慢性淋巴細胞性白血病(CLL)中受miR-29和miR-181調控的TCL1的表達的製作方法

2023-05-20 21:54:36

專利名稱：慢性淋巴細胞性白血病(CLL)中受miR-29和miR-181調控的TCL1的表達的製作方法
慢性淋巴細胞性白血病(CLL)中 受miR-29和miR-181調控的7TZ7的表達
相關申請的交叉參考
N/A
政府資助
本發明總體或部分由來自NIH授予/合同號P01 CA81534的基金 資助。政府具有本發明的某些權利。
背景技術：
慢性淋巴細胞性白血病(B-CLL)是世界上最常見的人白血病，在 美國每年佔有大約IO，OOO個新病例。1在成熟T細胞白血病中，發現 7TZ7(T-細胞白血病/淋巴瘤l)癌基因為14q31. 2上頻繁染色體重排的 靶。2之前已報導在B細胞中表達7TZ7的轉基因小鼠發生B-CLL。3本 發明者現在本文中認為7TZ7的失調在B-CLL的發病機理中可能是因果 事件，因為本發明者現也已顯示7TZ7是Akt癌蛋白(B細胞和T細胞 中抗細胞凋亡信號轉導中的至關重要的分子)的輔激活因子。4
最近的報導顯示，人CLL中高7TZ7 W《迷與未突變的Vh狀悉和 ZAP70陽性相關，表明7TZJ-驅動的CLL是B-CLL的侵襲性形式。5與 人B-CLL中的不良預後相關的最重要的遺傳因子之一是染色體llq缺 失。6
MicroRM是據認為參與時間和組織特異性基因調控的高保守非 編碼基因的大家族。7我們最近證明microRNA表達譜可用於區分正常 B細胞和惡性B-CLL細胞，並且microRNA特徵(s ignature)與慢性淋 巴細胞性白血病的預後和進展相關。s'9
目前未獲得普遍成功的治療或預防B-CLL的方法。通常基於多種預後參數(包括特定腫瘤標記的分析)來選擇療程。
儘管對B-CLL的治療進行了相當多的研究，但仍然難以對CLL進 行有效的診斷和治療，並且在患者中觀察到的死亡率表明需要對疾病 的診斷、治療和預防進行改進。
發明概述
本發明部分基於與正常對照細胞相比在乳腺癌細胞中差異表達 的miRNA的慢性淋巴細胞性白血病癌症特異性特徵的鑑定。
因此，本發明包括診斷受試者是否患有慢性淋巴細胞性白血病 (B-CLL)或處於發展其的風險中的方法，該方法包括測量來自所述受試 者的受試樣品中至少一種miR基因產物的水平，其中與對照樣品中相 應的miR基因產物水平相比，受試樣品中raiR基因產物水平的改變表 示受試者患有B-CLL或處於發展B-CLL的風險中。
在某些實施方案中，至少一種miR基因產物是miR-29或miR-181。 在某些實施方案中，至少一種miR基因產物是miR-29b和/或 miR-181b。
可使用多種本領域技術人員熟知的技術測量至少一種miR基因產 物的水平。在一個實施方案中， -使用Northern印跡分析測量至少一種 miR基因產物的水平。在另一個實施方案中，受試樣品中至少一種miR 基因產物的水平低於對照樣品中相應的miR基因產物的水平。此外， 在另一個實施方案中，受試樣品中至少一種miR基因產物的水平可高 於對照樣品中相應的oiiR基因產物的水平。
本發明還提供了診斷與受試者中一個或多個預後標記關聯的 B-CLL的方法，該方法包括測量來自所述受試者的B-CLL樣品中至少 一種miR基因產物的水平，其中與對照樣品中相應的miR基因產物水 平相比，受試樣品中至少一種miR基因產物水平的改變表示受試者患 有與一個或多個預後標記關聯的B-CLL。在一個實施方案中，這樣測 量至少一種miR基因產物的水平，即通過逆轉錄獲自受試者的受試樣 品的RM以提供一組靶寡脫氧核苷酸；將所述靶寡脫氧核苷酸與包含
7raiRNA-特異性探針寡核普酸的微陣列雜交以提供受試樣品的雜交鐠； 和，將受試樣品雜交譜與從對照樣品產生的雜交譜相比較來進行測量。 至少一種miRNA的信號的改變表示受試者患有B-CLL或處於發展 B-CLL的風險中。
本發明還包括治療受試者的CLL的方法，其中與從對照樣品產生 的信號相比，至少一種miRM的信號失調(例如，下調，上調)。
在某些實施方案中，微陣列包含針對選自miR-29或miR-181和 其組合的一種或多種miRNA的miRNA-特異性探針寡核苷酸。
本發明還包括診斷受試者是否患有與受試者中一種或多種不利 的預後標記關聯的B-CLL或處於發展其的風險中的方法，即通過逆轉 錄獲自受試者的受試樣品的RNA以提供一組耙寡脫氧核苷酸；將所述 靼寡脫氧核苷酸與包含miRM-特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交以 提供所述受試樣品的雜交i普；和，將受試樣品雜交謙與從對照樣品產 生的雜交鐠相比較來進行診斷。信號的改變表示受試者患有癌症或處 於發展癌症的風險中。
本發明還包括治療患有B-CLL的受試者的B-CLL的方法，其中， 與對照細胞相比，受試者的癌細胞中至少一種miR基因產物被下調或 上調。當至少一種miR基因產物在癌細胞中下調時，該方法包括對受 試者施用有效量的至少一種分離的miR基因產物，以便癌細胞在受試 者中的增殖被抑制。當至少一種miR基因產物在癌細胞中上調時，該 方法包括對受試者施用有效量的至少一種用於抑制至少一種miR基因 產物表達的化合物，以便癌細胞在受試者中的增殖被抑制。在某些實 施方案中，至少一種分離的miR基因產物選自raiR-29、 miR-181和其 組合。
在相關實施方案中，本發明提供了在受試者中治療B-CLL的方法， 該方法包括測定與對照細胞相比，B-CLL細胞中至少一種miR基因 產物的量；和通過對受試者施用有效量的至少一種分離的miR基因 產物(如果癌細胞中表達的miR基因產物的量低於對照細胞中表達的 miR基因產物的量)；或對受試者施用有效量的至少一種用於抑制至少一種miR基因產物的表達的化合物(如果癌細胞中表達的miR基因 產物的量高於對照細胞中表達的miR基因產物的量)來改變B-CLL細 胞中表達的miR基因產物的量，以便癌細胞在受試者中的增殖被抑制。 在某些實施方案中，至少一種分離的miR基因產物選自miR-29、 miR-181和其組合。
本發明還提供了用於治療B-CLL的藥物組合物，所述藥物組合物 包舍至少一種分離的miR基因產物和藥學上可接受的載體。在特定的 實施方案中，藥物組合物中至少一種分離的ffliR基因產物相應於在 B-CLL細胞中下調(與合適的對照細胞相比)的miR基因產物。在特 定的實施方案中，藥物組合物選自ffliR-29、 ffliR-181和其組合。在另 一個特定的實施方案中，藥物組合物包含至少一種miR表達抑制劑化 合物和藥學上可接受的載體。此外，在特定的實施方案中，藥物組合 物包含至少一種特異於在B-CLL細胞中上調(與合適的對照細胞相比) 的miR基因產物的miR表達抑制劑化合物。
在另 一個實施方案中，本發明提供了鑑定抗B-CLL試劑的方法， 該方法包括對細胞提供受試試劑和測量與B-CLL細胞中減少的表達水 平關聯的至少一種raiR基因產物的水平，其中與合適的對照細胞相比， 細胞中raiR基因產物水平的增加表示受試試劑為抗B-CLL試劑。在某 些實施方案中，miR基因產物選自miR-29、 miR-181和其組合。
本發明還提供了鑑定抗B-CLL試劑的方法，該方法包括給細胞提 供受試試劑和測量與B-CLL細胞中增加的表達水平關聯的至少一種 miR基因產物的水平，其中與合適的對照細胞相比，細胞中miR基因 產物水平的減少表示受試試劑為抗B-CLL試劑。在特定的實施方案中， miR基因產物選自miR-29、 miR-181和其組合。
當按照附圖
閱讀時，根據下列優選實施方案的詳細描述，本發明
附圖簡述
圖la-lf- 7TZ/的表達受歷/) i^和/z7J X^/調控:
9圖la- CLL中raj的表達。泳道l-8， CLL樣品。泳道2和6:
7T^7的表達被評定為低水平。所有其他泳道，rai的表達評定為高至
極高水平。
圖lb-三組B-CLL中7rU的表達。條圖表示指定的B-CLL樣品的 相對數目。
圖lc-邁/i -2外和肌？-7《/6和7T"的3' UTR的序列比對。
圖ld-螢光素酶測定中邁/; -2夕和/zl^-/( /靶向7TZ7的表達。對 於邁/i -i^螢光素酶測定，使用在下遊緊接螢光素酶的終止密碼子的 Xbal位點將包括與/zz/y -W互補的區域的7"a/ cDNA的片段(Tcll)插 入所示的包含構建體的pGL3栽體(Promega， Madison， WI)或單獨的 pGL3栽體。對於頂/y -7(57測定，將全長7TW cDNA以有義(TcllFL) 或反義(TcllFLAS)方向插入pGL3栽體。用所示的邁/i -2外或混雜 (scramble)陰性對照以及所示的包含一部分7"7 cDM (包括與 /z7/W-2夕同源的區域)的pGL3構建體(Tcl 1)或單獨的pGL3載體共轉染 293細胞。對於肌'A-J^/測定，7TZ7FL或7"aJFLAS與miR181 —起 共轉染。使用雙螢光素酶測定系統(Promega)測定螢火蟲和海腎 (reni 1 la)的螢光素酶活性，將螢火蟲的螢光素酶活性對海腎的螢光素 酶活性進行標準化(如廠商所建議)。以一式三份重複進行所有實驗。
圖le-miR-29b和邁L -M76對ra/蛋白質表達的影響。用單獨 的pcDNA3 7rZ//7(包含全長ra/cDNA的哺乳動物表達載體)(泳道1) 轉染293細胞或用pcDNA3ra7/7和/s/i -Z^廣泳道2 )前-miR( pre-miR) 陰性對照(泳道3 )或邁/y -/476 (泳道4)共轉染293細胞。使用7TZ/ 抗體通過Western印跡檢觀'J 7T" #4這。
圖lf-通過微陣列分析7TZ7蛋白質表達與範/i -7W6和/z /v -2外 的關係。值代表microRNA微陣列雜交信號。
