低或無飽和脂肪酸的轉基因卡諾拉的製作方法

2023-05-06 15:12:36

一些實施方案通常涉及某些δ-9去飽和酶，編碼這些酶的核酸，以及在植物細胞中表達該酶的方法。一些實施方案涉及利用某些δ-9去飽和酶的活性降低植物材料(例如種子)中飽和脂肪酸的組成百分比，並增加ω-7脂肪酸的組成百分比。另外的實施方案涉及利用種子特異性啟動子優先在種子中表達δ-9去飽和酶。本文還公開了通過特定實施方案中的方法製備的植物和植物材料，以及由那些含有小於3.5％或小於2.7％的飽和脂肪酸的植物產生的油。背景植物源油(vegetable-derivedoils)已逐漸取代了動物來源的油脂作為飲食脂肪攝入的主要來源。然而，大多數工業化國家的飽和脂肪攝入量仍然保持在總熱量消耗的15％至20％左右。為了推廣更健康的生活方式，美國農業部(usda)最近建議，飽和脂肪含量低於每日熱量攝入量的10％。為了促進消費者意識，美國農業部頒布的現行標註指南現在要求總飽和脂肪酸水平低於每14克1.0克方可獲得「低飽和」標註，低於每14克0.5克方可獲得「無飽和」標註。這意味著植物油要獲得「低飽和」或「無飽和」標註，飽和脂肪酸含量需要分別低於7％和3.5％。自從這些指南發布以來，消費者對「低飽和」和「無飽和」油的需求激增。到目前為止，這一需求主要是由卡諾拉油來滿足的，葵花油和紅花油也有貢獻，但小得多。雖然不飽和脂肪(單不飽和及多不飽和)是有益的(特別是在適度消費時)，但飽和脂肪和反式脂肪不是。飽和脂肪和反式脂肪會增加血液中不想要的低密度脂蛋白膽固醇水平。膳食膽固醇即使在不提高低密度脂蛋白的情況下也會增加低密度脂蛋白膽固醇，並可能導致心臟病。因此，建議選擇低飽和脂肪、低反式脂肪和低膽固醇食物作為健康飲食的一部分。油，無論是植物還是動物來源，其特徵主要由油分子中的碳原子數和氫原子數以及脂肪酸鏈中包含的雙鍵的數量和位置決定。大多數來自植物的油是由不同量的棕櫚酸(16:0)，硬脂酸(18:0)，油酸(18:1)，亞油酸(18:2)和亞麻酸(18:3)脂肪酸組成的。通常，棕櫚酸和硬脂酸被稱為「飽和的」，因為它們的碳鏈被氫原子飽和，因此沒有雙鍵；它們含有最大可能數量的氫原子。然而，油酸，亞油酸和亞麻酸分別是具有一個、兩個和三個雙鍵的18碳脂肪酸鏈。油酸通常被認為是單不飽和脂肪酸，而亞油酸和亞麻酸被認為是多不飽和脂肪酸。美國農業部「無飽和」油產品的定義(意思是具有小於3.5％飽和脂肪酸含量的油產品)以組合的飽和脂肪酸重量含量(與脂肪酸總量相比)計算。卡諾拉油的飽和脂肪酸水平是所有植物油中最低的。「卡諾拉」是指這樣的油菜(芸苔屬)，其芥子酸(c22:1)含量為至多2重量％，基於種子的總脂肪酸含量(優選至多0.5重量％，最優選基本上為0重量％)，並在破碎後產生在脫脂(無油)粕中含有少於30μmol/g硫代葡萄糖苷的風乾粕。這些類型的油菜與該物種的傳統品種相比具有優異的可食性。據推測，在油用種子中，脂肪酸合成主要發生在質體中。脂肪酸合成的主要產物是棕櫚酸(16:0)，其似乎被高效地延伸成為硬脂酸(18:0)。然後，當其還在質體中時，飽和脂肪酸可以被一種稱為醯基-acpδ-9去飽和酶的酶去飽和，從而引入一個或多個碳-碳雙鍵。具體來說，硬脂酸可以被質體δ-9去飽和酶快速去飽和而產生油酸(18:1)。事實上，棕櫚酸也可以被質體δ-9去飽和酶去飽和而成為棕櫚油酸(16:1)，但在大多數植物油中，這種脂肪酸僅微量存在(0-0.2％)。因此，質體中的脂肪酸合成的主要產物是棕櫚酸、硬脂酸和油酸。在大多數油中，油酸是合成的主要脂肪酸，因為飽和脂肪酸以低得多的比例存在。新合成的脂肪酸從質體轉運到細胞質。隨後在細胞質中去飽和的植物脂肪酸似乎限於油酸，其可以通過作用於酯化至磷脂醯膽鹼(pc)的油醯基或線基油基底物上的微粒體去飽和酶而被去飽和至亞油酸(18:2)和亞麻酸(18:3)。此外，依植物不同，可以通過延伸(至20:1、22:1和/或24:1)或通過添加官能團進一步修飾油酸。然後這些脂肪酸，與棕櫚酸和硬脂酸等飽和脂肪酸一起，在內質網膜中被組裝成甘油三酯。植物醯基-acpδ-9去飽和酶是可溶的。它位於質體基質中，並使用被酯化到acp的新合成的脂肪酸，主要是硬脂醯-acp，作為底物。這與其他δ-9去飽和酶形成對照：其他δ-9去飽和酶位於內質網膜(er或微粒體)中，使用被酯化到co-a的脂肪酸作為底物，並使棕櫚酸和硬脂酸等兩種飽和脂肪酸均飽和。美國專利5,723,595和6,706,950涉及植物去飽和酶。酵母δ-9去飽和酶基因已經從釀酒酵母中分離、克隆並測序。stukeyetal.(1989)j.biol.chem.264:16537-44；stukeyetal.(1990)j.biol.chem.265:20144-9。該酵母基因已被引入菸草葉組織(polashcoketal.(1991)fasebj.5:a1157；polashoketal.(1992)plantphysiol.100:894-901)中，並且似乎在該組織中表達。此外，在番茄中表達了該酵母基因。參見wangetal.(1996)j.agric.foodchem.44:3399-402；和wangetal.(2001)phytochemistry58:227-32。儘管在菸草和番茄中使用這種酵母δ-9去飽和酶基因都報告了某些不飽和脂肪酸的某些增加以及某些飽和脂肪酸的某些降低，但菸草和番茄顯然不是油料作物。此酵母基因也已被引入歐洲油菜。美國專利5,777,201。另一種不同的真菌醯基輔酶aδ-9去飽和酶，來自構巢麴黴，已經被引入到卡諾拉中，在種子油中實現了降低的飽和脂肪酸水平。美國專利申請公開us2008/0260933a1。構巢麴黴醯基輔酶aδ-9去飽和酶對硬脂酸酯的消耗(61-90％)比對更富的棕櫚酸脂肪酸的消耗(36-49％)更多。公開本文公開了新型真菌δ-9去飽和酶；包含至少一個編碼此類去飽和酶的核苷酸序列的核酸；包含上述任何一種的植物、植物材料(例如種子)、植物部分和植物商品。一些實施方案的方面的例子是從灰色大角間座殼(magnaporthegrisea)，穎枯小球腔菌(leptosphaerianodorum)和美洲棉鈴蟲(helicoverpazea)分離的真菌δ-9去飽和酶。一些實例包括對棕櫚酸或硬脂酸具有底物偏好的天然和合成的δ-9去飽和酶。一些實施方案包括編碼δ-9去飽和酶的分離的核酸分子，其包含與選自seqidno:1、seqidno:26、seqidno:27、seqidno:28seqidno:29、seqidno:30、seqidno:31、seqidno:32和seqidno:33的序列至少80％相同的胺基酸序列。在具體實例中，核酸分子包含與選自seqidno:2、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19、seqidno:20、seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23、seqidno:24和seqidno:25至少60％相同的序列。這些實施方案和進一步的實施方案可以包括分離的δ-9去飽和酶多肽，其包含與選自seqidno:1、seqidno:26、seqidno:27、seqidno:28seqidno:29、seqidno:30、seqidno:31、seqidno:32和seqidno:33的序列至少80％相同的胺基酸序列。還公開了在植物細胞中表達上述核酸和/或多肽中的至少一種的方法。特定的實施方案利用δ-9去飽和酶的活性，使得在包含所述植物細胞的植物、植物材料(例如種子)和/或植物部分、和/或由上述任何一種生產的植物商業產品中的飽和脂肪酸的組成百分比可以降低。在某些實施方案中，所述植物、植物材料、植物部分和/或植物商業產品中的ω-7脂肪酸可以同時增加。另外的實施方案利用種子特異性表達來進一步降低種子油中飽和脂肪酸的水平。一些實施方案包括減少植物，植物材料，植物部分和/或植物商業產品的飽和脂肪酸的量的方法，所述方法包括用編碼δ-9去飽和酶多肽的核酸分子轉化植物細胞本發明使得該細胞中的飽和脂肪酸的量減少。一些實施方案包括用於產生基因工程化植物的方法，所述植物與相同物種的野生型植物相比在該植物中包含減少量的飽和脂肪酸。這樣的方法可以包括用編碼一種或多種δ-9去飽和酶多肽的核酸分子或本發明的δ-9去飽和酶多肽的一個或多個拷貝轉化植物材料(或植物細胞)，並培養轉化的植物材料(或植物細胞)獲得植物。在具體實例中，可以用編碼本發明的δ-9去飽和酶多肽的核酸分子轉化來自擬南芥屬物種的植物細胞和/或植物材料。在其它具體實例中，可以轉化δ-9去飽和酶基因的兩個或更多個拷貝，其中每個δ-9去飽和酶基因由一個不同的啟動子控制。在其它具體實例中，所述兩個或更多個啟動子是種子特異性啟動子。從以下參考附圖進行的幾個實施例的詳細描述，上述和其它特徵將變得更加清晰。附圖說明圖1顯示pdab7305的質粒圖譜。圖2示出了與nexera710tm卡諾拉對照植物和由218-11.30hl轉基因卡諾拉植物組成的陽性對照植物相比，分離的t1卡諾拉植物的大批t2種子中tsfa(％)的分布。圖3顯示了與陰性對照nexera710tm卡諾拉植物相比，來自三個選擇的轉基因事件的t2種子群體中tsfa的分布。暗點代表tsfa低於3.5％的種子後代(暗線)。如圖所示，tsfa低於3.5％的植物產生不同量的產量，並且具有2至10個拷貝的pat轉基因，這些轉基因包含在與and9ds轉基因相同的t鏈整合體中。圖4示出了卡諾拉單一種子中的tsfa分布和飽和脂肪酸百分比(野生型對照植物被排除，以便該圖表示轉基因卡諾拉事件的tsfa值)。序列表使用37c.f.r.§1.822中定義的核苷酸鹼基的標準字母縮寫表示所附序列表中列出的核酸序列。僅顯示每個核酸序列的一條鏈，但互補鏈被理解為通過任何提及所顯示的鏈包括。在隨附的序列表中：seqidno:1顯示構巢麴黴醯基輔酶aδ-9去飽和酶(在某些地方稱為and9ds)蛋白質的胺基酸序列。seqidno:2顯示了構巢麴黴醯基輔酶aδ-9去飽和酶基因(在某些地方稱為and9ds)的v3的核酸序列。seqidno:3顯示pdab7305的第一植物轉錄單位(ptu)的核酸序列。seqidno:4顯示pdab7305的第二ptu的核酸序列。seqidno:5顯示pdab7305的第三ptu的核酸序列。