生產甘氨酸的方法

2023-12-09 11:32:11 3

專利名稱：生產甘氨酸的方法
技術領域：
本發明涉及生產甘氨酸的方法。更確切地，本發明涉及生產甘氨酸的方法，該方法包含在微生物酶的作用下，使甘氨腈(glycinonitrile)水溶液在水解反應系統中進行水解反應，從而轉化甘氨腈為甘氨酸，同時伴隨產生氨，其中該水解反應系統含有至少一種抑制該微生物酶的有機雜質化合物，該有機雜質化合物的分子量為95或以上，並且含有特定的結構，該水解反應是在這樣的條件下進行地，其中在水解反應期間，抑制微生物酶的有機雜質化合物在水解反應系統中的含量保持在10重量％或以下的水平，基於水解反應系統的重量而言。利用本發明的方法，能夠容易和高效地在商業規模上生產高純度的甘氨酸，可用作食品添加劑和用作合成藥物、農藥與洗滌劑的原料，而不會對環境造成嚴重的負擔。
背景技術：
按照慣例，生產甘氨酸的方法包含通過斯特雷克法從甲醛、氰化氫和氨合成甘氨腈；通過鹼(例如苛性蘇打)水解轉化所合成的甘氨腈為甘氨酸蘇打和氨；用酸(例如硫酸)中和甘氨酸蘇打，得到甘氨酸；通過晶體-沉積回收甘氨酸(參見未審日本專利申請說明書No.昭43-29929、昭51-19719、昭49-14420和昭49-35329)。由上顯而易見，這樣一種採用鹼的常規水解方法使用一種鹼和一種酸，用量各自等於所生成的甘氨酸的量。因此，這類方法具有一個問題在於，伴隨產生大量的鹽，副產物的處理對環境造成嚴重的負擔。進而，由於副產物鹽的溶解度接近於甘氨酸，不能通過單一步驟的晶體-沉積回收甘氨酸，因此，煩瑣的操作是回收甘氨酸所必要的，例如重複包含晶體-沉積和母液循環的周期(參見未審日本專利申請說明書No.昭51-34113(相當於DE 2541677-B和NL 7511023-B))。另外，作為中間體的甘氨腈水溶液在pH2.5或以上時是不穩定的，並且已知溫度越高，甘氨腈經歷變性作用的可能性越大，例如分解和變色(參見未審日本專利申請說明書No.昭49-14420、昭54-46720和昭54-46721)。根據日本化學會出版的《工業化學雜誌》第70卷第54頁(1967)的記載，氰化氫有可能在鹼性條件下因聚合作用而變性，隨著聚合作用的進行生成黑色固體。進而，日本化學會出版的《實驗化學講座》第1版第347頁描述了甘氨腈等的氰甲基有可能在鹼性條件下因加成聚合作用而變性，導致吡啶化合物和嘧啶化合物的生成。未審日本專利申請說明書No.昭62-212357(相當於美國專利No.4,661,614)公開了從甲醛、氰化氫和氨能夠合成亞胺化合物，例如亞氨基二乙腈。已審日本專利申請公報說明書No.昭51-244815公開了當加熱甘氨腈時，甘氨腈生成氨和亞胺化合物(例如亞氨基二乙腈)，進一步加熱導致該亞胺化合物變性，導致黑色化合物的生成。因此，在常規方法中，由上述分解和變性引起的甘氨酸收率降低是不可避免的。進而，常規方法具有一個缺點在於，採用活性炭或特殊的離子交換樹脂的煩瑣處理是除去變色物質所必要的(參見未審日本專利申請說明書No.平3-190851和未審日本專利申請說明書No.平4-226949(相當於EP 459803-B))。
至於不使用大量鹼和酸在適度條件下水解甘氨腈的方法，已知這樣一種方法，其中使用具有水解腈基活性的微生物簡單地水解甘氨腈，從而得到甘氨酸和銨。已審日本專利申請公報說明書No.昭58-15120(相當於法國專利No.225585)公開了這樣一種方法，其中使用懸浮在反應介質液體中的短桿菌R312進行水解反應，反應介質液體已經用苛性鉀等調節pH值為8。未審日本專利申請說明書No.平3-62391(相當於EP 187680-B)公開了這樣一種方法，其中使用懸浮在反應介質液體中的棒桿菌N-774進行水解反應，反應介質液體是pH值為7.7的磷酸鹽緩衝液。未審日本專利申請說明書No.平3-280889(相當於EP 450885-B)公開了這樣一種方法，其中使用能夠水解腈基的微生物從甘氨腈生產甘氨酸，該微生物屬於紅球菌屬、節桿菌屬、乳酪桿菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌屬、不動桿菌屬、產鹼菌屬、棒桿菌屬或鏈黴菌屬，其中該微生物是懸浮在反應介質液體中的，後者是pH值為7.7的磷酸鹽緩衝液。不過，正如這些專利文獻的實施例所示，這些方法要求凍幹微生物的用量等於或大於甘氨酸的量，或者作為替代選擇，使用大量凍幹微生物進行反應30小時，也就是5重量％或以上，基於甘氨酸的重量而言。進而，也正如這些專利文獻的實施例所示，這些方法要求向反應系統中連續加入中和劑，以保持反應系統的pH在中性範圍內，以便維持微生物的活性。一般來說，為了中和甘氨酸的銨鹽，向反應系統中加入硫酸或磷酸，因此大量硫酸銨或磷酸銨有可能剩餘在反應系統中。因此，使用微生物生產甘氨酸的上述方法的不利之處在於必須使用大量的酸和必須棄去大量廢液。進而，使用微生物的上述方法具有下列問題。在使用微生物的上述方法中，用於回收甘氨酸的操作除了濃縮步驟以外還需要加入甲醇等的步驟，以致用於回收甘氨酸的操作變得比上面提到的鹼水解法更加複雜(參見已審日本專利申請公報說明書No.昭58-15120(相當於法國專利No.225585))。進而，上述方法使用大量的微生物，這導致廢液量的進一步增加。另一方面，已知有這樣一種方法，它採用微生物和電透析，並且其中甘氨酸和氨是單獨回收的，同時回收鹼(參見未審日本專利申請說明書No.昭10-179183(相當於美國專利No.5,932,454和EP852261-A))。這種方法是用於生產甘氨酸的方法，包含下列步驟使用微生物生產有機酸(包括甘氨酸)的銨鹽的步驟；轉化銨鹽為鹼金屬鹽的步驟，從而排除氨；回收所排除的氨的步驟；通過電透析使鹼和有機酸彼此分離的步驟；用有機溶劑萃取有機酸的步驟；和從有機溶劑中分離有機酸的步驟。在上述專利文獻的實施例中，從培養在20g甘油培養基中的微生物僅得到0.3摩爾有機酸，說明微生物的活性是非常低的。因而，這種方法具有缺點在於，多個步驟和煩瑣操作是必要的，消耗大量的電，使用和棄去大量微生物。
由上顯而易見，利用微生物從甘氨腈生產甘氨酸的常規方法具有缺點在於，每單位數量凍幹微生物的活性和每單位時間的活性都是很低的，並且必須棄去大量的培養基和微生物。另外，在不採用電透析的方法的情況下，存在一些問題在於，由於為了調節反應系統的pH或者為了回收甘氨酸而使用中和劑，氨的回收是困難的，並且除去中和劑的步驟是必要的。即使在採用電透析的方法的情況下，氨的回收不僅需要電，而且需要煩瑣的多步操作。因此，這種方法的商業化實施不能令人滿意地進行。
發明概述
在這種情形下，本發明人進行了廣泛而深入的研究，以發現能夠解決上述問題的反應方法和反應條件，發現適合用在這樣一種反應方法中的微生物。結果意外地發現，一種用於生產甘氨酸的方法能夠達到上述目的，該方法包括在微生物酶的作用下，使甘氨腈水溶液在水解反應系統中進行水解反應，從而轉化甘氨腈為甘氨酸，同時伴隨產生氨，其中該水解反應系統含有至少一種抑制該微生物酶的有機雜質化合物，該有機雜質化合物的分子量為95或以上，並且含有特定的結構，該水解反應是在這樣的條件下進行的，其中在水解反應期間，抑制微生物酶的有機雜質化合物在水解反應系統中的含量保持在10重量％或以下的水平，基於水解反應系統的重量而言。也就是說，已經驚人地發現，利用上述方法，實現的優點不僅在於生產甘氨酸能夠無需使用和棄去大量的微生物、培養基、酸、鹼等，而且在於能夠抑制甘氨酸的變色，每單位重量微生物的甘氨酸生產活性和每單位時間的甘氨酸生產活性都變高了，能夠化學計量地生產甘氨酸和氨而不會分解或消耗，並且能夠單獨和容易回收。基於上述新發現，完成了本發明。
因此，本發明的主要目的是提供用於生產甘氨酸的方法，它的有利之處不僅在於能夠高效與化學計量地生產高純度甘氨酸和高純度氨，並能夠單獨回收，而且在於該方法不會對環境造成嚴重的負擔。
通過下列詳細的說明書和權利要求書並結合附圖，本發明的上述和其他目的、特徵和優點對本領域技術人員來說將是顯而易見的。
附圖的簡要說明
附圖中


圖1顯示用在生產甘氨酸的實施例12中的生產系統。
參考號碼的說明
1甲醛水溶液
2液態氰化氫
3氫氧化鈉
4氣態氨
5微生物懸液
6、7、8 高壓釜
9閃蒸設備
10 液態氨
11、16 中間罐
12 水解反應釜
13 連續離心機
14 所要棄去的微生物
15 循環型超濾設備
17 活性炭柱
18 連續晶體-沉積(crystal-deposition)設備
19 已被蒸發和回收的水
20 吹風
21 濾液
22 甘氨酸晶體
發明的詳細說明
本發明在一方面提供用於生產甘氨酸的方法，包括
提供水溶液形式的甘氨腈，
在具有水解腈基活性的微生物酶的作用下，使甘氨腈水溶液在水解反應系統中進行水解反應，從而轉化甘氨腈為甘氨酸，同時伴隨產生氨，
該水解反應系統含有至少一種抑制該微生物酶的有機雜質化合物，其中該至少一種抑制微生物酶的有機雜質化合物的分子量為95或以上，並且含有至少一個選自腈基、羧基、醯胺基、氨基、羥基和亞丙基胺(trimethyleneamine)結構的成員，其中該亞丙基胺結構具有由下式(1)代表的骨架
其中n代表整數1或以上，
該水解反應是在這樣的條件下進行的，其中在水解反應期間，抑制微生物酶的有機雜質化合物在水解反應系統中的含量保持在10重量％或以下的水平，基於水解反應系統的重量而言，和
從水解反應系統中分離甘氨酸。
為了易於理解本發明，本發明的必要特徵和各種優選實施方式列舉如下。
1、用於生產甘氨酸的方法，包括
提供水溶液形式的甘氨腈，
在具有水解腈基活性的微生物酶的作用下，使甘氨腈水溶液在水解反應系統中進行水解反應，從而轉化甘氨腈為甘氨酸，同時伴隨產生氨，
該水解反應系統含有至少一種抑制該微生物酶的有機雜質化合物，其中該至少一種抑制微生物酶的有機雜質化合物的分子量為95或以上，並且含有至少一個選自腈基、羧基、醯胺基、氨基、羥基和亞丙基胺結構的成員，其中該亞丙基胺結構具有由下式(1)代表的骨架
其中n代表整數1或以上，
該水解反應是在這樣的條件下進行的，其中在水解反應期間，抑制微生物酶的有機雜質化合物在水解反應系統中的含量保持在10重量％或以下的水平，基於水解反應系統的重量而言，和
從水解反應系統中分離甘氨酸。
2、根據上面第1項的方法，其中該至少一種抑制微生物酶的有機雜質化合物是在至少一種反應中作為副產物而生成的，該反應選自從氰化氫、甲醛和氨合成甘氨腈和甘氨腈水解為甘氨酸和氨。
3、根據上面第1或2項的方法，其中該至少一種抑制微生物酶的有機雜質化合物包含由下式(2)代表的化合物
NH3-n(CH2Y1)n(2)
其中每個Y1獨立地代表腈基、羧基或醯胺基；n代表整數2或3。
4、根據上面第1或2項的方法，其中該至少一種抑制微生物酶的有機雜質化合物包含至少一種選自由下列化合物(a)和(b)組成的組的化合物
(a)由下式(3)代表的化合物
其中
Y1代表腈基、羧基或醯胺基；
每個Y2獨立地代表氨基或羥基；
n代表整數0或以上；
該Z1或每個Z1獨立地是由下式(4)或(5)代表的
或
其中每個Y2獨立地代表氨基或羥基，和
(b)由下式(6)或(7)代表的化合物
或
其中每個Y2獨立地代表氨基或羥基；
每個Z2獨立地是由下式(8)或(9)代表的
或
Z1n-H (9)
其中
Y2代表氨基或羥基；
該Z1或每個Z1是如式(3)所定義的；
n代表整數0或以上。
5、根據上面第1或2項的方法，其中該至少一種抑制微生物酶的有機雜質化合物包含至少一種選自由下列化合物(c)和(d)組成的組的化合物
(c)由下式(10)或(11)代表的化合物
或
其中每個Y1獨立地代表腈基、羧基或醯胺基，和
(d)由下式(12)代表的化合物
(HCN)n(12)
其中n代表整數4或以上。
6、根據上面第1或2項的方法，其中該至少一種抑制微生物酶的有機雜質化合物包含這樣的化合物，在其分子中具有至少一個選自由下列骨架(e)和(f)組成的組的骨架
(e)由下式(13)代表的骨架
其中每個Y1獨立地代表腈基、羧基或醯胺基；
n代表整數2或以上，和
(f)由下式(14)或(15)代表的骨架
或
其中
該Y1或每個Y1獨立地代表腈基、羧基或醯胺基；
每個Y2獨立地代表氨基或羥基；
n代表整數1或以上。
7、根據上面第1或2項的方法，其中該至少一種抑制微生物酶的有機雜質化合物包含這樣的化合物，在其分子中具有至少一種骨架，選自由下列骨架(g)和(h)組成的組
(g)由下式(16)代表的骨架
其中
每個Y1獨立地代表腈基、羧基或醯胺基；
每個Y2獨立地代表氨基或羥基；
n代表整數2或以上，和
(h)由下式(17)或(18)代表的骨架
或
其中
該Y1或每個Y1獨立地代表腈基、羧基或醯胺基；
每個Y2獨立地代表氨基或羥基；
