催淚蛋白的部分肽的製作方法

2023-05-06 15:24:16 1

專利名稱：催淚蛋白的部分肽的製作方法
技術領域：
本發明涉及具有催淚蛋白(Iacritin)的特定部分序列的多肽，所述催淚蛋白是淚液中的蛋白質。本發明的多肽可以促進細胞粘附、特別是細胞與細胞外基質之間的細胞 粘附。而且，本發明的多肽可以促進淚液分泌。
背景技術：
已知細胞與細胞外基質的粘附涉及細胞的生存、運動性等各種功能。這是控制個 體的正常發育、組織的維持、或從損傷或感染中恢復的必需過程。基於這種細胞粘附的信號 通路的異常有時導致發育異常、循環系統疾病、細胞的轉化或轉移。另外，已報導了當細胞-細胞外基質間的粘附受到抑制時，細胞陷入被稱作「失巢 凋亡(anoikis)」的細胞死亡，因此，與細胞外基質的粘附對於細胞的生存是重要的(參見 非專利文獻1)。催淚蛋白是被鑑定為淚液分泌促進因子或類生長因子蛋白的蛋白質(參見專利 文獻1和2以及非專利文獻2)。關於催淚蛋白，下述1) 5)被報導1)催淚蛋白具有作為角膜上皮細胞和淚腺腺泡細胞的生長因子的活性；2)催淚蛋白顯示出對淚液蛋白質分泌的促進效果；3)催淚蛋白表達於源於例如淚腺、耳下腺、小唾液腺、顎下腺、甲狀腺、乳腺及角膜 上皮等組織的細胞；4)含有催淚蛋白的滴眼劑可以用於治療例如乾眼綜合症、斯耶格倫氏綜合症或角 膜上皮創傷等眼疾；5)利用表達催淚蛋白受體的細胞，通過催淚蛋白依賴的信號為指標，可以篩選出 與催淚蛋白或催淚蛋白受體結合的化合物。另外，已報導在3H-胸苷攝取的檢測試驗中，催淚蛋白或其兩端的一部分缺失的肽 具有促進唾液腺細胞分裂的作用(參見非專利文獻3)。然而，至今沒有關於催淚蛋白或其片段(部分肽)涉及細胞-細胞外基質粘附的 報導。另外，還沒有關於催淚蛋白片段對來自淚腺腺泡細胞的淚液蛋白質的分泌具有促進 作用的報導。專利文獻1 :W002/065943專利文獻2 :W005/119899非專利文獻1 =Frisch, S. M. et al. , Journal of Cell Biology 124， pp. 619-626(1994)非專利 文 獻 2 =Sanghi, S. et al. , Journal of Molecular Biology 310， pp. 127-139(2001)非專利文獻3:Wang，J. et al. Journal of Cell Biology 174，pp. 689-700 (2006)

發明內容
發明所要解決的課題本發明的目的是提供能夠促進細胞與細胞外基質之間特別是角膜上皮細胞與細胞 外基質之間粘附的物質和/或具有促進來自淚腺腺泡細胞的淚液蛋白質分泌的作用的物質。解決問題的方法本發明人鑑於上述問題已進行深入研究，並發現具有催淚蛋白特定部分序列的多 肽可以促進角膜上皮細胞與細胞外基質之間的粘附，並可以進一步促進來自淚腺腺泡細胞 的淚液蛋白質的分泌，從而完成本發明。因此，本申請發明如下。[1]多肽，其包含SEQ ID NO 1所示的胺基酸序列並具有70個殘基以下的胺基酸 長度。[2]多肽，其包含SEQ ID NO 1所示的胺基酸序列，其中1至3個胺基酸被缺失、置 換或添加，並具有與上述[1]所述的多肽等同的活性並具有70個殘基以下的胺基酸長度。[3]如上述[1]所述的多肽，其中SEQ ID NO 1所示胺基酸序列以外的部分由SEQ ID NO :2所示的胺基酸序列的部分序列組成。[4]多肽，其由上述[3]所述的多肽序列組成，其中1至3個胺基酸被缺失、置換或 添加，並具有與上述[3]所述的多肽等同的活性。[5]如上述[1]所述的多肽，其由SEQ ID NO :2所示的胺基酸序列的部分序列組 成。[6]多肽，其由上述[5]所述的多肽序列組成，其中1至3個胺基酸被缺失、置換或 添加，並具有與上述[5]所述的多肽等同的活性。[7]多肽，其由SEQ ID NO :3 5任一項所示的胺基酸序列組成。[8]多肽，其由SEQ ID NO :3 5任一項所示的胺基酸序列組成，其中1至3個氨 基酸被缺失、置換或添加，並具有與上述[7]所述的多肽等同的活性。