圖2a和2b-代表性CLL樣品的實時RT-PCR分析。選擇三個 /zl^-/W和範/W-W都具有高表達的樣品(25、37和41)和四個/z /W-7《/ 和歷/i -i^都具有低表達的的樣品(55、 56、 72和81)。按照廠商的實 驗方案對miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-181d、miR-29a、miR-29b式三份重複進行所有實 驗。
圖3包括顯示區分CLL亞型的統計學上顯著的microRNA的表1。 圖4a-4d包括CLL樣品信息圖4a包括CLL樣品信息；圖4b包 括侵襲性CLL的信息；圖4c包括進展緩慢的CLL的信息；以及圖4d 包括具有11q缺失的侵襲性CLL。如之前所描述的(Rassenti LZ, Huynh L， Toy TL，等人N Engl. J. Med. 2004; 351 :893-901)，測量表達 的IgVH基因的突變狀態和就ZAP-70進行免疫表型分型。使用針對CLL panel的常規Vysis探針進行FISH。這些FISH測定可檢測下列染色體 異常(成組的探針):llq-和17p-(llq23上的ATM和17pl3. 1上的P53)、 13q-和三體性12 (13ql4上的D13S319, 13q34上的LAMP1和著絲粒 12上的D12Z3)。
圖5包括顯示三種類型的B-CLL中成對比較的microRNA表達的表2。
優選實施方案的詳述
本發明證明ra7癌基因的失調是該疾病的侵襲性形式的發病機 理中的因果事件，這通過使用動物模型來驗證。為了研究CLL中ra7
調控的機制，進行三種類型的CLL (進展緩慢的CLL、侵襲性CLL和顯 示llq缺失的侵襲性CLL)的外microRNA表達i瞽分析(out microRNA expression profiling)。鑑定了相應於各組CLL的不同的microRNA 特徵。進一步確定了 7*a7的表達受邁L -2夕和頂/7 4<$7( CLL中差異表 達的兩種microRNA )調控。/wV -i^和頂L -7W的表達水平通常與進行 檢測的CLL樣品中的7TZ7的表達呈負相關。本文中顯示，CLL中7"7 的表達至少部分地受範/i -i^和/ZL^-/》/調控，並且此類miRNA可以是 過表達ra7的CLL的治療劑的候選物。
如在本文中可互換使用的，"miR基因產物"、"microRNA"、 "miR，，或"miRNA，，是指來自miR基因的未加工或已加工的RNA轉錄 物。由於miR基因產物不翻譯成蛋白質，因此術語"miR基因產物"不包括蛋白質。未加工的raiR基因轉錄物也稱為"miR前體"，其通 常包括長度大約70-100個核苷酸的RNA轉錄物。可通過用RNA酶(例 如，Dicer、 Argonaut或RM酶III例如大腸桿菌(E. coli)RNA酶 IIi)將其消化成具有活性的19至25個核苷酸的RM分子來加工miR 前體。該具有活性的19-25個核苷酸的RNA分子也稱為"已加工的，， miR基因轉錄物或"成熟的"miRNA。
可通過天然加工途徑(例如使用完整的細胞或細胞裂解物)或通 過合成加工途徑(例如4吏用分離的加工酶，例如分離的Dicer、 Argonaut或RM酶III)從raiR前體獲得具有活性的19-25個核苷酸的 RNA分子。應理解，還可通過生物或化學合成(而不用從miR前體加 工)直接產生具有活性的19-25個核苷酸的RNA分子。
本發明包括診斷受試者是否患有CLL或處於發展CLL的風險中的 方法，該方法包括測量來自受試者的受試樣品中至少一種miR基因產 物的水平和將受試樣品中的miR基因產物水平與對照樣品中的相應 ffliR基因產物水平相比較。如本文所使用的，"受試者"可以是患有 或懷疑患有乳腺癌的任何哺乳動物。在特定的實施方案中，受試者是 患有或懷疑患有CLL的人。
可在從受試者獲得的生物樣品的細胞中測量至少一種miR基因產
物的水平。例如，可通過常規的活組織檢查技術從懷疑患有相關的CLL
的受試者中取出組織樣品。在另一個實施例中，可從受試者中取出血 液樣品，並且可通過標準技術分離白細胞以用於DNA提取。優選在開
始放射療法、化學療法或其他療法之前從受試者獲得血液或組織樣品。 可從受試者的未受影響的組織、從正常人個體或正常個體的群體或從 相應於受試者的樣品的大部分細胞的培養細胞獲得相應的對照組織或 血液樣品。然後將對照組織或血液樣品與來自受試者的樣品一起進行 處理，以便可將從來自受試者的樣品的細胞中給定的miR基因產生的 miR基因產物的水平與來自對照樣品的細胞的相應的miR基因產物的 水平進行比較。
與對照樣品中相應的miR基因產物的水平相比，從受試者獲得的
12樣品中miR基因產物水平的改變(即增加或減少)表示於受試者中存 在CLL。在一個實施方案中，受試樣品中至少一種miR基因產物水平 高於對照樣品中相應的miR基因產物的水平(即，ffliR基因產物的表達 "上調")。如本文中所使用的，當來自受試者的細胞或組織樣品中 miR基因產物的量大於對照細胞或組織樣品中相同基因產物的量時， miR基因產物的表達"上調，，。在另一個實施方案中，受試樣品中至 少一種miR基因產物水平低於對照樣品中相應miR基因產物的水平 (即，miR基因產物的表達"下調")。如本文中所使用的，當從來自 受試者的細胞或組織樣品中的該基因產生的miR基因產物的量低於從 對照細胞或組織樣品中的相同基因產生的量時，miR基因的表達"下 調，，。可根據一個或多個RM表達標準確定對照和正常樣品中相對miR 基因表達。所述標準可包括例如0 miR基因表達水平、標準細胞系中 的miR基因表達水平或之前獲得的正常人對照的群體的ffliR基因表達 的平均水平。
可使用適合用於檢測生物樣品中RM表達水平的任何技術測量樣 品中miR基因產物的水平。用於測定來自生物樣品的細胞中的RNA表 達水平的合適技術(例如，Northern印跡分析、RT-PCR、原位雜交) 對於本領域技術人員來說是熟知的。在特定的實施方案中，使用 Northern印跡分析檢測至少一種miR基因產物的水平。例如，可通過 在核酸提取緩衝液存在的情況下進行勻漿，接著進行離心來從細胞純 化總的細胞RNA。沉澱核酸，然後通過用DM酶處理和沉澱來除去DM。 然後按照標準技術在瓊脂糖凝膠上通過凝膠電泳分離RNA分子，並將 其轉移至硝酸纖維素濾器。然後通過加熱將RNA固定在濾器上。使用 適當標記的與所述RM互補的DM或RNA探針進行特定RNA的檢測和 定量。參見，例如，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook等人,eds.， 第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989， Chapter 7，其全部公開內容通過引用合併入本文。
用於給定的miR基因產物的Northern印跡雜交的合適的探針可 從給定的miR的核酸序列產生。用於製備標記的DNA和RM探針的方法以及用於其與耙核苷酸序列的雜交的條件描述於Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook等人，eds.， 第2版， Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989， Chapters 10和11， 其公開內容通過引用合併入本文。
例如，可用例如放射性核素例如3H、 32P、 33P、 "C或"S、重金屬 或能夠用作已標記的配體的特異性結合對成員的配體(例如，生物素、 抗生物素蛋白或抗體)、螢光分子、化學發光分子、酶等來標記核酸探 針。
可通過Rigby等人(1977), J. Mol. Biol. 113: 237-251的切 口平移法或Fienberg等人(1983)， Anal. Biochem. 132:6-13的隨 機引物法(其全部公開內容通過引用合併入本文)將探針標記至高比 放射性(specific activity),後者是選擇用於從單鏈DNA或從RNA 模板合成高比放射性的"P-標記的探針的方法。例如，按照切口平移 法通過用高放射性的核苷酸置換預先存在的核苷酸，可能製備具有大 大超過108 cpm/微克的比放射性的32P-標記的核酸探針。然後可通過 將雜交濾器暴露於照相膠片來進行雜交的放射自顯影檢測。暴露於雜 交濾器的照相膠片的光密度掃描提供了 miR基因轉錄物水平的精確測 量。使用另一個方法，可通過計算機化的成像系統例如可從Amersham Biosciences, Piscataway， NJ獲得的Molecular Dynamics 400-B 2D Phosphorimager定量miR基因轉錄物水平。
當不能進行DM或RNA探針的放射性核素標記時，可使用隨機引 物法將類似物例如dTTP類似物5-(N-(N-生物素基-s -氨基己醯 基)-3-氨基烯丙基)脫氧尿苷三磷酸摻入探針分子。可通過與結合生 物素的蛋白質例如偶聯至螢光染料或產生顏色反應的酶的抗生物素蛋 白、鏈黴抗生物素蛋白和抗體(例如抗生物素抗體)反應來檢測生物 素化的探針寡核苷酸。
除了 Northern和其他RNA雜交技術外，可使用原位雜交技術來 測定RNA轉錄物的水平。該技術需要比Nor thern印跡^t術更少的細胞， 其包括將整個細胞置於顯微鏡蓋玻片上和用含有放射性標記的或另外標記的核酸(例如，cDNA或RM)探針的溶液探測細胞的核酸含量。該 技術特別適合用於分析來自受試者的組織活組織檢查樣品。原位雜交 技術的實施在美國專利5,427,916 (其全部公開內容通過引用合併入 本文)中進行了更詳細的描述。用於給定的miR基因產物的原位雜交 的合適的探針可從核酸序列產生。
細胞中miR基因轉錄物的相對數目還可通過對miR基因轉錄物進 行逆轉錄，然後通過聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增經逆轉錄的轉錄物 來進行測定。可通過與內部標準例如來自存在於相同樣品中的"持家" 基因的mRNA的水平相比較來定量miR基因轉錄物的水平。用作內部標 準的合適的"持家"基因包括例如，肌球蛋白或甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (G3PDH)。用於定量RT-PCR和其變型的方法在本領域技術人員的能力 之內。
