生產和培育具有提高的磷利用的植物的方法

2023-05-06 17:38:46

專利名稱：：生產和培育具有提高的磷利用的植物的方法
技術領域：
：本發明涉及生物技術。更特別地，本發明涉及植物遺傳工程領域。更具體地說，本發明涉及生產和培育具有提高的磷利用的轉基因植物的方法。
背景技術：
：磷(P)是植物生長，發育和繁殖所必需的營養素。氮之後，P糹皮認為是限制農業生產的第二種最重要的營養素。儘管土壤中磷的總量可能比較高，但是它常常以植物攝取不可利用的形式存在。例如，Saskatchewan土壤天生可利用的P含量低，P在土壤的上部6英寸處為400到2000lb/A，但是在生長季節期間只有極少量的總P是作物植物可利用的。為了減輕P缺乏並確保植物生產力，全世界每年幾乎3千萬噸的P肥料^皮應用於土壤(例如，在大約85%的Saskatchewan耕地中需要P肥料)。高達80%的來自肥料的P喪失，因為它變成固定的並且由於吸附，沉澱或轉化成有機形態對於植物攝取是不可利用的。而且，近年來已經日益關注過度使用肥料，尤其是P對環境汙染的影響。P幫助植物儲存和使用來自光合作用的能量以將養分傳送給植物，和在細胞之間傳送養分，並產生生長所需的糖，澱粉和蛋白質。響應無機P的限制，一些植物經歷生理和發育適應以清除來自環境的有限的磷酸鹽，包括減少它們的無機P消耗和調動它們的無機P|&存。磷脂是細胞無機P貯存的主要形式，而且在無機P飢餓期間它們的含量在植物中顯著下降。在植物中，甘油-3-磷酸(G-3-P)是磷脂合成的專性前體。進一步地，G-3-P代謝反映了總的代謝網絡的擾亂。G-3-P合成酶，NAD+依賴性甘油-3-磷酸脫氫酶，可能是胞質與線粒體之間的代謝連接，其是細胞氧化還原控制必要的和不可缺少的。因此，G-3-P代謝，尤其是胞質G-3-P脫氫酶的活性是植物脅迫耐受性的許多方面，包括無機P限制適應的關鍵。甘油-3-磷酸脫氫酶(GPDH)(EC1.1.1.8)是原核生物和真核生物必需的酶。使用MDH作為還原當量，GPDH催化磷酸二羥丙酮(DHAP)還原為甘油-3-磷酸(G-3-P)。植物細胞具有GPDH的至少兩種同工型，一種位於質體上，另一種位於夢質中\已經報導了從菠菜中純化胞質GPDH2。由GPDH催化的反應的產物，G-3-P,是所有甘油脂種類，包括膜和貯存脂合成的前體。細菌中該酶的生物合成作用，體內通過缺乏其活性的大腸桿菌突變林的甘油和G-3-P營養缺陷型的分離建立3。這些突變體在缺乏補充的G-3-P時不能合成磷脂。沒有GPDH活性缺陷的植物突變體的報導。除了對於脂生物合成是必需的之外，GPDH還參與幾種其他重要的生物過程。最值得注意的是，GPDH，通過消耗NADH和再生MD+,在保持細胞的氧化還原狀態中起重要作用。NAD7NADH對起著作為細胞氧化還原反應中還原當量的儲存器和載體的重要作用。為了進行分解代謝反應，NAD7MDH的比例應該較高。在正常的有氧條件下，過量的NADH被導入線粒體中並通過呼吸被消耗。在缺氧情況下，GPDH反應用作氧化還原閥以除掉額外的還原力。這樣，細胞的NAD7NADH比例可以被維持在允許分解代謝過程進行的水平。在啤酒糖酵母中，GPDH基因的表達易受氧化還原控制並由無氧條件誘導。GPD2基因(GPDH的兩種同工型中的一種)的缺失導致在缺氧情況下的缺陷生長4。在啤酒糖酵母中，GPDH也顯示出在適應滲透脅迫中起重要作用。GPDH在滲透和鹽濃度脅迫響應中通過它在甘油合成中的功能發揮它的作用。甘油是一種已知的滲透保護劑。它通過特異性甘油3-磷酸酶所引起的脫磷酸作用由G-3-P產生。為了響應高的外部滲透環境，酵母細胞積累甘油以補償細胞外與細胞內水勢之間的差異5。GPDH基因，GPD1的表達已經證明是滲透響應性的。一種啤酒糖酵母菌林，其中GPD1基因已經缺失，對NaCl超敏感7。在一些嗜鹽綠藻，包括杜氏藻屬，蟲黃藻科，J"ero/z70/7as和C力/a邁j^/o/7asre/"力ard〃/中已經報導了甘油作為滲透調節溶質的積累8。已經報導了植物Cw/力ea/a/ceo/a"的編碼GPDH活性的cDNA的序列。編碼的蛋白質暫時被指定為胞質同工型。迄今為止，還沒有關於植物GPDH的遺傳操作的報導。發明概述發明人意外地發現，能過量表達甘油-3-磷酸脫氫酶的轉基因植物在磷(P)限制條件下能較好地生長。因此，開發這裡描述的轉基因植物表示一種獲得更能持續的農業的方式，其可有助於滿足人們不斷增加的對食物的需求。而且，具有增強的P獲得能力的轉基因植物，其更有效的利用P,對於不能提供商品P肥料的供給糧食的農場應該是極為重要的並且幫助降低商業農場的成本。在一個實施方案中，一種大腸桿菌基因，編碼在強組成型啟動子，例如花椰菜花葉病毒35S啟動子的轉錄控制下的G-3-P脫氫酶的^j^，被用於在擬南芥和芸苔中產生轉基因植物，以生產具有比野生型植物高几倍的G3P水平的轉基因植物。在該轉基因植物中，調節原核生物與真核生物的甘油脂途徑之間的甘油脂生物合成代謝通量來響應G-3-P變化。與野生型植物相比，較高的細胞膜脂分子比例來源於質體原核生物甘油脂途徑，其主要產生單半乳糖二醯甘油(MGDG)和雙半乳糖二醯甘油(DGDG)。從而，轉基因植物中磷脂對非磷脂的比例降低。因此，雖然使用較少的P用於膜脂生物合成，但是這些轉基因植物能保留細胞活性。結果表明，當與對照相比較時，轉基因植物(擬南芥和油菜)產生更多的葉子和種子生物量，同時葉綠素含量較高，當在P限制條件下生長時，其產生較少的花色素苷(anthocynines)和澱粉。這些結果表明，轉基因植物對P限制更能復原。在一個實施方案中，一種用於培育轉基因植物，植物種子，或其後代的方法包括種植具有摻入基因組中的編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的工具的轉基因植物，植物種子或其後代。使該轉基因植物，植物種子或其後代生長至成熟並收穫成熟的轉基因植物，植物種子或其後代的種子。如這裡使用的，短語"植物，植物種子或其後代"用於指植物或它的後代或種子。例如，"植物，植物種子或其後代"指植物的T1，T2和T3世代以及用無性繁殖方法生產的植物。在另外的實施方案中，轉基因canola植物，種子或其後代含有具有整合到基因組中的編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的工具的基因組。編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的基因與啟動子可操作地連接。在另外的實施方案中，一種用於生產植物，植物種子或其後代的體系包括具有降低的磷含量的土壤和具有整合到基因組中的編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的工具的轉基因植物，植物種子或其後代。轉基因植物，植物種子或其後代能在具有降低的磷含量的土壤中生長大約60天或植物的生長季節(或產生種子的時間)。仍然在另外的實施方案中，一種用於降低培育作物植物所需的磷量的方法包括獲得能在具有降低的磷含量的土壤中生長至少60天或產生作物植物的時間的轉基因作物植物，植物種子或其後代，並在土壤中種植該轉基因作物植物，植物種子或後代。