對生物學粒子進行分類的裝置以方法

2023-05-06 07:09:36

專利名稱：對生物學粒子進行分類的裝置以方法
技術領域：
本發明涉及一種取得生物學粒子(例如細胞、染色體)的生物學信息、並基於所取得的生物學信息對粒子進行分類的裝置和方法。本發明尤其涉及一種流量檢查計量器與細胞分類器，其以層流狀態使採用螢光色素等被染色的細胞或染色體流動，檢測出對該流動照射雷射等光而得到的信息光(雜光、螢光)，並將檢測出的信息光中所包含的光學信息變換為電信號，來取得細胞或染色體的生物學信息，並且根據需要，基於該生物學信息而提取特定的細胞或染色體集團。
背景技術：
伴隨著生物工藝學(biotechnology)的發展，在醫學與生物學等領域中廣泛使用進行細胞與染色體等(以下稱作「細胞」)的自動分析以及分類的流動式細胞分析裝置(流量檢查計量器)。該流動式細胞分析裝置使作為分析對象的細胞粒子，在作為細胞排列機構的流路內以一列流動，對該流動而來的粒子照射雷射，並檢測出由粒子生成的信息光(前方雜光、螢光和側方雜光)將其變換成電信號，基於這些電信號來對細胞進行分析，其能夠對多數的細胞進行高速分析，並根據需要可以提取特定的細胞集團。
圖16是用於說明一般的流量檢查計量器的構成和其動作的模式圖。在該圖所示的流量檢查計量器200中，位於容器中且包含細胞的懸濁液201與其他容器中的防護(sheath)液202一同由抽氣機203導入到漏鬥狀的流動室(噴嘴)204。在流動室204的內部，形成了防護液202將懸濁液201包圍成圓筒狀的層流，即，使細胞沿著流槽(flow cell)的中心軸逐一正確流動的防護流。在流動室202的下部形成防護流的高速流，對該處照射從雷射源205射出並由聚焦透鏡206會聚的雷射207。懸濁液201所包含的細胞大多被螢光染料或螢光標記單克隆抗體(モノクロナ一ル)等的螢光物質進行了螢光標識。因此，在細胞從雷射207中經過時，會產生雜光和螢光。
雜光經過由聚焦透鏡208和光線區域209構成的聚焦光學系統，被例如光敏二級管等檢測器210檢測出。另一方面，對於螢光而言，紅色螢光被收集到由聚焦透鏡211、半透半反鏡212、聚焦透鏡213、濾光器214構成的聚焦光學系統，由光檢測器215檢測出，另外，綠色螢光從半透半反鏡212被收集到聚焦透鏡216、濾光器217，由光檢測器218檢測出。通常，螢光的檢測器215、218採用能夠檢測出微弱光的光電子增倍管。來自對雜光進行檢測的檢測器210、對紅色螢光進行檢測的光檢測器215以及對綠色螢光進行檢測的檢測器218的信號，分別被輸送到信號處理電路219，在這裡通過對雜光和螢光的強度進行分析來進行細胞的同定。
如圖17所示，信號處理電路219的同定結果被發送到充電部220。充電部220在被同定後的細胞到達防護流下端的分離點(break off point)221而形成包含所同定的細胞的液滴之前，即，在到達防護流線段的分離點221而形成液滴之前，基於同定結果對懸濁液201和防護液202施加規定極性的電荷。結果，在分離點221從防護流分離的液滴被賦與規定極性的電荷。帶電荷的液滴，在配置於分離點221下方且被施加不同極性的電荷的一對電極222、223之間，被電吸引而偏向二者中的一方，由此，被分類到分別配置在電極222、223下方的搜集管224或225中。(例如參照專利文獻1～4)專利文獻1特開昭59-643號公報專利文獻2特開昭59-184862號公報專利文獻3特開昭60-195436號公報專利文獻4特表平3-503808號公報這樣，在流量檢查計量器中，所檢測出的細胞的高度(level)(檢測位置)與對所檢測出的細胞賦與電荷的高度(level)(電荷位置)不同。因此，在啟動流量檢查計量器之前，需要正確測定從檢測位置到電荷位置的距離，並將其作為裝置的固有值而輸入。可是，最佳的電荷位置會隨著液體(懸濁液和防護液)的粘度與溫度以及噴嘴的狀態而變化，由此，存在著分類精度會降低的問題。另外，為了計測出從檢測位置到電荷位置的距離而設置照相機，能夠通過上下移動該照相機對從檢測位置到電荷位置的距離進行檢測，但是這樣的作法需要設置對照相機進行升降的機構，因此，該方法會使作業變得極其繁雜。

發明內容
鑑於此，本發明的裝置對包含生物學粒子的液體流照射光，檢測出來自該生物學粒子的光，由此取得該生物學粒子的生物學信息，並基於所取得的生物學信息對生物學粒子進行分類，包括光檢測部，檢測出來自上述生物學粒子的光；攝影部，對上述流和從該流分離的液滴進行攝像；將由上述攝影部所拍攝的流圖像作為基礎，計算出從上述光檢測器檢測來自生物學粒子的光的檢測位置到上述流下端位置的距離，和從上述流分離的液滴的間隔，並且，利用上述距離和間隔計算出上述粒子從檢測位置移動至下端位置的時間的機構；和在上述光檢測器檢測出來自生物學粒子的光之後，間隔上述計算出的時間，將與上述生物學粒子的性質對應的極性的電荷施加給上述流的機構。