seqidno:6-11顯示了在一些實施方案中可能有用的引物和探針的序列。seqidno:12是通過pcr擴增的灰色大角間座殼醯基輔酶aδ-9去飽和酶基因(在一些地方稱為mgd9ds)的示例性片段。seqidno:13是示例性的無內含子mgd9ds克隆。seqidno:14顯示了編碼第一種穎枯小球腔菌醯基輔酶aδ-9去飽和酶(在一些地方稱為lnd9ds-1)的示例性核酸序列。seqidno:15顯示了編碼第二種穎枯小球腔菌醯基輔酶aδ-9去飽和酶(在一些地方稱為lnd9ds-2)的示例性核酸序列。seqidno:16顯示了來自灰色大角間座殼的示例性天然δ-9去飽和酶基因(標記為mgd9dsv1)的編碼區。seqidno:17顯示了來自美洲棉鈴蟲的示例性天然δ-9去飽和酶基因(標記為hzd9dsv1)的編碼區。seqidno:18顯示了來自穎枯小球腔菌的示例性天然δ-9去飽和酶(lnd9ds-2v1)基因的編碼區。seqidno:19顯示了來自灰色大角間座殼(mgd9dsv2)的示例性卡諾拉優化的δ-9去飽和酶基因的序列。seqidno:20顯示了來自美洲棉鈴蟲的示例性卡諾拉優化的δ-9去飽和酶基因(hzd9dsv2)的序列。seqidno:21顯示了來自穎枯小球腔菌的示例性卡諾拉優化的δ-9去飽和酶基因(lnd9ds-2v2)的序列。seqidno:22顯示了來自穎枯小球腔菌的另一示例性卡諾拉優化的δ-9去飽和酶基因(lnd9ds-2v3)的序列。seqidno:23顯示了來自美洲棉鈴蟲的另一示例性的卡諾拉優化的δ-9去飽和酶基因(hzd9dsv3)的序列。seqidno:24顯示了一種編碼構巢麴黴δ-9去飽和酶的示例性核酸序列(在一些地方稱為and9dsv2)。seqidno:25顯示了第二種編碼構巢麴黴δ-9去飽和酶的示例性核酸序列(在一些地方稱為and9dsv3)。seqidno:26顯示了來自灰色大角間座殼(mgd9ds)的示例性天然δ-9去飽和酶的胺基酸序列。seqidno:27顯示了來自美洲棉鈴蟲的示例性天然δ-9去飽和酶(hzd9ds)的胺基酸序列。seqidno:28顯示了來自穎枯小球腔菌的示例性天然δ-9去飽和酶(lnd9ds-2)的胺基酸序列。seqidno:29顯示了由seqidno:24-25(and9ds)所例示的核酸編碼的胺基酸序列。seqidno:30顯示另一示例性and9ds去飽和酶的胺基酸序列。seqidno:31顯示來自釀酒酵母的示例性天然δ-9去飽和酶(scole1)的胺基酸序列。seqidno:32顯示了示例性and9ds去飽和酶的n-末端68個殘基(1-68)。seqidno:33顯示了示例性and9ds去飽和酶的c末端175個殘基(281-455)。具體實施方式(s)i.幾個實施例的概述我們以前將來自構巢麴黴的真菌醯基輔酶aδ-9去飽和酶引入油菜籽，從而在種子油中實現降低的飽和脂肪酸水平。美國專利申請公開us2008/0260933a1。構巢麴黴δ-9去飽和酶提供的硬脂酸耗竭(61-90％)比種子油中更豐富的棕櫚酸脂肪酸的耗竭(36-49％)更多。已經發現，提供多個拷貝的構巢麴黴δ-9去飽和酶能夠將卡諾拉中的飽和脂肪酸水平降低到3.5％以下。本文公開了編碼δ-9去飽和酶多肽的核酸分子，其包含與選自seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19、seqidno:20、seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23、seqidno:24和seqidno:25的序列至少60％相同的核苷酸序列。在一些實施方案中，核酸分子還可以包含可操作地連接到δ-9去飽和酶多肽編碼序列的基因調節元件。在特定實施方案中，基因調節元件可以是菜豆蛋白啟動子、菜豆蛋白5'非翻譯區、菜豆蛋白3'非翻譯區(「utr」)、根癌土壤桿菌orf13'非翻譯區、木薯葉脈花葉病毒啟動子、菸草rb7基質附著區、t鏈邊界序列、lfkcs3啟動子和fae1啟動子。在一些實施方案中，可以存在編碼δ-9去飽和酶多肽的核酸分子的幾個拷貝，並且每個拷貝可能處於一組不同的調節元件的調節控制之下。更具體地說，基因調節元件可以是菜豆蛋白啟動子和菜豆蛋白5'utr，和lesquerellafenderilfkcs3啟動子，從而有兩個拷貝的and9ds存在，一個拷貝由菜豆蛋白啟動子和5'utr控制，第二個拷貝由lfkcs3啟動子控制。在其它實施方案中，編碼δ-9去飽和酶多肽(或多個δ-9去飽和酶多肽)的核酸的幾個拷貝可以在其他調節元件的控制下，包括釀酒酵母δ-9去飽和酶啟動子、δ-9去飽和酶3'utr/終止子、ole1基因啟動子、菜豆菜豆蛋白3'非翻譯區、菜豆菜豆蛋白基質附著區，根癌土壤桿菌甘露氨酸合酶啟動子，根癌土壤桿菌orf233'非翻譯區，木薯葉脈花葉病毒啟動子、根癌土壤桿菌orf13'非翻譯區、菸草rb7基質附著區，過驅動(overdrive)、t-鏈邊界序列、lfkcs3啟動子、fae1啟動子、myc標籤和血凝素標籤。還公開了包含與選自seqidno:1的序列至少80％相同的胺基酸序列的δ-9去飽和酶多肽以及編碼這種δ-9去飽和酶多肽的核酸分子，例如seqidno:2。在一些實施方案中，核酸分子和δ-9去飽和酶多肽可以在植物材料、細胞、組織或整個植物中表達，以減少植物材料、細胞、組織或整個植物中的飽和脂肪酸的量(相對於在同一物種的野生型植物中觀察到的量)。本發明的替代實施方案包括減少植物材料、細胞、組織或整個植物中的飽和脂肪酸的量的方法。這樣的方法可以包括用至少一種上述的核酸分子轉化植物材料、細胞、組織或整個植物，使得植物材料、細胞、組織或整個植物中的飽和脂肪酸的量減少。具體實施方案包括用於優先降低植物材料，細胞，組織或整個植物中的棕櫚酸和/或硬脂酸的方法。本文公開的方法可以例如在植物或源自植物(例如擬南芥屬植物或卡諾拉)的植物材料中進行。一個具體實施方案涉及用於產生或再生基因工程植物的方法，所述植物與相同物種的野生型植物相比在植物中包含減少量的飽和脂肪酸，所述方法包括用至少一種上述核酸分子轉化植物細胞或材料的；並培養經轉化的植物材料以獲得植物。還公開了通過任何上述方法獲得的植物、植物材料、植物細胞和種子。ii.縮寫x:yδz含有x個碳原子和位於自羧基端數起第z位的y個雙鍵的脂肪酸acp醯基載體蛋白coa輔酶afa脂肪酸fas脂肪酶合酶fame脂肪酸甲酯kasiiβ-酮脂醯-acp合酶iimufa單不飽和脂肪酸pufa多不飽和脂肪酸wt野生型iii.術語脂肪酸：如本文中使用的，術語「脂肪酸」指例如從約c12至c22的不同鏈長的長鏈脂肪族酸(鏈烷酸)，儘管更長和更短鏈長的酸兩者是已知的。脂肪酸的結構以符號x:yδz表示，其中「x」是特定脂肪酸中碳(c)原子的總數，且「y」是碳鏈中如從該酸的羧基端開始數起的第「z」位中的雙鍵數目。代謝途徑：術語「代謝途徑」指細胞內存在的、由酶催化以實現代謝產物轉化或另一代謝途逕啟動的一系列化學反應。代謝途徑可以牽涉幾個或許多步驟，並且可以與不同代謝途徑競爭特定反應底物。類似地，一種代謝途徑的產物可以是又一代謝途徑的底物。代謝工程：出於本發明的目的，「代謝工程」指改變細胞中的一種或多種代謝途徑，使得在細胞中運行的總代謝途徑的總體方案內實現將初始底物逐步修飾為具有期望的精確化學結構的產物的理性策略設計。去飽和酶：如本文中使用的，術語「去飽和酶」指可以在一種或多種脂肪酸中去飽和(即，引入雙鍵)以生成感興趣的脂肪酸或前體的多肽。植物可溶性脂肪酸去飽和酶酶可以將雙鍵區域專一性引入飽和的醯基-acp底物中。醯基-coa去飽和酶將雙鍵區域專一性引入飽和的脂肪醯基-coa底物中。該反應牽涉通過由形成去飽和酶構造核心的四螺旋束配位的兩電子還原性二鐵中心活化分子氧。一些實施方案中特別感興趣的是醯基-coadelta-9去飽和酶。delta-9-18:01-acp去飽和酶是所有植物維持膜流動性需要的。雖然此酶主要使硬脂醯-acp去飽和，但是它在棕櫚醯-acp的情況中也在微小的程度上有活性。後代植物：為本發明的目的，「後代植物」指可以通過植物育種方法獲得的任何植物，或自其獲得的植物材料。植物育種方法是本領域中公知的，並且包括天然育種、人工育種、牽涉dna分子標誌分析的選擇育種、轉基因學、和商業育種。植物材料：如本文中使用的，術語「植物材料」指自植物獲得的任何細胞或組織。核酸分子：核苷酸的聚合形式，其可以包括rna的有義和反義鏈兩者、cdna、基因組dna、和上述物質的合成形式和混合的聚合物。核苷酸指核糖核苷酸、脫氧核苷酸、或任一類核苷酸的經修飾形式。如本文中使用的，「核酸分子」與「核酸」和「多核苷酸」是同義的。該術語包括dna的單鏈和雙鏈形式。核酸分子可以包括通過天然存在的和/或非天然存在的核苷酸聯接連接在一起的天然存在的和經修飾的核苷酸之任一或兩者。核酸分子可以經過化學或生物化學修飾，或者可以含有非天然的或衍生化的核苷酸鹼基，如本領域普通技術人員容易領會的。此類修飾包括例如標記物、甲基化、用類似物取代一個或多個天然存在的核苷酸、核苷酸間修飾，諸如不帶電荷的連接(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯，等等)、帶電荷的連接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯，等等)、懸垂的模塊(moiety)(例如，肽)、插入劑(例如，吖啶、補骨脂素，等等)、螯合劑、烷化劑(alkylator)、和經修飾的連接(例如，alpha異頭核酸，等等)。術語「核酸分子」還包括任何拓撲學構象，包括單鏈、雙鏈，部分雙鏈體、三聯體、髮夾、環形和掛鎖構象。可操作連接的：當第一核酸序列在與第二核酸序列的功能性關係中時，第一核酸序列與第二核酸序列可操作連接。例如，若啟動子影響編碼序列的轉錄或表達，則啟動子與編碼序列可操作連接。在重組生成時，可操作連接的核酸序列一般是連續的，且在必需連接兩個蛋白質編碼區時，在同一閱讀框中。然而，核酸為了可操作連接不需要是連續的。調節元件：如本文中使用的，術語「調節元件」指具有基因調節活性的核酸分子；即具有影響可操作連接的可轉錄核酸分子的轉錄或翻譯的能力的核酸分子。調節元件諸如啟動子、前導物、內含子和轉錄終止區是具有基因調節活性的非編碼核酸分子，其在活細胞的總體基因表達中發揮不可或缺的作用。