能防治家禽呼吸道疾病的免疫球蛋白複合劑的生產技術的製作方法

2023-12-09 05:13:36 2

專利名稱：能防治家禽呼吸道疾病的免疫球蛋白複合劑的生產技術的製作方法
技術領域：
本發明涉及獸藥與飼料添加劑領域，具體是指特效防治家禽呼吸道疾病的 免疫球蛋白與野馬追等複合製劑的生產方法。
本發明特別適用於家禽呼吸道疾病的預防和治療，同時也適用於各種家畜 與寵物等動物呼吸道疾病的防治。
(二)
背景技術：
家禽上呼吸道感染是指家禽上呼吸道受病原微生物侵襲所致的疾病。家禽 (以雞為例)常見呼吸道病主要由病毒、細菌和敗血黴形體等引起，其臨床的 主要特徵為流淚、流鼻涕、咳嗽、氣喘、羅音和呼吸困難、眼腫。常見有傳染 性喉氣管炎和傳染性支氣管炎等，該病多發生於春季的3 6月份，病傳播快， 感染率高，死亡率與環境、管理及雞的個體健康狀況有關， 一般其死亡率一般 在10% 40%，繼發性感染死亡率則更高，產蛋率下降20%左右，甚者下降50 %，此類疾病對雞的生產性能，甚至對養雞業的發展危害極大。
家禽傳染性呼吸道疾病對家禽的生產性能，對家禽業的發展危害極大，目 前較理想的治療藥物尚不多，常用的西藥不但價格貴，而且主要以抗菌素和糖 皮質激素為主，有一定的副作用。據國外學者的一項專題調査統計，南美北部 的養雞戶中，呼吸道疾病的治療支出費用佔雞所有疾病總支出的59%，其中死 亡支出為46.56%，藥物支出佔治療費用的65%。
家禽呼吸道病主要是指家禽呼吸道感染性病症，如家禽慢性呼吸道病、傳 染性支氣管炎、傳染性喉氣管炎、麴黴菌病等。這些常見、多發的傳染性疾病， 嚴重的影響了家禽生長發育，以至造成大批死亡，給家禽生產帶來巨大損失。 防治此類疾病，由於多採用抗生素和化學藥物，且由於應用的不規範、不合理， 經長期應用後，除了藥物毒性較大容易造成藥物中毒以外，還導致抗藥性和藥 物在禽蛋產品中的殘留，被人攝食後，屢有中毒事件發生，以至造成人群慢性 中毒、致畸、致癌等不良後果。對此，國內外均越來越引起高度重視。2001年， 國家農業部頒發的《無公害食品標準》中明確規定減少化學藥品和抗生素的使 用，禁止使用激素或其他有激素作用的物質及催眠鎮靜類藥物等等，因此，以 高效、低毒、低殘留為主攻方向，研製微生物製劑、開發現代中藥獸藥及發展 和充分利用生物技術搞好畜禽疾病防治已成為當前獸藥界的努力方向和熱門話 題。
雞傳染性呼吸道疾病主要有雞傳染性喉氣管炎、傳染性支氣管炎、慢性呼 吸道病、傳染性鼻炎以及禽大腸桿菌病等。目前治療病毒引起的呼吸道疾病尚 沒有特效的西藥，對細菌引起的呼吸道疾病，主要使用抗菌素如高力米先、綠
消炎寶、紅黴素、卡那黴素等，可根據不同的病因，採用不同的治療方法對症 治療。但細菌對抗菌素易產生抗藥性，且抗菌素毒副作用較大。近年來，我國 獸醫工作者根據傳統獸醫學的理論，運用野馬追等中獸藥防治雞呼吸道疾病， 尤其是病毒性呼吸道疾病取得了顯著成績。
野馬追為菊科植物輪葉澤蘭(Eupatorium)多年生草本，分布於華東、華南、 華北、東北及臺灣等地。盛產於江蘇、安徽等地區，其它各省也有分布，藥源 豐富，並可引種野生為家種。中醫藥理論認為野馬追有化痰止咳、清熱解毒、 利尿消腫、降壓的功能，用於感冒、咳嗽多痰、頭疼、扁桃體炎、菌痢、高血 壓。常用於治療慢性氣管炎，支氣管炎，高血壓等疾病。野馬追中含有豐富的 微量元素，主要以Fe、 Al、 Si為主，其次為Sr、 Ti、 Mn、 Ba，再次為Zn、 B、 Pb、 V、 Cu。據報導，中藥中的微量元素常與有機酸、胺基酸、肽等成分絡合， 產生協同作用而增強其療效。另外，儘管微量元素在人的機體內只佔總質量的 萬分之一以下，但它們在整個生命活動中卻發揮了巨大作用。微量元素參與機 體各種酶及活性物質的代謝，維持機體內環境的平衡。經過對野馬追活性篩選 提示乙酸乙酯提取部位為主要活性部位，並從中分離得到6種黃酮類化合物， 結構鑑定為棕矢車菊素、山柰酚、槲皮素、黃芪苷、三葉豆苷、金絲桃苷。
卵黃免疫球蛋白(Egg Yolk Immunoglobulin, IgY)具有增強機體抗菌、免 疫功能，採用生物技術從產蛋雞卵黃中製備特異性多克隆免疫球蛋白，具有成