另外，其他方式的裝置基於生物學粒子的生物學信息對生物學粒子進行分類，包括流路形成部，其形成隔開規定間隔配置了上述生物學粒子的液體流，並且噴射上述流而形成包含上述生物學粒子的液滴；照明部，其對上述流所包含的生物學粒子進行照明；檢測部，其檢測出從上述生物學粒子發出的光；攝影部，其對上述流和從上述流分離的液滴進行拍攝；從由上述攝影部所拍攝的流圖像，計算出從上述光檢測器檢測光的檢測位置到上述流下端位置的距離，和從上述流分離的液滴的間隔，並且，將上述距離和間隔作為基礎，計算出上述流從檢測位置移動至下端位置的時間的機構；處理部，其從由上述檢測部檢測出的光得到上述生物學粒子的生物學信息；在上述光檢測器檢測出光之後，延遲上述計算出的時間，基於由上述處理部得到的上述生物學粒子的生物學信息，向對應的上述生物學粒子賦與電荷的機構；和利用對上述生物學粒子施加的電荷，使包含上述生物學粒子的液滴的滴落方向發生偏向的機構。
本發明其他方式的裝置，對包含生物學粒子的液體流照射光，檢測出來自該生物學粒子的光，由此取得該生物學粒子的生物學信息，並基於所取得的生物學信息對生物學粒子進行分類，包括光檢測部，其對來自上述生物學粒子的光進行檢測；振動發生器，其對上述流施加振動；攝影部，其對上述流和從該流分離的液滴進行拍攝；利用由上述攝影部所拍攝的圖像，檢測出在流下端位置和最靠近其的液滴之間形成的小液滴的大小的機構；和根據上述小液滴的大小控制上述振動發生器的振動大小的機構。
本發明對生物學粒子進行分類的方法包括形成包括上述生物學粒子的液體流的工序；對上述流所包含的生物學粒子照射光的工序；檢測出來自上述生物學粒子的光的工序；將上述檢測出的光作為基礎，取得上述生物學粒子的信息的工序；對上述流和從該流分離的液滴進行攝像的工序；從上述流的攝影圖像，求出上述光的檢測位置與上述流下端位置之間的距離以及上述流所包含的生物學粒子的間隔，並利用上述距離和間隔，計算出上述液體以及生物學粒子從上述檢測位置移動至下端位置的時間的工序；在檢測出來自上述生物學粒子的光，經過上述計算出的時間之後，基於上述生物學粒子的信息對上述流注入電荷的工序；以及以上述被注入的電荷為基礎，對從上述流分離的液滴進行分類的工序。
本發明其他方式的方法，對包含生物學粒子的液體流照射光，檢測出來自該生物學粒子的光，由此取得該生物學粒子的生物學信息，並基於所取得的生物學信息對生物學粒子進行分類，包括檢測出來自上述生物學粒子的光的工序；對上述流賦予振動的工序；對上述流和從該流分離的液滴進行攝影的工序；利用上述所拍攝的圖像，檢測出在流下端位置和最靠近其的液滴之間形成的小液滴大小的工序；和根據上述小液滴的大小控制上述振動大小的工序。
根據具備這樣構成的裝置和方法，可以固定攝像機構。因此，裝置的構成變得簡單。而且，提高了生物學粒子的分類精度。


圖1是表示本發明所涉及的裝置的光學要素的圖。
圖2是表示本發明所涉及的裝置的流體力學結構的側視圖。
圖3是將圖1所示的裝置的檢測流路和配置在其附近的光纖的一部分放大了的放大橫剖面圖。
圖4是將圖1所示的裝置的檢測流路和配置在其附近的光纖的一部分放大了的放大縱剖面圖。
圖5是圖1所示的裝置的電路圖。
圖6是表示防護流的放大正視圖以及照相機的攝影圖像的圖。
圖7是將對攝影圖像進行數據處理之後的像素數表示於橫軸的圖。
圖8是將附屬(satellite)滴落物的像素數表示於橫軸的圖。
圖9是λ檢測處理的流程圖。
圖10是檢測出分離點的流程圖。
圖11是檢測出附屬滴落物大小的流程圖。
圖12是表示向容器供給樣品液和防護液的裝置的圖。
圖13是樣品液容器或者樣品液容器的剖視圖。
圖14是表示檢測裝置中的分光濾光器的配置的圖。
圖15是表示檢測裝置中的分光濾光器的優選配置的圖。
圖16是表示得到生物學粒子的生物學性質的現有裝置的立體圖。
圖17是用於說明生物學粒子的分類的圖。
圖中1-裝置，2-流路形成構件(流路塊)，41-防護流，5-照明部，6-第一雷射發生器，7-第二雷射發生器，8-第一雷射，9-光纖，11-聚焦透鏡，12-第二雷射，13-光纖，14-光束擴展器，15-聚焦透鏡，21-第一檢測部，22-聚焦透鏡，23-光檢測器，24-信號處理部，25-第二檢測器，90-分類裝置，110-液滴控制部，112-固定照相機，113-閃光燈，114-視頻數位化儀，117-中央控制部，118-振動發生器驅動部，119-閃光燈驅動部，120-充電控制部，121-滴落延遲控制部，133-液滴，134-附屬滴落物。
具體實施例方式
下面，參照附圖，對本發明所涉及的作為得到生物學粒子信息的裝置的實施方式，即流量檢查計量器進行說明。
(1)光學要素圖1表示流量檢查計量器的光學要素。如該圖所示，流量檢查計量器1具有流路塊(流路形成部)2(參照圖2)，該流路塊2形成了包含被螢光染料以及螢光抗體染色的生物學粒子(細胞或染色體)的液體(通常由包含細胞的懸濁液和防護液構成)所流過的微細流路。對在形成於流路塊2的流路3中流過的防護流(流動)4照射光的照明部5，具備多個激勵光源。這些多個光源優選利用產生不同波長雷射的雷射發生器。例如，在本實施方式中具備3個激勵光源，作為第一光源使用產生波長為488nm的第一雷射(氬雷射)的第一雷射發生器6A，作為第二光源使用產生波長為635nm的第二雷射(氦氖雷射)的第二雷射發生器6B，作為第三光源使用產生波長為375nm的第三雷射(紫外線雷射)的第三雷射發生器6C。
照明部5還具備用於將從第一～第三雷射發生器6A～6C射出的第一～第三雷射8A～8C導入到防護流4的光纖9A～9C、光束擴展器10A～10C，從雷射發生器6A～6C射出的雷射經由光纖9A～9C由光束擴展器10A～10C調整之後，經由兩個反射/透射鏡11b、11c而被合成，由一個聚焦透鏡12聚焦至防護流4。
