呋喃唑酮代謝物快速檢測試紙條和試紙卡的製作方法

2023-12-08 20:45:36

專利名稱：呋喃唑酮代謝物快速檢測試紙條和試紙卡的製作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種快速檢測微量硝基呋喃類藥物的器具， 特別是涉及一種呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-惡唑烷酮(AOZ)殘留分析的快速檢 測試紙條和試紙卡。
二、 技術背景呋喃唑酮(Furazolidone, FZ)，又名痢特靈，是一種人工 合成的硝基呋喃類廣譜抗菌藥物，對多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌及某些 原蟲和真菌具有抑制或殺滅效果，而且藥效穩定，在畜禽和水產養殖中得到了 廣泛的應用。但毒理學研究發現，呋喃唑酮及其代謝產物3-氨基-2-惡唑烷酮
(3-amino-2-oxazolidinone， AOZ)均有很強的毒副作用，可致癌、致突變， 可引起溶血性貧血、血小板減少性紫癜、多發性神經炎等多種疾病。1995年 歐盟首先禁止呋喃唑酮在畜禽和水產養殖中使用，隨後美國、日本、澳大利亞 等國將呋喃唑酮列為禁用藥，我國農業部2002年3月頒布的《食品動物禁用 的獸藥及其它化合物清單》(農牧發[2002] 1號)中將呋喃唑酮列為禁用藥。呋' 喃唑酮是我國食品安全監控的主要藥物之一。
儘管我國嚴禁呋喃哇酮用於畜牧、水產養殖業，但由於其藥效確切，價格 低廉，目前在畜牧和水產養殖中違禁使用現象仍較嚴重。呋喃唑酮在食品動物 中的殘留不僅直接危害食用者的身體健康，同時還嚴重製約我國動物性食品出 口，造成了巨大的經濟損失。
由於呋喃唑酮在動物體內很快代謝為AOZ， AOZ與組織蛋白結合且在體 內滯留時間長，被視為呋喃唑酮殘留的標示物。通過檢測母體藥物不能判定呋 喃唑酮的實際殘留情況，因此檢測呋喃唑酮殘留的最佳方法是檢測其代謝物
(AOZ)而並非母體藥物本身。
目前，用於AOZ殘留檢測的方法主要有理化分析法和酶聯免疫分析法.
(ELISA)等。理化分析法主要是高壓液相色譜(HPLC)、液相色譜-質譜聯用
(LC-MS)等。理化分析法靈敏度高，結果準確，但是樣品需經一系列複雜的
處理淨化，繁瑣費時，所需儀器設備價格昂貴，而且只有特定的專業技術人員
才能操作，不能進行現場檢測，時效性差，難以推廣。ELISA法以競爭性酶聯免 疫反應為檢測原理，反應顯色後用酶標儀測定OD值進行結果判定。縮短了檢 測時間，可以定性定量檢測。但ELISA方法需要配套的酶標儀和配套試劑，操 作過程仍較複雜，而且國內現處在研發階段，進口國外產品價格昂貴，因而 ELISA方法的應用受到了較大限制。
三、實用新型內容
本實用新型的目的研製出特異、敏感、快速、簡便的呋喃唑酮代謝物(AOZ) 殘留快速檢測試紙條和試紙卡。 本實用新型的技術方案是
一種呋喃唑酮代謝物快速檢測試紙條，含有襯板和在襯板上依次銜接的樣 品墊、金標結合墊、包被膜、吸水墊，在試紙條的兩端粘貼有保護膜，金標結
合墊為吸附AOZ金標抗體的玻璃纖維棉，在包被膜上有用AOZ偶聯的載體蛋 白溶液印製的直線式隱形檢測線，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG溶液印 制的直線式隱形對照線，兩條線平行排列組合為"I I "。
