可脫離的表面的製作方法

2023-05-06 16:45:51

專利名稱：可脫離的表面的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種表面，在所述表面上，細胞優選哺乳動物細胞附著並且增生，而且該表面使所述附著的細胞能夠從該表面脫離，所述細胞可以用於各種治療性和美容性的組織工程/外科手術。
組織工程是一種同許多臨床和美容手術領域相關的一種新生學科。更加具體地，組織工程涉及置換和/或恢復和/或修復受損的和/或罹病的組織，以把該組織和/或器官恢復到一種功能狀態。舉例說，但不是以限定的方式，組織工程可以用在對修復由於挫傷，或燒傷，或由於靜脈或糖尿病潰瘍組織衰退而不癒合的結果產生的創傷提供皮移植片上。另外，組織工程還實行於置換諸如因關節炎之類的退行性病變受累的關節；置換因種種環境因素(如吸菸、飲食)和/或先天性心臟病受損的冠狀動脈，包括置換動脈瓣膜/心臟瓣膜；器官移植；修復胃潰瘍；置換如骨質疏鬆之類病患的骨組織、置換神經肌肉疾病受累的或外傷受損的神經和肌肉及置換膀胱的材料以治療泌尿疾病。
可惜，離體培養細胞/組織只代表組織工程面臨的部分問題。在許多實例中，培養基中的細胞生長並非主要的障礙。把細胞/組織，經一種適當的載體(舉例說，但不是以限定的方式，培養著物、假體、植入物、三維間質支架、細胞外間質蛋白塗復的敷料、繃帶、石膏)轉移，使所述細胞/組織加入到受治療的患者體內，代表一種深遠的，更加棘手的問題。適於轉移置換組織的載體要用於組織工程就必須滿足某些要求。例如轉移載體可供選擇地具有以下的特性(i)它們提供一個細胞可以牢固地附著於其上的表面；(ii)它們讓附著的細胞能夠不受附著表面的防礙而生長和分裂；(iii)在適用時，它們提供一種不影響附著的細胞的分化(或者未分化)狀態的附著表面；(iv)它們把細胞保持在無菌的且免疫學上靜息的狀態；(v)它們以對患者的毒性微小；(vi)它們不傳播細菌或者病毒性疾病；及(vii)它們提供一種使附著的細胞可以容易地脫離然後因此侵入需要置換、恢復或者說修復的組織位置中的表面。
已經識別出了數種表面，其提供使細胞可以在其上附著、在培養物中生長和增生的基底，並且表達上述特性的細胞類型的卓越的例子是一種角質細胞。
用於支持細胞的附著和增生及生長的優選基底是膠原I，但其它的也已被研究(1)，例如在膠原-糖胺聚糖(C-GAG)基底上接種或者說沉積的，然後移植到燒傷處以形成培養的代用皮膚(CSS)的角質細胞，在14-28天之後發育成永久性的皮膚組織(2)。角質細胞也能夠離體地在合成的親水聚合物支架上生長(3)。已經有人把角質細胞移植到聚(羥乙基異丁烯酯)支架上，並且這些細胞展示了改進了的創面癒合，與非重建的表皮和正常人類皮膚的細胞角質型式無區別(4)。先前的研究展示含羧酸等離子體共聚物是如何在7天的時間內支持角質細胞的附著和增生的(5)。
人們還研究了細胞外間質蛋白質對人類角質細胞的附著、增生及轉移到皮膚創面模型的影響(6)。發現單凝膠、膠原I和膠原IV促進初始附著；而RGD、玻璃粘連蛋白、纖維結合蛋白和受過輻照的3T3成纖維細胞不促進。還發現細胞的增生受到單凝膠、膠原I、膠原IV和受過輻照的3T3成纖維細胞的積極影響(但是程度上低於初始附著受到的)。在後述的基底上增生的角質細胞保持轉移到一種簡單的離體創面模型上的能力。
在確定的表面上培養細胞還極少對分化的細胞提出挑戰。例如一般用於研究分化的細胞類型的成纖維細胞在培養中保持了很大的多效性並且相對地容易培養。相反，角質細胞一般地會在活體內經歷程序性的分化從基底表皮層(在此它們與附著在下皮層的基膜接觸)向上部的皮層移動。在較後的層中它們丟失其胞核並且經歷終末分化。一旦通過一定的分化點後它們就不能夠遷移和增生了，並且主要地起皮膚的屏障作用。
培養中的角質細胞在多數培養條件下經歷最終末分化並且對過早分化產生的不利條件作出反應。因此，挑戰在於建立一種表面，理想地，該表面本身不促進分化，並且該表面可以通過理想地與適當的培養基結合來保持細胞，諸如角質細胞，於一種增生的表現型，在此種表現型中它們能夠附著並且接著轉移到一種離體的創面模型上。
在考慮組織工程和創傷修復時，可以有幾個不同的方法供使用。當前研究的產品和治療一般地分為三個類型表皮置換、皮置換和代用皮膚。
表皮置換包含單層培養的角質細胞，或者用載體培養的角質細胞，並且一般地涉及離體生長融合的培養自體(患者自身的)表皮細胞。儘管可以得到非自體的模式作為「離架」方案，但是沒有跡象表明非自體的細胞能夠相容，雖然它們可以起生物繃帶的作用。由於這些原因，非自體的產品(EpicelTM和ActicelTM)已經得到了混合的臨床成就。另一種進行研究的產品，Laserskin，採用透明質酸作角質細胞發放系統，但是在領域內的一般技術人員使用時，把該載體用一層輻射過的3T3成纖維細胞預處理以促進角質細胞增生。其他人在研究膜載體用於在角質細胞形成完整的層前進行轉移。