在流路塊2的相反側形成有第一檢測裝置21，用於對在流路塊2內的流路流過的粒子照射的光的前方雜光(信息光)進行檢測。該第一檢測裝置21與參照圖16而說明的現有流量檢查計量器同樣，具備聚焦透鏡22、光檢測器23，通過聚焦透鏡22將來自細胞的前方雜光聚焦於光檢測器23。光檢測器23與信號處理部24連接，由光檢測器23所檢測出的信號被發送到信號處理部24進行處理。信號處理部24中的信號處理將在後面敘述。另一方面，對細胞的螢光和側方雜光(信息光)進行檢測的第二檢測裝置25，具備分別對第一雷射8A～第三雷射8C的螢光和側方雜光進行檢測的第一光纖26A～第三光纖26C，這些第一～第三光纖26A～26C的一端分別被固定在與第一～第三雷射8A～8C的聚光高度對應的位置(參照圖4)。第一～第三光纖26A～26C的另一端分別經由光纖連接器27A～27C與第一～第三分光器28A～28C光連接。
第一～第三分光器28A～28C，具備對從第一～第三光纖26A～26C輸出的光進行分光的一個或多個分光濾光器(半透半反鏡)30A～30C。這些多個分光濾光器30A～30C具有反射和透過分別預先確定的頻率區域的波長的功能。另外，對於光行進方向而言，在分光濾光器30A～30C的下遊側配置有帶通濾波器31A～31C，所述帶通濾波器31A～31C用於從由各分光濾光器反射的光中選擇性地僅透過特定波長區域的光。並且，與光的行進方向相關地，在多個帶通濾波器31A～31C的下遊側設置有多個光檢測器32A～32C(SSC，FL1～FL8)，用於檢測出透過各帶通濾波器之後的信息光(與側方雜光和規定的螢光色素對應的螢光)。
根據如此構成的流量檢查計量器1，由第一～第三雷射發生器6A～6C生成的第一～第三雷射8A～8C，經由光纖9A～9C、光束擴展器10A～10C、聚焦透鏡12，由在流路塊2的流路3內流過的防護流4導光，聚焦於粒子。此時，由於雷射8A～8C具有不同的波長，所以，在如圖所示那樣由一個聚焦透鏡12進行聚光的情況下，會產生因波長差而引起的軸上色像差。因此，在實施方式中，為了消除因該波長差而引起的軸上色像差，根據第一～第三雷射8A～8C的波長，分別由光束擴展器10A～10C將原本應該是平行光的雷射8A～8C稍微調整為非平行光，利用聚焦透鏡12將調整後的雷射聚焦於目標場所。
由防護流4搬送的生物學粒子被預先確定的多種螢光色素或螢光抗體染色。而且，在入射光的前方漫射的前方雜光被第一檢測裝置21的聚焦透鏡22聚焦，入射到光檢測器23，由該光檢測器23讀取前方雜光所包含的光信息，並變換成對應的電信號。從被第一雷射8照射後的粒子發出的側方雜光和螢光，分別由配置在入射光側方的第二檢測裝置25的第一～第三光纖26A～26C接收。由光纖26A～26C接收的光經由光纖連接器27A～27C被發送至第一～第三分光器25A～25C，在這裡由分光濾光器30A～30C分解成多種光之後，經由帶通濾波器31A～31C由光檢測器32A～32C進行檢測。分光檢測器32A～32C(SSC，FL1～FL8)僅檢測出通過了帶通濾波器31A～31C的不同波長區域的光。在如上所述由光檢測器32A～32C所檢測出的光，被變換成與該光所包含的信息對應的電信號後，被發送至信號處理部24進行處理，處理後的信號被用於粒子生物學性質的同定和後面所說明的分類處理。
(2)流體力學的要素對流量檢查計量器的流體力學要素進行說明。圖2是模式地表示流量檢查計量器1的層流形成容器40和連接在該容器40下端部的流路塊2的圖。如該圖所示，容器40大致同心具備上部的大徑圓筒部41、下部的小徑圓筒部42、連接這些大徑圓筒部41和小徑圓筒部42的傾斜部43，並在內部形成有層流形成室44。容器40的上端部與防護液供給部45連接。在容器40的頂部固定有沿著容器40的中心軸而延伸的鞘管47，與供給部48連接的供給管49被插入於鞘管47，所述供給部48用於提供包含生物學粒子(細胞或染色體)的液體。以相對於鞘管47供給管49可以上下移動並且相對於鞘管47供給管49可以調整若干角度的方式，確定鞘管47的內徑和供給管49的外徑。因此，在鞘管47和供給管49之間存在間隙，但通過橡膠製的密封圈等適當密封構件(未圖示)對該間隙進行了密封。
與容器40下端部連接的流路塊2可以利用可透過光的材料，例如從由水晶、玻璃、熔融矽石或透明塑料構成的組中選擇的材料製作，在與容器中心軸相同的軸上形成有微細的流路3。如圖3所示，流路3具有長方形的截面，並以如下方式進行配置即長邊方向的壁面55、56朝向X方向，短邊方向的壁面57、58朝向Y方向，第一～第三雷射8A～8C從一方的短邊方向壁面57入射，前方雜光59從相面對的另一方的短邊方向壁面58射出，並且，螢光和側方雜光60從一方的長邊方向壁面56射出。
流路塊2還如圖3和圖3放大表示那樣，保持對螢光和側方雜光進行檢測的第一～第三光纖26A～26C。這些光纖26A～26C與通常的光纖同樣，由導光的纖芯和被覆纖芯周圍的包層構成。在與這些的中心軸正交的方向加工這些第1～第3光纖26A～26C的一個端面61A～61C，並與流路3的長邊方向壁面56隔開規定的距離，向著與容器中心軸正交的水平方向(Y方向)而配置。