如這裡使用的，短語"編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的基因"用於指編碼M"基因的基因。在一個實施方案中，^W基因是原核生物來源的。在另一個實施方案中，^W基因是細菌來源的。^W基因的示例性實施方案包括，但不限於，來源於大腸桿菌(i".co//)(SEQIDN0:1)，弗氏志賀氏菌GS^/geZ/a/7eA72eW)(SEQIDNO:7)，鼠傷寒沙門氏菌(5(137/z7o/2e//<2^7力//^/"邁)(SEQIDNO:9)，腸沙門氏菌(i^/邁o/7e7/ae/7&Wca)(SEQIDNO:11)，鼠疫耶爾森氏菌(屍ers/;n's/es"力(SEQIDNO:13)，假結核耶爾森氏菌(7e"/"2、，油勵e徹/oy/力(SEQIDNO:15)，粘質沙雷氏桿菌Gyer/"/a範arcesce/2S)(SEQIDNO:17)，戶力ofor力s6cfws/u邁/刀esce力s(SEQIDNO:19)，胡蘿蔔軟腐歐文氏菌(i"i^2'//acaro^rors)(SEQIDNO:21)的那些基因或其保守性置換。編碼甘油-3-磷酸脫氬酶的工具也包括示例性^W基因的變體或突變體，其編碼具有或擁有與野生型或突變型^^J基因所編碼的甘油-3-磷酸脫氫酶相同的功能的蛋白質。例如，基因中的沉默突變和保守性置換已知是存在的，而且，仍然，編碼具有野生型基因相同功能的蛋白質。在另一個實施方案中，編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的工具含有編碼甘油-3-磷酸脫氫酶蛋白的核苷酸序列，該蛋白具有來源於大腸桿菌(SEQIDNO:2),弗氏志賀氏菌(SEQIDNO:8)，鼠傷寒沙門氏桿菌(SEQEDNO:10)，腸沙門氏菌(SEQIDNO:12)，鼠疫耶爾森氏菌(SEQIDNO:14)，假結核耶爾森氏菌(SEQIDNO:16)，粘質沙雷氏桿菌(SEQIDNO:18)，屍力Wor力aW^7麵.薦c(SEQIDNO:20)，胡蘿蔔軟腐歐文氏菌(SEQIDNO:22)的胺基酸序列或其保守性置換。在另一個實施方案中，公開了一種生產具有較低P的作物植物的方法。該方法包括種植能過量表達甘油-3-磷酸脫氫酶的轉基因種子。在一個實施方案中，轉基因種子包含編碼原核生物，細菌，真核生物，酵母或植物來源的甘油-3-磷酸脫氫酶蛋白的異源基因，其中編碼甘油-3-磷酸脫氫酶蛋白的異源基因為轉基因植物提供在具有降低的P含量的土壤中生長的能力。轉基因種子能在具有降低的P含量的土壤中生長，而且，仍然以與野生型植物基本上相同的方式，在已經用P施肥的土壤或具有適合的P含量的土壤中生長。如這裡使用的，術語"降低的磷含量"用於指需要外源的P或Pi來支持作物植物生長的土壤，或P含量小於大約百萬分之二十(20ppm)的土壤。仍然在一個另外的實施方案中，能過量表達甘油-3-磷酸脫氫酶，並因此在P含量降低的土壤中生長的轉基因種子是市售的。轉基因種子與指導轉基因種子的用戶支持轉基因種子生長的土壤中所需的P含量的說明一起放在容器中銷售。用這樣的方式，轉基因種子的用戶能降低施用於土壤中的P肥料的含量，或甚至避免施用P肥料到土壤中，從而，降低轉基因種子的用戶的操作成本。在一個實施方案中，表明了甘油-3-磷酸脫氫酶基因如wW的轉基因的過量表達增加了G-3-P的含量，降低了磷脂的含量，並因此增強了植物對低Pi利用率的耐受性。作物植物類，如玉米，小麥，大豆，水稻，蔬菜，以及對低P利用率敏感的樹種，也是用於引入參與G-3-P和磷脂代謝的基因的耙(作物植物)。在一個實施方案中，公開了一種用於在植物中表達異源甘油-3-磷酸脫氫酶的方法。在另一個實施方案中，描述了表達異源甘油-3-磷酸脫氫酶的植物，其中該異源甘油-3-磷酸脫氫酶經受比野生型甘油-3-磷酸脫氬酶低的反饋抑制。仍然在另外的實施方案中，公開了顯示在它的甘油脂中脂肪酸含量改變的遺傳改造植物。在一個實施方案中，描述了與野生型植物相比，顯示對滲透脅迫增強的耐受性的遺傳改造植物。仍然在另外的實施方案中，描述了與野生型植物相比，顯示增強的脅迫耐受性的遺傳改造植物。在一個另外的實施方案中，本發明公開了一種表達異源甘油-3-磷酸脫氫酶的方法，該酶在植物中比野生型甘油-3-磷酸脫氫酶對反饋抑制的敏感性低，該方法包括提供含有編碼甘油-3-磷酸脫氬酶的DNA序列的載體，該甘油-3-磷酸脫氫酶比野生型甘油-3-磷酸脫氫酶對反饋抑制的敏感性低；並用該栽體轉化植物。在另一個實施方案中，本發明描述了一種表達異源甘油-3-磷酸脫氫酶的植物，該異源甘油-3-磷酸脫氫酶比野生型甘油-3-磷酸脫氫酶對反饋抑制的敏感性低。在一個實施方案中，本發明公開了一種生產在它的甘油脂中具有改變的脂肪酸含量的遺傳改造植物的方法，該方法包括提供含有編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的DNA序列的載體，該甘油-3-磷酸脫氫酶比野生型甘油-3-磷酸脫氫酶對反饋抑制的敏感性低；並用該載體轉化植物。在另外的實施方案中，本發明公開了一種生產具有增加的甘油和/或甘油-3-磷酸酯水平的植物的方法，該方法包括提供含有編碼甘油-3-磷酸脫氬酶的DNA序列的載體，該甘油-3-磷酸脫氫酶比野生型甘油-3-磷酸脫氬酶對反饋抑制的敏感性低；並用該載體轉化植物。在一個另外的實施方案中，本發明公開了一種生產相對於野生型，具有增強的脅迫耐受性的遺傳改造植物的方法，該方法包括提供含有編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的DNA序列的栽體，該甘油-3-磷酸脫氬酶比野生型甘油-3-磷酸脫氳酶對反饋抑制的敏感性低；並用該載體轉化植物。在另外的實施方案中，本發明公開了一種生產相對於野生型，具有增強的滲透脅迫耐受性的遺傳改造植物的方法，該方法包括提供含有編碼甘油-3-磷酸脫氬酶的DM序列的載體，該甘油-3-磷酸脫氫酶比野生型甘油-3-磷酸脫氫酶對反饋抑制的敏感性低；並用該載體轉化植物。仍然在一個另外的實施方案中，本發明公開了一種增強植物中的細胞甘油-3-磷酸脫氫酶活性的方法，該方法包括提供含有編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的DM序列的載體，該甘油-3-磷酸脫氫酶比野生型甘油-3-磷酸脫氫酶對反饋抑制的敏感性低；並用該載體轉化植物。仍然在另一個實施方案中，本發明公開了一種用於遺傳轉化植物的載體，其中該載體含有編碼具有甘油-3-磷酸脫氫酶活性的蛋白的DNA，而且轉化以後，該植物顯示增強的甘油和/或甘油-3-磷酸酯產生。附圖簡述本專利或申請文件包含至少一幅以顏色製作的附圖。帶有彩色附圖的本專利或專利申請出版物的副本經請求並支付必要的費用由專利局提供。圖1顯示了大腸桿菌^W"基因的核苷酸序列和推斷的胺基酸序列。點突變用'突出和表示；圖2顯示了gpW,植物轉化載體，pGPSA-VI的圖示，沒有按比例繪製；圖3顯示了選擇的獨立擬南芥轉基因系中關於^W,基因的Southern印跡分析。圖4顯示了在擬南芥轉基因系中^W,基因表達的Northern印跡分析。圖5顯示了選擇的MW,轉基因擬南芥系的葉脂肪酸分布。