對fmr1和fmr2基因5』非翻譯區進行表徵的pcr方法

2023-05-21 04:28:51

專利名稱：：對fmr1和fmr2基因5』非翻譯區進行表徵的pcr方法
技術領域：
：本發明屬於DNA合成與分析領域，特別是涉及富含GC的模板和產物。MM自從首次分離到DNA合成酶並確定了體外合成DNA的條件，DNA合成反應已被廣泛在生物技術、醫藥和研究應用中用於製備和分析目的。聚合酶鏈式反應，或PCR是可以快速和指數性擴增DNA序列的一類DNA合成反應。與其他循環進行的合成反應一樣，PCR涉及以循環的方式反覆拷貝靶序列。典型的PCR實施過程包括提供與待擴增序列末端互補的引物、合適的緩衝液、鎂鹽、脫氧核苷三磷酸(dNTPs)和嗜熱DNA聚合酶。包含在例如基因組DNA樣品中的模板或靶DNA與這些成分在水溶液中接觸。混合物在不同溫度進行循環，這些溫度促進模板的變性、引物與模板的退火、然後聚合酶對引物的延伸，從而產生更多產物。由於每個循環的產物可以在隨後的反應中作為模板，產物的量幾乎指數增長直至其他反應成分(開始過量存在)被耗盡。參見例如美國專利4，683，202；M.J.McPherson&S.G.Moller,PCR:TheBasics(2ndEd.，Taylor&Francis)(2006)。PCR與其他形式的循環進行的核酸合成反應對於分子生物學、生物技術、以及日漸地對於醫學都是標準工具。PCR和相關技術的關鍵優勢是快速、低成本、敏感度、可用於高通量分析以及多能性。擴增只需要幾小時甚至更短時間、少數的個別反應可能只耗費1美元以下的試劑、需要的模板量通常在納克級別、自動化使得每個機器人每天可以進行幾千個反應，可以設計出用於擴增幾乎任何序列的引物。PCR及相關技術被廣泛用於分析和製備應用。PCR的典型製備用途是用於擴增序列使它可以克隆到異源載體中。PCR重要的分析應用包括涉及具有大小多態性的基因座的病情診斷或基因型確定。表現出醫學相關的大小多態性的基因座一個例子是，位於人X染色體上的FMRl基因的5』非翻譯區(UTR)。正常個體的該區域內通常有5-44個CGG重複。相反，含有200到2000或更多個CGG重複的基因座等位基因指示著脆性X染色體症候群(FXQ。這種等位基因被稱為全突變等位基因(FullMutationalleles)0它們在遺傳學上不穩定。患有FXS的個體可能有諸如共濟失調、卵巢早衰、學習障礙和其他認知/行為狀況(包括類自閉症症狀)的症狀的各種組合。PCR多能性的一個令人遺憾的例外是難以擴增富含GC序列的長片段，包括FMRl5'UTR的全突變等位基因。對FMRlPCR進行的優化企圖包括對常規PCR方法條件的改進。參見GenomeRes.6(7):633-8(1996)；NucleicAcidsRes.25(19):3957-8(1997)；J.Mol.Diagn8:544-550(2006)；Am.J.Med.Genet.51(4):527-34(1994)。但是在FMRlPCR方法發展了15年多以後，即使最近的2008年(Genet.Med.10(10):714-9(2008))，一篇發表的關於檢測新生兒中脆性X染色體的試驗性篩選研究仍報導說「在確定女性中FMRl重複數目的內部驗證過程中使用的...兩種定量鏈式聚合酶反應(PCR)分析方法未能產生可靠和可重複的結果(粗體是後加的)，此外「由初級或次級分離物進行的二次PCR的失敗高度提示FMRlCGG重複的異常大小」。因此，本領域技術人員仍然把可重複地PCR擴增全突變脆性X染色體等位基因看作是有待解決的問題。在通過PCR檢測含有超過100個重複的CGG三聯重複區時觀察到，隨著重複數目的增加，檢測越來越弱(J.Mol.Diagn.7:605-12(2005))。這一困難，結合FXS症候群的各不相同的特性，導致為了檢測全突變等位基因使用諸如Southern印跡的程序(同上)。Southern印跡通常比PCR更耗時，成本更高，沒有PCR適合用於高通量應用。Tassone等(J.Mol.Diagn.10:43-49Q008)；"Tassone2008」)最近發表的文章描述了用於不經等位基因的全長擴增來檢測較長CGG等位基因的分析法。還可參見W02008/011170。該方法利用了與延展的CGG區內的位點雜交的嵌合PCR引物，這樣如果存在寬的PCR產物彌散帶就表明延展等位基因陽性(同上46頁)。隨機雜交策略可能導致非特異性擴增和分辨力不足。這篇文章中使用的基礎PCR條件已被多個不同實驗室進行了檢驗，似乎可以成功擴增的CGG重複數目是大約350CGG重複。參見例如Salutoetal.,J.Mol.Diagn.7:605-612(2005)Tassone2008中的非特異擴增很明顯。Tassone2008圖1所示的瓊脂糖凝膠中的彌散帶似乎含有的產物超過了包含350個重複的擴增子的預期最大長度，因此可能彌散帶大部分不代表CGG重複的特異產物(參見Tassone2008的圖1；泳道5中的彌散帶似乎延伸到上樣孔內的空間)。Tassone等在圖3的圖標中指出他們使用了High-Lowladder(Bionexus,Oakland,CA)作為分子量標記，圖1中的標記似乎與圖3的相同。High-Lowladder中最大的條帶大約101Λ，而圖1中的彌散帶超過了該條帶。這一長度也比分析中使用的樣品的預期全長產物長。列出的最大等位基因大小是615個CGG重複。因此，通過給1845nt重複加上大約200nt旁側序列估計出全長產物預期大約21Λ。非特異性產物會降低基於擴增的脆性X染色體關聯等位基因狀態的確定方法的準確性和可信度。此外，用於檢測脆性X染色體的一些單純基於基因特異性引物設計的常規PCR方法有局限性。例如，這類方法根據PCR擴增子的遷移率提供對CGG重複數目的一個估計。為了能夠準確地確定重複數目，通常相對外部校準物(例如一組合適的分子量標準)來測量擴增子遷移率。能夠不依賴外部校準物的情況下準確確定CGG的數目將是可取的。而且，FMRl等位基因可能含有散布在CGG重複中的AGG序列，通常位於重複區段的5』區域。對AGG序列元件的了解可以從一方面表徵等位基因。AGG序列元件可以用於臨床決策。例如注意到某個僅含有59個重複的FMRl等位基因，從母親到她的孩子中延展為全突變等位基因的病例，並且已知該等位基因缺乏任何AGG元件。參見Nolinetal.,Am.J.Hum.Genet.72=454-464(2003)。的確，全突變如果會，也是很少在第一批20個CGG重複之後含有AGG元件，生物物理研究表明在CGG重複區段中帶有AGG「中斷者」的模板更可能採取更常規的DNA結構，更穩定和易於被準確地複製。參見例如Wfeisman-Shomeretal.，NucleicAcidsRes.28:1535-41(2000)；Zhongetal.,Am.J.Med.Genet.64:261-5(1996)；Larsenetal.,Am.J.Med.Genet.93:99-106(2000)；禾口Dombrowskietal.,Hum.Mol.Genet.118371-7W2002)。因此，需要對FMRl基因中諸如AGG元件的中斷元件進行作圖的技術。所以中斷元件作圖具有與脆性X染色體症候群，以及其他重複相關疾病有關的研究和診斷應用。現有的AGG元件作圖方法包括測序和限制性酶切圖譜。DNA測序技術比較繁重，特別是因為該技術通常需要對目標序列進行富集或分離(無論是體外或通過電腦模擬)，在脆性X染色體診斷測試中不是常規進行的。基於限制性酶切圖譜的方法使用MnlI酶(酶識別GAGG序列，在所述序列5』方向7個鹼基對處切割)來根據包含FMRl5』UTR中CGG重複區的PCR產物被消化得到的片段大小來推測AGG的位置。參見例如Eichleretal.,Nat.Genet.8:88-94(1994)；Zhongetal.，Am.J.Hum.Genet.57:351-361(1995)。Eichler等的方法包括重複區的PCR擴增、產物純化、過夜酶切消化、電泳7小時以及Southern印跡。在Zhong等的方法中，「將PCR產物用酚/氯仿提取一次，乙醇沉澱並在10升中用5單位MnlI於37°C部分消化50-70分鐘(thePCRproductwasextractedoncewithphenol/chloroform,ethanolprecipitated,andpartiallydigestedin10literswith5unitsatfor50_70min.)，，(同上353頁)。之後進行電泳和Southern印跡。這兩種方法除了PCR和電泳還涉及多個步驟，包括純化/清理、限制酶切和Southern印跡。本文提供了方法對FMRl和FMR2基因的5』UTR中CGG重複進行定量，以及中斷序列的序列成分進行鑑定、定量和揭示。本發明潛在的應用包括給脆性X染色體測試的臨床應用。