皮置換含有一種支持結構，或者說植入間質，用於浸潤、貼附、增生和通過成纖維細胞(在有些情況下通過內皮細胞)產生新間質。IntegraTM使用牛皮膠原I與軟骨素(chrondroitin)-6-硫酸鹽在矽氧烷底片上交聯的皮成分。還考慮一種用成纖維細胞和表皮細胞接種的變種。這種合成的間質在3/4周後降解並且在使用裂隙厚度網孔皮移植片之前促進新皮生成。AllodermTM是一種冷凍乾燥的、人類去表皮皮膚，含有供體成纖維細胞(來自篩選的皮膚庫供體)。XenodermTM是類似的，使用一種豬的皮，它讓間質能夠結合到創面中，顯示較低的免疫抗原性，並且能夠使主細胞再生。其它人還在開發著膠原基聚合物作為支架，或者說合成間質，用於發放角質細胞和成纖維細胞，在非接種地植入實驗創傷中時它們已經顯示支持細胞向內生長。
當前認為最有前景的產品，DermagrafTM採用一種用同種異體成纖維細胞接種的PGA/PLA間質。在4周後可以看到植入的間質吸收，及細胞沉積的膠原I-III-VI、彈性蛋白、纖維結合蛋白和核心蛋白聚糖。非接種的模式不支持移植。這種產品的優點是，如果用角質細胞接種它可以阻滯傷口收縮，並且這種非膠原的間質克服與免疫抗原性/BSE轉移相關聯的問題。
代用皮膚結合了皮置換和表皮置換兩者。AppligraftTM結合了用同種異體成纖維細胞接種的膠原I凝膠和一種同種異體角質細胞的融合片。儘管同種異體角質細胞和成纖維細胞在皮膚損傷中的長期存活性還有疑問，有可能有活力的同種異體細胞可以發放能夠加速修復過程的生物介質(例如生長因子)。
領域內的一般技術人員會理解，提供愈創系統(而不是那些使用從患者組織，即自體組織得到的材料)的以上方案，存在有從供體源向受治療的患者傳播感染媒介的可能性。另外異種移植還需要一般公眾接受為在組織工程中使用人類組織的替代。
與創傷前處理，間質支架(用於細胞生長)的選擇和使用同種異體細胞的相關的幾個問題還有待完全解決，但毫無疑問用組織工程方法進行創傷修復與現有的治療會展現很大的治療性優勢。從以上的討論可以看出，角質細胞為研究組織工程中使用的組織提供了一種卓越的模型系統。但是組織工程面對主導問題是提供一種可以滿足培養和向患者轉移細胞/組織的理想載體的所有的要求的基底。
細胞培養皿和生物植入物或者說載體一般地用讓細胞附著、生長和增生的聚合物製造，或者塗覆讓細胞附著、生長和增生的聚合物。往往，如果所述基底/載體要用於植入培養的細胞/組織的工具，那麼與之結合使用的植入的間質就應當是可生物降解的(請參見國際第WO/9012603號公開)。而且，對基底進行處理以促進細胞的附著和增生是領域內公知的。例如國際第WO89/02457號和第WO90/02145號公開了便於細胞附著的表面化學改性。國際第WO89/02457號公開涉及聚四氟乙烯(TeflonTM)及其它碳氟聚合物的化學改性，以及它們在內皮細胞培養中的應用。國際第WO90/02145號公開說明了一種中性化的全氟-3，6二噁-4-甲基-7-辛烯磺醯氟化物的共聚物和單體四氟乙烯用於為各種細胞/組織培養中用的基底進行覆層。
美國第US4919659號專利說明使用等離子可聚合氣體(例如丙酮、甲醇、環氧乙烷)塗覆細胞附著生長的表面。塗覆過的表面顯示提高了纖維結合蛋白(一種細胞粘接多肽)的結合力從而便於細胞附著在處理過的表面上。這樣處理過的表面可用在為生物植入物提供器材和提供細胞培養皿等方面。典型地，諸如聚酯、聚四氟乙烯或者聚氨酯之類的材料塗覆以等離子聚合化氣體然後與纖維結合蛋白接觸。纖維結合蛋白吸收的表面與對照表面比較顯示提高了大鼠3T3細胞的附著性。
等離子體是電離的，一般地用電場激發。它們是含有離子、電子、中子(自由基、亞穩的、基態的和激發態的種類)和電磁輻射的高度活潑的化學環境。在減壓情況下可以達到一種電子的溫度與離子和中子的溫度大不相同的狀態。這種等離子體稱為「冷」或者「非均態」的等離子體。在這種環境中已經表明有許多揮發性有機化合物(淨的，或者帶有其它氣體，例如氬)聚合(H.K.Yasuda，Plasma polymerisation，Academic Press，London，1985)在與該等離子體接觸的雙表面上和排放下遊的表面上。所述的有機化合物常常稱為「單體」。沉積物常常稱為「等離子體聚合物」。這種形式的聚合的優點包括超薄的無孔膜沉積；等離子體聚合物可以沉積在範圍寬廣的基底上；過程沒有溶劑，而等離子聚合物沒有汙染。