參照圖2和圖4，為了使從下端管口74噴出的液體分別分離成包含細胞的液滴，流路塊2保持有在上下方向或半徑方向提供振動的振動發生器89。優選振動發生器89在小徑筒部的周圍對稱配置多個。而且，優選使用壓電元件(PZT)作為振動發生器89。
如圖4所示，流量檢查計量器1還具備用於採取特定粒子集團的分類裝置90。該分類裝置90具有電荷注入電路91、電極驅動電路(電源電路)92。電荷注入電路91與注入電極93連接，所述注入電極93與從管口74噴射的液體接觸。另外，電極驅動電路92，與在管口74的下方配置在從該管口74噴射的液體兩側的一對導電性電極板(偏向板)94、95連接。另外，注入電極93的設置位置沒有限定，只要能夠與在流路塊2內的流路流過的液體接觸即可。
(3)基本動作根據具備這樣構成的流量檢查計量器1，如圖2所示，由防護液供給部45供給的防護液在容器40的內部朝向下方移動。按照防護液將容器的中心軸作為中心而在容器40的內部以層流狀態移動的方式，確定單位時間的防護液的供給量。另一方面，由供給部48供給的懸濁液經由供給管49，以層流狀態提供給流動的防護液的中心。由此，形成了防護液對懸濁液的周圍進行包圍的圓筒狀層流，即，沿著容器40的中心軸逐一正確地流動粒子的防護流。然後，在容器40的傾斜部43處被加速之後，懸濁液和防護液被輸送至小徑筒部42，之後，進入流路塊2由傾斜(taper)流路3再次加速，進入到流路3中。
如圖3所示，通過流路3的粒子被第一～第三雷射8A～8C照射，由此，產生了前方雜光和螢光及側方雜光。前方雜光59從位於第一～第三雷射8A～8C的延長線上的壁面58出射到流路塊2的外部，被第一檢測裝置21檢測。另一方面，基於第一～第三雷射8A～8C的螢光及側方雜光60分別被聚焦於第一～第三光纖26A～26C，被第二檢測裝置25檢測。
如圖4所示，通過了流路3的防護液從管口74被噴射。被噴射的防護液基於由振動發生器89施加於容器40的小徑筒部42的振動，分別成為收容有粒子的液滴。尤其是在本實施方式中，由于振動發生器89被設置在容器40的小徑圓筒42處，所以，振動發生器89所產生的振動能夠高效地傳遞到層流混合液，良好地分離出液滴96。
從管口74噴出的防護液所含有的液滴，被充電為從電荷注入電路91施加到注入電極93的電壓的正極性或負極性。施加於電極的電壓的極性，根據由信號處理部24所檢測出的粒子的生物學性質而確定。被充電的液滴96在通過電極板94a、95a之間時偏向，僅提取特定的粒子。
(4)控制電路圖5表示信號處理部24和分類裝置90的電路構成。如圖所示，信號處理部24具備多個放大器101，從第一檢測部21和第二檢測部25的光檢測器輸出的信號(與前方雜光、側方雜光、螢光對應的信號)分別被放大。被放大的信號在通過A/D變換器102從模擬信號變換為數值信號之後.被發送至存儲器103進行存儲。
如上所述，第二檢測部中的三個光纖26A～26C，在流路3的流動方向配置於不同的位置。因此，由下遊側的光纖檢測出從一個粒子發出的螢光及雜光的時刻，比由上遊側的光纖檢測出從同一粒子發出的螢光及雜光的時刻慢規定時間。結果，對於一個粒子而言，從各光纖對放大器101輸入信號的時間會產生規定時間的差。因此，在本實施方式中，放大器101與定時控制部104連接，基於考慮了上述規定時間延遲的時刻而從定時控制部發送的信號，與一個粒子相關聯的信號被從多個放大器101同時輸出。另外，從存儲器103輸出的數位訊號在補償電路105、放大電路106中被處理之後，輸入到分類裝置90，用於上述的液滴(粒子)分類處理。而且，從信號處理電路24輸出的信號被輸出到分類裝置90，用於液滴控制以及分類控制。
分類裝置90具有液滴控制部110和充電控制部120，這些液滴控制部110和充電控制部120與信號處理部24連接。
分類裝置90與固定照相機(攝像部)112連接，所述固定照相機112用於對從管口74噴射的液體流動(防護流111)的下端部以及其周邊區域進行攝影。在隔著防護流110而與固定照相機112相反的一側固定有閃光燈113，其用於按照規定的周期向防護流111發光。
照相機112的輸出與對照相機112的映像信號進行數字處理的視頻數位化儀(視頻俘獲器)114連接，由照相機112拍攝的圖像(映像信號)通過視頻數位化儀114變換成數位訊號。視頻數位化儀114與在液滴控制部110中內置的存儲部116連接，由照相機112拍攝的圖像作為映像信息被存儲於存儲部116。與存儲部116一同內置於液滴控制部110的中央控制部117與存儲部116連接，以存儲於存儲部116的映像信息為基礎進行以下說明的處理。中央控制部117與振動發生器驅動部118和閃光燈驅動部119連接，對驅動發生器89和閃光燈113的驅動進行控制。中央控制部117與滴落延遲控制部121連接，並且，滴落延遲控制部121與電荷注入電路91連接，所述滴落延遲控制部121用於對從粒子通過了檢測位置的時刻，到粒子以包含於液滴的狀態從防護流111分離之前的時間(延遲時間)進行控制。
閃光燈113的發光周期t被固定為與施加于振動發生器89的信號的周期，即振動發生器89的振動周期相同，該周期t與形成液滴的周期完全一致。因此，由固定照相機112所拍攝的防護流111具有圖6所示的固定形狀。
其中，防護流111的流速v由下述公式(1)提供。
