於有限的藥學應用。即使採用最有效的凍幹保護劑糖，也需要很高的糖/dna摩爾比(通常大於1000:1)以獲得穩定性。結果，往往必須將凍乾產品稀釋很大的倍數以獲得等滲製劑，而這導致最終dna濃度降至凍幹前的dna濃度。對於許多陽離子載體，最終dna濃度通常可為約0.1mg/ml～0.2mg/ml，且常常低於0.1mg/ml。儘管低濃度製劑足以用於體外研究，其臨床應用可能因最佳給藥的高體積需求而受到限制。例如，在穩定性所需的最佳糖濃度下，1mg的dna劑量可能需要被稀釋在5ml～10ml中以保持等滲性，這對於局部體內施用而言體積過大。抑制了靈活給藥的這種藥學限制是合成基因傳輸體系在人類臨床試驗中效力不理想的主要促成因素之一，並且確證需要穩定且生物活性的更濃縮的dna製劑。

技術實現要素：

本發明提供了在高核酸濃度下展示出出人意料的穩定性並且增加核酸轉染的效率和給藥靈活性的組合物。本文所述的組合物能被有效地凍幹並復水為包括高核酸濃度在內的各種核酸濃度，而不會損失生物活性或使核酸聚集。

在一方面，本發明提供了包含陽離子脂聚合物和至少約0.5mg/ml的核酸的混合物的組合物，優選為藥物組合物，其中所述混合物懸浮於水溶液中。所述陽離子脂聚合物包含具有獨立地與其共價相連的膽固醇和聚乙二醇基團的陽離子聚合物主鏈。膽固醇與陽離子聚合物主鏈的摩爾比是約0.1～約10，而聚乙二醇與陽離子聚合物主鏈的摩爾比是約0.1～約10。所述組合物還可包含填料賦形劑。在某些方面，核酸與脂聚合物的混合物形成複合物。在某些方面，所述組合物包含縮合的核酸。縮合的核酸的量通常取決於核酸的組成性構成和製備組合物時的條件。

本發明還提供了製備上述組合物的方法。

在另一方面，本發明提供了核酸和脂聚合物的凍幹組合物。本發明的凍幹組合物，優選為凍幹藥物組合物包含填料賦形劑、縮合核酸和陽離子脂聚合物。如上所述，陽離子脂聚合物包含具有與其共價相連的膽固醇和聚乙二醇基團的陽離子聚合物主鏈，且其中膽固醇與陽離子聚合物主鏈的摩爾比是約0.1～約10，而聚乙二醇與陽離子聚合物主鏈的摩爾比是約0.1～約10。

另外，本發明還提供了使用本文所述的組合物通過例如轉染各種細胞和組織來治療疾病和/或病症的方法。

附圖說明

圖1是本發明的製造過程的示意圖。

圖2顯示了濃縮狀態和非濃縮狀態下的核酸粒徑的圖。

圖3顯示了電泳實驗結果以顯示核酸的縮合。

圖4顯示了本發明的另一個實施方式的轉染活性的圖。

圖5a和圖5b是顯示採用帶有和不帶il-12的脂聚合物進行治療的結果的神經切片的照片。

圖6顯示了帶有脂聚合物的il-12與對照相比的抗癌效力的兩幅圖。

圖7a和圖7b是不同核酸/陽離子聚合物混合物的粒徑的圖。

圖8a和圖8b是由不同核酸/陽離子聚合物混合物引起的螢光素酶表達的圖。

圖9是顯示核酸/陽離子脂聚合物組合物在長期儲存後的生物活性的圖。

具體實施方式

在公開和描述本發明之前，應當理解，本發明不限於本文所公開的特定的結構、方法步驟或材料，而可延伸至相關領域的普通技術人員認可的所屬結構、方法步驟或材料的等同物。還應理解，由於本發明的範圍僅由所附權利要求及其等同物的限制，故本文採用的術語僅用於描述特定實施方式的目的而並非旨在進行限制。

必須注意的是，除非上下文明確地另外指出，如本說明書和所附權利要求中所用，單數形式「a」、「an」和「the」也包括複數指代物。

如本文所用，術語「縮合的核酸」和「部分縮合的核酸」被用來指已與本發明的陽離子脂聚合物接觸的核酸。在某些方面，縮合核酸保持與陽離子脂聚合物相接觸。縮合核酸通常比非縮合核酸佔據顯著更小的體積。然而，認識到縮合核酸的量可能隨局部環境的變化而不同(例如，脂質之於水性環境)。在本發明的不同方面中，縮合核酸是核酸和陽離子脂聚合物的納米顆粒中的那些核酸，所述納米顆粒縮合的尺寸為約50nm～約300nm、更優選為約50nm～200nm且進而更優選為約50nm～150nm。「部分縮合的核酸」是指已與本發明的陽離子脂聚合物接觸的核酸，其中所述核酸未達到完全縮合，然而仍然比非縮合核酸佔據明顯更小的體積。

如本文所用，術語「複合物」是指與脂聚合物，優選為陽離子脂聚合物相結合的核酸。包含縮合核酸和陽離子脂聚合物的複合物通常作為顆粒，優選作為納米顆粒而存在。

如本文所用，術語「進行轉染」和「轉染」是指核酸從細胞的外部環境向細胞內環境(特別是指細胞質和細胞核)的轉運。不受特定理論的束縛，應該理解，核酸可以在被封裝在一個或多個陽離子聚合物/核酸複合物內或附著於其上或者被與其一起攜帶後被輸送至細胞。特定的轉染實例將核酸輸送至細胞核。

如本文所用，「受試對象」是指可以受益於本發明的藥物組合物的施用或方法的哺乳動物。受試對象的實例包括人類，並且還可包括如馬、豬、牛、狗、貓、兔和水生哺乳動物等其它動物。

如本文所用，「組合物」是指兩種以上的化合物、元素或分子的混合物。在某些方面，術語「組合物」被用來指代核酸和傳輸體系的混合物。

如本文所用，「n:p比」是指功能化陽離子脂聚合物中的氨基氮與核酸中的磷酸根基團的摩爾比。

如本文所用，「物理化學性質」是指例如但不限於帶有陽離子聚合物的核酸複合物的粒徑和表面電荷、顆粒溶液的ph和滲透摩爾濃度(osmolality)等各種性質。

如本文所用，術語「施用」、「進行施用」和「輸送」是指將組合物呈遞給受試對象的方式。施用可以通過如口服、胃腸外、透皮、吸入和植入等各種本領域已知途徑來完成。因此，口服施用可以通過吞咽、咀嚼、吮吸包含組合物的口服劑型來實現。胃腸外施用可以通過在靜脈內、動脈內、肌內、關節內、鞘內、腹膜內、皮下等注射組合物來實現。作此用途的注射劑可以被製備為作為液體溶液或懸浮液的常規形式，或者適於在注射前在液體中製備為溶液或懸浮液的固體形式，或被製備為乳化液。另外，透皮施用可以通過將透皮組合物塗敷、粘附、展塗、貼附、灌塗、按壓或塗抹於皮膚表面上而完成。這些及其它施用方法是本領域內公知的。在一個具體方面，施用可包括將組合物輸送至受試對象從而所述組合物進行系統循環並與靶標細胞結合以便通過胞吞作用而被攝取。