一種呋喃唑酮代謝物快速檢測試紙條，含有襯板和在襯板上依次銜接的樣 品墊、金標結合墊、包被膜、吸水墊，.在試紙條兩端粘貼有保護膜，金標結合 墊為吸附AOZ衍生物金標抗體的玻璃纖維棉，在包被膜上有用AOZ衍生物偶 聯的載體蛋白溶液印製的直線式隱形檢測線，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔 IgG溶液印製的直線式隱形對照線，兩條線平行排列組合為"I I "。
一種呋喃唑酮代謝物快速檢測試紙卡，含有襯板、樣品墊、金標結合墊、 包被膜和吸水墊組成試紙芯，試紙芯放在特製的塑料卡中，金標結合墊為吸附 AOZ金標抗體的玻璃纖維棉，在包被膜上有用AOZ偶聯的載體蛋白溶液印製的 直線式隱形檢測線，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG溶液印製的直縛式隱 形對照線，兩條線平行排列組合為"I I "。
一種呋喃唑酮代謝物快速檢測試紙卡，含有襯板、樣品墊、金標結合墊、 包被膜和吸水墊組成試紙芯，試紙芯放在特製的塑料卡中，金標結合墊為吸附 AOZ衍生物金標抗體的玻璃纖維棉，在包被膜上有用AOZ衍生物偶聯的載體蛋
白溶液印製的直線式隱形檢測線，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG溶液印 制的直線式隱形對照線，兩條線平行排列組合為"I I "。
所述的襯板為不吸水的韌性材料；所述的樣品墊為玻璃纖維棉，或尼龍膜， 或聚偏二氟乙烯膜，或聚酯膜；所述的吸水墊為吸水能力較強的吸水濾紙或濾 油紙；所述的韌性材料為硬質塑膠條，或不吸水硬紙條；所述的包被膜為硝酸 纖維素膜，或為純纖維素膜，或為羧化纖維素膜；所述的保護膜為不透明的膠 膜。
所述的AOZ金標抗體為膠體金標記的AOZ單克隆抗體或多克隆抗體,AOZ 衍生物金標抗體為膠體金標記的AOZ衍生物單克隆抗體或多克隆抗體，所述的 偶聯AOZ或偶聯AOZ衍生物的載體蛋白為牛血清白蛋白BSA，或為雞卵清白 蛋白OVA，或為人血清白蛋白HSA。
所述的試紙條在樣品墊、金標結合墊及吸水墊上覆蓋有保護膜，樣品墊、 金標結合墊對應的保護膜上印製有待測樣品標記線，該標記線偏向樣品墊一側 約0.5cm處。
所述的塑料卡由底座和面蓋嵌合在一起構成，底座上有放試紙芯的凹槽以 及與面蓋相結合的卡齒，面蓋有觀察窗和加樣孔以及與底座相結合的卡齒，觀 察窗與試紙芯的包被膜相對應，加樣孔與試紙芯的樣品墊相對應，在觀察窗旁 邊分別印有T和C， T表示檢測線，在靠近加樣孔側，C表示對照線，在遠離加. 樣孔側。
本實用新型的快速檢測試紙條和試紙卡具有下列優點
① 特異性強，敏感性高。該膠體金層析檢測試紙條和試紙卡以膠體金標記 高親和力的單克隆抗體為基礎製備而成，金標抗體中金顆粒與抗體分子之間無 共價鍵形成，二者通過異性電荷間的範德華力相結合，膠體金標記對單克隆抗 體的特異性和親和力影響很小，且具有較高的標記率。因此，試紙條和試紙卡 具有較強的特異性和較高的敏感性，檢出最低限量可達到1 5ppb。
② 簡便、快速、時效性強。使用膠體金層析檢測試紙條和試紙卡，無需任 何其它試劑和儀器，可現場操作，只要將試紙條插入被檢樣品10 20秒鐘，在' 10分鐘內即可判定檢測結果。
③ 結果顯示形象、直觀、準確。膠體金層析檢測試紙條和試紙卡均以顯示 棕紅色線"I "和"I I"作為檢測結果陽性和陰性標記，即在包被膜上顯示. 一條棕紅色線"I "時，表示在被檢樣品中含有被檢物，顯示兩條棕紅色線"I
I "時，表示在被檢樣品中不含被檢物。結果判定形象、直觀、準確，簡單明 了，不易出現假陽性和假陰性等人為誤判。
④ 節省費用，適用範圍廣，便於推廣。使用快速檢測試紙條和試紙卡，比