[9]細胞粘附促進劑，其包含上述[1] [8]任一項所述的多肽。[10]促進細胞粘附的方法，其包括將上述[1] [8]任一項所述的多肽以有效濃 度與細胞接觸。[11]淚液分泌促進劑，其包含上述[1] [8]任一項所述的多肽。發明效果本發明可以提供一種新的多肽，所述多肽能夠促進細胞與細胞外基質之間、特別 是角膜上皮細胞與細胞外基質之間的粘附。本發明的多肽可通過將所述多肽加入用於製備 移植用角膜上皮片的培養基中來製備防止細胞脫落而長期穩定發揮功能的角膜上皮片。並 且，本發明可以提供一種新的多肽，所述多肽能夠發揮對源自淚腺腺泡細胞的淚液分泌的 促進作用。直接作用於淚腺並且能夠發揮對淚液分泌的促進作用的物質可以是預防或治療 乾眼症以及乾眼症相關疾病的有用藥物。
具體實施例方式本發明的多肽的一個實施方式是包含由以下SEQ ID NO :1所示的胺基酸序列的多肽。QGTAKVTSSRQELNPLKSIVEKSILLTEQALAKA(SEQ ID NO 1)
SEQ ID NO :1所示的胺基酸序列相當於由138殘基組成的SEQ ID NO 2所示的源 於人的全長催淚蛋白(參見GenBank/EBI資料庫登錄號NM_033277和ay005150 (基因組)) 中的69 102位。而且，本發明的多肽只要與上述多肽具有等同的活性，其可以是包含SEQ ID NO 1 所示的胺基酸序列的多肽，其中1至3個、優選地1至2個、更優選地1個胺基酸被缺失、置 換或添加。本發明的多肽的胺基酸長度通常為70個殘基以下，優選為60個殘基以下、特別優選為32至58個殘基，最優選為34至55個殘基。還優選為35至55個殘基。只要本發明多肽的胺基酸序列包含SEQ ID NO :1所示胺基酸序列(或SEQ ID NO 1所示胺基酸序列，其中1至3個胺基酸被缺失、置換或添加)，它的其他部分可以是任意的 胺基酸序列。所述任意的胺基酸序列可以在SEQ ID NO :1所示胺基酸序列(或SEQ ID NO 1所示胺基酸序列，其中1至3個胺基酸被缺失、置換或添加)的N末端側、C末端側、或同 時在N末端側和C末端側存在。任意的胺基酸序列的實例包括SEQ ID NO :2所示的胺基酸 序列的部分序列(下述)。優選地，本發明的多肽除了 SEQ ID NO :1所示胺基酸序列以外，僅由SEQ ID NO: 2所示胺基酸序列的部分序列組成。SEQ ID NO :2所示胺基酸序列的部分序列是指SEQ ID NO :2所示胺基酸序列(催淚蛋白的胺基酸序列)中的任意部分序列，並且可以包含SEQ ID NO :1所示胺基酸序列的一部分或全部。SEQ ID NO :2所示胺基酸序列的部分序列可以被添 加至SEQID NO 1所示的胺基酸序列的N末端側、C末端側、或N末端側和C末端側二者。當SEQ ID NO :2所示胺基酸序列的部分序列被添加至SEQ ID NO :1所示胺基酸序 列的N末端側和C末端側二者時，它們可以是在SEQ ID NO :2所示胺基酸序列中相互連續 的，也可以是不連續的，或者可以部分或全部相互重疊。此處，所獲得的多肽可以具有這樣的胺基酸序列，其中1至3個、優選1至2個、更 優選1個胺基酸被缺失、置換或添加，只要它具有與所述多肽等同的活性，即只要它維持所 述多肽的細胞粘附促進作用和/或淚液分泌促進作用。本發明的多肽更優選地為具有70個殘基以下的包含SEQ ID NO=I所示胺基酸序 列的多肽，並且作為整體是由催淚蛋白的連續的部分肽組成。即，本發明的多肽的一個實施 方式是具有70個殘基以下的催淚蛋白的部分肽，其由SEQ ID NO :2所示胺基酸序列的33 至138位部分的連續胺基酸序列組成。此處，所獲得的多肽可以具有這樣的胺基酸序列，其中1至3個、優選1至2個、更 優選1個胺基酸被缺失、置換或添加，只要它具有與所述多肽等同的活性，即只要它維持所 述多肽的細胞粘附促進作用和/或淚液分泌促進作用。本發明多肽的一個更優選的實施方式是由這樣的胺基酸序列組成的多肽，所述氨 基酸序列由下列SEQ ID NO 3-5任一項組成。