如本文所用，術語「核酸」是指dna和rna以及它們的合成同源物。核酸的非限制性實例可以包括編碼蛋白的質粒dna或產生核苷酸序列的抑制性rna、單鏈或雙鏈、錯義、反義、無義的合成序列以及控制蛋白、肽和核酸製備的開關調節性核苷酸和速率調節性核苷酸。另外，核酸還可以包括但不限於基因組dna、cdna、sirna、shrna、mrna、trna、rrna、雜交序列或者合成或半合成序列以及天然來源或人工來源的核酸。在一方面，核苷酸序列還可以包括對治療性蛋白的合成或抑制進行編碼的那些核苷酸序列。所述治療性蛋白的非限制性實例可以包括抗癌劑、生長因子、降血糖劑、抗血管生成劑、細菌抗原、病毒抗原、腫瘤抗原或代謝酶。抗癌劑的實例可以包括白細胞介素-2、白細胞介素-4、白細胞介素-7、白細胞介素-12、白細胞介素-15、幹擾素-α、幹擾素-β、幹擾素-γ、集落刺激因子、粒細胞-巨噬細胞刺激因子、抗血管生成劑、腫瘤抑制基因、胸苷激酶、enos、inos、p53、p16、tnf-α、fas配體、突變癌基因、腫瘤抗原、病毒抗原或細菌抗原。在另一方面，質粒dna可以編碼shrna分子，所述shrna分子被設計來抑制參與腫瘤細胞或其它過度增殖細胞的生長或維持的蛋白。此外，在某些方面，質粒dna可以同時編碼治療性蛋白和一種或多種shrna。在其他方面，核酸還可以為質粒dna和包括正義rna、反義rna、核酶在內的合成rna的混合物。另外，核酸的尺寸可能有所不同，可從寡核苷酸到染色體。這些核酸可以源自人類、動物、植物、細菌、病毒和合成。它們可以通過本領域技術人員已知的任何技術而獲得。

如本文所用，術語「濃縮的」是指其稀釋度被降低的組合物。在本發明的某些方面，「濃縮的」組合物包含縮合dna(優選在等滲溶液中)。在本發明的一個特定方面，濃縮的組合物包含懸浮於等滲溶液中的至少約0.5mg/ml的縮合dna。

如本文所用，術語「聚合主鏈」用於指代重均分子量在指定範圍內的一系列聚合主鏈分子。就此而言，當如膽固醇等分子被描述為與聚合主鏈分子以一定的摩爾比共價連接時，應該理解所述比例代表與所述聚合主鏈分子系列連接的膽固醇分子的平均數目。例如，如果據描述膽固醇以0.5的摩爾比與聚合物主鏈共價連接，則平均將有一半的聚合主鏈分子具有相連的膽固醇。作為另一個實例，如果據描述膽固醇以1.0的摩爾比與聚合物主鏈共價連接，則平均每個聚合主鏈分子將與一個膽固醇分子相連。然而，實際上應該理解的是，某些聚合主鏈分子在這種情況下可能沒有相連的膽固醇分子，而其它聚合主鏈分子可能有多個相連的膽固醇分子，而所述比例是由相連的膽固醇分子的平均數導出。同樣的推理適用於聚乙二醇與聚合主鏈的摩爾比。

如本文所用，術語「肽」可以被用來指代包含兩個以上的由一個胺基酸的羧基與另一個胺基酸的α-氨基相連的胺基酸的天然或合成分子。本發明的肽不受長度限制，因而「肽」可以包括多肽和蛋白。

如本文所用，術語「共價的」和「共價地」是指電子在原子對間共享的化學鍵。

如本文所用，為方便起見，可以將多個項目、結構元素、組成元素和/或材料呈現在一個通表中。然而，應該將列表中的每個成員如同被單獨確定為獨立和獨特的成員那樣看待這些列表。因此，在有相反的指示時，不應僅憑它們出現在共同的組中而將這類列表中的任何個體成員視作相同列表中任何其它成員的實際等價物。

濃度、量和其它數字數據可以以範圍形式在本文中表達或呈現。應該理解，這種範圍形式僅出於方便和簡潔而使用，因而應將其靈活地解讀為不僅包含所述範圍的極值所明確列出的數值，而且還包含該範圍內涵蓋的所有的個體數值或子範圍，如同每個數值和子範圍都被明確列出。舉例而言，「約1～約5」的數值範圍應被解讀為不僅包含約1～約5的明確列出值，還包含該指定範圍內的各個值和子範圍。因此，在該數值範圍內包含如2、3、和4等個體數值和如1～3、2～4和3～5等子範圍以及單獨的1、2、3、4和5。相同的原則也應用於僅列出作為最小值或最大值的一個數值的範圍。此外，不論範圍的寬度或所描述的特性如何，該解讀方式都適用。

本發明提供了可以在不影響核酸或核酸組合物的物理化學性質或生物性質時將低濃度核酸組合物(例如，0.15mg/ml)高度濃縮的技術。在一方面，可以將核酸組合物濃縮33倍而不會影響所述性質。這些高度濃縮的核酸組合物使得可以使用範圍較大的體內給藥方案，這在以前由於與試圖達到高於約0.3mg/ml的先前嘗試相關的較差穩定性而極為困難。

更具體而言，本發明提供了濃縮且穩定的藥物組合物，包括用於製備和使用這類組合物的方法。在一方面，例如，提供的藥物組合物包含至少約0.5mg/ml的核酸，其中，核酸與陽離子脂聚合物複合並且該複合物懸浮於等滲溶液中。懸浮於等滲溶液中的所述複合物包含部分縮合或完全縮合的核酸分子。所述陽離子脂聚合物包含具有與其共價相連的膽固醇和聚乙二醇基團(即分子)的陽離子聚合物主鏈。膽固醇分子與陽離子聚合物主鏈的摩爾比為約0.1～約10，而聚乙二醇分子與陽離子聚合物主鏈的摩爾比為約0.1～約10。在另一方面，聚乙二醇分子與陽離子脂聚合物中的陽離子聚合物主鏈的摩爾比為約1～約10。在再一方面，聚乙二醇分子與陽離子脂聚合物中的陽離子聚合物主鏈的摩爾比為約1～約5。在另一方面，膽固醇分子與陽離子脂聚合物中的陽離子聚合物主鏈的摩爾比為約0.3～約5。在又一方面，膽固醇分子與陽離子脂聚合物中的陽離子聚合物主鏈的摩爾比為約0.4～約1.5。

所述組合物還包含填料賦形劑。所得組合物適於將核酸輸送至靶標細胞以便根據核酸的功能來誘發、抑制或修飾生物響應。

在一方面，膽固醇和聚乙二醇分子可以獨立地並直接地與陽離子聚合物主鏈共價連接。在另一方面，膽固醇和聚乙二醇分子各自間接地與陽離子聚合物主鏈共價連接。例如，可以通過連接子或間隔子使膽固醇分子直接或間接地與聚乙二醇分子偶聯，而該聚乙二醇分子再與陽離子聚合物主鏈共價連接。另外一種方式，膽固醇分子可以直接與陽離子脂聚合物主鏈連接，而聚乙二醇分子通過連接子或間隔子間接地與所述脂聚合物連接。