一些實施方案中，發明涉及分析樣品中至少一種模板所包含的至少一種CGG富含區的方法，所述方法包括(a)提供至少兩個不同引物，包括含有066、0^、606、06(、60或66(重複的第一引物；和與CGG富含區之外的位點退火的第二引物；(b)用所述至少兩個不同引物和包含至少一種CGG富含區的至少一種模板進行PCR，其中所述PCR產生一組產物；(c)利用解析度高的技術將產物分開，產生產物大小和豐度的表現形式(representation)；以及(d)得出關於所述至少一種CGG富含區中是否存在中斷序列，或者中斷序列在所述至少一種CGG富含區中處於何處的信息。一些實施方案中，發明涉及分析樣品中至少一種模板所包含的至少一種CGG富含區的方法，所述方法包括(a)提供至少三種不同引物，包括含有CGG、CCG、GCG、CGC、GCC或GGC重複和5，側翼(flap)的第一引物；與CGG富含區之外的位點退火的第二引物；和具有第一引物的5』側翼所包含的序列的第三引物，其中第一引物提供的濃度低於第三引物；(b)用所述至少三種不同引物和所述至少一種模板進行PCR，其中所述PCR產生一組產物；(c)利用解析度高的技術將產物分開，產生產物大小和豐度的表現形式；以及(d)由上述表現形式得出關於所述至少一種CGG富含區中是否存在中斷序列，或者中斷序列在所述至少一種CGG富含區中處於何處的信息。一些實施方案中，發明涉及分析樣品中至少一種模板所包含的至少一種CGG富含區的方法，所述方法包括(a)提供兩種不同引物，其中第一引物含有CGG、CCG、GCG、CGC、GCC或GGC重複；第二引物與CGG富含區之外的位點退火；(b)用所述至少兩種不同引物和包含CGG富含區的模板進行PCR，其中所述PCR產生一組產物；(c)利用解析度高的技術將產物分開，產生產物大小和豐度的表現形式；以及(d)由所述表現形式得出關於CGG重複數目的信息。一些實施方案中，發明涉及分析樣品中至少一種模板所包含的至少一種CGG富含區的方法，所述方法包括(a)提供三種不同引物，其中第一引物含有CGG、CCG、GCG、CGC、GCC或GGC重複和5』側翼；第二引物與CGG富含區之外的位點退火；第三引物具有第一引物的5』側翼所包含的序列；(b)用所述三種不同引物和包含CGG富含區的模板進行PCR，其中所述PCR產生一組產物；(c)利用解析度高的技術將產物分開，產生產物大小和豐度的表現形式；以及(d)由所述表現形式得出關於CGG重複數目的信息。一些實施方案中，發明涉及包含選自SEQIDNO44和SEQIDNO45的序列的寡核苷酸。應當理解，如權利要求，以上概述和下面的詳述僅用於示範和解釋，不是對發明的限制。發明詳述發明涉及擴增CGG重複區全部或部分的擴增反應。一些實施方案中，CGG重複區包含在FMRl的5，UTR或FMR2的5，UTR中。發明涉及這樣的擴增反應，所述反應使用與CGG重複區以外退火的引物，和與CGG重複序列、序列的序列置換或反向互補(GCG、CCG、CGC、GCC或GGC)退火的引物。與CGG重複區以外(上遊或下遊)退火的引物可以是正向或反向引物。引物可以與CGG重複區旁側的序列退火。這類正向引物的例子包括CGGTGGAGGGCCGCCTCTGAGC(SEQIDNO:1)、CAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTT(SEQIDNO:2)、CAGTCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCG(SEQIDNO:3)、TCCGGTGGAGGGCCGCCTCTGAGC(SEQIDNO:4)、GGTTCGGCCTCAGTCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCG(SEQIDNO:5)、GGGTTCGGCCTCAGTCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCG(SEQIDNO:6)、GCGGGCCGGGGGTTCGGCCTCAGTCA(SEQIDNO:7)、CAGCGGGCCGGGGGTTCGGCCTCAG(SEQIDNO:8)、GCAGCGGGCCGGGGGTTCGGCCTCA(SEQIDNO9),GGGCCGGGGGTTCGGCCTCAGTCAG(SEQIDNO:10)、GGGGTTCGGCCTCAGTCAGGCGCTCA(SEQIDNO:11)、GGGGTTCGGCCTCAGTCAGGCGCTCAG(SEQIDNO12)、GGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCACTTCC(SEQIDNO13),TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA(SEQIDNO14),CACTTCCGGTGGAGGGCCGCCTCTGA(SEQIDNO15)、TTCCGGTGGAGGGCCGCCTCTGAGC(SEQIDNO:16)禾口TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCACGGCGGCGGCGGCGGA(SEQIDNO:44)。這類反向引物的例子包括CGCACTTCCACCACCAGCTCCTCCA(SEQIDNO:17)、GGAGCCCGCCCCCGAGAGGTG(SEQIDNO18)、GGGAGCCCGCCCCCGAGAGGT(SEQIDNO19)、CGCACTTCCACCACCAGCTCCTCCAT(SEQIDNO:20)、CGGGAGCCCGCCCCCGAGAGGTG(SEQIDNO:21)、CCGGGAGCCCGCCCCCGAGAGGT(SEQIDNO22),CCGGGAGCCCGCCCCCGAGAGGTG(SEQIDNO:23)、CGCCGGGAGCCCGCCCCCGAGAGGTG(SEQIDNO:24)、GCGCCGGGAGCCCGCCCCCGAGAGGT(SEQIDNO25)、CGCCGGGAGCCCGCCCCCGAGAGGT(SEQIDNO:26)、GCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCCACCA(SEQIDNO27),GCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCCA(SEQIDNO28),AGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC(SEQIDNO:2、CGCCATTGGAGCCCCGCACTTCCAC(SEQIDNO:30)、TTGGAGCCCCGCACTTCCACCACCA(SEQIDNO:31)、AGCCCCGCACTTCCACCACCAGCTCCTC(SEQIDNO:3、GAGCCCCGCACTTCCACCACCAGCTCCT(SEQIDNO33),CATTGGAGCCCCGCACTTCCACCACCAG(SEQIDNO:34)、CCCGCACTTCCACCACCAGCTCCTCCATCT(SEQIDNO35),TAGAAAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC(SEQIDNO:36)、MGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC(SEQIDNO:37)、MGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCCCCGCCGCCGCCGCCG(SEQIDNO43)和AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCCCCGCCGCCGCCGCCT(SEQIDNO45)。發明進一步涉及方法及其用途，包括提供引物TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCACTTCCGGT(SEQIDNO38)、AGCGTCTACTGTCTCGGCACTTGCCCGCCGCCGCCG(SEQIDNO39)、TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA(SEQIDNO:40)和TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCACGGCGGCGGCGGCGG(SEQIDNO:41)。發明還涉及包含SEQIDNOs1-38或40之一併在3，端附加CGG重複或其置換和反轉序列的引物。發明進一步涉及包括提供引物的方法及其用途，所述引物含有多個序列CGG的三核苷酸重複或其置換和反轉序列。在一些實施方案中，引物中的CGG重複數量是四個或五個。在一些實施方案中，引物含有12-15個核苷酸的三核苷酸重複序列。