因此，在植物中發揮功能的分離的調節元件可用於經由分子工程化技術修飾植物表型。「調節元件」意指決定是否表達特定基因、何時表達特定基因、及以何種水平表達特定基因的一系列核苷酸。調節dna序列與調節蛋白或其它蛋白質特異性相互作用。如本文中使用的，術語「基因調節活性」指能夠影響可操作連接的核酸分子的轉錄或翻譯的核酸分子。具有基因調節活性的分離的核酸分子可以提供可操作連接的核酸分子的時間或空間表達或調控表達水平和速率。具有基因調節活性的分離的核酸分子可以包括啟動子、內含子、前導物、或3』轉錄終止區。啟動子：如本文中使用的，術語「啟動子」指牽涉rna聚合酶ii或其它蛋白質諸如轉錄因子(調節轉錄的反式作用蛋白因子)的識別和結合以啟動可操作連接的基因轉錄的核酸分子。啟動子可以自身含有招致可操作連接的基因轉錄的亞元件諸如順式元件或者增強子域。「植物啟動子」是在植物細胞中功能性的天然的或非天然的啟動子。可以使用植物啟動子作為5』調節元件以調控一種或多種可操作連接的基因表達。植物啟動子可以以其時間、空間、或發育表達模式限定。本文中所描述的核酸分子可以包含含有啟動子的核酸序列。序列同一性：如本文中在兩種核酸或多肽序列的背景中所使用的，術語「序列同一性」或「同一性」可以指兩種序列中在規定的比較窗裡為了實現最大對應性而比對時相同的殘基。兩種核酸序列間或兩種胺基酸序列間的相似性按照序列間共享的序列同一性水平表示。序列同一性通常按照百分比同一性表示；百分比越高，兩種序列越相似。用於比對比較序列的方法在下文詳細描述。在提及蛋白質使用序列同一性百分比時，認可的是，不相同的殘基位置經常相差保守的胺基酸取代，其中胺基酸殘基用具有類似化學特性(例如，電荷、疏水性或空間效應)的其它胺基酸殘基取代，並且因此不改變分子的功能特性。因此，在序列相差保守取代時，百分比序列同一性可以向上調節以校正不相同殘基位點處取代的保守性質。相差此類保守取代的序列被說成具有「序列相似性」或「相似性」。用於進行此調節的技術是本領域普通技術人員公知的。通常，此類技術牽涉將保守取代評分為部分的，而不是完全的匹配，由此增加百分比序列同一性。例如，在對相同的胺基酸給予0-1的得分，而對非保守取代給予0得分的情況中，對保守取代給予0-1的得分。可以計算保守取代的得分，例如如程序pc/gene(intelligenetics,mountainview,ca)中執行的。如本文中所使用的，術語「序列同一性百分比」可以指在比對窗裡比較兩個最佳比對序列時測定的數值，其中為了兩個序列的最佳比對，比較窗中序列的部分與參照序列(其不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即，缺口)。通過測定兩個序列中存在相同核苷酸或胺基酸殘基的位置的數目以產生匹配位置數目，將匹配位置的數目除以比較窗中位置的總數，並將結果乘以100以產生序列同一性百分比來計算百分比。胺基酸序列中的類似位置：可以通過前述段落中所描述的方法比對核酸和胺基酸序列。在比對時，若各位置在共有序列內是相同的，則一個序列中的位置與比對序列中的位置在「類似位置」中。用於比對比較序列的方法是本領域中公知的。各種程序和比對算法記載於：smith和waterman,adv.appl.math.2:482,1981；needleman和wunsch,j.mol.biol.48:443,1970；pearson和lipman,proc.natl.acad.sci.usa85:2444,1988；higgins和sharp,gene73:237-44,1988；higgins和sharp,cabios5:151-3,1989；corpet等,nucleicacidsresearch16:10881-10890,1988；huang,等,computerapplicationsinthebiosciences8:155-65,1992；pearson等,methodsinmolecularbiology24:307-31,1994；tatiana等,femsmicrobiol.lett.,174:247-50,1990.altschul等,j.mol.biol.215:403-10,1990(關於序列比對方法和同源性計算的詳細討論)。美國國家生物技術信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation,ncbi)基本局部比對搜索工具(blast)在網際網路上可獲得(於blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)，其與序列分析程序，例如blastp和blastn結合使用。關於如何使用此程序測定序列同一性的描述在網際網路上經由ncbi於blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi？cmd＝web&page_type＝blastdocs可獲得。為了比較胺基酸序列，使用預設參數採用blast程序的「blast2種序列(blast2sequence)」功能(bl2seq)。特定參數可以在本領域技術人員的判斷內調節，以例如提供錯配罰分或匹配獎勵。經轉化的：如本文中使用的，術語「經轉化的」指已經接受外來核酸分子，諸如構建體導入的細胞、組織、器官、或生物體。可以將導入的核酸分子整合入接受細胞、組織、器官或生物體的基因組dna中，使得導入的多核苷酸分子得到後續後代繼承。「轉基因」或「經轉化」細胞或生物體還包括所述細胞或生物體的後代和自在例如雜交中採用此類轉基因植物作為親本的育種程序生成並展現出源自存在外來核酸分子的改變的表型的後代。iv.減少宿主細胞、組織、或生物體中飽和脂肪酸的代謝工程方法a.概述本發明的一個實施方案包括在植物種子中引入具有特定醯基-coa偏愛(例如，對於棕櫚酸或硬脂酸)的delta-9去飽和酶。delta-9去飽和酶的特定醯基-coa偏愛實現對某些特定飽和脂肪酸集合(例如，棕櫚酸酯，用於轉化成單不飽和產物)的靶向。選擇醯基-coadelta-9去飽和酶來降低植物中的飽和脂肪酸含量，因為它們通常不以任何可察覺的程度在植物系統中生成。b.多肽依照本發明的一些實施方案的多肽包含如下的胺基酸序列，其在與選自下組的序列比對時顯示增加的百分比同一性：seqidno:1、seqidno:26、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29、seqidno:30、seqidno:31、seqidno:32和seqidno:33。這些和其它實施方案內的特定胺基酸序列可以包含與前述序列具有例如至少約70％,約75％,約80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％96％,97％,98％,99％或100％同一性的序列。在許多實施方案中，在與前述序列比對時具有前述序列同一性的胺基酸序列編碼具有delta-9-18:0-acp去飽和酶酶促活性的肽，或此類肽的部分。c.核酸一些實施方案包括編碼上文所描述的多肽的核酸分子。例如，一些實施方案中的核酸序列在與選自下組的序列比對是顯示增加的百分比同一性：seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19、seqidno:20、seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23、seqidno:24和seqidno:25。這些和其它實施方案內的特定核酸序列可以包含與選自下組的序列具有例如至少約60％,約65％,約70％,約75％,約80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％96％,97％,98％,99％或100％同一性的序列：seqidno:3,seqidno:4,seqidno:5,seqidno:8,seqidno:9,seqidno:10,seqidno:11,seqidno:15,seqidno:16,seqidno:17,seqidno:44,seqidno:45,seqidno:48和seqidno:49。本領域普通技術人員理解的是，可以例如通過依照密碼子簡併性引入可允許的核苷酸取代在不實質性改變編碼多肽的胺基酸序列的情況中修飾核酸分子。在一些實施方案中，本發明的核酸分子包含基因調節元件(例如，啟動子)。啟動子可以基於會接受載體構建體插入的細胞類型選擇。在細菌、酵母和植物中發揮功能的啟動子是本領域中公知的。啟動子也可以基於其調節特徵進行選擇。此類特徵的例子包括增強轉錄活性、可誘導性、組織特異性、和發育階段特異性。在植物中，已經描述了病毒或合成起源的誘導型、組成性活性、時間調節性、和空間調節性啟動子。見例如poszkowski等(1989)emboj.3:2719；odell等(1985)nature313:810；及chau等(1989)science244:174-81)。有用的誘導型啟動子包括例如由通過應用安全劑(取代的苯磺醯胺除草劑)誘導的水楊酸或聚丙烯酸誘導的啟動子、熱休克啟動子、自菠菜硝酸鹽還原酶可轉錄核酸分子序列衍生的硝酸鹽誘導型啟動子、激素誘導型啟動子、和與rubp羧化酶的小亞基和lhcp家族結合的光誘導型啟動子。有用的組織特異性、發育調節性啟動子的例子包括β-伴大豆球蛋白(conglycinin)7sα啟動子和種子特異性啟動子。可用於在種子質體中優先表達的植物功能性啟動子包括那些來自牽涉含油種子中脂肪酸生物合成的蛋白質和來自植物儲存蛋白的。此類啟動子的例子包括來自可轉錄核酸分子序列諸如菜豆蛋白、油菜籽蛋白、玉米醇溶蛋白、大豆胰蛋白酶抑制劑、acp、硬脂醯-acp去飽和酶、和油質蛋白的5』調節區。另一種例示性的組織特異性啟動子是種子組織特異性的凝集素啟動子。更具體地說，啟動子可以包括菜豆(phaseolusvulgaris)菜豆蛋白啟動子(單獨的或與菜豆菜豆蛋白3'非翻譯區和菜豆菜豆蛋白3'基質附著區域聯用)，lesquerellafendlerikcs3啟動子或根癌土壤桿菌曼甘露氨酸合酶啟動子。