我們探討了等離子聚合物沉積塗覆適當的基底以用於細胞/組織培養(5、7、8)。可以用揮發性有機化合物的等離子體(在10-2毫毫巴的減壓下，並且理想地＜100℃)得到薄的聚合物膜。在等離子體沉積中，一般地有起始化合物或者說電離氣體的廣泛裂解並且產生的大範圍的官能團殘片不利地加入到沉積中去。我們指出通過運用低等離子體輸入功率(低等離子體功率/單體流速比)可以製造具有高官能團留著率的膜。這樣的低功率/速率比的一個例子是2W/2.0sccm。然而，可以採用其它的相對低的並且為領域內的一般技術人員所公知的比率。
已經顯示出對於丙烯酸(9)、丙烯酸與一種碳氫化合物的共聚物(例如1，7-辛二烯)使得能夠一定程度上控制表面上生成的等離子共聚物(PCP)(7)中的官能團濃度。PCP可以直接地沉積在多數的表面上，不論幾何形狀如何，使它們對於處理諸如線網和纖維的表面及細胞培養用塑料皿是理想的。這會明顯地使它們對於臨床應用有用處，在此細胞可以被生長在PCP塗覆的二維或者三維支架上，然後應用於創面或者組織修復/恢復部位。
我們曾把人類角質細胞培養在用等離子體聚合物/共聚物塗覆的表面上。使用低功率/單體流速比產生了一種等離子體聚合物/共聚物，其中，來自等離子體氣體沉積到等離子體聚合物/共聚體的，含酸單體(在此例中是丙烯酸)的酸官能團在很大程度上保持完好(留著的)。這些沉積確實含有其它的官能團(例如由後等離子氧化產生的羥基)，但是被表述有「高度酸官能團」，反映從等離子體氣體進行到等離子體聚合物膜的高度酸留著率性。「高度酸官能團」並不指等離子聚合物/共聚物中的酸官能團的量(濃度/密度)，等離子聚合物/共聚物中的酸官能團的量取決於含酸單體/碳氫化合物的共聚合化比率。
在這些表面上培養的角質細胞不僅附著、以非分化的狀態生長和增生，而且還從表面上脫離轉移到創面模型上。以此方式促進角質細胞轉移的基底顯示在愈創領域中有很大的前景。我們把這些有利的特性歸功於為我們的處理過表面的高度酸官能團，和在便於細胞脫離的所述的附著表面的特性。
本文中談到的高度酸官能團，要包括那些具有5-20％的表面酸官能團並且更加優選地超過20％的表面酸官能團的量的表面。這裡的百分比指在此類環境中的碳原子的數。例如20％的酸官能團意味在等離子體聚合物中的每一百個碳原子中20個在酸型環境中。
根據本發明的第一方面提供有至少一種細胞培養表面，至少一個細胞可以可釋地附著在所述的細胞培養表面上並且所述的細胞培養表面是高度酸官能團的。
在此說高度酸官能團是指含有在5％至20％之間或者大於20％表面酸官能團的表面。
領域內的一般技術人員會清楚，在附著表面上的酸官能團導致提高細胞的附著性(5、7、10、12)。我們發現，以低等離子體功率/單體流量比率的細胞培養表面的等離子體聚合使得在塗覆以該聚合物的表面上有高的酸官能團留著率。在用100％的丙烯酸處理的細胞培養表面上培養的細胞顯示出提高了從處理過的表面上脫離的能力，從而促進去表皮皮膚(DED)的角質細胞浸潤。從100％丙烯酸產生的等離子聚合物可能不含有對於細胞附著理想的酸官能團百分比。然而，丙烯酸與碳氫化合物，舉例說，但是不以限制的方式，1，7-辛二烯的等離子體共聚合化使得能夠有一定程度的控制沉積過程，並且能夠提供一種角質細胞可能附著、增生和從之脫離的表面。典型地，在單體流中用超過50％的丙烯酸處理過的細胞培養表面產生酸官能團在5％-21％之間的等離子聚合物表面，這取決於使用的酸的濃度。例如用100％的丙烯酸處理過的細胞培養表面產生酸官能團約21％的等離子聚合物表面。
在本發明的一種優選實施例中，所述的表面提供一種基底，至少一個細胞可以在其上生長和增生。優選地，所述表面便利於所述的細胞以非分化的狀態生長和增生。可選地，取決於組織類型，所述的表面便利於所述的細胞以分化的狀態生長和增生。
在本發明的另一個優選實施例中所述的表面不對附著於其上的細胞誘發免疫反應，從而把它們輸入到患者體內時不激發免疫反應。
在本發明的又一個優選實施例中所述的表面對患者有微小的毒性並因此把附著於其上的細胞輸入到患者體內時不誘發不良的反應。
在本發明的又一個優選實施例中，所述的表面適用於採用哺乳動物源的細胞，並且更加優選地人類源的細胞。
在本發明的再一個優選實施例中所述的表面適用於使用以下的細胞類型角質細胞；軟骨細胞；成骨細胞；內皮細胞。理想地所述細胞是角質細胞。
在本發明的另一個優選實施例中所述的表面酸官能團由羧酸官能團提供。
在本發明的又一個優選實施例中所述的表面的酸官能團至少是5％且更通常在5-20％之間表面酸官能團。更理想地，還有所述的表面酸官能團大於20％。理想地，所述酸官能團由丙烯酸提供。可選地所述的酸官能團由丙酸提供。
在本發明的另一個優選實施例中所述的表面典型地由用一種含酸單體的等離子體共聚物除覆的基底提供。舉例說，但是不是以限制的方式，丙烯酸和一種碳氫化合物，舉例說，但是不是以限制的方式，1，7-辛二烯。理想地，在饋送氣體中，所述的丙烯酸以50％-100％提供而1，7-辛二烯以0-50％提供。