本低，產量高的特點。IgY能夠凝聚、吞噬和中和細菌及毒素成分；增強免疫系
統功能，預防呼吸道等疾病，促進營養吸收。用於家禽的保健和疾病治療等。
在我國富含免疫球蛋白的原料很豐富，就全國範圍內，每年可得豬血1125 1150 億千克，如果這些原料能被很好地利用起來，將產生巨大的經濟效益和社會效 i。
經過大量試驗，申請者進行了一系列研究，其研究成果通過省級專家鑑定， 達到國內領先水平，其結果如下
1、 按完全隨機設計將200隻5周齡未免疫AA肉公雞按體重隨機分為4個 試驗組和1個對照組，每組40隻雞。試驗組每隻雞每天灌服1.5mL野馬追等中 草藥與免疫球蛋白複合添加劑，對照組灌服1.5mL生理鹽水作安慰劑。按照野 馬追等中草藥與免疫球蛋白的不同配比分為試驗組I、 II、 III和W，配比分別為 1:1， 1:0.8， 1:0.5， 1:0.2。試驗表明，每天灌服1.5mL野馬追等中草藥與免疫球 蛋白複合添加劑，對傳染性支氣管炎的保護率可達到98.5%。而沒有灌服複合添 加劑的肉雞的保護率僅為12.5%。中草藥與免疫球蛋白配合使用後，肉雞對傳染 性支氣管炎的抵抗力有明顯增強。抗體消長規律同時表明這類複合添加劑在肉 雞體內的有效期為18 21d。
2、 按照野馬追等中草藥與免疫球蛋白的不同配比分為試驗組I、 II、 III和 IV，配比分別為l:l, 1:0.8， 1:0.5， 1:0.2。試驗利用中草藥與免疫球蛋白不同配
比對禽大腸桿菌分離株(0422)、大腸桿菌(C84010)、大腸桿菌02型(C84002)、 大腸桿菌O78型(C84008)菌株等進行藥敏試驗。結果表明，4種配比的複合製劑 對各型禽大腸桿菌都有一定的抗菌活性，MIC在15.6g/L至125g/L之間，中草 藥與免疫球蛋白為1:1時禽大腸桿菌敏感性最高，其餘各組對不同血清型的禽大 腸桿菌也有較高的敏感性。試驗證明抗大腸桿菌細胞壁膜的抗體可減弱或制 止大腸桿菌培養平板上該菌的生長。卵黃免疫球蛋白防止大腸桿菌附著於腸細 胞的這類特性，在抗沙門氏菌方面也得到了證實。卵黃免疫球蛋白與中草藥之 間表現出協同作用，各組都有較好的抑菌作用。
3、 將不同配比的野馬追等中草藥與免疫球蛋白複合製劑體外抑制病毒的能 力進行比較。抑病毒實驗採用兩種方法病毒致細胞病變抑制實驗和血凝抑制 實驗，以產生50%細胞病變的最高藥物稀釋度或不產生凝血的最小藥物濃度為 其最小抑病毒的濃度。樣品I對腺病毒7型(AdV7)的最小抑制濃度為1/640， 作用弱於樣品II，而對其它病毒的作用都最強。樣品IV除對腺病毒3型(AdV3) 的最小抑制濃度為1/640，對其餘病毒的抑制作用在4種樣品中最弱。體外抑制 病毒實驗表明選用1:1配比的複合製劑最能有效防治呼吸道疾病。急性上呼吸道 感染有70% 80%由病毒引起，實驗所選7種病毒為呼吸道感染最常見的病毒， 尤其是合胞病毒，對呼吸道病毒感染具有一定代表性。實驗結果表明，中草藥 與免疫球蛋白配比為1:1，對各病毒的抑制效果最強。這也合理解釋了其防治呼 吸道疾病效果最佳。結果也與先前提高肉雞日增重和飼料轉化效率，促進蛋雞 法氏囊發育，有效保護傳染性支氣管炎等實驗一致。
4、 選用體重相近的20周齡伊莎蛋雞200隻，採用單因素隨機試驗，隨機 分為5個組，每個組設5個重複，每個重複8隻雞。研究觀察中草藥野馬追等 中草藥與免疫球蛋白複合製劑對蛋雞傳染性支氣管炎的治療效果。選用20周齡 伊莎蛋雞200隻，隨機分為5組。試驗組I、 II、 m和iv與對照組，試驗組分別 吸入中草藥與免疫球蛋白配比為1:1， 1:0.8， 1:0.5, 1:0.2的複合製劑，連用7 天后觀察對免疫器官指數的影響，攻毒後觀察各組免疫保護效果，並在臨床上 加以觀察利用。試驗結果表明，中草藥與免疫球蛋白複合製劑(配比l:l)能促 進蛋雞法氏囊發育，對傳染性支氣管炎有很好的免疫保護效果。吸入複合製劑 對傳染性支氣管炎有較好的保護作用，保護率在85% 100%範圍內。其中，以 試驗組I (配比1:1)效果最優，保護率達100%。利用複合製劑(配比為1:1) 進行緊急治療，結果對三個雞場發病雞的治癒率分別為98.16%、99.02%、98.22%， 表現出較好的治療效果。