在一些情況下，可能期望同時測定樣品中多個不同miR基因產物 的表達水平。在其他情況下，可能期望測定與癌症關聯的所有已知miR 基因的轉錄物的表達水平。評估數百種miR基因的癌症特異性表達水 平非常費時並且需要大量的總RNA(對於每一個Northern印跡需要至 少20 )jg)和需要放射性同位素的放射自顯影技術。
為了克服這些限制，可構建以微晶片形式(即，微陣列)存在的寡 核普酸文庫，該文庫包含一組特異於一組miR基因的探針寡脫氧核普 酸。使用該微陣列，可通過逆轉錄RNA以產生一組靶寡脫氧核苷酸， 將它們與微陣列上的探針寡脫氧核苷酸雜交以產生雜交譜或表達譜來 測定生物樣品中多個mi croRNA的表達水平。然後將受試樣品的雜交譜 與對照樣品的雜交鐠比較，從而確定在CLL中具有改變的表達水平的 microRM。如本文中所使用的，"探針寡核苷酸"或"探針寡脫氧核 苷酸"是指能夠與靶寡核苷酸雜交的寡核苷酸。"靶寡核苷酸"或"靶 寡脫氧核苷酸"是指待檢測(例如，通過雜交)的分子。"miR-特異 性探針寡核苷酸"或"特異於miR的探針寡核苷酸"是指具有選擇用 於與特定miR基因產物或特定miR基因產物的逆轉錄物雜交的序列的 探針寡核苷酸。
15特定樣品的"表達譜"或"雜交i脊"本質上是樣品的狀態指紋； 雖然兩種狀態可能具有相似表達的任何特定基因，但同時評價大量基 因允許產生對於細胞的狀態是獨特的基因表達諳。即，正常細胞可與 CLL細胞相區別，並且在CLL細胞內，可確定不同的預後狀態(例如， 良好的或不良的長期存活希望)。通過比較不同狀態中CLL細胞的表達 譜，獲得關於在這些狀態的每一個狀態中為重要的(包括基因的上調 或下調)基因的信息。在CLL細胞或正常細胞中差異表達的序列的鑑 定以及導致不同預後結果的差異表達允許以許多方法使用該信息。例 如，可評估特定的治療方案(例如，確定化療藥物是否改善特定患者 的長期預後)。類似地，可通過將患者樣品與已知的表達i普比較來進 行或確認診斷。此外，這些基因表達鐠(或個體基因)允許篩選抑制 CLL表達鐠或將不良預後謙轉變成更好的預後傳的藥物候選物。
因此，本發明提供了診斷受試者是否患有CLL或處於發展CLL的 風險中的方法，該方法包括逆轉錄獲自受試者的受試樣品的RNA以提 供一組靶寡脫氧核苷酸，將靶寡脫氧核苷酸與包含miRNA-特異性探針 寡核苷酸的微陣列雜交以提供受試樣品的雜交鐠，和將受試樣品雜交 鐠與從對照樣品產生的雜交語比較，其中至少一種miRNA的信號的改 變表示受試者患有CLL或處於發展CLL的風險中。
在一個實施方案中，微陣列包含針對人miRNome的大部分的 miRNA-特異性探針寡核普酸。在特定的實施方案中，微陣列包含針對 選自miR-29或miR-181和其組合的一種或多種miRNA的miRNA特異性 探針寡核苷酸。
可從基因特異性寡核苷酸探針(所述探針從已知的m i RM序列產 生)製備微陣列。對於各miRNA,陣列可包含兩種不同的寡核苷酸探 針， 一種探針包含活性成熟序列，而另一種探針特異於miRNA的前體。 陣列還可包含可用作雜交嚴格條件的對照的對照，例如與人直系同源 物只相異於少數幾個鹼基的一個或多個小鼠序列。還可將來自兩個物 種的tRNA印製在微晶片上，從而為特異性雜交提供內部的、相對穩定 的陽性對照。還可將用於非特異性雜交的一個或多個合適的對照包含在微晶片上。為了該目的，基於與任何已知的miRNA不存在任何同源 性選擇序列。
可使用本領域內已知的技術製備微陣列。例如，在位置C6上對 合適長度例如40個核苷酸的探針寡核苷酸進行5，-胺修飾，並且使 用可商購獲得的微陣列系統例如GeneMachine OmniGrid 100 Microarrayer和Amersham CodeLinkTM活化的載玻片進行印製。通過 用標記的引物逆轉錄靼RNA來製備相應於乾RNA的標記的cDM寡聚 物。在第一鏈合成後，使RNA/DNA雜交物變性以降解RM模板。然後 將所製備的標記的靶cDM在雜交條件(例如在25。 C下於6X SSPE/30% 甲醯胺中進行18小時，然後在37。 C下於O. 75XTNT中清洗40分鐘) 下與微陣列晶片雜交。在陣列上的其中固定的探針DNA識別樣品中的 互補靶cDNA的位置上，發生雜交。標記的乾cDNA標記陣列上的其中 發生結合的確切位置，從而允許自動檢測和定量。輸出信號由一列雜 交事件組成，其標示了特定cDNA序列的相對豐度，從而標示了患者樣 品中相應的互補miR的相對豐度。才艮據一個實施方案，標記的cDNA 寡聚物是從生物素標記的引物製備的生物素標記的cDM。然後通過使 用例如鏈黴抗生物素蛋白-Alexa647綴合物直接檢測包含生物素的轉 錄物來處理微陣列，和使用常規掃描方法掃描微陣列。陣列上的各點 的圖像強度與患者樣品中相應的miR的豐度成比例。
使用陣列對於miRM表達的檢測具有幾個有利方面。第一，可在 一個時間點上鑑定相同樣品中的數百個基因的整體表達。第二，通過 寡核苷酸探針的仔細設計，可鑑定成熟分子和前體分子的表達。第三， 與Northern印跡分析相比，晶片需要少量RM，並且使用2.5 ju g總 RNA可提供可重現的結果。數目相對有限的miRM(每物種數百個)允許 對數個物種構建共同的微陣列，其中對每一物種使用不同的寡核苷酸 探針。這樣的工具允許分析各已知的ffliR在不同條件下的跨物種表達。
除了用於特定miR的定量表達水平測定外，包含相應於raiRNome 的大部分(優選整個miRNome)的miRNA-特異性探針寡核苷酸的微芯 片可用於進行miR基因表達譜分析，以分析miR的表達模式。可使不同的raiR特徵與已建立的疾病標記關聯或直接與疾病狀態關聯。
按照本文中描述的表達語分析法，對來自懷疑患有癌症(例如 CLL)的受試者的樣品的總RNA進行定量逆轉錄以提供一組與樣品中的 RNA互補的標記的靶寡脫氧核苷酸。然後將靶寡脫氧核苷酸與包含 m i RNA-特異性探針寡核普酸的微陣列雜交，從而提供樣品的雜交語。 結果是顯示樣品中iniRNA的表達模式的樣品的雜交鐠。雜交鐠包括來 自靶寡脫氧核苷酸(其來自樣品)與微陣列中的miRNA-特異性探針寡 核苷酸結合的信號。所述譜可記錄為結合的存在或不存在(信號對0 信號)。更優選地，記錄的譜包括來自各雜交的信號的強度。將所述 鐠與從正常的(即非癌的)對照樣品產生的雜交鐠相比較。信號的改 變表示受試者中存在癌症。
用於測量miR基因表達的其他技術也在本領域技術人員的能力之 內，其包括用於測量RM轉錄和降解的速率的各種方法。
本發明還提供了診斷與一個或多個預後標記關聯的CLL的方法， 該方法包括測量來自受試者的CLL受試樣品中至少一種miR基因產物 的水平，將CLL受試樣品中該至少一種raiR基因產物的水平與對照樣 品中相應的miR基因產物的水平相比較。與對照樣品相比受試樣品中 至少一種miRNA的信號的改變(例如，增加、減少)表示受試者患有 與一個或多個預後標記關聯的CLL或處於發展其的風險中。
CLL可與一個或多個預後標記或特徵關聯，包括與不利的(即， 負面)預後關聯的標記或與良好的(即，正面)預後關聯的標記。在 某些實施方案中，使用本文中描述的方法診斷的CLL與一個或多個不 利預後特徵關聯。
本文中描述了其表達在與這些預後標記中的每一個關聯的CLL細 胞中發生改變的特定microRNA。在一個實施方案中，這樣測量至少一 種miR基因產物的水平，即通過逆轉錄獲自受試者的受試樣品的RM 以提供一組靶寡脫氧核苷酸，將該靶寡脫氧核苷酸與包含miRNA-特異 性探針寡核苷酸的微陣列雜交，從而提供受試樣品的雜交鐠，然後將 受試樣品的雜交鐠與從對照樣品產生的雜交譜相比較來進行測量。
18不希望受任何理論束縛，據信，細胞中一種或多種miR基因產物 水平的改變可導致這些miR的一種或多種預期的靶失調，這可導致CLL 形成。因此，改變miR基因產物水平(例如，通過減少在CLL細胞中上 調的miR的水平，通過增加在癌細胞中下調的miR的水平)可成功地治 療CLL。本文中描述了在CLL細胞中失調的miRM的假定的基因靶的 實例。
因此，本發明包括治療受試者的CLL的方法，其中至少一種miR 基因產物在受試者的癌細胞中失調(例如，下調、上調)。當至少一種 分離的miR基因產物在CLL細胞中下調時，該方法包括施用有效量的 該至少一種分離的miR基因產物，以便癌細胞在受試者中的增殖被抑 制。當至少一種分離的miR基因產物在癌細胞中上調時，該方法包括 對受試者施用有效量的至少一種用於抑制該至少一種miR基因表達的 化合物(本文中稱為miR基因表達抑制化合物)，以便CLL細胞的增 殖^皮抑制。
如本文中所使用的，術語"治療"、"醫治"和"療法"是指改 善與疾病或病況例如CLL相關的症狀，包括預防或延遲疾病症狀的發 作，和/或減少疾病或病況的症狀的嚴重度或頻率。術語"受試者"和 "個體"在本文中定義為包括動物例如哺乳動物，包括但不限於靈長 類動物、牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠或 其他牛科、羊科、馬科、犬科、貓科、齧齒目或鼠科物種。在優選實 施這群中，動物是人。
如本文中所使用的，分離的miR基因產物的"有效量"是足以在 患有CLL的受試者中抑制癌細胞增殖的量。通過考慮因素例如受試者 的大小和體重、疾病侵入的程度、受試者的年齡、健康和性別、施用 的途徑以及施用是局部的還是全身性的，本領域技術人員可容易地確 定對給定的受試者施用的miR基因產物的有效量。
例如，分離的miR基因產物的有效量可基於待治療的受試者的大 致或估計的體重。優選，如本文中所描述的，胃腸外或腸內施用這樣 的有效量。例如，對受試者施用的分離的miR基因產物的有效量可在大約5- 3000微克/kg體重、大約700-1000微克/kg體重的範圍內或 大於大約1000微克/kg體重。