領域內的一般技術人員會清楚，本發明的細胞培養表面在此可以用於在施用在，舉例說，但是不是以限制的方式，急性和/或慢性和/或輕度和/或嚴重的皮膚創傷(包括靜脈和糖尿病潰瘍)之前；和/或軟骨修復；和/或骨修復；和/或肌肉修復；和/或神經修復/和可結締組織修復和/或血管修復；和/或尿道修復之前，細胞可以生長在塗覆了的基底上的臨床應用方面。本發明還通過提供所述的表面作為組織工程載體的整體部分來提供任何上述的細胞培養表面。
根據本發明的第二方面提供有一種用於組織工程的載體，其中，所述的載體與一種細胞表面集成，或者施加於一種細胞培養表面上，至少一個細胞可以可逆地附著於這種細胞培養表面上，其特徵在於，所述表面是高度酸官能團的。
載體定義為在根據本發明可以用於組織工程中的表面上培養細胞的結構。舉例說，但是不是以限制的方式，一種假體、一種植入物、間質、敷料、細胞培養盤、線網、繃帶、石膏、可生物降解的間質和聚合物膜。
在本發明的一個優選實施例中提供有一種治療載體，所述的治療載體含有一種根據本發明的附著有選擇出的細胞的表面，其中所述的治療載體適用於施加和/或植入進需要治療組織工程的患者。
在本發明的另一個優選實施例中，提供有一種含有間質材料(舉例說，但是不以限制的方式，一種合成或者自然發生的並且要麼是長持續性的，要麼是可生物降解的的間質材料)的治療載體，含有一種根據本發明的表面，細胞附著於所述表面上，用於外科植入手術。
在本發明的又一個優選實施例中，所述的載體適用於以下的任何細胞類型角質細胞、軟骨細胞、成骨細胞、內皮細胞、尿道上皮細胞(urothelial)、表皮細胞。
在本發明的又一個優選實施例中，所述的治療性載體包含角質細胞。
根據本發明的第三方面，提供有一種美容載體，它含有一種根據本發明實施例的任何方面的細胞培養表面，以用於美容組織工程。
在根據本發明的第四方面，提供有一種製備根據本發明的任何前述方面或者實施的表面的方法，含有(i)在一饋送氣體中混合選擇比例的含酸單體和一種碳氫化合物；(ii)產生所述的混合物的等離子體；以及(iii)用所述的等離子體塗覆適當的基底以提供一種留著率高度酸官能團的表面聚合物/共聚物。
領域內的一般技術人員會清楚，產生等離子體可以使用低的也可以使用高的功率並且不論是連續的波還是脈衝的等離子體。
優選地，所述等離子體功率用一種0-50W功率和流速為0-20sccm的等離子體產生，一般地是在連續波的條件下。然而，也可在用脈中波的情況下在等離子體功率和流速中做相應的校正，如領域內的一般技術人員所知。
在本發明的一個優選方法中所述的酸是丙烯酸並且所述的碳氫化合物是一種雙烯並且特別是一種雙不飽和的烯，例如1，7-辛二烯。
在本發明的另一個方法中所述的等離子體在饋送氣體中含有50-100％不飽和酸，例如丙烯酸和0-50％己烷或者二烯，(例如1，7-辛二烯)。
在本發明的另一個優選實施例，在饋送氣體中，所述等離子體含有以下比例的酸(例如丙烯酸)和己烷或者二烯(例如1，7-辛二烯)；酸 烯(例如丙烯酸)％ (例如1，7-辛二烯％)50 5060 4070 3080 2090 10100 0現在參照以下的表和圖，僅通過舉例說明本發明的一個實施例。
表1示出由丙烯酸和1，7-辛二烯形成的PCP的XPS結果匯總；表2示出由丙酸製備的PPs的XPS的結果匯總；表3示出由脈衝的丙烯酸製備的PPs的XPS結果匯總；表4示出由高功率丙烯酸製備的PPs的XPS結果匯總；表5示出在接觸4天後各種表面對DED的粘著性；

圖1示出角質細胞附著在各種表面上；圖2示出角質細胞附著在高功率丙烯酸、脈衝的丙烯酸和丙酸表面上；圖3是角質細胞轉移後在DED上留著率的測量；圖4(a)示出與DED接觸4天後由於角質細胞從膠原I、載體和碳氫化合物表面轉移到DED上造成的染色；
圖4(b)示出與DED接觸4天後由於角質細胞從含酸的表面轉移到DED上造成的染色；圖5示出與DED接觸4天後由於角質細胞從脈衝的丙烯酸表面轉移到DED上造成的染色；圖6示出與DED接觸4天後由於角質細胞從丙酸表面轉移到DED上造成的染色；圖7示出與DED接觸4天後由於角質細胞從高功率的丙烯酸表面轉移到DED上造成的染色。
材料和方法等離子體共聚合丙烯酸和1，7-辛二酸及丙酸從Aldrich Chemical Co.(英國)得到。所述單體在幾個冷凍-泵吸/解凍循環之後原封不動地使用。聚合在一個圓柱形的反應器容器中(直徑8釐米，長度50釐米)進行，由兩級旋轉泵抽真空。等離子體由一個射頻信號(13.56MHz)發生器和一個電感耦連到所述反應器容器上的放大器維持。反應器中的基礎壓力是3×10-3毫巴。