用儀器分析和進口ELISA試劑盒的費用大幅下降。另外，試紙條和試紙卡的適 用範圍廣，可滿足不同層次人員需要，包括專業檢驗，海關檢疫，衛生檢疫， 質量監測，加工企業和養殖場戶等，便於推廣應用，具有廣闊的市場前景和明 顯的經濟、社會效益。
四、

圖l、呋喃唑酮代謝物快速檢測試紙條俯視結構示意圖。 圖2、呋喃唑酮代謝物快速檢測試紙條剖面結構示意圖。 圖3、呋喃唑酮代謝物快速檢測試紙卡俯視結構示意圖。 圖4、呋喃唑酮代謝物快速檢測試紙卡剖面結構示意圖。 圖中，1:襯板，2:樣品墊，3:金標物結合墊，4:包被膜，5:檢測線， 6:對照線，7:吸水墊，8-1:樣品浸入端保護膜，8-2:手柄端保護膜，9:標識線， 10:力口銜L 11:觀察窗，12:面板，13: i纖芯固定槽，14:鵬。
五具體實施方式
要製成呋喃唑酮代謝物快速檢測試紙條和試紙卡，首先需要製備偶聯呋喃 唑酮代謝物載體蛋白和呋喃唑酮代謝物衍生物載體蛋白，用於製備相應的檢測 線和抗體；而且需要製備呋喃唑酮代謝物金標抗體和呋喃唑酮代謝物衍生物金 標抗體，用於製備相應的金標抗體纖維棉；另外需要製備羊抗或兔抗小鼠IgG (或羊抗兔IgG)抗體，用於製備對照線。
1、呋喃唑酮代謝物(AOZ)與載體蛋白偶聯
採用戊二醛法，將AOZ與載體蛋白BSA進行偶聯製備人工結合抗原 AOZ-BSA。具體製備方法如下稱取BSA30mg溶於5ml pH7.4的0.01mol/L磷 酸緩衝液(PBS)中，攪拌下加入AOZ 5 6mg，緩慢滴加25%戊二醛溶液O.lml，
磁力攪拌反應4 6h。 5000r/min離心10min，收集上清液裝入透析袋，在4。C下 用0.01mol/L (pH7.4)的PBS透析72h，每天更換透析液2 3次。最後收集透 析袋內的橙黃色溶液過葡聚糖凝膠層析柱(SephadexG-25)進一步提純，製得. 人工結合抗原AOZ-BSA，保存於-2(TC冰箱備用。
同法，用OVA或HSA替代BSA製得人工結合抗原AOZ-OVA或AOZ-HSA。.
2、 AOZ衍生物與載體蛋白偶聯
碳二亞胺法將AOZ對醛基苯甲酸衍生物(CPAOZ)與載體蛋白BSA進 行偶聯製備人工結合抗原CPAOZ-BSA。具體製備方法如下:稱取BSA 100mg溶 於6mlpH7.4的0.01mol/LPBS中，加入N，N-二甲基甲醯胺(DMF) lml，攪拌 溶解；稱取CPAOZ 14mg溶於1.2ml二甲基甲醯胺(DMF)中，攪拌下加入二 環己基碳二亞胺(DCC) 16.5mg和N-羥基琥珀醯亞胺(NHS) 8.5mg, 4"下磁 力攪拌反應過夜，5000r/min離心10min，取上清液並在磁力攪拌下逐滴加入上 液中，4'C下密封攪拌反應4 6h， 5000r/min離心10min，收集上清液裝入透析 袋，在4'C下用pH7.4的PBS透析72h，每天更換透析液2 3次。最後收集透' 析袋內的無色CPAOZ-BSA溶液，保存於-2(TC冰箱備用。
同法，用OVA或HSA替代BSA製得人工結合抗原CPAOZ-OVA或 CPAOZ陽HSA。
混合酸酐法冰浴條件下進行，將CPAOZ 8.2mg溶解在0.8ml DMF中，攪 拌加入三丁胺30ul，反應30min，再加入氯甲酸異丁酯20^1反應lh，而後加入 載體蛋白BSA溶液(BSA50mg溶於2mlpH為7.4的0.01mol/LPBS中)反應過 夜，終止反應。收集反應物裝入透析袋，在4'C下用0.01mol/L (pH7.4)的' PBS透析3天，每天更換透析液2 3次。最後收集透析好的反應物過 SephadexG-25層析柱進一步提純，製得人工結合抗原CPAOZ-BSA，保存於一 2(TC冰箱備用。