公式1v≌L/T (1)L從雷射聚焦位置(檢測位置)LIP(Laser Intercept Point)到防護流下端位置(分離點)BP(Break off Point)的距離T粒子從檢測位置LIP移動到下端位置BP的時間另外，粒子的移動速度(液滴的滴落速度)可以使用閃光燈113的發光周期，由下述公式(2)表示。
公式2v≌λ/t(2)λ液滴的間隔t閃光燈的發光周期由公式(1)、(2)可導出下述公式(3)。
公式3L/T＝λ/t (3)另外，公式(3)可以變形為下述的公式(4)。
公式4T/f＝L/λ (4)公式(4)中的(T/t)是將粒子從檢測位置LIP移動到分離點BP的時間(T)除以閃光燈發光周期(t)，與從檢測位置LIP到分離點BP之間應該存在的粒子數對應，在下面的說明中，根據需要將其稱作「滴落延遲DD」。其中，滴落延遲DD不是整數，而是包含小數點以下的值的數。因此，通過採用滴落延遲DD，公式(4)可以變形為下述公式(5)。
公式5DD＝L/λ (5)圖6對照表示照相機112的拍攝區域，由四方框130所包圍的區域131是被攝影的圖像。如上所述，由于振動發生器89的振蕩頻率與閃光燈113的發光頻率完全一致，所以，由照相機112拍攝的防護流以及從該防護流分離的液滴的圖像，只要其他的原因(例如對振動發生器89施加的脈衝電壓)不發生變化，就會停留為圖示的狀態。而且，如圖所示，由照相機112拍攝的是包含分離點BP的防護流111的一部分，為了在後述說明的圖像處理中獲得規定的解析度，而沒有包含檢測位置LIP。
從分離點BP到攝影圖像上端132的距離LB，例如可以沿著防護流111在其附近配置適當的刻度或對此替代的基準尺寸物，通過與所拍攝的圖像大小(像素數)進行對比來進行計測。
從圖像上端132到檢測位置LIP的距離LBO，可以基於以下所說明的計算過程1～3來計算。這些計算過程由中央控制部117自動執行。
計算過程1計算過程1，是對粒子從檢測位置LIP移動到分離點BP的時間T進行計算的過程。在該計算過程1中，以充分隔開粒子間隔的狀態使粒子流動，一邊使延遲時間Δt』變化，一邊對注入電極93注入規定極性(正極性或負極性)的電荷，對偏向於目標方向的粒子數進行計數。偏向於目標方向的粒子數最多的狀態是延遲時間Δt』與移動時間T一致的狀態，如果電荷注入時刻從該狀態發生偏離，則電荷無法恰當地注入，不偏向於目標方向。因此，如果使延遲時間Δt』變化，則可得到高斯分布狀態的時間延遲(Δt』)-粒子數(被計數的粒子數)特性(未圖示)，與高斯分布的峰值對應的時間延遲Δt』(peak)相當於移動時間T，中央控制部117計算出時間延遲Δt』(peak)，將其作為移動時間T存儲於存儲部116。
計算過程2計算過程2是對從檢測位置LIP到分離點BP之間可能存在或存在的多個粒子的粒子間平均距離(這相當於液滴的間隔)λ進行計算的過程，參照圖6，與從防護流111形成的液滴133對應，在防護流111中隔開一定的間隔交互地形成大徑部分和小徑部分，粒子間距離與防護流的大徑部分(或小徑部分)的間隔對應。因此，中央控制部117對圖像數據進行二值化，由背景的圖像區別防護流111。對由照相機112拍攝的防護流111的攝影圖像二值化而得到的圖像數據的編輯結果如圖7所示。該圖7，橫軸表示攝影圖像上下方向的各高速[y(i)]，縱軸表示橫方向的像素數[x(i)]。而且，圖中所示的Y(1)··Y(4)··表示各大徑部的最大徑部分(峰值)的高度，峰值間距離(平均距離)表示為間隔λ。
具體而言，在計算過程2中如圖9的流程圖所示，中央控制部117將後述處理所必須的數據(iY軸方向的列號、I峰值號、F1標誌)初始化(1001)，對i+1列所包含的防護流的像素數和i列所包含的防護流的像素數進行比較(1002)。在i+1列的像素數x(i+1)比i列的像素數x(i)大的情況下(像素數具有增加傾向的情況)，將標誌F1設定為1(1003)，並將其與列號i相加(1004)。另一方面，在i+1列的像素數x(i+1)比i列的像素數x(i)小的情況下(像素數具有減少傾向的情況)，判斷標誌F1是否為1(1005)。即，在判斷步驟1002、1005中，判斷到列號i為止具有增加傾向的像素數，是否從列號i+1起向減少傾向轉化了。然後，判斷像素數x(i)是否超過了閾值x(th1)(參照圖7)(1006)，如果超過了閾值x(th1)，則將列號i賦與給Y(I)而存儲(1007)，更新峰值號I(1008)，將標誌F1設定為「0」(1009)，判斷i+1是否達到最終列號n(1010)。在i+1沒有達到最終列號n的情況下，對列號進行加一處理(count up)(1004)，並執行判斷步驟1002。然後，在i+1達到最終行號n時，以如上所述求取的峰值號Y(I)[Y(1)··Y(4)··]為基準，計算出峰值間的平均距離，即間隔λ(1011)。另外，閾值x(th1)是用於對大徑部和以下所說明的附屬滴落物(小液滴)進行區別的數值，被設定成比通常所形成的附屬滴落物的大小以及其像素數大的值。
計算過程3計算過程3是使用中央控制部117所計算出的時間T和間隔λ等，計算出距離LBO過程。具體而言，在該計算過程3中，使用將上述公式(4)進行下述變化而得到的公式(6)，來計算距離LBO。
公式6T/t＝(LB+LBO)/λLB+LBO＝(T/t)·λLBO＝(T/t)·λ-LB(6)如上所述，公式(5)所包含的時間T、間隔λ以及距離LB被如上所述進行計算，閃光燈發光周期t為已知。因此，使用這些被計算出的各個數值來計算距離LBO。而且，使用所計算出的距離LBO、LB可以計算出距離L。