圖6顯示了在有或沒有225mMNaCl的1/2MS培養基中，由選擇的擬南芥轉基因系產生的種子的發芽率。圖7顯示了在補充了各種濃度的NaCl的1/2MS培養基中，野生型擬南芥和轉基因系#13種子的發芽率。圖8顯示了在各種鹽度脅迫程度下，土壤中生長的轉基因植物的特性，如實驗細節中詳述的。圖9舉例說明了擬南芥葉子中gpsA的G3P含量。圖10顯示了擬南芥葉子中G3P代謝對磷脂含量的影響。圖11描述了^W轉基因系的土壤生長的葉子中的磷含量。圖12舉例說明了在低和高Pi培養基中發育的擬南芥的G3P和磷脂含量。圖13描述了轉基因擬南芥gpsA系能耐受低Pi脅迫。圖14是表明擬南芥gpsA系能耐受低Pi脅迫的另一個實施方案。圖15是表明擬南芥gpsA系能耐受低Pi脅迫的一個另外的實施方案。使種子在高Pi條件(O.5mM)下生長於石棉中2周，並將籽苗移植到降低的Pi含量條件(4Mm)10天。圖16描述了缺乏甘油-3-磷酸脫氫酶基因(AtGPDHc)的擬南芥突變體<2&/7必(7/—具有低的G3P含量並對低Pi脅迫敏感。圖17舉例說明了^W轉基因canola能耐受低Pi脅迫。使籽苗生長於沙土中3周並每2天用+Pi溶液(100ml/盆)澆灌(圖17A)。圖17B顯示了每天用無Pi溶液(80ml/盆)澆灌。圖17A描述了在沙土中生長68天的canola籽苗，圖17B舉例說明了在沙土中生長100天的canola。圖18舉例說明了表明^W轉基因canola能耐受低Pi脅迫的另一個實施方案。將在沙土中生長4天的籽苗移植到含有0.5raMPi的培養基中7天，然後每周將培養基轉換為10um和50jum,共2周。2周以後，每周將培養基轉換為無Pi培養基直到植物成熟。圖19表明^W轉基因canola在低Pi和低溫條件下從早期生長階段發育成大的植物結構。將種子種植在濾紙中並在8'C下用-Pi養分溶液澆灌16天。發明的最佳模式發明人對轉基因植物應用的發現已經繼續。例如，發明人發現了轉基因擬南芥植物能具有增強的滲透脅迫耐受性和甘油脂中脂肪酸含量改變(參見，PCT國際公開W001/21820Al，2001年03月29日公開，以其全部內容引入這裡作為參考)。由於它在脂生物合成，以及在脅迫響應中的作用，植物中增強的GPDH活性是需要的。在植物中過量表達植物或者非植物GPDH基因的轉基因方法，原則上，可望增強GPDH活性。不過，將非植物基因插入到植物基因組中存在幾個固有的優點。已充分確立了，將相同的植物基因引回到它的來源物種中，甚至在有義方向下，由於共抑制地會導致全部酶活性的降低。不同來源的基因(異源的)，特別是來自於進化上遠緣相關物種的那些基因，可望免於這種阻礙。更重要地，相同酶促功能的蛋白質在不同的物種中常常通過不同的模式受到調控。異源酶可能免於抑制內源酶的控制因素。低的甘油-3-磷酸酯產生抑制的任何甘油-3-磷酸脫氫酶。這種酶稱為反饋缺陷的。在一個實施方案中，異源酶是具有單個胺基酸突變的甘油-3-磷酸脫氫酶。該突變不應當大大降低甘油-3-磷酸脫氫酶活性，但是應當降低甘油-3-磷酸酯對該酶的抑制。已經報導大腸桿菌基因的一個等位基因，g/7^"，編碼反饋抑制缺陷的GPDH蛋白的一種改變型。在一個優選的實施方案中，本發明的方法使用含有基因WW屍的載體。發明人鑑定了^"屍序列中的一個點突變w"中密碼子255的第3個核苷酸中A被C取代。該突變導致編碼的蛋白質中Glu255(GAA)取代為Asp255(GAC)。g/^屍基因的序列和該基因的推斷的胺基酸序列顯示於圖1。基因序列列於SEQIDNO:1，而編碼的蛋白質列於SEQIDNO:2。在其它的實施方案中，基因序列是下列序列中的任何一個SEQIDNO:1，SEQIDNO:7，SEQIDNO:9，SEQIDNO:11，SEQIDNO:13，SEQIDNO:15，SEQIDNO:17，SEQIDNO:19，SEQIDNO:21及其保守性突變體。載體可以是適於轉化使用的植物物種的任何栽體。適合的載體的例子包括pHS737，pHS738，pRD400;pBinl9;和pCGN322313。GPDH是所有植物的生物合成途徑所共有的。因此，本發明的方法，可以用於任何植物。在一個實施方案中，發明人使用模式植物物種擬南芥。由於該植物容易以經典遺傳學和分子遺傳學的方式進行操作，所以擬南芥已經廣泛用作植物分子遺傳學，發育，生理學和生物化學中的模式生物14'1516。該雙子葉植物也與芸苔作物植物屬緊密相關並且愈加明顯的是，有關擬南芥中基礎生物過程的遺傳控制的信息可以轉移到其它的種中"。實際上，存在許多例子，其中特定代謝途徑或發育過程的分子生物學和生物化學，以及對植物進行遺傳改造而導致所述的代謝途徑或過程改變的可能性的研究，已經首先在模式植物擬南芥中進行了測試，然後表明能在其他的植物，特別是作物植物中產生類似的表型。根據本發明的方法，在植物中表達異源GPDH,導致植物的三醯甘油中脂肪酸含量改變。在油料種子中改變甘油脂的脂肪酸含量以獲得某些所需的特性常常是需要的。例如，對於供人類消費的油類，可能希望增加不飽和脂肪酸含量。為了其他的用途，增加飽和脂肪酸含量可能是合乎需要的。發明人已經發現，過量表達^W,基因的植物轉化體產生甘油脂，其具有增加的16碳脂肪酸比例和同時降低的18碳脂肪酸。由於GPDH與甘油脂合成的關係，本發明的方法特別適合用於產生油料種子的植物。術語"產生油料種子的植物"包括任何植物或作物植物，可以從其分離可銷售量的油。培育一些具有特別感興趣的脂肪酸組成的甘油脂的植物或作物植物，用於生產甘油脂，即使脂含量較低(例如，低於1wt%)。本發明的方法可用於這種植物，以改變甘油脂的脂肪酸含量。優選的植物或作物植物是那些種子脂含量至少為lwty。的植物或作物植物。油料種子作物植物的一些示例性例子如下(括號中給出了俗名)^oragooi77cj'/7a//51(玻璃苣)；芸苫屬("ras".a)物種，例:i口芥末,canola，；由菜，及ca/z;7esfr/51，及/7a/w51，及ra/a;大麻(大麻，在亞洲廣泛用作植物油)；紅花(紅花)；椰子樹(椰子)；6Vs/z76ea6/^S2'/7/ca(crambe);萼3巨花屬(Cwp力ea)物種(萼i巨花屬生產工業感興趣的中鏈脂肪酸)；f/aeis^;y"e/Wi(非洲油棕)；f/ae/s(美國〉'由標水司)；大豆(67yc//7e邁ai)(大豆)；Co5^/p/i/邁力ir/sfwz7(衝帛花一美國)；海島棉(Coi^7P7wz76ar^2f/e/se)(才帛花一埃及)；草本才帛力er6ace:/邁)(才帛花一亞洲)；^e7/a/^力^a/7/7i/27/cwz7)物種(小麥)和玉米(Zea忠a/ze)(玉米)。GPDH消耗MDH，並因此在保持健康細胞的氧化還原平衡中起重要作用。脅迫條件經常導致植物代謝，尤其是氧化還原狀態的擾亂。脅迫條件包括這樣的情況如乾燥，過分潮溼，過熱，過冷，過多的日照，和對植物的物理損害。這些因素會導致高於正常水平的NADH。過多的NADH會產生高濃度的活性氧中間體(ROS)，其對蛋白質和核酸是危險的，甚至會導致細胞死亡。提高的GPDH活性，如由本發明的方法誘導的，可提高植物保持細胞的氧化還原平衡的能力，從而導致對脅迫增強的耐受性。植物遭受的另一種類型的脅迫是滲透脅迫。