在畜禽呼吸道疾病防治方面，野馬追等中獸藥的研究開發和生物技術的應 用取得了明顯的進展。但大多藥物作用重在治標，呼吸道疾病又多有反覆發作， 往往呈現防不勝防之勢。有些生物製品能增強動物免疫功能，然而目前應用還 不廣。使用野馬追等中獸藥與免疫球蛋白切合治療家禽呼吸道疾病，能達到低
毒、低殘留或無毒無殘留的目的，其禽蛋產品可為綠色和無公害食品，從而保 證了食品的安全性，有利於衝破一些國家對我國禽蛋產品出口的制約，贏得國 際市場，擴大對外貿易。免疫球蛋白與野馬追等中獸藥複合製劑為綠色保健品， 具有無公害、無殘留、無毒副作用、不產生抗藥性等特點。在防治家禽呼吸道 疾病疾病方面，做到治標與治本結合。推廣應用後可減少化學藥品在動物產品 中的殘留，實現禽產品的綠色無害化，提高我國禽產品的綜合競爭力，帶動和 促進農業增效、農民增收，保障人民群眾的食肉安全，市場前景廣闊。有利於 衝破一些國家對我國禽產品出口的制約，贏得國際市場，擴大對外貿易，具有 重要的經濟意義和社會效益。
發明內容
本發明的目的在於，提出防治家禽呼吸道疾病免疫球蛋白與野馬追或野馬 追等中草藥複合製劑的製備方法，在野馬追或野馬追等中草藥基料基礎上添加
特異性卵黃免疫球蛋白而形成的，本發明綜合了中草藥與免疫球蛋白的優點， 是一種新型的抗生素替代品，可以替代抗生素，解決了傳統用抗生素治療家禽 呼吸道疾病產生耐藥性問題，實現家禽產品的綠色無害化。
本發明的工藝如下
l.卵黃免疫球蛋白的製備方法
l.l雞蛋免疫製備選擇健康產蛋母雞，用市購或自製的呼吸道病原微生物 多價疫苗(如雞新城疫一傳染性法氏囊一傳染性支氣管炎三聯油乳劑滅活苗)
對蛋雞胸部肌肉分別多點注射，0.5mL/只，每周免疫一次，三次免疫後，免疫球 蛋白水平達到高效價後，收集雞蛋。
1.2跑黃免疫球蛋白提取方法——乙酸一乙酸鈉緩衝液方法(一) 高免蛋先用清水洗去蛋殼表面的汙物，浸入0.5%新潔爾滅溶液中，浸泡IO 分鐘，再用75%的酒精衝洗，無菌打破蛋殼，倒入消毒好的容器中，用滅菌勺 分離出卵黃放入無菌容器。1體積蛋黃加9體積的乙酸一乙酸鈉緩衝液 (0.05mol/L， pH為5.0)， 二者攪拌時間為15min，混勻，4'C，靜置10h。離心 (1 900r/min, l(TC, 10min)，棄沉澱。收集沉澱，將沉澱溶於25 mmo1/L， NaCI 溶液中使其成為均一的懸浮液，4'C下濾紙過濾除去其中的脂蛋白沉澱，收集濾 液(含有卵黃免疫球蛋白的水溶性蛋白組分)，得到卵黃免疫球蛋白粗提物冷凍真 空乾燥—測定卵黃免疫球蛋白的含量和活性—製成卵黃免疫球蛋白製劑—粉 劑或注射劑
1.3卵黃免疫球蛋白提取方法——水稀釋法(二)
高免蛋先用清水洗去蛋殼表面的汙物，浸入0.5%新潔爾滅溶液中，浸泡IO 分鐘，再用75%的酒精衝洗。用蛋清/蛋黃分離器得到蛋黃液，用無菌水1:9倍 稀釋，經攪拌(15min， 4。C)，靜置(10h),冷凍離心(4°C， 10000rpm， 25min)， 取上清液(WSF)得到卵黃免疫球蛋白粗提液(或經過鹽析(NaCl)，然後預過濾，
分出殘渣，透過液超濾，所得超濾液最後經DEAE離子交換層析(pH7.2磷酸鹽 緩衝液平衡後，並用其作洗脫液，收集蛋白液)分離後得到含高純度IgY液體) 用真空冷凍乾燥機凍幹，得到卵黃免疫球蛋白粉劑，或製成腸溶卵黃免疫球蛋 白膠囊和其他劑型。
1.4卵黃免疫球蛋白提取方法一超濾法(三)
利用水稀釋法得到的粗提卵黃免疫球蛋白液，採用超濾法，分子截留量採 用100kDa，操作壓力差為0.12MPa、進料溫度為30'C， pH5.2，截留液免疫球 蛋白回收率達到91.89%，純度為86%;最後，經DEAE離子交換層析得到高純 度的卵黃免疫球蛋白。
1.5卵黃免疫球蛋白提取工藝(以雞蛋為例)
鮮雞蛋—打蛋取蛋黃—製備蛋黃溶液—鹽析—超濾濃縮—冷凍真空幹 燥—測定卵黃免疫球蛋白的含量和活性—製成卵黃免疫球蛋白製劑—粉劑或 注射劑
2. 血清免疫球蛋白的製備方法
