測定作為腎病診斷標記物的嗜中性粒細胞明膠酶相關性脂籠蛋白(ngal)的製作方法

2023-12-09 04:34:46

專利名稱：：測定作為腎病診斷標記物的嗜中性粒細胞明膠酶相關性脂籠蛋白(ngal)的製作方法
技術領域：
：本發明涉及通過對體液中人嗜中性粒細胞明膠酶相關性脂籠蛋白(neutrophilgelatinase-associatedlipocalin,NGAL)的測定來"^斷並監測人的疾病的方法，所述人嗜中性粒細胞明膠酶相關性脂籠蛋白的異常濃度表示疾病或一組疾病，在這種情況下為導致腎功能下降的腎病，包括由缺血性損傷(由於對腎臟的血液供給受損)、接觸腎毒劑或對移植腎臟的排斥所導致的那些。本發明的方法特別可用於早期檢測腎臟對缺血性損傷的反應，缺血性損傷的臨床或病理結果通常是急性腎衰竭(ARF)、急性腎小管壞死(ATN)或急性腎小管間質性腎病(ATIN),並也可用於監測腎病的病程，包括對治療性措施的反應。
背景技術：
：對於可導致ARF、ATN或ATIN的腎臟缺血性損傷的檢測迄今依賴於臨床症狀，如少尿和液體瀦留，結合血和尿的化學測試結杲，這些結果顯示出鈉排洩低、血肌酸酐和尿素水平已升高並且正在升高，以及如果測量的話，還有肌酸酐清除率低。這些症狀表示存在有已確定的病症。也已經分析了腎小管損傷的多種尿標記物。在這些標記物中，od-微球蛋白、p2-微球蛋白(PendersandDelangheJR,2004)和N-乙醯基-(3-D-葡糖胺酶(NAG)(Kotanko等，2000)在已確定的ATN的病例中升高，但只在實驗動物的缺血或毒性損傷後4或5天後才出現。腎損傷分子-1(KIM-1)在患ATN的患者的尿中也升高，但其時程(儘管很可能早)卻沒有在人類患者中確立(Han等，2002)。富含半胱氨酸的蛋白質61(CYR61)在實驗動物的缺血性損傷後6到9小時在尿中出現峰(Muramatsu等，2002)。然而，它在人中的水平仍未知。已經被研究過的其它標記物包括叢生蛋白(clusterin)(Aulitzky等，992)和脂籠蛋白型前列腺素D合酶(L-PGDS)(Tsuchida等，2004);它們對於早期診斷或預測ATN的有用性仍是不清楚的。由於腎臟接觸到缺血或腎毒劑後這些標記物分子在尿中出現的時程通常是緩慢的，它們未納入診斷由這些傷害所導致的早期或即將發生的腎病的一般應用中。嗜中性粒細胞明膠酶相關性脂籠蛋白(NGAL)也稱作嗜中性粒細胞脂籠蛋白(NL;對於人嗜中性粒細胞脂籠蛋白為HNL),脂籠蛋白2(LCN2),25-kDa的a2-微球蛋白相關性蛋白(在大鼠中)或24P3(在小鼠中)。在大鼠中，它也被稱為neu相關性脂籠蛋白(NRL),因為它的基因在由neu(HER2/c-erbB-2)癌基因引發的乳房腫瘤中過表達(StoeszandGould,1995)。NGAL是最早從多形核白細胞的顆粒中分離的2S-kDa糖蛋白(Triebel等，Kjeldsen等，l"3)。它含有二硫鍵，並且形成一定比例的二聚體和比例較小的三聚體。它與也稱作基質金屬蛋白酶9(MMP-9)或明膠酶B的92-kDa人嗜中性粒細胞IV型膠原酶相關，或者呈形成表觀kDa115的複合體的單體(Monier等，2000;Yan等，2001),或者呈形成表觀kDa125的複合體的二聚體(Yan等，2001)。已經多種癌症(包括前列腺癌、膀胱癌、腎癌和乳腺癌)患者的尿中鑑定出這些複合體。NGAL最初被披露為嗜中性粒細胞活化的標記物，在侵入微生物尤其是化膿菌造成嗜中性粒細胞脫顆粒以及顆粒蛋白的胞吐作用時被釋放到血中。同樣地，在來自人的血漿或血清樣本中測量到NGAL水平升高被認為是表示該個體患有炎症，特別是由細菌感染導致的炎症(Venge,2000;美國專利6,136,526;PCT申請W095/29404)。在這方面，但與它號稱具體來自嗜中性粒細胞相牴觸，NGAL(24P3)在小鼠中被鑑定為1型急性期蛋白，其表達主要位於急性期反應中的肝臟(LiuandNilsen-Hamilton,1995)。