同法，用OVA或HSA替代BSA製得人工結合抗原CPAOZ-OVA或 CPAOZ-HSA。
3、 抗AOZ單克隆抗體或多克隆抗體的製備
單抗製備以50pg 100ng/只的AOZ-載體蛋白結合抗原免疫8周齡BALBZc
小鼠3 4次，每次免疫間隔時間3 5周，最後一次超強免疫後3 4天，無菌 取其脾細胞並與NSO骨髓瘤細胞雜交融合，置37卩、5%(302培養箱中培養。培 養10 14天，用間接ELISA方法選擇強陽性、抑制率高、細胞生長旺盛的孔進 行3次有限稀釋克隆化，而後擴大培養，建立雜交瘤細胞株，其分泌的單克隆 抗體可特異地與AOZ反應。以體內誘生法進行單抗製備，以辛酸-硫酸銨法提純' 單抗，一20'C凍存備用。
多抗製備:用AOZ-載體蛋白結合抗原免疫紐西蘭白兔，免疫劑量為200pg 50(Hig/次，背部皮下分4 6點注射。首免，用AOZ-載體蛋白結合抗原與等量 弗氏完全佐劑(FCA)混合，充分乳化；加強免疫，用AOZ-載體蛋白結合抗原 與等量弗氏不完全佐劑(FIA)混合，充分乳化，首免後2 3周進行，連續免 疫4 5次，每次間隔2 3周，最後一次免疫後10 15天，以ELISA法測其定 效價達到105以上時，採血並分離收集高免血清。以飽和硫酸銨鹽析法提取IgG 抗體，一20'C凍存備用。 ，
4、 抗AOZ衍生物單克隆抗體或多克隆抗體的製備
參照抗AOZ單克隆抗體或多克隆抗體的製備方法，以AOZ衍生物載體蛋. 白結合抗原替代AOZ載體蛋白結合抗原，製備抗AOZ衍生物單克隆抗體或多 克隆抗體。
5、 金標抗體和金標物結合墊的製備
①AOZ金標抗體和金標物結合墊的製備:採用檸檬酸鈉還原法製備膠體金 溶液，即在沸騰的200ml 0.01 0.02%氯金酸溶液中加入新鮮配製的1%檸檬酸 三鈉8ml，獲得直徑約15nm的膠體金溶液，用O.lmol/LK2C03調pH值至8.5 9.5，置2 8'C保存備用。以l: 2000'的標記比將待標記的抗AOZ單克隆抗體' 或多克隆抗體加入pH8.5 9.5的金溶膠中，標記10min後，加入20X的PEG10000 至終濃度為0.05%， 4°C、 1500 2000rpm離心20min，除去未結合的膠體金顆' 粒，4°C、 15000rpm離心lh,棄上清，獲初步純化的金標抗體蛋白混合物，再 用丙烯葡聚糖S-400柱層析進行分離純化，獲得AOZ膠體金標記抗體。將l: 100 1: 500稀釋的膠體金標記抗體(單克隆抗體或多克隆抗體)吸附於精製玻 璃纖維棉中，4'C低溫真空乾燥，製備AOZ金標物結合墊。
②AOZ衍生物金標抗體和金標物結合墊的製備參照AOZ金標抗體和金 標物結合墊的製備方法，以AOZ衍生物單克隆抗體或多克隆抗體替代AOZ單 克隆抗體或多克隆抗體，製備AOZ衍生物金標抗體和金標物結合墊。
6、 羊抗或兔抗小鼠IgG (或羊抗兔IgG)抗體的製備 以飽和硫酸銨法提取AOZ及其AOZ衍生物陰性小鼠血清IgG (或陰性兔
血清IgG)。即取l份小鼠血清(或兔血清)加2份PBS (pH7.2)混勻，加等體 積飽和硫酸銨溶液混勻，置4'C冰箱12h, 4aC、 2500rpm離心15min，棄上清； 再以適量PBS (pH7.2)溶解沉澱，加飽和硫酸銨溶液至終濃度33%，置4'C冰 箱2h， 4°C、 2500rpm離心15min，棄上清，以適量PBS (pH7.2)溶解沉澱， 置4'C冰箱內用PBS (pH7.2)透析48h，中間換液3次，4°C、 12000rpm離心 15min，收集上清，以紫外分光光度計測定其蛋白濃度。以提取的小鼠血清(或 兔血清)IgG按50 100ng/kg體重經皮下和肌肉注射健康山羊或家兔3 4次， 末次注射10天後，以ELISA測定其血清效價達到1: 2000以上時，心臟或動脈 採血，分離收集高免血清。以飽和硫酸銨法提取羊抗或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔 IgG)抗體(方法與提取小鼠血清IgG相同，不再重述)，用於膠體金層析檢測 試紙條和試紙卡對照線的製備。