VQGTAKVTSSRQELNPLKSIVEKSILLTEQALAKA(SEQ ID NO 3)QGTAKVTSSRQELNPLKSIVEKSILLTEQALAKAGKGMHGGVPGG(SEQ ID NO 4)QGTAKVTSSRQELNPLKSIVEKSILLTEQALAKAGKGMHGGVPGGKQFIENGSEF(SEQ ID NO 5)SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :5所示的胺基酸序列分別相當於催淚蛋 白胺基酸序列(SEQ ID NO 2)的68至102位、69至113位或69至123位。換言之，由SEQID NO :3至5所示的胺基酸序列組成的本發明的多肽為催淚蛋白的部分肽。本發明的多肽的還另一個優選實施方式為由以下的SEQ ID NO :8組成的胺基酸序 列所組成的多肽。EISGPAEPASPPETTTTAQETSAAAVQGTAKVTSSRQELNPLKSIVEKSILLTEQALAKA(SEQ ID NO 8)SEQ ID NO 8所示胺基酸序列相當於催淚蛋白胺基酸序列(SEQ IDNO 2)的43至 102位。換言之，由SEQ ID NO :8所示胺基酸序列組成的本發明的多肽為催淚蛋白的部分肽。本發明的多肽是上述催淚蛋白的部分肽，可以具有這樣的胺基酸序列，其中1至3 個、優選1至2個、更優選1個胺基酸被缺失、置換或添加，只要它與所述多肽具有等同的活 性，即，只要它維持所述多肽所具有的細胞粘附促進作用和/或淚液分泌促進作用。本說明書中，「胺基酸」通常是指「天然的胺基酸」。但是，只要滿足本發明的目的， 也可以是「非天然的胺基酸」。此處，「天然的胺基酸」是指天然的胺基酸的L-異構體。天然 的胺基酸包括甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、苯丙 氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、組氨酸、天冬氨酸、天冬醯胺、穀氨酸、穀氨醯胺、 精氨酸、鳥氨酸以及賴氨酸。除非明確指出，本說明書中的所有胺基酸為L型。但是，使用 D型胺基酸的實施方式也在本發明的範圍內。此處，「非天然的胺基酸」是指蛋白質中通常 不存在的胺基酸。非天然的胺基酸的實例包括正亮氨酸、對硝基苯丙氨酸、高苯丙氨酸、對 氟苯丙氨酸、3-氨基-2-苄基丙酸、高精氨酸的D型或D-苯丙氨酸。本說明書中，「部分肽」是由SEQ ID NO 2所示催淚蛋白的胺基酸序列的一部分所 組成的多肽。本說明書中，「胺基酸的缺失」是指從胺基酸序列的任意位置去除組成胺基酸。本說明書中，「胺基酸的置換」是指在胺基酸序列的任意位置用其他胺基酸置換組 成胺基酸。作為胺基酸的置換，保守置換是優選的。保守置換是指胺基酸被具有等同性質 的其他胺基酸替代的置換，原因在於肽化學領域的普通技術人員期望多肽的二級結構和親 水性質沒有實質變化。關於相互間保守置換的胺基酸組，通常已知為下列(1)甘氨酸、天 冬醯胺、穀氨醯胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸；(2)丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮 氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸；(3)甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨 酸；(4)亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸；(5)穀氨醯胺和天冬醯胺；(6)穀氨酸和天冬氨酸；(7) 精氨酸、賴氨酸和組氨酸；(8)苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。本說明書中，「胺基酸的添加」是指在胺基酸序列的任意位置添加任意胺基酸，並 包括胺基酸的插入。 