美國專利申請2004/0219603描述了NGAL作為用於檢測腎小管細胞損傷早期發作的尿生物標記物的用途。然而，它沒有描述在考察NGAL水平升高的原因時，是否或如何將腎小管細胞損傷與全身性炎症或細菌感染區分開。發明概述現在已經驚異發現，由於腎損傷導致的NGAL水平通常高於由不影響腎臟功能的炎症、感染或癌性病症導致的NGAL水平。這使得建立用於診斷和/或監測患者的腎病的、將腎病和不影響腎臟的其他病症區分開來的方法成為可能。腎病指整個腎或組成腎的一種或多種細胞結構的、超過了維持正常健康狀態的調節機制的任何功能改變，包括此種改變的結構和超微結構的相關改變。這種病症的非窮舉的例子包括與腎臟缺血有關的病症，如急性腎小管壞死(ATN)或急性腎小管間質性腎炎(ATIN),還包括無論任何病因的急性腎衰竭(ARF)或慢性腎衰竭(CRF),無論任何病因的急性和慢性的腎小球腎炎，由於尿路梗阻導致的腎病，由於高血壓導致的腎病，與妊娠的先兆子癇或毒血症有關的腎病，對移植腎的排斥或復發性疾病，以及腎臟的先天的和肺瘤疾病。因此，本發明提供了用於診斷和/或監測人的腎損傷的方法，包括測量在從患者取得的體液樣本中，優選尿中人嗜中性粒細胞明膠酶相關性脂籠蛋白(NGAL)的水平。如果NGAL水平高於由不必然影響腎臟功能的其他病症如炎症或感染性病症或癌症所導致的特定的升高得較少的NGAL水平，則升高的NGAL水平表示腎損傷。因此，第一方面，本發明涉及診斷、監測或測定人類腎病可能性的方法，其中所述方法區分腎病和不影響腎臟的其它病症，所述方法包含如下步驟i)測定在來自人的體液樣本中的人NGAL濃度，ii)比較所述濃度和預定的截斷值，所述截斷值經選擇以排除與不影響腎臟的病症相關的NGAL的較低濃度，其中在所述截斷值以上的濃度表示有腎病。進一步地，本發明在一個實施方案中允許區分腎病的不同程度。因此，例如在一個實施方案中，本發明的方法包括將所述濃度與第二個截斷值比較的其它步驟，所述第二個截斷值經選擇來排除NGAL的較低濃度，所述NGAL的較低濃度與不可能需要通過透析治療病人的較輕程度的腎病相關，其中在該截斷值以上的濃度表示是可能需要通過透析治療的較嚴重的腎病。對於可能會導致ARF、ATN或ATIN的腎損傷的其它標記物分子的分析未納入常規臨床使用，因為這些其它標記物在腎病發病過程中於尿中出現得過遲，以致不可用於提醒大夫病症的發病或指導預防性或治療性的措施。這個問題已經被本發明解決，本發明使用了對於在人樣本如尿中NGAL的分析來檢測腎病的發病。動物研究提示，這是最早出現在尿中的腎損害標記物，其在尿中的水平在發生損害後2或3個小時內升高。從而，本發明對於尿NGAL的分析提供了檢測可能導致ARF、ATN或ATIN的腎損傷的方法，該方法將其與其他病症區分，並且，如果發展速度允許的話，啟動合適的措施來逆轉此過程。優選通過免疫化學方法來測定NGAL水平。這種方法的例子包括但絕不限於夾心法ELISA(酶聯免疫吸附測定)，側向流動法，或浸棍法(dipstick)。圖1最大尿NGAL值對於醫院重症監護病房收住的60名成年患者的腎臟患病診斷的受試者工作特徵(receiveroperatingcharacteristics)(ROC)曲線。只有可用其它數據被分為腎臟患病或腎臟不患病的患者被包括在內。圖2最大血漿NGAL值對於與圖1相同的患者的腎臟患病診斷的受試者工作特徵(ROC)曲線。圖3最大尿NGAL值對於32名成年患者的透析需要診斷的受試者工作特徵(ROC)曲線，所述患者為醫院重症監護病房接收並且臨床診斷出腎臟患病。圖4由於腹主動脈動脈瘤破裂而急性手術的老年男性患者的尿NGAL和血漿肌酸酐值的時程。圖5罹患不影響腎臟功能的膿毒病的女性患者的尿NGAL和血漿肌酸酐值的時程。該圖顯示了用於診斷腎臟患病的尿NGAL的截斷水平(329ng/mL)以及女性血漿肌酸酐正常值的上限(0.088mmol/L)。