在一些實施方案中，引物含有從3個到10個的多個重複。引物可能含有3、4、5、6、7、8、9或10個重複，和任選的1或2個C和/或G殘基的其他部分重複。還可以提供其他引物來保證例如多態位點的結合，或者用於擴增大小已知區域作為內部標準。在一些實施方案中，與CGG重複序列退火的引物對包含中斷元件的CGG富含區內的位點優先結合。與CGG重複序列退火的引物優先結合至少一種包含中斷元件的位點，通過例如在PCR反應中使用該引物和如上所述與CGG富含區之外結合的反向第二引物，會導致選擇性擴增包含所述中斷元件的至少一種產物。優先結合活性可以是對包含CGG和AGG元件的位點，或者它們的置換和/或反轉序列特異的，比如包含(1)一個AGG元件或者包含A的部分AGG元件，以及(三、四、五、或六個CGG元件和任選的部分CGG元件的位點。優先結合的程度，表達為使用所述引物和結合到CGG富含區之外的反向第二引物進行的擴增反應中被選擇性擴增的產物與背景產物的比率，可以是至少3倍、4倍、5倍或6倍；或者可以在3-12倍、3-10倍、3-8倍、4-12倍、4-10倍、4-8倍、3-7倍、4-7倍、3-6倍或4-6倍的範圍內。所述至少一種被選擇性擴增的產物通常其長度對應沿著模板從與包含中斷元件的位點優先結合時第一引物的5』端到與CGG富含區之外位點結合時第二引物的5』端之間的距離。—些實施方案中，與CGG重複序列退火併優先結合包含中斷元件的CGG富含區內的位點的引物可能在與CGG重複序列退火的引物部分的內部或者末端含有A、T或U殘基，或者換句話說，在CGG、CCG、GCG、CGC、GCC或GGC重複之中或者末端含有A、T或U殘基；參見例如以上SEQIDNOs44和45。A、T或U殘基可以發生在引物的3，端。當A、T或U殘基發生在CGG、CCG、GCG、CGC或GCC、GGC重複的末端時，A、T或U殘基與最後一個完整CGG、CCG、GCG、CGC、GCC或GGC重複之間可能有也可能沒有部分CGG、CCG、GCG、CGC、GCC或GGC重複。如下文更詳細的描述，可以用非天然核苷酸殘基代替A、T或U殘基，所述非天然核苷酸殘基比其他天然核苷酸殘基更優先與T/U或A殘基配對。類似地，也可能用一或多個比其他天然核苷酸殘基更優先與C或G殘基配對的非天然核苷酸殘基代替構成CGG、CCG、GCG、CGC,GCC或GGC重複的一或多個G和/或C。在本來是由CGG、CCG、GCG、CGC、GCC或GGC重複(任選含有A、T、U或如上討論的相應的非天然殘基)構成的序列中存在一或多個這種非天然殘基不影響所述序列在本發明公開中被認為是CGG、CCG、GCG、CGC、GCC或GGC重複序列。在非錨定分析法中，提供的第一引物對不包含中斷元件的CGG富含區有優先結合活性。在非錨定方法結果中，較低水平的產物表明存在著中斷元件，因為這些產物的合成涉及第一引物結合到包含中斷元件的位點上並延伸。低水平的產物在電泳圖中顯示為缺口或者被較高峰包圍的低峰。在錨定分析法中，提供的第一引物對包含中斷元件的CGG富含區有優先結合活性。應當注意，可以給這樣的反應提供對包含中斷元件的CGG富含區內的位點有優先結合活性的引物，所述反應其中的至少一種模板包含至少一種含有0、1或複數個中斷元件的CGG富含區；引物「對包含中斷元件的CGG富含區有優先結合活性」的說法並不表示例如CGG富含區一定包含複數個中斷元件。錨定分析法中，較高水平的產物表明存在著中斷元件，因為這些產物的合成涉及第一引物與包含中斷元件的位點結合併延伸。高水平產物可能在電泳圖中顯示為被低峰和/或基線信號包圍的峰尖。一些實施方案中，錨定分析法中使用的第一引物在CGG重複之中或者3』端包含A、T或U殘基。一些實施方案中，錨定分析法中使用的第一引物包含比其他天然核苷酸殘基更容易與A或T/U殘基配對的非天然核苷酸殘基。非天然核苷酸殘基是包含腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶(分別是A、T、G、C和U)之外的核苷鹼基的核苷酸殘基。優先與A或T/U殘基配對的非天然核苷酸殘基的例子包括，但不限於比其他天然殘基更易於與A或T/U配對的T、U或A的加合物(例如5-取代的尿嘧啶類似物)；和包含諸如例如假尿嘧啶和二氨基嘌呤的核苷鹼基的殘基。兩種引物與雙鏈核酸模板的相反兩鏈結合時，它們被認為是反向的引物。本文中，當序列發生在包含CGG重複的鏈中CGG富含區的5』方向時，序列是CGG富含區的上遊。本文中，當序列發生在包含CGG重複的鏈中CGG富含區的3』方向時，序列是CGG富含區的下遊。本發明的方法可能涉及包括提供至少兩種或至少三種不同引物的擴增反應。在一些實施方案中，提供了至少三種不同引物，其中的一種引物是另一引物的亞序列。在一些實施方案中，一個引物是包含CGG重複和5』側翼序列的嵌合引物，另一個引物具有嵌合引物5』側翼序列的序列。應當注意，具有嵌合引物5』側翼序列之序列的引物可以，但不必須具有嵌合引物的全部非重複序列。換句話說，一個引物的部分或全部序列可以由另一個引物的序列構成；例如，嵌合引物包含5』側翼序列，另一個引物可以包含部分或全部5』側翼的序列。在一些實施方案中，引物含有12-15個核苷酸的CGG重複序列。5』側翼序列可能對應與CGG重複區相鄰或靠近的序列，或者與CGG重複區內的和周圍的序列無關。在一些實施方案中，嵌合引物的長度大約是35、40、45、50或55nt。在一些實施方案中，一或多種引物的Tm在60V-75V的範圍內，例如大約60V、65°C、70V或75°C。一些實施方案中，提供了至少三種不同引物，其中一種引物提供的濃度低於另一種引物的濃度。例如，任選提供的嵌合引物濃度低於具有嵌合引物5』側翼序列之序列的引物的濃度。濃度的比率，以倍數表示，可能在2-10，000或更大的範圍內，例如是10、20、50、100、200、500、1，000,2,000,5,000或10，000。這種實施方案中，處於較低濃度的引物可以在擴增反應早期的幾輪中被耗盡，因此延伸通常全部或者幾乎全部來自仍然存在的引物(開始處於較高濃度)。本發明涉及擴增核酸的反應。擴增反應的例子包括，但不限於PCR、NASBA(基於核酸序列性擴增)和SDA(鏈置換擴增)。參見例如美國專利4，683，202(PCR)；美國專利6，326，173；J.ofVirol.Methods151:283-293(2008)(NASBA)；以及美國專利5，648，211(SDA)。以上文獻均通過引用併入本文。技術人員知道適合提供何種試劑。這些方法每一種都涉及在有助於DNA聚合發生和含有模板的溶液中進行DNA的合成，因此涉及使用DNA聚合酶、核苷酸和二價陽離子(以鹽提供，特別是鎂)。這些方法的不同在於提供其他的催化活性、使用熱循環溫育或等溫溫育以及引物的使用和結構。通常還要提供合適PH的緩衝液，比如pH7和8、6.5和8.5、6和9之間，或者大約7.4或7.5。根據本發明的PCR，至少提供一對與相反兩鏈的末端或者目標區域結合的引物，這樣它們各自引導朝向另一引物的合成。反應在不同溫度循環從而推動高溫下底物變性步驟、低溫下引物退火步驟，以及在可能但不一定比退火步驟的溫度高的溫度下進行延伸。由於一個循環的產物可以在下個循環中作為底物，發生擴增。在NASBA中，除了DNA聚合酶，還提供RNA聚合酶(RNAP)，後者也可能是逆轉錄酶(RT)(例如，可以利用RNA或DNA模板催化DNA合成的酶)。提供的引物類似於PCR中使用的那些，但至少一種引物還包含RNAP可以識別的啟動子序列。因此，RT的產物作為RNAP的模板，而RNAP合成RNA作為RT的模板，從而發生擴增。一些形式的NASBA中，提供RNaseH在通過RT合成了RNA-DNA雜交體後產生單鏈DNA。通過RT和RNAP的聯合作用，在不需要反覆熱變性的情況下進行擴增。SDA技術中以等溫和異步方式進行DNA擴增，意味著不是利用循環式熱變性來分開兩條鏈的，而是通過DNA合成本身進行鏈置換，其中3』OH的延伸導致下遊鏈被置換。3』OH先是由外部引物提供，然後通過切口反應提供。需要提供兩對引物。『內部』的一對引物與擴增子周圍結合，並且包含含有限制性酶切位點的5』側翼。另一對「外部」引物定位在遠側，即離目標區域更遠。內部引物可以與模板結合，被延伸，然後被相應外部引物的合成所置換。之後，發生置換的DNA通過例如第二鏈合成成為雙鏈。下一步是將雙鏈分子的一條鏈切口，這可以通過使用經修飾的核苷酸和限制酶切位點來實現，其中一條鏈(而非另一條鏈)上的所述切割位點由於修飾核苷酸而失活。反應中提供了與該位點對應的限制性內切酶，從而生成切口。所得到的切口處的3』OH被DNA聚合酶延伸，將一條鏈(可以再作為模板要注意，一些展示的鏈並非最初是全長，但由於形成切口，內部引物帽的遠端缺乏互補。這不會削弱引物結合(該引物的非帽部分具有足以穩定退火的長度)且，通過引物結合，產生5』突出端，使聚合酶能進行填充)置換，重新形成的雙鏈分子再次成為切口反應的底物，然後被延伸和置換，導致擴增發生。過程中不需要進行反覆熱變性。