n代表整數1或以上。
8、根據上面第1或2項的方法，其中該至少一種抑制微生物酶的有機雜質化合物包含六亞甲基四胺。
9、根據上面第1至8項之任意一項的方法，其中該至少一種抑制微生物酶的有機雜質化合物在重水中測量的13C-NMR波譜中53ppm與100ppm之間表現峰。
10、根據上面第1至9項之任意一項的方法，其中該至少一種抑制微生物酶的有機雜質化合物在關於水解反應系統測量的紫外-可見吸收光譜中340nm與380nm之間和440nm與480nm之間表現最大吸收。
11、根據上面第1至10項之任意一項的方法，其中該至少一種抑制微生物酶的有機雜質化合物的分子量為130或以上。
12、根據上面第1至11項之任意一項的方法，其中該至少一種抑制微生物酶的有機雜質化合物的量為1重量％或以下，基於水解反應系統的重量而言。
13、根據上面第1至12項之任意一項的方法，其中該水解反應系統中溶解有5重量ppm或以下的氧，基於水解反應系統的重量而言。
14、根據上面第1至13項之任意一項的方法，其中水解作用是利用密閉反應系統、用惰性氣體加壓的反應系統、流通惰性氣體的反應系統或在低於大氣壓的壓力之下的反應系統進行的，以便抑制溶解在水解反應系統中的氧量。
15、根據上面第1至14項之任意一項的方法，其中水解作用是在其中溶解有氨的水解反應系統中進行的。
16、根據上面第1至15項之任意一項的方法，其中水解作用是在含有2重量％或以下電解質的水解反應系統中進行的，基於甘氨腈的重量而言。
17、根據上面第1至16項之任意一項的方法，其中具有水解腈基活性的微生物酶是從屬於下列屬的微生物衍生的，所述屬選自不動桿菌屬(Acinetobacter)、紅球菌屬(Rhodococcus)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、產鹼菌屬(Alcaligenes)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)和假絲酵母屬(Candida)。
18、根據上面第17項的方法，其中不動桿菌屬的微生物菌株是不動桿菌(Acinetobacter sp.)AK226，保藏在日本國立生命科學和人體技術研究所(National Institute of Bioscience andHuman-Technology，Japan)中，保藏號為FERM BP-2451，或不動桿菌(Acinetobacter sp.)AK227，保藏在日本國立生命科學和人體技術研究所中，保藏號為FERM BP-7413。
19、根據上面第17項的方法，其中紅球菌屬的微生物菌株是海洋紅球菌(Rhodococcus maris)BP-479-9，保藏在日本國立生命科學和人體技術研究所中，保藏號為FERM BP-5219。
20、根據上面第17項的方法，其中棒桿菌屬的微生物菌株是棒桿菌(Corynebacterium sp.)C5，保藏在日本國立生命科學和人體技術研究所中，保藏號為FERM BP-7414，或Corynebacteriumnitrilophilus，保藏在美國典型培養物保藏中心(American TypeCulture Collection，U.S.A.)中，保藏號為ATCC 21419。
21、根據上面第17項的方法，其中產鹼菌屬的微生物菌株是糞產鹼菌(Alcaligenes faecalis)IFO 13111，保藏在日本國立生命科學和人體技術研究所中，保藏號為FERM BP-4750。
22、根據上面第17項的方法，其中分枝桿菌屬的微生物菌株是分枝桿菌(Mycobacterium sp.)AC777，保藏在日本國立生命科學和人體技術研究所中，保藏號為FERM BP-2352。
23、根據上面第17項的方法，其中紅假單胞菌屬的微生物菌株是球形紅假單胞菌(Rhodopseudomonas spheroides)，保藏在美國典型培養物保藏中心中，保藏號為ATCC 11167。
24、根據上面第17項的方法，其中假絲酵母屬的微生物菌株是熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)，保藏在美國典型培養物保藏中心中，保藏號為ATCC 20311。
25、根據上面第1至24項之任意一項的方法，其中在進行從水解反應系統中分離甘氨酸的同時，獨立於甘氨酸回收地回收伴隨產生的氨。
26、根據上面第25項的方法，其中甘氨酸和氨是通過至少一個操作而單獨回收的，該操作選自蒸餾、反應性蒸餾(reactivedistillation)、被惰性氣體夾帶、離子交換、提取、利用不良溶劑再沉澱和通過濃縮或冷卻的晶體-沉積。
27、根據上面第26項的方法，其中氨是通過蒸餾、反應性蒸餾或被惰性氣體夾帶而回收的，甘氨酸是通過使氨回收之後剩餘的液體進行通過濃縮或冷卻的晶體-沉積而回收的。
28、根據上面第1至27項之任意一項的方法，該方法包括
(1)在密閉的反應系統內，在鹼催化劑(alkali catalyst)的存在下，使氰化氫與甲醛在水性介質中反應，得到水溶液形式的乙醇腈，
(2)向乙醇腈的水溶液中加入氨，進行乙醇腈與氨之間的反應，從而得到水溶液形式的甘氨腈，同時生成水，
(3)通過蒸餾從所得甘氨腈的水溶液中分離大部分氨和一部分水，從而得到水解反應系統，含有水溶液形式的甘氨腈和剩餘未分離的氨，其中回收所分離的氨，用於再循環至步驟(2)，
(4)在由加入到處於密閉系統內的水解反應系統中的微生物產生的微生物酶的作用下，使水解反應系統進行水解反應，從而轉化甘氨腈為甘氨酸，同時伴隨產生氨，
(5)通過至少一個操作分離微生物和微生物酶，該操作選自離心過濾和膜過濾，其中回收微生物和微生物酶，用於再循環至步驟(4)，
(6)通過至少一個操作分離一部分在步驟(1)至(5)中伴隨產生的、抑制微生物酶的有機雜質化合物，該操作選自膜過濾和吸附劑分離(adsorbent-separation)，
(7)通過蒸餾分離在步驟(4)中伴隨產生的氨和在步驟(4)後剩餘在水解反應系統中的過量的水，其中回收所分離的氨，用於再循環至步驟(2)，
(8)在步驟(7)後或者與此同時，通過晶體-沉積分離甘氨酸，和
(9)乾燥甘氨酸的晶體。
29、用於生產甘氨酸的方法，包括提供水溶液形式的甘氨腈，使甘氨腈的水溶液進行水解反應，從而轉化甘氨腈為甘氨酸，同時伴隨產生氨，和從水解反應系統中分離甘氨酸，其中甘氨腈的水解作用是在氨的存在下進行的。
30、根據上面第29項的方法，其中氨的量為0.001至5mol，相對於1摩爾甘氨腈而言。
31、用於生產甘氨酸的方法，包括提供水溶液形式的甘氨腈，使甘氨腈的水溶液進行水解反應，從而轉化甘氨腈為甘氨酸，同時伴隨產生氨，和從水解反應系統中分離甘氨酸，其中在進行從水解反應系統中分離甘氨酸的同時，在鹼和酸缺乏下，獨立於甘氨酸回收地回收伴隨產生的氨。
32、根據上面第31項的方法，其中甘氨酸和氨是通過至少一個操作而單獨回收的，該操作選自蒸餾、反應性蒸餾、被惰性氣體夾帶、離子交換、提取、利用不良溶劑再沉澱和通過濃縮或冷卻的晶體-沉積。
33、根據上面第32項的方法，其中氨是通過蒸餾、反應性蒸餾或被惰性氣體夾帶而回收的，甘氨酸是通過使氨回收之後剩餘的液體進行通過濃縮或冷卻的晶體-沉積而回收的。
下面將詳細描述本發明。
本發明中優選的是，甘氨腈是從氰化氫、甲醛和氨合成的。甘氨腈可以通過常規方法合成。具體來說，甘氨腈例如可以通過這樣一種方法合成，其中從氰化氫和甲醛合成乙醇腈(羥基乙腈)，然後向乙醇腈加入氨並與之反應，從而得到甘氨腈；或者其中直接從氰化氫、甲醛和氨合成甘氨腈。
用在本發明中的水解反應系統包含乙醇腈、甘氨腈、甘氨酸、氨、水、催化劑、抑制微生物酶的有機雜質化合物等。
含在水解反應系統中的、抑制微生物酶的有機雜質化合物可逆地抑制微生物酶的化合物，或不可逆地抑制微生物酶的化合物，使微生物酶失活和不可能再使用。這類有機雜質化合物的分子量為95或以上，並且含有至少一個選自由腈基、羧基、醯胺基、氨基、羥基和亞丙基胺結構組成的組的成員。例如，有機雜質化合物可以是任意下列物質用於生產甘氨酸的原料；含在催化劑等中的添加劑；和含在原料中的雜質。另外，有機雜質化合物可以是任意下列物質在從氰化氫、甲醛和氨合成甘氨腈期間伴隨產生的化合物；和在甘氨腈(氨基乙腈)水解為甘氨酸和氨期間伴隨產生的化合物。進而，有機雜質化合物可以是任意下列物質在具有水解腈基活性的微生物酶產生期間伴隨產生的化合物；和從分離與純化甘氨酸步驟再循環的副產物。
含在本發明水解反應系統中的有機雜質化合物的具體實例包括至少一種選自由下列化合物(A)至(F)組成的組的化合物。
(A)由下式(2)代表的化合物
NH3-n(CH2Y1)n (2)
其中每個Y1獨立地代表腈基、羧基或醯胺基；n代表整數2或3。
由上式(2)代表的化合物是含有亞胺(-NH-)結構或次氮基(-N＝)結構的縮合化合物和通過其水解作用生成的化合物。作為這類縮合化合物的實例，可以提到亞氨基二乙腈和次氮基三乙腈，它們已知是通過乙醇腈與甘氨腈之間的縮合反應生成的。通過這類縮合化合物腈基的水解作用生成的化合物實例包括亞氨基二乙酸、氰基甲基氨基乙酸、亞氨基二乙醯胺、氰基甲基氨基乙醯胺、氨基甲醯基甲基氨基乙酸、次氮基三乙酸、N-(氰基甲基)亞氨基二乙酸、N，N-雙(氰基甲基)氨基乙酸、N-(氨基甲醯基甲基)亞氨基二乙酸、N，N-雙(氨基甲醯基甲基)氨基乙酸、次氮基三乙醯胺、N-(氰基甲基)亞氨基二乙醯胺、N，N-雙(氰基甲基)氨基乙醯胺等。
(B)至少一種選自由下列化合物(a)和(b)組成的組的化合物
(a)由下式(3)代表的化合物
其中
Y1代表腈基、羧基或醯胺基；
每個Y2獨立地代表氨基或羥基；
n代表整數0至100；
該Z1或每個Z1獨立地是由下式(4)或(5)代表的
或
其中每個Y2獨立地代表氨基或羥基，和
(b)由下式(6)或(7)代表的化合物
或
其中每個Y2獨立地代表氨基或羥基；
每個Z2獨立地是由下式(8)或(9)代表的
或
Z1n-H (9)
其中
Y2代表氨基或羥基；
該Z1或每個Z1是如式(3)所定義的；
n代表整數0至100。
由上式(3)代表的化合物是加成聚合化合物和通過該加成聚合化合物腈基的水解作用生成的化合物。由式(6)代表的化合物是具有嘧啶骨架的加成環化化合物——它是通過上述加成聚合化合物的環化作用生成的——和通過這樣的加成環化化合物腈基的水解作用生成的化合物。由式(7)代表的化合物是具有吡啶骨架的加成環化化合物——它是通過上述加成聚合化合物的環化作用生成的——和通過這樣的加成環化化合物腈基的水解作用生成的化合物。例如，苯乙腈的加成反應描述在日本化學會出版的《實驗化學講座》第1版第18-2卷第347頁中，這類加成化合物已知是通過這樣一種機理生成的，氰基甲基經歷加成二聚作用或加成三聚作用，之後是可選的環化作用或聚合作用。
由上式(3)代表的加成二聚物實例包括通過乙醇腈與甘氨腈之間的加成反應所得到的化合物，也就是1，3-二氨基-2-亞氨基-丁腈、1，3-二羥基-2-亞氨基-丁腈、1-氨基-2-亞氨基-3-羥基丁腈和3-氨基-2-亞氨基-1-羥基丁腈。通過上述化合物腈基的水解作用生成的化合物實例包括1，3-二氨基-2-亞氨基-丁酸、1，3-二羥基-2-亞氨基-丁酸、1-氨基-2-亞氨基-3-羥基丁酸、3-氨基-2-亞氨基-1-羥基丁酸、1，3-二氨基-2-亞氨基-丁醯胺、1，3-二羥基-2-亞氨基-丁醯胺、1-氨基-2-亞氨基-3-羥基丁醯胺、3-氨基-2-亞氨基-1-羥基丁醯胺等。
作為由上式(3)代表的並且含有由上式(4)代表的結構、即其中腈基被加成鍵合到亞甲基上的結構的加成三聚物的實例，可以提到1，3，5-三氨基-2，4-二亞氨基己腈、1，3-二氨基-2，4-二亞氨基-5-羥基己腈、1，5-二氨基-2，4-二亞氨基-3-羥基己腈、3，5-二氨基-2，4-二亞氨基-1-羥基己腈、1-氨基-2，4-二亞氨基-3，5-二羥基己腈、3-氨基-2，4-二亞氨基-1，5-二羥基己腈、5-氨基-2，4-二亞氨基-1，3-二羥基己腈、2，4-二亞氨基-1，3，5-三羥基己腈等。通過上述化合物腈基的水解作用生成的化合物實例包括1，3，5-三氨基-2，4-二亞氨基己酸、1，3-二氨基-2，4-二亞氨基-5-羥基己酸、1，5-二氨基-2，4-二亞氨基-3-羥基己酸、3，5-二氨基-2，4-二亞氨基-1-羥基己酸、1-氨基-2，4-二亞氨基-3，5-二羥基己酸、3-氨基-2，4-二亞氨基-1，5-二羥基己酸、5-氨基-2，4-二亞氨基-1，3-二羥基己酸、2，4-二亞氨基-1，3，5-三羥基己酸、1，3，5-三氨基-2，4-二亞氨基己醯胺、1，3-二氨基-2，4-二亞氨基-5-羥基己醯胺、1，5-二氨基-2，4-二亞氨基-3-羥基己醯胺、3，5-二氨基-2，4-二亞氨基-1-羥基己醯胺、1-氨基-2，4-二亞氨基-3，5-二羥基己醯胺、3-氨基-2，4-二亞氨基-1，5-二羥基己醯胺、5-氨基-2，4-二亞氨基-1，3-二羥基己醯胺、2，4-二亞氨基-1，3，5-三羥基己醯胺等。