本領域技術人員還可容易地確定用於對給定的受試者施用分離 的miR基因產物的合適的給藥方案。例如，可對受試者施用一次(例 如，作為單次注射或沉積(deposition) ) miR基因產物。可選擇地， 可以每天1次或2次對受試者施用miR基因產物，進行大約3至大約 28天，特別地大約7至大約10天的時期。在特定的給藥方案中，每 天1次施用miR基因產物，進行7天。當給藥方案包括多次施用時， 應理解，對受試者施用的miR基因產物的有效量可包括在整個給藥方 案中施用的基因產物的總量。
如本文中使用的，"分離的，，miR基因產物是合成的或通過人工 介入從天然狀態改變或取出的miR基因產物。例如，合成的miR基因 產物，或部分或完全從其天然狀態的共存材料分離的miR基因產物被 認為是"分離的，，。分離的miR基因產物可以以大體上純化的形式存 在，或可以存在於已將所述miR基因產物遞送入其中的細胞中。因此， 有意地被遞送至細胞或在細胞中表達的miR基因產物被認為是"分離 的"miR基因產物。在細胞內從miR前體分子產生的miR基因產物也 被認為是"分離的"分子。
分離的miR基因產物可使用許多標準技術獲得。例如，可使用本 領域已知的方法化學合成或重組產生miR基因產物。在一個實施方案 中，使用適當保護的核糖核苷亞磷醯胺和常規的DNA/RNA合成儀化學 合成miR基因產物。合成RNA分子或合成試劑的提供商包括例如 Proligo (Hamburg, Germany)、 Dharmacon Research (Lafayette, CO, U. S. A.) 、 Pierce Chemical (part of Perbio Science, Rockford, IL， U. S.A. )、 Glen Research (Sterling, VA， U. S. A.) 、 ChemGenes (Ashland, MA， U. S. A.)和Cruachem (Glasgow, UK)。
可選擇地，可使用任何合適的啟動子從重組環形或線性DNA質粒 表達miR基因產物。用於從質粒表達RM的合適的啟動子包括例如U6 或HI RNA pol III啟動子序列或巨細胞病毒啟動子。其他合適啟動子的選擇在本領域技術人員的能力之內。本發明的重組質粒還可包括用
於在癌細胞中表達miR基因產物的誘導型或可調控的啟動子。
可通過標準技術從培養的細胞表達系統分離從重組質粒表達的 miR基因產物。還可將從重組質粒表達的miR基因產物遞送至癌細胞 並且在其中直接表達。下面更詳細地論述重組質粒將miR基因產物遞 送至癌細胞的用途。
miR基因產物可從分開的重組質粒表達，或它們可從相同的重組 質粒表達。在一個實施方案中，miR基因產物從單個質粒表達為RNA 前體分子，然後通過合適的加工系統(包括但不限於癌細胞中現有的 加工系統)將該前體分子加工成功能性raiR基因產物。其他合適的加 工系統包括例如體外果蠅細胞裂解物系統(例如，如屬於Tuschl等人 的美國公開專利申請2002/0086356中所描述的，其全部公開內容通過 引用合併入本文)和大腸桿菌RNA酶III系統(例如，如屬於Yang等人 的美國公開專利申請2004/0014113中所描述的，其全部公開內容通過 引用合併入本文)。
適合用於表達miR基因產物的質粒的選擇、用於將核酸序列插入 質粒以表達基因產物的方法以及將重組質粒遞送至目的細胞的方法在 本領域技術人員的能力之內。參見，例如，Zeng等人(2002)， Molecular Cell 9:1327-1333; Tuschl (2002)， Nat. Biotechnol， 20:446-448; Brummelkamp等人 (2002)， Science 296:550-553; Miyagishi等人(2002)， Nat. Biotechnol. 20: 497-500; Paddison 等人 (2002)， Genes Dev. 16:948-958; Lee等人 (2002), Nat. Biotechnol. 20:500-505;和Paul等人(2002)， Nat. Biotechnol. 20:505-508，其全部公開內容通過引用合併入本文。
在一個實施方案中，表達miR基因產物的質粒包含在CMV立即早 期啟動子(intermediate-early promoter )控制下編碼miR前體RNA 的序列。如本文中所使用的，"在啟動子的控制下"是指編碼miR基 因產物的核酸序列位於啟動子的3'端，以便啟動子可起始miR基因產 物編碼序列的轉錄。miR基因產物還可從重組病毒栽體表達。可預期miR基因產物可 從兩個分開的重組病毒載體或從相同的病毒載體表達。可通過標準技 術從培養的細胞表達系統分離從重組病毒載體表達的RNA或所述RNA 可在癌細胞中直接表達。下面更詳細地論述重組病毒栽體將ffliR基因 產物遞送至癌細胞的用途。
本發明的重組病毒載體包含編碼miR基因產物的序列和用於表達 RNA序列的任何合適的啟動子。合適的啟動子包括例如U6或H1 RM po 1 III啟動子序列，或巨細胞病毒啟動子。其他合適的啟動子的選擇在 本領域技術人員的能力之內。本發明的重組病毒載體還可包含用於在 癌細胞中表達miR基因產物的誘導型或可調控的啟動子。
可使用能夠接受miR基因產物的編碼序列的任何病毒栽體；例如， 來源於腺病毒(AV)、腺伴隨病毒(AAV)、逆轉錄病毒(例如，慢病毒 (LV)、彈狀病毒(Rhabdoviruses)、鼠白血病病毒)、皰滲病毒等的 栽體。可通過用來自其他病毒的包膜蛋白或其他表面抗原假型化栽體 或通過置換不同的病毒衣殼蛋白(如果合適)來改變病毒載體的趨向 性。
例如，可用來自水泡性口膜炎病毒(VSV)、狂犬病病毒(rabies )、 伊波拉病毒(Ebola)、莫科拉病毒(Mokola)等的表面蛋白假型化本發明 的慢病毒栽體。可通過對栽體進行工程改造以表達不同的衣殼蛋白血 清型來製備本發明的AAV載體，使之靶向不同的細胞。例如，表達血 清型2型基因組上的血清型2型衣殼的AAV載體稱為AAV2/2。AAV2/2 栽體中的該血清型2型衣殼基因可用血清型5型衣殼基因替換，從而 產生AAV 2/5載體。用於構建表達不同衣殼蛋白血清型的AAV栽體的 技術在本領域技術人員的能力之內；參見，例如，Rabinowitz， J. E.， 等人(2002)， J. Virol. 76:791-801，其全部公開內容通過引用合 併入本文。
適合用於本發明的重組病毒載體的選擇、用於將用於表達RM的
核酸序列插入載體的方法、將病毒載體遞送至目的細胞的方法和表達 的RNA產物的回收在本領域技術人員的能力之內。參見，例如，
22Dornburg (1995)， Gene Therap. 2:301-310; Eglitis (1988)， Biotechniques 6:608-614; Miller (1990)， Hum. Gene Therap. 1:5-14;和Anderson (1998), Nature 392:25-30，其全部公開內容 通過引用合併入本文。
特別合適的病毒載體是來源於AV和AAV的載體。用於表達raiR 基因產物的合適的AV栽體、用於構建重組AV載體的方法以及用於將 載體遞送至靶細胞的方法描述於Xia等人(2002)， Nat. Biotech. 20:1006-1010，其全部^〉開內容通過引用合併入本文。用於表達miR 基因產物的合適的AAV載體、用於構建重組AAV載體的方法以及用於 將載體遞送至靶細胞的方法描述於Samulski等人(1987)， J. Virol. 61:3096-3101; Fisher等人(1996)， J. Virol, 70:520-532; Samulski等人(1989)， J. Virol. 63: 3822-3826;美國專利 5， 252， 479;美國專利5， 139， 941;國際專利申請WO 94/13788;和國 際專利申請WO 93/24641，其全部公開內容通過引用合併入本文。在 一個實施方案中，從包含CMV立即早期啟動子的單個重組AAV載體表 達miR基因產物。
在某些實施方案中，本發明的重組AAV病毒載體包含在人U6 RM 啟動子控制下的與polyT終止序列有效連接的編碼miR前體RM的核 酸序列。如本文中所使用的，"與polyT終止序列有效連接"是指編 碼有義或反義鏈的核酸序列以5'方向與polyT終止信號緊密鄰接。在 從栽體轉錄miR序列的過程中，polyT終止信號用於終止轉錄。
在本發明的治療方法的其他實施方案中，還可對受試者施用有效 量的至少一種抑制miR表達的化合物。如本文中所使用的，"抑制miR 表達"是指治療後miR基因產物的活性成熟形式的產量低於治療前產 生的量。通過使用例如上述用於診斷方法的測定miR轉錄物水平的技 術，本領域技術人員可容易地確定miR的表達在癌細胞中是否已被抑 制。抑制可在基因表達的水平上(即，通過抑制編碼ffliR基因產物的 miR基因的轉錄)或在加工的水平上(例如，通過抑制miR前體至成熟 的活性miR的加工)發生。如本文中所使用的，抑制miR表達的化合物的"有效量，，是足以 在患有與癌症相關性染色體特徵關聯的癌症的受試者中抑制癌細胞的 增殖的量。通過考慮因素，例如受試者的大小和體重、疾病侵入的程 度、受試者的年齡、健康和性別、施用的途徑以及施用是局部的還是 全身性的，本領域技術人員可容易地確定對給定的受試者施用的抑制 miR表達的化合物的有效量。
例如，抑制表達的化合物的有效量可基於待治療的受試者的大致 或估計的體重。如本文中所描述的，除其他以外，胃腸外或腸內施用 這樣的有效量。例如，對受試者施用的抑制表達的化合物的有效量可 在大約5- 3000微克/kg體重、大約700-1000微克/kg體重的範圍內 或其可大於大約1000微克/kg體重。
本領域技術人員還可容易地確定用於對給定的受試者施用抑制 miR表達的化合物的合適的給藥方案。例如，可對受試者施用一次(例 如，作為單次注射或沉積)抑制表達的化合物。可選擇地，可以每天 1次或2次對受試者施用抑制表達的化合物，進行大約3至大約28天， 更優選大約7至大約IO天的時期。在特定的給藥方案中，每天1次施 用抑制表達的化合物，進行7天。當給藥方案包括多次施用時，應理 解，對受試者施用的抑制表達的化合物的有效量可包括在整個給藥方 案中施用的化合物的總量。