中央控制部117將如上所述而確定的距離L和間隔λ帶入公式(5)，確定滴落延遲DD。所確定的滴落延遲DD由滴落延遲控制部121存儲到存儲部116作為基準值DD，用於後面所說明的滴落延遲調整控制。
(5)分類控制在粒子的分類控制中，液滴控制部110與充電控制部120從信號處理部24接收對檢測器已經檢測出粒子這一信息進行表示的信號(檢測信號)。若接收到檢測信號，則液滴控制部110驅動滴落延遲控制部121，在經過與所存儲的滴落延遲DD對應的延遲時間T之後，啟動電荷注入電路91，將電荷注入到液體。被注入的電荷的極性，基於從信號處理電路24輸出的信號由電荷控制電路120決定。然後，由電荷控制電路120所決定的極性的電荷從電荷注入電路91向液體注入。因此，在電荷注入之後立即從防護流111分離的液滴(包含所被檢測的粒子的液滴)，被注入與關於粒子檢測出的生物學性質相對應的極性的電荷，在從電極板94、95之間通過之際發生偏向，被採取到對應的容器(未圖示)。
(6)反饋控制(滴落延遲控制)在流量檢查計量器1中所使用的防護液的粘度根據環境(例如溫度)而變化。如果防護液的粘度發生變化，則分離點BP會上下移動，使得形成液滴的定時發生變化。因此，液滴控制部110利用照相機112的圖像，計算出從分離點BP到攝影圖像上端的距離LB*。該計算如上所述，通過沿著防護流111在其附近配置適當的刻度或替代其的基準尺寸物，能夠以由照相機112所拍攝的基準尺寸物的大小(像素數)為基準進行計測。具體而言如圖10所示，液滴控制部110將列號設定為「1」(1011)，判斷該列號的像素數x(i)是否為「0」(1012)。在像素數x(i)不是「0」的情況下，更新列號i(1013)，進行同樣的判斷處理(1012)。如果判斷為像素數x(i)是「0」，則將其列號i設定為YBP(參照圖8)，根據該YBP的值與基準尺寸物的尺寸，通過比例計算來算出LB*。
接著，液滴控制部110以從照相機112得到的圖像為基準，計算出間隔λ*。計算粒子間距離的方法與上述的計算過程2同樣。
然後，液滴控制部110以所計算的距離LB*和間隔λ*為基礎，根據將公式(5)變形的下述公式(7)計算出新的滴落延遲DD*。
公式7DD*＝(LB*+LBO)/λ*(7)然後，基於如上所述計算出的新的滴落延遲DD*，液滴控制部110對將電荷注入液體的定時(時間延遲Δt)進行調整。另外，由於從公式(7)可知，LB*+LBO是具有長度單位的固定值，所以，即使改變形成液滴的頻率與防護液的供給壓力，也可以如上所述正確地求出間隔λ*，由此，可正確地求取滴落延遲DD*。結果，能夠高精度地維持分類。
(7)反饋控制(電壓控制)如圖6所示，當液滴133從防護液111分離之際，在分離後的液滴133和與防護液111連接未分離的液滴133之間，產生不包含粒子的微小液滴的附屬滴落物134。在附圖中，附屬滴落物134表示為從液滴133分離而獨立的理想狀態，優選為以該獨立的理想狀態將電荷注入到防護流111。因此，液滴控制部110一邊從對照相機112所拍攝的圖像進行了處理的二值圖像數據中檢測出附屬滴落物134的狀態，一邊控制對振動發生器89所施加的電壓，從而調整振動發生器89所產生的振動大小，以便使如圖6所示得到附屬滴落物134獨立的狀態。
具體而言，如圖11的流程圖所示，液滴控制部110將上述分離點BP的列號YBP提供給列號i，並且，將標誌F2設定為「1」(1021)。接著，對列號i進行遞加(increment)處理(1022)，判斷比分離點BP位於下面的各列號i的像素數x(i)是否超過規定閾值x(th2)(參照圖8)(1023)。在像素數x(i)沒超過規定閾值x(th2)的情況下，判斷標誌F2是否為「0」(1027)，如果標誌F2不為「0」，則對列號i進行遞加處理(1022)。如上所述，分離點BP是像素數x(i)成為「0」的點。因此，如圖8所示，在與分離點BP連續的多個列號中，由於像素數x(i)沒有超過閾值x(th2)，所以，反覆執行步驟1022→1023→1027。
但是，如果判斷為像素數x(i)超過了規定閾值x(th2)(1023)，則判斷標誌F2是否為「1」(1024)，如果標誌F2為初始狀態(標誌F2＝1)，則將此時的列號i設定為附屬滴落物上端列號YS1(1025)，將標誌F切換為「0」(1026)。一旦判斷為像素數x(i)超過閾值x(th2)，則該狀態被暫時維持(參照圖8)。因此，在像素數x(i)超過閾值x(th2)的期間，反覆執行步驟1022→1023→1024。如果列號i成為附屬滴落物下端部附近的列號，則像素數x(i)變為閾值x(th2)以下(1023)。結果，從處理1022進入處理1027，判斷標誌F2是否被設定為「0」。此時，標誌F被設定為「0」(1026)。因此，將列號i設定為附屬滴落物下端列號YS2(1028)。而且，從附屬滴落物下端列號YS2減去附屬滴落物上端列號YS1，計算出從附屬滴落物上端到附屬滴落物下端的像素數YS(1029)。然後，液滴控制部110由像素數YS計算出附屬滴落物134的長度。接著，液滴控制部110對計算出的附屬滴落物134的長度YS和所存儲的基準長度Yref進行比較，調整由驅動部118對振動發生器89施加的電壓，將附屬滴落物134的長度維持恆定。另外，也可以替代附屬滴落物134的長度，根據下述公式(8)計算出圖8所示的圖像面積(大小)A，按照在液滴控制部110中將該面積A維持恆定的方式進行控制。