作為由上式(3)代表的並且含有由上式(5)代表的結構、即其中腈基被加成鍵合到亞氨基上的結構的加成三聚物的實例，可以提到2，4-二氨基-3-(2-氨基-1-亞氨基乙基亞氨基)丁腈、2-氨基-4-羥基-3-(2-氨基-1-亞氨基乙基亞氨基)丁腈、4-氨基-2-羥基-3-(2-氨基-1-亞氨基乙基亞氨基)丁腈、2，4-二羥基-3-(2-氨基-1-亞氨基乙基亞氨基)丁腈、2，4-二氨基-3-(2-羥基-1-亞氨基乙基亞氨基)丁腈、2-氨基-4-羥基-3-(2-羥基-1-亞氨基乙基亞氨基)丁腈、4-氨基-2-羥基-3-(2-羥基-1-亞氨基乙基亞氨基)丁腈、2，4-二羥基-3-(2-羥基-1-亞氨基乙基亞氨基)丁腈等。通過上述化合物腈基的水解作用生成的化合物實例包括2，4-二氨基-3-(2-氨基-1-亞氨基乙基亞氨基)丁酸、2-氨基-4-羥基-3-(2-氨基-1-亞氨基乙基亞氨基)丁酸、4-氨基-2-羥基-3-(2-氨基-1-亞氨基乙基亞氨基)丁酸、2，4-二羥基-3-(2-氨基-1-亞氨基乙基亞氨基)丁酸、2，4-二氨基-3-(2-羥基-1-亞氨基乙基亞氨基)丁酸、2-氨基-4-羥基-3-(2-羥基-1-亞氨基乙基亞氨基)丁酸、4-氨基-2-羥基-3-(2-羥基-1-亞氨基乙基亞氨基)丁酸、2，4-二羥基-3-(2-羥基-1-亞氨基乙基亞氨基)丁酸、2，4-二氨基-3-(2-氨基-1-亞氨基乙基亞氨基)丁醯胺、2-氨基-4-羥基-3-(2-氨基-1-亞氨基乙基亞氨基)丁醯胺、4-氨基-2-羥基-3-(2-氨基-1-亞氨基乙基亞氨基)丁醯胺、2，4-二羥基-3-(2-氨基-1-亞氨基乙基亞氨基)丁醯胺、2，4-二氨基-3-(2-羥基-1-亞氨基乙基亞氨基)丁醯胺、2-氨基-4-羥基-3-(2-羥基-1-亞氨基乙基亞氨基)丁醯胺、4-氨基-2-羥基-3-(2-羥基-1-亞氨基乙基亞氨基)丁醯胺、2，4-二羥基-3-(2-羥基-1-亞氨基乙基亞氨基)丁醯胺等。
由上式(3)代表的化合物實例還包括這樣的加成聚合化合物，其中甘氨腈或乙醇腈的腈基被加成鍵合到上述化合物的甲基或亞氨基上。由上式(3)代表的這類化合物可以具有無規共聚物構型，其中由上式(4)代表的結構單元和由上式(5)代表的結構單元交替排列在分子中，或者具有嵌段共聚物構型，其中該分子含有至少兩個不同的聚合物嵌段，它們各自獨立地含有至少一個由式(4)和(5)代表的結構單元。
作為由上式(6)代表的、具有通過腈基末端的環化作用生成的嘧啶骨架的加成環化化合物實例，可以提到4，5-二氨基-2，6-雙(氨基甲基)嘧啶、4-氨基-5-羥基-2，6-雙(氨基甲基)嘧啶、5-氨基-4-羥基-2，6-雙(氨基甲基)嘧啶、4，5-二氨基-2-氨基甲基-6-羥基甲基嘧啶、4-氨基-5-羥基-2-氨基甲基-6-羥基嘧啶、5-氨基-4-羥基-2-氨基甲基-6-羥基嘧啶、4，5-二氨基-6-氨基甲基-2-羥基甲基嘧啶、4-氨基-5-羥基-6-氨基甲基-2-羥基嘧啶、5-氨基-4-羥基-6-氨基甲基-2-羥基嘧啶、4，5-二氨基-2，6-雙(羥基甲基)嘧啶、4-氨基-5-羥基-2，6-雙(羥基甲基)嘧啶、5-氨基-4-羥基-2，6-雙(羥基甲基)嘧啶等。由上式(6)代表的化合物的進一步實例包括通過這樣一種反應生成的加成環化化合物，其中腈基被加成鍵合到任意上述化合物的1-位亞甲基上，並且所得化合物被由上式(8)或(9)代表的取代基取代。由上式(6)代表的這類化合物可以具有無規共聚物構型，其中由上式(4)代表的結構單元和由上式(5)代表的結構單元交替排列在分子中，或者具有嵌段共聚物構型，其中該分子含有至少兩個不同的聚合物嵌段，它們各自獨立地含有至少一個由式(4)和(5)代表的結構單元。另外，通過上述加成環化化合物腈基的水解作用生成的化合物也可以被提到作為由式(6)代表的化合物實例。
作為由上式(7)代表的、具有通過腈基末端的環化作用生成的吡啶骨架的加成環化化合物實例，可以提到2，3，4，5-四氨基-6-氨基甲基吡啶、2，3，4-三氨基-5-羥基-6-氨基甲基吡啶、2，4，5-三氨基-3-羥基-6-氨基甲基吡啶、2，4，5-三氨基-3，5-二羥基-6-氨基甲基吡啶、2，3，4，5-四氨基-6-羥基甲基吡啶、2，3，4-三氨基-5-羥基-6-羥基甲基吡啶、2，4，5-三氨基-3-羥基-6-羥基甲基吡啶和2，4，5-三氨基-3，5-二羥基-6-羥基甲基吡啶。由上式(7)代表的化合物的進一步實例包括通過這樣一種反應生成的加成環化化合物，其中腈基被加成鍵合到任意上述化合物的6-位亞甲基上，並且所得化合物被由上式(8)或(9)代表的取代基取代。由上式(7)代表的這類化合物可以具有無規共聚物構型，其中由上式(4)代表的結構單元和由上式(5)代表的結構單元交替排列在分子中，或者具有嵌段共聚物構型，其中該分子含有至少兩個不同的聚合物嵌段，它們各自獨立地含有至少一個由式(4)和(5)代表的結構單元。另外，通過上述加成環化化合物腈基的水解作用生成的化合物也可以被提到作為由式(7)代表的化合物的實例。
(C)至少一種選自由下列化合物(c)和(d)組成的組的化合物
(c)由下式(10)或(11)代表的化合物
或
其中每個Y1獨立地腈基、羧基或醯胺基，和
(d)由下式(12)代表的化合物
(HCN)n (12)
其中n代表整數4至200。
由上式(10)或(11)代表的化合物是氰化氫的四聚物和通過該四聚物腈基的水解作用生成的化合物。由上式(12)代表的化合物是氰化氫的聚合物。
由上式(10)或(11)代表的化合物(即氰化氫的四聚物)的實例包括二氨基馬來腈(maleonitrile)及其互變異構體，也就是氨基亞氨基琥珀腈。通過氰化氫四聚物腈基的水解作用生成的化合物實例包括二氨基馬來酸、2，3-二氨基-3-氰基丙烯酸、2，3-二氨基-3-氰基丙烯醯胺、2，3-二氨基-3-氨基甲醯基丙烯酸、2，3-二氨基-3-氨基甲醯基丙烯醯胺、氨基亞氨基琥珀酸、2-氨基-3-亞氨基-3-氨基甲醯基丙醯胺、2-氨基-3-亞氨基-3-氰基丙酸、2-氨基-3-亞氨基-3-氰基丙醯胺、2-氨基-3-亞氨基-3-氨基甲醯基丙酸、3-氨基-2-亞氨基-3-氰基丙酸、3-氨基-2-亞氨基-3-氰基丙醯胺和3-氨基-2-亞氨基-3-羰基丙酸。
由上式(12)代表的氰化氫聚合物實例包括下列化合物。若n＝4，則除了由上式(10)或(11)代表的化合物以外，還可以提到3-氨基-2，4-二亞氨基丁酸；若n＝5，則可以提到3-氨基-3-氰基-2，4-二亞氨基丁酸和3-氨基-2，4，5-三亞氨基庚酸；若n＝6，則可以提到3，4-二氨基-3，4-二氰基-2-亞氨基丁酸、3-氨基-3-氰基-2，4，5-三亞氨基庚酸等。由上式(12)代表的氰化氫聚合物的進一步實例包括其中n是7或以上的氰化氫聚合物。
(D)這樣一種化合物，在其分子中具有至少一個選自由下列骨架(e)和(f)組成的組的骨架
(e)由下式(13)代表的骨架
其中每個Y1獨立地代表腈基、羧基或醯胺基；
n代表整數2至120，和
(f)由下式(14)或(15)代表的骨架
或
其中
每個Y1獨立地代表腈基、羧基或醯胺基；
每個Y2獨立地代表氨基或羥基；
n代表整數1至70。
在其分子中具有由上式(13)代表的骨架的化合物實例包括氰化氫的聚合物和通過氰化氫聚合物腈基的水解作用生成的聚合物。作為這樣一種氰化氫聚合物的具體實例，可以提高這樣一種聚合物，它具有至少一個選自由氨基氰基亞甲基結構、氨基氨甲醯基亞甲基結構和氨基羧基亞甲基結構組成的組的結構，並且具有2個或以上重複單元。上面提到的氰化氫聚合物可以是在重水中測量的13C-NMR波譜中70ppm與90ppm之間表現一個峰的化合物，其中該峰歸因於亞甲基結構。
在其分子中具有由上式(14)或(15)代表的骨架的化合物實例包括多環化合物和通過該多環化合物腈基的水解作用生成的化合物。作為這類化合物的具體實例，可以提到這樣一種多環化合物，其中具有3，4，4，5-四氨基-4-(氰基、羧基或氨基甲醯基)-3，4，5，6-四氫吡啶骨架的6-元環5-位和6-位分別是相鄰6-元環的2-位和3-位，和這樣一種多環化合物，其中3，7，9，10-四氨基-3，4，6，7，9，10-六氫吡啶並[2，3-e]吡啶骨架的6-位、7-位、8-位和9-位分別是相鄰吡啶骨架的5-位、10-位、4-位和3-位。這樣一種多環化合物可以是在重水中測量的13C-NMR波譜中60ppm與80ppm之間表現一個峰的化合物，其中該峰歸因於亞甲基結構。這樣一種多環化合物可以是在紫外-可見光譜中380nm與460nm之間表現最大吸收的化合物。
上述氰化氫聚合物等的生成機理描述在日本化學會出版的《工業化學雜誌》(Kogyo Kagaku Zasshi)第70卷第54頁(1967)中。
(E)這樣一種化合物，在其分子中具有至少一個骨架，該骨架選自由下列骨架(g)和(h)組成的組
(g)由下式(16)代表的骨架
其中
每個Y1獨立地代表腈基、羧基或醯胺基；
每個Y2獨立地代表氨基或羥基；
n代表整數2至120，和
(h)由下式(17)或(18)代表的骨架
或
其中
每個Y1獨立地代表腈基、羧基或醯胺基；
每個Y2獨立地代表氨基或羥基；
n代表整數1至70。
在其分子中具有由上式(16)代表的骨架的化合物是通過氧化聚合作用生成的化合物(即氧化聚合產物)和通過該氧化聚合產物腈基的水解作用生成的化合物。這些化合物已知是通過亞甲基的氧化偶聯反應生成的。這類化合物的實例包括2，3-二氨基琥珀腈和2-氨基-3-羥基琥珀腈(它們是通過乙醇腈和甘氨腈的氧化偶聯生成的)；和通過上述化合物的水解作用生成的化合物，例如2，3-二氨基琥珀酸、2，3-二氨基-3-氨基甲醯基丙醯胺、2，3-二氨基-3-氰基丙酸、2，3-二氨基-3-氨基甲醯基丙酸、2，3-二氨基-3-氰基丙醯胺、2-氨基-3-羥基-3-氰基丙酸、2-氨基-3-羥基-3-氨基甲醯基丙酸、2-氨基-3-羥基-3-氰基丙醯胺、3-氨基-2-羥基-3-氰基丙酸、3-氨基-2-羥基-3-氨基甲醯基丙酸和3-氨基-2-羥基-3-氰基丙醯胺。化合物(E)的進一步實例包括具有這樣一種結構的氧化聚合產物，在該結構中亞甲基化合物被偶聯到任意上述在其分子中具有由式(16)代表的骨架的化合物上，還包括通過這類氧化聚合產物腈基的水解作用生成的化合物。這樣一種化合物的具體實例是這樣的化合物，它具有至少一個選自由氨基氰基亞甲基結構、氨基氨基甲醯基亞甲基結構、氨基羧基亞甲基結構、羥基氰基亞甲基結構、羥基氨基甲醯基亞甲基結構和羥基氨基羧基亞甲基結構組成的組的結構，並且具有2個或以上重複單元。上面提到的這樣一種氧化聚合產物可以是在重水中測量的13C-NMR波譜中70ppm與90ppm之間表現一個峰的化合物，其中該峰歸因於亞甲基結構。
在其分子中具有由式(17)或(18)代表的骨架的化合物是通過上述氧化聚合產物氰基的加成環化作用生成的。這類化合物是在其分子中具有由上式(17)或(18)代表的骨架的多環化合物和通過該多環化合物腈基的水解作用生成的化合物。作為這類化合物的實例，可以提到這樣一種多環化合物，其中具有3，4，4，5-(氨基和/或羥基)-4-(氰基、羧基或氨基甲醯基)-3，4，5，6-四氫吡啶骨架的6-元環5-位和6-位分別是相鄰6-元環的2-位和3-位，和這樣一種多環化合物，其中3，7，9，10-(氨基和/或羥基)-3，4，6，7，9，10-六氫吡啶並[2，3-e]吡啶骨架的6-位、7-位、8-位和9-位分別是相鄰吡啶骨架的5-位、10-位、4-位和3-位。這樣一種多環化合物可以是在重水中測量的13C-NMR光譜中60ppm與80ppm之間表現一個峰的化合物，其中該峰歸因於亞甲基結構。另外，這樣一種多環化合物可以是在紫外-可見光譜中340nm與380nm之間和440nm與480nm之間表現最大吸收的化合物。
(F)六亞甲基四胺和具有亞丙基胺結構的化合物，它具有由下式(1)代表的骨架
其中n代表整數1至150。
這類化合物已知是通過甲醛與氨的縮合作用生成的。具有由上式(1)代表的結構的化合物實例包括下列化合物。若n＝1，則可以提到N-氨基甲基-六氫-1，3，5-三嗪；若n＝2，則可以提到N，N』-雙氨基甲基-六氫-1，3，5-三嗪、五亞甲基四胺和六亞甲基五胺；若n＝3，則可以提到N，N』，N」-三氨基甲基-六氫-1，3，5-三嗪；若n＝4，則可以提到六亞甲基四胺和七亞甲基五胺。