7、 快速檢測試紙條和試紙卡檢測反應原理
當快速檢測試紙條和試紙卡測試端加入待測樣品溶液後，待測溶液通過虹 吸作用帶動待測物及金標物結合墊中的金標抗體一起向包被膜擴散，並最終滲. 入手柄端吸水濾紙。在擴散過程中，待測物可與金標抗體相結合，進而封閉金 標抗體上待測物的抗原結合點，阻止金標抗體與包被膜上偶聯載體蛋白抗原的 檢測線結合，檢測線不能顯色，而羊或兔抗小鼠IgG (或羊抗兔IgG)抗體則可 與金標抗體結合，形成一條棕紅色對照線"I "，為陽性表示。反之樣品溶液中 無待測物則不能阻止金標抗體與包被膜上偶聯載體蛋白抗原的檢測線結合，顯 示棕紅色檢測線"I "，同樣羊抗或兔抗小鼠IgG (或羊抗兔IgG)抗體也與金 標抗體結合，顯示棕紅色對照線"I "，這樣形成兩條棕紅色線"I I "，為陰' 性表示。如果包被膜上沒有棕紅色線顯示，則表明試紙條已失效。
實施例一、A0Z快速檢測試紙條，參見圖1和圖2。圖中1為襯板，用硬質'
塑膠條製成；2為樣品墊，用玻璃纖維棉製成；3為金標物結合墊，根據上述具 體實施方式"5"所述的製備方法，製備吸附有膠體金標記的抗AOZ單克隆抗體 玻璃纖維棉；4為包被膜，釆用硝酸纖維素膜；5為隱形檢測線，用偶聯A0Z載 體蛋白溶液在包被膜上印製成"I "，載體蛋白為牛血清白蛋白BSA; 6為隱形 對照線，用兔抗小鼠IgG抗體溶液在包被膜上印製成"I ",兩條線平行排列組 合為"I I "; 7為手柄端的吸水墊，用吸水濾紙製成。將2、 3、 4、 7從右至左 依次粘貼固定在塑膠薄片條1上，彼此之間交界處纖維互相搭接。8—1為覆蓋 在樣品墊2和金標物結合墊3上面的樣品端白色保護膜，8—2為覆蓋在吸水墊 7上面的手柄端其它顏色保護膜(如黃色)，9為測試樣品的帶箭頭標示線，即 在樣品墊2與金標物結合墊3交界處對應的白色保護膜偏向樣品墊一側約0.5cm 處印製的標示線，在標示線右側保護膜上印有箭頭及MAX字樣。
試紙條適於檢測的樣品及其檢測操作方法與結果判定
檢測樣品可為組織樣、蛋樣、蜂蜜樣和奶樣。
檢測樣品製備
① 組織樣和蛋樣將樣品勻漿後，稱取lg樣品加入5ml甲醇/乙醇/乙醚 (1:1:1)提取液，5000r/min離心10min，取上清液；沉澱中再加入5ml甲醇/
乙醇/乙醚提取液，5000r/min離心10min，取上清液，收集兩次上清液混勻後， 用N2吹乾，加入5ml0.15mol/LpH7.4的PBS稀釋，用於檢測分析。
② 奶樣取奶樣2ml在15。C條件下3000r/ min離心5min,除去上層脂肪， 取下層液，加入5ml甲醇/乙醇/乙醚(1:1:1)提取液，5000r/min離心10min，取. 上清液；沉澱中再加入5ml甲醇/乙醇/乙醚提取液，5000r/min離心10min，取上 清液，收集兩次上清液混勻後，用N2吹乾，加入5ml 0.15mol/LpH 7.4的PBS 稀釋，用於檢測分析。
③ 蜂蜜樣取蜂蜜樣品2g，加入5ml甲醇/乙醇/乙醚(1:1:1)提取液， 5000r/min離心10min，取上清液；沉澱中再加入5ml甲醇/乙醇/乙醚提取液， 5000r/min離心10min，取上清液，收集兩次J:清液混勻後，用N2吹乾，加入 5ml 0.15mol/L pH 7.4的PBS稀釋，甩於檢測分析。