發明內容我們已經發現人嗜中性粒細胞明膠酶相關性脂籠蛋白(NGAL)在人尿樣本中的濃度只適度受到感染性或炎症性狀態的影響。然而，NGAL水平在由於缺血性損傷導致的腎病中明顯升高，並且NGAL的升高在ATN中尤其高。進一步地，我們現在發現NGAL的血清或血漿水平不必然反映感染性或炎症性狀態，甚至在血嗜中性粒細胞計數極低時，如在白血病中可能出現的那樣或作為治療白血病的結果，它也會升高。事實上，在分析隨機選擇的重病患者的血和尿的點樣本(spotsample)時，人血清或血漿的NGAL濃度與尿NGAL濃度存在緊密相關，但這些水平與外周血嗜中性粒細胞計數或C-反應蛋白(一種常用作炎症標記物的急性期蛋白)的濃度之間的相關性很差。因此，不受具體理論所限，可以假設NGAL由腎臟響應缺血以及能夠刺激腎NGAL表達的其他影響而產生，並且不僅大量釋放到尿中，而且也釋放到血液中，因此勝於如美國專利6,136,526所述的將血清或血漿中NGAL的測定作為炎症或細菌感染標記物的應用。因此，本發明涉及測定體液樣本中的NGAL以作為腎病的診斷標記物，所述樣本優選已經去除了任何嗜中性粒細胞的人尿，所述腎病特別是由於腎臟缺血或腎毒劑導致的那些。在本發明中，為使NGAL濃度特異性表示腎病，它必須超過設定的截斷值以排除那些可能由於不引起腎損傷的感染或炎性狀態或癌所造成的較低NGAL濃度。在一個實施方案中，本發明的方法包括測定待診斷個體的尿樣本中人類NGAL濃度的步驟，所述尿樣本優選被離心以去除任何嗜中性粒細胞，並將所測濃度與選定的截斷值比較，所述截斷值被確定超過了在無腎病、但可能或者明顯健康或者患有其他病症(包括炎性病症、細菌感染或癌)的人中發現的尿濃度。如果所測的NGAL濃度超過了所述截斷水平，這表示該人患有腎損傷並可能罹患或已經罹患ARN、ATN或ATIN。低於截斷水平的NGAL尿水平不能以可接受程度的特異性診斷腎損傷，因為這個水平可見於健康個體或患有炎性、感染性或癌性病症的那些個體，所述截斷水平優選在250ng/mL或更高的水平，如在250ng/mL和525ng/mL之間的^f直，如275ng/mL，或300ng/mL,或325ng/mL,或350ng/mL,或375ng/mL,或400ng/mL,或425ng/mL,或450ng/mL，或475ng/mL,或500ng/mL。在另一個實施方案中，所用的截斷值是lpg/mL的值或更高的值。優選地，尿截斷值的陽性預測值是80%或更高，如85%或更高，例如90%或更高。或者，或另外地，尿截斷的陰性預測值優選是80%或更高，如85%或更高,例如90%或更高。在另一個實施方案中，本發明包括測定在來自待診斷個體的血漿或血清樣本中人類NGAL的濃度的步驟，以及將所測濃度與所選截斷值進行比較，該截斷值被確定超過了在無腎病、但可能或者明顯健康或者患有其他病症(包括炎性病症、細菌感染或癌)的人中發現的血漿或血清的濃度。如果所測的NGAL濃度超過了截斷水平，這表示該人患有腎損傷並可能罹患或已經罹患ARN、ATN或ATIN。在血漿或血清中的NGAL濃度的截斷水平與尿中類似，它優選在250ng/mL或更高的水平，例如300ng/mL或更高值，或在250ng/mL和525ng/mL之間的值，如275ng/mL,或300ng/mL,或325ng/mL，或350ng/mL，或375ng/mL,或400ng/mL，或425ng/mL,或450ng/mL，或475ng/mL，或500ng/mL。優選地，血漿截斷值的陽性預測值是80%或更高，如85%或更高，例如卯％或更高。或者，或另外地，所選的血漿截斷值的陰性預測值優選是80%或更高，如85%或更高，例如卯％或更高。本發明的另一個方面為所述方法可用於區分嚴重腎損害和不太嚴重的腎損害，所述嚴重腎損害可能需要一些形式的透析、通常造成很高的尿NGAL水平，而所述不太嚴重的腎損害可能僅偶爾需要透析、通常使尿NGAL升高得較少。因此，第二個較高截斷水平(低於該第二個較高截斷水平的尿NGAL水平不預示需要透析、但診斷為較輕程度的腎損傷)優選為在1000ng/mL和3000ng/mL之間的水平，如1250ng/mL，或1500ng/mL，或1750ng/mL，或2000ng/mL,或2250ng/mL,或2500ng/mL,或2750ng/mL。