當植物被迫在其中外部水供給具有異常高濃度的溶質的環境中生長時，這樣的情況就產生了。遇到的最常見的溶質包括鹽(尤其是NaCl)，不過，在汙染的區域，也可能遇到其他的溶質。本發明的方法導致轉化植物的組織中增加水平的甘油和/或甘油-3-磷酸。甘油用作滲透保護劑，允許轉化植物生長在通常不支持它的條件中。使用常規的遺傳工程技術可以將編碼GPDH活性的異源基因導入到植物的基因組中並表達。用於將基因插入到植物基因組中的最完善的方法是根癌土壤桿菌介導的轉化。將DM導入到植物中的本領域已知的其他技術包括電穿孔法，化學介導的DM吸收，和使用微粒。參考下面的實施例將對本發明進行更詳細的描述。這些實施例只是用於舉例說明本發明。實施例實施例I.分子生物技術。對使用的一些技術的概述，參見Ausebel等CurrentprotocolsinMolecularBiology,Vols1，2，3,(1995)NewYork:Wiley,引入這裡作為參考。實施例II.鑑定來自大腸桿菌菌林BB26R的w",基因的點突變。為了研究基因的結構，發明人合成了兩個引物，TTAGTGGCTGCTGCGCTC(GPSA3,SEQIDNO:3)和AACAATGAACCAACGTAA(GPSA5，SEQIDNO:4)，其分別與對應於^W基因的3'和5'端的序列互補。分別用分離自野生型大腸桿菌K12和菌抹BB26R的模板DM進行PCR擴增。根據Cronan等獲得擁有^W,等位基因的BB26R菌林。用QIAquickTMPCR純化試劑盒(Qiagen)純化PCR產物並完全測序。通過使用電腦程式DNAstarTM的序列比對來比較(野生型)和^W屍(突變型)的序列。實施例III.構建用於^^f的植物轉化載體。才艮據^W/"的序列設計引物GAGAGCTCTTAGTGGCTGCTGCGCTC(GPSA31,SEQIDNO:5)和GAAGAAGGATCCAACAATGAACCAACGTAA(GPSA51,SEQEDNO:6)。在GPSA31的5'末端，添加Sac/限制性位點，同時在GPSA5的5'末端添加化/z^/限制性位點。將該引物用於進行卯W/'序列的PCR擴增。用QIAquickPCR純化試劑盒(QiagenTM)純化PCR產物並用^c/Z^/z^/消化。將^c/Z5a/z^/消化的g/7^/"DNA片段隨後插入到土壤桿菌二元栽體pBI121(Clontech)中來置換含有GUS基因的5"ac//^/^/區域。得到的植物轉化栽體被命名為pGPSA-VI(2000年08月31保藏於美國典型培養物保藏中心，10801UniversityBlvd.,Manassa，VA20110-2209，保藏號PTA-2433)。pGPSA-VI中的^W/"基因表達盒含有由組成型35S啟動子驅動的W^屍編碼區域。它的3'末端的側翼為N0S終止子。pGPSA-VI中35S啟動子與^7^/"編碼序列之間的連接區通過測序得到證實。一旦該基因表達盒摻入到植物基因組中，^7^,蛋白因而將在所有的植物組織包括營養與生殖(種子)組織中表達。實施例IV.植物生長條件。挑選擬南芥作為植物宿主來測試^W"基因的影響，因為擬南芥被普遍公認為用於遺傳和生化研究的實驗室模式植物。而且，擬南芥在許多方面與canola如，例如，芸苔類似，並被認為是含油種子植物。用擬南芥進行的成功的遺傳操作可應用於其他的物種"。使所有的擬南芥對照和轉基因植物同時生長於人工生長室中，16小時螢光照明(150-200jaE/m/秒)，8小時黑暗，22°C，如之前所述19。實施例V.植物轉化。質粒pGPSA-VI通過電穿孔法導入到根瘤土壤桿菌菌林GV3101中，該菌林帶有輔助胭脂鹼質粒pMP90。使生態型哥倫比亞的野生型擬南芥植物生長於土壤中。將抽莒後1周的植物用帶有pGPSA-VI的根瘤土壤桿菌菌林GV3101的懸浮液真空滲入過夜2°。滲入以後，使植物生長至產生種子(T1)。大量收穫幹種子(T1)並在含有50mg/L卡那黴素的選擇培養基上篩選。選擇培養基上2至3周以後，將表現為綠色的卡那黴素抗性籽苗(T1)轉移到土壤中，允許其生長到成熟。收穫來自Tl植物的種子(T2)並在卡那黴素平板上萌發以測試分離比率。典型的單基因插入事件將引起3:1的卡那黴素抗性/敏感比例。為了進一步地證實wW屍基因的整合，從選擇的轉基因系分離DNA來用利用DNA製備的探針進行Southern印跡分析。還分離了總的RNA用於Northern分析以證實^W,基因的表植物種子或其後代，例如，植物的T1，T2和T3世代。實施例VI.脂肪酸分布分析。如Katavic等21所述從發育中的葉子分離脂類，並通過氣相色i瞽法對脂肪酸組成進行分析。實施例VII.植物對鹽度脅迫的耐受性分析。使用Apse等"報導的方案，對擬南芥生態型哥倫比亞(野生型)植物和過量表達^"/'基因的植物的耐鹽性進行了測定。栽有野生型植物和過量表達^W屍基因的4個轉基因系中的每個系(被命名為#7，#13，#54和#58)的盆被分成5組(標記為A到E)。植物被種植在4'盆中，每個盆都含有4個植物。使植物生長2周，培養液中僅含營養素(22g溶於80升水中的20:20:20植物營養素(PlantProductsCo.Ltd.,Canada),以確保甚至所有植物的生長。以後，每隔一天，以16天的澆灌方式，使用25ml稀釋的營養液。對照(A)組接受僅含營養素，而不補加NaCl的溶液。剩餘的組用補充有NaCl的營養液澆灌。NaCl補加的濃度每組每4天以50raM逐步增加，到所示的最大值(A)0mMNaCl，(B)50mMNaCl,(C)100mMNaCl，(D)150mMNaCl和(E)200mMNaCl。監控植物的表型，開花期，等等。用野生型和選擇的T3轉基因系的表面滅菌的擬南芥種子進行種子萌發分析，所述種子播種於含有20ml1/2MS培養基23，補加了B5維生素和2%蔗糖的培養皿中。為了進行鹽脅迫萌發測定，添加了各種濃度的NaCl。使培養物於22'C,在焚光燈，16小時光照和8小時黑暗下生長。在IO天的時段以後記錄種子萌發。胚根和子葉的出現被認為是萌發的證據。實施例VIII.^7^,基因具有在GPDH蛋白(gpsA2ffl)中改變一個胺基酸殘基的點突變。Kito和Pizer"最初對大腸桿菌中G-3-P的生物合成進行了研究。Cronan和Bell"將位於大腸桿菌遺傳圖語的染色體小片71上的基因座確定為生物合成的甘油-3-磷酸脫氫酶的結構基因。以前報導了大腸桿菌^W基因的核苷酸序列和推斷的胺基酸序列26。對磷脂生物合成突變體的生物化學研究表明，細胞水平的G-3-P必須被嚴密地調控，Bell(1974)，J.Bacteriol.117，1065-1076。大腸桿菌突變體，具有甘油-P醯基轉移酶，該酶對G-3-P的表觀蟁比正常的大腸桿菌高IO倍以上。隨後，鑑定了；〃"突變體的回覆子，BB26R。這些回復子的甘油-3-磷酸脫氫酶活性對G-3-P所致的反饋抑制的敏感性低大約20倍。這些反饋抗性^^4等位基因被命名為^W,。基於^^^r蛋白的分子機制是未知的。從菌林A5^fyT克隆^W,基因並確定它的核苷酸序列。序列分析表明，^W,與wW只有一個核苷酸鹼基不同。點突變，^W中的密碼子255的第3個核苷酸上的C取代為A(圖1)被發現於^W,基因中。