正如上面詳細解釋的，含在用在本發明中的水解反應系統中的有機雜質化合物的實例包括通過羥基與氨基之間的縮合反應生成的化合物、通過腈基與活化亞甲基之間的加成反應生成的化合物、通過腈基與活化亞甲基之間的環化反應生成的化合物、通過亞甲基的氧化反應生成的化合物、通過亞甲基的環化反應生成的化合物和通過上述化合物腈基的水解作用生成的化合物。有機雜質化合物的進一步實例包括通過上述反應的組合生成的化合物，也就是下列化合物(I)至(V)
(I)通過由式(3)、(6)、(7)、(10)或(11)代表的化合物或由式(13)至(18)之任一代表的骨架的氨基與由式(3)、(6)或(7)代表的化合物或由式(14)至(18)之任一代表的骨架的羥基之間的縮合反應生成的化合物；
(II)通過由式(2)、(3)和(10)至(12)之任一代表的化合物或由式(13)、(14)、(16)或(17)代表的骨架的腈基的加成反應生成的化合物；
(III)通過由式(2)、(3)和(10)至(12)之任一代表的化合物或由式(13)、(14)、(16)或(17)代表的骨架的腈基與由式(3)、(6)、(7)或(11)代表的化合物的亞氨基之間的加成反應生成的化合物；
(IV)通過由式(2)、(3)和(10)至(12)之任一代表的化合物或由式(13)、(14)、(16)或(17)代表的骨架的腈基與由式(1)至(3)、(6)和(7)之任一代表的化合物的亞甲基之間的加成反應生成的化合物；
(V)通過一種或多種由(1)至(3)、(6)和(7)之任一代表的化合物的亞甲基的氧化偶聯作用生成的化合物。
這樣一種化合物可以是在重水中測量的13C-NMR光譜中53ppm與100ppm之間表現一個峰的化合物。進而，由於通過環化反應生成的化合物變色，因此作為有機雜質化合物的環化化合物可以是在紫外-可見光譜中340nm與380nm之間和440nm與480nm之間表現最大吸收的化合物。
含在本發明水解反應系統中的有機雜質化合物是分子量為95或以上的多官能化合物，這樣的化合物顯著降低微生物酶的活性。本發明中，甘氨酸是在這樣的條件下生產的，其中分子量為95或以上、優選為130或以上的有機雜質化合物在水解反應系統中的含量基於水解反應系統的重量而言，保持在10重量％或以下、優選為5重量％或以下、更優選為1重量％或以下的水平，以便提高微生物酶的活性。
關於用於保持有機雜質化合物在水解反應系統中的含量基於水解反應系統的重量而言在10重量％或以下的方法，可以提到這樣一種方法，其中將溶解在水解反應系統中的氧量抑制到5重量ppm或以下，基於水解反應系統的重量而言。在大氣壓下溶解在水解反應系統中的氧量一般為8重量ppm至10重量ppm。若將溶解在水解反應系統中的氧量抑制到5重量ppm或以下，則減少副產物的生成。為了抑制對微生物酶的水解活性等的抑制作用，優選的是溶解在水解反應系統中的氧量為0.5重量ppm或以下，更有利為0.05重量ppm或以下，基於水解反應系統的重量而言。
本發明中，作為用於抑制溶解在水解反應系統中的氧量的方法，可以採用這樣一種方法，其中水解作用是利用隔絕空氣的密閉反應系統、用惰性氣體加壓的反應系統、流通惰性氣體的反應系統或在低於大氣壓的壓力之下的反應系統進行的。作為惰性氣體的實例，可以提到稀有氣體，例如氦氣和氬氣；天然氣，例如甲烷氣、乙烷氣和丙烷氣；低沸點醚，例如二乙醚；和氮氣。這些氣體可以單獨或聯合使用。從安全性等觀點來看，氮氣是優選的。在使用密閉反應系統的情況下，隔絕反應系統與空氣可以更有效地通過用惰性氣體向反應系統加壓來進行。關於向反應系統加壓應當達到的壓力水平，不存在特別的限制。不過，鑑於所用微生物酶的壓力耐受性，優選的是加壓後的反應系統的壓力在超計大氣壓至1.0MPa的範圍內，更有利為超計大氣壓至0.5MPa。另一方面，若使用在低於大氣壓的壓力之下的反應系統，則反應系統的壓力可以在大於0.7kPa(0.7kPa是水在0℃下的蒸氣壓)至小於大氣壓的範圍內，優選為大於4.0kPa至小於大氣壓。
本發明中，為了抑制溶解在水解反應系統中的氧量，不僅有必要隔絕反應系統與空氣，而且有必要除去溶解在原料等中的氧。為了從反應系統中除去氧，可以採用各種常規方法。例如，可以提到蒸餾脫氣法，其中通過蒸餾除去溶解在反應系統中的氧；惰性氣流處理法，其中使惰性氣體流通反應系統，從而用惰性氣體代替溶解在系統中的氧；和還原性化合物加入處理法，其中向反應系統中加入還原性化合物，從而通過還原作用消耗氧。可以用於還原性化合物加入處理的還原性化合物實例包括還原性生化化合物、甲酸的化合物和亞硫酸的化合物。關於可以用於還原性化合物加入處理的還原性生化化合物，不存在特別的限制。例如，可以使用L-抗壞血酸；L抗壞血酸酯，例如L-抗壞血酸硬脂酸酯；鹽，例如L-抗壞血酸鈉；穀胱甘肽；L-半胱氨酸；半胱氨酸鹽，例如鹽酸L-半胱氨酸一水合物；半胱氨酸酯，例如氯化L-半胱氨酸乙酯和氯化L-半胱氨酸甲酯；和N-取代的半胱氨酸，例如N-乙醯基-L-半胱氨酸。這些化合物中，L-抗壞血酸是優選的。向反應系統中加入還原性生化化合物的量因溶解在系統中的氧量而並；不過，從甘氨腈的穩定化觀點來看，還原性生化化合物的加入量為0.001至5mol％，優選為0.01至2mol％，基於甘氨腈的摩爾量而言。關於可以用於還原性化合物加入處理的還原性甲酸化合物，不存在特別的限制。例如，可以使用甲酸；甲酸鹽，例如甲酸銨；和甲酸酯，例如甲酸甲酯和甲酸乙酯。這些化合物中，甲酸和甲酸銨是優選的。向反應系統中加入還原性甲酸化合物的量因溶解在系統中的氧量而異；不過，從甘氨腈的穩定化觀點來看，還原性甲酸化合物的加入量為0.002至8mol％，優選為0.02至4mol％，基於甘氨腈的摩爾量而言。關於可以用於還原性化合物加入處理的亞硫酸化合物，不存在特別的限制。例如，可以使用二氧化硫、亞硫酸、亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鉀、亞硫酸氫鉀和亞硫酸銨。這些化合物中，亞硫酸銨是優選的。由於亞硫酸化合物是電解質，並且表現促進副產物產生的作用，因此向反應系統中加入亞硫酸化合物的量為0.001至2重量％，優選為0.01至1重量％，其中應當對加入量加以選擇，以便滿足下述關於反應系統中電解質總量的要求。
進而，作為另一種用於保持有機雜質化合物在水解反應系統中的含量在基於水解反應系統的重量而言10重量％或以下的水平的方法，可以提到這樣一種方法，其中使用氨作為甘氨腈的穩定劑。若加熱甘氨腈，則生成氨和亞胺化合物(例如亞氨基二乙腈)，進一步加熱導致亞胺化合物變性，導致黑色化合物的生成。因此，利用溶解有氨的水解反應系統可以穩定甘氨腈。向反應系統中加入氨的量可以因反應溫度和反應時間而異，但是優選的是氨的用量為0.001至5mol、更有利地為0.01至2mol/mol甘氨腈/升。一般來說，過量的氨在甘氨腈的合成之後會剩餘其中。過量的氨本身可以用作穩定劑，無需從甘氨腈中分離過量的氨。
另外，作為進一步用於保持有機雜質化合物在水解反應系統中的含量在基於水解反應系統的重量而言10重量％或以下的水平的方法，可以提到這樣一種方法，其中將反應系統中電解質的量保持在2重量％或以下的水平，基於甘氨腈的重量而言。電解質已知促進從腈化合物產生副產物。用在本發明中的電解質實例不僅包括鹼金屬鹽、鹼土金屬鹽和兩種或多種金屬鹽的混合物(例如磷酸鹽緩衝液)，而且包括能夠生成甘氨酸鹽的鹼金屬化合物與鹼土金屬化合物(例如苛性蘇打)和無機酸(例如硫酸、鹽酸和硝酸)。向反應系統中加入這類電解質促進從腈化合物生成副產物，作為這種促進作用的原因之一，注意到向水溶液中加入電解質導致溶解在水溶液中的氧量增加(參見《化學手冊》(Kagaku Benran)修訂第4版第II-159頁表8.54，日本化學會出版)。因此，優選的是在使用微生物酶之前，通過洗滌減少在微生物酶的產生中用作培養基或緩衝液並且剩餘在微生物酶中的電解質至預定水平，減少含在甘氨腈水溶液中的鹼催化劑的量，和抑制加入到反應介質液體中以調節其pH值的磷酸鹽緩衝液的量至儘可能低的水平。含在水解反應系統中的電解質總量被調節至2重量％或以下，優選為1重量％或以下，更優選為0.5重量％或以下，基於甘氨腈的重量而言。
上述抑制溶解在水解反應系統中的氧量的方法、上述向水解反應系統中溶解氨的方法和上述控制水解反應系統的電解質濃度的方法可以聯合使用。優選的是聯合使用所有這些方法。
關於用於產生用在本發明中的微生物酶——其中該酶具有水解腈基的活性——的微生物，不存在特別的限制。例如，可以適當地使用屬於如下屬的微生物，所述屬選自由不動桿菌屬、紅球菌屬、棒桿菌屬、產鹼菌屬、分枝桿菌屬、紅假單胞菌屬和假絲酵母屬組成的組。不過，微生物並不限於它們。微生物的具體實例包括下列微生物菌株(1)至(9)
(1)不動桿菌(Acinetobacter sp.)AK226(參見已審日本專利申請公報說明書No.昭63-2596)，於1985年5月28日(原始保藏日)保藏在日本國立生命科學和人體技術研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan(郵編No.305-0046))中，保藏號為FERM BP-2451；
(2)不動桿菌(Acinetobacter sp.)AK227(參見已審日本專利申請公報說明書No.昭63-2596)，於1985年5月28日(原始保藏日)保藏在日本國立生命科學和人體技術研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan(郵編No.305-0046))中，保藏號為FERM BP-7413；
(3)海洋紅球菌(Rhodococcus maris)BP-479-9(參見未審日本專利申請說明書No.平7-303491和平7-303496)，於1993年11月2日(原始保藏日)保藏在日本國立生命科學和人體技術研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan(郵編No.305-0046))中，保藏號為FERM BP-5219；
(4)棒桿菌(Corynebacterium sp.)C5(參見已審日本專利申請公報說明書No.平6-65313)，於1986年8月28日(原始保藏日)保藏在日本國立生命科學和人體技術研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan(郵編No.305-0046))中，保藏號為FERM BP-7414；
(5)Corynebacterium nitri lophilus(參見未審日本專利申請說明書No.平2-84198)，保藏在美國典型培養物保藏中心(UniversityBoulevard，Manassas VA(郵編No.10801))中，保藏號為ATCC 21419；
(6)糞產鹼菌(Alcaligenes faecalis)IFO 13111(參見未審日本專利申請說明書No.平6-70856)，於1994年7月22日(原始保藏日)保藏在日本國立生命科學和人體技術研究所(1-3，Higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan(郵編No.305-0046))中，保藏號為FERM BP-4750；
(7)分枝桿菌(Mycobacterium sp.)AC777(參見未審日本專利申請說明書No.平2-84918和美國專利No.5,283,193)，於1989年3月27日(原始保藏日)保藏在日本國立生命科學和人體技術研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan(郵編No.305-0046))中，保藏號為FERM BP-2352；
(8)球形紅假單胞菌(Rhodopseudomonas spheroides)(參見未審日本專利申請說明書No.平6-303991)，保藏在美國典型培養物保藏中心(University Boulevard，Manassas VA(郵編No.10801))中，保藏號為ATCC 11167；
(9)熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)(參見未審日本專利申請說明書No.平6-303991)，保藏在美國典型培養物保藏中心(University BouleVard，Manassas VA(郵編No.10801))中，保藏號為ATCC 20311。