聚乙二醇與陽離子聚合物主鏈之間的一個具體連接子是帶有端羧基的亞烷基，優選為1～20個碳原子、且更優選為約2～約4個碳原子的直鏈亞烷基。該連接子上的端羧基在與陽離子聚合物主鏈的氨基連接時形成陽離子脂聚合物與聚乙二醇之間的醯胺鍵。適於與陽離子聚合物主鏈分子反應的起始聚乙二醇是帶有以活化基團(例如，n-羥基琥珀醯亞胺基酯)結尾的連接子分子的聚乙二醇。

從聚乙烯亞胺、氯甲酸膽固醇酯(忽略立體化學)和甲氧基聚乙二醇-丙酸n-羥基琥珀醯亞胺基脂的反應得到的陽離子脂聚合物結構的一部分的實例是以下結構。圖例反映了伯胺基、仲胺基和叔胺基在聚乙烯亞胺中的適當分布，並且此處為明確起見，採取了不存在的規則聚乙烯亞胺鏈。

在本發明的各方面中，n通常為約8～約20，更具體為約10～約15，且進而更具體為約12；x通常為約2～約3，更具體為約2.5；y通常為約6～約10，更具體為約7～約9，進而更具體為約7.5；z通常為約0.4～約0.8，更具體為約0.5～約0.7，且進而更具體為約0.6。

另外，在某些方面，可以使用本文所提出的技術將此前已經使用二次縮合體系(secondarycondensingsystem)縮合的核酸進一步縮合以實現核酸在高濃度下更高的穩定性。同樣地，在根據本發明的方面進行縮合之前，核酸可以處於部分縮合形式或非縮合形式。二次縮合體系可以包括本領域普通技術人員已知的任何縮合材料或技術，這些縮合材料或技術包括但不限於陽離子脂、陽離子肽、環糊精、陽離子化明膠、樹枝狀分子(dendrimer)、殼聚糖及其組合。

對於本發明的方面的組合物可以實現各種核酸縮合程度。在一方面，通過與陽離子聚合物形成複合物而將組合物中的所有核酸或很大部分的核酸縮合。在另一方面，組合物中約30重量％的核酸被縮合。在又一方面，組合物中約50重量％的核酸被縮合。在再一方面，組合物中約70重量％的核酸被縮合。在另一方面，約90重量％的核酸被縮合。

另外，組合物中核酸的濃度會根據組合物中所用材料、濃縮方法和核酸的預期用途而有所不同。然而，在一方面，核酸濃度至少為約0.5mg/ml。在另一方面，核酸濃度至少為約1mg/ml。在又一方面，核酸濃度至少為約3mg/ml。在再一方面，核酸濃度可以至少為約5mg/ml。在另一方面，核酸濃度可以至少為約10mg/ml。在又一方面，核酸濃度可以至少為約20mg/ml。在再一方面，核酸濃度可以為約10mg/ml～約40mg/ml。

可以利用各種方法來確定核酸組合物的縮合程度。例如，在一方面，可以使組合物經過電泳來確定組合物中的核酸與添加至組合物中的陽離子聚合物形成聚合物的程度。帶負電的核酸與帶正電的陽離子脂聚合物的靜電吸引抑制核酸移動通過瓊脂糖凝膠。於是，進行電泳後，通過與陽離子聚合物複合而縮合的核酸在凝膠中保持不動，而非縮合的核酸、沒有與陽離子聚合物結合的核酸已移動了與凝膠中的電流強度有關的一定距離。在另一個實例中，可以通過組合物內的粒徑來確定核酸的縮合。粒徑可以通過動態光散射來測定。通常，縮合核酸將具有比非縮合核酸更小的粒徑。優選的縮合核酸是處在核酸與陽離子脂聚合物的納米顆粒中的那些核酸，其尺寸為約50nm～約300nm、更優選為約50nm～200nm且進而更優選為約50nm～150nm。

在本發明的方面的組合物和方法中可以利用任何已知的核酸，包括上述那些實例。同樣，不應將本文所述的核酸視為一種限制。在一方面，例如，核酸可以包括編碼蛋白、多肽或肽的質粒。眾所周知，許多肽在根據本發明的方面配製為藥物組合物時被證實是有益的。一些這類肽的非限制性實例可以包括白細胞介素-2、白細胞介素-4、白細胞介素-7、白細胞介素-12、白細胞介素-15、幹擾素-α、幹擾素-β、幹擾素-γ、集落刺激因子、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、血管生成劑、凝血因子、降血糖劑、凋亡因子、抗血管生成劑、胸苷激酶、p53、ip10、p16、tnf-α、fas配體、腫瘤抗原、神經肽、病毒抗原、細菌抗原及其組合。在一個具體方面，核酸可以是編碼白細胞介素-12的質粒。在另一方面，核酸可以是編碼抑制性核糖核酸的質粒。在再一方面，核酸可以是合成短幹擾核糖核酸。在又一方面，核酸是設計來抑制治療性肽的表達的反義分子。

如上文所述，陽離子脂聚合物可以包含具有與其共價連接的膽固醇和聚乙二醇的陽離子聚合物主鏈。陽離子聚合物主鏈可以包括本領域普通技術人員已知的可以用於縮合和濃縮本發明的各方面的核酸的任何陽離子聚合物。然而，在一方面，陽離子聚合物主鏈可以包括陽離子聚合物主鏈是選自聚乙烯亞胺、聚(三甲亞胺)、聚(四甲亞胺)、聚丙烯亞胺、氨基糖苷-聚胺、二脫氧二氨基-b-環糊精、精胺、亞精胺、聚甲基丙烯酸(2-二甲基氨基)乙酯、聚賴氨酸、聚組氨酸、聚精氨酸、陽離子化明膠、樹枝狀分子、殼聚糖及其組合。在一個具體方面，陽離子聚合物主鏈可以是聚乙烯亞胺。

在一個特定方面，脂聚合物由獨立地與膽固醇和聚乙二醇共價連接的聚乙烯亞胺(pei)構成。在該方面，陽離子脂聚合物中peg:pei:膽固醇的平均摩爾比是約2～3:1:0.25～1，且優選為約2.25～2.75:1:0.4～0.8，且更優選為約2.5:1:0.6。在一個特定方面，該脂聚合物的分子量(作為游離鹼)為約3kd～4kd，優選為約3.25kd～3.75kd，且更優選為約3.54kd；相應的鹽酸鹽的分子量為約4kd～5kd，優選為約4.5kd。

另外，陽離子聚合物主鏈的分子量可能根據包括核酸性質、組合物的預期用途等多種因素而有所不同。然而，在一方面，陽離子聚合物主鏈的分子量可能為約100～約500,000道爾頓。此外，陽離子脂聚合物的其它各種組分的分子量也可能不同。在一方面，例如，聚乙二醇的分子量可能為約50～約20,000道爾頓。