公式8A=YS1YS2x(i)---(8)]]>這樣，由於在流量檢查計量器1中基於由照相機112所拍攝的圖像對振動發生器89施加的電壓進行反饋控制，因此在一定位置穩定自動地形成理想形狀的防護流。而且，由於利用由照相機112所拍攝的圖像調整滴落延遲DD(延遲時間Δt)，所以，粒子被正確地分類。
(8)懸濁液/防護液供給部圖12詳細表示了防護液供給部45和供給部48。如圖所示，防護液供給部45具備防護液容器140，該防護液容器140中收容有防護液141。該防護液容器140連接有兩根導管142、143。導光142的一端與防護液141的上部密閉空間連接，另一端與壓力源144連接。另外，導管143的一端浸入到防護液141，另一端與緩衝容器145連接。緩衝容器145是容量遠比防護液容器140的容量小的容器，收容有從防護液容器140經由導管143供給的防護液141。緩衝容器145還經由其它的導管146與容器40連接。如圖所示，導管143、146的一端浸漬在緩衝容器145所收容的防護液141中。
供給部48具備樣品容器148，其用於收容作為生物學粒子(細胞或染色體)的樣品液147。樣品容器148與一端和供給管49連接的樣品導管149連接，該樣品導管149的另一端浸漬於樣品液143。導管150的一端與收容在樣品容器148的樣品液147的上部密閉空間連接。導管150的另一端與壓力調整部151連接，並且，壓力調整部151經由其他的導管152與壓力源153連接。而且，壓力調整部151與緩衝容器145的上部密閉空間通過導管154連接。
按照以上的結構，在防護液供給部45中，收容於防護液容器140的防護液141基於從壓力源144通過導管142施加的壓力P10而被加壓，通過導管143以壓力P11供給到緩衝容器145。另外，緩衝容器145的防護液141基於從防護液容器140供給的防護液141的壓力P11，通過導管146以壓力P12被供給到容器40。另一方面，在供給部48中，從壓力源153提供的壓力P20在壓力調整部151中被調整，調整後的壓力P21被施加在樣品容器148的上部密閉空間。結果，樣品容器148的樣品液147以規定的壓力P22經由導管149被供給到鞘管49。此時，從鞘管49噴射的樣品液147的壓力P22，需要使得提供給容器40的樣品液147不因防護液141而被擾亂地徑直流動。因此，樣品液147的壓力P22被設定為比防護液141的壓力P12僅大規定壓力ΔP。
具體而言，在實施方式中，防護液供給部45中的導管142、143、146的管內壓力P10、P11、P12大致相同。另一方面，在供給部48中，連接於壓力調整部151下遊側的兩根導管150、149的管內壓力大致相同。而且，壓力調整部151將通過導管154提供的緩衝容器145的內部壓力P12』(該壓力與壓力P11、P12大致相同)作為基準，將施加了其所必要的壓力差ΔP的壓力設為從壓力調整部151輸出的壓力P21。
並且，在實施方式中，防護液容器145和緩衝容器148的容積被設定為防護液容器140的大約1/10～大約1/1000，優選為大約1/500。因此，即使由於防護液141被消耗而使得防護液容器145的水平面下降，與沒有緩衝容器145的情況相比，也可以穩定地確保提供給容器40的防護液141和樣品液147的壓差。
(9)容器優選防護液供給部45的防護液容器145和供給部48的樣品容器148的至少任意一方採用圖13所示的容器。圖13所示的容器155由外側容器156和內側容器157構成。外側容器156由金屬或塑料等剛性比較高的材料形成。內側容器157可以由玻璃等材料形成。外側容器156由能夠收容內側容器157的容器主體158、和能夠拆裝自如且密封地安裝於容器主體158的上埠部的封蓋159構成。將封蓋159安裝於容器主體158的機構優選採用通常的螺紋構造。另外，為了對封蓋159和容器主體158之間進行密封，如圖所示，優選在二者之間配置密封圈160。為了將液體(防護液或樣品液)提供給內側容器157或對被收容的液體進行加壓，封蓋159具有多個導管插入孔161、162，插入在導管插入孔161、162的導管163、164的周圍由橡膠等的彈性環狀構件165、166密封。如果將這樣構成的容器用作防護液供給容器145或樣品容器148，則即使對由剛性比較高的材料形成的外側容器156所圍成的內部空間施加壓力，使得由通常容易破裂的玻璃等材料形成的內部容器157產生龜裂的情況下，外側容器156的壓力也可以維持為規定的值，因此可以穩定地供給樣品液。另外，在將容器155用作樣品容器的情況下，為了防止了樣品液所包含的生物學粒子凝聚而固定，需要周期性施振並攪拌粒子。該情況下，由於外側容器156由剛性高的材料形成，所以，即使施加周期性的振動也不會發生破裂。另外，在實施方式中於封蓋159上設置了孔161、162，並將導管163、164插入到這些孔中，但也能夠以貫通的狀態將導管固定於封蓋159，在封蓋貫通導管的兩端(封蓋的內側和外側)連接不同的導管。