如上所述，只要具有與所述多肽具有等同的活性，本發明的多肽可以具有這樣的 胺基酸序列，其中1至3個、優選1至2個、更優選1個胺基酸被缺失、置換或添加，並且上 述多肽也屬於本發明的範圍。此處，「具有等同的活性」是指具有胺基酸缺失、置換或添加 前的多肽的細胞粘附促進作用的約80%以上、優選約90%以上。作為細胞粘附促進作用， 促進細胞與細胞外基質之間粘附的作用可以作為實例列舉。該作用可如下述實施例所述測 定將測試多肽添加在用適合的細胞外基質包覆的板上，在其上形成角膜上皮細胞層，將細 胞培養預定時間並對粘附的細胞計數。可選地，「具有等同的活性」是指具有胺基酸缺失、置換或添加前的多肽的淚液分泌促進作用的約80%以上、優選約90%以上。作為淚液分泌促 進作用，促進來自淚腺腺泡細胞的淚液蛋白質(例如乳鐵蛋白)的分泌作用可以作為實例 列舉。該作用可如下述實施例所述測定培養適合的淚腺腺泡細胞，將測試多肽添加至其培 養基中，並對培養基中所分泌的淚液蛋白質進行定量。 另外，在不影響其活性的範圍內，上述各多肽可以是衍生物，其中N末端氨基、C末 端羧基或胺基酸側鏈的官能團被化學修飾。衍生化的實例包括在氨基添加保護基(例如乙 醯化、甲醯化、Boc化、Fmoc化)、羧基的酯化(乙基化等)等。當穀氨醯胺存在於N末端時， 側鏈可以是閉環以產生焦穀氨酸。各多肽可以根據已知方法以鹽的形式存在。作為多肽的鹽，藥理學上可接受的鹼 (例如鹼金屬)鹽或酸鹽以及藥理學上可接受的酸加成鹽是特別優選的。藥理學上可接 受的酸加成鹽的實例包括無機酸(例如鹽酸、磷酸、氫溴酸、硫酸)鹽、有機酸(例如醋酸、 蟻酸、丙酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸、安息香酸、甲磺酸、苯磺 酸)鹽等等。本發明的多肽可以通過常規化學合成方法、重組DNA技術等等產生。當本發明的多肽通過化學合成方法產生時，其可以根據已知的肽合成方法產生。 肽合成方法的實例包括固相合成法、液相合成法等，優選固相合成法。固相合成法的實例包 括Fmoc法。Fmoc法是這樣的方法用9-芴甲氧羰基(Fmoc)基團保護氨基、用叔丁醇 保護基保護側鏈官能團，其中在用作為仲胺的哌啶對Fmoc基進行去保護的同時Fmoc氨基 酸被縮聚，最後通過如三氟乙酸的弱酸去除側鏈保護基。即，從要合成的肽的C末端側反覆 進行選擇性去除α「氨基保護基和縮聚被保護的胺基酸的一系列操作以構建被保護的肽 鏈，並且去除側鏈官能團的保護基以得到目標肽。在固相肽合成法中，也通常採用利用自動肽合成裝置的合成(例如《新生化 學實驗講座1蛋白質IV》(1992)日本生化學會編，東京化學同人；「The Peptides Analysis, Synthesis, Biology" Vol.1-5, ed. by E. Gross, J. Meienhofer ；Vol. 6-9, ed. by S. Udenfriend, J. Meienhofer, Academic Press, New York(1979-1987))。當通過重組DNA技術產生本發明的多肽時，例如，基於編碼該多肽的cDNA鹼基序 列設計引物，並以適合的cDNA文庫作為模板，通過聚合酶鏈式反應(PCR)對目標序列進行 擴增，由此可以產生編碼多肽的cDNA。這種PCR方法是本技術領域熟知的並在例如「PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications」，Academic Press，Michael，et al.， eds. , 1990中描述。然後，將編碼本發明多肽的DNA併入到適合的表達載體中，然後將其引 入真核生物或原核生物細胞中，並表達各鏈以得到所需多肽。可用於本發明多肽表達的宿 主細胞的實例包括但不限於原核生物宿主例如大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆 菌(Bacillus subtilis)等和真核生物宿主例如酵母、真菌、昆蟲細胞、哺乳動物細胞等。 載體是可以轉染至細胞且在細胞基因組中或獨立於細胞基因組而可複製的單鏈或雙鏈核 酸分子。