一些實施方案中，本發明的方法包括提供GC/AT比率大於1並且總dNTP濃度有助於利用富含GC的模板來合成DNA的dNIPs。參見美國專利申請12/371，306。GC/AT比率可以是大約1.1、1.2,1.4,1.6、2、2·5、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或更高。GC/AT比率可以在1.1和20、1.1禾Π15、1.1禾Π10、1.1禾Π8、1禾Π15、1.1和7、1.1禾口6、1.1和5、1·2禾口25、1.4和25、1.6和25、2禾口25、3禾口25、4禾口25、5禾口25、2禾口15、2.5和10，或者4和10之間。總dNTP濃度可以是大約0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9、1、1·2、1.5、2或3mM。dNTP濃度可以在0.4和3mM、0.5和3mM、0.6和3mM、0.7和3mM、0.8和3mM、0.9和3mM、1和3mM、0.4和2mM、0.4和1.5mM、0.4和1.2mM、0.4和lmM、0.4和0.9mM、0.4和0.8mM、0.4和0.7mM、0.5和2mM、0.5和ImM，或者0.6和0.9mM之間。「GC/AT比率」意味著給定溶液或混合物中，dCTP、dGTP及其所有核苷酸類似物的總濃度與dATP、dTTP、dUTP及其所有核苷酸類似物的總濃度的比率。「dNTP」代表脫氧核苷三磷酸，是指dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP及其類似物。「核苷酸類似物」是包含天然鹼基腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)之外的鹼基部分、與脫氧核糖相同或類似的糖部分、以及至少一種磷酸或多個磷酸(例如二磷酸或三磷酸)部分的分子或離子。核苷酸類似物是特定核苷酸(特別是dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP)的類似物，當它包含結構和構型都適合通過聚合酶引入核酸雙螺旋的三磷酸和糖部分，以及這樣的鹼基時，所述鹼基在核酸雙螺旋中的鹼基配對特性和被DNA聚合酶引入核酸雙螺旋的位點與以上列舉的5種核苷酸之一非常類似，除了dTTP的類似物通常也是dUTP的類似物，反之亦然。與包括但不限於「核苷」、「鹼基」、「核苷鹼基」或「殘基」等名詞關聯使用的名詞「類似物」應當按照和與「核苷酸」關聯時同樣方式地解釋。一些實施方案中，可以提供強化劑。強化劑有助於成功進行產生富含GC的產物的反應。PCR反應中通常可以包括多種強化劑來提供產量、特異性和一致性，並且可能是通過降低模板DNA的Tm來實現。強化劑可能通過螺旋去穩定、反應抑制劑中和或其他機理，包括未知機理來發揮作用。強化劑包括，但不限於甜菜鹼、甜菜鹼類似物、甘油、牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇、氯化四甲胺、7-脫氧-GTP、中性去汙劑、二甲基亞碸(DMSO)、甲醇、乙醇、異丙醇、甲醯胺、丙酮、乙醯胺、N-甲基甲醯胺、N，N-二甲基甲醯胺、丙酮、乙醯甲胺、N-甲基乙醯甲胺、N，N-二甲基乙醯甲胺、2-吡咯烷酮、N-甲基吡咯烷酮、丙醯胺和異丁烯胺。中性去汙劑包括，但不限於TWEEN-20、β-辛基-葡萄糖苷、辛基-β-硫-吡喃葡萄糖苷、TritonX-100、TritonX_114、NP-40、Brij_35、Brij_58、Tween-80、PluronicF-68、PluronicF-127、脫氧BigCHAP、CHAPS、CHES、壬基苯氧基聚乙氧乙醇(Tergitol-typeNP-40)和辛基苯氧基聚乙氧乙醇(Ig印alCA-630)。甜菜鹼類似物包括，但不限於同型丹醇(homodeanol)甜菜鹼、丹醇甜菜鹼、丙酸甜菜鹼、同型甘油甜菜鹼、二乙醇同型甜菜鹼、三乙醇同型甜菜鹼、羥丙基同型甜菜鹼、N-甲基-N-(2-羧乙基)嗎啉內鹽、N-甲基-N-(2-羧乙基)哌啶內鹽、N-甲基-N-(2-羧乙基)吡咯內鹽、N，N-二甲基-N-(2-羥乙基)-N-(2-磺乙基)銨內鹽、N，N-二甲基-N-(2-羥乙基)-N-(3-磺丙基)銨鹽、N，N-二羥乙基-N-甲基-N-(3-磺丙基)銨內鹽、N,N-二甲基-N-(2-羥乙基)-N-(4-磺丁基)銨內鹽、N-甲基-N-(3-磺丙基)嗎啉內鹽和N-甲基-N-(3-磺丙基)哌啶內鹽。可以提供的甜菜鹼、甜菜鹼類似物和/或其他強化劑摩爾濃度在0.01和5M、0.01和4M、0.01和3M、0.01禾口2.5M、0.02和5M、0.03和5M、0.04和5M、0.05和5M、0.07和5M、0.1禾口5M、0.2禾口5M、0.3禾口5M、0.4禾口5M、0.5禾口5M、0.7禾口5M、1禾口5M、1.5禾口5M、0.1和4M、0.5和3M、1和2.5M,或者1.5和2.5M之間，例如大約0.01,0.02,0.05,0.1,0.2,0.5、0.75、1、1.25,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2.0,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5、3、3·5、4、4·5或5M。替代地，可以提供的強化劑w/v或ν/ν百分比濃度在0.1和50%,0.2和50%,0.5和50%、1和50%,2和50%,5和50%,0.1和40%,0.1和30%,0.1和20%,0.5和40%,1和30%或者2禾口20%之間，例如大約0.1,0.2,0.5、1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50%的體積百分比。中性去汙劑可以提供體積百分比在0.0001和10%,0.0002和10%,0.0005和10%,0.001和10%,0.002和10%,0.005和10%,0.01禾口10%,0.02禾口10%,0.05禾口10%,0.0001和5%,0.0001和2%,0.0001和1%,0.0005和1%，或者0.001和之間，例如大約0.0001,0.0002,0.0003,0.0004,0.0005,0.0006,0.0007,0.0008,0.0009,0.001,0.002、0.003,0.004,0.005,0.006,0.007,0.008,0.009,0.01,0.02,0.03,0.04,0.05,0.06,0.07、0.08,0.09,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10%的體積百分比。本領域技術人員能夠確認各種強化劑的適宜濃度。本發明涉及這樣的方法，所述方法包括給擴增反應提供緩衝液。所述緩衝液可以包括例如但不限於，三羥甲基氨基甲烷(Tris)、雙三羥基甲氨基丙烷(bis-trispropane)、重碳酸鹽、磷酸鹽、甘氨酸、組氨酸、4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPEQ、3-(N-嗎啉)丙磺酸(M0PQ和各種共軛鹼/酸及其鹽。本發明涉及這樣的方法，所述方法包括提供至少一種DNA聚合酶由dNIPs以模板依賴性方式合成DNA。DNA聚合酶可以包括野生型、改造過的、嗜熱的、嵌合的、工程化的和/或一種以上聚合酶的混合物。DNA聚合酶可以包括ExactPolymerase(5PRIMEGmbH),AccuSureDNAPolymerase(Bioline),PhusionAccuPrimePfx(Invitrogen)、PlatinumTaqDNAPolymeraseHighFidelity(Invitrogen)、PhireHotStartDNAPolymerase(NewEnglandBiolabs)、PhusionHotStartHigh-FidelityDNAPolymerase(NewEnglandBiolabs)>JumpStartREDTaqDNAPolymerase(Sigma-Aldrich)、PfuUltraHotstartDNAPolymerase(Stratagene)、PfuTurboCxHotstartDNAPolymerase(Stratagene)、PrimeSTARHSDNAPolymerase(Takara)、ExtensorHi-FidelityPCREnzyme(ABgene)、ACCUZYMEDNAPolymerase(Bioline),SAHARADNAPolymerase(Bioline),VELOCITYDNAPolymerase(Bioline)、GeneChoiceAccuPOLDNAPolymerase(GeneChoice，Inc.).GeneChoiceUniPOLDNAPolymerase(GeneChoice，Inc.)