丙烯酸和1，7-辛二烯在2W的等離子體功率和2.0sccm的總流速下共聚合。等離子體共聚合物沉積在一種載體聚羥基丁酸(Goodfellow，Cambidge，UK)和乾淨的鋁箔上(用於XPS分析)。共聚合時的壓力典型地是4.0×10-2毫巴。另一個用於沉積丙酸的聚合用同樣的條件進行。另外丙烯酸用脈衝等離子條件進行沉積。等離子功率為50W，使用5個毫秒的等離子佔和40毫秒的等離子空的佔空周期。單體流速是2.0sccm。最後，丙烯酸在連續波高功率的條件下沉積。所用的功率是7.5W，同時流速為2.0sccm。
對於所有的共聚合，都使用了20分鐘的沉積時間。在等離子關閉後讓單體混合物繼續流動20分鐘。這樣做是為使由於暴露於實驗室環境吸取的大氣中的氧最少。
X射線光電子能譜法XP光譜由採用Mg KαX射線的VG CLAM2型光電子分光計得到。對於每個樣品，分別使用通過50和20電子伏特的分析器獲取測量掃描光譜(0-1100電子伏特)和窄帶光譜。使用Spectra6.0軟體(R.Unwin Software，Cheshire)獲得光譜。隨後的處理用Scienta數據處理軟體(Scienta Instruments，Uppsala，Sweden)進行。分光計用Au 4f 7/2峰位置在84.00電子伏特標定，並且在C ls與F ls之間的光譜在PTFE樣品中於397.2電子伏特測量，這與Beamson和Briggs報導的397.19電子伏特測量值很好的吻合。
細胞培養從皮/表皮結合處分離正常成年人角質細胞(從乳房復位成形術和腹壁成形術得到)，方法依以前所述(14)。細胞在完全格林氏培養基中培養，此種培養基包括霍亂毒素(0.1毫微摩爾)、氫化可的松(0.4微克/毫升)、EGF(10毫微克/毫升)、腺嘌呤(1.8×10-4摩爾)、三碘-1-甲狀腺原氨酸(2×10-7摩爾)、胰島素(5毫克/毫升)、轉鐵蛋白(5微克/毫升)、穀氨酸(2×10-3摩爾)、兩性黴素B(0.625微克/毫升)，青黴素(1000免疫單位/毫升)、鏈黴素(1000微克/毫升)及100％的胎牛血清。在37℃，5％的二氧化碳環境中培養細胞。用臺盼藍染色和標準血球計數器進行總細胞計數和可存活細胞計數。
細胞培養試驗只用新鮮分離的細胞。通過在層流室中過夜風乾溶於0.1摩爾乙酸(200微克/毫升)中的膠原I(32微克/平方釐米)製備膠原塗覆的載體的樣品。細胞以12.0×106個細胞/毫升的密度接種在三份組表面上，用直徑10毫米的不鏽鋼環保持樣品在6穴組織培養盤中扁平。培養24小時後，用MTT-ESTA檢測測定每三份的一個樣品上的角質細胞附著(15)。這估計了可成活細胞數，這種測定以前提示了人類角質細胞數(16)中的平行增長(16)。細胞在PBS中使用0.5毫克/毫升的MTT培育40分鐘。用酸化異丙醇洗提染色。光密度測量是在540納米進行的，使用已減除的630納米蛋白參考波長做參考。
每三份中的餘下的兩個樣品去與DED和添加的格林氏培養基接觸使該表面處於空/液介面上。該DED/表面創面模型在37℃下置於培養箱中4天，4天後把表面從DED分開並用如上所述MTT測定評估表面向DED轉移的程度。DED的MTT要求把DED在染色洗提前用MTT培育120分鐘。
結果XPS特性用丙烯酸和1，7-辛二烯準備PCP的XP檢測掃描光譜只揭示在沉積中有碳和氧。O/C比示於表1中。隨著饋送的單體中丙烯酸的摩爾數加大O/C比增加。對於各種含氧官能團進行了PCP的C ls核能級譜峰擬合。首先為加樣進行了光譜校正，把碳氫化合物信號設定到285電子伏特，然後擬合了以下官能團在+1.5電子伏特移位的醇/醚(C-OH/R)；在+3.0電子伏特移位的羰基(C＝O)；在+4.0電子伏特移位的羧酸/酯(COOH/R)；而在+0.7電子伏特移位的結合在羧酸鹽(C-COOH/R)上的一個β-位碳。所述峰擬合結果及一種樣品的峰擬合(Faa/Ftot＝1)示於表1。在該峰擬合中FWHM組份峰保持相同並且在1.4-1.6電子伏特範圍。該組份峰的高斯峰與洛倫茲峰的比(G/L)也保持恆定並且在0.8-0.9的範圍。儘管XPS不能區分羧酸和酯官能團，等離子體聚合化丙烯酸的掠射角紅外線分光測量顯示，在本研究中所用的低功率下，在XP光譜中的羧基峰可以歸為羧酸而不是酯(10)。在PCP中出現的其它碳-氧官能團(除了羧酸之外)包括羰基和醇/醚。這是由於等離子體中單體破裂造成的。在沉積物與從等離子體容器壁上吸收的水分之間的反應(在聚合時)及大氣中的氧氣與水之間的反應(在聚合後)也對此起了作用。C-OH/R峰被認為主要是羥基。在一個以前的研究中我們更加詳細地檢驗了丙烯酸/1，7-辛二烯的PCP中含氧官能團的同一性(用饋送單體中不同摩爾數丙烯酸進行比較)(11)。基於此研究，我們認為，在PCP表面上，羧酸官能團對角質細胞起作用，而不是C-OH。後者應當以高濃度出現(25％)以促進細胞附著(8)。