檢測操作方法將AOZ膠體金層析檢測試紙條樣品端插入待測樣品液中，
插入深度不超過標記線，約10 20秒鐘取出檢測試紙條，水平放置，5 10分 鍾觀察判定檢測結果。
結果判定①陽性如果在包被膜上顯示有一條棕紅色線"I "，表示檢測 結果為陽性，說明在待測樣品中含有AOZ;②陰性如果在包被膜上顯示有兩 條棕紅色線"I I "，表示檢測結果為陰性，說明在待測樣品中不含AOZ;③失 效如果在包被膜上沒有棕紅色線顯示，則表明試紙條已失效。
實施例二、 AOZ檢測試紙卡，參見圖3、圖4。圖中1、 2、 3、 4、 5、 6和 7分別為襯板、樣品墊、金標物結合墊、包被膜、隱形檢測線、隱形對照線和吸 水墊，其製備方法與實施例一相同，組成試紙芯；14為塑料製成的試紙卡底座， 試紙芯固定在底座的固定槽13中；12為塑料製成的試紙卡面板，其上的加樣孔 IO與試紙芯的樣品墊相對應，是滴加待檢樣品的位置；在面板上的觀察窗ll與' 試紙芯的包被膜相對應，是觀察判定結果的窗口，其旁邊印有T和C，分別與 包被膜上的檢測線和對照線相對應。
檢測樣品及檢測樣品製備和實施例一相同。
檢測時，將試紙卡平放，從加樣孔滴加待測樣品液，5 10分鐘從觀察窗判 定檢測結果。
結果判定如在包被膜上對應T的位置顯示有一條棕紅色線"I"時，表 示檢測結果為陽性，說明在待測樣品中含有AOZ;如在包被膜上對應T、 C的 位置顯示有兩條棕紅色線"I I "時，表示檢測結果為陰性，說明在待測樣品. 中不含AOZ;如在包被膜上沒有棕紅色線顯示，則表明試紙條己失效。
實施例三、檢測試紙條結構和實施例一基本相同，不同之處在於以抗AOZ 多克隆抗體替代抗AOZ單克隆抗體，製備AOZ金標抗體和金標物結合墊；偶 聯AOZ的載體蛋白為雞卵清白蛋白OVA，用羊抗兔IgG替代兔抗小鼠IgG抗 體溶液在包被膜上製備對照線"I "。
其它包括檢測樣品、操作方法和結果判定等均同實施例一，不再重述。
實施例四、檢測試紙卡結構和實施例二基本相同，不同之處在於以抗AOZ 多克隆抗體替代AOZ單克隆抗體，製備AOZ金標抗體和金標物結合墊；偶聯 AOZ的載體蛋白為雞卵清白蛋白OVA，用羊抗兔IgG替代兔抗小鼠IgG抗體溶
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液在包被膜上製備對照線"I "。
其它包括檢測樣品、操作方法和結果判定等均同實施例二，不再重述。
實施例五、檢測試紙條結構和實施例一基本相同，不同之處在於以抗AOZ. 對醛基苯甲酸衍生物(CPAOZ)單克隆抗體替代抗AOZ單克隆抗體，製備AOZ 衍生物金標抗體和金標物結合墊；用AOZ-衍生物載體蛋白偶聯物替代AOZ-載. 體蛋白偶聯物在包被膜上製備檢測線"I "，偶聯AOZ衍生物的載體蛋白為人 血清白蛋白HSA。
檢測樣品製備
① 組織樣和蛋樣將樣品勻漿後，按每g樣品加入10ml O.125mol/L的HCL 及l.Oml 4mg/ml的2-硝基苯甲醛溶液，置37"C水浴中振蕩16h(過夜)，用1 mol/L NaOH調pH至7.0-7.5;再加入5ml正己烷，混勻攪拌10min，4'C條件下5000r/min 離心10min，棄去上層正己烷溶液層，下層溶液加乙酸乙酯8ml，旋轉振蕩10min， 4'C條件下5000r/min離心10min，用N;j吹乾，加入5mL含0.05%吐溫-20的 PBS(pH7.4， 0.15mol/L)稀釋，用於檢測分析。