可以用常規培養基培養產生用在本發明中的微生物酶的微生物。作為碳源，例如可以使用葡萄糖、甘油、蔗糖、果糖、有機酸(例如乙酸)、糊精和麥芽糖。作為氮源，可以使用氨及其鹽、尿素、硫酸鹽、硝酸鹽、有機氮源(例如酵母浸膏、麥芽浸膏、蛋白腖、大豆油和肉浸膏)。另外，適當地選擇無機營養素，例如磷酸鹽、鈉、鉀、鐵、鎂、鈷、錳和鋅，和維生素，並加入到培養基中。將微生物需氧培養，pH值為4至10，優選為6至8，溫度為5至50℃，優選為20至35℃。進而，可以向培養基中加入酶誘導劑，例如內醯胺化合物(γ-內醯胺、δ-內醯胺、ε-己內醯胺等)、腈化合物和醯胺化合物。關於在本發明的商業化實施的情況下用於產生用在本發明中的微生物酶的微生物，原始形式的微生物可以用於產生微生物酶，或者從其衍生的突變菌株可以用於產生微生物酶。例如，利用適當的誘變劑通過誘導自發突變或者通過遺傳工程技術可以得到組成型產生酶的突變菌株。作為用在本發明中的微生物酶，可以使用下列產物之一從培養肉湯回收的微生物的細胞(微生物細胞)，和微生物製備物。微生物製備物的實例包括微生物的勻漿、從勻漿分離的酶、固定化的微生物和固定化的酶，後者酶是通過從微生物中分離和提取酶再將所提取的酶固定在載體上而得到的。微生物細胞可以通過常規方法從培養肉湯回收。
本發明中，以上述方式得到的微生物細胞或微生物製備物可以以微生物水懸液的形式貯存，將微生物細胞或微生物製備物懸浮在蒸餾水或緩衝液中即可製備水懸液。為了減少反應後棄去的廢液量，優選的是上述微生物懸液是用蒸餾水製備的，尤其是再循環的蒸餾水，它是通過這樣一種方法得到的，其中在晶體-沉積操作等期間，在反應混合物完全隔絕空氣的條件下進行蒸餾。為了提高貯存穩定性，可以向微生物懸液中加入穩定劑。為了減少反應後棄去的廢液量，優選地使用甘氨酸作為上述穩定劑。
本發明中，利用任意下述方法之一，可以快速地進行甘氨腈的水解以生成甘氨酸這樣一種方法，其中將甘氨腈水溶液或含氨的甘氨腈水溶液(以上述方式得到)加入到微生物細胞或微生物製備物的水懸液(以上述方式得到)中；這樣一種方法，其中將微生物細胞或微生物製備物的水懸液加入到甘氨腈水溶液中；和這樣一種方法，其中將微生物細胞或微生物製備物(以上述方式得到)固定在載體上，使甘氨腈水溶液流動，同時接觸所固定的微生物細胞或微生物製備物。一般來說，將0.01至5重量％上述微生物細胞或微生物製備物——以微生物的乾重計——和1至40重量％甘氨腈(酶底物)裝入反應釜內，在例如0至60℃、優選為10至50℃的溫度下進行反應1至24小時，優選為3至8小時。可以使用這樣一種反應方法，其中將甘氨腈裝入反應釜內，得到低濃度的甘氨腈，然後在反應過程中逐漸裝入另外的甘氨腈，或者這樣一種反應方法，其中反應溫度隨著時間變化。當甘氨腈水解為甘氨酸和氨時，反應系統的pH值比引發水解反應之前反應系統的pH值升高。為了防止反應系統的pH值隨著反應進程而增加，可以在引發反應之前向反應系統中加入緩衝劑，或者作為替代選擇，可以在反應期間向反應系統中加入酸或鹼。不過，從減少廢液量的觀點來看，優選的是不向水解反應系統中加入緩衝劑、酸或鹼。水解作用可以在開放型反應釜內進行；不過，從防止伴隨產生的氨分散到空氣中導致環境汙染這一問題的觀點、高效回收氨的觀點和高效隔絕反應系統與空氣的觀點來看，優選的是水解反應是在密封的反應釜內利用密閉反應系統進行的，以便導致伴隨產生的氨蓄積在反應釜內。
氨和甘氨酸可以通過至少一種操作而單獨回收，該操作選自由蒸餾、反應性蒸餾、被惰性氣體夾帶、離子交換、提取、利用不良溶劑再沉澱和通過濃縮或冷卻的晶體-沉積組成的組。從易於操作和避免使用有機溶劑、酸和鹼的觀點來看，優選的是首先，通過蒸餾、反應性蒸餾或被惰性氣體夾帶回收氨，然後，使在氨的回收之後剩餘的液體進行通過濃縮或冷卻的晶體-沉積，從而回收甘氨酸。作為用於進行反應性蒸餾的反應釜，可以使用單柱塔、多級塔或填充塔，帶有用於通過冷卻回收氨和水的冷卻器。優選的是反應性蒸餾是以連續方式或間歇方式進行的，壓力等於或高於反應混合物的沸騰壓力，例如在60℃下為20.0kPa或更高，在0℃下為0.6kPa或以上。更優選的是在12.6kPa至1.3kPa的壓力下進行真空反應性蒸餾。若氨是通過被惰性氣體夾帶回收的，則從反應混合物中回收氨可以通過這樣一種方法進行，其中所用反應釜帶有用於引入惰性氣體的噴嘴和用於從惰性氣體中回收氨和水的冷卻盤，氨被惰性氣體以連續方式或間歇方式帶出，壓力在輕微超大氣壓至減壓的範圍內，從而從反應混合物中分離氨。進而，為了促進氨的分離，可以在惰性氣體的流動中進行真空反應性蒸餾。反應模式可以是分批模式或流動反應模式，或者這兩種模式的組合。
因而，用於水解反應的反應模式可以因用於加入微生物或甘氨腈的方法和用於分離與回收氨的方法而異。若使用微生物細胞或微生物製備物的水懸液時或者若通過反應性蒸餾或被惰性氣體夾帶回收氨時，一般來說，水解反應可以主要通過分批反應模式或採用多級攪拌容器的多級流動反應模式進行。若使用固定化的微生物，則水解反應可以主要通過採用管狀反應釜的流動反應模式進行。上述反應模式可以聯合使用。用於水解反應的反應模式並不限於上述那些。
通過本發明的方法，甘氨腈水解得到甘氨酸的收率大約為100mol％。所有伴隨產生的氨可以以甘氨酸的銨鹽形式蓄積在密封的反應釜內，其中甘氨酸在反應釜內是以高度濃縮的甘氨酸水溶液形式存在的。作為替代選擇，所有或大部分伴隨產生的氨可以在反應同時與通過反應性蒸餾或被惰性氣體夾帶從反應混合物中分離，所分離的氨可以通過冷卻回收。若微生物含有腈水合酶作為微生物酶，則甘氨酸在反應系統中被腈水合酶水解生成甘氨醯胺。在這種情況下，通過向反應系統中加入具有水解甘氨醯胺活性的微生物或微生物酶，可以將甘氨醯胺完全轉化為甘氨酸和氨。從含有甘氨酸的銨鹽的高度濃縮的甘氨酸水溶液中回收甘氨酸例如可以通過這樣一種方法進行，包括通過離心過濾和/或膜過濾分離微生物或微生物酶，和通過晶體-沉積、離子交換或利用不良溶劑的再沉澱回收甘氨酸。伴隨產生的氨以及一部分水可以通過蒸發分離，然後通過蒸餾或提取回收。用於生產甘氨酸的本發明方法的優選實施方式例如包括下列步驟
(1)在密閉的反應系統內，在鹼催化劑的存在下，使氰化氫與甲醛在水性介質中反應，得到水溶液形式的乙醇腈，
(2)向乙醇腈的水溶液中加入氨，進行乙醇腈與氨之間的反應，從而得到水溶液形式的甘氨腈，同時生成水，
(3)通過蒸餾從所得甘氨腈的水溶液中分離大部分氨和一部分水，從而得到水解反應系統，其含有水溶液形式的甘氨腈和剩餘未分離的氨，其中回收所分離的氨，用於再循環至步驟(2)，
(4)在由加入到處於密閉系統內的水解反應系統中的微生物產生的微生物酶的作用下，使水解反應系統進行水解反應，從而轉化甘氨腈為甘氨酸，同時伴隨產生氨，
(5)通過至少一個操作分離微生物和微生物酶，該操作選自由離心過濾和膜過濾組成的組，其中回收微生物和微生物酶，用於再循環至步驟(4)，
(6)通過至少一個操作分離一部分在步驟(1)至(5)中伴隨產生的、抑制微生物酶的有機雜質化合物，該操作選自由膜過濾和吸附劑分離組成的組，
(7)通過蒸餾分離在步驟(4)中伴隨產生的氨和在步驟(4)後剩餘在水解反應系統中的過量的水，其中回收所分離的氨，用於再循環至步驟(2)，
(8)在步驟(7)後或者與此同時，通過晶體-沉積分離甘氨酸，和
(9)乾燥甘氨酸的晶體。
本發明在另一方面提供用於生產甘氨酸的方法，該方法包括提供水溶液形式的甘氨腈，使甘氨腈的水溶液進行水解反應，從而轉化甘氨腈為甘氨酸，同時伴隨產生氨，和從水解反應系統中分離甘氨酸，其中甘氨腈的水解作用是在氨的存在下進行的。這種方法中，優選的是氨的量為0.001至5mol，相對於1摩爾甘氨腈而言。利用本發明的方法，有可能使甘氨腈穩定，高效和化學計量地生產甘氨酸。
本發明在另一方面提供用於生產甘氨酸的方法，包括使甘氨腈的水溶液進行水解反應，從而轉化甘氨腈為甘氨酸，同時伴隨產生氨，和從水解反應系統中分離甘氨酸，其中在進行從水解反應系統中分離甘氨酸的同時，在鹼和酸缺乏下，獨立於甘氨酸回收地回收伴隨產生的氨。在這種情況下，優選的是甘氨酸和氨是通過至少一個操作而單獨回收的，該操作選自由蒸餾、反應性蒸餾、被惰性氣體夾帶、離子交換、萃取、利用不良溶劑再沉澱和通過濃縮或冷卻的晶體-沉積組成的組。另外，優選的是氨是通過蒸餾、反應性蒸餾或被惰性氣體夾帶而回收的，甘氨酸是通過使氨回收之後剩餘的液體進行通過濃縮或冷卻的晶體-沉積而回收的。利用本發明的方法，有可能使氨再循環，減少對環境造成的負擔。
實施發明的最佳方式
下面，將參照下列實施例和對比例更加詳細地描述本發明，但是它們不應被解釋為限制本發明的範圍。
在實施例和對比例中，為了防止氧進入反應系統，所有基本反應操作都是在氮氣氛下進行的。另外，在第一次向反應系統中加入水溶液之前，通過對水溶液進行氮淨化操作將溶解在水溶液中的氧用氮淨化(也就是說，降低氧濃度至0.01ppm或以下)，該操作例如包含反覆若干次的循環，所述循環包含用氮氣向水溶液加壓，然後恢復壓力至大氣壓。不過，應當注意在商業規模的過程中(實施例12)，用於製備水溶液的水是從濃縮甘氨腈步驟和用於甘氨酸晶體-沉積的濃縮步驟再循環的蒸餾水，因此，沒有必要進行任何特殊的操作(為了除去氧)，除了在氮氣氛下貯存水溶液等。
在下列實施例和對比例中，各種操作是以下列方式進行的。
(1)氨和水的蒸發和回收
氨和水的蒸發和回收是在減壓下利用薄膜蒸餾設備(由ShibataScientific Technology Inc.，Japan製造和銷售)進行的，停留時間為1分鐘或以下。
(2)反應混合物的濃縮
30ml或以下反應混合物的濃縮是在減壓下利用旋轉蒸發器進行的，它帶有用於操作旋轉蒸發器的循環攪拌器(由Tokyo RikakikaiCo.，Ltd.，Japan製造和銷售)。
(3)微生物的分離
甘氨腈的水解反應之後的微生物分離是利用冷凍離心機(由Hitachi Ltd.，Japan製造和銷售)通過在10,000rpm下離心反應混合物達15分鐘進行的。
(4)蛋白質的除去
在實施例1至11中，利用注射器用超濾濾器(由Terumo Corp.，Japan製造和銷售)在壓力下過濾除去蛋白質。在實施例12中，利用循環超濾設備(超濾膜「SIP-1013」，由Asahi Kasei Kabushiki Kaisha，Japan製造和銷售)除去蛋白質。
(5)液相色譜
甘氨酸、甘氨腈、乙醇腈、亞氨基二乙腈、亞氨基二乙酸、六亞甲基四胺、氨、硫酸離子、鈉離子等是通過離子對色譜加以分析的。作為分析儀器，利用液相色譜設備(LC-6A型，RI和UV檢測器，各自由Shimadzu Corporation，Japan製造和銷售)和柱子(ODS柱，由Tosoh Corp.，Japan製造和銷售)。在離子對色譜中，使用戊磺酸鈉作為離子對試劑。
(6)凝膠滲透色譜
通過凝膠滲透色譜(GPC)分析分子量為55的乙醇腈和分子量為4,000或以下的有機雜質化合物。作為凝膠滲透色譜設備，可以利用LC-9A型(由Shimadzu Corporation，Japan製造和銷售)和GPC-IR型，RI和UV檢測器(各自由Nicolet Instrument Corporation，U.S.A.製造和銷售)。作為柱子，可以利用「Asahipak GS-220 NQ柱」(Showdex柱，由Showa Denko K.K.，Japan製造和銷售)。
(7)變色化合物的分析
利用紫外-可見分光光度計(U-3120型，由Hitachi，Ltd.，Japan製造和銷售)，測量水解反應系統在200nm與800nm之間的紫外-可見吸收光譜。通過測定最大吸收處的波長和峰的高度，分析含在水解反應系統中的變色化合物。
(8)NMR
通過在重水中測量各自的1H-NMR光譜和13C-NMR光譜，分析有機雜質化合物。1H-NMR分析是利用「J NM-α400」(由JEOL LTD.，Japan製造和銷售)進行的，13C-NMR分析是利用「AC-200」(由BrukerInstruments，Germany製造和銷售)進行的。NMR樣品是這樣製備的，在減壓下乾燥水解反應系統，得到乾燥物，將所得乾燥物溶於重水，向其中加入4，4-二甲基-4-矽烷-戊磺酸鈉鹽(δ＝0.015ppm)作為內標。
實施例1
(1)甘氨腈的合成
使用帶有攪拌器和夾套的8-升高壓釜(其中高壓釜是由AsahiKasei Kabushiki Kaisha，Japan製造和銷售的)作為反應釜。將反應釜的內部用氮氣淨化，向反應釜內加入1,200g 37％甲醛水溶液和與甲醛等量的氰化氫，使甲醛與氰化氫彼此反應，從而得到乙醇腈水溶液。向所得乙醇腈水溶液中加入5,000g 25％氨水溶液，反應進行2小時，從而得到含有所合成的甘氨腈的反應混合物。下面，藉助薄膜蒸餾設備在減壓下除去反應混合物中存在的未反應的氨和過量的水，從而得到30重量％甘氨腈水溶液。通過液相色譜分析所得甘氨腈水溶液，分析顯示除了甘氨腈以外，甘氨腈溶液還含有0.8重量％的亞氨基二乙腈。進而，通過凝膠滲透色譜分析甘氨腈水溶液，分析顯示在甘氨腈水溶液中含有1.2重量％至少一種分子量為95或以上的有機雜質化合物。