用於抑制miR基因表達的合適的化合物包括雙鏈RM (例如短的 或小幹擾RNA或"siRNA")、反義核酸和酶促RNA分子例如核酶。這 些化合物中的每一種可被靼向給定的miR基因產物並且破壞靶miR基 因產物或誘導靶miR基因產物的破壞。
例如，給定的miR基因的表達可通過用分離的雙鏈RNA( "dsRNA") 分子誘導miR基因的RM千擾來抑制，所述雙鏈RNA分子與miR基因 產物的至少一部分具有至少90%、例如至少95%、至少98°/。、至少99% 或100%的序列同源性。在特定的實施方案中，dsRM分子是"短的或 小幹擾RM"或"siRM"。
用於本方法的siRNA包括長度大約17個核苷酸至大約29個核苷
24酸、優選長度大約19至大約25個核苷酸的短雙鏈RNA。 siRNA包含通 過標準Watson-Crick鹼基配對相互作用(在下文中"鹼基配對")退 火在一起的有義RM鏈和互補反義RNA鏈。有義鏈包含大體上與靶miR 基因產物內包含的核酸序列同一的核酸序列。
如本文中所使用的，siRNA中與靶mRM內包含的靶序列"大體上 同一"的核酸序列是與靶序列同一的核酸序列或與靶序列相異於l或 2個核苷酸的核酸序列。siRNA的有義和反義鏈可包括兩個互補的單鏈 RM分子或可包括其中兩個互補部分鹼基配對並且通過單鏈"髮夾結 構"區域共價連接的單個分子。
siRNA還可以是與天然存在的RNA相異於一個或多個核苷酸的添 加、缺失、置換和/或改變的經改變的RM。這樣的改變可包括非核苷 酸材料的添加，例如至siRNA的末端或至siRNA的一個或多個內部核 苷酸的添加，或使siRNA抵抗核酸酶降解的修飾或用脫氧核糖核普酸 對siRNA中的一個或多個核普酸的置換。
siRNA的一條或兩條鏈還可包含3:懸突。如本文中所用的，"3' 懸突"是指從雙鏈RNA鏈的3'-末端延伸的至少一個未配對的核苷酸。 因此，在某些實施方案中，siRNA包含至少一個長度為1至大約6個 核苷酸(其包括核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸)、長度為1至大約5 個核苷酸、長度為1至大約4個核苷酸或長度為大約2至大約4個核 苷酸的3'懸突。在特定的實施方案中，3:懸突存在於siRNA的兩條鏈 上，且其長度為2個核苷酸。例如，siRNA的各條鏈可包含二胸苷酸 ("TT，，)或二尿苷酸("uu")的3'懸突。
siRNA可通過化學或生物方法產生，或可從重組質粒或病毒載體 表達，如上文對分離的miR基因產物所描述的。用於產生和檢測dsRM 或siRNA分子的示例性方法描述於屬於Gewirtz的美國公開專利申請 2002/0173478和屬於Reich等人的美國公開專利申請2004/0018176， 其全部公開內容通過引用合併入本文。
給定的miR基因的表達還可通過反義核酸抑制。如本文中所使用 的，"反義核酸，，是指通過RM-RNA或RNA-DNA或RNA-肽核酸相互作用與耙RM結合的核酸分子，其改變耙RNA的活性。適合用於本方法 的反義核酸是通常包含與miR基因產物中的連續核酸序列互補的核酸 序列的單鏈核酸(例如，RNA、 DM、 RM-DNA嵌合物、PM)。反義核酸 可包含與miR基因產物中的連續核酸序列50-100%互補、75-100%互補 或95-100%互補的核酸序列。本文提供了用於miR基因產物的核酸序 列。不希望受任何理論束縛，據信，反義核酸激活RNA酶H或降解miR 基因產物/反義核酸雙鏈體的另一種細胞核酸酶。
反義核酸還可包含對核酸主鏈或對糖和鹼基部分(或它們的等價 物)的修飾，從而增加靶特異性、核酸酶抗性、遞送或與分子的功效 相關的其他性質。此類修飾包括膽固醇部分、雙鏈體插入劑例如吖啶 或一種或多種抗核酸酶基團。
反義核酸可通過化學或生物方法產生，或可從重組質粒或病毒載 體表達，如上文對分離的miR基因產物所描述的。用於產生和檢測的 示例性方法在本領域技術人員的能力之內；參見，例如，S te i n和Cheng (1993)， Science 261:1004以及屬於Woolf 等人的美國專利 5， 849， 902，其全部公開內容通過引用合併入本文。
給定的miR基因的表達還可通過酶促核酸(enzymatic nucleic acid)抑制。如本文中所使用的"酶促核酸"是指包含與miR基因產 物的連續核酸序列互補的底物結合區並且能夠特異性切割miR基因產 物的核酸。酶促核酸底物結合區可以例如與miR基因產物中的連續核 酸序列50-100%互補、75-100%互補或95-100%互補。酶促核酸還可包 括在鹼基、糖和/或磷酸基團上的修飾。用於本方法的示例性酶促核酸 是核酶。
酶促核酸可通過化學或生物方法產生，或可從重組質粒或病毒栽 體表達，如上文對分離的miR基因產物所描述的。用於產生和檢測 dsRNA或s iRNA分子的示例性方法描述於Werner和Uhlenbeck (1995): Nucl. Acids Res. 23: 2092-96; Hammann等人(1999)， Antisenseand Nucleic Acid Drug Dev. 9:25-31;以及屬於Cech等人的美國專利 4, 987, 071,其全部公開內容通過引用合併入本文。至少一種miR基因產物或至少一種用於抑制raiR表達的化合物的 施用將在患有與癌症相關性染色體特徵關聯的癌症的受試者中抑制癌 細胞的增殖。如本文中所使用的，"抑制癌細胞的增殖"是指殺死細 胞或永久性或暫時地阻止或減緩細胞的生長。如果受試者中癌細胞的 數目在施用miR基因產物或抑制miR基因表達的化合物後保持恆定或 減少，那麼可推斷癌細胞增殖被抑制。如果癌細胞的絕對數目增加但
腫瘤生長的速度下降，則也可推斷癌細胞增殖被抑制。
受試者體內的癌細胞數目可通過直接測量或通過對原發性或轉
移性腫瘤塊的大小的估計來確定。例如，受試者中癌細胞的數目可通 過免疫組織學方法、流式細胞術或經設計用於檢測癌細胞的特徵表面 標記的其他4支術來測量。
可通過適合用於將此類化合物遞送至受試者的癌細胞的任何方 法來對受試者施用miR基因產物或抑制miR基因表達的化合物。例如，
染受試者的細胞的方法來施用miR基因產物或抑制miR表達的化合物。 在一個實施方案中，用包含編碼至少一種miR基因產物或抑制miR基 因表達的化合物的序列的質粒或病毒載體轉染細胞。
用於真核細胞的轉染方法在本領域內是熟知的，包括例如核酸至 細胞的細胞核或前核(pronucleus)的直接注射、電穿孔、脂質體轉 移和由親脂材料介導的轉移、受體介導的核酸遞送、基因槍或微粒加 速、磷酸鈣沉澱以及由病毒載體介導的轉染。
例如，細胞可用質脂體轉移化合物例如DOTAP (N-[1-(2， 3-二油 醯氧基)丙基]-N，N，N-三甲基-甲基石克酸銨，Boehringer- Mannheim) 或等價物例如LIPOFECTIN進行轉染。使用的核酸的量對於實施本發明 不是至關重要的；可接受的結果可用0. 1-100微克核酸/105個細胞來 獲得。例如，可使用在3微克D0TAP中的大約0. 5微克質粒載體/105 個細胞的比例。
還可通過任何合適的腸內或胃腸外施用途徑對受試者施用raiR基 因產物或抑制ffliR基因表達的化合物。用於本方法的合適的腸內施用途徑包括例如口服、直腸或鼻內給藥。合適的胃腸外施用途徑包括例
如血管內給藥(例如，靜脈內團注(bolus injection)、靜脈內輸注、 動脈內團注、動脈內輸注和至脈管系統內的導管滴注)；組織外周 (peri-t issue )和組織內注射(例如，腫瘤外周和腫瘤內注射，視網 膜內注射或視網膜下注射)；皮下注射或沉積，包括皮下輸注(例如通 過滲透泵)；對目的組織的直接施用，例如通過導管或其他安置裝置(例 如，；f見網膜丸劑(retinal pellet)或栓劑或包含多孔的、無孔的或 凝膠狀材料的植入物)；以及吸入。特別合適的施用途徑是注射、輸注 和靜脈內施用入患者。
在本方法中，miR基因產物或抑制miR基因產物表達的化合物可 以以棵露的RNA形式、與遞送試劑一起或以包含表達miR基因產物或 抑制表達的化合物的序列的核酸(例如，重組質粒或病毒載體)的形 式對受試者進行施用。合適的遞送試劑包括例如Mirus Transit TK0 親脂試劑、lipofectin、 1 ipofectamine、 cellfectin、聚陽離子(例
如，多聚賴氨酸)和脂質體。
本文中公開了包含表達miR基因產物或抑制miR基因表達的化合 物的序列的重組質粒和病毒載體、以及用於將此類質粒和栽體遞送至 癌細胞的4支術。
在特定的實施方案中，脂質體用於將miR基因產物或抑制miR基 因表達的化合物(或包含編碼它們的序列的核酸)遞送至受試者。脂質 體還可增加基因產物或核酸的血液半衰期。可從標準的形成小嚢泡的 脂質形成用於本發明的合適的脂質體，所述脂質通常包括中性的或帶 負電荷的磷脂和固醇例如膽固醇。脂質的選擇通常通過考慮因素例如 期望的脂質體大小和脂質體在血流中的半衰期來進行指導。已知許多 用於製備脂質體的方法，例如如Szoka等人(1980)， Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467; 和美國專利4,235, 871 、 4, 501,728 、 4， 837， 028和5， 019， 369 (其全部^^開內容通過引用合併入本文)中所 描述的方法。
用於本方法的脂質體可包含將脂質體靶向癌細胞的配體分子。結
28合癌細胞中普遍的受體的配體例如結合腫瘤細胞抗原的單克隆抗體是 優選的。
用於本方法的脂質體還可進行修飾以避免被單核巨噬細胞系統
("麗S")和網狀內皮系統("RES")清除。此類經修飾的脂質體在表 面具有調理作用-抑制部分或所述部分被整合入脂質體結構。在特別優 選實施方案中，本發明的脂質體可包含調理作用-抑制部分和配體。 用於製備本發明的脂質體的調理作用-抑制部分通常是與脂質體