② 奶樣取奶樣2ml在15'C條件下3000r/min離心5min，除去上層脂肪，取 下層液，加入10ml 0.125mol/L的HCL及l.Oml 4mg/ml的2-硝基苯甲醛溶液， 置37'C水浴中振蕩16h(過夜)，用1瓜01凡忖3011調？11至7.0 7.5;再加入正己 烷5ml，攪拌10min， 4。C條件下5000r/min離心10min，棄去上層正己垸溶液層， 下層溶液加乙酸乙酯8ml，旋轉振蕩10min, 4'C條件下5000r/min離心10min， 用N2吹乾，加入5ml含0.05%吐溫-20的PBS(pH 7.4， 0.15M)稀釋，用於檢測
分析。 '
③ 蜂蜜樣取蜂蜜樣品2g，加入10ml 0.125mol/L的HCL及l.Oml 4mg/ml 的2-硝基苯甲醛溶液，置37'C水浴中振蕩16h(過夜)，用1 mol/L NaOH調pH 至7.0-7.5;再加入正己烷5ml，攪拌10min， 4'C條件下5000r/min離心10min, 棄去上層正己烷溶液層，下層溶液加乙酸乙酯8ml，旋轉振蕩10min， 4'C條件 下5000r/min離心10min，用N2吹乾，加入5ml含0.05%吐溫-20的PBS(pH 7.4， 0.15M)稀釋，用於檢測分析。
其它包括檢測操作方法和結果判定等均同實施例一，不再重述。實施例六、檢測試紙條結構和實施例一基本相同，不同之處在於以抗AOZ
對醛基苯甲酸衍生物(CPAOZ)多克隆抗體替代抗AOZ單克隆抗體，製備AOZ 衍生物金標抗體和金標物結合墊；用AOZ-衍生物載體蛋白偶聯物替代AOZ-載 體蛋白偶聯物在包被膜上製備檢測線"I "，偶聯AOZ衍生物的載體蛋白為人. 血清白蛋白HSA，用羊抗兔IgG替代兔抗小鼠IgG抗體溶液在包被膜上製備對 昭線"I "。
其它包括檢測樣品、操作方法和結果判定等均同實施例五，不再重述。 實施例七、檢測試紙卡結構和實施例二基本相同，不同之處在於以抗AOZ 對醛基苯甲酸衍生物(CPAOZ)單克隆抗體替代抗AOZ單克隆抗體，製備AOZ 衍生物金標抗體和金標物結合墊；用AOZ衍生物-載體蛋白偶聯物替代AOZ-載 體蛋白偶聯物在包被膜上製備檢測線"I ",偶聯AOZ衍生物的載體蛋白為雞 卵清白蛋白OVA。
其它包括檢測樣品、操作方法和結果判定等均同實施例五，不再重述。 實施例八、檢測試紙卡結構和實施例二基本相同，不同之處在於以抗AOZ 對醛基苯甲酸衍生物(CPAOZ)多克隆抗體替代抗AOZ單克隆抗體，製備AOZ — 衍生物金標抗體和金標物結合墊；用AOZ衍生物-載體蛋白偶聯物替代AOZ-載 體蛋白偶聯物在包被膜上製備檢測線"I "，用羊抗兔IgG替代兔抗小鼠IgG抗 體溶液在包被膜上製備對照線"I ",偶聯AOZ衍生物的載體蛋白為雞卵清白 蛋白OVA。
其它包括檢測樣品、操作方法和結果判定等均同實施例五，不再重述。
權利要求1.一種呋喃唑酮代謝物快速檢測試紙條，含有襯板和在襯板上依次銜接的樣品墊、金標結合墊、包被膜、吸水墊，在試紙條的兩端粘貼有保護膜，其特徵是金標結合墊為吸附AOZ金標抗體的玻璃纖維棉，在包被膜上有用AOZ偶聯的載體蛋白溶液印製的直線式隱形檢測線，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG溶液印製的直線式隱形對照線，兩條線平行排列組合為「| |」。
2. —種呋喃唑酮代謝物快速檢測試紙條，含有襯板和在襯板上依次銜接的樣 品墊、金標結合墊、包被膜、吸水墊，在試紙條兩端粘貼有保護膜，其特徵是 金標結合墊為吸附AOZ衍生物金標抗體的玻璃纖維棉，在包被膜上有用AOZ 衍生物偶聯的載體蛋白溶液印製的直線式隱形檢測線，用羊抗或兔抗小鼠IgG、 或羊抗兔IgG溶液印製的直線式隱形對照線，兩條線平行排列組合為"I I "。