其它有用的啟動子包括胭脂氨酸合酶、甘露氨酸合酶、和章魚鹼合酶啟動子(其在根癌土壤桿菌(agrobacteriumtumefaciens)的腫瘤誘導質粒上攜帶)；花椰菜花葉病毒(camv)19s和35s啟動子；增強型camv35s啟動子；玄參花葉病毒35s啟動子；來自核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(ssrubisco)小亞基的光誘導型啟動子；來自菸草的eif-4a啟動子(mandel等,(1995)plantmol.biol.29:995-1004)；玉米蔗糖合成酶；玉米醇脫氫酶i；玉米光收穫複合物(lightharvestingcompolex)；玉米熱休克蛋白；來自擬南芥的幾丁質酶啟動子；ltp(脂質轉移蛋白)啟動子；矮牽牛查耳酮異構酶；豆富含甘氨酸的蛋白1；馬鈴薯patatin；泛素啟動子；和肌動蛋白啟動子。優選地，有用的啟動子是種子選擇性的、組織選擇性的、或誘導型的。種子特異性調節在例如ep0255378中有討論。為了獲得更高的異源基因表達，可以優選的是再工程化改造基因，使得它在表達宿主細胞(例如，植物細胞，例如，卡諾拉、稻、菸草、玉米、棉、和大豆)中更有效地表達。因此，設計植物表達的編碼delta-9去飽和酶的基因中任選的額外步驟(即，在提供一種或多種基因調節元件外)是為了最佳表達而再工程化改造異源基因蛋白質編碼區。具體的實施方案包括再設計的基因，其經過優化以提高在轉基因卡諾拉植物細胞或擬南芥植物細胞中，而不是在用天然存在的異源基因序列轉化的卡諾拉植物細胞或擬南芥植物細胞中的表達水平(即，生成更多蛋白質)。由於由遺傳密碼的冗餘性/簡併性提供的可塑性(即，一些胺基酸由超過一種密碼子規定)，不同生物體或生物體類中的基因組進化已經導致同義密碼子的差別選擇。此「密碼子偏愛」在蛋白質編碼區的平均鹼基組成中得到反映。例如，具有含相當較低g+c含量的基因組的生物體利用更多的在同義密碼子的第三位具有a或t的密碼子，而那些具有較高g+c含量的生物體利用更多的在第三位具有g或c的密碼子。此外，認為mrna內「次要」密碼子的存在可以降低所述mrna的絕對翻譯速率，尤其在與次要密碼子對應的帶電荷的trna的相對豐度較低時。此推理的延伸是通過個別次要密碼子降低翻譯速率對於多種次要密碼子至少會是疊加的。因此，在特定表達宿主中具有相對較高次要密碼子含量的mrna會具有相應較低的翻譯速率。此速率可以通過編碼蛋白質的相應低水平反映。在工程化改造編碼delta-9去飽和酶的優化基因以在卡諾拉或擬南芥(或其它植物，諸如稻、菸草、玉米、棉或大豆)中表達中，若已經測定預期的宿主植物的密碼子偏愛，則其是有幫助的。存在多種公眾可用的dna序列資料庫，其中可以尋找關於植物基因組的密碼子分布或各種植物基因的蛋白質編碼區的信息。密碼子偏愛是表達宿主(例如，植物，諸如卡諾拉或擬南芥)使用以編碼其蛋白質的胺基酸的密碼子的統計學分布。密碼子偏愛可以以單一密碼子相對所有胺基酸的密碼子的使用頻率計算。或者，密碼子偏愛可以以單一密碼子用於編碼特定胺基酸，相對於所述胺基酸的所有其它密碼子(同義密碼子)的頻率計算。在為delta-9去飽和酶基因的植物表達設計優化的編碼區中，應當確定植物優選的主要(「第一選擇」)密碼子，及優選密碼子的第二、第三、第四選擇等等(在存在多種選擇時)。然後，可以設計新的編碼delta-9去飽和酶基因胺基酸序列的dna序列，其中新的dna序列與天然dna序列(編碼去飽和酶)不同之處在於取代編碼宿主優選性(第一優選性、第二優選性、第三優選性、或第四優選性，等等)密碼子以規定胺基酸序列內每個位置處的胺基酸。然後，對新的序列分析限制酶位點，其可以已經通過修飾創建。通過將這些密碼子用下一優選性密碼子替換來進一步修飾鑑定的推定限制性位點以除去限制性位點。序列中可以影響異源序列的轉錄或翻譯的其它位點是外顯子:內含子接合(5』或3』)、多聚-a添加信號、和/或rna聚合酶終止信號。可以進一步分析序列，並將其進行修飾以降低ta或cg雙聯體的頻率。在這些雙聯體外，具有相同的超過約6個g或c核苷酸的序列區組也可以不利地影響序列的轉錄或翻譯。因此，有利地，通過將第一或第二選擇的密碼子，等等用選擇的下一優選性密碼子替換來修飾這些區組。上文所描述的方法使本領域技術人員能夠修飾對於特定植物而言外來的基因，使得基因在植物中最佳地表達。所述方法在pct申請wo97/13402中進一步例示。如此，可以使用與一些實施方案的去飽和酶/基因在功能上等同的經優化的合成基因來轉化宿主，包括植物。關於生成合成基因的更多指導可以參見例如美國專利5,380,831。一旦在紙上或在計算機晶片中設計出經植物優化的dna序列，可以在實驗室中合成實際的dna分子以在序列上精確對應於設計的序列。可以將此類合成的dna分子克隆，並以其它方式操作，完全就像它們源自自然或天然來源那樣。d.用於遺傳轉化植物材料的方法一些實施方案涉及生成包含一種或多種核酸分子的經轉化的細胞的方法，所述核酸分子包含與選自下組的序列至少60％相同的核酸序列：seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19、seqidno:20、seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23、seqidno:24和seqidno:25。此類核酸分子還可以包含例如非編碼調節元件，諸如啟動子。也可以將其它序列與非編碼調節元件和可轉錄核酸分子序列一起導入細胞中。這些其它序列可以包含3』轉錄終止子、3』多聚腺苷酸化信號、其它非翻譯序列、轉運或靶向序列、選擇標誌、增強子、和操縱基因。一般地，轉化方法包括下列步驟：選擇合適的宿主細胞，用重組載體轉化宿主細胞，並獲得經轉化的宿主細胞。用於將dna導入細胞中的技術是本領域技術人員公知的。一般地，這些方法可以分成5類：(1)化學方法(graham和vandereb(1973)virology54(2):536-9；zatloukal等(1992)ann.n.y.acad.sci.660:136-53)；(2)物理方法，諸如微注射(capechi(1980)cell22(2):479-88)、電穿孔(wong和neumann(1982)biochim.biophys.res.commun.107(2):584-7；fromm等(1985)proc.natl.acad.sci.usa82(17):5824-8；美國專利5,384,253)、和顆粒加速(johnston和tang(1994)methodscellbiol.43(a):353-65；fynan等(1993)proc.natl.acad.sci.usa90(24):11478-82；(3)病毒載體(clapp(1993)clin.perinatol.20(1):155-68；lu等(1993)j.exp.med.178(6):2089-96；eglitis和anderson(1988)biotechniques6(7):608-14)；(4)受體介導的機制(curiel等(1992)hum.gen.ther.3(2):147-54；wagner等(1992)proc.natl.acad.sci.usa89(13):6099-103)；和(5)細菌介導的機制，諸如用土壤桿菌。或者，可以通過直接注射植物的生殖器官來將核酸直接導入花粉中。zhou等(1983)methodsinenzymology101:433；hess(1987)intern.rev.cytol.107:367；luo等(1988)plantmol.biol.reporter6:165；pena等(1987)nature325:274。其它轉化方法包括例如原生質體轉化，如美國專利5,508,184中例示的。也可以將核酸分子注射入未成熟的胚中。neuhaus等(1987)theor.appl.genet.75:30。最常使用的用於轉化植物細胞的方法是：土壤桿菌介導的dna轉移方法(fraley等(1983)proc.natl.acad.sci.usa80:4803)(如美國專利5,824,877；美國專利5,591,616；美國專利5,981,840；和美國專利6,384,301中例示的)和生物射彈或微粒轟擊介導的方法(即，基因槍)(諸如記載於美國專利5,550,318；美國專利5,538,880；美國專利6,160,208；美國專利6,399,861；和美國專利6,403,865)。通常，核轉化是期望的，但是在期望特異性轉化質體，諸如葉綠體或造粉體的情況中，可以對某些植物物種諸如擬南芥、菸草、馬鈴薯和卡諾拉物種利用期望的核酸分子的微粒介導的遞送來轉化植物質體。經由使用屬於土壤桿菌屬的遺傳工程化土壤細菌實現土壤桿菌介導的轉化。幾種土壤桿菌物種介導轉移稱為「t-dna」的特定dna，其可以遺傳工程化改造為將任何期望的dna部分攜帶入許多植物物種中。標記t-dna介導的發病機制過程的主要事件是：誘導毒力基因、和加工並轉移tdna。此過程是許多綜述的主題。見例如ream(1989)ann.rev.phytopathol.27:583-618；howard和citovsky(1990)bioassays12:103-8；kado(1991)crit.rev.plantsci.10:1-32；zambryski(1992)annualrev.plantphysiol.plantmol.biol.43:465-90；gelvin(1993)於transgenicplants,kung和wu編,academicpress,sandiego,ca,第49頁-第87頁；binns和howitz(1994)於bactericalpathogenesisofplantsandanimals,dang編,berlin:springerverlag.,第119-38頁；hooykaas和beijersbergen(1994)ann.rev.phytopathol.32:157-79；lessl和lanka(1994)cell77:321-4；及zupan和zambryski(1995)annualrev.phytopathol.27:583-618。為了對經轉化的植物細胞選擇或評分(不管轉化方法如何)，導入細胞中的dna可以含有在可再生的植物組織中發揮功能以生成化合物的基因，所述化合物對植物組織賦予對否則有毒性的化合物的抗性。