在構建本發明的藥物組合物時，已發現功能化陽離子脂聚合物中的氨基氮與核酸中的磷酸根之間的摩爾比(n:p比)可能影響核酸可以被縮合和/或濃縮的程度。然而，最佳n:p比可能根據核酸的化學性質而在某種程度上有所不同，在一方面，陽離子聚合物主鏈中的氨基氮與核酸中的磷酸根之比為約0.1:1～約100:1。在另一方面，陽離子聚合物主鏈中的氨基氮與核酸中的磷酸根之比為約3:1～約20:1。在再一方面，陽離子聚合物主鏈中的氨基氮與核酸中的磷酸根之比為約6:1～約15:1。在其它方面，氨基氮與核酸中的磷酸根之比為約3:1～約100:1，或約5:1～約100:1，或約7:1～約100:1。在又一方面，該比例為約10:1～約100:1，或更優選為約10:1～約20:1。在一個具體方面，陽離子聚合物主鏈中的氨基氮與核酸中的磷酸根之比為約11:1。

另外，還設想可在所述藥物組合物中包含填料賦形劑。這類填料可以為製劑提供多種有益性質，例如，凍幹和復水期間的冷凍保護、粘合、等滲平衡、穩定化等。應該理解，不同的組合物之間填料材料可以不同，且所用的特定填料不應被視作限制性的。在一方面，例如，填料賦形劑可以包括各種糖、糖醇、澱粉、纖維素及其組合物。在另一方面，填料賦形劑可以包括乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖、半乳糖、甘露醇、麥芽糖醇、麥芽糖、山梨糖醇、木糖醇、甘露糖、葡萄糖、果糖、聚乙烯吡咯烷酮、甘氨酸、麥芽糊精、羥甲基澱粉、明膠、山梨糖醇、菲可(ficol)、氯化鈉、磷酸鈣、碳酸鈣、聚乙二醇及其組合。在又一方面，填料賦形劑可以包括乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖、半乳糖、甘露醇、麥芽糖醇、麥芽糖、山梨糖醇、木糖醇、甘露糖、葡萄糖、果糖、聚乙烯吡咯烷酮、甘氨酸、麥芽糊精及其組合。在一個具體方面，填料賦形劑可以包括蔗糖。在另一個具體方面，填料賦形劑可以包括乳糖。

組合物中填料賦形劑的濃度可以為約0.01％～約5％，更具體為約0.1％～約3.0％，再更具體為約0.1％～約0.3％。

在某些方面，可能有益的是將陽離子脂聚合物功能化以使得可以靶定受試對象或培養物中的特定細胞或組織。這種靶定是公知的，且本文所說的實例不應被視作限制性的。在一方面，例如，陽離子脂聚合物可以包含與陽離子脂聚合物或聚乙二醇分子共價連接的靶定部分。這類靶定部分可以允許陽離子脂聚合物在受試對象中系統地循環以定位並特異性靶定特定的細胞類型或組織。這類靶定部分的實例可以包括轉鐵蛋白、去唾液酸糖蛋白、抗體、抗體片段、低密度脂蛋白、細胞受體、生長因子受體、細胞因子受體、葉酸、轉鐵蛋白、胰島素、去唾液酸血清類粘蛋白、甘露糖-6-磷酸、甘露糖、白細胞介素、gm-csf、g-csf、m-csf、幹細胞因子、紅細胞生成素、表皮生長因子(egf)、胰島素、去唾液酸血清類粘蛋白、甘露糖-6-磷酸、甘露糖、lewisx和sialyllewisx、n-乙醯乳糖胺、葉酸、半乳糖、乳糖，和血栓調節蛋白、如多粘菌素b和血球凝集素ha2等融合劑、親溶酶體劑(lysosomotropicagent)、如t抗原等核定位信號(nls)以及它們的組合。特定靶定部分的選擇和連接完全在本領域普通技術人員的知識範圍內。

本發明還提供了能夠被長期儲存並在使用前復水的凍幹藥物組合物。在一方面，凍幹藥物組合物可以包含填料賦形劑和與陽離子脂聚合物縮合的核酸的凍幹混合物，其中所述陽離子脂聚合物包含具有與其共價相連的膽固醇和聚乙二醇的陽離子聚合物主鏈，且其中膽固醇與陽離子聚合物主鏈的摩爾比為約0.1～約10，而聚乙二醇與陽離子聚合物主鏈的摩爾比為約0.1～約10。凍幹藥物組合物可以為從乾粉到部分復水的混合物的多種形式。

本發明還包括製備含有縮合核酸的各種藥物組合物的方法。在一方面，例如，本發明提供了製備具有以至少0.5mg/ml濃縮於等滲溶液中的縮合核酸的藥物組合物的方法。該方法可以包括將核酸與陽離子脂聚合物在填料賦形劑中混合，其中所述陽離子脂聚合物包含具有與其共價相連的膽固醇和聚乙二醇的陽離子聚合物主鏈，且其中膽固醇與陽離子聚合物主鏈的摩爾比為約0.1～約10，而聚乙二醇與陽離子聚合物主鏈的摩爾比為約0.1～約10。可以將所述混合物凍幹為粉末以濃縮核酸混合物並其後用稀釋劑復水以形成包含在等滲溶液中的至少約0.5mg/ml的縮合核酸的溶液。

通常，所述組合物可以通過將核酸溶液與陽離子脂聚合物溶液在二糖的存在下混合併隨後凍幹並在等滲溶液中復水而獲得。該方法可以縮放，從而生產數毫克(實驗室規模)至數百毫克(gmp規模)的延長保存期的高度濃縮核酸製劑。如上所述，陽離子脂聚合物具有其中聚乙二醇和膽固醇通過共價鍵與之連接的陽離子聚合物主鏈。在聚乙烯亞胺的情形中，在一方面，聚乙二醇與聚乙烯亞胺之間的化學計量比以及膽固醇與聚乙烯亞胺之間的化學計量比分別為0.5～10和0.1～10。陽離子聚合物的化學組成對於獲得高度濃縮的穩定核酸製劑可能非常重要。沒有顯示出膽固醇和peg連接的陽離子聚合物不容易產生穩定的高度濃縮製劑，如下文實施例中所示。

本發明的方面的組合物還可以與其它的縮合核酸複合物合併以在較高核酸濃度下獲得更大的複合物穩定性。例如，可以添加不同量的peg-pei-膽固醇以提高在高核酸濃度下通常不穩定的其它核酸傳輸體系的穩定性。