另外，通過13C-NMR分析甘氨腈水溶液。發現除了歸因於甘氨腈和亞氨基二乙腈的峰以外，在NMR光譜中60nm至70nm附近還存在一個峰。當測定甘氨腈水溶液的吸光度時，發現在344nm和468nm觀察到最大吸收，在344nm和468nm的吸光度以利用10mm石英池測量的值計，分別為0.297和0.08。
(2)微生物的培養
在具有下列組成的培養基中，將不動桿菌(Acinetobacter sp.)AK226(FERM BP-2451)在30℃下培養1天。
培養基
(培養基是這樣製備的，將下述組分溶於蒸餾水，pH值為7.5)富馬酸 1.0重量％肉浸膏 1.0蛋白腖 1.0氯化鈉 0.1ε-己內醯胺 0.3磷酸鉀(I) 0.2硫酸鎂七水合物 0.02氯化銨 0.1硫酸鐵(II)七水合物 0.003氯化錳四水合物 0.002氯化鈷六水合物 0.002
(3)甘氨腈的水解
通過離心從培養肉湯收集所培養的微生物細胞，用蒸餾水洗滌三次。然後，向洗滌後的微生物加入蒸餾水，以便得到含有18.0重量％微生物的微生物懸液，以微生物的乾重計。將200ml玻璃高壓釜內部用氮氣淨化，在氮氣氛下向其中加入53.3g上步(1)中合成的30重量％甘氨腈水溶液和46.7g蒸餾水。隨後，向高壓釜內加入1.0g微生物懸液，在40℃下引發反應。此時，高壓釜內反應系統的pH值大約為7。反應開始後，反應系統的pH值開始增加。反應開始後兩小時，pH值變為10。使反應進行10小時，從而得到100g的反應混合物。取出2g反應混合物。關於所取出的反應混合物，通過液相色譜測定作為原料的甘氨腈和所生產的甘氨酸的量，通過奈斯勒氏法(Nessler’smethod)測定氨的量。液相色譜的結果顯示用作原料的甘氨腈已經完全從反應系統中消失，甘氨酸的收率為99％。氨是化學計量地產生的。每克(乾重)微生物生產的甘氨酸的量為117g/g，甘氨酸生產的活性為12g/g·Hr。
將其餘98g反應混合物離心，同時冷卻，從而分離微生物和回收上清液。藉助超濾膜在壓力下過濾所回收的上清液，從而從上清液中除去殘留的微生物細胞和蛋白質，得到濾液。取出2ml濾液，進行紫外-可見吸收光譜的測量，發現在468nm的吸光度為0.79。藉助薄膜蒸餾設備蒸餾其餘濾液，從而通過蒸發從濾液中分離氨和過量的水。其結果是，當將冷凝物和冰與在乾冰-乙醇捕集器內回收的液體合併在一起時，得到48g氨水溶液。從蒸餾設備底部回收43g濃甘氨酸溶液。將濃甘氨酸溶液冷卻至室溫，從而通過晶體-沉積分離甘氨酸。乾燥通過僅進行一次晶體-沉積操作所得到的晶體，從而得到16.5g甘氨酸晶體。所得甘氨酸的純度為99.99％。
對比例1
以下列方式分析有機雜質化合物的影響，它們是含在甘氨腈水溶液中的副產物。在氮氣流下，將按與實施例1相同方式得到的30重量％甘氨腈水溶液在90℃下加熱。利用乾冰-乙醇捕集器截留通過加熱產生並被氮氣驅使的蒸汽。在加熱開始後15分鐘、30分鐘和1小時的時間點取10ml被加熱的甘氨腈溶液作為樣本，之後每30分鐘進一步進行取樣，直至加熱開始後5小時。將溶液樣本(總計11份樣本)在冷卻下貯存。
將一部分溶液樣本各自通過液相色譜、凝膠滲透色譜、紫外-可見吸收光譜和13C-NMR加以單獨分析。加熱30分鐘或更長時間的甘氨腈溶液具有氨味。儘管甘氨腈溶液是隨著時間的推移而濃縮的，不過被加熱的甘氨腈溶液的甘氨腈濃度在30至35重量％的範圍內。從這些結果發現，含在甘氨腈溶液中的甘氨腈已被加熱變性。進而，分子量為95或以上的有機雜質化合物的量隨著加熱時間的推移而增加。有機雜質化合物包括亞氨基二乙腈，進一步包括至少一種在13C-NMR光譜中50ppm與90ppm之間表現一個峰的化合物和至少一種在紫外-可見吸收光譜中380nm和468nm表現最大吸收的化合物。
關於每種上面所得11份加熱的甘氨腈水溶液樣本和一份不加熱的甘氨腈水溶液樣本(也就是總計12份樣本)，評價微生物從甘氨腈水溶液生產甘氨酸的水解活性，關於所表現的水解活性，在這12份樣本中進行對比。程序如下。利用氮盒，將各為5.0ml的甘氨腈溶液樣本單獨裝入試管內，向其中加入5.0ml蒸餾水。下面，使用不動桿菌(Acinetobacter sp.)AK226，按與實施例1相同的方式製備微生物懸液，含有12.5重量％的微生物，以微生物的乾重計。向每支試管內加入0.5ml所製備的微生物懸液，將試管用Parafilm熱密封。將熱密封的試管放置在置於氮盒中的恆溫搖動器內，在30℃下進行水解反應達8小時，從而在每支試管內得到反應混合物。取出2g反應混合物，通過液相色譜分析。結果如表1所示。如表1所示，發現甘氨酸的收率取決於有機雜質化合物的濃度，若有機雜質化合物的濃度超過10重量％，則甘氨酸的收率顯著降低(見樣本11和12的結果)。反應混合物中除甘氨酸以外的幾乎所有物質都是未反應的甘氨腈，從受到作用的甘氨腈，從這個事實得出結論，有機雜質化合物顯著抑制微生物酶的活性。另一方面，若有機雜質化合物的濃度為5重量％或以下，則甘氨酸的收率為90％或以上，若有機雜質化合物的濃度為1重量％或以下，則甘氨酸的收率與在不加熱的甘氨腈溶液的情況下所得收率相同。
表1
實施例2
(1)甘氨腈的合成
按與實施例1相同的方式合成30重量％甘氨腈水溶液。
(2)微生物的培養
按與實施例1相同的方式培養不動桿菌(Acinetobacter sp.)AK226。
(3)甘氨腈的水解
通過離心從培養肉湯收集所培養的微生物細胞，用蒸餾水洗滌三次。然後，向洗滌後的微生物加入蒸餾水，以便得到含有5.0重量％微生物的微生物懸液，以微生物的乾重計。將用作反應釜的耐壓Schlenk’s管內部用氮氣淨化，在氮氣氛下向其中加入1.0ml微生物懸液和16ml蒸餾水，然後加入3ml甘氨腈水溶液。然後，將耐壓Schlenk’s管熱密封，在20℃下引發反應。此時，耐壓Schlenk’s管內反應系統的pH值大約為7。反應開始後兩小時，pH值變為10.1。取出一部分反應系統，通過液相色譜分析。液相色譜的結果顯示用作原料的甘氨腈已經從反應系統中消失，化學計量地生成甘氨酸。基於上述結果，在反應期間每2小時重複這樣一種操作，包括升高反應溫度5℃和同時向反應釜內加入3ml 30重量％甘氨腈水溶液(酶底物)，直至該操作進行4次。反應總計進行10小時，從而得到32ml反應混合物。取出2ml反應混合物，按與實施例1相同的方式進行分析。結果發現用作原料的甘氨腈已經完全從反應系統中消失，甘氨酸的收率為100％。氨是化學計量地產生的。每克(乾重)微生物生產的甘氨酸的量為120g/g，甘氨酸生產的活性為12g/g·Hr。
將其餘30ml反應混合物離心，同時冷卻，得到上清液，對所得上清液進行超濾，從而得到濾液。利用旋轉蒸發器濃縮所得濾液，從而得到濃甘氨酸溶液。冷卻濃甘氨酸溶液，從而通過晶體-沉積分離甘氨酸。過濾回收晶體，然後乾燥，從而得到4.6g甘氨酸晶體。所得甘氨酸的純度為99.99％。
實施例3
(1)甘氨腈的合成
按與實施例1相同的方式合成30重量％甘氨腈水溶液。
(2)微生物的培養
按與實施例1相同的方式培養不動桿菌(Acinetobacter sp.)AK226。
(3)甘氨腈的水解
通過離心從培養肉湯收集所培養的微生物細胞，用蒸餾水洗滌三次。然後，向洗滌後的微生物加入蒸餾水，以便得到含有12.5重量％微生物的微生物懸液，以微生物的乾重計。將200ml玻璃高壓釜內部用氮氣淨化，在氮氣氛下向其中加入53.3g上步(1)中合成的30重量％甘氨腈水溶液和41.7g蒸餾水。隨後，向高壓釜內加入5g微生物懸液，在50℃下引發反應。此時，高壓釜內反應系統的pH值大約為7。反應開始後，反應系統的pH值開始增加。反應開始後一小時，pH值變為10。使反應進行8小時，從而得到100g的反應混合物。取出2g反應混合物，按與實施例1相同的方式加以分析。結果發現用作原料的甘氨腈已經完全從反應系統中消失，甘氨酸的收率為99％。氨是化學計量地產生的。每克(乾重)微生物生產的甘氨酸的量為168g/g，甘氨酸生產的活性為21g/g·Hr。
按與實施例1相同的方式對反應混合物進行離心、超濾和薄膜蒸餾，從而得到48g氨水和43g濃甘氨酸溶液。將含在濃甘氨酸溶液中的甘氨酸結晶和乾燥，從而得到17g甘氨酸晶體。所得甘氨酸的純度為99.99％。
實施例4
將實施例3中通過離心回收的微生物細胞用蒸餾水洗滌三次。然後，向洗滌後的微生物加入蒸餾水，以便得到5g微生物懸液。利用所得微生物懸液，按基本上與實施例3相同的方式生產甘氨酸。具體來說，將200ml玻璃高壓釜內部用氮氣淨化，在氮氣氛下向其中加入50.0g按實施例1步驟(1)合成的30重量％甘氨腈水溶液和45.0g蒸餾水。隨後，向高壓釜內加入5g微生物懸液，在50℃下引發反應。使反應進行8小時，從而得到100g的反應混合物。取出2g反應混合物，按與實施例1相同的方式加以分析。結果發現用作原料的甘氨腈已經完全從反應系統中消失，甘氨酸的收率為99％。氨是化學計量地產生的。每克(乾重)微生物生產的甘氨酸的量為157g/g，甘氨酸生產的活性為27g/g·Hr。實施例3和4中每克(乾重)微生物生產的甘氨酸的量之和為335g/g，甘氨酸生產的總體活性為20g/g·Hr。
按與實施例1相同的方式對其餘反應混合物進行離心、超濾和薄膜蒸餾，從而得到48g氨水和42g濃甘氨酸溶液。將含在濃甘氨酸溶液中的甘氨酸結晶和乾燥，從而得到16g甘氨酸晶體。所得甘氨酸的純度為99.99％。
實施例5
將實施例4中通過離心回收的微生物細胞用蒸餾水洗滌三次。然後，向洗滌後的微生物加入蒸餾水，以便得到5g微生物懸液。利用所得微生物懸液，按基本上與實施例3相同的方式生產甘氨酸。具體來說，將200ml玻璃高壓釜內部用氮氣淨化，在氮氣氛下向其中加入43.3g按實施例1步驟(1)合成的30重量％甘氨腈水溶液和51.7g蒸餾水。隨後，向高壓釜內加入5g微生物懸液，在50℃下引發反應。使反應進行8小時，從而得到100g的反應混合物。取出2g反應混合物，按與實施例1相同的方式加以分析。結果發現用作原料的甘氨腈已經完全從反應系統中消失，甘氨酸的收率為99％。氨是化學計量地產生的。每克(乾重)微生物生產的甘氨酸的量為136g/g，甘氨酸生產的活性為17g/g·Hr。實施例3、4和5中每克(乾重)微生物生產的甘氨酸的量之和為461g/g，甘氨酸生產的總體活性為26g/g·Hr。
實施例6
(1)甘氨腈的合成
按與實施例1相同的方式合成30重量％甘氨腈水溶液。
(2)微生物的培養
在具有下列組成的培養基中，將海洋紅球菌(Rhodococcus maris)BP-479-9(FERM BP-5219)在30℃下培養1天。
培養基
(培養基是這樣製備的，將下述組分溶於蒸餾水，pH值為7.5)甘油 1.0重量％肉浸膏 1.0蛋白腖 1.0氯化鈉 0.1ε-己內醯胺 0.3磷酸鉀(I)0.2硫酸鎂七水合物 0.02氯化銨 0.1硫酸鐵(II)七水合物 0.003氯化錳四水合物 0.002氯化鈷六水合物 0.002
(3)甘氨腈的水解
通過離心從培養肉湯中收集所培養的微生物細胞，用蒸餾水洗滌三次。然後，向洗滌後的微生物加入蒸餾水，以便得到含有6.0重量％微生物的微生物懸液，以微生物的乾重計。利用1.0ml所得微生物懸液，按基本上與實施例2相同的方式生產甘氨酸。具體來說，使甘氨腈的水解反應進行10小時，從而得到32g的反應混合物。取出2g反應混合物，按與實施例1相同的方式加以分析。結果發現用作原料的甘氨腈已經完全從反應系統中消失，甘氨酸的收率為100％。氨是化學計量地產生的。每克(乾重)微生物生產的甘氨酸的量為100g/g，甘氨酸生產的活性為10.0g/g·Hr。
按與實施例1相同的方式處理其餘反應混合物，從而得到4.6g甘氨酸晶體。
實施例7
(1)甘氨腈的合成
按與實施例1相同的方式合成30重量％甘氨腈水溶液。
(2)微生物的培養
按與實施例6相同的方式培養Corynebacterium nitrilophilus(ATCC 21419)。
(3)甘氨腈的水解
通過離心從培養肉湯中收集所培養的微生物細胞，用蒸餾水洗滌三次。然後，向洗滌後的微生物加入蒸餾水，以便得到含有8.0重量％微生物的微生物懸液，以微生物的乾重計。利用1.0ml所得微生物懸液，按基本上與實施例2相同的方式生產甘氨酸。具體來說，使甘氨腈的水解反應進行10小時，從而得到32g的反應混合物。取出2g反應混合物，按與實施例1相同的方式加以分析。結果發現用作原料的甘氨腈已經完全從反應系統中消失，甘氨酸的收率為99％。氨是化學計量地產生的。每克(乾重)微生物生產的甘氨酸的量為75g/g，甘氨酸生產的活性為8g/g·Hr。
按與實施例1相同的方式處理其餘反應混合物，從而得到4.6g甘氨酸晶體。
實施例8