作為選擇、篩選、或評分標準物使用的感興趣的基因包括但不限於β-葡糖醛酸糖苷酶(gus)、綠色螢光蛋白(gfp)、螢光素酶、和抗生素或除草劑耐受性基因。抗生素抗性基因的例子包括賦予對青黴素、卡那黴素(和新黴素、g418、博來黴素)；甲氨蝶呤(和甲氧苄啶)；氯黴素；和四環素的抗性的基因。例如，草甘膦(glyphosate)抗性可以由除草劑抗性基因賦予。della-cioppa等(1987)bio/technology5:579-84。也可以執行其它選擇裝置，包括例如但不限於對膦絲菌素(phosphinothricin)、雙丙氨磷和正向選擇機制的耐受性(joersbro等(1998)mol.breed.4:111-7)，並且認為在本發明的實施方案的範圍內。然後，可以容許通過選擇或篩選鑑定並在支持再生的合適培養基中培養的經轉化的細胞成熟成植物。目前公開的方法可以與任何可轉化的植物細胞或組織一起使用。如本文中使用的，可轉化的細胞和組織包括但不限於能夠進一步增殖以產生植物的那些細胞或組織。本領域技術人員認可許多植物細胞或組織是可轉化的，其中在插入外源dna和適當的培養條件後植物細胞或組織可以形成分化的植物。適合於這些目的的組織可以包括但不限於未成熟的胚、小盾(scutellar)組織、懸浮細胞培養物、未成熟的花序、枝分生組織、節外植體、愈傷組織、下胚軸組織、子葉、根、和葉。自經轉化的植物原生質體或外植體再生、發育、和培養植物是本領域中已知的。weissbach和weissbach(1988)methodsforplantmolecularbiology,(編)academicpress,inc.,sandiego,ca；horsch等(1985)science227:1229-31。此再生和生長方法通常包括下列步驟：選擇經轉化的細胞，並將那些細胞培養到胚發育的通常階段到生根的小植物階段。類似地，再生轉基因的胚和種子。在此方法中，一般將轉化體在存在選擇培養基的情況中培養，所述選擇培養基選擇成功轉化的細胞並誘導植物幼芽(shoot)的再生。fraley等(1993)proc.natl.acad.sci.usa80:4803。這些幼芽通常在2至4個月內獲得。此後，將所得的轉基因生根幼芽在合適的植物生長培養基諸如土壤中種植。可以將倖免於暴露於選擇劑的細胞，或已經在篩選測定法中得分為正的細胞在支持植物再生的培養基中培養。然後，可以將幼芽轉移至合適的根誘導培養基中，所述根誘導培養基含有選擇劑和防止細菌生長的抗生素。許多幼芽會形成根。然後，將這些移植至土壤或其它培養基以容許根的繼續發育。一般地，如上文概述的方法會根據採用的特定植物品系而不同，並且因此，方法的細節在本領域技術人員的判斷內。再生的轉基因植物可以自花傳粉以提供純合轉基因植物。或者，可以將自再生的轉基因植物獲得的花粉與非轉基因植物，優選地，農藝學重要的物種的近交系雜交。相反，可以使用來自非轉基因植物的花粉來給再生的轉基因植物傳粉。轉基因植物可以將轉化的核酸序列傳遞給其後代。優選地，轉基因植物是在轉化的核酸序列方面是純合的，並在有性繁殖後且由於有性繁殖而將所述序列遺傳給所有其後代。可以自由轉基因植物生成的種子培養後代。然後，可以將這些其它植物自花傳粉以生成真正的植物育種株系。可以對來自這些植物的後代評估基因表達，等等。可以通過幾種常見的方法諸如western印跡、northern印跡、免疫沉澱、和elisa(酶聯免疫吸附測定法)檢測基因表達。也可以對經轉化的植物分析導入的dna的存在和由本發明的核酸分子和胺基酸分子賦予的表達水平和/或脂肪酸譜。本領域技術人員知道可用於分析經轉化的植物的許多方法。例如，用於植物分析的方法包括但不限於southern印跡或northern印跡、基於pcr的方法、生物化學測定法、表型篩選法、田間評估、和免疫診斷測定法。用於特異性轉化雙子葉植物的方法是本領域技術人員公知的。已經對許多作物，包括但不限於擬南芥屬的成員、棉(棉(gossypiumhirsutum))、大豆(大豆(glycinemax))、花生(落花生(arachishypogaea))、和芸苔屬的成員描述了使用這些方法的轉化和植物再生。已經對棉(美國專利5,004,863；美國專利5,159,135；美國專利5,518,908)；大豆(美國專利5,569,834；美國專利5,416,011；mccabe等(1988)biotechnology6:923；christou等(1988)plantphysiol.87:671-4)；(美國專利5,463,174)；花生(cheng等(1996)plantcellrep.15:653-7；mckently等(1995)plantcellrep.14:699-703)；蕃木瓜；和豌豆(grant等(1995)plantcellrep.15:254-8)發表了主要通過使用根癌土壤桿菌轉化雙子葉植物並獲得轉基因植物的方法。用於轉化單子葉植物的方法也是本領域中公知的。已經對許多作物，包括但不限於大麥(大麥(hordeumvulgarae))；玉蜀黍(玉蜀黍(zeamays))；燕麥(燕麥(avenasativa))；野茅(野茅(dactylisglomerata))；稻(稻(oryzasativa)，包括印度和日本變種)；高粱(高粱(sorghumbicolor))；甘蔗(甘蔗(saccharumsp))；葦狀羊茅(葦狀羊茅(festucaarundinacea))；草地草(turfgrass)物種(例如，匍莖剪股穎(agrostisstolonifera)、草地早熟禾(poapratensis)、錐穗鈍葉草(stenotaphrumsecundatum))；小麥(小麥(triticumaestivum))；和苜蓿(苜蓿(medicagosativa))描述了使用這些方法的轉化和植物再生。對於本領域技術人員顯而易見的是，可以使用並修改許多轉化方法以對許多感興趣的目標作物生成穩定的轉基因植物。可以選擇任何植物在目前公開的方法中使用。依照本發明修飾的優選的植物包括例如但不限於含有種子植物、擬南芥(arabidopsisthaliana)、琉璃苣(琉璃苣屬(borago)物種)、卡諾拉(canola)(芸苔屬(brassica)物種)、蓖麻(蓖麻(ricinuscommunis))、可可豆(可可(theobromacacao))、玉米(玉蜀黍)、棉(棉屬(gossypium)物種)、兩節薺屬(crambe)物種、萼距花屬(cuphea)物種、亞麻(亞麻屬物種)、小濱菊屬(lesquerella)和鯨油草(limnanthes)物種、linola、旱金蓮(旱金蓮屬(tropaeolum)物種)、月見草屬(oenothera)物種、橄欖(olive)(木樨欖屬(olea)物種)、棕櫚(油棕屬(elaeis)物種)、花生(花生屬(arachis)物種)、油菜籽(rapeseed)、紅花(紅花屬(carthamus)物種)、大豆(大豆屬(glycine)和野生大豆(soja)物種)、向日葵(向日葵屬(helianthus)物種)、菸草(菸草屬(nicotiana)物種)、斑鳩菊屬(vernonia)物種、小麥(小麥屬(triticum)物種)、大麥(大麥屬(hordeum)物種)、稻(稻屬(oryza)物種)、燕麥(燕麥屬(avena)物種)、高粱(高粱屬(sorghum)物種)、和黑麥(黑麥屬(secale)物種)或禾本科(gramineae)的其它成員。對於本領域技術人員顯而易見的是，可以使用並修改許多轉化方法以對許多感興趣的目標作物生成穩定的轉基因植物。e.轉基因種子在一些實施方案中，轉基因種子可以包含delta-9去飽和酶多肽，其包含與選自下組的序列至少80％相同的胺基酸序列：seqidno:1、seqidno:26、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29、seqidno:30、seqidno:31、seqidno:32和seqidno:33。在這些和其它實施方案中，轉基因種子可以包含與選自下組的序列至少60％相同的核酸序列：seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19、seqidno:20、seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23、seqidno:24和seqidno:25。在一些實施方案中，轉基因種子可以展現出降低的飽和脂肪酸(例如，棕櫚酸脂肪酸和/或硬脂酸脂肪酸)水平。可以自能育轉基因植物收穫種子，並可以用於培養經轉化植物的後代世代，包括包含如上文所列的至少一種核酸序列，和任選地至少一種別的感興趣的基因或核酸構建體的雜種植物株系。提供以下實施例來例示某些具體的特徵和/或實施方案。這些實施例不應解釋為將本發明限於所描述的具體特徵或實施方案。實施例實施例1：pdab7305的構建體設計構巢麴黴δ-9去飽和酶(and9ds)酶先前在美國專利申請序列號2008/0260933中公開，在本文中為seqidno:1。合成包含and9dsv3編碼序列的多核苷酸序列(seqidno:2)，並將其引入質粒構建體pdab7305中用於土壤桿菌介導的植物轉化(圖1)。所得的構建體含有三個植物轉錄單元(也被描述為基因表達盒，二者可互換使用)。第一植物轉錄單元(ptu)(seqidno:3)由rb7基質附著區(rb7mar；國際專利申請號wo9727207)、菜豆菜豆蛋白啟動子(pvphas啟動子；美國專利號5,504,200)、and9ds編碼序列(anδ9去飽和酶v3)、菜豆菜豆蛋白3'非翻譯區(pvphas3'utr；美國專利號5,504,200)和菜豆菜豆蛋白3'基質附著區(pvphas3'mal；美國專利號5,504,200)構成。第二個ptu(seqidno:4)由lesquerellafendlerikcs3啟動子(lfkcs3啟動子；美國專利號7,253,337)、and9ds編碼序列(anδ9去飽和酶v3)和根癌土壤桿菌orf233'非翻譯區(atuorf233'utr；美國專利號5,428,147)構成。