、ElongaseEnzymeMix(Invitrogen)、Pfx50DNAPolymerase(Invitrogen)、PhusionDNAPolymerase(NewEnglandBiolabs)、KODHiFiDNAPolymerase(Novagen)、KODXLDNAPolymerase(Novagen)、Expand20kbPLUSThermostableDNApolymerasemixture(RocheAppliedScience)、ExpandHighFidelityPLUSThermostableDNApolymerasemixture(RocheAppliedScience)、ExpandHighFidelityThermostableDNApolymerasemixture(RocheAppliedScience)、ExpandLongTemplateThermostableDNApolymerasemixture(RocheAppliedScience)、Easy-AHigh-FidelityPCRCloningEnzyme(Stratagene)、EXLtmDNAPolymerase(Stratagene)、HerculaseEnhancedDNAPolymerase(Stratagene)、Herculase⑧IIFusionDNAPolymerase(Stratagene)、KapaLongRangeDNAPolymerase(KapaBiosystems)、KapaHiFiDNAPolymerase(KapaBiosystems)、Kapa2GRobustDNAPolymerase(KapaBiosystems)、Kapa2GRobustHotStartDNAPolymerase(KapaBiosystems)、Kapa2GFastDNAPolymerase(KapaBiosystems)、Kapa2GFastHotStartDNAPolymerase(KapaBiosystems)、LATAQDNAPolymerase(Takara)、OptimaseDNAPolymerase(Transgenomic,Inc.)、Exo-PfuDNAPolymerase(Stratagene)、HotMasterTaqDNAPolymerase(5PRIMEGmbH)、HotTaqDNAPolymerase(AbnovaCorporation)、AmpliTaqGold⑧DNAPolymerase(AppliedBiosystems)、BstDNAPolymeraseLgFrag(NewEnglandBiolabs)、MasterAmpTflDNAPolymerase(EPICENTREBiotechnologies)ΛRedHotDNAPolymerase(ABgene)、ThermoprimePlusDNAPolymerase(ABgene)、Taq-redDNAPolymerase(AppliChemGmbH)、BIO-X-ACTtmLongDNAPolymerase(Bioline)、BIO-X-ACTShortDNAPolymerase(Bioline)、BiolineHybriPolDNAPolymerase(Bioline)、BioThermTaqDNAPolymerase(eEnzymeLLC)、EU-TaqDNAPolymerase(eEnzymeLLC)、SynergyTaqDNAPolymerase(eEnzymeLLC)ΛGeneChoiceRedPOLDNAPolymerase(GeneChoice,Inc.)^AccuPrimeGC-RichDNAPolymerase(Invitrogen)ΛPyroPhage3173DNAPolymerase、ExoMinus(Lucigen)、9DegreesNorth(Modified)DNAPolymerase(NewEnglandBiolabs)、TherminatorDNAPolymerase(NewEnglandBiolabs)、PwoDNAPolymerase(RocheAppliedScience)、Paq5000DNAPolymerase(Stratagene)、YieldAceDNAPolymerase(Stratagene)、e2TAKDNAPolymerase(Takara)或來自下述的天然存在的DNA聚合酶火球菌(P.kodakaraensis)、強烈火球菌(P.furiosus)、熱球菌(T.gorgonarius、Τ.zilligii、Τ.Iitoralis「VentTM」)、P.GB-D"DeepVent」、熱球菌(Τ.9Ν-7、Τ.aggregans、Τ.barossii、Τ.fumicolans、Τ.celer)、火球菌(Pyrococcussp.ST700株)、太平洋熱球菌(T.pacificus)、海底火球菌(P.abysii)、深棲熱球菌(T.profundus)、Τ.siculi、熱水熱球菌(Τ.hydrothermalis)、Thermococcussp.GE8株、Τ·thioreducens)、火球菌(P.horikoshii)或熱球菌(T.onnurineusNAl、Thermococcussp.9°N_7、Thermococcussp.GI-JΛThermococcussp.MAR—13、Thermococcussp.GB-CΛThermococcussp.GI-H)、水生棲熱菌(Thermusaquaticus)、嗜熱棲熱菌(Thermusthermophiles)、棲熱菌(Thermuscaldophilus)、絲狀棲熱菌(Thermusfiliformis)、黃棲熱菌(Thermusflavus)、海棲熱袍菌(Thermotogamaritime)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)或熱堅芽抱桿菌(Bacilluscaldotenax)。通過發明獲得的數據，例如測試結果，可以用於診斷是否存在某狀況或疾病的過程。利用本發明獲得的數據可以用於確定某個體的基因型。通過發明獲得的數據可以用於檢測與脆性X染色體症候群、脆性X染色體相關震顫共濟失調、和脆性X染色體相關原發性卵巢功能不全關聯的基因型。與這些狀況相關的基因座是本領域已知的，包括但不限於FMR1、FMR2、FMRl的5'UTR、FMR2的5'UTR、FMRl的5'UTR內的CGG重複，以及FMR2的5』UTR內的CGG重複。在其他實施方案中，通過發明獲得的數據可以用於檢測與富含GC三核苷酸重複紊亂和/或中斷元件關聯的基因型，比如脆性X染色體症候群、脆性X染色體相關震顫共濟失調症候群、脆性X染色體相關原發性卵巢功能不全、強直性肌營養不良、亨廷16頓舞蹈症、脊延髓肌萎縮、齒狀核紅核蒼白球丘腦下核萎縮和/或脊髓小腦性共濟失調。中斷元件，正如其名字暗示的，打斷一系列的重複序列。CGG富含區可能包含或不包含中斷元件。因此，CGG富含區可以包含一系列三核苷酸重複，在這些系列中有至少一種中斷元件。與這些狀況相關的基因座是本領域已知的，包括但不限於FMR1、FMR2、DMPK、ZNF9、HTT、AR、ATN1、ATXN1-3、ATXN7、ATXN10、CACNA1A、SCA8、PPP2R2B禾口TBP。參見例如Nat.Genet.13(1)105-8(1996)；Nat.Genet.13(1)109-13(1996)。方法可以包括確定CGG富含區任何一端，例如任何一端的60、90、120、150、180、210、M0、270或300bp內是否存在中斷元件，所述CGG富含區是樣品中含有的至少一種等位基因所包含的。確定樣品中含有的至少一種等位基因所包含的CGG富含區任何一端給定距離內是否存在中斷元件，應當理解為包括確定整個CGG富含區內是否存在中斷元件，從而整個CGG富含區都處於任何一端給定距離內。一些實施方案中，方法包括不依靠輔助或反射方法對至少一種CGG富含區進行分析，所述輔助或反射方法包括諸如Southern印跡、限制性消化或測序(例如Sanger測序、Maxam-Gilbert測序、連接法測序(ligationsequencing)以及包括可逆中止鹼基測序和焦磷酸測序的單分子邊合成邊測序(又稱為第二代測序技術))的程序。但方法可以包括如本文所述確定至少一種CGG富含區的相關信息，比如長度和/或中斷元件組成和位置。一些實施方案中，方法包括通過高解析度技術，由文中所述擴增反應產生的產物大小和豐度來獲取確定至少一種CGG富含區相關信息，比如長度和/或中斷元件組成或位置的充分必要fn息。