該點突變導致甘油-3-磷酸脫氫酶酶蛋白中從Asp255(GAC)變為Glu255(GAA)。目前已經表明，與野生型wW基因相比，^pW屍基因含有一個點突變。發明人已經證明，該點突變是GPDH酶為什麼比野生型對G-3-P反饋抑制的敏感性低20倍的原因。因此，細胞的G-3-P能夠達到高於野生型能產生的水平。實施例IX.引入^7^/'基因到植物基因組中不影響植物發育。產生了很多^W,轉基因植物。這些轉基因植物(Tl)最初在補充有卡那黴素的1/2MS培養基中篩選卡那黴素抗性。在我們的培育條件下，所有的Tl轉基因植物似乎都不能與野生型擬南芥對照區別開來，而且當轉移到土壤中時，以與野生型植物的生長速度相同的速度發育。生育力和種子產量沒有受轉基因影響。因此證明了^7"^基因的整合對植物生長和繁殖沒有任何不利的影響。確定了就卡那黴素抗性而論來自Tl植抹的(T2)種子的分離比率。選擇轉基因系#7，#13，#54，#58用於進一步的研究，因為分離分析表明這些系是單插入的轉基因系。為了進一步地證實^W,基因摻入到植物基因組中，分別從#7,#13，#54，#58系的T3植物籽苗分離出基因組DNA。用3種不同的限制性內切酶消化的基因組DM的Southern分析表明，這些系含有單拷貝的^W,基因，而且轉基因是固有地穩定的(圖4)。用從這些系提取的RNA進行的Northern分析進一步證實了^7",基因在這些轉基因系中以高水平表達。因此，實現了將W^"基因引入到高等植物中並在高等植物中表達。實施例X.擬南芥^^4,轉化體具有改變的脂肪酸分布。從轉基因植物以及野生型對照的葉組織提取總脂類，以及使用氣相色鐠法對脂肪酸組成進行分析。為了最小化植物發育期間可能存在的任何差異，小心以確保收集的全部植物葉子處於相同的發育階段。用從幾抹野生型植物收集的葉子獲得了可重複的結果，從而證實野生型植物之間的脂肪酸分布沒有顯著差異。然而，來自擬南芥轉基因植物的葉子的數據表明，^7^"基因產物影響脂肪酸組成。如圖5所示，^7^屍轉基因植物一致地顯示出升高水平的16碳脂肪酸，和成比例地降低水平的18碳脂肪酸。具體地說，轉基因植物顯示出16:0脂肪酸2-5%的增加，和16:3脂肪酸大約1.5-3.5%的增加。伴隨地，18:2和18:3脂肪酸降低的範圍為2-5%(圖5)。轉基因植物與對照之間的差異也是明顯的，如果對總的16碳(16C)脂肪酸對總的18碳(18C)脂肪酸的比率進行比較。例如，在描述的生長條件下，轉基因系#58，系#13和系#54的16C/18C比率分別為0.53，0.6和0.68，而對照植物的比率為0.43。這種表型很可能是由轉基因植物中高GPDH活性產生的G-3-P增加的供給量的直接結果。它與Gardiner等以前的報導是一致的，其中當提高量的G-3-P供應給分離的質體時，在新合成的脂肪酸當中觀察到16C/18C脂肪酸的比例增加28。實施例XI.wW/"基因提高了植物的脅迫耐受性。如前面所述，GPDH消耗NADH並再生MD+。使細胞的NADH降低對線粒體呼吸和能荷具有有益的影響。GPDH參與細胞氧化還原狀態的控制，而且也許能降低可能損傷活性氧中間體的濃度。植物細胞已知在脅迫條件下經歷氧化裂解，因而常常導致細胞死亡。目前的研究揭示了""/'轉基因植物具有增強的耐鹽性。可以在不同的發育階段觀察到增強的耐鹽性。轉基因植物種子以與在1/2MS培養基上的非轉基因對照植物相同的頻率萌發(圖6，上面的畫面)。然而，在添加了鹽的培養基上(圖6，下面的畫面)，野生型僅僅萌發大約55%，而轉基因系#54，#58，#7和#13分別以90%,86%，87%和95%的比率萌發。用各種NaCl濃度進一步地評估系#13種子的萌發頻率。如圖7所示，在檢驗的所有NaCl濃度中，系#13種子一致顯示高於野生型植物種子的萌發率。用250mMNaCl觀察到最顯著的效果，其中低於40%的野生型種子萌發，而80%的系#13種子萌發。在兩種情況都不能從萌發的種子確定營養缺陷型生長。野生型擬南芥在含有175mMNaCl的培養基上萌發相當好(80%)。然而，籽苗生長和發育卻嚴重延遲。相反，轉基因植物的生長速率基本上較高。6周以後，野生型植物的葉組織發生萎黃病並最終死亡，而在相同的條件下，轉基因植物仍然保持相對健康的綠葉。還研究了生長於土壤中的植物的耐鹽性。發明人按照Apse等報導的處理方案"，其設計為模仿田間脅迫條件。如圖8所示，與野生型植物相比，轉基因植物顯示改進的生長和發育模式。用50mMNaCl反覆處理的大部分野生型植物出現嚴重地脅迫反應，葉片顏色變暗。相同的處理似乎沒有影響轉基因系的生長和繁殖。當應用含有100mM鹽的溶液時，野生型植物停止生長並最終死亡，而大多數轉基因植物發育成熟並產生種子。當實施一種澆灌方案以達到150raMNaCl的鹽濃度時，轉基因植物顯示明顯的脅迫表型，但是仍然能產生種子，雖然具有較短的角果和極少的種子產量。來自系#54的植物在測試的轉基因系當中顯示最高的鹽度。甚至當澆灌達到200raMNaCl的鹽濃度時，它們也產生種子。實施例XII.^W轉基因擬南芥具有提高的G3P含量。使擬南芥生態型哥倫比亞和gpsA轉基因植物在長日照條件(16小時光照/8小時黑暗光周期)下，在人工生長室(2rc白天/i6。c夜間，55%RH，和100jamol.nT2.s-1PAR)中生長3周。收穫蓮座葉，用於確定細胞的G-3-P含量。如圖9所示，gpsA植物的葉組織的G-3-P含量為野生型植物的3倍。實施例XIII.^W轉基因擬南芥在細胞膜脂類分布中具有降低的磷脂摩爾比。為了研究增加的G-3-P產生對甘油脂合成的影響，通過2-D薄層色譜法(TLC)分離主葉甘油脂種類，並在葉組織中分析它們的摩爾比和脂肪酸組成(標準生長條件，參見上面)。結果概括於表l中。表1*4《野J^(T"和^^橫差厲擬^^^^^類^應嚴凝i>C炎值4^"J個袢本^"f^值。_tableseeoriginaldocumentpage2316:1順式和16:1反式脂肪酸之和在^7"植物中，非磷脂分子，包括單半乳糖二醯甘油(MGDG),二半乳糖二醯甘油(DGDG)和硫脂(SL)的比例基本上都得到增加。另一方面，磷脂分子包括磷脂醯膽鹼(PC)，砩脂醯乙醇胺(PE)和磷脂醯肌醇(PI)以及磷脂醯甘油(PG)的含量全部被降低。磷脂對非磷脂的比例也降低(圖10)。從在甘油脂分子中檢測到的脂肪酸組成的改變可以推斷，質體原核生物甘油脂途徑對轉基因系中總的細胞膜脂合成的貢獻比對野生型對照中的更大。實施例XIV.標準生長條件下，^W轉基因擬南芥中的Pi含量沒有被降低。由於增加的G-3-P將不可避免地需要更多的P，Pi利用率在轉基因植物中有可能受到影響。通過與在標準條件下生長於土壤中的野生型植物相比較，分析轉基因系中的P含量來解決該問題。如圖11所示，轉基因植物實際上具有稍微增加的總P含量。重要地，無機P水平的提高几乎完全能解釋轉基因植物中P含量的稍微增加。有機P含量保持在與野生型植物相當的水平。因此，轉基因植物不處於一般的無機磷(Pi)限制脅迫下，並且這兩種甘油脂途徑改變的相對貢獻不是對Pi限制的代謝響應的結果。實施例XV.在Pi限制下在野生型植物中G-3-P和磷脂含量也顯示負相關。也確立了在野生型植物中存在Pi限制脅迫響應與細胞G-3-P代謝的表現相關。