從(i)丙酸的連續波沉積，(ii)脈衝丙烯酸及(iii)高功率丙烯酸測定的XP光譜也只揭示在沉積中的碳和氧，並且用以上對丙烯酸定出的同樣標準擬合。對丙酸，脈衝丙烯酸及高功率丙烯酸的曲線擬合結果分別示於表2、表3和表4中。基於我實驗室對脈衝等離子體的研究，可以期望脈衝等離子體中的低佔空比會產生更高的羧基留著率(21)。由比較表1和表4可見增加等離子體功率導致-50％的羰基官能團留著率下降，及相應的醇/醚及羰基官能團的增加。
表1 由丙烯酸和1，7-辛二烯製備PCP的XPS結果匯總％C ls核能級中的官能團
一個β-移位碳以與在峰擬合上附加的羧酸鹽連結等幅度地方式結合在羧酸鹽(在從碳氫化合物+0.7電子伏特移位處的(C-COOH/R))上。
表2 由丙酸製備的PPs的XPS的結果匯總％C ls核能級中的官能團
一個β-移位碳以與在峰擬合上附加的羧酸鹽連結等幅度地方式結合在羧酸鹽(在從碳氫化合物+0.7電子伏特移位處的(C-COOH/R))上。
表3 由脈衝的丙烯酸製備的PPs的XPS結果匯總％C ls核能級中的官能團
一個β-移位碳以與在峰擬合上附加的羧酸鹽連結等幅度地方式結合在羧酸鹽(在從碳氫化合物+0.7電子伏特移位處的(C-COOH/R))上。
表4 由高功率丙烯酸製備的PPs的XPS結果匯總％C ls核能級中的官能團
一個β-移位碳以與在峰擬合上附加的羧酸鹽連結等幅度地方式結合在羧酸鹽(在從碳氫化合物+0.7電子伏特移位處的(C-COOH/R))上。
細胞在表面上的附著對於所有的表面，在分離角質細胞之後用計數器進行了細胞計數，示出97％細胞成活率(2.5×107總細胞)。24小時後用MTT測定檢查這些表面。
(i)丙烯酸/1，7-辛二烯結果示於圖1。數據顯示單體流中用50％和100％丙烯酸製備的含酸表面性能稍好於膠原I。在流中用25％的酸製造的表面與TCPS可相比較，但是角質細胞在碳氫化合物表面上附著不佳。
(ii)丙酸、高功率丙烯酸、脈衝丙烯酸結果示於圖2。細胞雖然附著於所有的表面，但是，膠原I顯示附著程度較高。細胞附著的程度不是接著從表面向DED轉移的程度的預報因子，但是注意到用不同單體前體和/或等離子體產生的表面的確支持角質細胞的附著是重要的。細胞附著顯然是隨後的轉移成功的前提。
向DED轉移細胞表5匯總了從DED分離載體聚合物表面的結果。膠原I表面和在氣體流中用100％製備的表面對DED粘著良好，表示角質細胞幾乎都從表面轉移到DED上。在單體流中用低量酸製備的表面粘著較差，而載體和碳氫化合物表面易於從DED剝離，表示細胞轉移程度較低。
表5 在接觸4天後各種表面對DED的粘著性
在表面和DED並置4天後把兩者分開，而圖2中示出在表面上進行MTT測定的結果，圖3中示出在DED上進行MTT測定的結果。與在轉移到DED上的相比較所有例中保留在表面上的細胞的光密度極低。對向DED的轉移進行檢驗時，在膠原I上生長的細胞顯示最高的值，約大於僅用載體時所見的4倍。生長在用25％酸處理的表面上的細胞的轉移與僅用載體時所見可相比較。生長在用50％和100％酸處理的表面上的細胞卻顯示顯著多地轉移到DED上。生長在碳氫化合物處理的表面上的細胞顯示很少向DED轉移。
角質細胞從丙烯酸/1，7-辛二烯PP向DED轉移的照像證據示於圖4(a)和圖4(b)。碳氫化合物(1，7-辛二烯)和載體(biopol)表面未染色，而膠原I和含酸表面卻因為在DED上的角質細胞顯示染為紫色。圖5示出由於細胞從脈衝的丙烯酸PP轉移造成的染色。圖6示出用丙酸PP的同樣結果。而圖7示出由於細胞從高功率的丙烯酸PP(沉積於無紡纖維上)轉移造成的DED染色。
討論本研究的目的是擴大本實驗室的原有工作，這些研究揭示使用PCP表面用於角質細胞附著和增生，但是對向DED的轉移無助。角質細胞對這些研究提出了特殊的挑戰，因為它們在許多基底上經歷不可逆的終末分化。從而細胞失去了遷移或形成群體的能力，而這些能力特性卻是在從支持表面向創面轉移角質細胞以達到表皮再生所需要的。
因此本發明的目的是檢驗在什麼範圍內促進附著的表面會促進細胞向一個簡單的離體創口模型轉移。
人類角質細胞在含有各種濃度羧酸官能團的PCP表面上可成功地培養，在附著的細胞數上，與一種優選的角質細胞培養基膠原I上的細胞表現可相比較。
使用碳氫化合物等離子聚合物作陰性對照是重要的，因為早先的一項研究懷疑過TCPS做對照的適宜性(17)。這樣的顧慮是由於在製造過程中對TCPS的表面處理引起的，這種表面處理視表面氧化程度不同可以使TCPS對水溶液不穩定。還不清楚不同批次的TCPS是否接收確切相同量的表面氧化，也不清楚此種表面氧化是否易於受老化的影響。
儘管細胞附著對官能團濃度的依從性還有待研究，先前已經表明角質細胞在有2-3％低量酸官能團的表面上加強附著(11)。然而，在本研究中顯示在含21％酸的表面上附著也並不低。應當提醒的是酸PCP還含有其它的O-C官能團，主要是C-OH。即使如此，我們以前的研究顯示酸PCP在融合程度及細胞數方面與膠原I可相比較(由DNA測定)。