3. —種呋喃唑酮代謝物快速檢測試紙卡，含有襯板、樣品墊、金標結合墊、 包被膜和吸水墊組成試紙芯，試紙芯放在特製的塑料卡中，其特徵是金標結 合墊為吸附AOZ金標抗體的玻璃纖維棉，在包被膜上有用AOZ偶聯的載體蛋 白溶液印製的直線式隱形檢測線，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG溶液印 制的直線式隱形對照線，兩條線平行排列組合為"I I "。
4. 一種呋喃唑酮代謝物快速檢測試紙卡，含有襯板、樣品墊、金標結合墊、 包被膜和吸水墊組成試紙芯，試紙芯放在特製的塑料卡中，其特徵是金標結 合墊為吸附AOZ衍生物金標抗體的玻璃纖維棉，在包被膜上有用AOZ衍生物' 偶聯的載體蛋白溶液印製的直線式隱形檢測線，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗 兔IgG溶液印製的直線式隱形對照線，兩條線平行排列組合為"I I "。
5. 根據權利要求1 4中任一項所述的試紙條或試紙卡，其特徵是所述的 襯板為不吸水的韌性材料；所述的樣品墊為玻璃纖維棉，或尼龍膜，或聚偏二 氟乙烯膜，或聚酯膜；所述的吸水墊為吸水能力較強的吸水濾紙或濾油紙；所 述的韌性材料為硬質塑膠條，或不吸水硬紙條；所述的包被膜為硝酸纖維素膜， 或為純纖維素膜，或為羧化纖維素膜；所述的保護膜為不透明的膠膜。
6. 根據權利要求1 4中任一項所述的試紙條或試紙卡，其特徵是所述的. AOZ金標抗體為膠體金標記的AOZ單克隆抗體或多克隆抗體，AOZ衍生物金 標抗體為膠體金標記的AOZ衍生物單克隆抗體或多克隆抗體，所述的偶聯AOZ 或偶聯AOZ衍生物的載體蛋白為牛血清白蛋白BSA，或為雞卵清白蛋白OVA， 或為人血清白蛋白HSA。
7. 根據權利要求1或2所述的試紙條，其特徵是在樣品墊、金標結合墊及 吸水墊上覆蓋有保護膜，樣品墊、金標結合墊對應的保護膜上印製有待測樣品 標記線，該標記線偏向樣品墊一側約0.5cm處。
8. 根據權利要求3或4所述的試紙卡，其特徵是所述的塑料卡由底座和面 蓋嵌合在一起構成，底座上有放試紙芯的凹槽以及與面蓋相結合的卡齒，面蓋 有觀察窗和加樣孔以及與底座相結合的卡齒，觀察窗與試紙芯的包被膜相對應， 加樣孔與試紙芯的樣品墊相對應，在觀察窗旁邊分別印有T和C，T表示檢測線， 在靠近加樣孔側，C表示對照線，在每離加樣孔側。
專利摘要本實用新型公開了一種呋喃唑酮代謝物殘留分析的快速檢測試紙條和試紙卡。試紙條含有襯板、樣品墊、金標結合墊、纖維素膜、吸水墊和保護膜，金標結合墊為吸附呋喃唑酮代謝物AOZ金標抗體或AOZ衍生物金標抗體的玻璃纖維棉，在纖維素膜上有用AOZ-載體蛋白偶聯物或AOZ衍生物-載體蛋白偶聯物印製的直線式隱形檢測線，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG印製的直線式隱形對照線，兩條線平行排列組合為「| |」。將不帶保護膜的試紙芯放在特製的塑料卡中，即得到試紙卡，塑料卡的面板上設有加樣孔和結果顯示窗。本實用新型的試紙條和試紙卡具有特異性強、靈敏度高、簡便、快速、直觀、準確的特點，適用範圍廣，成本低，易推廣應用。
文檔編號G01N21/78GK201004063SQ20062003238
公開日2008年1月9日 申請日期2006年9月1日 優先權日2006年9月1日
發明者張改平, 李學伍, 楊繼飛, 楊豔豔, 王自良, 範國英, 東 趙, 鄧瑞廣 申請人:河南省動物免疫學重點實驗室