膜結合的巨大的親水聚合物。如本文中所使用的，抑制調理作用的部 分，當其通過化學或物理方式(例如通過將脂溶性錨嵌入膜本身或通 過與膜脂質的活性基團的直接結合)附著至膜時，與脂質體膜"結合"。 此類抑制調理作用的親水聚合物形成了顯著減少脂質體被醒S和RES 吸收的保護性表面層；例如，如美國專利4，920，016中所描述的，其 全部公開內容通過引用合併入本文。
適合於修飾脂質體的抑制調理作用的部分優選是具有大約500至 大約40， 000道爾頓，更優選大約2， 000至大約20， 000道爾頓的數量 平均分子量的水溶性聚合物。此類聚合物包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二 醇(PPG)衍生物；例如甲氧基PEG或PPG以及PEG或PPG硬脂酸酯；合 成的聚合物，例如聚丙烯醯胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；線性的、分支 的或樹枝狀聚醯胺；聚丙烯酸；多元醇，例如與羧基或氨基化學連接 的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神經節苷脂，例如神經節苷脂GM1。 PEG、 甲氧基PEG或甲氧基PPG或其衍生物的共聚物也是合適的。此外，抑 制調理作用的聚合物可以是PEG和多聚胺基酸、多糖、聚乙二胺、聚 乙烯胺或多聚核普酸的嵌段共聚物。抑制調理作用的聚合物還可以是 包含胺基酸或羧酸的天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖 醛酸、透明質酸、果膠酸、神經氨酸、褐藻酸、角叉菜膠(carrageenan ); 胺化的多糖或低聚糖(線性或分支的)；或羧基化的多糖或低聚糖，例 如與具有所得的羧基的連接的碳酸的衍生物反應的多糖或低聚糖。優 選，抑制調理作用的部分是PEG、 PPG或其衍生物。用PEG或PEG-衍 生物修飾的脂質體有時稱為"PEG化脂質體"。可通過許多熟知的技術中的任一種將抑制調理作用的部分結合
至脂質體膜。例如，可將PEG的N-羥基琥珀醯亞胺酯與磷脂醯乙醇胺 脂質可溶性錨結合，然後再與膜結合。類似地，可使用Na(CN)BH3和 溶劑混合物(例如以30: 12比例的四氫呋喃和水)在60° C下通過還 原胺化作用，用硬脂醯胺脂質可溶性錨衍生葡聚糖(dextran)聚合物。 用調理作用-抑制部分修飾的脂質體在循環中比未修飾的脂質體 保持更長時間。因此，此類脂質體有時稱為"隱形(stealth)"脂質 體。已知隱形脂質體在通過多孔或"滲漏"微脈管系統飼餵的組織中 積累。因此，由此類微脈管系統缺陷表徵的組織例如實體瘤將有效地 積累這些脂質體；參見Gabizon，等人(1988)， Proc. Natl. Acad. Sci.， U.S.A., 18: 6949-53。此外，減少的通過RES的吸收通過阻止 脂質體在肝和脾中的大量積累來降低隱形脂質體的毒性。因此，用調 理作用-抑制部分修飾的脂質體特別適合用於將miR基因產物或抑制 miR基因表達的化合物(或包含編碼它們的序列的核酸)遞送至腫瘤 細胞。
可在對受試者施用前，按照本領域已知的技術將miR基因產物或 抑制miR基因表達的化合物配製為藥物組合物，有時稱為"藥劑"。 因此，本發明包括用於治療CLL的藥物組合物。在一個實施方案中， 藥物組合物包含至少一種分離的miR基因產物和藥學上可接受的栽 體。在特定的實施方案中，該至少一種miR基因產物相應於與適合的 對照細胞相比在CLL細胞中具有減少的表達水平的miR基因產物。在 某些實施方案中，分離的miR基因產物選自邁2V -2夕或邁L -/c!i7和其組 合。
在其他實施方案中，本發明的藥物組合物包括至少一種抑制miR 表達的化合物。在特定的實施方案中，至少一種抑制miR基因表達的 化合物特異於其在CLL細胞中的表達高於對照細胞的miR基因。在某 些實施方案中，抑制miR基因表達的化合物特異於選自或 忠/i -7《7和其組合的一種或多種miR基因產物。
本發明的藥物組合物表徵為是至少無菌的和無熱原的。如本文中所使用的，"藥物製劑"包括用於人和獸醫用途的製劑。用於製備本 發明的藥物組合物方法在本領域技術人員的能力之內，例如在
Remington's Pharmaceutical Science, 第17版，Mack Publishing Company, Easton， Pa. (1985)中所描述的，其全部分公開內容通過 引用合併入本文。
本藥物製劑包含至少一種與藥學上可接受的載體混合的miR基因 產物或抑制miR基因表達的化合物(或至少一種包含編碼它們的序列 的核酸)(例如，按重量計算O. 1至90%)，或其生理上可接受的鹽。 本發明的藥物製劑還可包含至少一種由脂質體封裝的miR基因產物或 抑制raiR基因表達的化合物(或至少一種包含編碼它們的序列的核酸) 和藥學上可接受的載體。
特別適合的藥學上可接受的載體是水、緩衝水溶液、常用鹽溶液、 0. 4%的鹽溶液、0. 3%的甘氨酸、透明質酸等。
在特定的實施方案中，本發明的藥物組合物包含至少一種抗核酸 酶降解的miR基因產物或抑制miR基因表達的化合物(或至少一種包 含編碼它們的序列的核酸)。本領域技術人員可以例如通過將一個或 多個在2'-位置被修飾的核糖核苷酸摻入miR基因產物來容易地合成 具有核酸酶抗性的核酸。合適的2'-修飾的核糖核苷酸包括在2'-位置 用氟、氨基、烷基、烷氧基和0-烯丙基修飾的核糖核苷酸。
本發明的藥物組合物還可包含常規藥物賦形劑和/或添加劑。合 適的藥物賦形劑包括穩定劑、抗氧化劑、重量摩爾滲透壓濃度調節劑、 緩衝劑和pH調節劑。合適的添加劑包括例如生理上生物相容性緩沖劑 (例如，氨丁三醇鹽酸鹽)、螯合劑(例如，DTPA或DTPA-雙醯胺)或鈣 螯合絡合物(例如，鈣DTPA、 CaNaDTPA-雙醯胺)的添加或任選地，鈣 或鈉鹽(例如，氯化鈣、抗壞血酸鈣、葡萄糖酸鈣或乳酸鈣)的添加。 本發明的藥物組合物可以以液體形式包裝使用或可以進行凍千。
對於本發明的固體藥物組合物，可使用常規無毒性的固體的藥學 上可接受的載體例如藥物級的甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖 精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。例如，用於口服施用的固體藥物組合物可包含上文所列的任一載
體和賦形劑以及10-95%,優選25%-75%的至少一種miR基因產物或抑 制miR基因表達的化合物(或至少一種包含編碼它們的序列的核酸)。 用於氣霧劑(吸入)施用的藥物組合物可包含按重量計算0. 01-20%,優 選l。/。-10。/。的至少一種封裝在上文所述的脂質體中的miR基因產物或抑 制miR基因表達的化合物(或至少一種包含編碼它們的序列的核酸) 和噴射劑。還可如所期望的包含載體例如卵磷脂以用於鼻內遞送。
本發明還包括鑑定抗CLL試劑的方法，該方法包括給細胞提供受 試試劑和測量細胞中至少一種miR基因產物的水平。在一個實施方案 中，該方法包括給細胞提供受試試劑和測量至少一種與CLL細胞中減 少的表達水平關聯的miR基因產物的水平。與合適的對照細胞相比， 細胞中miR基因產物水平的增加表示受試試劑為抗CLL試劑。在特定 的實施方案中，至少一種與CLL細胞中減少的表達水平關聯的raiR基 因產物選自肌W-W或肌'i -M7和其組合。
在其他實施方案中，該方法包括給細胞提供受試試劑和測量至少 一種與CLL細胞中增加的表達水平關聯的miR基因產物的水平。與合 適的對照細胞相比，細胞中miR基因產物水平的減少表示受試試劑是 抗CLL試劑。在特定的實施方案中，至少一種與CLL細胞中增加的表 達水平關聯的miR基因產物選自瓜/j -i^或範/i -747和其組合。
合適的試劑包括但不限於藥物(例如，小分子、肽)和生物大分子 (例如，蛋白質、核酸)。試劑可通過重組、合成產生，或其可從天然 來源分離(即，純化)。用於給細胞提供此類試劑的各種方法(例如， 轉染)在本領域內是熟知的，並且在上文中描述了幾種此類方法。用 於檢測至少一種miR基因產物的表達的方法(例如，Northern印跡、 原位雜交、RT-PCR、表達謙分析)在本領域內也是熟知的。
本發明現將通過下列非限定性實施例來舉例說明。
實施例CLL樣品和microRNA孩i:晶片實驗。
在CLL Research Consortium institution, 在徵得經診斷患有 CLL的患者同意後，獲得80個CLL樣品。簡而言之，從CLL患者獲得 血液，通過Ficol 1/Hypaque梯度離心(Amersham， Piscataway, NJ) 分離淋巴細胞並使用標準Trizol法處理其以進行RNA提取。如之前所 述進行蛋白質提取。lfl如之前所述進行MicroRNA-微晶片實驗。9各 microRNA孩i晶片包舍相應於326個人和249個小鼠microRNA基因的 兩重探針。如之前所述進行統計學分析。11為了鑑定統計學上顯著的 差異表達的microRNA， ^吏用BRB ArrayTools進4亍種類預測分析。 DNA-構建體、轉染、Western印跡和螢光素酶測定法 將包含5'和3' UTR cDNA的全長7TZ/ cDNA克隆入pUSEamp栽 體(Upstate Biotechnology, Chicago, IL)(用於圖le) 。 2夕6 和邁/v —RNA歡鏈體購自A邁bion (Austin, TX) 。 i口之前戶斤述進孑亍 轉染。12用雙螢光素酶測定系統(Promega)測定螢火蟲和海腎的螢光 素酶活性，並將螢火蟲的螢光素酶活性對海腎螢光素酶活性進行標準 化。如之前所述4，使用抗7TZ7單克隆抗體(克隆27D6)進行細胞裂 解物製備和Western印跡分析。
結果和討論
Tell的高表達與侵襲性B-CLL表型相關。