對在正常(足夠的P)與Pi限制條件下生長的野生型植物的G-3-P含量進行了比較。在無機P限制(0.1mM)條件下(與以lmM的Pi供給量相比較)，野生型植物的葉子中的G-3-P含量增加5x，圖12A。在Pi限制條件下，野生型和轉基因系都具有降低的磷脂含量。因此，在野生型和轉基因系中，細胞膜系統中的G-3-P含量與磷脂比率之間都存在負相關(圖12B)。實施例XVI.在Pi限制條件下，^w轉基因擬南芥生長增強。當在低Pi(0.lmM)培養基上直接萌發種子時，3周以後，^W轉基因擬南芥生長得比野生型植物好(圖13A)。而且，野生型植物顯示出紫色，其是在低Pi供給量下經常觀察到的花色素苷積累的指示，相比之下，gpsA系要好得多，其顯示出綠葉，而且沒有可見的花色素苷積累的徵兆。當對花色素苷含量進行定量時，發現野生型中的水平比^7^系中的水平高2-3倍(圖13B)。相比之下，野生型中的葉綠素含量比系低45%(圖13C)。這些結果表明，系沒有經歷與野生型植物相同程度的低Pi利用率。當將籽苗在正常Pi條件中種植10天並移植到低Pi培養基中再生長10天時，獲得了相似的結果。如圖14A所示，^W系表現出較高的生長速率。系的葉綠素含量比野生型植物的高50%(圖14C),並且系的花色素苷含量比野生型植物的低4倍(圖14D)。在低Pi條件下25天以後，系的表現趨勢仍然較好(圖14B)。當估算系的鮮重與乾重時，與野生型植物相比一致地存在40%到45%的增加(圖14E和14F)。已知在Pi限制條件下，植物積累澱粉。因此，當與gpsA植物進行比較時，在低Pi條件下，在野生型植物中觀察到較高水平的澱粉積累(圖14G)。當將植物在低Pi(4uM)(0.124ppm)條件下，在石棉中水培3周時，^W植物的鮮重與乾重也比野生型植物的高30%-70%(圖15B和15C)。而且，與野生型植物相比，在^7^葉子中檢測到較高水平的無機Pi含量(圖15D)。實施例XVII.當與野生型植物相比時，在Pi限制條件下擬南芥中內源G-3-P脫氫酶的缺乏導致受損的生長。通過篩選威斯康星大學現有的T-DNA標記群體，鑑定了帶有中斷擬南芥內源G-3-P脫氫酶基因，"6^/Wc/的T-DNA插入的擬南芥突變體"^7Wc/-7(生態型Wassilewskija)。該突變體具有G-3-P脫氬酶活性，因此其細胞G-3-P的含量甚至低於野生型植物的水平。不過該突變體對Pi飢餓將是超敏感的，而且當Pi是限制性的時，表現比野生型植物差。確定了在低Pi條件下a^/7必cW突變系的生長，如圖16A所示，具有顯著降低的總G-3-P含量，其在atgpdhcl突變體的籽苗和根中檢測到。該降低也與相較於對照植物Ws降低的生長速率相關。60天以後，a^;c^c/突變體全部死亡，但是它們的對照植物Ws仍然是有生活力的，雖然產生嚴重的脅迫反應。實施例XVIII.在Pi限制條件下，^W轉基因Canola的生長增強。A/7a/"iT是一種世界上重要的油料作物植物，而且canola高產所需的磷大於小麥或大麥。因此，產生了具有gpsA基因構建體的轉基因canola，並估價其在低Pi耐受性方面的表現。如圖17A和17B所示，當植物在沙培中經受低Pi條件時，canola植物顯示出比野生型對照明顯的生長優勢，還較早到達開花期。重要地，canola植物的種子產量基本上高於野生型植物(圖17B)。引入^W基因到canola中對於低Pi生長的益處通過水培得到進一步證實。與沙培類似，canola植物長出更好的莖和葉片；開花早(圖18A和18B);而且在10juM(0.31ppm)和50pM(1.55ppm)(低)Pi條件下，gpsA植物的種子產量都高50-100%(圖18C)。寒冷氣候下土壤磷的充足供應量已經公認是植物在早期生長階段形成強壯的，健康的根系的主要限制因素，其將承受從頭到尾使用水分和養分的後果。促進早期營養生長和較大籽苗的發育因此是重要的農學性狀。此外，早期生長導致更早而且更一致的開花，因此增進較高產量的莢果和種子發育，也更能經受住來自生物和非生物脅迫的脅迫。土壤溫度是早期籽苗生長的一個關鍵因素，通常，溫度低於10'C導致逐漸較差的萌發和突出體。確定了canola籽苗對組合的低Pi和低溫條件的響應。如圖19A所示，canola以與提高的建立早期生長能力一致的方式長出較大的籽苗。在低Pi和低溫條件下，在gpsA籽苗中存在比野生型植物增加25-45%的籽苗長度和鮮重(圖19B和19C)。實施例XIX.在細菌中鑑定^7^基因。使用電腦程式DNAsta,或blast程序，其是已知的而且很容易從網際網路上可用的國家生物技術信息中心(NCBI)購買到，通過序列比對，鑑定與大腸桿菌^W基因同源的^W基因的序列。實施例XX.用於其它細菌的^W基因的植物轉化載體的構建。將引物TTAGTGGCTGCTGCGCTC(GPSA3，SEQIDNO:3)和AACAATGAACCAACGTAA(GPSA5，SEQIDNO:4),其分別與對應於大腸桿菌中^W基因的3'和5'末端的序列互補，用於使用從包含野生型^W基因的弗氏志賀氏菌，鼠傷寒沙門氏菌，腸沙門氏菌，鼠疫耶爾森氏菌，假結核耶爾森氏菌，粘質沙雷氏桿菌，屍力Wor力fl6crM/M7/7e"e/^和胡蘿蔔軟腐歐文氏菌的菌林分離的模板DNA進行PCR擴增。用QIAquickPCR純化試劑盒(Qiagen)純化PCR產物並完全測序。實施例XXI.植物轉化載體的構建。將引物GAGAGCTCTTAGTGGCTGCTGCGCTC(GPSA31，SEQIDNO:5)和GAAGAAGGATCCAACAATGAACCAACGTAA(GPSA51,SEQIDNO:6)，其分別與大腸桿菌中^W基因的3'和5'末端互補，而且在GPSA31的5'末端含有Sacl限制性位點以及在GPSA5的5'末端含有&邊#/限制性位點，用於PCR擴增弗氏志賀氏菌(SEQIDNO:7)，鼠傷寒沙門氏菌(SEQIDNO:9)，腸沙門氏菌(SEQIDNO:11)，鼠疫耶爾森氏菌(SEQIDNO:13)，假結核耶爾森氏菌(SEQIDNO:15)，粘質沙雷氏桿菌(SEQIDNO:17)，戶.7咖/z7e"e/7S(SEQIDNO:19)和胡蘿蔔軟腐歐文氏菌(SEQIDNO:21)的序列。用QIAquickPCR純化試劑盒(Qiagen)純化PCR產物並用5^c/Z^yz^/消化。將"a/z^/消化的^W,DNA片段插入到土壤桿菌二元載體pBI121(Clontech)中，由此置換GUS基因的區域。得到的植物轉化載體包含含有弗氏志賀氏菌，鼠傷寒沙門氏菌，腸沙門氏菌，鼠疫耶爾森氏菌，假結核耶爾森氏菌，粘質沙雷氏桿菌，屍./M〃'/7escew和胡蘿蔔軟腐歐文氏菌的g/7W編碼區的表達盒，其由組成型35S啟動子驅動。它的3'末端的側翼為N0S終止子。35S啟動子與^^4編碼序列之間的連接區通過測序得到進一步證實，每個載體都含有弗氏志賀氏菌，鼠傷寒沙門氏菌，腸沙門氏菌，鼠疫耶爾森氏菌，假結核耶爾森氏菌，粘質沙雷氏桿菌，屍.hy^'/e"e/^和胡蘿蔔軟腐歐文氏菌的^W編碼區。