2.1選擇健康動物(如豬、馬、牛、羊等)，用市購或自製的呼吸道病原微 生物多價疫苗(如雞新城疫一傳染性法氏囊一傳染性支氣管炎三聯油乳劑滅活 苗)，採用口服免疫、注射或滴鼻方法，對其進行免疫，劑量每頭0.1 3.0mL。 在免疫三天後進行採血，自然凝固後，採用轉速2000~10000r/min,離心20 30min，取血清，得到血清免疫球蛋白粗提液。
2.2從血液中提取免疫球蛋白。常用的有鹽析法(如多聚磷酸鈉絮凝法、硫酸 銨鹽析法)、有機溶劑沉澱法(如冷乙醇分離法)、有機聚合物沉澱法、變性沉澱 法等。用於大規模生產的方法主要有:冷乙醇分離法、鹽析法、利凡諾法和柱層 析法等，應用較多的為硫酸銨鹽析法和冷乙醇分離法。
2.3提取工藝(以硫酸銨鹽析法為例).-
豬血清—加入硫酸銨飽和溶液進行沉澱—免疫球蛋白(Ig)粗品—加蒸餾水 轉移—超濾—透析—免疫球蛋白純品。工藝條件採用pH7.0 7.2、 40 50°C、 50。/。飽和度的(NH4)2S04溶液，此工藝可以大規模生產免疫球蛋白、安全無毒、 操作方便。既能保證免疫球蛋白的生物活性不受破壞，又能滿足大量生產的需要。
2.4噴霧乾燥方法
將提取的血清免疫球蛋白粗提液，配製成蛋白濃度為10% 20%的溶液，分 別在入風口溫度120 180°C,出風口溫度60 80。C條件下進行噴霧乾燥，真空 包裝，置於冰箱保存。
3. 中草藥提取物製備方法
將野馬追單項中草藥或按照野馬追、板藍根、麻黃、桔梗、穿心蓮、魚腥 草、黃芪、葶藶子、茯苓等中草藥1 10:1:1:1:1:1:1:1:1比例混合，利用微粉碎200710161430.1說明書第6/12頁機粉碎後混合，分別得到野馬追與野馬追等中草藥粉劑；利用超聲波提取中草 藥粉劑有效成分，提取前的浸泡時間是60 90 min。超聲波頻率採用20 40kHz， 超聲波處理30min。過濾後，經過低溫冷凍乾燥機或噴霧乾燥製成粉劑。3.1野馬追等中草藥提取物的製備取已經粉碎好的一定量的野馬追等中草 藥，置於具塞三角瓶中，加入倍體積量的提取溶劑，置於超聲波裝置中，處理 30min後，過濾，濾液減壓濃縮後，在加入5倍體積量的提取溶劑超聲波處理 15min，過濾，濾液減壓濃縮，如此重複2次，合併3次提取物的濃縮物，即得 到該溶劑的超聲波提取的粗提物，置於4t;冰箱保存備用。3.2野馬追等中草藥提取物微膠囊生產技術按照大豆白與麥芽糊精的比例1:2，中草藥提取物添加量為2.2%,均質壓力 為30MPa,噴霧乾燥塔進風口風溫IOO'C，出風風溫70 80'C。經噴霧乾燥制 得中草藥提取物微膠囊。4. 中草藥粉碎採用微粉碎機或超微粉碎機對野馬追與野馬追等中草藥進行粉碎。5. 中草藥與免疫球蛋白複合飼料添加劑製備方法5.1中草藥提取粉劑(或粉體)與免疫球蛋白粉劑(或未提取物) 按照野馬追等中草藥提取粉劑(或粉體)與免疫球蛋白粉劑(或未提取物) 與載體1:0.3:2的比例，先將中草藥提取粉劑(或粉體)與免疫球蛋白粉劑(或 未提取物)加入到混合機混合lmin，再加入載體(加入的比例為0. 1 99%) 混合4min，即得複合飼料添加劑。5.2利用提取的中草藥濾液，濃縮至原液濃度為lg/mL，採用間歇法滅菌。 經過低溫冷凍乾燥機進行製成粉劑；卵黃免疫球蛋白粉劑由疫苗經過蛋雞免疫 製備。中草藥提取粉劑與卵黃免疫球蛋白粉劑複合製備了中草藥免疫球蛋白復 合飼料添加劑。6. 中草藥免疫球蛋白複合製劑製備方法按照野馬追等中草藥提取液與免疫球蛋白提取液1:0.5的比例均勻混合，滅 菌—中草藥免疫球蛋白混合液—真空包裝—注射劑、口服劑或氣霧劑成品 本發明的優點是-1. 通過應用雞呼吸道疾病疫苗(如新城疫一傳染性法氏囊一傳染性支氣管炎 三聯油乳劑滅活苗或其他有關疫苗)免疫蛋雞，製備雞抗雞新城疫一傳染性法 氏囊一傳染性支氣管炎的特異性高免卵黃免疫球蛋白，或免疫豬等哺乳動物獲得特異性血清免疫球蛋白。應用平板式膜超濾技術對卵黃中的免疫球蛋白進行 分離，採用真空冷凍乾燥工藝，製備卵黃免疫球蛋白粉劑。2. 利用超聲波技術對野馬追等中草藥進行了提取，採用真空冷凍乾燥工藝， 製備中草藥卵黃免疫球蛋白飼料添加劑和氣霧劑產品。3. 原料來源廣泛，可再生；工藝流程簡單，條件溫和；整個製備工藝無任何