在各個方面，合成傳輸體系包含核酸和可以通過本領域中可利用的各種技術來製備的陽離子載劑。已知有多種核酸用陽離子載劑：例如，聚乙烯亞胺、聚(三甲亞胺)、聚(四甲亞胺)、聚丙烯亞胺、氨基糖苷-聚胺、二脫氧二氨基-b-環糊精、精胺、亞精胺、聚甲基丙烯酸(2-二甲基氨基)乙酯、聚賴氨酸、聚組氨酸、聚精氨酸、陽離子化明膠、樹枝狀分子、殼聚糖、如1,2-二油醯基-3-三甲基銨丙烷(dotap)、n-[1-(2,3-二油醯氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化銨(dotma)、1-[2-油醯氧基乙基]-2-油烯基-3-(2-羥乙基)氯化咪唑啉(dotim)、2,3-二油烯基氧基-n-[2-(精胺羧基醯胺基)乙基]-n,n-二甲基-1-丙基三氟乙酸銨(dospa)、3β-[n-(n',n'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲醯基]鹽酸膽固醇(dc-膽固醇hcl)、二(十七烷基)醯胺基(氨基乙醯基)亞精胺(dogs)、n,n-二硬脂醯基-n,n-二甲基溴化銨(ddab)、n-(1,2-二肉豆蔻氧基丙-3-基)-n,n-二甲基-n-羥乙基溴化銨(dmrie)、n,n-二油烯基-n,n-二甲基氯化銨(dodac)等陽離子脂類及其組合。當這些傳輸體系與peg-pei-膽固醇組合時，核酸傳輸體系的穩定性得到增加。

本發明的方面還提供了藥物組合物的使用方法。例如，在一方面，哺乳動物細胞的轉染可以包括使哺乳動物細胞與本文所述的組合物接觸，並將哺乳動物細胞在一定條件下溫育以使所述組合物能進入細胞並引發核酸的生物活性。這類轉染技術是本領域普通技術人員已知的。另外，在另一方面，可以通過將組合物傳輸至溫血生物體或受試對象內而轉染靶標組織。這種傳輸可以通過如其中輸送所述組合物還可以包括選自腫瘤內、腹膜內、靜脈內、動脈內、氣管內、肝門內、口服、顱內、肌內、關節內及其組合等施用形式進行。所述靶標組織可以包括會受益於轉染的任何組織或組織的亞類。例如，所述靶標組織可以包括但不限於卵巢、子宮、胃、結腸、直腸、骨、血液、小腸、胰腺、乳腺、頭、頸、肺、脾、肝、腎、腦、甲狀腺、前列腺、膀胱、甲狀腺、皮膚、腹腔、胸腔及其組合

實施例

本文提供以下實施例以增進對本發明的特定實施方式的更清晰的理解，但絕不意味著對其的任何限制。

製劑a

將1g的1800da支鏈聚乙烯亞胺(pei)(0.56mm)溶解於5ml氯仿中並置於ml圓底燒瓶中，在室溫攪拌20分鐘。將380mg氯甲酸膽固醇酯(0.84mm)和500mg活化甲氧基聚乙二醇(mpeg-spa，甲氧基聚乙二醇丙酸n-羥基琥珀亞醯胺基酯)(550da)(0.91mm)溶解於5ml氯仿中病轉移至滴液漏鬥中，該滴液漏鬥位於含有pei溶液的圓底燒瓶的頂部。在5～10分鐘中於室溫將氯甲酸膽固醇酯和mpeg-spa的混合物緩慢添加至pei溶液中。將溶液在室溫再攪拌4小時。通過旋轉蒸發儀除去溶劑之後，在攪拌下將殘餘粘性材料溶解於20ml乙酸乙酯中。通過緩慢添加20ml正己烷將產物從溶劑中沉澱析出；將液體從產物傾析除去。用20ml的乙酸乙酯/正己烷混合物(體積比1/1)將產物洗滌兩次。傾析除去液體後，通過氮氣吹掃10～15分鐘將材料乾燥。將材料溶解於10ml的0.05nhcl以製備氨基的鹽形式。使水溶液過濾通過0.2μm濾紙。通過凍幹獲得最終產物。

該實施例製劑的摩爾比是3.0摩爾mpeg-spa和1.28摩爾膽固醇與1摩爾pei分子偶聯。

製劑b

將20g(11.1mmol)的支鏈pei(bpei)和200ml乾燥氯仿共同混合以使bpei溶解。溶解後，在攪拌下於20～30分鐘內將含4g氯甲酸膽固醇酯和18.7g(26mmol)活化甲氧基聚乙二醇(mpeg-spa，甲氧基聚乙二醇丙酸n-羥基琥珀亞醯胺基酯，mpeg分子量550，酯分子量719)的200ml乾燥氯仿溶液逐滴添加至反應混合物中，接著是3～4小時的溫育期。然後將混合物置於真空下以濃縮溶液並除去殘留氯仿。將所得殘留物溶解於320ml的1mhcl水溶液中並攪拌。將該ppc鹽酸鹽溶液再次在真空下濃縮，從而產生高度粘稠的材料。為了分離ppc鹽酸鹽並除去反應副產物和未反應的起始原料，將濃縮的混合物與丙酮(<0.4％水)並攪拌，從而導致ppc鹽酸鹽沉澱為游離漂浮的材料。沉澱後，棄去上清液。將吸溼性的ppc鹽酸鹽在真空下乾燥。

首先通過製備ppc和dna在10％乳糖中的適當濃度的溶液來產生聚合物dna複合物。將陽離子聚合物(mg/ml)和dna(3mg/ml)在注射用水中的儲備溶液稀釋於0.3％～3％的乳糖溶液中：這是在復水後獲得最終的10％乳糖濃度所必需的。然後在攪拌下將dna逐滴加入ppc溶液中並在室溫溫育15分鐘以形成複合物。

將500μl製得的組合物添加至2ml硼矽酸鹽玻璃瓶內並置於凍幹機中。將玻璃瓶於-34℃冷卻4小時，其後開始初次乾燥。24小時後，將擱板溫度升至20℃並在真空下再保持24小時。最後將擱板溫度升至4℃並將玻璃瓶在真空下封口。

製劑c

將180毫克支鏈pei1800(0.1mm)溶解於4ml氯甲酸酯並在室溫攪拌30分鐘。將70毫克氯甲酸膽固醇酯(0.14mm)和48mgpeg330(0.14mm)溶解於1ml氯甲酸酯中，並用注射器在3～10分鐘內緩慢添加至pei溶液中。將混合物在室溫攪拌4小時。添加10ml乙酸乙酯以用於沉澱之後，將溶液在-20℃溫育過夜，然後將液體從燒瓶中傾析除去。將剩餘材料用5ml的乙酸乙酯/正己烷混合物(體積比為1/1)洗滌2次。通過氮氣吹掃10～15分鐘以乾燥剩餘材料，在20分鐘內將其溶解於10ml的0.05nhcl中，然後使溶液過濾通過0.2μm注射器式過濾器。通過冷凍乾燥將水溶液凍幹以從聚合物中將水除去。