表達載體包括驅動DNA表達的啟動子區，並可以進一步包括轉錄和翻譯的調節序 列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列、3』非編碼區、增強子等。用於原核生物宿主的啟動 子的實例包括bla啟動子、cat啟動子、IacZ啟動子，用於真核生物宿主的實例包括小鼠金 屬硫蛋白I基因序列的啟動子、皰疹病毒TK啟動子、SV40早期啟動子、酵母糖酵解酶基因 序列基因啟動子等。載體的例子包括但不限於PBR322、pUC118、pUC119、AgtlO, AgtlUpMAM-neo、pKRC、BPV、牛痘(vaccinia)、SV40、2_micron 等。表達載體優選含有一個或更多個標記從而可選擇含有該載體的宿主細胞。作為標記，可使用那些為互補營養缺陷型宿主提供營養、提供抗生物抗性(例如氨苄青黴素、四環 素、新黴素、潮黴素、遺傳黴素等)或提供重金屬抗性的的標記(例如銅)。而且，可以構建這樣的載體從而利用信號序列使本發明的多肽分泌並表達、或者 使本發明的多肽以與不同多肽的融合多肽形式表達。通過使用融合多肽，可以改善多肽的 穩定性、或者可以促進純化。這種表達載體的構建在本技術領域是熟知的。被構建為表達本發明多肽的載體可通過轉化、轉染、接合、原生質體融合、電穿孔、 粒子槍技術、磷酸鈣沉澱、直接顯微注射等引入適合的宿主細胞。通過將含有載體的細胞在 適合的培養基中生長以產生本發明的多肽，從細胞或培養基回收所需的重組多肽以及純化 多肽，可獲得本發明的多肽。本發明的多肽也可以這樣產生通過例如Kimkel法或缺口雙鏈體法等已知方法 或其類似方法，在缺失、置換或添加胺基酸的位置加入修飾以得到編碼多肽的cDNA，並將基 因用於與上述重組DNA技術類似的重組DNA技術中。通過例如使用基於位點特異性突變 引入法的的突變引入試劑盒(例如 Mutant-K (Takara Bio Inc.)，Mutant-G (Takara Bio Inc.))等或TakaraBio Inc.的LA PCR體外突變系列試劑盒，可將突變引入基因。可以使用已知的方法對如上所述得到的本發明多肽進行分離和純化。已知的分離 和純化方法的實例包括鹽析、溶劑沉澱、透析、超濾、凝膠過濾、SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳、 離子交換色譜、親和層析、逆相高效液相色譜、等電聚焦等。由此所得的本發明的多肽促進細胞與細胞外基質之間特別是角膜上皮細胞與細 胞外基質之間的粘附。以下對其具體用途進行說明。(1)含有本發明多肽的角膜上皮片製備用培養液本發明的多肽在製備移植用角膜上皮片時，尤其可以促進角膜上皮細胞與基底的 粘附，原因在於對角膜上皮細胞與細胞外基質之間粘附的促進效果。角膜上皮片是活體角膜的代用物並且用於角膜渾濁的治療以恢復視力等。其用 於治療例如史蒂文斯詹森綜合症、化學創傷等難治癒的角膜上皮疾病。角膜上皮片可這 樣製備例如在含有血清的培養基中將細胞例如角膜上皮細胞等加至基底例如羊膜或膠 原蛋白片上，培養細胞，通過與3T3成纖維細胞共培養或氣升等而分層(Ophthalmology， vol.42, No. 3，pages245-250，2000)。作為角膜上皮片的製備方法，採用 W003/043542、 JP-A-2004-298447、JP-A-2004-261533、JP-A-2002-331025 等描述的已知方法。在角膜上皮片的產生方法中，可使用用於產生角膜上皮片的已知基底，而且可使 用源於活體生物的基底和人工製備的基底中的任一種。具體而言，對於源於活體生物的基 底可以是羊膜，對於源於人工的基底可以是膠原蛋白片。羊膜覆蓋子宮和胎盤最外層，並在 分娩過程中與胎盤一起被排出體外。作為用於細胞培養的培養基，可以使用用於製備角膜上皮片的已知培養基，例 如 EpiLife 培養基(Cascade Biologies Inc.製造)、DMEM/F12 培養基(Invitrogen Corporation製造)、DMEM培養基(Invitrogen Corporation製造)等，並且培養基可以 含有已知血清。儘管只要上述細胞可以生長良好，培養溫度不具體限制，但是通常為約 15°C _45°C。儘管只要上述細胞可以生長良好，培養時間不具體限制，但是通常為約1-30天。