關於至少一種CGG富含區中是否存在中斷序列或中斷序列處於至少一種CGG富含區的何處的信息可能包括的信息有比如樣品中的至少一種模板所包含的至少一種CGG富含區是否含有中斷序列；在有一個以上不同模板的情況中，樣品中的每個模板是否含有中斷序列；至少一種CGG富含區中存在的中斷序列數目的下界估計；和/或至少一種中斷元件的至少一種位置(包括如下文討論的，確定到給定準確水平)。鑑於本領域普通技術人員的知識，以上列出的具體類型的信息不包括其他類型可以通過本文明確或暗含地公開的發明方法確定的信息。一些實施方案中，方法包括進行至少兩個分析，其中每個分析包括(a)提供引物，其中所述至少兩個分析的引物不是相同的；(b)進行擴增反應來產生一組產物；(c)將產物分開，展現所述至少兩個分析產生的產物的大小和豐度；以及(d)得出關於所述至少一種CGG富含區中是否存在中斷序列，或者中斷序列在所述至少一種CGG富含區中處於何處的信息。一些實施方案中，得出的信息包括那些如果只進行一個分析則無法得到的信息，比如在樣品包含至少兩個不同的含有CGG富含區的模板和CGG富含區中的至少一種存在至少一種中斷元件的情況中，至少兩個CGG富含區中的哪一個包含至少一種中斷元件。例如，圖10中顯示了根據一個分析的結果，這類信息可能不明確的情形。文中討論了其他可能的不明確之處，以及如何解決的例子。在一些實施方案中，至少兩個分析包括錨定分析和非錨定分析。在一些實施方案中，所述至少兩個分析使用了包含CGG、CCG、GCG、CGC、GCC或GGC重複的反方向引物。就是說，第一分析可以包括提供引物，所述引物含有一個包含重複的朝著上遊方向的引物；第二分析可以包括提供引物，所述引物含有一個包含重複的朝著下遊方向的引物；或者相反。在一些實施方案中，方法包括至少三個分析，包括至少兩個非錨定分析和至少一種錨定分析，或者反過來。所述至少兩個非錨定(或錨定)分析可以如前一段落討論的，使用包含CGG、CCG、GCG、CGC、GCC或GGC重複的反方向引物。應當注意一些情況中，「一組產物」可能不包含複數個大的或可檢測到的產物，比如在用包含最多一個CGG富含區的樣品進行的錨定分析中，而其中CGG富含區含有最多一個中斷序列。如果一個分析所用的引物中至少有一個與其他分析所用的引物不同，則方法之間的引物被認為「不相同」；換句話說，一些引物可以是一樣的。方法可以包括通過進行如上所述的至少兩個分析，確定雜合、異倍體或鑲嵌基因型的至少一種細節，其中擴增反應使用不相同的引物組，所述至少一種細節是通過比較至少兩個擴增反應的結果而確定的。樣品的基因型是指樣品的來源的基因型；對於混合樣品的情況，這個名詞涵蓋了多個個體基因型。具有雜合基因型的樣品包含來自這樣的細胞的遺傳物質，所述細胞含有包含CGG富含區的基因座的兩個等位基因。具有鑲嵌基因型的樣品包含含有CGG富含區的基因座的至少兩個等位基因，並且樣品所來源的細胞中含有CGG富含區的基因座的等位基因中至少一種是基因不同的。具有鑲嵌基因型的樣品所包含的至少兩個等位基因可以根據它們的豐度劃分為主要或次要等位基因。豐度最大的等位基因被認為是主要等位基因，豐度最小的等位基因被認為是次要等位基因；當存在兩個以上等位基因時，根據它們的相對豐度(表達為百分比)在算術上是更接近具有最大豐度還是最小豐度的等位基因來分類為主要或次要。例如，在包含相對豐度分別為60%、31%和9%的第一、第二和第三等位基因的樣品中，第二等位基因被認為是次要等位基因。主要和次要等位基因的存在也可能是異倍體造成的，例如，如果基因組包含三個拷貝的CGG富含區，其中兩個是相同的(主要等位基因)，一個不同(次要等位基因)。異倍體在下文有詳細討論。一些實施方案中，方法包括檢測樣品是否包含相對豐度至少δ^Α1^、？1^』1^、9%、10%、15%、20%或25%的次要等位基因。應當理解，次要等位基因的CGG富含區與主要等位基因的CGG富含區不同。例如，次要等位基因含有的CGG富含區可能有不同的重複數目和/或不同的AGG元件分布。一些實施方案中，方法包括檢測樣品是否包含含有中斷元件的次要等位基因。一些實施方案中，方法包括以下文討論的準確程度檢測中斷元件在次要等位基因中的位置。具有異倍體基因型的樣品包含不是整倍數的含CGG富含區的基因座的多個等位基因。對於配子和已經發生減數分裂的種系細胞中的常染色體基因座，整倍數是1；除了雄性配子和已經發生減數分裂的雄性種系細胞中的性染色體基因座，對個體細胞，整倍數可能是0或1，對於群體平均為大約0.5(根據存在的攜帶X和Y染色體的細胞的數量而有差別)。對於雄性體細胞和還未發生減數分裂的雄性種系細胞中的X染色體基因座，整倍數也是1。對於體細胞和還未發生減數分裂的種系細胞中常染色體上的基因座，對於雌性體細胞和還未發生減數分裂的雌性種系細胞中的X染色體基因座，整倍數是2。樣品有可能具有雜合、異倍體和鑲嵌這些情況中的一種以上。鑲嵌基因型可能發生在例如來自一些個體的樣品中，所述個體包含來源於不同祖細胞(接合子、囊胚細胞、幹細胞等)的細胞，或者包含由於體細胞突變(包括重複數目的改變，比如重複延展)而基因不同的細胞。異倍體存在於一些症候群中，例如唐氏、特納氏和克氏(Klinefelter’s)，也可能經由染色體不分離事件體細胞發生；這類事件會產生能夠提供異倍體樣品的個體，可能也是或者不是雜合體。可以對樣品進行分析來確定有關基因型的至少一種細節，所述樣品包含含有CGG富含區的基因座的至少兩個不同等位基因(由於該基因座是雜合、異倍體或鑲嵌中的至少一種情況)。所述至少一種細節可以包括所述至少兩個不同等位基因中的一個、兩個、都沒有或者兩個以上(如果可行)是否包含至少一種中斷元件。所述至少一種細節可以包括所述至少兩個不同等位基因中的至少一種所包含的中斷元件的最小數目。例如，可以確定出一個等位基因包含至少一種中斷元件。所述至少一種細節可以進一步包括另一個等位基因包含例如至少兩個中斷元件。所述至少一種細節可以包括所述至少一種中斷元件在一個等位基因上的位置。一些實施方案中，所述至少一種細節包括由單個分析的結果不能明白地確定的關於雜合、異倍體和/或鑲嵌樣品的基因型的至少一種細節。以下列舉了根據單個分析的結果可能是含糊的細節1.單個分析的結果可能表明存在至少一種中斷元件，但該結果對於哪個等位基因包含所述至少一種中斷元件可能不清楚。2.單個分析的結果可能表明存在至少兩個中斷元件，但該結果對於這些中斷元件包含在相同等位基因或不同等位基因中可能不清楚。3.單個分析的結果可能表明存在至少三個中斷元件，但該結果對於所述至少三個中斷元件在至少兩個不同等位基因中是如何分布的可能不清楚。4.單個分析的結果可能對於第一等位基因的某位點是否存在中斷元件不明確，比如被第二等位基因對應的大的峰信號遮蓋了產物大小和豐度的表現。在一些實施方案中，本發明的方法導致合成的產物不含或者沒有較大部分的非特異性擴增物質。在一些實施方案中，當模板是以下實施例1-3中描述的樣品之一時，方法導致合成的產物不含或者沒有較大部分的非特異性擴增物質。在一些實施方案中，本發明的方法導致合成的產物不含或者沒有較大部分的超過預期大小的非特異性擴增物質，所述預期大小是通過將CGG富含區長度加上根據第二引物退火位置進行的調整後計算得到的。一些實施方案中，通過對產物大小和含量表現的信號進行光密度測定或整合，確定產物含有低於20%、15%UO^jW、2%或的物質大於前一句中描述的預期大小。在一些實施方案中，所述表現是電泳圖。正如本文定義的，當產物如上確定含有低於大約10%的物質超過預期大小時，產物「基本不含」非特異性擴增物質。發明涉及包括對模板進行分析的方法，所述模板含有富含GC的重複序列，比如例如CGG或CCG三核苷酸。所述分析可以包括實施擴增反應和以高解析度將產物分開。高解析度可能是足夠將包含例如20與21、或20與22、或20與23、或20與24、或20與25個三核苷酸重複的產物區分開；或者在一些實施方案中，是足夠將長度相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸或鹼基對的產物區分開的解析度。可以應用在本發明的方法中實現這一分離步驟的技術的例子包括，但不限於毛細管電泳和聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE;—些PAGE實施方案在本領域經常被稱為「跑測序膠」)，或者「晶片實驗室」類型的微流體/電泳系統。用於進行毛細電泳的儀器可以從例如AppliedBiosystems(ABI),Beckman,Agilent和Qiagen等供貨商購買，合適的儀器包括但不限於ABI310、3100、3130/3130xl或3730/3730x1;BeckmanP/ACEMDQ；Agilent2100Bioanalyzer和QiagenQIAxcel。通過電泳分離產物的過程可能包括使用液體聚合物，例如均由AppliedBiosystems銷售的P0P-7、P0P-6、P0P_5或P0P-4。在一些實施方案中，產物的分離使用了可以根據大小精確地將含有大約250、300、350、400或更多個三核苷酸重複的產物分開的聚合物，比如例如P0P-4。