用於成像式螢光顯微術的顯微鏡及其使用方法

2023-05-06 20:50:41

專利名稱：用於成像式螢光顯微術的顯微鏡及其使用方法
技術領域：
本發明涉及一種用於成像式螢光顯微術，特別是用於寬視野螢光顯微術的顯微鏡，其具有脈衝式光源和成像探測器。此外，本發明還涉及一種特別是應用本發明的顯微鏡的相應方法。本發明總體涉及螢光顯微術，其中特別是涉及寬視野螢光顯微術。
背景技術：
寬視野螢光顯微術在生物和醫學研究中具有重大意義。在傳統的螢光顯微術中試樣或多或少經逐點照射，而在所謂的寬視野顯微術(widefiled-microscopy)中所述試樣經大面積照射，並用物鏡成像，以致該整個系統的PSF(點擴展函數，Point SpreadFunction)僅由物鏡的(探測)PSF決定。與此相反，在共聚焦顯微鏡中入射光聚焦在試樣 上，以致該總PSF是照射PSF和探測PSF的乘積。較之在具有空間濾光片的共聚焦顯微鏡中通過探測針孔所能實現的，原則上，在寬視野螢光顯微鏡中有明顯更多的激發光從試樣反散射進顯微鏡的探測器的光徑。然而為了能夠在令人滿意的條件下攝取圖像，必須充分抑制散射光/反射光。為此，在寬視野螢光顯微鏡中通常使用抑制該相應激發波長的吸收濾光片。這通常藉助於濾光立方體實現，所述濾光立方體除包含吸收濾光片(發射濾光片)外還包含用於激發光的光譜純化的激發濾光片和作為主分光片的二向色鏡，其中所述主分光片同時有助於激發濾光片和發射濾光片。但對此的缺點是，由於不變的濾光片特性，激發光的光譜調諧是不可能的。此外，在多波長激發時，必需使用在合適的光譜位置上進行透射或反射的完全特定的濾光片，這進一步限制了濾光片的靈活性，並在許多可能的光譜激發範圍和探測範圍裡需要進行大量的濾光片組合，以至於這是不可能通過在實踐中常用的濾光片輪實現的。此外，各濾光片的光譜寬度還有所制約，即該探測範圍距激發波長範圍必然有一定的光譜間距，從而在中間範圍損失了探測光，對於顯微鏡更高的靈敏度來說，該探測光是應該可以探測到的。對共聚焦顯微鏡可示例性地參閱文獻DE 199 06 757 Al。其中該探測光通常至少部分作為被校準的光束而穿過針孔。相應地可使用聲光部件。與此相反，在寬視野顯微鏡中，在視野鏡組中存在真實圖像，這表明光在許多可能的空間角度中同時入射，這使得相應的聲光部件的使用似乎反而沒什麼意義，甚至完全不可能。這歸因於所述聲光部件需要極大的光孔，因此會特別複雜且昂貴。在文獻US 5252834中公開了顯微鏡中的門控制,但不用於成像和完全不適用成像中的反射光抑制/散射光抑制。但其中涉及逐點光譜攝像試樣的化學組成的特性測定(顯微分光光度術)。其中未提供成像探測器。

發明內容
本發明的目的在於，在適用於寬視野螢光顯微術的成像式螢光顯微鏡中，利用簡單的裝置實現反射光抑制/散射光抑制，用以因此在令人滿意的條件下攝取可再現的圖像。對此所需的措施應可用簡單的裝置成本低廉地實現。上述關於本發明的顯微鏡的目的是通過權利要求I的特徵部分實現的。上述關於本發明的方法的目的是通過從屬權利要求18的特徵部分實現的，更確切地說是利用本發明的顯微鏡。關於本發明的顯微鏡，其基本目的是如此實現的，即設有用於門控制的裝置，並通過該門控制實現光源和探測器的同步以達到反射光抑制/散射光抑制的目的，從而對適宜於處理的螢光成分加以利用，而對不適宜的成分予以捨棄。本發明的方法是相應地為此設計的。本發明的方法提出對顯微鏡中的成像探測器結合脈衝光源進行門控制。然而目前在顯微術中主要使用的照相機不允許進行門控制，甚至不對所有像素同時進行，因為通常是通過共同的讀取寄存器進行按序讀取。通常也不允許使用具有單光子靈敏度的CMOS晶片，因為儘管可以利用其進行並行讀取，但該讀取過程在亞IOOns範圍內對適用的門控制 來說實在是太慢了。基於本發明，優選將以蓋革模式運行的雪崩光電二極體的陣列(APD陣列；其中這種APD有時也被稱為「矽光電倍增管」)用於成像設備，所述成像設備允許進行門控制的，並可藉助它實現本發明的反射光抑制/散射光抑制。原則上也可以考慮其它適於「可門控制的照相機」的可能性。本發明基於利用脈衝光源和成像探測器進行工作的螢光顯微鏡。