該製劑的摩爾比是0.85摩爾peg和0.9摩爾膽固醇與1摩爾pei分子偶聯。

製劑d

將500毫克的25kda直鏈pei(0.02mm)溶解於30ml中並在65℃攪拌30分鐘。將冷凝器和滴液漏鬥與三頸燒瓶裝配。將200mgmpeg-nhs1000(0.2mm)和40mg氯甲酸膽固醇酯(0.08mm)的5ml氯仿溶液在3～10分鐘內緩慢添加至pei溶液中。將溶液在65℃再均勻攪拌4小時，並在旋轉蒸發儀中將體積減至5ml。將溶液在50ml乙醚中沉澱以除去游離膽固醇，從燒瓶傾析除去液體，並用20ml乙醚將剩餘材料洗滌2次。用純氮氣乾燥後，將材料溶解於10ml的2.0nhcl和2ml三氟乙酸的混合物中。用mwco15000透析管將溶液在去離子水中透析48小時，每12小時更換新鮮水。將溶液凍幹以除去水。

該製劑的摩爾比是12.0摩爾peg和5.0摩爾膽固醇與1摩爾pei分子偶聯。

製劑e

將1g的pei(分子量：1200道爾頓)溶解於15ml無水二氯甲烷和100μl的三乙胺(tea)的混合物中。在冰上攪拌30分鐘後，1.2g氯甲酸膽固醇酯緩慢添加至pei溶液中並將混合物在冰上攪拌過夜。通過添加乙醚使所得產物沉澱，接著離心並隨即用額外的乙醚和丙酮洗滌。將非水溶性脂聚合物溶解於氯仿中以得到0.08g/ml的最終濃度。合成和純化後，用maldi-toffms和1hnmr對非水溶性脂聚合物進行表徵。

非水溶性脂聚合物1200的nmr測定顯示，與pei偶聯的膽固醇的量約為40％。非水溶性脂聚合物的maldi-tof質譜分析顯示其分子量約為1600。

製劑f

將3g的pei(分子量：1800道爾頓)在10ml無水二氯乙烷和100μl三乙胺的混合物中於冰上攪拌30分鐘。將1g氯甲酸膽固醇酯溶解於5ml無水的冰冷二氯甲烷中然後在30分鐘內緩慢添加至pei溶液中。將混合物在冰上攪拌12小時並將所得產物在旋轉蒸發儀中乾燥。將粉末溶於50ml的0.1nhcl中。將水溶液用100ml的二氯甲烷萃取3次，然後過濾通過玻璃微纖維過濾器。通過蒸發溶劑濃縮產物，用極大過量的丙酮進行沉澱，並在真空下乾燥。用maldi-tof和101hnmr分析產物。非水溶性脂聚合物1800的nmr結果顯示，與pei偶聯的膽固醇的量約為47％。peace的maldi-toff質譜分析顯示其分子量約為2200。這表明大多數的peace1800的膽固醇和pei的摩爾比為1/1，但是某些沒有偶聯或以2/1的摩爾比(膽固醇/pei)偶聯。

製劑g

在冰上將50毫克pei1800溶解於2ml無水二氯甲烷中。然後將200μl氯甲酸苄酯緩慢添加至反應混合物中並將溶液在冰上攪拌4小時。攪拌之後，添加10ml二氯甲烷並用15ml飽和nh4cl萃取溶液。施用硫酸鎂從二氯甲烷相除去水。在真空下減少溶液體積並用乙醚沉澱產物cbz保護pei。將50毫克的伯胺cbz保護pei溶解於二氯甲烷中，添加10mg氯甲酸膽固醇酯並將溶液在冰上攪拌12小時。將產物cbz保護脂聚合物用乙醚沉澱，用丙酮洗滌，然後在作為氫供體的h2下溶解在含作為催化劑的鈀活性炭的dmf中。將混合物在室溫攪拌15小時，過濾通過並通過旋轉蒸發儀減少溶液體積。用乙醚沉澱來獲得最終產物。

製劑h

在室溫將500毫克nh2-peg-cooh3400(0.15mm)溶解在5ml無水氯仿中30分鐘。將676mg氯甲酸膽固醇酯在1ml無水氯仿中的溶液(1.5mm)緩慢添加至peg溶液中然後在室溫再攪拌4小時。在冰上將混合物在500ml乙醚中沉澱1小時，然後用乙醚洗滌3次以除去非偶聯的膽固醇。用氮氣吹掃乾燥後，將粉末溶解於5ml的0.05nhcl以使peg上的羧基酸化。通過凍幹機乾燥材料。在室溫將100毫克pei1800(0.056mm)、50mgdcc和50mgnhs溶解於5ml氯仿中，將混合物攪拌20分鐘，然後將380mg的膽固醇-peg-cooh在1ml氯仿中的溶液緩慢添加至pei溶液中。在室溫攪拌6小時之後，用旋轉蒸發儀除去有機溶劑。將剩餘材料溶解於10ml去離子水中並通過fplc純化。

實施例1

帶有陽離子脂聚合物的縮合核酸的濃縮脂製劑的製備

該實例說明了在實驗室規模生產下完全縮合核酸的高度濃縮製劑的製備。這涉及製備帶有陽離子聚合物的核酸複合物並隨後凍幹和復水於等滲溶液中。所用核酸是編碼il-12或螢光素酶基因的質粒dna，且所述聚合物包含與聚乙二醇(peg)和膽固醇(chol)共價連接的聚乙烯亞胺(pei)主鏈(peg-pei-chol或ppc)。peg與pei的摩爾比和膽固醇與pei的摩爾比分別為0.5～10和0.1～10。首先，在注射用水中分別製備5mg/ml的dna溶液和ppc溶液，隨後在3％乳糖中稀釋至0.15mg/ml(dna)和0.554mg/ml(ppc)。用微量移液器將dna乳糖溶液添加至ppc乳糖溶液中以使氮與磷酸根之比(n:p比)為11:1，並將該製劑在室溫溫育15分鐘以使得複合物能夠形成。用來自labconcocorp.,kansascity,mo的freezone凍干係統將3％乳糖中的ppc/dna複合物凍幹。將500μl製得的製劑添加至2ml硼矽酸鹽玻璃管中，然後使用由以下階段組成的凍幹程序將其凍幹：

1)冷凍階段(變溫(ramp)0.25℃/分鐘，在34℃保持4小時)，

2)初次乾燥階段(在34℃保持24小時)，

3)二次乾燥階段(變溫至20℃並保持24小時)，和

4)以0.25℃/分鐘變溫至4℃。

將所得凍乾粉末用注射用水復水為0.1mg/ml～20mg/mldna的各種濃度。一批典型的小規模製劑的量為100mg～200mg的完全配製的dna。

實施例1a

基本根據上文實施例1所概述的步驟使用n:p比為11:1的陽離子脂聚合物和il-12核酸來製備核酸/陽離子脂聚合物製劑。該陽離子脂聚合物的peg:pei:膽固醇摩爾比為約2.5:1:0.6，且分子量(作為游離鹼)為約3.54kd。將所得的含乳糖製劑凍幹並可以復水為至少約0.5mg/ml的核酸濃度而不會有核酸聚集或明顯的轉染活性損失。