在含水的媒介中，酸PCP可以水合，如我將於另文所述(18)。試驗顯示酸PCP的穩定性取決於單體流中丙烯酸的濃度。高濃度的酸(＞60％總流量)導致欠穩定的表面。此要求使得把低濃度的酸表面(＜5％)的發展被打上對促進附著及續後的增生「理想」的標籤。然而談及從酸表面上轉移，很可能要用不同的標準。儘管低濃度酸官能團賦予表面穩定性，角質細胞可能因良好地附著於其上而防礙了轉移。在個評估是從轉移實驗的結果得出的，實驗中饋送單體中25％的酸流量(在PCP表面上2.6％的羧酸)顯示對DED最低的轉移。相反饋送單體中100％的酸流量(在PCP表面上＞20％的羧酸)細胞轉移顯著地高。這些表面的性能僅被膠原I勝出。以50％酸的饋送單體流量，轉移介於高酸和低酸官能團表面之間，正如所料。這些結果指出促進附著和增生的理想表面可能不是產生最大程度的從PCP向DED轉移的表面。從碳氫化合物PP的低量轉移證實這樣一種表面不能夠支持增生狀態的角質細胞。儘管，細胞轉移對官能團濃度的依從性還需要充分地探討，用高量酸官能團時角質細胞表現出加強了從表面轉移。因此可以清楚在促進增生的表面(低酸官能團)和促進轉移的表面(高酸官能團)之間存在一種折衷。
在含血清的培養基中，已經表明細胞受一種蛋白質的吸附層的作用，而不是直接受培養基本身作用(19)，這種介導蛋白層吸附(幾乎是)自發的。細胞對受研究的培養基的響應提示要麼是蛋白膜的成分有變化，要麼是這些蛋白在吸附後的活性有變化，或者兩者兼有。實驗表明一些粘性蛋白支持細胞附著，例如纖維結合蛋白和玻璃粘連蛋白。Tidwell等(12)表述了在用有不同末端的鏈烷硫醇鹽(alkanethiolates)化學藥品在SAM上形成的蛋白層與各自支持不同層次的牛動脈內皮細胞附著的蛋白層之間的區別。儘管細胞附著和擴散是細胞增生的重要條件，但是它們並不是排他性的條件。血清也是一種生長因子的來源並且已經表明對於低級哺乳動物細胞是必須的。實驗提示把生長因子吸收到細胞外間質材料中在其活性化中起重要的作用(20)。
結果表明可以從大範圍的起始單體中提供羧酸官能團。丙烯酸是不飽和類有機酸中的一種，而丙酸是飽和有機酸。因此，只要單體可充分地揮發以流經等離子室，可料想任何有機酸都應當適於用作製造能夠顯示角質細胞附著及續後向DED轉移的PP表面。而且結果表明一個寬範圍的等離子條件能夠製備促進所需要的細胞附著和轉移的表面。我們表明，在連續波的條件下，高和低功率的方式都可以成功地製備所需特性的PP。另外，把等離子體進行脈衝提供另一種在表面上沉積酸官能團的途徑。另一個考慮是一個範圍的載體表面可以用於等離子沉積。在此研究中一種可生物降解的載體(biopol)，和一種不可以生物降解的載體(聚丙烯，Delnet，由AET Specialty Nets供應)，表明它們均可以塗覆以促進角質細胞向DED轉移的PP。數據提示，儘管載體膜可在其特性上有別(例如溶解性，吸收性)，PP沉積在影響細胞性能的載體上是首要的(儘管諸如結構/孔徑之類的形態影響可能意味著PP覆層不是均勻的「扁平」表面，照樣在載體輪廓上發生沉積。因此當PP覆層的載體用於DED時，細胞在不會與DED發生接觸處附著就位)。人們設想，任何轉移現象的外科應用都會要求一種膜樣的載體而不是網樣的載體，以保證細胞在PP表面上的最大附著，而不是在載體材料的覆層的輪廓之內。
基於以上的討論，很明顯酸PCP在支持角質細胞附著和轉移上的成功是多因素的。然而，我們的結果提示角質細胞的附著和轉移特別地由羧酸官能團促進。這最可能是通過從血清形成的介導蛋白層的控制起作用。
含高濃度酸官能團(典型地羧基)的PCP表面與碳氫化合物相比較更促進角質細胞的附著和向DED的轉移。在含到20％酸官能團的表面上的初始附著與培養24小時後細胞在膠原I基底上的表面附著可相比較。
對於含高濃度的羧酸官能團表面細胞從PCP向DED的轉移是最多的，儘管在低酸官能團濃度的表面也觀察到了轉移。用從飽和和不飽和有機酸沉積的PP都達到細胞轉移。在連續波的條件下，低和高功率法都能夠產生促進細胞轉移的PP。脈衝等離子體也提供了一種製造促轉移PP表面的途徑。
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權利要求
1.一種細胞培養表面，至少一個細胞可以可釋地附著於這種細胞培養表面，其特徵在於，所述表面有高度酸官能團。
2.如權利要求1所述的細胞培養表面，其特徵在於，所述表面提供一種基底，至少一個細胞可以在其上生長和增生。
3.如權利要求1或2所述的細胞培養表面，其特徵在於，所述表面便利於所述的細胞以非分化的狀態生長和增生。