考慮到螢光的衰變時間，當脈衝光源所具有的脈衝寬度在螢光團的壽命範圍內或更好地低於此範圍時，對於脈衝光源是有利的。基於通常的螢光染料，脈衝寬度在5ns範圍內，優選在Ins範圍內，更優選在200ps範圍內是有利的。光源可以是雷射器、LED、閃光LED或可被激發雷射的放大介質等。如果該光源可觸發則更是特別有利的，其中這一點對於本發明技術方案的實施不是必不可少的。在特別有利的方式中，可應用脈衝式白光雷射器、脈衝式LED、脈衝式OPO和其它脈衝式雷射器。使用可門控制的成像探測器，換言之「可門控制的照相機」進行探測。其可以是預接具有經某種改制的可觸發的/可門控制的光學快速快門的照相機，或是可門控制地激活/去活的成像探測器。也可利用在產生探測信號後提供相應信息的成像探測器，該信息表明是否應處理或棄去相應的信號成分。可門控制的光學快門可以是例如可快速控制的光學圖像放大器，所述圖像放大器在關閉狀態下不增強光，而在接通狀態下增強光；也可以是可飽和的光學吸收器，所述光學吸收器通過短的光脈衝而飽和，並由此在施加門控制時變成透明的。可門控制的探測器可基於以蓋革模式運行的雪崩光電二極體(APD)中的陣列實現。為此，該成像探測器的每個單個像素均由單個以蓋革模式運行的APD陣列組成或由其中多個陣列組成(=子陣)。通過施加合適的門電壓開啟單個APD的蓋革模式，由此實現入射光子能夠觸發對APD的擊穿，並產生相應的電子信號。只要門控制關閉，該狀態就不會發生，以致此時該探測器是去活的。也可考慮門控制的其它實現可能方式，例如與此相反的，所述探測器的輸出端在門控制的斷開時間中短路或針對信號支路中斷。類似的可由外部控制的門控制也可在其它的照相機類型如CMOS晶片或CXD晶片中實現。原則上不一定需要在門控制斷開狀態下抑制信號的產生。「保存」相應的時間信息就足夠了。在極端情況下，對每個單個光子賦以時間標記，即對每個單個光子的到達時間予以存儲就足夠了，用以在下遊的數據處理設備(現場可編程序門列陣(FPGA)、數位訊號處理設備(DSP)及其他)中判定是否應處理該光子或捨棄該光子。這並不是對每個單個光子所必須進行的。原則上對每個像素錄下時間信號分布或其一部分，並隨後加以處理就足夠了。前述所討論的技術之間的轉換方式不是一成不變的，特別是由於當今日益增強的集成電子技術。重要的是，該成像設備是可門控制的，其中對所有像素優選存在一致的(同時的)門控制，儘管在特定情況下，也可考慮不同的時間門位置(temporal gatepositions)。富於獨創性的關鍵的一步在於，該可門控制的成像設備與脈衝光源是同步的，從而在處理中可再現性地利用適宜的螢光成分，而捨棄不適宜的成分。優選將屬於目標螢光 的光成分通過適宜的門控制用於成像，也就是說，如所實現的那樣彼此相互獨立。屬於反射光或散射光的成分被捨棄。在某些情況下有意義的是，在照射後對可自由調節的時間範圍內的螢光加以使用，而捨棄其它的光，或者將其歸入或輸入至少一個其它的探測通道。這對試樣來說是至關重要的，對試樣來說能夠通過螢光壽命推測試樣內部的局部情況。為應用本發明的設想，該成像探測器即「照相機」僅需將其門控制與光源有效地同步。這可如此實現，即提供顯示為主機的中心觸發設備，以該主機來觸發光源和照相機。與之相反，所述光源例如在被動模式耦合雷射器中也可形成主機觸發信號，利用該主機觸發信號觸發照相機，或者照相機可由內置的或外設控制的時鐘形成觸發信號，然後以該觸發信號同步所述光源。如果實現相應的配置，則在顯微鏡中易於實現反射光抑制/散射光抑制。在傳統的顯微鏡中，僅這一點就已經有助於實現對複雜試樣的成像。這個優點是可被利用的，只要棄用在顯微鏡中常規的螢光立方體並由此可達到比迄今為止明顯更高的光譜自由度。當用中性分光片取代螢光立方體(例如50 50或80 20，即20%的反射的入射光，和80%的透射的螢光或其它分配比例)時，則還可將任意波長同時用於螢光激發，以及極端情況下甚至在相同波長下進行探測，且無反射光或散射光的問題。但為實現上述情況，特別有效的抑制是必需的，例如通過結合各類門控制方法來實現。此外還可考慮使用吸收濾光片、陷波濾光片、帶寬濾光片、漸變濾光片或其它濾光片。