弗氏志賀氏菌(SEQIDNO:8),鼠傷寒沙門氏菌(SEQIDNO:10)，腸沙門氏菌(SEQIDNO:12)，鼠疫耶爾森氏菌(SEQIDNO:14)，假結核耶爾森氏菌(SEQIDNO:16)，粘質沙雷氏桿菌，(SEQIDNO:18)，戶./願'腳ce"s(SEQIDNO:20)和胡蘿蔔軟腐歐文氏菌(SEQIDNO:22)的gpsA蛋白，因此在植物組織包括營養和生殖(種子)組織中得到表達，一旦該基因表達盒被摻入到植物基因組中。實施例XXII.植物生長條件。將擬南芥和canola選作為植物宿主用於測試弗氏志賀氏菌，鼠傷寒沙門氏菌，腸沙門氏菌，鼠疫耶爾森氏菌，假結核耶爾森氏菌，粘質沙雷氏桿菌，戶.7i/邁/"e"e/7s和胡蘿蔔軟腐歐文氏菌的基因，以及具有保守突變的^7^4基因的影響。使所有的擬南芥和canola對照以及轉基因植物，同時生長在人工生長室中，在16小時螢光照明(150-200mE/ra/秒)，8小時黑暗，22。C條件下，如之前所述19。實施例XXIII.植物轉化。將含有弗氏志賀氏菌(SEQIDNO:7)，鼠傷寒沙門氏菌(SEQIDNO:9)，腸沙門氏菌(SEQIDNO:11)，鼠疫耶爾森氏菌(SEQIDNO:13)，假結核耶爾森氏菌(SEQIDNO:15)，粘質沙雷氏桿菌(SEQIDNO:17)，屍./"/n//2esce"s(SEQIDNO:19)和胡蘿蔔軟腐歐文氏菌(SEQIDNO:21)中的每個的g/7W基因及其保守性突變的質粒，通過電穿孔法，引入到根瘤土壤桿菌菌林GV3101中，該菌株帶有輔助胭脂鹼質粒pMP90。培育生態型哥倫比亞的野生型擬南芥植物和canola。在抽莒後1周，植物用帶有該質粒的根瘤土壤桿菌菌林GV3101的懸浮液真空滲入過夜，所述質粒含有弗氏志賀氏菌(SEQIDNO:7)，鼠傷寒沙門氏菌(SEQIDNO:9)，腸沙門氏菌(SEQIDNO:11)，鼠疫耶爾森氏菌(SEQIDNO:13)，假結核耶爾森氏菌(SEQIDNO:15)，粘質沙雷氏桿菌(SEQIDNO:17)，戶./麵'腳ce/zs(SEQIDNO:19)和胡蘿蔔軟腐歐文氏菌(SEQIDNO:21)中每個的基因及其保守性突變。滲入以後，使植物生長產生種子(T1)。大量收穫幹種子(Tl)並在含有50mg/L卡那黴素的選擇培養基上篩選。選擇培養基上2到3周以後，將表現為綠色的卡那黴素抗性籽苗(T1)轉移到土壤中，允許其生長到成熟。收穫來自T1植物的種子(T2)並在卡那黴素平板上萌發，以測試分離比率。典型的單基因插入事件引起3:1的卡那黴素抗性/敏感比例。為了進一步證實gpW基因的整合，從選擇的轉基因系分離DM並用利用DM製備的探針進行Southern印跡分析。還分離了總的RNA用於Northern分析以進一步證實弗氏志賀氏菌(SEQIDNO:7)，鼠傷寒沙門氏菌(SEQIDNO:9)，腸沙門氏菌(SEQIDNO:11)，鼠疫耶爾森氏菌(SEQIDNO:13)，假結核耶爾森氏菌(SEQIDNO:15)，粘質沙雷氏桿菌(SEQIDNO:17)，屍."/^'"esce/^(SEQIDNO:19)和胡蘿蔔軟腐歐文氏菌(SEQIDNO:21)中每個的基因及其保守性突變的表達。實施例XXIV.在無機P限制條件下，^7sA轉基因擬南芥和Canola的生長。使含有弗氏志賀氏菌(SEQIDNO:7)，鼠傷寒沙門氏菌(SEQIDNO:9)，腸沙門氏菌(SEQIDNO:11)，鼠疫耶爾森氏菌(SEQIDNO:13)，假結核耶爾森氏菌(SEQIDN0:15)，粘質沙雷氏桿菌(SEQIDNO:17)，戶./"邁/j3e"e/^(SEQIDNO:19)和胡蘿蔔軟腐歐文氏菌(SEQIDNO:21)的基因及其保守性突變的轉基因野生型擬南芥生態型哥倫比亞植物和canola生長於具有降低的P含量(小於20ppm)的土壤中或生長於低Pi培養基(O.lraM)(大約3.1ppm)上。3周以後，比較野生型植物與轉基因植物的生長，並對花色素苷含量和葉綠素含量進行定量。植物還在低Pi(4juM)(大約0.124ppm)條件下，在石棉上水培3周。也測定野生型與轉基因^p^植物的鮮重，乾重和無機Pi含量。儘管已經用各種示例性實施方案對本發明進行了說明和描述，但是對本發明所屬領域的普通技術人員來說顯而易見的各種添加，刪除和修改，即使這裡沒有說明或具體描述，也認為屬於下面的權利要求所包含的本發明的範圍內。而且，不同的實施方案的特徵或要素可以組合應用。'Gee"a厶，(1988)屍/aW力"/oA86，98—103;Geeefa人，(1988)/Va"r腳Wo/.87，379-383.2Kirsha/.，(1992)屍/fl/7f戶力j^2'o/.100，352—359.3HsuandFox(1970)/.Aa"e/7a人103，410-416;Bell(1974)/.AaCeW".117，1065-1076.4Ansell"，(1997)，層(9/.16，2179-2187.5Brown(1990)，in#/cor6/a7^"er57res/.16，2179-2187.8HusicandTolbert，(1986)，戶/a/7f戶力"/o人82，594-596;Ben-AmotzandAvron，(1983)，We「#/cro&2'o7.37，95-119.9Hausmann，(1995).屍/a/"/;2#efa6o"^77,aader，/.,a/d他z7/化？.,e&)，pp53-536，f7w^er爿catoz/c10BellandCronan(1975)，/.Oe瓜250，7147-7152.11DatlaRS，HammerlindiJK,PanchukB,PelcherLE，KellerW.(1992).#od///7ed62./7ar7/7a/7ffra/7S屍oi7i7at/o/rectorsK/f力f力efr//cT-0^ege/2ee/7cof/2./7g,.Ce/7e122:383-384.12FrischDA，Harris-HailerLW,YokubaitisNT，ThomasTL，HardinSH,HallTC.(1995).Co邁p7efese《i/e/ceo屍f力e6//ar/rector"/'/l夕,'.戶/a"f#0/^/oJ27:405—409.13RoeslerK,ShintaniD，SavageL，BoddupalliS，0hlroggeJB(1997)rargef//7goff力e爿ra62'i/0/^/51Ao/wower/c/Va//1腳W。7113:75-81.14Meyerowitz，E.M.andChang,C.(1985)#o7eci//ar6/0/0^70//7e/7咖屍ress,,，pp.353-366.15Meyerowitz,E.M.(1987)爿Ta62'd0/^/st力a/ia/a.爿/7/7.TeF.21:93-111.16Goodman,H.M.，Ecker,J.R.andDean，C.(1995)r力egei3麵Jrad/do;^/^f力a/2'a刀a.戶roc.Sc厶^S^92:10831-10835.17Lagercrantz,U.，Putterill，J.，Coupland,G.andLydiate，D.(1996)C0卿ar"/7e/z7a/7///^//7Jra620;7s/sa"d5ra^/ca，/7"e/Vo,/跟屍/a/^/.9:13-20.18seeforexample:Zouefa/.