被添加至培養基中用於製備角膜上皮片的本發明多肽可以是用於促進角膜上皮 細胞與基底之間的粘附的活性成分。培養基中的多肽濃度通常為0. 0001w/v% -0. lw/v%, 優選為0. 001w/v% -0. 01w/v%。本發明的多肽促進基底的細胞外基質與角膜上皮細胞之 間的固定，並且可以進行牢固的角膜上皮片的製備，該角膜上皮片通過防止細胞脫落而長 時間穩定地發揮功能。(2)含有本發明多肽的藥物由於本發明的多肽促進細胞與細胞外基質之間的粘附，其可用作細胞粘附促進 齊U。本發明的粘附促進劑可以用於源於哺乳動物(例如大鼠、小鼠、豚鼠、鳥、綿羊、馬、牛、 豬、猴子、黑猩猩、人等)的細胞(例如角膜上皮細胞、角膜內皮細胞、結膜細胞等)，優選地 用於源於人的角膜上皮細胞。只要能夠與細胞粘附，細胞外基質不具體限制並包括(1)纖 維狀蛋白質例如膠原蛋白、彈性蛋白等，(2)細胞粘附糖蛋白例如纖連蛋白、層粘連蛋白、玻 連蛋白等，(3)複合糖例如包含肝素、透明質酸、硫酸軟骨素等的糖胺聚糖等，以及由這些細 胞外基質組成的基膜(例如前彈力層、後彈力層、羊膜等)。已報導與細胞外基質的細胞粘附對於細胞存活是重要的(Frisch，S.M. et al., J. Cell Biol. 1994,124,619. , Porcu, Μ. , et al. , Cornea 2007,26,73.) 還報導了在角膜 中，由於作為細胞外基質之一的層粘連蛋白5的消失引起的抑制細胞粘附促進了角膜上皮 細胞的死亡。由於本發明的多肽促進角膜上皮細胞粘附至由細胞外基質組成的角膜上皮 的基膜(前彈力層等)，它抑制了眼表層上的角膜上皮細胞的死亡。另外，已知由分裂、移 動(伸展)和粘附組成的細胞運動參與角膜上皮的修復(Suzuki, K. et al.，Prog. Retin. EyeRes. 2003，22，113)。本發明的多肽促進細胞運動中的粘附過程，從而促進角膜上皮損傷 (即，創傷或缺損)的修復。因此，包含本發明多肽的藥物對於角膜上皮病症的治療是有用的。作為引起角膜 上皮病症的具體疾病可以是由物理或化學性刺激、過敏、細菌或真菌或病毒感染等引起的 角膜炎、角膜潰瘍、角膜上皮剝離(角膜糜爛)、角膜上皮浮腫、角膜熱傷、化學物質等引起 的角膜腐蝕、乾眼症、眼球乾燥症、慢性表層角膜炎、淺層點狀角膜病變、角膜上皮糜爛、持 續性角膜上皮缺損等。本發明的多肽對於這些疾病相關的角膜上皮病症的治療尤其有用。另外，本發明的多肽具有對源於淚腺腺泡細胞的淚液分泌的促進作用。淚液覆蓋 由角膜和結膜組成的眼球表面，保持角結膜的溼潤性並防止乾燥。然而，近年來，由於淚液 減少相關的乾燥的角結膜表面、戴隱形眼睛過程中乾眼、或辦公自動化設備操作過程中幹 眼等，越來越多的人抱怨各種症狀例如疲勞感、異物感，即乾眼症。乾眼症有時伴隨由角膜 上皮細胞病症引起的角膜上皮病症或角膜上皮糜爛等，嚴重的情況下可發生角膜潰瘍或眼 部感染。為了緩解這些與乾燥相關的各種症狀，使用主要含有鹽例如氯化鈉等的人工淚液， 以及含有羥乙基纖維素、硫酸軟骨素或透明質酸等的滴眼劑。但是，就目前情況，還沒有發 展出令人滿意的試劑。雖然這些症狀療法能夠減輕症狀，但是它不是用於根治性治療的原 因療法。淚液由於其內在功能而被認為具有治療乾眼引起的角結膜病症的效果，因此，直接 作用於淚腺以促進淚液分泌的物質被期待為對於乾眼症及乾眼症相關疾病有用的預防和 治療藥物。儘管含有本發明多肽的藥學產物的劑量形式不具體限制，但是優選為滴眼劑、洗眼劑、眼軟膏、片劑等，更優選為滴眼劑或眼軟膏。這些可以通過廣泛使用的技術製備。例 如，滴眼劑可以通過適當地混合添加物例如等滲劑、緩衝劑、PH調節劑、增溶劑、增稠劑、穩 定劑、保存劑等來製備。另外，穩定的滴眼劑也可通過添加PH調節劑、增稠劑、分散劑等並 懸浮藥物來獲得。