4.如權利要求1或2所述的細胞培養表面，其特徵在於，所述的表面便利於所述的細胞以分化的狀態生長和增生。
5.如權利要求1-4中任一項所述的細胞培養表面，其特徵在於，所述的表面不對附著於其上的細胞誘發免疫反應。
6.如權利要求1-5中任一項所述的細胞培養表面，其特徵在於，所述的表面對患者有很微小的毒性。
7.如權利要求1-6中任一項所述的細胞培養表面，其特徵在於，所述的表面適用於使用哺乳動物源的細胞。
8.如權利要求7所述的細胞培養表面，其特徵在於，所述哺乳動物細胞是人類的。
9.如權利要求1-8中任一項所述的細胞培養表面，其特徵在於，所述的表面適用於使用以下的任何細胞類型角質細胞；軟骨細胞；成骨細胞；內皮細胞；尿道上皮細胞；表皮細胞。
10.如權利要求9所述的細胞培養表面，其特徵在於，所述細胞類型是角質細胞。
11.如權利要求1-10中任一項所述的細胞培養表面，其特徵在於，所述的表面酸官能團由羧酸提供。
12.一種細胞培養表面，它通過羧酸的等離子聚合得到。
13.如權利要求1-12中任一項所述的細胞培養表面，其特徵在於，所述的表面的酸官能團是5-20％之間表面酸官能團。
14.如權利要求1-12中任一項所述的細胞培養表面，其特徵在於，所述的表面酸官能團大於20％。
15.如權利要求1-14中任一項所述的細胞培養表面，其特徵在於，所述酸官能團由丙酸提供。
16.如權利要求1-14中任一項所述的細胞培養表面，其特徵在於，所述的酸官能團由丙烯酸提供。
17.如權利要求1-16中任一項所述的細胞培養表面，其特徵在於，所述的表面由用一種含酸單體的等離子體共聚物覆以基底提供。
18.如權利要求17所述的細胞培養表面，其特徵在於，所述的共聚物是丙烯酸和一種碳氫化合物的混合物。
19.如權利要求18所述的細胞培養表面，所述碳氫化合物是1，7-辛二烯。
20.如權利要求18或19所述的細胞培養表面，其特徵在於，在饋送氣體中丙烯酸以50％-100％提供而1，7-辛二烯以0-50％提供。
21.一種用於組織工程的載體，含有根據權利要求1-20中任一項所述的細胞培養表面。
22.如權利要求21所述的載體，其特徵在於，所述的載體是一種治療性的載體，並含有權利要求1-20中任一項所述的細胞培養表面，選擇的細胞附著於該培養表面上，其中，所述的治療性載體適於施用於或者說植入於需要治療性組織工程的患者。
23.如權利要求22所述的治療性載體，其特徵在於，所述的治療性載體含有間質材料，所述細胞用於外科植入手術。
24.如權利要求22或23所述的治療性載體，其特徵在於，所述的載體適用於以下的任何細胞類型角質細胞、軟骨細胞、成骨細胞、內皮細胞、尿道上皮細胞、表皮細胞。
25.一種美容載體，含有一種權利要求1-20中任一項所述的細胞培養表面。
26.一種製備如權利要求1-20中任一項所述的細胞培養表面的方法，包括(i)提供一種酸。(ii)產生所述酸的等離子體；以及(iii)用所述的等離子體塗覆適當的基底以提供一種留著高度酸官能團的表面聚合物。
27.如權利要求27所述的方法，其特徵在於，所述的酸是丙烯酸或丙酸。
28.一種製備如權利要求1-20所述的細胞培養表面的方法，包括(i)在饋送氣體中混合選擇比例的含酸單體和一種碳氫化合物；(ii)產生所述的混合物的等離子體；和(iii)用所述的等離子體塗覆適當的基底以提供一種留著高度酸官能團的表面聚合物/共聚物。
29.如權利要求26-28中任一項所述的方法，其特徵在於，所述等離子體在連續波的條件下用一種0-50W的等離子體功率和0-20sccm的流速產生。
30.如權利要求26-28中任一項所述的方法，其特徵在於，所述等離子體用脈衝波條件產生。
31.如權利要求28-30中任一項所述的方法，其特徵在於，所述酸是丙烯酸並且所述的碳氫化合物是1，7-辛二烯。
32.如權利要求31所述的方法，其特徵在於，所述的等離子體在饋送氣體中含有50-100％的丙烯酸和0-50％的1，7-辛二烯。
33.如權利要求31所述的方法，其特徵在於，所述的等離子體含有以下比例的丙烯酸和1，7-辛二烯丙烯酸％ 1，7-辛二烯％50506040703080209010100 0
34.如權利要求28所述的方法，其特徵在於，所述的等離子體含有以下比例的酸和碳氫化合物酸％ 碳氫化合物％50506040703080209010100 0
全文摘要
本發明涉及一種細胞培養表面,細胞附著於所述細胞培養表面,並且增生,而且所述細胞培養表面使所述的附著細胞可以從所述表面脫離以用於各種治療性和美容性組織工程/外科手術。
文檔編號A61P17/02GK1357039SQ0080916
公開日2002年7月3日 申請日期2000年6月23日 優先權日1999年6月23日
發明者羅伯特·肖特, 大衛·哈多, 希拉·麥克尼爾 申請人:塞爾特蘭股份有限公司