實施例2

帶有陽離子脂聚合物的縮合核酸的濃縮液體製劑的製備

該實例說明了高度濃縮的縮合核酸製劑的製備，如圖1所示。該方案已生產超過6000mg的完全配製的dna(與實施例1所述的小規模製備所生產的100mg～200mgdna相比)，並能擴展至甚至更高的生產量。該放大方法涉及用蠕動泵將大量dna和聚合物溶液混合從而實現在線混合情景以形成複合物，接著施行可配合大負載的凍幹循環。簡言之，將dna和ppc分別製備為3％乳糖中的0.3mg/ml和1.1mg/ml的溶液。用帶有內徑為0.89mm的矽套管(watsonmapvlow,z982-0088)的蠕動泵(watsonmarlow,sci400)於225±25ml/分鐘的流速將兩個組分以恆定流速合併。兩個混合物通過聚丙烯t形連接器在各個管的末端會合。聚合物和dna溶液的混合導致立即形成納米顆粒。將40毫升配製的複合物置於100ml玻璃管中並用由以下階段組成的凍幹程序凍幹：

1)在-50℃預冷凍至多720分鐘，

2)在65μmhg，在-40℃一次乾燥至多180分鐘，然後在-34℃乾燥至多1980分鐘，和

3)在65μmhg，在-25℃二次乾燥至多720分鐘，然後在-15℃乾燥至多3180分鐘，在-10℃乾燥至多1500分鐘，並在4℃乾燥至多1440分鐘。

將所得凍乾粉末用注射用水復水為0.1mg/ml～20mg/mldna的各種濃度。一批典型的該規模產品的量為6000mg的完全配製的dna。

實施例3

帶有陽離子脂聚合物的縮合核酸的濃縮液體製劑的粒徑的測定

如實施例1和2所述製備帶有陽離子脂聚合物ppc的質粒dna的高度濃縮製劑。為進行聚合物/核酸粒徑測定，用來自brookhaveninstrumentscorp.,holtsville,ny的90plus/bi-masparticlesizer分析所述液體製劑的等分試樣。具體而言，將50μl製劑添加至聚苯乙烯比色皿中的950μl的milli-q水中以進行分析。

圖2顯示了預凍幹或非濃縮的製劑(0.15mg/mldna)中的dna/ppc複合物和在用il-12質粒(圖2a)或螢光素酶質粒(圖2b)復水為0.5mg/ml～10mg/ml的更高濃度之後的粒徑。在更高濃度的復水沒有顯著影響粒徑，這表明該複合物是穩定的。

實施例4

帶有陽離子脂聚合物的核酸的濃縮液體製劑的核酸縮合物的分析

在該實例中評估了ppc聚合物縮合質粒dna的能力。如實施例1和2所述製備帶有陽離子脂聚合物ppc的質粒dna的高度濃縮製劑。用1％瓊脂糖凝膠對該核酸/聚合物複合物進行電泳。帶負電的質粒dna與帶正電的ppc聚合物的靜電引力阻止dna運行通過瓊脂糖凝膠。如圖3所示，該高度濃縮製劑中存在的所有dna是縮合的。

實施例5

帶有陽離子脂聚合物的核酸的濃縮液體製劑中的核酸濃度的測定

使用agilent8453分光光度計(agilenttechnologies,inc.santaclara,ca)對dna與ppc複合物的高度濃縮製劑中的核酸量進行定量。用950μl注射用水(wfi)將50μl所述製劑在石英比色皿中稀釋並採用260nm波長測定吸光度。假設1光密度(260nm處)＝50μg/mldna，確定dna濃度。

實施例6

帶有陽離子脂聚合物的核酸濃縮液體製劑的轉染活性的測定

在體外確定dna與ppc的複合物的高度濃縮製劑的轉染活性。將其與非濃縮製劑的轉染活性進行直接比較。通過實施例1和2中所述的方法製備含有螢光素酶或il-12質粒的轉染複合物，並復水為0.15mg/ml～10mg/ml的dna濃度。將cos-1細胞(1.5×105細胞/孔)接種至10％胎牛血清(fbs)中的12孔組織培養板中。在沒有fps存在時將各孔與4μg的複合dna在總體積為500μl的dulbecco/vogt改進eagle最小必需培養基(dmem)中溫育6小時。當溫育期結束時，將培養基置於1ml的補充有10％fbs的新鮮dmem中再40小時。在溫育期結束時，在細胞培養基(il-12)或細胞裂解物(螢光素酶)中測定轉染活性。對於il-12水平測定，通過il-12elisa測試直接分析細胞培養基。對於螢光素酶測定，用磷酸緩衝鹽水洗滌細胞並用tent緩衝液(50mmtris-cl[ph8.0]2mmedta,150mmnacl,1％tritonx-100)裂解。使用orionmicroplateluminometer(bertholddetectionsystems,oakridge,tn)測定細胞裂解物中的作為相對光單位(rlu)的螢光素酶活性。最終螢光素酶值以rlu/mg總蛋白為單位報導。用bca蛋白測試試劑盒(piercebiotechnology,inc.,rockford,il)確定總蛋白水平。來自il-12和螢光素酶質粒/ppc複合物的高度濃縮製劑的il-12和螢光素酶表達水平分別如圖4a和圖4b。數據顯示高度濃縮形式的核酸複合物的轉染活性得到保留。

實施例7

帶有陽離子脂聚合物的核酸的濃縮液體製劑的製備物中的各種賦形劑糖的評估及其表徵

評估了作為凍幹過程期間的可能填充劑或填料劑以用於製備高度濃縮製劑的兩種常用糖(乳糖和蔗糖)。分別製備3％、1.5％和0.3％的ppc/dna複合物在乳糖和蔗糖中的溶液。使用實施例1中所用方案將這些製劑凍幹。凍幹過程後，將製劑用wfi復水為0.5mg/ml、1mg/ml和5mg/ml的最終dna濃度。對這些不同製劑評估其粒徑和體外基因轉移。如表1所示，不管冷凍保護劑填料是蔗糖或乳糖，粒徑和轉染活性均得到保留。這些結果顯示超過一類糖可以被用於製備物理化學和生物學穩定的帶有陽離子聚合物的高濃度核酸。

表1

帶有陽離子聚合物的核酸的濃縮等滲製劑的製備物中的賦形劑糖的評估

實施例8

帶有陽離子脂聚合物的核酸的濃縮液體製劑在顱內表達後的正常腦實質中的il-12表達

檢驗帶有陽離子聚合物ppc的il-12質粒在正常腦組織中的直接施用以確定核酸和陽離子脂聚合物的高度濃縮製劑在體內是否是生物活性的。在來自治療後14天或1月處死的動物的大腦切片上進行對il-12的免疫組織化學染色。僅用ppc治療的動物的腦實質沒有顯示出任何il-12染色(圖5a)。相反，用pmil-12/ppc在顱內進行注射的小鼠的腦實質對於il-12為陽性染色(圖5b)。該實驗表明，帶有陽離子聚合物的核酸複合物的生物活性在濃縮過程中得到保留。另外，可以推斷細胞因子在注射後的至少一個月中仍然存在。而且，該細胞因子在處死前仍然存活的動物的大腦中的存在表明il-12的實際表達沒有導致大腦中的致命毒性。