等滲劑的實例包括甘油、丙二醇、氯化鈉、氯化鉀、山梨醇、甘露醇等。緩衝劑的實例包括磷酸、磷酸鹽、檸檬酸、醋酸、ε 「氨基己酸、氨丁三醇等。ρΗ調節劑的實例包括鹽酸、檸檬酸、磷酸、醋酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、硼酸、四硼酸 鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉等。增溶劑的實例包括聚山梨酸酯80、聚氧乙烯氫化蓖麻油60、聚乙二醇4000等。增稠劑和分散劑的實例包括纖維素聚合物例如羥丙基甲基纖維素、羥基丙基纖維 素等、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮等。另外，穩定劑的實例包括依地酸、依地酸鈉等。 常規保存劑的實例包括山梨酸、山梨酸鉀、苯扎氯銨、苄索氯銨、對羥基苯甲酸甲 月旨、對羥基苯甲酸丙脂、氯丁醇等。這些保存劑也可以組合使用。含有本發明多肽的滴眼劑期望地具有4至8的ρΗ以及約為1的滲透壓比。在含有本發明多肽的藥學產物中，本發明多肽的濃度可以根據症狀、年齡等設定 而不具體限制。例如，當本發明的多肽被包含在滴眼劑、洗眼劑等時，其濃度為0. OOlw/ v% -lw/v%，優選為0. 05w/v% -0. 5w/v%。例如，在滴眼劑中的劑量是每次滴注一滴至數 滴，每天一次至數次。滴眼劑可以是通常的滴注液或當使用時被溶解的滴注液。含有本發明多肽作為有效成分的藥學產物可用於例如哺乳動物(例如大鼠、小 鼠、豚鼠、鳥、綿羊、馬、牛、豬、猴子、黑猩猩、人等)等。實施例下面通過參考實施例對本發明進行詳細說明，但實施例不被解釋為具有限定性。實施例1多肽的合成通過固相合成法合成多肽。具體地，將芴甲氧羰基(Fmoc)基引入胺基酸並用樹脂 支持該胺基酸。然後，使用二氯甲烷作為溶劑，2- (1H-苯並三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基 脲(HBTU)和N-甲基吡咯烷酮(NMP)作為交聯劑進行醯胺鍵形成反應。使用DMF/20%哌啶 去除保護基。所得的產物通過高效液相色譜(柱0DS、溶劑水/乙腈/0. 05% TFA)純化。 由此，獲得由下列胺基酸序列組成的多肽1-3。多肽1 :VQGTAKVTSSRQELNPLKSIVEKSILLTEQALAKA(SEQ IDNO 3)白色粉末 MALDI-T0F-MS 計算值3750. 13 ；實際值3752. 27 ；純度(HPLC A/ Α% )96· 207%多肽2 QGTAKVTS SRQELNPLKSIVEKSILLTEQALAKAGKGMHGGVPGG(SEQID NO 4)白色粉末MALDI-T0F-MS 計算值4588. 35 ；實際值4590. 14 ；純度(HPLC A/ Α% )96· 88%多肽3:QGTAKVTSSRQELNPLKSIVEKSILLTEQALAKAGKGMHGGVPGGKQFIENGSEF(SEQ ID NO 5)白色粉末MALDI-T0F-MS 計算值5768. 64 ；實際值5767. 61 ；純度(HPLC A/ Α% )95· 15%
實施例2多肽的合成通過固相合成法合成多肽。具體地，將芴甲氧羰基(Fmoc)基引入胺基酸並用樹脂 支持該胺基酸。並且，使用二氯甲烷作為溶劑以及2-(1Η-苯並三唑-1-基)-1，1，3，3_四 甲基脲(HBTU)和N-甲基吡咯烷酮(NMP)作為交聯劑進行醯胺鍵形成反應。使用DMF/20% 哌啶去除保護基。所得的產物通過高效液相色譜(柱0DS、溶劑水/乙腈/0. 05% TFA) 純化。由此，獲得由下列胺基酸序列組成的多肽6和7。多月太6:QGTAKVTSSRQELNPLKSIVEKSILLTEQAL AKA(SEQ ID NO 1)白色粉末 MALDI-T0F-MS 計算值3653. 27 ；實際值3652. 28 ；純度(HPLC A/ Α% )99· 26%多肽7:EISGPAEPASPPETTTTAQETSAAAVQGTAKVTSSRQELNPLKSIVEKSILLTEQALAKA(SEQ ID NO 8)白色粉末MALDI-T0F-MS 計算值6148. 