，UnitedStatesPatentNo:6,051,755，April18，2000.19Katavica人，(1995)，戶/a/7f戶Am'o/.108，399—409.2。Bechtolds"a/.,d.5W.戶ar2乂5We/ces/aWe/"屍e"/e腳s316，1194-1199.21Katavica入，(1995)屍/a/^戶A)^2'0/.108:399—409.22Apse"a7.，(1999)5We腳285，1256-1258.23MurashigeandSkoog(1962)，屍力;^2'o/屍/a/^15:473—497,24JA/o厶(1969)，244，3316—3333.25CronanandBell;(1974)，1.^Ce,/o人118，598-605.26YeandLarson(1988)，/."acfen'a人，170，4209-4215.27BellandCronan(1975)，丄Sio入C力e邁.250，7147-7152.28Gardinera7.,(1982)，P/a/^屍力/Wo人70，1316—1320.29Apse"a/.，(1999)S".e腳285，1256-1258.權利要求1.一種收穫轉基因種子的方法，該方法包括種植轉基因植物，植物種子或其後代；其中該轉基因植物，植物種子或其後代具有摻入基因組中的編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的工具；使轉基因植物，植物種子或其後代生長到成熟；和從成熟的轉基因植物，植物種子或其後代收穫種子。2.權利要求1的方法，進一步包括用編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的工具轉化植物細胞，以產生轉基因植物，植物種子或其後代。3.權利要求2的方法，進一步包括選擇用編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的工具轉化的植物細胞。4.權利要求1的方法，其中使轉基因植物，植物種子或其後代生長到成熟進行至少60天。5.權利要求1的方法，其中將轉基因植物，植物種子或其後代種植在具有降低的磷含量的土壤中。6.權利要求5的方法，其中該土壤的磷含量為低於20ppm的磷。7.權利要求l的方法，進一步包括從收穫的種子提取油。8.通過權利要求7的方法生產的油。9.權利要求1的方法，其中編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的工具包括原核生物來源的核苷酸序列。10.—種轉基因canola植物，種子或其後代，包含基因組；整合到該基因組中的編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的工具；和與編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的工具可操作地連接的啟動子。11.權利要求10的轉基因canola植物，種子或其後代，其中編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的工具是原核生物來源的核苷酸序列。12.權利要求10的轉基因canola植物，種子或其後代，其中編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的工具是細菌來源的核苷酸序列。13.權利要求10的轉基因canola植物，種子或其後代，其中編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的工具包含原核生物來源的核苷酸序列。14.一種配置用於裝運權利要求10的轉基因canola植物，種子或其後代的容器，其中該容器帶有指導轉基因canola植物，種子或其後代的用戶使該轉基因canola植物，種子或其後代生長所必需的磷含量的說明。15.—種用於生產植物，植物種子或其後代的系統，包括具有降低的礴含量的土壤；和具有整合到該轉基因植物，植物種子或其後代的基因組中的異源基因的轉基因植物，植物種子或其後代，該異源基因編碼甘油-3-磷酸脫氫酶；其中該轉基因植物，植物種子或其後代能在具有降低的磷含量的土壤中生長大約60天。16.權利要求15的系統，其中編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的異源基因包含原核生物來源的核苷酸序列。17.權利要求15的系統，其中編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的異源基因包含細菌來源的核苷酸序列。18.權利要求15的系統，其中該具有降低的磷含量的土壤的磷含量為低於大約20ppm的磷。19.一種用於降低使作物植物生長所需的磷含量的方法，該方法包括獲得具有整合到該轉基因作物植物，植物種子或其後代的基因組中的異源基因的轉基因作物植物，植物種子或其後代，該異源基因編碼甘油-3-磷酸脫氫酶；其中該轉基因作物植物，植物種子或其後代能在具有降低的磷含量的土壤中生長至少60天；和種植該轉基因作物植物，植物種子或其後代。20.權利要求19的方法，其中編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的基因包含原核生物來源的核苷酸序列。21.權利要求19的方法，其中將轉基因植物，植物種子或其後代種植在磷含量低於大約20ppm磷的土壤中。22.—種生長在田地中的作物植物，該作物植物包括至少一種含有整合到基因組中的編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的工具的轉基因植物，其中編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的工具與啟動子可操作地連接，其中該作物植物能在具有降低的磷含量的土壤中生長至少60天。23.—種在磷含量降低的土壤中培育植物的方法的改進，所述的磷含量降低的土壤的平均磷含量低於20ppm，該改進包括培育該植物，一種通常在這種磷含量降低的土壤中存活不超過60天的商業上有價值的植物，但是與非遺傳修飾植物相比，已經對該植物進行了遺傳修飾，以在該遺傳修飾植物的基因組中包含編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的異源基因，以便該遺傳修飾植物能在所述的磷含量降低的土壤中生長超過60天。全文摘要公開了對於外源甘油-3-磷酸脫氫酶而言為轉基因的植物，該植物具有提高的磷利用，以及生產該植物的方法，和在磷含量降低的土壤中培育該植物的方法。與野生型相比，轉基因植物具有提高水平的甘油-3-磷酸，其導致提高的脅迫耐受性，甘油酯中改變的脂肪酸含量以及對磷缺乏土壤的耐受性。文檔編號C12N15/82GK101193550SQ200680020827公開日2008年6月4日申請日期2006年4月26日優先權日2005年5月4日發明者W·凱勒,沈文雲,鄒吉濤申請人:加拿大國家研究委員會