第三個ptu(seqidno:5)由根癌土壤桿菌甘露氨酸合酶啟動子(atumas啟動子；barker,r.f.,idler,k.b.,thompson,d.v.,kemp,j.d.,(1983),apolynucleotidesequenceofthet-dnaregionfromtheagrobacteriumtumefaciensoctopinetiplasmidpti15955,plantmolecularbiology,2(6),335-50)、膦絲菌素乙醯轉移酶基因(pat；wohlleben等，(1988)gene，70：25-37)、和根癌土壤桿菌orf13'非翻譯區(atuorf13′utr；huangetal.,(1990)j.bacteriol.,172:1814-1822)構成。通過限制酶消化和測序證實該構建體。最後，將該構建體轉化到根癌土壤桿菌中並作為甘油儲儲存。實施例2：土壤桿菌介導的對卡諾拉(brassicanapus)下胚軸的轉化土壤桿菌製備使用含有pdab7305二元質粒的土壤桿菌菌株在含有鏈黴素(100mg/ml)和壯觀黴素(50mg/ml)的yep培養基(bactopeptonetm(20.0g/l)和酵母提取物(10.0g/l))板上劃線，並於28℃溫育2天。使用無菌接種環從2日劃線平板上刮取含有pdab7305二元質粒經增殖的土壤桿菌菌株。然後將刮下的含有pdab7305二元質粒的土壤桿菌菌株接種入150ml進入無菌500ml帶有擋板的燒瓶中的具有鏈黴素(100mg/ml)和壯觀黴素(50mg/ml)的改良yep液體中，並以200rpm於28℃搖動。將培養物離心後重懸在m-培養基(ls鹽；3％葡萄糖；改良的b5維生素；1μm細胞分裂素；1μm2,4-d；ph5.8)中，並稀釋至合適的濃度(50個klett單位，用分光光度計測得)，之後轉化卡諾拉下胚軸。卡諾拉轉化：種子萌發：將卡諾拉種子(品種nexera710tm)在10％clorox中表面滅菌10分鐘，並用無菌蒸餾水漂洗三次(在該過程中種子盛放在鋼製濾網中)。將種子種植在phytatraytm中含有的1/2ms卡諾拉培養基(1/2ms、2％蔗糖、0.8％瓊脂)(每個phytatraytm為25粒種子)上以進行萌發，並放置在設置為25℃和16小時光照/8小時黑暗光周期的生長方案的percivaltm生長室中5天以供萌發。預處理：在第5天，在無菌情況下切出長度約3mm的下胚軸節段，棄去剩餘的根和芽部分(通過在切出過程期間將下胚軸節段浸入10ml無菌milliqtm水中來防止它們乾燥)。在具有設置為22-23℃和16小時光照/8小時黑暗光周期的生長方案的percivaltm生長室中預處理前，將下胚軸節段在無菌濾紙上在愈傷組織誘導培養基msk1d1(ms；1mg/l細胞分裂素；1mg/l2,4-d；3％蔗糖；0.7％植物瓊脂(phytagar))上水平放置3天。與土壤桿菌的共培養：在土壤桿菌共培養前一天，用含有pdab7305二元質粒的土壤桿菌菌株接種含有合適抗生素的yep培養基的燒瓶。將下胚軸節段從濾紙愈傷組織誘導培養基msk1d1轉移至含有10ml液體m培養基的空100x25mmpetritm培養皿，以防止下胚軸節段乾燥。在此階段使用刮刀舀出節段，並轉移至新的培養基。用移液管除去液體m培養基，並將40ml土壤桿菌懸浮液添加至petritm培養皿(500個段及40ml土壤桿菌溶液)。將各下胚軸節段在周期性渦旋振蕩下胚軸節段培養皿的條件下處理30分鐘，使得下胚軸在土壤桿菌溶液中保持浸沒。在處理期結束時，將土壤桿菌溶液移液入廢物燒杯中，用高壓滅菌器處理，並棄去(將土壤桿菌溶液完全除去以放置土壤桿菌生長過度)。將經處理的下胚軸用鑷子返迴轉移至含有用濾紙覆蓋的msk1d1培養基的初始平板，注意確保各節段不乾燥。將經轉化的下胚軸節段與未轉化的對照下胚軸節段一起放回到降低光強(通過用鋁箔覆蓋平板)下的percivaltm生長室，並將經處理的下胚軸節段與土壤桿菌共培養3天。在選擇培養基上的愈傷組織誘導：在共培養3天後，將下胚軸節段用鑷子個別地轉移至愈傷組織誘導培養基msk1d1h1(ms；1mg/l細胞分裂素；1mg/l2,4-d；0.5g/lmes；5mg/lagno3；300mg/l特美汀(timentin)；200mg/l羧苄西林(carbenicillin)；1mg/lherbiacetm；3％蔗糖；0.7％植物瓊脂)上，生長方案設定為22-26℃。將下胚軸節段在培養基上錨定，但是不深埋到培養基中。選擇和芽再生：在愈傷組織誘導培養基上7天後，將生成愈傷組織的(callusing)下胚軸段轉移至具有選擇的芽再生培養基1msb3z1h1(ms；3mg/lbap；1mg/l玉米素；0.5gm/lmes；5mg/lagno3；300mg/l特美汀tm；200mg/l羧苄西林；1mg/lherbiace；3％蔗糖；0.7％植物瓊脂)上。在14天後，將已發出芽的下胚軸節段轉移至具有增強的選擇的再生培養基2msb3z1h3(ms；3mg/lbap；1mg/l玉米素；0.5gm/lmes；5mg/lagno3；300mg/l特美汀tm；200mg/l羧苄西林；3mg/lherbiacetm；3％蔗糖；0.7％植物瓊脂)，生長方案設定為22-26℃。芽伸長：在14天後，將具有已生發芽的下胚軸節段從再生培養基2轉移至芽伸長培養基msmesh5(ms；300mg/l特美汀tm；5mg/lherbiacetm；2％蔗糖；0.7％tc瓊脂)，生長方案設定為22-26℃。從下胚軸節段分離已經伸長的芽，並轉移至msmesh5。14天後，將在伸長培養基的第一輪培養中未伸長的剩餘芽轉移到新鮮的芽延長培養基msmesh5。在這個階段，丟棄所有剩下的未產生芽的下胚軸片段。根誘導：在芽伸長培養基上培養14天後，將分離的芽轉移至msmest培養基(ms；0.5g/lmes；300mg/l特美汀tm；2％蔗糖；0.7％tc瓊脂)以在22-26℃進行根誘導。將任何在第一次轉移msmest培養基的過程中在溫育後未生根的芽轉移到msmest培養基上的第二或第三輪溫育，直至芽生出根。pcr分析：經轉化的卡諾拉下胚軸片段再生成有根的芽後，用pcr分子確認測定法對其進一步分析。從綠芽獲得葉組織，通過pcr測試是否存在pat選擇標誌物基因。丟棄任何褪綠芽，不進行pcr分析。鑑定為pat選擇標誌物基因存在為陽性的樣品在msmest培養基上保存並培養，以繼續發出和伸長芽和根。丟棄根據pcr分析鑑定為陰性不含pat選擇標誌物基因的樣品。將包含選擇標誌物基因存在pcr陽性的芽和根的經轉化的卡諾拉植物移植到溫室中的土壤中。卡諾拉植物在土壤中定植之後，進一步分析卡諾拉植物，通過invadertm定量pcr測定法和southern印跡法定量pat基因表達盒的拷貝數。證實含有至少一個pat基因表達盒拷貝的轉基因t0卡諾拉植物推進進一步分析種子脂肪酸譜。通過fame分析方法分析從這些轉基因t0卡諾拉植物獲得的種子(即t1卡諾拉種子)，以鑑定與對照植物相比總飽和脂肪酸減少的事件(總飽和脂肪酸含量通過將所有飽和脂肪酸，包括短鏈和長鏈脂肪酸加和來確定)。實施例3：從轉基因pdab7305卡諾拉植物獲得的t1卡諾拉種子的fame分析對於發生分離的(segregating)t1卡諾拉種子，通過fame分析方法分析以鑑定這樣的t0卡諾拉事件：其產生的t1卡諾拉種子的總飽和脂肪酸(c14:0，c16：0，c18：0，c20:0，c22:0，c24:0)與從相同條件下生長的對照植物獲得的種子相比降低。對所有總飽和脂肪酸(tsfa)的總和進行定量，並與陰性對照植株進行比較。使用下面描述的方案對單個t1卡諾拉種子完成fame分析。對來自每個單獨的卡諾拉t0事件的總共24個單一t1卡諾拉種子進行測定，並且對來自每個個體的tsfa結果進行定量。使用鋼球磨機將單一卡諾拉種子樣品在庚烷中均質化，其中庚烷中含有十七烷酸三甘酯(triheptadecanoin)(nu-chekprep)作為三醯基甘油內標。在均質化之前，加入0.25m新鮮製備的甲醇鈉(sigma-aldrich，st.louis，mo)在甲醇中的溶液。萃取在40℃恆定震搖下進行。內源性脂肪酸回收率用甲基化的替代物c17脂肪酸的回收率來歸一化。重複3次fame(脂肪酸甲酯)萃取，將庚烷層合併後分析。所得的fame通過gc-fid進行分析，使用來自sge的毛細管柱bpx70(15m×0.25mm×0.25μm)。根據保留時間鑑定每種fame，並通過注入來自matreyallc(pleasantgap，pa)菜籽油參考預混物作為校準標準，同時添加適當的長鏈脂肪酸(nu-chekprep，elysianmn)，來加以定量。大批種子分析由50mg等分試樣(10至15個種子組合)組成，並按照上述相同方案加以少許修改後實施。為了推動衍生化反應完全，首先用庚烷萃取油三次。然後，將合併的油提取物的對應於1個種子的等分試樣如上述單種子方案所述衍生化成fame。通過在第四次萃取/衍生化中檢查內源fame的存在來驗證反應的完全性。基於表明與對照油菜植物tsfa相比顯著減少的fame結果，鑑定並選擇了三個轉基因卡諾拉事件(事件2182[12]-138.001，事件2182[12]-125.001和事件2182[12]-156.001)推進到t1代。測定了另外兩個植物脂肪酸內含物範疇。這些範疇包括單不飽和脂肪酸(mufa：c16:1，c18:11和c20:11)和多不飽和脂肪酸(pufa：c18:12和c18:13)濃度，列出這些範疇以顯示t1種子中降低的tsfa的效果(表1)。表1：與幾個nexera710tm非轉化對照植物相比，從三個轉基因卡諾拉事件獲得的單個t1種子tsfa、mufa和pufa含量總結。n*表示對每個植物後代分析的單t1種子的數量。與nexera710tm非轉化對照植物相比，轉基因卡諾拉事件的平均tsfa顯著降低。在tsfa的降低的同時，觀察到mufa含量(c18:1和c16:1)的增加。mufa含量的增加是and9ds過表達而在飽和脂肪酸自羧酸官能團起的第9個碳(δ9)處引入雙鍵的直接結果。有趣的是，pufa含量並未隨著磷酸甘油酯去飽和酶fad2的合成c18:2的底物mufa的積累而增加。將t1卡諾拉植物事件在溫室中生長並自受精，以將滲入的轉基因固定在後代植物中。對來自每個轉基因事件的多個t1卡諾拉植物完成了invadertm定量pcr檢測。這些結果表明，從三個事件中獲得的t1卡諾拉植物均含有約2或3個拷貝的pdab7305t鏈整合(圖3頂部小圖)。