(1)甘氨腈的合成
按與實施例1相同的方式合成30重量％甘氨腈水溶液。
(2)微生物的培養
按與實施例6相同的方式培養棒桿菌(Corynebacterium sp.)C5。
(3)甘氨腈的水解
通過離心從培養肉湯中收集所培養的微生物細胞，用蒸餾水洗滌三次。然後，向洗滌後的微生物加入蒸餾水，以便得到含有12.5重量％微生物的微生物懸液，以微生物的乾重計。提供這樣一種反應釜，由帶有攪拌器的1000ml可分離三頸燒瓶、用於保持恆溫的夾套、延伸至可分離燒瓶底部的氮氣引入噴嘴、與乾冰捕集器連接的溼氣分離器、溫度計和用於對反應混合物取樣的管子組成。向可分離燒瓶內裝入9ml微生物懸液，然後向其中加入30ml 30重量％甘氨腈水溶液和161ml蒸餾水。在30℃下引發反應，在進行反應的同時利用氣流計以3升/小時的速率向可分離燒瓶內輸送氮氣。反應開始後1小時，向可分離燒瓶內進一步加入30ml 30重量％甘氨腈水溶液。每隔1小時再進行甘氨腈水溶液的加入達3次，反應總計進行5小時，從而得到反應混合物和副產物。在乾冰捕集器內回收副產物，合併在乾冰捕集器內所回收的冰和液體後，得到15g副產物。將所得副產物溶於50ml水，關於所得溶液，通過奈斯勒氏法測定氨的量。發現在乾冰捕集器內已經回流了14g氨。得到305g的反應混合物。取出2g反應混合物，按與實施例1相同的方式加以分析。結果發現用作原料的甘氨腈已經從反應系統中消失，甘氨酸的收率為99％。進而，痕量氨殘留在反應混合物中。每克(乾重)微生物生產的甘氨酸的量為53g/g，甘氨酸生產的活性為11g/g·Hr。
按與實施例1相同的方式處理其餘303g反應混合物，從而得到47g甘氨酸晶體。
實施例9
(1)甘氨腈的合成
按與實施例1相同的方式合成30重量％甘氨腈水溶液。
(2)微生物的培養
按與實施例6相同的方式培養糞產鹼菌(Alcaligenes faecalis)IFO 13111(FERM BP-4750)。
(3)甘氨腈的水解
通過離心從培養肉湯中收集所培養的微生物細胞，用蒸餾水洗滌三次。然後，向洗滌後的微生物加入蒸餾水，以便得到含有12.5重量％微生物的微生物懸液，以微生物的乾重計。提供這樣一種反應釜，由帶有攪拌器的1000ml可分離三頸燒瓶、用於保持恆溫的夾套、延伸至可分離燒瓶底部的氮氣引入噴嘴、通過乾冰捕集器與真空泵連接的單柱蒸餾塔、壓力傳感器、溫度計和用於對反應混合物取樣的管子組成，其中該管子與液體轉移泵連接。向可分離燒瓶內裝入11ml微生物懸液，然後向其中加入30ml 30重量％甘氨腈水溶液和159ml蒸餾水。在30℃下引發反應，在進行反應的同時利用氣流計以3升/小時的速率向可分離燒瓶內輸送氮氣。反應開始後1小時，向可分離燒瓶內進一步加入30ml 30重量％甘氨腈水溶液。每隔1小時再進行甘氨腈水溶液的加入達3次，反應總計進行5小時，從而得到反應混合物和副產物。在乾冰捕集器內回收副產物，合併在乾冰捕集器內所回收的冰和液體後，得到25g副產物。將所得副產物溶於50ml水，關於所得溶液，通過奈斯勒氏法測定氨的量。發現在乾冰捕集器內已經回收了15g氨。得到295g的反應混合物。取出2g反應混合物，按與實施例1相同的方式加以分析。結果發現用作原料的甘氨腈已經從反應系統中消失，甘氨酸的收率為99％。進而，痕量氨殘留在反應混合物中。每克(乾重)微生物生產的甘氨酸的量為42g/g，甘氨酸生產的活性為9g/g·Hr。
按與實施例1相同的方式處理其餘293g反應混合物，從而得到48g甘氨酸晶體。
實施例10
(1)甘氨腈的合成
按與實施例1相同的方式合成30重量％甘氨腈水溶液。
(2)微生物的培養
按與實施例6相同的方式單獨培養下述微生物。
微生物
不動桿菌(Acinetobacter sp.)AK227(FERM BR-7413)
分枝桿菌(Mycobacterium sp.)AC777(FERM BR-2352)
球形紅假單胞菌(Rhodopseudomonas spheroides)(ATCC 11167)
熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)(ATCC 20311)
假單胞菌(Pseudomonas sp.)88-SB-CN5
支頂孢(Acremonium sp.)D9K
克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)D5B
(3)甘氨腈的水解
關於每種所培養的微生物，下列程序都是單獨進行的。通過離心從培養肉湯收集所培養的微生物細胞，用蒸餾水洗滌三次。然後，向洗滌後的微生物加入蒸餾水，以便得到含有12.5重量％微生物的微生物懸液，以微生物的乾重計。利用所得微生物懸液，按下列方式生產甘氨酸。將200ml玻璃高壓釜內部用氮氣淨化，在氮氣氛下向其中加入53.3g上步(1)中合成的30重量％甘氨腈水溶液和42.7g蒸餾水。隨後，向高壓釜內加入4.0g微生物懸液，在40℃下引發反應。使反應進行8小時，從而得到100g的反應混合物。取出2g反應混合物。關於所取出的反應混合物，通過液相色譜法測定作為原料的甘氨腈的量和所生產的甘氨酸的量，通過奈斯勒氏法測定氨的量。結果如表2所示。如表2所示，在任意所採用的微生物的情況下，用作原料的甘氨腈都已經完全從反應系統中消失，生產甘氨酸的收率高。進而，氨是化學計量地產生的。
表2
實施例11
(1)甘氨腈的合成
按與實施例1相同的方式合成30重量％甘氨腈水溶液。
測定甘氨腈水溶液在468nm下的吸光度。發現利用10mm石英池在1mol甘氨腈每升的濃度下測量的吸光度為0.08。
(2)微生物的培養
按與實施例6相同的方式單獨培養下述微生物。
微生物
不動桿菌(Acinetobacter sp.)AK226(FERM BP-2451)
海洋紅球菌(Rhodococcus maris)BP-479-9(FERM BP-5219)
棒桿菌(Corynebacterium sp.)C5(FERM BP-7414)
Corynebacterium nitrilophilus(ATCC21419)
產鹼菌(Alcaligenes faecalis)IFO 13111(ATCC 8750)
(3)甘氨腈的水解
關於每種所培養的微生物，下列程序都是單獨進行的。通過離心從培養肉湯收集所培養的微生物細胞，用蒸餾水洗滌三次。然後，向洗滌後的微生物加入蒸餾水，以便得到含有12.5重量％微生物的微生物懸液，以微生物的乾重計。利用所得微生物懸液和表3所示還原性化合物，按下列方式生產甘氨酸。將200ml玻璃高壓釜內部用氮氣淨化，在氮氣氛下向其中加入53.3g上步(1)中合成的30重量％甘氨腈水溶液和42.7g蒸餾水，然後加入表3所示還原性化合物。然後，向高壓釜內加入表3所示量(重量)的微生物懸液。若所用微生物懸液的量小於5g，則還向高壓釜內加入蒸餾水，以便微生物懸液和蒸餾水的總重量達到5g。在30℃下引發反應，進行10小時。關於每種所用的微生物，還進行不使用還原性化合物的實驗，供對比。進而，關於不動桿菌(Acinetobacter sp.)AK226，為了進行在利用開放反應系統所得效果與利用密閉反應系統所得效果之間的對比，還利用開放反應系統而不使用還原性化合物進行了實驗。每次實驗得到100g反應混合物，取出2g反應混合物。關於所取出的反應混合物，通過奈斯勒氏法測定氨的量，通過液相色譜法測定作為原料的甘氨腈的量和所生產的甘氨酸的量。
按與實施例1相同的方式對其餘反應混合物進行冷凍離心和超濾，從而得到甘氨酸溶液。取出一部分所得甘氨酸溶液，在468nm下進行吸光度測量。通過進行薄膜蒸餾、晶體-沉積(一次)和乾燥，從剩餘甘氨酸溶液中回收甘氨酸晶體。測定所回收的甘氨酸的純度。結果如表3所示。
加入還原性化合物大大抑制甘氨酸的變色。進而，甘氨酸的收率大大提高了，甘氨酸晶體的純度為99.99％。另一方面，若反應是在開放反應系統中進行的，則得到變為褐色的反應混合物，甘氨酸的收率也降低了。在變為褐色的反應混合物的情況下，反應混合物的超濾是困難的，所得甘氨酸晶體變色，其純度降低至99％。
表3
*在468nm下的吸光度(利用10mm石英池在1mol甘氨酸每升的濃度下測量的值)
實施例12
下面參照
圖1所示生產系統詳細解釋甘氨酸的連續生產。
(1)甘氨腈的合成
1-升不鏽鋼高壓釜6、7和8獨立帶有攪拌器、水位傳感器、壓力計、安全閥和溫度指示計，它們和閃速蒸餾設備9是彼此串聯的。按下列方式合成甘氨腈。在進行反應之前，將高壓釜6、7和8和連接高壓釜彼此的導管內部用氮氣淨化。提供三個隔膜泵，這些隔膜泵分別用於向高壓釜6連續輸送37重量％甲醛水溶液1(含有小於10重量％的甲醇)，進料速率為100g/hr(甲醛水溶液1預先已被處理過，用氮置換溶解其中的氧)；液態氰化氫2，進料速率為33.3g/hr；和含有100ppm4％氫氧化鈉的蒸餾水3，進料速率為240g/hr。將反應溫度設置在40℃，引發用於生產乙醇腈的反應。反應開始後立即觀察到產熱，但是之後反應在所設置的反應溫度下進行。利用水位控制器調節停留時間為1小時，利用泵將含有乙醇腈的反應混合物從高壓釜7輸送到高壓釜8內，同時在0.2MPa壓力下向高壓釜7連續輸送氨氣4，通過質流控制器控制進料速率為82標準升/hr。將高壓釜7的反應溫度設置在55℃，引發用於生產甘氨腈的反應。在反應開始時觀察到由氨的吸收引起的產熱，但是之後反應在所設置的反應溫度和壓力下進行。利用水平控制器調節停留時間為1小時，利用泵將反應混合物從高壓釜7輸送到高壓釜8內。將高壓釜8的溫度設置在55℃。經過1小時的停留時間後，利用泵從高壓釜8中連續抽取含有甘氨腈的反應混合物。收集從反應開始的前6個小時期間所得初始反應混合物作為廢液，將反應開始6小時後所得反應混合物和以後所得反應混合物輸送到設置在大氣壓下的閃速蒸餾設備9內。將閃速蒸餾設備9的柱頂溫度設置在-20℃，在閃速蒸餾設備9的柱頂冷卻反應混合物。通過用冰冷卻反應混合物，除去含在反應混合物中的水分，通過乾冰-乙醇捕集器回收溼氨氣，從而得到液態氨10。將所回收的液態氨10用作原料，輸送到高壓釜7內。從閃速蒸餾設備的柱底回收含有少量氨的甘氨腈水溶液，將所回收的甘氨腈溶液貯存在5℃的中間罐11內。關於貯存，向中間罐11內的甘氨腈溶液中加入100ppm10重量％硫酸作為穩定劑。得到33重量％甘氨腈溶液。所得甘氨腈溶液含有0.9重量％亞氨基二乙腈和1.3重量％至少一種分子量為95或以上的有機雜質化合物。
(2)微生物的培養
按與實施例1相同的方式培養不動桿菌(Acinetobacter sp.)AK226(FERM BP-2451)。通過離心從培養肉湯中收集所培養的微生物細胞，用蒸餾水洗滌三次。然後，向洗滌後的微生物加入蒸餾水，以便得到含有12.5重量％微生物的微生物懸液5，以微生物的乾重計。
(3)水解反應和微生物的分離
使用10-升高壓釜作為水解反應釜12，它帶有攪拌器、溫度計和pH傳感器。在氮氣流下向水解反應釜12內裝入5,400g貯存在中間罐11內的甘氨腈水溶液，然後，向其中加入60g上步(2)中製備的微生物懸液5。在設置為50℃的反應溫度下引發甘氨腈的水解反應。進行8小時反應後，將所得反應混合物轉移到連續離心機3內(TA1-02型，由Westfalia Separator Inc.，U.S.A.製造和銷售)，在那裡通過離心過濾從反應混合物中分離微生物。將五分之一所分離的微生物(微生物漿液)棄去(所要棄去的微生物14)，其餘微生物用蒸餾水洗滌三次。然後，向洗滌後的微生物加入蒸餾水，以便得到48g所回收的微生物懸液。將12g按與上步(2)相同的方式製備的微生物懸液與所回收的微生物懸液混合，從而得到60g微生物懸液。將所得60g微生物懸液裝入水解反應釜12，在那裡按與上述相同方式進行甘氨腈的水解。如此這般重複反應操作，包括上述用於分離和再循環微生物的操作。將通過離心過濾所得濾液(也就是含有甘氨酸的反應混合物)轉移到循環型超濾設備15內(利用超濾膜「SIP-1013」，由Asahi KaseiKabushiki Kaisha，Japan製造和銷售)，在那裡濃縮，同時循環。將所得濃反應混合物轉移到中間罐16內，貯存在那裡。當循環液體的體積減少到500ml時，向其中加入500ml蒸餾水，以便混合物的總體積變為1000ml，再次濃縮混合物，直至循環液體的體積變為500ml。這種包含在超濾設備內稀釋液體、然後濃縮稀釋後的液體的循環進行2次，然後棄去500ml剩餘在超濾設備15內的循環液體。
重複上述用於生產甘氨酸的步驟(3)，得到如下所示結果，其中步驟(3)的一個循環花費12小時。
濃反應混合物含有83重量％甘氨酸的銨鹽和0.9重量％至少一種分子量為95或以上的有機雜質化合物。
(4)甘氨酸晶體的回收