以高解析度分離產物組可以利用機器實現，例如從包含電壓源(例如DC電泳)的機器、包含壓力源(例如泵)的機器和包含柱子或毛細管的機器中選擇的適合進行化學分離的機器。當然機器可以包含上述組成部分中的一種以上。以高解析度分離產物可以產生產物大小和豐度的表現形式。該表現形式可以是本領域技術人員能夠肉眼或者藉助儀器(比如例如帶有合適軟體的計算機或光密度計)解釋的圖像或圖形，從而理解反應產物的大小和含量。在一些實施方案中，表現形式是電泳圖、照片、圖形、曲線或放射自顯影圖像。這些表現形式可能來源於或者記錄自產物或者結合在產物上的染料分子所發射的光子或β顆粒；可以通過例如攝影術或電子學方法對它們進行檢測，並處理或顯影生成所述表現形式。本發明涉及的方法包括由產物大小和豐度表現形式獲取關於CGG重複數目(即模板中包含多少CGG重複或者總的三核苷酸重複)的信息。這類信息獲取可能包括計數表現形式中可觀察到的種類的數目從而確定重複數量(從最小產物包含的重複數目開始，可能是例如4或幻，或者根據表現形式中觀察到的最大產物的位置估計重複數目。在一些實施方案中，CGG富含區包含於FMRl的5，UTR或FMR2的5，UTR。在一些實施方案中，方法包括檢測CGG富含區中是否存在中斷元件。在一些實施方案中，所述中斷元件是AGG三核苷酸。檢測是否存在這些中斷元件可以通過例如確定模板中第一引物結合顯著減少的位置；或者通過確定與相鄰長度相比，產物的量明顯減少的一組長度來實現。例如，如果在含有至少總共14個三核苷酸重複的區域中第10個三核苷酸是AGG，並且使用包含4個CGG重複的引物進行了擴增反應，可以預期相對含有9和14個重複的相鄰產物，含有10、11、12和13個CGG重複的產物存在的量明顯減少。含量的減少程度可能在25%到95%或更高的範圍內，例如減少25%,30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%。減少程度通常取決於樣品的接合性；例如對於有些樣品，可能相應產物的量的減少顯示在25%到75%的範圍內，所述樣品中CGG富含區就包含該CGG富含區的等位基因而言，或者就特定AGG重複而言是來自雜合子。對於另一些樣品，可能相應產物的量的減少顯示在50%到95%或更高的範圍內，所述樣品中CGG富含區就包含該CGG富含區的等位基因而言，或者就特定AGG重複而言是來自半合子或純I=I丁ο在一些實施方案中，方法不需要使用外部標準或校準物，比如例如參照標準或分子量大小標準。之所以可以實現這一獨立性是因為在一些實施方案中，可以利用長度相差一個三核苷酸重複的產物所對應的峰來數出最大產物的大小，其中計數可以表明模板中的重複的數量(根據引物所包含的重複數量進行必要調節)。一些實施方案中，產物大小和含量表現形式中的峰之間的間距可以用於通過例如外推來估計最大產物的大小；當對應較大重複數量的峰的解析度不足以數出所有峰，包括最大產物的峰時，這一點很有用。在一些實施方案中，方法可以將CGG富含區中的重複數量明確到100、50、20、10、5、4、3、2、1或0個重複以內。對一個量確定到了0個單位以內意味著確定了它的準確數值。在一些實施方案中，方法包括將CGG富含區中的重複數量明確到100、50、20、10、5、4、3、2、1或0個重複以內。例如，方法可以包括確定出CGG富含區中的重複數量含有少於70個CGG重複，明確到5、4、3、2、1或0個重複以內；確定出CGG富含區中的重複數量含有70-120個CGG重複，明確到10、5、4或3個重複以內；或者確定出CGG富含區中的重複數量含有超過120個CGG重複，最多大約200個CGG重複，明確到20、10或5個重複以內。對於更大的CGG重複區很難準確確定因為缺少可靠的已知標準。在一些實施方案中，方法可以確定出中斷元件的位置在60、45、30、15、12、9、6、5、4、3、2、1或0個核苷酸以內。可以將中斷元件的位置確定為例如相對CGG富含區任何一端的距離。一些實施方案中，引物中的至少一種包含放射性或電磁性可檢測的部分。放射性可檢測的部分包括發射可檢測顆粒(比如β或Y顆粒)的放射性同位素，例如14C、3H、32P、3節、3、和1251。電磁學可檢測的部分包括與電磁輻射(包括吸收、發射或這兩者)以可檢測的方式發生相互作用的化學實體，比如發色團和螢光團，例如螢光素、FAM、花青染料、羅丹明染料等。本發明的其他方面可以部分地由以下描述中給出，和部分地由說明書顯而易見，或者經過實踐本發明而得知。藉助尤其是所附權利要求中指出的元素和各種組合，可以認識並獲得本發明的各方面。附圖簡述併入本說明書並構成說明書一部分的附解了發明的多個實施方案，與描述部分一起解釋了發明的原理。圖1概括了包含AGG三核苷酸的CGG富含模板的擴增。引物序列是權利要求1.分析樣品中至少一種模板所包含的至少一種CGG富含區的方法，所述方法包括(a)提供至少兩種不同引物，包括含有CGG、CCG、GCG、CGC、GCC或GGC重複的第一引物；和與CGG富含區之外的位點退火的第二引物；(b)用所述至少兩種不同引物和包含至少一種CGG富含區的至少一種模板進行PCR，其中所述PCR產生一組產物；(c)利用解析度高的技術將產物分開，產生產物大小和豐度的表現形式；以及(d)得出關於所述至少一種CGG富含區中是否存在中斷序列，或者中斷序列在所述至少一種CGG富含區中處於何處的信息。2.分析樣品中至少一種模板所包含的至少一種CGG富含區的方法，所述方法包括(a)提供至少三種不同引物，包括含有CGG、CCG、GCG、CGC、GCC或GGC重複和5』側翼的第一引物；與CGG富含區之外的位點退火的第二引物；和具有第一引物的5』側翼所包含的序列的第三引物，其中第一引物提供的濃度低於第三引物；(b)用所述至少三種不同引物和所述至少一種模板進行PCR，其中所述PCR產生一組產物；(c)利用解析度高的技術將產物分開，產生產物大小和豐度的表現形式；以及(d)由上述表現形式得出關於所述至少一種CGG富含區中是否存在中斷序列，或者中斷序列在所述至少一種CGG富含區中處於何處的信息。3.權利要求1或2中任一項所述的方法，包括由所述表現形式得出關於中斷序列在CGG富含區中處於何處的信息。4.權利要求1或2中任一項所述的方法，其中所述中斷序列是AGG元件。5.權利要求1或2中任一項所述的方法，進一步包括由所述表現形式得出關於CGG重複數目的信息。6.權利要求5所述的方法，其中所述關於CGG重複數目的信息決定了CGG富含重複區包含多於還是少於200個CGG重複。7.權利要求6所述的方法，其中所述關於CGG重複數目的信息決定了CGG富含區內存在的CGG重複數目。8.權利要求1或2中任一項所述的方法，附帶條件是由上述表現形式得出關於所述至少一種CGG富含區中是否存在中斷序列，或者中斷序列在所述至少一種CGG富含區中處於何處的信息時，沒有使用外部標準或校準物。9.權利要求1或2中任一項所述的方法，其中所述CGG富含區包含在FMRl的5』UTR中。10.權利要求1或2中任一項所述的方法，其中所述CGG富含區包含在FMR2的5』UTR中。11.權利要求1或2中任一項所述的方法，其中所述高解析度技術可以將長度相差3個核苷酸或鹼基對的產物區分開。12.權利要求1或2中任一項所述的方法，其中所述高解析度技術是毛細管電泳。13.權利要求1或2中任一項所述的方法，其中所述表現形式是電泳圖。14.權利要求1或2中任一項所述的方法，其中從所述表現形式得出關於CGG富含區中是否存在中斷序列、或者中斷序列在所述CGG富含區中處於何處的信息，包括確定第一引物結合顯著減少的位置。15.權利要求1或2中任一項所述的方法，其中從所述表現形式得出關於CGG富含區中是否存在中斷序列，或者中斷序列在所述CGG富含區中處於何處的信息包括確定與相鄰長度的產物量相比，產物的量明顯減少的一個或多個長度。16.權利要求1或2中任一項所述的方法，其中從所述表現形式得出關於CGG富含區中是否存在中斷序列，或者中斷序列在所述CGG富含區中處於何處的信息包括確定與相鄰長度的產物量相比，產物的量減少至少50%的一個或多個長度。17.權利要求1或2中任一項所述的方法，其中從所述表現形式得出關於CGG富含區中是否存在中斷序列，或者中斷序列在所述CGG富含區中處於何處的信息包括確定與相鄰長度的產物量相比，產物的量減少至少90%的一個或多個長度。18.權利要求1或2中任一項所述的方法，其中從所述表現形式得出關於CGG富含區中是否存在中斷序列，或者中斷序列在所述CGG富含區中處於何處的信息包括確定與相鄰長度的產物量相比，產物的量減少至少25%的一個或多個長度，其中所述CGG富含區就包含該CGG富含區的等位基因而言，是來自雜合子。19.權利要求1或2中任一項所述的方法，其中所述第一引物包含4或5個CGG或CCG重複。20.權利要求1或2中任一項所述的方法，其中所述第二引物選自SEQIDNOs1_38。21.權利要求1或2中任一項所述的方法，其中所述至少一種引物包含放射性或電磁性可檢測的部分。22.權利要求1或2中任一項所述的方法，其中所述至少一種引物包含螢光團。