無法具體確定拷貝數，因為pdab7305t鏈整合體在三個事件中以不同的拷貝數分離。讓t1卡諾拉植物事件在溫室中生長成熟並自受精。收穫產生的t2卡諾拉種子用於通過fame測定法進行脂肪酸譜分析。實施例4：從轉基因pdab7305卡諾拉植物獲得的t2卡諾拉種子的fame分析通過先前描述的fame分析方法分析大批t2卡諾拉種子，以鑑定與對照植物(nexera710tm)相比總飽和脂肪酸有所減少的t1卡諾拉植物株系(圖2)。每株植物的產量作為每株植物的種子克數記錄。將產量結果與含有穩定整合的構巢麴黴δ-9去飽和酶轉基因的轉基因陽性對照事件218-11.30(參見wo2006/042049)(本文也描述為218-11.30hs50或218-11.30hl)的產量進行比較，對照植物與本發明的轉基因植物一起種植。218-11.30植物和本主題公開的轉基因卡諾拉植物都表達相似的轉基因。然而，本主題公開中用於轉化2182[12]-125.sx001、2182[12]-138.sx001和2182[12]-156.sx00卡諾拉植物的構建體是不同的，因為它包含第二個ptu，該ptu由lesquerellafendlerikcs3啟動子及該啟動子驅動表達的and9ds編碼序列組成，並且被根癌土壤桿菌orf233'非翻譯區所側翼。定量對本主題公開的轉基因植物的tsfa(％)，並與從陽性對照218-11.30hl轉基因卡諾拉植物和陰性對照nexera710tm植物獲得的tsfa(％)進行比較。鑑別出少數本主題公開的轉基因植物含有較高水平的tsfa，其水平近似於陰性對照的nexera710tm植物。這些植物是由於轉基因在自受精期間發生分離而產生的同胞無效體(siblingnulls)，並且不包含任何積極表達的本主題公開的轉基因的拷貝。這些結果證實，在鑑別出t1卡諾拉植物中，大批t2卡諾拉種子的總飽和脂肪酸含量降低到3.5％以下。進一步分析t2卡諾拉株系，以確定哪一個卡諾拉株系含有低拷貝數的pdab7305t鏈整合體，並產生高t2種子產量。(圖3)。選擇這樣的本主題公開的卡諾拉植物個體：含有的tsfa少於3.5％，產生的產量超過10g，並且含有的t鏈拷貝數最低。基於這三個標準(tsfa水平低於3.5％，高種子產量和低拷貝數)，選擇了七個卡諾拉植物並推進以進一步表徵tsfa譜。使用invaderassay從每個t1株系的一個植物確定拷貝數。表2。將這些t2卡諾拉植物株系轉移到溫室，生長成熟並自受精。進一步分析t2卡諾拉植物株系，並通過fame測定法收穫t3種子進行脂肪酸譜分析。表2：列出了基於最高產量(種子重量)，最低pat拷貝數(t1植物)和最低tsfa選擇的t2卡諾拉株系。實施例5：t2卡諾拉株系的分子確認對於選出的含有pat基因表達盒(和緊密連鎖的and9ds基因表達盒)的t2卡諾拉事件，使用定量pcr和southern印跡分析表徵分子整合模式。通過水解探針測定法確認and9ds整合通過水解探針測定證實and9ds基因表達盒的存在。首先通過水解探針測定(類似於taqmantm)篩選分離的t2卡諾拉植物，以確認pat轉基因的存在。從這些研究中產生的數據用於確定轉基因拷貝數，並用於選擇用於回交和推進到後代的轉基因卡諾拉事件。將組織樣品收集在96孔板中，使用klecotm組織粉碎機和不鏽鋼珠(hooverprecisionproducts，cumming，ga)，在qiagenrlttm緩衝液中進行組織浸漬。在組織浸漬後，根據製造商的建議方案，使用biosprint96tm植物試劑盒(qiagen，germantown，md)以高通量形式分離基因組dna。基因組dna用quant-itpicogreendnaassaykittm(molecularprobes，invitrogen，carlsbad，ca)定量。使用biorobot3000tm自動液體處理器(qiagen，germantown，md)，將定量後的基因組dna調節至約2ng/μl用於水解探針測定。通過使用480系統(rocheappliedscience，indianapolis，in)的實時pcr進行類似於測定的水解探針測定的轉基因拷貝數確定。使用probedesignsoftware2.0設計用於pat和內部參考基因hmg1(weng等(2005).j.aoacint.88(2):577-84)的測定。為了擴增，在10μl體積多重反應中製備1×終濃度的480探針主混合物(含有0.4μm的每種用於and9ds和pat的引物，和0.2μm的每種探針)(表3)。進行兩步擴增反應，在60℃下延伸40秒，捕獲螢光。運行所有樣品，並將平均循環閾值(ct)值用於每個樣品的分析。實時pcr數據的分析使用相對量化模塊使用軟體版本1.5進行，並基於δδct方法。對照包括：來自單一拷貝校準品的基因組dna樣品，以及每次運行中包括的已知的二拷貝檢查品。表4列出了水解探針測定的結果。使用qpcr測定從每個t1株系的n株(並平均，給出表4中的值)確定拷貝數。表3：用於pat和內部參考(hmg1)的水解探針測定的引物和探針序列。表4:利用水解探針測定法確定的and9ds事件(t2植物)的拷貝量結果水解探針測定的結果確定了兩個株系(2182[12]-138.sx001.sx094和2182[12]-138.sx001.sx090)，其具有與陽性對照植物(218-11.30(hl))相當的相對標準偏差(如表4所示為sd)和變異係數(如表4所示為cv％)的組合。218-11.30(hl)對照植物先前被鑑定為含有兩個固定拷貝的and9ds基因插入(wo2006042049)。通過將選定的卡諾拉株系(2182[12]-138.sx001.sx094和2182[12]-138.sx001.sx090)與218-11.30(hl)對照植物進行比較，鑑定出將會含有固定拷貝的pdab7305t鏈整合體的特定卡諾拉株系。通過southern印跡分析確認and9ds基因組整合。使用southern印跡分析建立證明t鏈dna片段的整合模式，並鑑定含有全長and9ds基因表達盒的卡諾拉株系。產生了可證明在卡諾拉基因組內的轉基因插入物的整合和完整性的數據。使用特異於and9ds基因表達盒的pcr擴增探針進行詳細的southern印跡分析。該探針與經過特異性限制酶消化的基因組dna的雜交鑑定出具有特定分子量的基因組dna片段，用這些片段的模式來表徵用於推進到下一代的轉基因事件。將組織樣品收集在2ml錐形管中並凍幹2天。用kleckotm組織粉碎機和鎢珠進行組織浸漬。在組織浸漬後，使用ctab分離程序分離基因組dna。使用qiagengenomictipstm試劑盒進一步純化基因組dna。用quant-itpicogreendnatm測定試劑盒(molecularprobes，invitrogen，carlsbad，ca)定量基因組dna。將經定量的基因組dna調節至一致的濃度。對於每個樣品，用限制酶bamhi(newenglandbiolabs，beverley，ma)充分消化4μg基因組dna。使用quickprecipitationsolutiontm(edgebiosystems，gaithersburg，md)，根據製造商的建議方案通過沉澱來濃縮消化的dna。然後將基因組dna在65℃下重懸浮於25μl水中1小時。將重懸浮的樣品加載到1xtae中製備的0.8％瓊脂糖凝膠上，並以1.1v/cm在1xtae緩衝液中電泳過夜。對凝膠依次進行變性(0.2mnaoh/0.6mnacl)30分鐘，及中和(0.5mtris-hcl(ph7.5)/1.5mnacl)30分鐘。利用層析紙捻和紙巾，使20xssc溶液被動地穿透凝膠吸引到經處理的immobilontmny+轉移膜(millipore，billerica，ma)上，來將dna片段轉移到尼龍膜上。轉移後，將膜用2xssc短暫洗滌，與stratalinkertm1800(stratagene，lajolla，ca)交聯，並在80℃下真空烘烤3小時。使用400型雜交培養箱(robbinsscientific，sunnyvale，ca)，將印跡與預雜交溶液(perfecthybplus，sigma，st.louis，mo)在65℃下在玻璃滾瓶中溫育1小時。從含有整個編碼序列的pcr片段製備探針。使用qiaexiigelextractionkittm純化pcr擴增子，並用digdnalabelingkittm(rocheappliedbiosciencse，indianapolis，in)標記。印跡在65℃下雜交過夜，變性探針直接加入到雜交緩衝液中。雜交後，在65℃用0.1×ssc/0.1％sds依次洗滌印跡40分鐘。最後，將印跡暴露於儲磷成像屏，並使用moleculardynamicsstorm860tm成像系統成像。本研究中完成的southern印跡分析用於確定拷貝數，並確認所選擇的事件在卡諾拉基因組中含有and9ds基因表達盒。表5提供了來自基於上述表2中定義的標準選定的株系的多個t2植物的條帶分布。對照株系不含有選擇標誌物，這確認了pcr數據。從三個事件中選擇的大多數株系顯示均一的條帶模式(數目和大小)，除了來自事件2182[12]-125.sx001.sx014的株系外。事件2182[12]-138.sx001的所有三個t2系顯示具有一致條帶模式的t2群體。表5：對來自四個轉基因事件的多個t2卡諾拉株系以及nexera710tm卡諾拉對照植物完成的southern分析的概述。通過與在瓊脂糖凝膠上樣品旁邊運行的已知標準品進行比較來確定每個樣品的觀察到的條帶的大小。實施例6：選定的卡諾拉株系的t3種子產量來自t2卡諾拉株系的選定植物在溫室中生長成熟。從植物收穫種子。清洗種子，並確定每個t2卡諾拉株系的種子產量(表6)。將來自每一株系的種子的產量與來自在相同條件下生長的未轉化的對照植物(nexeratm710gs)獲得的種子的產量進行比較。表6給出了從每個t2卡諾拉株系獲得的不同植物的產量結果。這些結果表明，測試的每個植物和株系的產量是可變的。但是t2卡那拉株系的平均產量(2182[12]-125.sx001.sx014,2182[12]-138.sx001.sx085、2182[12]-138.sx001.sx090、2182[12]-138.sx001.sx094、和2182[12]-156.sx001.sx049)相對近似，並且沒有顯著偏離對照植物(nexeratm710g5和218-11.30(hl))。