實施例9

帶有脂聚合物的核酸的濃縮液體製劑在小鼠成膠質細胞瘤模型中的效力

在小鼠成膠質細胞瘤模型中檢驗了表達il-12的完全複合核酸的高度濃縮製劑的抗癌效力。通過顱內注射1×105個gl261成膠質細胞瘤細胞以及3μl的來自5mg/mlil-12質粒dna高度濃縮製劑的il-12/ppc複合物共注射物來將腫瘤植入小鼠大腦皮層。對動物監測任何的神經毒性徵兆並在可能時進行屍體解剖以確證死亡是由顱內腫瘤造成的。使用kaplan-meier存活率分析對存活率作圖。以15μg質粒劑量施用的pmil-12/ppc複合物的單次顱內注射的耐受良好，這是因為沒有觀察到顯著的副作用。15μg質粒劑量的pmil-12/ppc複合物的單次注射顯著提高了動物存活率。

實施例10

帶有陽離子脂聚合物的核酸的濃縮液體製劑在卵巢癌患者中的生物活性

檢驗了表達il-12基因的完全縮合核酸的高度濃縮製劑在患有復發性卵巢癌的患者中的生物活性。每周4次的il-12質粒和ppc的高度濃縮等滲製劑在患有復發性卵巢癌的女性中的腹膜內施用在受治療的患者的腹膜液中產生顯著的ifn-γ(il-12的替代標記物)水平。ifn-γ水平為20pg/ml腹膜液～275pg/ml腹膜液。這些數據表明，il-12核酸的高度濃縮製劑適於臨床應用。

實施例11

評估陽離子聚合物的化學組成對帶有陽離子脂聚合物的核酸的濃縮液體製劑的性質的影響

此前的嘗試已經表明，由於濃縮過程造成的不良穩定性和轉染損失，因而對帶有如脂質或聚合物等陽離子基因載劑的核酸製劑進行濃縮是極為困難的。為了確定物理化學和生物學穩定的高濃度完全縮合核酸的成功製備是否對於測試陽離子聚合物peg-pei-膽固醇(ppc)是獨一無二的，測試了包括帶有游離pei、與膽固醇相連的pei或與peg相連的pei的陽離子聚合物以及陽離子脂質體dotap。製備0.15mg/ml的dna複合物並如實施例1所述濃縮至0.5mg/ml～5mg/ml。如實施例3和6所述確定粒徑和轉染活性。如圖7和8所示，用游離pei(pei1800、pei15000、pei25000)或pei-膽固醇、pei-peg或陽離子脂質dotap製備的dna複合物沒有產生穩定的複合物，因為這些複合物在凍幹並復水為0.5mg/ml～5mg/ml後聚集並損失了轉染活性。去穩定化效果在5mg/ml比0.5mg/ml更加顯著。相比之下，用peg-pei-膽固醇(ppc)製備的dna複合物在凍幹和於高dna濃度復水期間保持了其物理化學性質和轉染性質(圖7和8)。這些結果表明，用膽固醇和peg對陽離子聚合物的共價修飾對於濃縮過程中的活性保留是至關重要的。

實施例12

帶有陽離子聚合物的核酸的凍幹製劑或濃縮液體製劑的長期穩定性

用實施例2中概述的方法在cgmp下製備了大規模的凍幹il-12/ppc複合物，並儲存於-80℃、-20℃、4℃和25℃(60％rh)以用於穩定性評估。進行分析時，從儲存器中取出管並添加2.4ml的wfi。對於每個樣品，測定ph、dna濃度、滲透摩爾濃度、粒徑和生物活性。如圖9所示，il-12/ppc複合物的dna濃度、ph、滲透摩爾濃度和粒徑在指定溫度的兩年儲存期間都得到維持。如實施例6所述，在cos-1細胞中對pil-12/ppc的基因轉移活性進行定量。用4μgdna的生物材料轉染cos-1細胞。轉染後48小時，用商購elisa試劑盒對細胞培養基中的il-12水平進行定量。在-80℃或-20℃的儲存期間，生物產品的生物活性沒有明顯改變。在時間為0時，活性為151±130pg/ml，其餘數據在該標準偏差內波動，例外的是在25℃處隨時間進行活性持續下降。在4℃，在360天時觀察到轉染活性的降低，但由於樣品不足，沒有可利用的後續時間點以得出結論性評估。

實施例13

帶有陽離子聚合物的核酸的濃縮液體製劑的復水材料的穩定性

在單獨的研究中檢驗了復水材料的穩定性。根據實施例2所述的方法製備凍幹的il-12質粒dna/ppc複合物，並在注射用水中復水為0.5mg/ml。將復水材料儲存於4℃。在第60天和第90天取出樣品並分析粒徑、滲透摩爾濃度和基因表達。同時分析儲存於-80℃的密封管中的凍乾產物以進行比較。如表2所示，在用wfi復水後，復水的egen-001在4℃至少在90天中是穩定的。與儲存於-80℃的密封管中的凍乾產物相比，包括dna濃度、粒徑、滲透摩爾濃度或基因表達的穩定性參數均未顯著改變。

表2

帶有陽離子聚合物的核酸的高度濃縮及完全縮合的等滲製劑在4℃的長期穩定性

實施例14

通過與peg-pei-膽固醇共同配製來製備合成核酸傳輸體系的高度濃縮穩定dna製劑

將peg-pei-膽固醇添加至現存的合成核酸傳輸體系中以提高在高核酸濃度下通常不穩定的核酸製劑的穩定性。

在一個實施例中，將peg-pei-膽固醇添加至用25kda的直鏈聚乙烯亞胺(lpei25kd)製備的dna製劑中。可以用lpei25kd以10:1(n:p比)在3％乳糖的存在下製備濃度為0.15mg/ml的dna製劑。然後可以將peg-pei-膽固醇以不同的ppc與配製的dna之比添加至lpe125kd/dna複合物中。例如，ppc/dna(n:p比)可以為(0:1)、(1:1)、(5:1)、(7.5:1)、(11:1)、(15:1)和(20:1)。可以將500μl的各個製劑加入2ml硼矽酸鹽玻璃管中，然後在冷凍乾燥系統中凍幹。凍幹程序由以下階段組成：

1)冷凍階段(變溫0.25℃/分鐘，在-34℃保持4小時)，

2)初次乾燥階段(在-34℃保持24小時)，

3)二次乾燥階段(變溫至-20℃並保持24小時)，和

4)以0.25℃/分鐘變溫至4℃。

可以將凍幹製劑用注射用水復水為0.5mg/ml或其它合適的濃度。

應該理解，上述組合物和應用模式僅是對本發明的優選實施方式的說明。本領域技術人員可以在不背離本發明的實質和範圍的情況下設想出多種修改和替代性設置，且所附權利要求旨在包括這些修改和設置。因此，儘管上文已經用目前被視為是最實際和優選的本發明的實施方式對本發明進行了具體和詳細的描述，但對於本領域技術人員顯而易見的是，可以在不背離本文所述的原則和概念的情況下進行多種修改，這些修改包括但不限於尺寸、材料、形狀、形式、功能和操作方式的變化。