廢水、廢氣廢液產生，無環境汙染。4.本發明綜合了中草藥與免疫球蛋白的優點，是一種新型的抗生素替代品， 具有增強機體抗菌、免疫功能，可抑制致病性雞新城疫一傳染性法氏囊一傳染 性支氣管炎等致病微生物的生長，是維持家禽健康所必需。具有創新性，可以 替代抗生素使用，有廣闊的市場前景。
具體實施方式
具體實施方式
一原料野馬追等中草藥提取物、卵黃免疫球蛋白、載體1. 野馬追等中草藥提取物製備按照野馬追、板藍根、麻黃、桔梗、穿心蓮、魚腥草、黃芪、葶藶子、茯苓等中草藥10 1:1:1:1: 1:1:1:1:1的比例混合，利用微粉碎機粉碎後混合，再利 用超聲波提取其有效成分，提取前的浸泡時間是60 90 min。超聲波頻率採用 20 40kHz，超聲波處理30min。過濾後，經過低溫冷凍乾燥機或噴霧乾燥製成 粉劑。2. 卵黃免疫球蛋白製備-2.1雞蛋免疫製備選擇健康產蛋母雞，用市購或自製的呼吸道病原微生物 多價疫苗(如雞新城疫一傳染性法氏囊一傳染性支氣管炎三聯油乳劑滅活苗)對蛋雞胸部肌肉分別多點注射，0.5mL/只，每周免疫一次，三次免疫後，免疫球 蛋白水平達到高效價後，收集雞蛋。2.2卵黃免疫球蛋白提取方法(以乙酸一乙酸鈉緩衝液方法為例) 高免蛋先用清水洗去蛋殼表面的汙物，浸入0.5%新潔爾滅溶液中，浸泡IO 分鐘，再用75%的酒精衝洗，無菌打破蛋殼，倒入消毒好的容器中，用滅菌勺 分離出卵黃放入無菌容器。1體積蛋黃加9體積的乙酸一乙酸鈉緩衝液 (0.05mol/L， pH為5.0)， 二者攪拌時間為15min，混勻，4°C，靜置10h。離心 (l卯Or/min， 10°C， 10min)，棄沉澱。收集沉澱，將沉澱溶於25 mmo1/L， NaCI 溶液中使其成為均一的懸浮液，4'C下濾紙過濾除去其中的脂蛋白沉澱，收集濾 液(含有卵黃免疫球蛋白的水溶性蛋白組分一WSF)，得到卵黃免疫球蛋白粗提物 冷凍真空乾燥—測定卵黃免疫球蛋白的含量和活性—製成卵黃免疫球蛋白制 劑3. 免疫球蛋白複合製劑製備3.1按照野馬追等中草藥提取粉劑(或粉體)與卵黃免疫球蛋白粉劑(或卵 黃、血清免疫球蛋白)l:l比例混合，混合時，先將中草藥提取粉劑(或粉體) 與卵黃免疫球蛋白粉劑乾粉(或未提取物)加入到混合機混合lmin，再添加30 80%玉米芯混合4min，即得複合製劑產品。3.2在卵黃免疫球蛋白粉劑(或卵黃、血清免疫球蛋白)基礎上，添加經過 粉碎、微粉碎、超微粉碎，或粉碎後的中草藥提取物或其原料混合後的粉體l 99%，製備免疫球蛋白複合製劑；3.3在經過粉碎、微粉碎、超微粉碎，或粉碎後的中草藥提取物或其原料粉 體的基礎上，添加卵黃免疫球蛋白粉劑(或卵黃、血清免疫球蛋白)1 99%， 製備免疫球蛋白複合製劑；3.4按照野馬追等中草藥提取液與卵黃免疫球蛋白提取液1:1的比例混合， 採用間歇殺菌，裝瓶，製備製成複合氣霧劑。3.5利用超聲波提取中草藥有效成分，合併濾液，濃縮至原液濃度為lg/mL。 將製得的中草藥液體提取物與液體卵黃免疫球蛋白按照1:1混合—中草藥免疫 球蛋白液體—間歇滅菌—測定卵黃免疫球蛋白的含量和活性—進行調配—裝瓶 處理後—成品(或製成腸溶卵黃免疫球蛋白膠囊或其他劑型)具體實施方式
二-原料野馬追等中草藥提取物、卵黃、載體1. 野馬追等中草藥提取物製備按照野馬追、板藍根、麻黃、桔梗、穿心蓮、魚腥草、黃芪、葶藶子、茯苓等中草藥10 1:1:I:1:I:1:1:1:1的比例混合， 利用微粉碎機粉碎後混合，再利用超聲波提取其有效成分，提取前的浸泡時間 是60 90min。超聲波頻率採用20 40kHz，超聲波處理30min。過濾後，經過 低溫冷凍乾燥機或噴霧乾燥製成粉劑。2. 卵黃製備取新鮮高免蛋消毒後，人工打蛋取卵黃或通過蛋清/蛋黃分離器得到蛋黃液。3. 中草藥與卵黃複合製劑製備-.按照野馬追等中草藥提取物與卵黃重量比1:1的比例進行混合後—添加 20 80%脫脂米糠與0.5%抗氧化劑—通過混合機混勻—滅菌—真空包裝—野馬追中草藥免疫球蛋白粉劑產品。
具體實施方式