(10)分光濾光器的配置在流量檢查計量器1中，檢測裝置25的分光濾光器30A～30C通常使用分色鏡。該分色鏡一般具有反射率比透過率大的特性。例如，反射率R大約為0.9，透過率大約為0.8。因此，例如如圖14所示，如果將三個分光濾光器167、168、169串聯配置，由檢測器FL1～FL4檢測各分光濾光器167、168、169的透過光，並將透過分光濾光器的光向下遊側傳輸，則在將輸入到檢測裝置25的光強度設為1的情況下，由最後的分光濾光器169反射的光強度和透過該分光濾光器169的光強度分別減少至0.576(＝0.8×0.8×0.9)、0.512(＝0.8×0.8×0.8)。與之相對，如圖15所示，如果將分光濾光器167、168、169的反射光傳輸到下遊側，則由最後的分光濾光器169反射的光強度和透過該分光濾光器169的光強度分別為0.729(＝0.9×0.9×0.9)、0.648(＝0.9×0.9×0.8)，與圖14所示的裝置相比，減少了光的強度降低，因此，提高了檢測裝置25的檢測靈敏度。
權利要求
1.一種裝置，對包含生物學粒子的液體流照射光，檢測出來自該生物學粒子的光，由此取得該生物學粒子的生物學信息，並基於所取得的生物學信息對生物學粒子進行分類，包括光檢測部，其對來自所述生物學粒子的光進行檢測；攝影部，其對所述流和從該流分離的液滴進行攝像；基於由所述攝影部所拍攝的流圖像，計算出從所述光檢測器檢測出來自生物學粒子的光的檢測位置到所述流下端位置的距離，與從所述流分離的液滴的間隔，並且，利用所述距離和間隔計算出所述粒子從檢測位置移動至下端位置的時間的機構；以及在所述光檢測器檢測出來自生物學粒子的光之後，間隔所述計算出的時間，將與所述生物學粒子的性質對應的極性的電荷施加給所述流的機構。
2.一種裝置，基於生物學粒子的生物學信息對該生物學粒子進行分類，包括流路形成部，其形成液體流，所述液體流隔開規定間隔配置了所述生物學粒子，並且，噴射所述流，而形成包含所述生物學粒子的液滴；照明部，其對所述流包含的生物學粒子進行照明；檢測部，其對從所述生物學粒子發出的光進行檢測；攝影部，其對所述流和從所述流分離的液滴進行攝像；從由所述攝影部攝影的流圖像，計算出從所述光檢測器檢測出光的檢測位置到所述流下端位置的距離，與從所述流分離的液滴的間隔，並且基於所述距離和間隔，計算出所述流從檢測位置移動至下端位置的時間的機構；處理部，其從由所述檢測部檢測出的光得到所述生物學粒子的生物學信息；在所述光檢測器檢測出光之後，包含所述計算出的時間延遲地基於由所述處理部得到的所述生物學粒子的生物學信息，向對應的所述生物學粒子賦予電荷的機構；和利用對所述生物學粒子施加的電荷，使包含所述生物學粒子的液滴的滴落方向發生偏向的機構。
3.一種裝置，對包含生物學粒子的液體流照射光，檢測出來自該生物學粒子的光，由此取得該生物學粒子的生物學信息，並基於所取得的生物學信息對生物學粒子進行分類，包括光檢測部，其對來自所述生物學粒子的光進行檢測；振動發生器，其對所述流施加振動；攝影部，其對所述流和從該流分離的液滴進行攝像；利用由所述攝影部拍攝的圖像，對在流下端位置和最靠近其的液滴之間形成的小液滴大小進行檢測的機構；以及根據所述小液滴的大小控制所述振動發生器的振動大小的機構。
4.一種方法，其中對生物學粒子進行分類，包括形成包括所述生物學粒子的液體流的工序；對所述流所包含的生物學粒子照射光的工序；對來自所述生物學粒子的光進行檢測工序；基於所述檢測出的光，取得所述生物學粒子的信息的工序；對所述流和從該流分離的液滴進行攝像的工序；從所述流的攝影圖像，求出所述光的檢測位置與所述流的下端位置之間的距離以及所述流所包含的生物學粒子的間隔，並利用所述距離和間隔，計算出所述液體以及生物學粒子從所述檢測位置移動至下端位置的時間的工序；在從檢測出來自所述生物學粒子的光開始經過所述計算出的時間之後，基於所述生物學粒子的信息對所述流注入電荷的工序；和根據所述被注入的電荷，對從所述流分離的液滴進行分類的工序。
5.一種方法，其中對包含生物學粒子的液體流照射光，檢測出來自該生物學粒子的光，由此取得該生物學粒子的生物學信息，並基於所取得的生物學信息對生物學粒子進行分類，包括對來自所述生物學粒子的光進行檢測的工序；對所述流賦予振動的工序；對所述流和從該流分離的液滴進行攝像的工序；利用所述所拍攝的圖像，對在流下端位置和最靠近其的液滴之間形成的小液滴大小進行檢測的工序；和根據所述小液滴的大小控制所述振動大小的工序。
全文摘要
一種裝置，對包含生物學粒子的液體流照射光，檢測出來自該生物學粒子的光，由此取得該生物學粒子的生物學信息，並基於所取得的生物學信息對生物學粒子進行分類，包括光檢測部，檢測出來自生物學粒子的光；攝影部，對流和從該流分離的液滴進行攝像；將由攝影部所拍攝的流圖像作為基礎，計算出從光檢測器對來自生物學粒子的光進行檢測的檢測位置到流下端位置的距離，與流所包含的粒子的間隔，並利用這些距離和間隔計算出粒子從檢測位置移動至下端位置的時間的機構；和在光檢測器檢測出來自生物學粒子的光之後，間隔所計算出的時間，將與生物學粒子的性質對應的極性的電荷施加給流的機構。這樣，使對生物學粒子分類的裝置構成簡單，並提高了分類精度。
文檔編號G01N33/483GK1950690SQ200580013728
公開日2007年4月18日 申請日期2005年4月28日 優先權日2004年4月30日
發明者神田昌彥 申請人:貝葉生物科學株式會社