上步(1)中的反應開始18小時後，在中間罐16內得到大約6kg濃反應混合物。然後，使用中間罐16內的濃反應混合物引發甘氨酸的連續晶體-沉積。程序如下所述。使濃反應混合物流經活性炭柱17，從而得到已被活性炭處理的濃縮液。將所得經過活性炭處理的濃縮液輸送到連續晶體-沉積設備18內，流速為425g/hr，用於進行晶體-沉積操作。連續晶體-沉積設備18帶有攪拌器、水位傳感器、溫度計和真空蒸餾柱。通過真空蒸發從中除去含在濃縮液中的過量水和液態氨，速率分別為大約200g/hr和大約20g/hr。將蒸發後的水和液態氨分別回收為蒸餾水19和液態氨10，蒸餾水19和液態氨10都再循環用於上述步驟(1)。漿液(甘氨酸濃度40重量％)蓄積在晶體-沉積容器內。通過抽吸從晶體-沉積容器底部間歇地抽取一部分蓄積在晶體-沉積容器內的漿液，以便晶體-沉積容器內漿液的表面保持在預定的容器內上下水平之間。對所抽取的漿液進行過濾，同時加熱，得到濾液。排放所得濾液(排放液20)，直至其重量減少4％從而得到濾液21，將濾液21再循環至晶體-沉積容器。從晶體-沉積操作開始3小時後，晶體-沉積操作達到穩態，甘氨酸晶體沉積在晶體-沉積容器內。從晶體-沉積設備18中取出所沉積的甘氨酸晶體，乾燥，從而得到甘氨酸晶體22。測定甘氨酸晶體22的純度為99.99％。在這種生產系統中，生產甘氨酸的平均速率為82g/hr(54g/g微生物)，甘氨酸的總收率為90％(其中總收率(％)是減去所有步驟中所有損失(％)的計算值)。
工業實用性
利用本發明的方法，能夠生產高純度的可用作食品添加劑和合成藥物、農藥與洗滌劑的原料的甘氨酸，同時實現如下優點每單位重量微生物的甘氨酸生產活性和每單位時間的甘氨酸生產活性都變高了，能夠化學計量地生產甘氨酸和氨而不會分解或消耗，並且能夠單獨和容易回收。進而，能夠按商業規模生產甘氨酸，不會對環境造成嚴重的負擔。
權利要求
1、用於生產甘氨酸的方法，包括
提供水溶液形式的甘氨腈，
在具有水解腈基活性的微生物酶的作用下，使甘氨腈水溶液在水解反應系統中進行水解反應，從而轉化所述甘氨腈為甘氨酸，同時伴隨產生氨，
所述水解反應系統含有至少一種抑制所述微生物酶的有機雜質化合物，其中所述至少一種抑制所述微生物酶的有機雜質化合物具有95或以上的分子量，並且含有至少一個選自腈基、羧基、醯胺基、氨基、羥基和亞丙基胺結構的成員，其中所述亞丙基胺結構具有由下式(1)代表的骨架
其中n代表整數1或以上，
所述水解反應是在這樣的條件下進行的，其中在所述水解反應期間，抑制所述微生物酶的所述有機雜質化合物在所述水解反應系統中的含量保持在10重量％或以下的水平，基於所述水解反應系統的重量而言，和
從水解反應系統中分離甘氨酸。
2、根據權利要求1的方法，其中所述至少一種抑制所述微生物酶的有機雜質化合物是在至少一種反應中作為副產物而生成的，該反應選自從氰化氫、甲醛和氨合成甘氨腈和甘氨腈水解為甘氨酸和氨。
3、根據權利要求1或2的方法，其中所述至少一種抑制所述微生物酶的有機雜質化合物包含由下式(2)代表的化合物
NH3-n(CH2Y1)n (2)
其中每個Y1獨立地代表腈基、羧基或醯胺基；n代表整數2或3。
4、根據權利要求1或2的方法，其中所述至少一種抑制所述微生物酶的有機雜質化合物包含至少一種選自下列化合物(a)和(b)的化合物
(a)由下式(3)代表的化合物
其中Y1代表腈基、羧基或醯胺基；每個Y2獨立地代表氨基或羥基；n代表整數0或以上；該z1或每個z1獨立地是由下式(4)或(5)代表的
或
其中每個Y2獨立地代表氨基或羥基，和(b)由下式(6)或(7)代表的化合物
或
其中每個Y2獨立地代表氨基或羥基；
每個Z2獨立地是由下式(8)或(9)代表的
或
Z1n-H (9)
其中
Y2代表氨基或羥基；
該Z1或每個Z1是如式(3)所定義的；
n代表整數0或以上。
5、根據權利要求1或2的方法，其中所述至少一種抑制所述微生物酶的有機雜質化合物包含至少一種選自下列化合物(c)和(d)的化合物
(c)由下式(10)或(11)代表的化合物
或
其中每個Y1獨立地代表腈基、羧基或醯胺基，和
(d)由下式(12)代表的化合物
(HCN)n (12)
其中n代表整數4或以上。
6、根據權利要求1或2的方法，其中所述至少一種抑制所述微生物酶的有機雜質化合物包含在其分子中具有至少一個選自下列骨架(e)和(f)的骨架的化合物
(e)由下式(13)代表的骨架
其中每個Y1獨立地代表腈基、羧基或醯胺基；
n代表整數2或以上，和
(f)由下式(14)或(15)代表的骨架
或
其中
該Y1或每個Y1獨立地代表腈基、羧基或醯胺基；
每個Y2獨立地代表氨基或羥基；
n代表整數1或以上。
7、根據權利要求1或2的方法，其中所述至少一種抑制所述微生物酶的有機雜質化合物包含在其分子中具有至少一個選自下列骨架(g)和(h)的骨架的化合物
(g)由下式(16)代表的骨架
其中
每個Y1獨立地代表腈基、羧基或醯胺基；
每個Y2獨立地代表氨基或羥基；
n代表整數2或以上，和
(h)由下式(17)或(18)代表的骨架
或
其中
該Y1或每個Y1獨立地代表腈基、羧基或醯胺基；
每個Y2獨立地代表氨基或羥基；
n代表整數1或以上。
8、根據權利要求1或2的方法，其中所述至少一種抑制所述微生物酶的有機雜質化合物包含六亞甲基四胺。
9、根據權利要求1至8之任一項的方法，其中所述至少一種抑制所述微生物酶的有機雜質化合物在重水中測量的13C-NMR光譜中53ppm與100ppm之間表現出峰。
10、根據權利要求1至9之任一項的方法，其中所述至少一種抑制所述微生物酶的有機雜質化合物在關於所述水解反應系統測量的紫外-可見吸收光譜中340nm與380nm之間和440nm與480nm之間表現最大吸收。
11、根據權利要求1至10之任一項的方法，其中所述至少一種抑制所述微生物酶的有機雜質化合物的分子量為130或以上。
12、根據權利要求1至11之任一項的方法，其中所述至少一種抑制所述微生物酶的有機雜質化合物的量為1重量％或以下，基於所述水解反應系統的重量而言。
13、根據權利要求1至12之任一項的方法，其中所述水解反應系統中溶解有5重量ppm或以下的氧，基於所述水解反應系統的重量而言。
14、根據權利要求1至13之任一項的方法，其中所述水解作用是利用密閉反應系統、用惰性氣體加壓的反應系統、流通惰性氣體的反應系統或在低於大氣壓的壓力之下的反應系統進行的，以便抑制溶解在所述水解反應系統中的氧量。
15、根據權利要求1至14之任一項的方法，其中所述水解作用是在其中溶解有氨的所述水解反應系統中進行的。
16、根據權利要求1至15之任一項的方法，其中所述水解作用是在含有2重量％或以下電解質的所述水解反應系統中進行的，基於甘氨腈的重量而言。
17、根據權利要求1至16之任一項的方法，其中所述具有水解腈基活性的微生物酶是從屬於以下屬的微生物衍生的，所述屬選自不動桿菌屬、紅球菌屬、棒桿菌屬、產鹼菌屬、分枝桿菌屬、紅假單胞菌屬和假絲酵母屬。
18、根據權利要求17的方法，其中所述不動桿菌屬的微生物菌株是不動桿菌(Acinetobacter sp.)AK226，保藏在日本國立生命科學和人體技術研究所中，保藏號為FERM BP-2451，或不動桿菌(Acinetobacter sp.)AK227，保藏在日本國立生命科學和人體技術研究所中，保藏號為FERM BP-7413。
19、根據權利要求17的方法，其中所述紅球菌屬的微生物菌株是海洋紅球菌(Rhodococcus maris)BP-479-9，保藏在日本國立生命科學和人體技術研究所中，保藏號為FERM BP-5219。
20、根據權利要求17的方法，其中所述棒桿菌屬的微生物菌株是棒桿菌(Corynebacterium sp.)C5，保藏在日本國立生命科學和人體技術研究所中，保藏號為FERM BP-7414，或Corynebacteriumnitrilophilus，保藏在美國典型培養物保藏中心中，保藏號為ATCC21419。
21、根據權利要求17的方法，其中所述產鹼菌屬的微生物菌株是糞產鹼菌(Alcaligenes faecalis)IFO 13111，保藏在日本國立生命科學和人體技術研究所中，保藏號為FERM BP-4750。
22、根據權利要求17的方法，其中所述分枝桿菌屬的微生物菌株是分枝桿菌(Mycobacterium sp.)AC777，保藏在日本國立生命科學和人體技術研究所中，保藏號為FERM BP-2352。
23、根據權利要求17的方法，其中所述紅假單胞菌屬的微生物菌株是球形紅假單胞菌(Rhodopseudomonas spheroides)，保藏在美國典型培養物保藏中心中，保藏號為ATCC 11167。
24、根據權利要求17的方法，其中所述假絲酵母屬的微生物菌株是熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)，保藏在美國典型培養物保藏中心中，保藏號為ATCC 20311。
25、根據權利要求1至24之任一項的方法，其中在進行從所述水解反應系統中分離甘氨酸的同時，獨立於甘氨酸回收地回收伴隨產生的氨。
26、根據權利要求25的方法，其中甘氨酸和氨是通過至少一個操作而單獨回收的，所述操作選自蒸餾、反應性蒸餾、被惰性氣體夾帶、離子交換、提取、利用不良溶劑再沉澱和通過濃縮或冷卻的晶體-沉積。
27、根據權利要求26的方法，其中氨是通過蒸餾、反應性蒸餾或被惰性氣體夾帶而回收的，甘氨酸是通過使氨回收之後剩餘的液體進行通過濃縮或冷卻的晶體-沉積而回收的。
28、根據權利要求1至27之任一項的方法，該方法包括
(1)在密閉的反應系統內，在鹼催化劑的存在下，使氰化氫與甲醛在水性介質中反應，得到水溶液形式的乙醇腈，
(2)向乙醇腈的水溶液中加入氨，進行乙醇腈與氨之間的反應，從而得到水溶液形式的甘氨腈，同時生成水，
(3)通過蒸餾從所得甘氨腈的水溶液中分離大部分氨和一部分水，從而得到水解反應系統，該水解反應系統含有水溶液形式的甘氨腈和剩餘未分離的氨，其中回收所分離的氨，用於再循環至步驟(2)，
(4)在由加入到處於密閉系統內的所述水解反應系統中的微生物產生的微生物酶的作用下，使所述水解反應系統進行水解反應，從而轉化所述甘氨腈為甘氨酸，同時伴隨產生氨，
(5)通過至少一個操作分離所述微生物和所述微生物酶，所述操作選自離心過濾和膜過濾，其中回收所述微生物和所述微生物酶，用於再循環至步驟(4)，
(6)通過至少一個操作分離一部分在步驟(1)至(5)中伴隨產生的、抑制所述微生物酶的有機雜質化合物，所述操作選自膜過濾和吸附劑分離，
(7)通過蒸餾分離在步驟(4)中伴隨產生的氨和在步驟(4)後剩餘在所述水解反應系統中的過量的水，其中回收所分離的氨，用於再循環至步驟(2)，
(8)在步驟(7)之後或者同時，通過晶體-沉積分離所述甘氨酸，和
(9)乾燥所述甘氨酸的晶體。
29、用於生產甘氨酸的方法，包括提供水溶液形式的甘氨腈，使甘氨腈的水溶液進行水解反應，從而轉化所述甘氨腈為甘氨酸，同時伴隨產生氨，和從水解反應系統中分離甘氨酸，其中所述甘氨腈的水解作用是在氨的存在下進行的。
30、根據權利要求29的方法，其中氨的量為0.001至5mol，相對於1摩爾甘氨腈而言。
31、用於生產甘氨酸的方法，包括提供水溶液形式的甘氨腈，使甘氨腈的水溶液進行水解反應，從而轉化所述甘氨腈為甘氨酸，同時伴隨產生氨，和從水解反應系統中分離甘氨酸，其中在進行從所述水解反應系統中分離甘氨酸的同時，在鹼和酸缺乏下，獨立於甘氨酸回收地回收伴隨產生的氨。
32、根據權利要求31的方法，其中甘氨酸和氨是通過至少一個操作而單獨回收的，所述操作選自蒸餾、反應性蒸餾、被惰性氣體夾帶、離子交換、提取、利用不良溶劑再沉澱和通過濃縮或冷卻的晶體-沉積。
33、根據權利要求32的方法，其中氨是通過蒸餾、反應性蒸餾或被惰性氣體夾帶而回收的，甘氨酸是通過使氨回收之後剩餘的液體進行通過濃縮或冷卻的晶體-沉積而回收的。
全文摘要
公開了用於生產甘氨酸的方法，其特徵在於在微生物酶的作用下，使甘氨腈水溶液在水解反應系統中進行水解反應，從而轉化甘氨腈為甘氨酸，同時伴隨產生氨，其中該水解反應系統含有至少一種抑制該微生物酶的有機雜質化合物，該有機雜質化合物具有分子量95或以上，並且含有至少一個選自腈基、羧基、醯胺基、氨基、羥基和亞丙基胺結構的成員，該水解反應是在這樣的條件下進行的，其中在水解反應期間，抑制微生物酶的有機雜質化合物在水解反應系統中的含量保持在10重量％或以下的水平，基於水解反應系統的重量而言。
文檔編號C12P13/04GK1433479SQ0081871
公開日2003年7月30日 申請日期2000年12月27日 優先權日1999年12月27日
發明者青木肇也, 川上潔, 大坪一政 申請人:旭化成株式會社