92 ；實際值6146. 82 ；純度(HPLC A/ Α% )87· 47%對比實施例1以上述實施例1相同的方法，得到由下列胺基酸序列組成的多肽4和5。多肽4 :EISGPAEPASPPETTTTAQETSAAAVQGTAKVT(SEQ ID NO 6)白色粉末MALDI-T0F-MS 計算值3197. 56 ；實際值3199. 98 ；純度(HPLC A/ Α% )99· 53%多肽5 :QGTAKVTSSRQELNPL(SEQ ID NO 7)白色粉末MALDI-TOF-MS 計算值1728. 94 ；實際值1728. 82 ；純度(HPLC A/ Α% )98· 01%實驗實施例1 催淚蛋白的部分肽對人角膜上皮細胞向細胞外基質粘附的促進作 用將細胞外基質溶液(10μg/mL，膠原蛋白型 IV =Becton, Dickinson and Company) 加入96孔板(Iwaki Glass Company, Limited)。將溶液在37°C培養1小時以用細胞外基 質包覆板。除去過量的細胞外基質溶液後，加入0. 的BSA溶液(Sigma-Aldrich Co.)以 封閉沒有用細胞外基質包覆的區域。接著，去除BSA溶液並用PBS洗滌板2次，將實施例1 和對比實施例1合成的多肽1-5 (濃度100 μ g/mL)以每孔50 μ L添加。而且，將建立的人 角膜上皮細胞(HCE-T 可通過Invest Ophthalmol Vis Sci. 1995，36，614所描述的方法制 備)在無血清的條件下過夜培養，並以2X104個細胞/IOOyL DMEM/F12培養基/孔添加至 板。將板在37°C溫育20分鐘以使細胞粘附於板。通過MTT測試(D0JIND0 LABORATORIES) 計算所粘附細胞的數量。以未添加多肽作為100%計算細胞粘附比率並顯示於表1。表權利要求
1.一種多肽，其包含SEQ ID NO :1所示的胺基酸序列並具有70個殘基以下的胺基酸 長度。
2.一種多肽，其包含SEQ ID NO :1所示的胺基酸序列，其中1至3個胺基酸被缺失、置 換或添加，具有與權利要求1所述的多肽等同的活性並且具有70個殘基以下的胺基酸長度。
3.根據權利要求1所述的多肽，其中SEQID NO 1所示胺基酸序列以外的部分由SEQ ID NO :2所示胺基酸序列的部分序列組成。
4.一種多肽，其由根據權利要求3所述的多肽的胺基酸序列組成，其中1至3個胺基酸 被缺失、置換或添加，並且具有與根據權利要求3所述的多肽等同的活性。
5.根據權利要求1所述的多肽，其由SEQID NO :2所示的胺基酸序列的部分序列組成。
6.一種多肽，其由根據權利要求5所述的多肽的序列組成，其中1至3個胺基酸被缺 失、置換或添加，並且具有與權利要求5所述的多肽等同的活性。
7.一種多肽，其由SEQ ID NO :3-5任一項所示的胺基酸序列組成。
8.一種多肽，其由SEQ ID NO :3 5任一項所示的胺基酸序列組成，其中1至3個氨 基酸被缺失、置換或添加，並且具有與根據權利要求7所述的多肽等同的活性。
9.一種細胞粘附促進劑，其包含權利要求1至8任一項所述的多肽。
10.一種促進細胞粘附的方法，其包括將根據權利要求1至8任一項所述的多肽以有效 濃度與細胞接觸。
全文摘要
本發明公開了包含催淚蛋白部分序列的多肽，其可促進細胞與細胞外基質之間的粘附。本發明還公開了包含催淚蛋白部分序列的多肽，其具有淚液分泌促進活性。本發明具體公開了包含SEQ ID NO1(其是催淚蛋白特定部分序列)所示胺基酸序列並且具有70個以下殘基的胺基酸長度的多肽。所述多肽可促進細胞與細胞外基質之間的粘附。所述多肽還可促進淚腺腺泡細胞中的淚液分泌。
文檔編號C12N15/00GK102083974SQ200980109468
公開日2011年6月1日 申請日期2009年3月19日 優先權日2008年3月19日
發明者東光佳, 中島毅 申請人:千壽製藥株式會社