在同時應用合適的偏振激發光時，使用偏振濾光片代替上述的中性濾光片還有助於進一步的反射光抑制/散射光抑制，雖然產生了探測靈敏度較低的後果。在此情況下要指出的是，「反射光抑制/散射光抑制」的概念不一定僅涉及試樣的反射/散射，也可指在顯微鏡內部構件上的要加以抑制的反射/散射。特別有利的是，將中性濾光片即光譜較平坦的漸變濾光片或可調濾光片與可調諧光源或具有平坦光譜分布的光源(如白光源)相組合，照射光從所述光源的光譜中截取。通過這種組合可實現具有高靈敏度的全光譜可調諧的寬視野顯微鏡。由此可為所有試樣找到其各自最佳的光譜照射設置，甚至可進行激發波長掃描。其也可與顯微鏡中的光譜探測相組合。在極端情況下，甚至可採用相應的組合激發光譜/發射光譜。本發明的技術可應用於所有具有成像設備的螢光顯微鏡中。旋轉盤顯微鏡(spinning disc microscopy)、定位顯微鏡、TIRP顯微鏡、具有結構化照射的顯微鏡、SPIM顯微鏡等也屬此列。本發明的技術可應用於反射光照射及透射光照射的螢光顯微術。此時存在多種以有利的方式將發明技術方案進行設置和擴展的各種可能方法。為此，一方面可參閱權利要求I的從屬權利要求，另一方面參閱以下根據附圖對本發明的優選實施例的說明。結合根據附圖對本發明的優選實施例的說明，還概述了該技術方案的有利設置和擴展。


圖I以示意圖示出了常規的、在實踐中被熟知的具有濾光立方體的螢光顯微鏡的基本結構，
圖2示出了本發明的顯微鏡的第一種實施例，其中所述照射設備包括可觸發的LED,圖3示出了本發明的顯微鏡的另一種實施例，其中應用了中性分光片或極性分光片，以及圖4示出了本發明的顯微鏡的另一種實施例，其中應用了光學快速快門。
具體實施例方式圖I以示意圖示出了常規螢光顯微鏡的基本結構，其中藉助於濾光立方體對激發光進行調諧。具體來說，在圖I所示出的裝置包括被作為光源的的照射設備I、位於照射設備I光路下遊的聚光鏡2和具有激發濾光片4和二向色分光片5的濾光立方體3。激發光6a經所述激發濾光片4通過物鏡7到達試樣8。來自試樣8的突光/反射光6b通過物鏡7經濾光立方體3、集成發射濾光片9被鏡筒透鏡10聚焦到探測器11，該探測器可設計成具有集成照相機晶片12的照相機。將如此得到的信號輸入電子計算機13中，該電子計算機既包括圖像處理設備還包括控制設備，特別是用於控制照射設備I。圖2示出了本發明裝置的第一種實施例，據此還應用了現有技術已知的濾光立方體3。使用可觸發的LED作為脈衝式照射設備I。主機，具體來說是由電子計算機13控制或可經電子計算機13編程的觸發設備/同步設備14被設計用於本發明的門控制。關於其它的如相應於圖I的現有技術的結構特徵，為避免重複可參閱對圖I的描述。圖3示出了在本發明裝置的另一種實施例框架中使用中性分光片或偏振分光片15作為濾光立方體3的組件或其替代品。照射設備I設計成由用於本發明門控制的主機所指示的雷射器。其觸發信號被光基準傳感器16截取。將該觸發直接輸入可門控制的照相機11，該照相機可包括集成分析裝置。此處必要時可去掉外部觸發設備。在圖3的實施例中僅示例性地設計了兩種呈照相機11形式的光譜探測設備。分度濾光片17用於對來自照射設備I的光線進行的特定光譜成分的提取。就此要指明的是，也可使用具有類似功能的其它元件如AOTF代替分度濾光片17。
圖4示出了本發明裝置的另一種實施例，其中藉助光學快速快門18實現這樣的裝置。此外，在圖4中還規定了，在本發明構想的一種特別有利的實施中，將中性分光片15固定組裝在顯微鏡中，從而不需要或者說不再需要更換濾光立方體。關於本發明的顯微鏡的其它有利方案，為避免重複可參閱本對說明書的概述部分以及所附權利要求。最後要特別指出，以上所述本發明裝置的實施例僅用於闡述所要求保護的技術方案，然而該技術方案不限於這些實施例。附圖標記列表I 照射設備，光源2 聚光鏡 3 濾光立方體4 激發濾光片5 二向色分光片，二向色鏡6a 激發光6b 突光/反射光7 物鏡8 試樣9 發射濾光片10 鏡筒透鏡11 探測器，照相機12 照相機晶片13 電子計算機，數據處理設備14 觸發/同步設備15 中性分光片，偏振分光片16 光基準傳感器17 漸變濾光片18 光學快門