為了評價B-CLL樣品中ra7和microRNA的表達，選擇三組 B-CLL: 23個進展緩慢的B-CLL樣品、25個侵襲性B-CLL樣品和32 個顯示lld缺失的侵襲性B-CLL樣品。樣品的詳細描述示於圖4a-4d。
MicroRNA樣￡晶片實驗顯示三組CLL在microRNA表達才莫式上顯示 顯著的特徵差異(參見圖3-表1和圖5-表2)。
為了測定三組CLL中7TW蛋白的表達，使用27D6 Ta7單克隆 抗體進4亍Western印跡分析。這些實驗的結果示於圖la-b.
7TL 的表達被評定為低水平、中等水平、高水平和極高水平。我 們的實驗在23個進展緩慢的B-CLL的15個(65%)中、25個侵襲性B-CLL
33的11個(44%)中和32個具有llq缺失的侵襲性B-CLL的1個(3%)中顯 示低水平；然而在23個進展緩慢的B-CLL的1個(4%)中、25個侵襲 性B-CLL的14個(56%)中和在32個具有llq缺失的侵襲性B-CLL 的24個(75°/。)中觀察到高和極高的ra7的表達(圖lb)。在本文中，本發明者認為ra7的過表達與侵襲性B-CLL表型 (p〈10,和11q缺失(p〈l(T)相關。該結果與最近公布的研究一致，所 述研究顯示人CLL中的高TCL1的表達與未突變的Vh狀悉和ZAP70陽 性相關。5MiR-29和miR-181乾向Tcll的表達為了確定輩巴向7Ti^的miRNA， 4吏用由Bielefeld University Bioinfo鹿tics Server提供的RNAhybrid軟體和miRBase資料庫13。 在耙向7n:7的miR-候選物中，發現範/i -2外和歷/W-JW6 (圖lc，具 有更低同源性的幾個其他位點未顯示)在具有llq缺失的侵襲性B-CLL 中也下調(圖3-表1)。這些miR的表達通過代表性樣品組中的實時RT-PCR來驗證(圖 4a-4d)。此外，之前已顯示，miR-29家族成員的表達可區分具有良好和不 良預後的CLL樣品。9然後如之前所描述的，使用插入到螢光素酶ORF 下遊的3' UTR確定這些miR是否確實耙向ra/的表達。12用所 示的歷/y -2外或混雜(scramble)陰性對照以及所示的包含cDM 的一部分(含有與範/i -ZP同源的區域)的pGL3構建體(Tcll)或單獨 的pGL3載體共轉染HEK293細胞。對於yz /i —W測定，將全長cDM以有義(TcllFL)或反義 (TcllFLAS)方向插入pGL3栽體。圖ld顯示7VX7 niRNA的表達被邁M-W 和/Z7/W:W抑制。為了驗證這些發現，將包含5'和UTR的全長ra7 cDNA克隆入CMV哺乳動物表達載體並且觀察邁L -2外和/z/"-J476是 否影響7TZ7蛋白的表達水平。我們將該構建體與巡/W-^^. 和前-miR陰性對照(混雜)共轉染入293細胞，如在圖le上所顯示的。這些實驗顯示與頂/i -2夕和邁/j -747的共表達顯著減少了TCLl的表達(圖le，泳道2對泳道1和3)。因此，本文中顯示邁W-i^6和巡/i -7W6在mRNA和蛋白質水平上 草巴向7a7的表達。有趣地，在B-CLL樣品中肌V -Z^和邁/^ -/《M表達與ra7蛋白表達之間存在負相關(圖If):所有顯示高肌7 -"6和邁/i -7^6表達的樣品也顯示低或中等的ra/w《《；所有顯示極高 ra7的表達的樣品普遍顯示低邁/i -2外和/3 /> -7476的表達。這些結果顯示CLL中7^7的表達至少部分受歷L -Z 和/Z7/7 -7W調控。本文中證明，ra7的表達受/Z72'w-w和/z L -7(^調控，並且該調控與所研究的三組B-CLL相關。儘管觀察到ra/蛋白表達和這兩種miR之間的負相關，但顯著比例的B-CLL樣品顯示低7TZ7的表達和低 yz /i -2夕和範/i -747的表達(圖lf)。這表明在這些樣品中，7^7的表 達在轉錄上被下調或被其他miRNA下調。邁/W-W和肌V -7W都不位於 llq的事實表明該區域可能包含這兩種raiR的表達的重要調節子。有趣地，yz /v -7《7在B細胞中差異表達，7TZ7主要是B細胞特異 性基因。14然而不希望受理論束縛，本發明者在本文中認為在B細胞 成熟的不同階段raj和肌V -7W表達之間存在負相關。因為範/i -i^ 和/z7/i -/<W是天然的7TX7抑制劑，因此這些miR可以是過表達7TZ7 的B-CLL的治療劑的有用的候選物。根據專利法規的條款，已在其優選實施方案中解釋和說明了本發 明實施的原理和模式。然而，必須理解，可以不按明確解釋和說明的 方法來實施本發明而不背離其精神或範圍。參考文獻上述參考文獻和下面的參考文獻，以它們為本文中所示內容提供 示例性方案或其他詳細補充的程度，明確地通過引用合併入本文。1. Sgambati M， Linet M, Devesa S. Chronic Lymphocytic Leukemia, Epidemiological, Familial, and Genetic Aspects. Chronic Lymphocytic Leukemias， Second Edition, Revised and Expanded,Bruce Cheson， Ed Marcel Dekker， Inc. NewYork. 200; 33-62.2. VirgilioL, Narducci MG， IsobeM，等人Identification of the TCLl gene involved in T—eel 1 malignancies. Proc Natl. Acad. Sci. USA 1994; 91 :12530-12534.3. Bichi R， Shinton SA， Martin ES，等人 Human Chronic Lymphocytic Leukemia modeled in mouse by targeted TCLl expression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002; 99:6955-6960.4. Pekarsky Y， Koval A， Hallas C,等人Tell enhances Akt kinase activity and mediates its nuclear translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000; 97:3028—3033.5. HerlingM, Patel KA， Khalili J，等人 TCLl shows a regulated expression pattern in Chronic Lymphocytic Leukemia that correlates with molecular subtypes and proliferative state. Leukemia. 2006; 20:280-285.6. Dohner H， Stilgenbauer S， Benner A,等人Genomic aberrations and survival in Chronic Lymphocytic Leukemia. N. Engl. J. Med. 2000; 343: 1910-1916.7. Anibros V. The functions of animal microRNAs. Nature. 2004;431: 350-355.8. Calin GA， Liu CG, Sevignani C，等人 MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell Chronic Lymphocytic Leukemias. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004; 101:11755-11760.369. Calin GA， Ferracin M， Cimmino A，等人A MicroRNA signature associated with prognosis and progression in Chronic Lymphocytic Leukemia. N. Engl. J.Med. 2005; 353:1793-1801.10. Palamarchuk A， Efanov A， Maximov V, Aqeilan RI， Croce CM， Pekarsky Y. Akt phosphorylates Tal 1 oncoprotein and inhibits its repressor activity. Cancer Res. 2005; 65:4515-4519.11. Vol inia S, Calin GA， Liu CG,等人 A'microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006; 103: 2257-2261.12. Cimmino A， Calin GA， FabbriM，等人miR-15 and miR-16 induce apoptosis by targeting BCL2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005; 102: 13944-13949.13. Griffiths-Jones S， Grocock RJ， van Dongen S， Bateman A， Enright AJ. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Res. 2006'， 34:D140-144.14. Ramkissoon SH，Mainwaring LA，Ogasawara Y， 等人 Hematopoietic-specific microRNA expression in human cells. Uuk Res. 2005.