三原料中草藥提取物、卵黃卵清、載體1. 1.野馬追等中草藥提取物製備按照野馬追、板藍根、麻黃、桔梗、穿心蓮、魚腥草、黃貧、葶藶子、茯苓等中草藥10 1:1:1:1: 1:1:1:1:1的比例混合， 利用微粉碎機粉碎後混合，利用微粉碎粉碎後混合，再利用超聲波提取其有效 成分，提取前的浸泡時間是60 90 min。超聲波頻率採用20 40kHz，超聲波 處理30min。過濾後，經過低溫冷凍乾燥機或噴霧乾燥製成粉劑。2. 卵黃卵清製備取新鮮高免蛋消毒後，打蛋取卵黃蛋清，除去蛋殼或通過蛋清/蛋黃分離器 得到蛋黃液。3. 中草藥卵黃卵清製劑製備將製得的中草藥提取物與卵黃蛋清按照1: 1的比例進行配比—添加20 60 %白碳黑，通過混合機混勻—滅菌—中草藥免疫球蛋白粉劑—測定卵黃免疫球蛋白的含量和活性—真空包裝—成品具體實施方式
四-原料中草藥微(超微)粉碎、卵黃免疫球蛋白、載體1. 中草藥微(超微)粉碎按照野馬追、板藍根、麻黃、桔梗、穿心蓮、魚腥草、黃芪、葶藶子、茯苓等中草藥10 1:1:1:1: 1:1:1:1:1的比例混合，利用微粉碎機粉碎後混合，，利 用微粉碎粉碎後混合，製備中草藥粉劑。2. 卵黃免疫球蛋白製備(採用水稀釋法)-高免蛋先用清水洗去蛋殼表面的汙物，浸入0.5%新潔爾滅溶液中，浸泡IO 分鐘，再用75%的酒精衝洗，無菌打破蛋殼。分離蛋清與卵黃，卵黃加9倍無 菌水稀釋，用HCI調節pH5.2稀釋液混合後，於4'C冷藏5h，在4°C 1000g條件 下離心lh，上清液加入飽和硫酸銨及硫酸鈉鹽析沉澱，離心後，經過低溫冷凍 乾燥機或噴霧乾燥，即得粗提卵黃免疫球蛋白。3. 野馬追等中草藥免疫球蛋白製劑製備將製得的中草藥提取物與卵黃免疫球蛋白(或血清免疫球蛋白)按照1:1的 比例進行配比—添加20 60%白碳黑，通過混合機混勻—滅菌—中草藥免疫球 蛋白粉劑—真空包裝—成品具體實施方式
五原料野馬追等中草藥微(超微)粉碎、卵黃、載體1. 野馬追等中草藥提取物製備按照野馬追、板藍根、麻黃、桔梗、穿心蓮、魚腥草、黃芪、葶藶子、茯苓等中草藥10 1:1:1:1: 1:1:1:1:1的比例混合，利用 微粉碎機粉碎後，高速混合5min,製成野馬追等中草藥粉劑。2. 卵黃製備取新鮮高免蛋消毒後，人工打蛋取卵黃或通過蛋清/蛋黃分離器得到蛋黃液。3. 野馬追等中草藥與卵黃複合製劑製備按照中草藥提取物與卵黃重量比l: 1的比例進行混合後—添加20 80%脫 脂米糠與0.5%抗氧化劑—通過混合機混勻—滅菌—真空包裝—野馬追等中草藥 免疫球蛋白粉劑產品。
具體實施方式
六-原料野馬追等中草藥微(超微)粉碎、卵黃卵清、載體按照野馬追、板藍根、麻黃、桔梗、穿心蓮、魚腥草、黃芪、葶藶子、茯零等中草藥10 1:1:1:1: 1:1:1:1:1的比例混合，利用超微粉碎或微粉碎機粉碎後 混合，製得中草藥粉劑。 2.卵黃卵清製備
取新鮮高免蛋消毒後，打蛋取卵黃蛋清，除去蛋殼或通過蛋清/蛋黃分離器 得到蛋黃液。3.野馬追等中草藥卵黃卵清製劑製備-將製得的野馬追等中草藥粉劑與卵黃蛋清按照1:1的比例進行配比—添加 20 60%粉碎的大豆皮，通過混合機混勻—滅菌4 5分鐘—中草藥免疫球蛋白 粉劑—真空包裝—成品具體實施方式
七原料野馬追提取物、卵黃免疫球蛋白(或血清免疫球蛋白)、載體1. 野馬追提取物製備將野馬追烘乾後，用微粉碎機粉碎後混合，再利用超聲波提取其有效成分，提取前的浸泡時間是60 90 min。超聲波頻率採用20 40kHz，超聲波處理 30min。過濾後，經過低溫冷凍乾燥機或噴霧乾燥製成粉劑。2. 卵黃免疫球蛋白製備2.1雞蛋免疫製備選擇健康產蛋母雞，用市購或自製的呼吸道病原微生物多價疫苗(如雞新城疫一傳染性法氏囊一傳染性支氣管炎三聯油乳劑滅活苗)對蛋雞胸部肌肉分別多點注射，0.5mL/只，每周免疫一次，三次免疫後，免疫球 蛋白水平達到高效價後，收集雞蛋。2.2卵黃免疫球蛋白提取方法(以乙酸一乙酸鈉緩衝液方法為例) 高免蛋先用清水洗去蛋殼表面的汙物，浸入0.5%新潔爾滅溶液中，浸泡IO 分鐘，再用75%的酒精衝洗，無菌打破蛋殼，倒入消毒好的容器中，用滅菌勺 分離出卵黃放入無菌容器。