權利要求
1.一種用於成像式螢光顯微術，特別是用於寬視野螢光顯微術的顯微鏡，其具有脈衝式光源⑴和成像探測器(11)，其特徵在於，設有用於門控制的裝置，並通過該門控制實現光源(I)和探測器(11)的同步來達到反射光抑制/散射光抑制的目的，從而對適宜於處理的螢光成分加以利用，而對不適宜的成分進行捨棄。
2.根據權利要求I所述的顯微鏡，其特徵在於，屬於目標螢光的光成分能夠通過門控制輸入探測器(11)，並且屬於反射光/散射光的那些光成分不用於成像。
3.根據權利要求I或2所述的顯微鏡，其特徵在於，經照射後一定時間段的螢光是可用的，而在該時間段外的螢光不用於成像和/或能夠被輸入另一探測通道。
4.根據權利要求I至3中任一項所述的顯微鏡，其特徵在於，為所有像素提供一致的和/或同步的門控制。
5.根據權利要求I至4中任一項所述的顯微鏡，其特徵在於，對不同像素，能夠實現不同的時間門控制或位置門控制。
6.根據權利要求I至5中任一項所述的顯微鏡，其特徵在於，用於所述門控制的裝置包括限定主機的優選的中心觸發設備(14)，通過該觸發設備可觸發光源和探測器。
7.根據權利要求6所述的顯微鏡，其特徵在於，所述光源(I)，尤其在模式耦合的雷射器中，形成可觸發探測器(11)的主機觸發信號。
8.根據權利要求6所述的顯微鏡，其特徵在於，所述探測器(11)，尤其是通過內置的或外設控制的時鐘形成觸發信號，所述光源(I)能夠基於該觸發信號同步。
9.根據權利要求I至8中任一項所述的顯微鏡，其特徵在於，所述探測器(11)被設計成可門控制的照相機。
10.根據權利要求9所述的顯微鏡，其特徵在於，所述照相機(11)包括可觸發的/可門控制的快速光學快門(18)，或該快門在功能上配屬於所述照相機(11)。
11.根據權利要求10所述的顯微鏡，其特徵在於，所述快門(18)設計成可快速控制的光學圖像增強器，該增強器在接通狀態下對光進行增強。
12.根據權利要求10所述的顯微鏡，其特徵在於，該快門(18)設計成光學吸收器，該吸收器通過短的光脈衝而飽和，並由此在施加門控制信號時變成透明的。
13.根據權利要求I至12中任一項所述的顯微鏡，其特徵在於，所述探測器(11)能夠如此進行門控制，即被相應地激活/去活。
14.根據權利要求I至13中任一項所述的顯微鏡，其特徵在於，所述探測器(11)的輸出在門控制的斷開時間中短路和/或針對信號支路斷開/中斷。
15.根據權利要求I至14中任一項所述的顯微鏡，其特徵在於，探測器(11)包括優選以蓋革模式運行的雪崩光電二極體(APD)陣列，其中所述成像探測器(11)的每個單個像素均由單個APD組成，或由多個APD子陣組成。
16.根據權利要求I至14中任一項所述的顯微鏡，其特徵在於，所述探測器(11)在產生探測信號後提供信息，所述信息將各信號成分鑑定為可用的或不可用的。
17.根據權利要求I至15中任一項所述的顯微鏡，其特徵在於，將代表到達時間的時間標記或時間信號分布記錄分配給每個光子或像素，用以在後置的數據處理設備(13)中決定該光子/像素是否可用於分析。
18.一種利用包括脈衝式光源和成像探測器的顯微鏡，特別是利用權利要求I至17中任一項所述的顯微鏡，進行成像螢光顯微術，特別是進行寬視野螢光顯微術的方法，其特徵在於， 採用門控制用以生成成像可用信號，即通過門控制光源和探測器的同步，以達到反射光/散射光抑制的目的，從而將適宜於分析的螢光成分加以利用，而將不適宜的成分進行去除。
全文摘要
本發明涉及一種用於成像式螢光顯微術，特別是用於寬視野螢光顯微術的顯微鏡，其具有脈衝光源(1)和成像探測器(11)，其特徵在於，設有用於門控制的裝置，並通過該門控制實現光源(1)和探測器(11)的同步，以達到反射光/散射光抑制的目的，從而將適宜於分析的螢光成分加以應用，而將不適宜的成分進行去除。此外本發明還涉及一種利用本發明的顯微鏡實施成像式螢光顯微術的方法。
文檔編號G01N21/64GK102830097SQ201210206620
公開日2012年12月19日 申請日期2012年6月18日 優先權日2011年6月17日
發明者V·塞弗裡德 申請人:徠卡顯微系統複合顯微鏡有限公司