權利要求
1. 診斷受試者是否患有慢性淋巴細胞性白血病(B-CLL)或處於發展其的風險中的方法，該方法包括測量來自所述受試者的受試樣品中至少一種miR基因產物的水平，其中與對照樣品中相應的miR基因產物的水平相比，受試樣品中miR基因產物的水平的改變表示受試者患有B-CLL或處於發展B-CLL的風險中。
2. 權利要求l的方法，其中所述至少一種miR基因產物是miR-29或miR-181。
3. 權利要求1的方法，其中所述至少一種raiR基因產物是miR-29b。
4. 權利要求1的方法，其中所述至少一種miR基因產物是miR-181b。
5. 權利要求1的方法，其中^f吏用Northern印跡分析測量所述至少一種miR基因產物的水平。
6. 權利要求1的方法，其中受試樣品中所述至少一種miR基因產物的水平低於對照樣品中相應的miR基因產物的水平。
7. 權利要求1的方法，其中受試樣品中所述至少一種miR基因產物的水平高於對照樣品中相應的miR基因產物的水平。
8. 用於診斷受試者中與一個或多個預後標記關聯的B-CLL的方法，該方法包括測量來自所述受試者的B-CLL樣品中至少一種miR基因產物的水平，其中與對照樣品中相應的miR基因產物的水平相比，受試樣品中至少一種miR基因產物的水平的改變表示受試者患有與一個或多個預後標記關聯的B-CLL。
9. 診斷受試者是否患有B-CLL或處於發展其的風險中的方法，該方法包括(1) 逆轉錄來自獲自受試者的受試樣品的RM以提供一組靶寡脫氧核苷酸；(2) 將耙寡脫氧核苷酸與包含miRNA-特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交，從而提供受試樣品的雜交譜；和(3)將受試樣品雜交譜與從對照樣品產生的雜交譜相比較， 其中至少一種miRNA的信號的改變表示受試者患有B-CLL或處於發展B-CLL的風險中。
10. 權利要求9的方法，其中與從對照樣品產生的信號相比，至 少一種miRNA的信號下調。
11. 權利要求9的方法，其中與從對照樣品產生的信號相比，至 少一種miRNA的信號上調。
12. 權利要求9的方法，其中微陣列包含針對選自miR-29或 miR-181和其組合的一種或多種miRNA的miRNA-特異性探針寡核苷酸。
13. 診斷受試者是否患有與受試者中一個或多個不利預後標記 關聯的B-CLL或處於發展其的風險中的方法，該方法包括(1) 逆轉錄來自獲自受試者的受試樣品的MA以提供一組靶 寡脫氧核苷酸；(2) 將靶寡脫氧核苷酸與包含miRM-特異性探針寡核苷酸 的微陣列雜交，從而提供所迷受試樣品的雜交鐠；和(3) 將受試樣品雜交譜與從對照樣品產生的雜交譜相比較， 其中信號的改變表示受試者患有癌症或處於發展癌症的風險中。
14. 權利要求13的方法，其中微陣列包含至少一個針對選自 miR-29或miR-181和其組合的miRM的miRM-特異性探針寡核苷酸。
15. 治療患有B-CLL的受試者的B-CLL的方法，在所述B-CLL中， 與對照細胞相比，至少一種raiR基因產物在受試者的癌細胞中下調或 上調，該方法包括(1) 當至少一種miR基因產物在癌細胞中下調時，對受試者 施用有效量的至少一種分離的miR基因產物，以便癌細胞在受試者中 的增殖被抑制；或(2) 當至少一種miR基因產物在癌細胞中上調時，對受試者 施用有效量的至少一種用於抑制所述至少一種raiR基因產物表達的化合物，以便癌細胞在受試者中所述的增殖被抑制。
16. 權利要求15的方法，其中步驟(l)中所述至少一種分離的 miR基因產物選自miR-29、 miR-181和其組合。
17. 權利要求15的方法，其中步驟(2)中至少一種miR基因產物 選自邁iR-29、 miR-181和其組合。
18. 治療受試者的B-CLL的方法，該方法包括(1) 測定與對照細胞相比，B-CLL細胞中至少一種miR基因 產物的量；和(2) 通過下列步驟改變B-CLL細胞中表達的miR基因產物的i) 對受試者施用有效量的至少一種分離的miR基因產 物，如果癌細胞中表達的niiR基因產物的量低於對照細胞中表達的miR 基因產物的量；或ii) 對受試者施用有效量的至少一種用於抑制所述至少 一種niiR基因產物的表達的化合物，如果癌細胞中表達的miR基因產 物的量高於對照細胞中表達的miR基因產物的量，以便癌細胞在受試 者中的增殖被抑制。
19. 權利要求18的方法，其中步驟(i)中所述至少一種分離的 miR基因產物選自miR-29、 miR-181和其組合。
20. 權利要求18的方法，其中步驟(ii)中所述至少一種miR基 因產物選自miR-29、 ffliR-181和其組合。
21. 用於治療B-CLL的藥物組合物，其包含至少一種分離的ffliJR 基因產物和藥學上可接受的載體。
22. 權利要求21的藥物組合物，其中所述至少一種分離的miR 基因產物相應於與合適的對照細胞相比在B-CLL細胞中下調的miR基 因產物。
23. 權利要求22的藥物組合物，其中所述分離的ffliR基因產物 選自miR-29、 miR-181和其組合。
24. 用於治療B-CLL的藥物組合物，其包含至少一種miR表達抑制劑化合物和藥學上可接受的載體。
25. 權利要求24的藥物組合物，其中所述至少一種miR表達抑 製劑化合物特異於與合適的對照細胞相比在B-CLL細胞中上調的miR 基因產物。
26. 權利要求25的藥物組合物，其中所述至少一種miR表達抑 製劑化合物特異於選自miR-29、 miR-181和其組合的miR基因產物。
27. 鑑定抗B-CLL試劑的方法，該方法包括給細胞提供受試試劑 和測量至少一種與B-CLL細胞中減少的表達水平關聯的miR基因產物 的水平，其中與合適的對照細胞相比，細胞中miR基因產物水平的增 加表示所述受試試劑是抗B-CLL試劑。
28. 權利要求27的方法，其中所述miR基因產物選自miR-29、 miR-181和其組合。
29. 鑑定抗B-CLL試劑的方法，該方法包括給細胞提供受試試劑 和測量至少一種與B-CLL細胞中增加的表達水平關聯的miR基因產物 的水平，其中與合適的對照細胞相比，細胞中miR基因產物水平的減 少表示所述受試試劑是抗B-CLL試劑。
30. 權利要求29的方法，其中所述miR基因產物選自miR-29、 miR-181和其組合。
全文摘要
本發明提供了用於診斷、預後和治療慢性淋巴細胞性白血病(CLL)的新的方法和組合物。本發明還提供了鑑定抗CLL試劑的方法。
文檔編號C12Q1/68GK101535505SQ200780040146
公開日2009年9月16日 申請日期2007年9月17日 優先權日2006年9月19日
發明者C·M·克羅斯 申請人:俄亥俄州立大學研究基金會