1體積蛋黃加9體積的乙酸一乙酸鈉緩衝液 (0.05mol/L， pH為5.0), 二者攪拌時間為15min，混勻，4'C，靜置10h。離心 (1 900r/min， l(TC， 10 min)，棄沉澱。收集沉澱，將沉澱溶於25 mmo1/L， NaCI 溶液中使其成為均一的懸浮液，4'C下濾紙過濾除去其中的脂蛋白沉澱，收集濾 液(含有卵黃免疫球蛋白的水溶性蛋白組分一WSF)，得到卵黃免疫球蛋白粗提物 冷凍真空乾燥一測定卵黃免疫球蛋白的含量和活性一製成卵黃免疫球蛋白制 劑。3. 野馬追免疫球蛋白製劑製備3.1按照野馬追提取粉劑(或粉體)與卵黃免疫球蛋白(或血清免疫球蛋白) 粉劑乾粉1:1比例混合，混合時，先將野馬追提取粉劑(或粉體)與卵黃免疫球 蛋白粉劑乾粉(或未提取物)加入到混合機混合lmin，再添加30 80%玉米芯 混合4min，即得複合製劑產品。3.2按照野馬追提取液與卵黃免疫球蛋白(或血清免疫球蛋白)提取液1:1 的比例混合，採用間歇殺菌，裝瓶，製備製成複合氣霧劑。3.3利用超聲波提取野馬追有效成分，合併濾液，濃縮至原液濃度為lg/mL。 將製得的野馬追提取物與液體卵黃免疫球蛋白(或血清免疫球蛋白)按照1:1混
合—中草藥免疫球蛋白液體—間歇滅菌—測定卵黃免疫球蛋白(或血清免疫球 蛋白)的含量和活性—進行調配—裝瓶處理後—成品(或製成腸溶卵黃免疫球 蛋白膠囊或其他劑型)
具體實施方式
八
原料野馬追、卵黃、載體
1. 野馬追提取物製備用微粉碎機將烘乾的野馬追粉碎後，再利用超聲波提取其有效成分，提取前的浸泡時間是60 90 min。超聲波頻率採用20 40kHz， 超聲波處理30min。過濾後，經過低溫冷凍乾燥機或噴霧乾燥製成粉劑。
2. 卵黃製備取新鮮高免蛋消毒後，人工打蛋取卵黃或通過蛋清/蛋黃分離器得到蛋黃液。
3. 野馬追與卵黃複合製劑製備按照野馬追提取物與卵黃重量比1:1的比例進行混合後—添加20 80%脫 脂米糠與0.5%抗氧化劑—通過混合機混勻—滅菌—真空包裝—野馬追中草藥免 疫球蛋白粉劑產品。
具體實施方式
九
原料野馬追提取物、卵黃卵清、載體1. 1.野馬追提取物製備將野馬追烘乾後，用微粉碎機粉碎後混合，再利用超聲波提取其有效成分，提取前的浸泡時間是60 90 min。超聲波頻率採用 20 40kHz，超聲波處理30min。過濾後，經過低溫冷凍乾燥機或噴霧乾燥製成
2. 卵黃卵清製備取新鮮高免蛋消毒後，打蛋取卵黃蛋清，除去蛋殼或通過蛋清/蛋黃分離器 得到蛋黃液。
3. 野馬追卵黃卵清製劑製備將製得的野馬追提取物與卵黃蛋清按照1:1的比例進行配比—添加20 60 %白碳黑，通過混合機混勻—滅菌—野馬追免疫球蛋白粉劑—測定卵黃免疫球 蛋白的含量和活性—真空包裝—成品
具體實施方式
十
原料野馬追微(超微)粉碎、卵黃免疫球蛋白(或血清免疫球蛋白)、載體
1. 野馬追微(超微)粉碎將野馬追烘乾後，用微粉碎機粉碎後混合，製備野馬追粉劑。
2. 卵黃免疫球蛋白製備(採用水稀釋法)高免蛋先用清水洗去蛋殼表面的汙物，浸入0.5%新潔爾滅溶液中，浸泡IO 分鐘，再用75%的酒精衝洗，無菌打破蛋殼。分離蛋清與卵黃，卵黃加9倍無 菌水稀釋，用1^1調節口1"15.2稀釋液混合後，於4t:冷藏5h，在4'C1000g條件 下離心lh，上清液加入飽和硫酸銨及硫酸鈉鹽析沉澱，離心後，經過低溫冷凍 乾燥機或噴霧乾燥，即得粗提卵黃免疫球蛋白。 3.野馬追等中草藥免疫球蛋白製劑製備將製得的野馬追提取物與卵黃免疫球蛋白(或血清免疫球蛋白)按照1:1的 比例進行配比—添加20 60%白碳黑，通過混合機混勻—滅菌—中草藥免疫球 蛋白粉劑—真空包裝—成品具體實施方式
十一-原料野馬追微(超微)粉碎、卵黃、載體1. 野馬追微(超微)粉碎將野馬追烘乾後，用微粉碎機粉碎後混合，製備野馬追粉劑。2. 卵黃製備取新鮮高免蛋消毒後，人工打蛋取卵黃或通過蛋清/蛋黃分離器得到蛋黃液。3. 野馬追與卵黃複合製劑製備按照中草藥與卵黃重量比l:l的比例進行混合後—添加20 80%脫脂米糠 與0.5%抗氧化劑—通過混合機混勻—滅菌—真空包裝—野馬追免疫球蛋白粉劑產品。
具體實施方式