23.權利要求1或2中任一項所述的方法，其中所述方法是錨定的分析法。24.權利要求23所述的方法，其中第一引物在CGG、CCG、GCG、CGC、GCC或GGC重複之中或3，端包含選自A、T、AG、CT、AGG和CCT的亞序列。25.權利要求M所述的方法，其中第一引物在CGG、CCG、GCG、CGC、GCC或GGC重複的3』端包含A。26.權利要求M所述的方法，其中第一引物在CGG、CCG、GCG、CGC、GCC或GGC重複的3』端包含CCT。27.權利要求23所述的方法，進一步包括檢測所述至少一種CGG富含區所包含的至少一種中斷元件。28.權利要求27所述的方法，進一步包括確定樣品是否包含中斷元件位置不同的主要和次要等位基因。29.權利要求1或2中任一項所述的方法，其中所述方法是非錨定的分析法。30.權利要求2所述的方法，其中提供的所述第一引物和第三引物的濃度使得第三引物的摩爾濃度比第一引物多至少100倍。31.權利要求2所述的方法，其中提供的所述第一引物和第三引物的濃度使得第三引物的摩爾濃度比第一引物多至少500倍。32.權利要求2所述的方法，其中提供的所述第一引物和第三引物的濃度使得第三引物的摩爾濃度比第一引物多至少900倍。33.權利要求2所述的方法，其中所述第二引物與CGG富含區下遊退火，所述第三引物與CGG富含區上遊退火。34.權利要求2所述的方法，其中所述第二引物與CGG富含區上遊退火，所述第三引物與CGG富含區下遊退火。35.權利要求1或2中任一項所述的方法，進一步包括提供至少另外的第一引物和任選另外的第二引物，所述另外的第一引物包含CGG、CCG、GCG、CGC、GCC或GGC重複；用至少另外的第一引物、選自步驟(a)中第二引物和另外的第二引物的引物，以及至少一種模板進行第二PCR，其中第二PCR產生第二組產物；以高解析度技術將第二組PCR產物分開，產生第二個產物大小和豐度的表現形式；其中步驟(a)的第一引物對不含有中斷元件的CGG富含區內的位點有優先結合活性，而另外的第一引物對含有中斷元件的CGG富含區內的位點有優先結合活性。36.權利要求35所述的方法，其中所述另外的第一引物在CGG、CCG、GCG、CGC、GCC或GGC重複的3』端包含A。37.權利要求35所述的方法，其中所述另外的第一引物在CGG、CCG、GCG、CGC、GCC或GGC重複的3』端包含T。38.權利要求35所述的方法，進一步包括確定至少一種CGG富含區的至少一種長度。39.權利要求38所述的方法，其中所述樣品包含來自對於CGG區倍性至少為2的細胞的遺傳物質，並且該方法包括確定至少兩個CGG富含區的至少兩個長度。40.權利要求38所述的方法，其中所述樣品包含含有CGG富含區的等位基因，所述CGG富含區包含至少100個CGG重複。41.權利要求35所述的方法，進一步包括確定樣品是否包含中斷元件位置不同的主要和次要等位基因。42.權利要求35所述的方法，其中所述另外的第一引物相對第一引物取向相反。43.權利要求42所述的方法，其中第一引物結合CGG富含區時其3』端朝向下遊，另外的第一引物結合CGG富含區時其3』端朝向上遊。44.權利要求43所述的方法，其中所述方法包括檢測至少一種中斷元件並確定包含所述至少一種中斷元件的CGG富含區的大小。45.權利要求44所述的方法，其中樣品包含至少第一和第二等位基因，並且第一和第二等位基因包含長度不同的CGG富含區。46.權利要求35所述的方法，進一步包括提供至少另外的第三引物和任選另外的第四引物，所述另外的第三引物包含CGG、CCG、GCG、CGC、GCC或GGC重複；用至少另外的第三引物、選自另外的第二引物和另外的第四引物的引物，以及至少一種模板進行第三PCR，其中第三PCR產生第三組產物；以高解析度技術將第三組PCR產物分開，產生第三個產物大小和豐度的表現形式；其中另外的第三引物相對步驟(a)的第一引物取向相反，並且與另外的第一引物不同。47.權利要求46所述的方法，進一步包括確定樣品所包含的至少一種等位基因任意一端150bp內是否存在中斷元件。48.權利要求47所述的方法，進一步包括確定至少一種等位基因所包含的至少一種中斷元件的至少一種位點。49.權利要求1或2中任一項所述的方法，進一步包括提供至少另外的第一引物和另外的第二引物，所述另外的第一引物包含CGG、CCG、GCG、CGC、GCC或GGC重複；用至少另外的第一引物和另外的第二引物，以及至少一種模板進行第二PCR，其中第二PCR產生第二組產物；以高解析度技術將第二組PCR產物分開，產生第二個產物大小和豐度的表現形式；其中另外的第一引物與步驟(a)的第一引物取向相反。50.權利要求49所述的方法，其中第一引物和另外的第一引物中的至少一種對不含中斷元件的CGG富含區中的位點有優先結合活性。51.權利要求50所述的方法，其中第一引物對不含中斷元件的CGG富含區中的位點有優先結合活性，而另外的第一引物對包含中斷元件的CGG富含區中的位點有優先結合活性。52.權利要求51所述的方法，其中樣品包含含有不同長度的CGG富含區的至少兩個等位基因，該方法進一步包括確定所述至少兩個等位基因的長度。53.權利要求52所述的方法，進一步包括檢測至少一種中斷元件和確定包含所述至少一種中斷元件的等位基因的長度。54.分析樣品中至少一種模板所包含的至少一種CGG富含區的方法，所述方法包括(a)提供至少兩種不同引物，其中第一引物含有CGG、CCG、GCG、CGC、GCC或GGC重複；和第二引物與CGG富含區之外的位點退火；(b)用所述至少兩種不同引物和包含CGG富含區的模板進行PCR，其中所述PCR產生一組產物；(c)利用解析度高的技術將產物分開，產生產物大小和豐度的表現形式，其中長度相差3個核苷酸的產物能夠被分開；以及(d)由所述表現形式得出關於CGG重複數目的信息。55.分析樣品中至少一種模板所包含的至少一種CGG富含區的方法，所述方法包括(a)提供至少三種不同引物，其中第一引物包含CGG、CCG、GCG、CGC、GCC或GGC重複和5』側翼；第二引物與CGG富含區之外的位點退火；第三引物具有與第一引物的5』側翼相同的序列，並且第一引物提供的濃度低於第三引物；(b)用所述至少三種不同引物和包含CGG富含區的模板進行PCR，其中所述PCR產生一組產物；(c)利用解析度高的技術將產物分開，產生產物大小和豐度的表現形式，其中長度相差3個核苷酸的產物能夠被分開；以及(d)由上述表現形式得出關於CGG重複數目的信息。56.權利要求M或55中任一項所述的方法，其中所述關於CGG重複數目的信息確定CGG富含重複區包含多於還是少於200個CGG重複。57.權利要求M或55中任一項所述的方法，其中所述信息確定CGG富含區內存在的CGG重複數目。58.權利要求M或55中任一項所述的方法，附帶條件是由上述表現形式得出關於CGG重複數目的信息時，沒有使用外部標準或校準物。59.權利要求M或55中任一項所述的方法，其中所述CGG富含區包含在FMRl的5』UTR中。60.權利要求M或55中任一項所述的方法，其中所述CGG富含區包含在FMR2的5』UTR中。61.權利要求討或55中任一項所述的方法，其中所述高解析度技術可以將長度相差3個核苷酸或鹼基對的產物區分開。62.權利要求M或55中任一項所述的方法，其中所述高解析度技術是毛細管電泳。63.權利要求M或55中任一項所述的方法，其中所述表現形式是電泳圖。64.權利要求M或55中任一項所述的方法，其中所述第一引物包含4或5個CGG或CCG重複ο65.權利要求討或55中任一項所述的方法，其中所述第二引物選自SEQIDNOs1_38。66.權利要求M或55中任一項所述的方法，其中至少一種引物含有螢光團。67.權利要求55所述的方法，其中提供的所述第一引物和第三引物的濃度是第三引物的摩爾濃度比第一引物多至少100倍。68.權利要求55所述的方法，其中提供的所述第一引物和第三引物的濃度是第三引物的摩爾濃度比第一引物多至少500倍。69.權利要求55所述的方法，其中提供的所述第一引物和第三引物的濃度是第三引物的摩爾濃度比第一引物多至少900倍。70.權利要求55所述的方法，其中所述第二引物與CGG富含區下遊退火，所述第三引物與CGG富含區上遊退火。71.權利要求55所述的方法，其中所述第二引物與CGG富含區上遊退火，所述第三引物與CGG富含區下遊退火。72.寡核苷酸，包含選自SEQIDNO44和SEQIDNO45的序列。全文摘要本公開涉及通過利用一組至少其中之一包含CGG重複區的一部分的引物擴增一組產物並分離所述產物產生產物大小和豐度的表現形式，從而確定三核苷酸(例如CGG)重複區內是否存在AGG或中斷元件及其位置的方法，和確定該區域內存在的重複數目的方法。文檔編號C12Q1/68GK102449171SQ201080032511公開日2012年5月9日申請日期2010年2月16日優先權日2009年3月24日發明者G.J.拉薩姆,S.薩,陳良進申請人:奧斯瑞根公司