表6：來自卡諾拉轉基因品株系和未轉化的nexeratm710gs對照植物的種子產量(以總克數計)的annova分析。括號中連接相同字母的植物產量結果沒有顯著差異(p<0.05)。事件/株系植物數比例產量(g)218-11.30(hl)120.061865.7233333(a,b)2182[12]-125.sx001.sx014350.180415.9874286(a,b)2182[12]-138.sx001.sx085340.175266.8394118(a)2182[12]-138.sx001.sx090330.170106.4887879(a,b)2182[12]-138.sx001.sx094350.180415.0302857(b)2182[12]-156.sx001.sx049330.170106.3715152(a,b)nexeratm710g5120.061867.1666667(a,b)總計1941.00000---實施例7：從轉基因pdab7305卡諾拉植物獲得的t3卡諾拉種子的fame分析通過先前描述的fame分析方法分析單個和大批的t3卡諾拉種子，以表徵各株系的脂肪酸譜，從而鑑定與對照植物相比導致總飽和脂肪酸減少的特定株系。定量總飽和脂肪酸的總和，並與陽性對照和陰性對照植物進行比較。結果證實，在所選的卡諾拉植物株系中，單個和大批t3卡諾拉種子的總飽和脂肪酸和飽和脂肪酸(由棕櫚酸和硬脂酸含量之和確定)含量降低到3.5％以下。令人驚訝的是，兩個株系，2182[12]-138.sx001.sx085和2182[12]-138.sx001.sx094，積累的tsfa水平平均在3.0％以下。首次描述了由包含小於3.0％飽和脂肪酸的大批種子構成的卡諾拉株系。表7和表8。此外，將一個亞組的卡諾拉株系用於種子fame分析，以確定在單個卡諾拉種子中能夠獲得的總飽和脂肪酸和飽和脂肪酸水平的最低水平。從基於大批種子的最低總飽和脂肪酸以及高水平的植物產量選擇出的卡諾拉株系獲得種子，用於單種子fame分析。使用fame方法，每個株系分析總共288個個體種子。分析的總結見表9。來自所選植物的所有單種子的平均tsfa低於2.8％，明顯低於3.5％的tsfa水平。在單種子卡諾拉的水平上，最低的tsfa水平為2.25％。這顯著低於nexeratm710g5對照植物獲得的tsfa水平5.11％。最後，轉基因卡諾拉株系中tsfa的最大百分比不超過3.5％，單種子的平均飽和水平為2.52％，遠低於3.5％。表9和圖4。表7顯示了與未轉化的nexeratm710g5對照和轉化的218-11.30(hl)陽性對照植物相比，5個遺傳上均一的卡諾拉株系群體的t2成熟種子大批fame分析的分布。求出所有個體測量值(n)的平均值，以代表卡諾拉植物群體的tsfa和飽和百分比。用粗體字標明了2182[12]-138.sx001.sx085和2182[12]-138.sx001.sx094，因為這兩個株系的平均tsfa百分比低於3.00％。表7表8顯示了與nexeratm710g5對照相比，從事件2182[12]-138.sx001獲得的單個t2後代植物的最低t3成熟種子大批fame和植物產量。顯示的結果是油的百分比、tsfa的百分比、飽和脂肪酸的百分比(通過總結棕櫚酸和硬脂酸含量確定)和種子產量。表8表9顯示了來自選定的t2株系的t3單種子fame分析結果的分布。與在相該表顯示tsfa和飽和脂肪酸百分比的平均值(平均值)、最小值(最小)和最大值(最大)，與同條件下生長的nexeratm710g5對照卡諾拉籽植物相比。相比於nexeratm710g5對照卡諾拉植物，所選事件的t3種子中的總飽和脂肪酸(tsfa)和飽和脂肪酸水平均有降低。表9序列表美國陶氏益農公司d·j·加喬迪p·a·o·默洛m·a·湯普森t·a·沃爾什b·r·威爾遜m·維爾特具有少於3.5%的總飽和脂肪酸的轉基因卡諾拉的生成7167133patentinversion3.51455prt構巢麴黴1metseralaprothralaaspileargalaargalaproglualalys151015lysvalhisilealaaspthralaileasnarghisasntrptyrlys202530hisvalasntrpleuasnvalpheleuileileglyileproleutyr354045glycysileglnalaphetrpvalproleuglnleulysthralaile505560trpalavaliletyrtyrphephethrglyleuglyilethralagly65707580tyrhisargleutrpalahiscyssertyrseralathrleuproleu859095argiletrpleualaalavalglyglyglyalavalgluglyserile100105110argtrptrpalaargasphisargalahishisargtyrthraspthr115120125asplysaspprotyrservalarglysglyleuleutyrserhisleu130135140glytrpmetvalmetlysglnasnprolysargileglyargthrasp145150155160ileseraspleuasngluaspprovalvalvaltrpglnhisargasn165170175tyrleulysvalvalphethrmetglyleualavalprometleuval180185190alaglyleuglytrpglyasptrpleuglyglyphevaltyralagly195200205ileleuargilephephevalglnglnalathrphecysvalasnser210215220leualahistrpleuglyaspglnpropheaspaspargasnserpro225230235240argasphisvalilethralaleuvalthrleuglygluglytyrhis245250255asnphehishisglupheproserasptyrargasnalaileglutrp260265270hisglntyraspprothrlystrpseriletrpalatrplysglnleu275280285glyleualatyraspleulyslyspheargalaasngluileglulys290295300glyargvalglnglnleuglnlyslysleuasparglysargalathr305310315320leuasptrpglythrproleuaspglnleuprovalmetglutrpasp325330335asptyrvalgluglnalalysasnglyargglyleuvalalaileala340345350glyvalvalhisaspvalthrasppheilelysasphisproglygly355360365lysalametileserserglyileglylysaspalathralametphe370375380asnglyglyvaltyrtyrhisserasnalaalahisasnleuleuser385390395400thrmetargvalglyvalileargglyglycysgluvalgluiletrp405410415lysargalaglnlysgluasnvalglutyrvalargaspglysergly420425430glnargvalileargalaglygluglnprothrlysileproglupro435440445ileprothralaaspalaala45045521368dna人工序列編碼構巢麴黴delta9去飽和酶v3的合成核苷酸2atgtctgctccaaccgctgacatcagggctagggctccagaggctaagaaggttcacatc60gctgataccgctatcaacaggcacaattggtacaagcacgtgaactggctcaacgtcttc120ctcatcatcggaatcccactctacggatgcatccaagctttctgggttccacttcaactc180aagaccgctatctgggctgtgatctactacttcttcaccggacttggaatcaccgctgga240taccacaggctttgggctcactgctcatactctgctactcttccacttaggatctggctt300gctgctgttggaggaggagctgttgagggatctatcagatggtgggctagggatcacagg360gctcatcataggtacaccgataccgacaaggacccatactctgttaggaagggacttctc420tactctcaccttggatggatggtgatgaagcagaacccaaagaggatcggaaggaccgac480atctctgatctcaacgaggacccagttgttgtttggcaacacaggaactacctcaaggtt540gtgttcaccatgggacttgctgttccaatgcttgttgctggacttggatggggagattgg600cttggaggattcgtgtacgctggaatccttaggatcttcttcgttcaacaagctaccttc660tgcgtgaactctcttgctcactggcttggagatcaaccattcgatgataggaactctcct720agggatcacgtgatcaccgctcttgttacccttggagagggataccacaacttccaccac780gagttcccatctgactacaggaacgctatcgagtggcaccagtacgatcctaccaagtgg840tctatctgggcttggaagcaacttggattggcttacgatctcaag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