十二原料野馬追微(超微)粉碎、卵黃卵清、載體1. 野馬追微(超微)粉碎將野馬追烘乾後，用微粉碎機粉碎後混合，製備野馬追粉劑。2. 卵黃卵清製備取新鮮高免蛋消毒後，打蛋取卵黃蛋清，除去蛋殼或通過蛋清/蛋黃分離器 得到蛋黃液。3. 野馬追卵黃卵清製劑製備-將製得的野馬追粉劑與卵黃蛋清按照1:1的比例進行配比—添加20 60% 粉碎的大豆皮，通過混合機混勻—滅菌4 5分鐘—野馬追免疫球蛋白粉劑—真 空包裝—成品。


圖1是免疫球蛋白提取純化製備工藝流程。其工藝流程圖說明如下取新鮮高免蛋消毒後，通過蛋清/蛋黃分離器得到 蛋黃液，乙酸/乙酸鈉緩衝液(0.05mol/L， pH5.20) l:9倍稀釋,經攪拌(15min， 4'C)，靜置(10h),冷凍離心(4'C， 10，000g, 25min),取上清液(WSF)，鹽 析(NaCl)，然後預過濾，分出殘渣，透過液超濾，所得超濾液最後經DEAE離 子交換層析(pH7.2磷酸鹽緩衝液平衡後，並用其作洗脫液，收集蛋白液)分離後 得到高純度IgY。
權利要求
1、防治家禽呼吸道疾病免疫球蛋白複合製劑是在特異性免疫球蛋白基礎上添加基料而形成的，其特徵在於，所謂的基料是以野馬追或按照野馬追、板藍根、麻黃、桔梗、穿心蓮、魚腥草、黃芪、葶藶子、茯苓等中的2～9種原料的提取物或其粉體調配混勻而成的；所謂的特異性免疫球蛋白是利用市購或自製的呼吸道病原微生物多價疫苗(如雞新城疫—傳染性法氏囊—傳染性支氣管炎三聯油乳劑滅活苗)等製備的單價或多加滅活疫苗免疫蛋雞，其免疫雞蛋再經過消毒、分離純化工藝製備而成的，或由上述疫苗免疫哺乳動物如家禽、兔等製備的血清免疫球蛋白；經過粉碎(或提取)的中草藥與特異性免疫球蛋白(或卵黃、卵黃卵清)按照一定配比與載體複合混勻而成的固體或液體製劑。採用口服、注射、噴霧或伴飼料等方法給藥，對家禽呼吸道疾病有特效，治癒率達到91％以上，提高家禽生長速度8％以上。
2、 根據權利要求1所述的防治家禽呼吸道疾病免疫球蛋白複合製劑的製備方 法，其特徵在於，複合製劑為粉劑、水劑、氣霧劑、顆粒劑或其他劑型，可 以做飼料添加劑和各種藥劑。
3、 根據權利要求1所述的防治冢禽呼吸道疾病中草藥免疫球蛋白複合製劑的制 備方法，其特徵在於，中草藥基料採用粉碎、微粉碎、超微粉碎，或粉碎後 的提取物或其原料混合後的粉體，在複合製劑中加入的比例為1 99%。
4、 根據權利要求1所述的防治家禽呼吸道疾病免疫球蛋白複合製劑的製備方 法，其特徵在於，特異性卵黃免疫球蛋白為提取，或特異免疫雞蛋經過消毒 後直接打蛋，利用蛋清蛋黃或只用蛋黃，再與權利3中的中草藥混合，在復 合製劑中加入的比例為0. 1 99% 。
5、 根據權利要求1所述的防治家禽呼吸道疾病免疫球蛋白複合製劑的製備方 法，其特徵在於，利用家禽呼吸道疾病致病性微生物等製備的單價或多加滅 活疫苗免疫蛋雞，其免疫雞蛋採用分離純化工藝製備而成的，再與權利3中 的中草藥混合，在複合製劑中加入的比例為0. 1 99% 。
6、 根據權利要求1所述的防治家禽呼吸道疾病免疫球蛋白複合製劑的製備方 法，其特徵在於，採用口服、注射、噴霧、伴料等方法給藥，對家禽呼吸道 疾病有特效，也用於各種家畜與寵物等動物呼吸道疾病的防治。
全文摘要
本發明涉及獸藥與飼料添加劑領域，具體是指特效防治家禽呼吸道疾病的免疫球蛋白複合製劑的生產方法。其特徵是用特異性免疫球蛋白或含有特異性免疫球蛋白的未提取物按一定配比添加部分載體或填充物等混勻而成。本發明綜合了免疫球蛋白與載體或填充物的優點，形成了新型的抗生素替代品，達到標本兼治，可以加快家禽呼吸道疾病的康復，達到防病與治病的目的，同時還降低了成本。是一種安全、無激素的綠色產品，對家禽呼吸道疾病有特效，治癒率達到98％以上，提高家禽生長速度8％以上。本發明特別適用於家禽呼吸道疾病的預防和治療，同時也適用於各種家畜與寵物等動物呼吸道疾病的防治。
文檔編號A61P31/00GK101391102SQ200710161430
公開日2009年3月25日 申請日期2007年9月23日 優先權日2007年9月23日
發明者方希修, 王冬梅, 王壽軒 申請人:方希修;王壽軒;王冬梅