優選地，較高截斷值的陽性預測值是80%或更高，如85%或更高，例如90%或更高。或者，或另外地，較高截斷值的陰性預測值優選是70%或更高。本發明的另一個方面是所述方法可用於檢測患者腎臟患病的發作，所述患者正在接受對另一種疾病的觀察和/或治療，所述另一種疾病可能自身與NGAL的體液水平升高有關或無關，並且腎臟患病是可能的併發症。在這種情況下，可以每天或以較短的間隔監測與患者的潛在病症有關的尿、血漿或血清NGAL濃度，並且尿、血漿或血清NGAL濃度升高超過之前的水平表示腎臟患病的發作。在這些情況下，表示腎臟患病發作的NGAL濃度升高的幅度優選是50ng/mL或更高，如100ng/mL或更高，例如150ng/mL或更高，如200ng/mL或更高，例如300ng/mL或更高，如400ng/mL或更高，例如500ng/mL或更高。本發明的另一個方面是所述方法可用於在腎臟患病的天然進展過程中、和在對治療措施的應答中監測使NGAL水平升高的腎臟患病的病程。在這些情況下，只要任何復發的炎症性、感染性或癌性病症在監測階段保持相對穩定，NGAL水平的改變就反映腎損傷或再生的狀態。取體液樣本來監測的間隔可以短，從而提供腎損傷的最早的可能的指示，並且可以早期啟動治療措施。監測體液中的NGAL水平以檢測腎臟患病優選以不超過24個小時的間隔來進行，更優選更短的間隔，短至不超過3個小時的時間段，或者例如如果知道已出現損害(例如在手術過程中)甚至更短的間隔。對體液樣本如尿樣本中人NGAL的測定，可以用任何提供滿意的分析特異性、靈敏度和精確度的方法來進行。優選的方法是結合測定，所述結合測定使用對人類NGAL特異的一種或多種結合分子。這些結合分子包括但不限於抗NGAL的多克隆或單克隆抗體或通過其他途徑產生的特異性NGAL結合分子。在優選的方法中，使用抗重組人類NGAL的單克隆抗體。一種抗體與固相支持物相連來從樣本(如尿樣本)捕捉NGAL,而其它抗體連接於標記如可用本領域技術人員已知的很多種方法中的任一種來檢測的染料複合物、或生物素或酶。固相支持物可以是，例如用於酶聯免疫吸附測定(ELISA)的聚苯乙烯或聚氯乙烯表面，或膠乳(聚苯乙烯)顆粒，或由壓縮的聚乙烯顆粒組成的過濾玻璃料(filterfrit)，或多孔硝化纖維素基質，或事實上是在免疫化學分析中使用的任何合適的支持物。根據本發明測定人尿樣本中的NGAL的優選方法，包括浸棍、側向流動或微型柱(minicolumn)檢測，這些檢測可以對樣本作迅速、接近患者的分析。然而，如本領域^^術人員在上述內容公開後的理解，其它測定NGAL的方式也可使用。在優選的實施方案中，本發明的方法不包括在人或動物身體上實施的手術的、治療的或診斷的步驟。如下的非限制性實施例被提供用來進一步舉例說明本發明。實施例實施例1:NGAL浸棍測試由聚苯乙烯表面組成的浸棍分析區用抗人類NGAL的捕捉抗體包被。將離心、稀釋的樣本的等分試樣加入在第一個試管中的酶標記的抗NGAL檢測抗體溶液，將浸棍浸入其中。酶標記的檢測抗體與NGAL的複合物結合到浸棍上，然後用自來水洗滌並置於在第二個試管中的顯色底物溶液中。在給定時間內在底物溶液中顯現的顏色，或者通過肉眼與指示尿樣本中NGAL濃度的色彩強度表比較來讀取，或者在簡單的比色計中讀取，此比色計能例如被編制來直4矣顯示NGAL的濃度。實施例2:NGAL側向流動裝置由多孔硝化纖維素條組成的側向流動裝置在其遠端以橫帶的形式包被有抗NGAL的捕捉抗體。抗檢測抗體所來源的物種的抗體的另一條橫帶被置於捕捉抗體帶遠側，用作條功能的對照。所述條的近側端包含吸附或連接到標記的聚苯乙烯顆粒或染料複合物顆粒上的抗NGAL檢測抗體。當將離心的尿樣本的等分試樣置於條的近側端時，與檢測抗體連接的標記顆粒通過毛細管吸引沿所述條移動。當到達捕捉抗體帶時，只有已結合NGAL的那些顆粒會保留，產生可檢測的帶。無論NGAL是否結合，到達抗檢測抗體的抗體的對照帶的顆粒都會產生可檢測的帶。在有色顆粒的情況下，可以肉眼讀取標記帶的強度，或者藉助於對所用標記合適的檢測裝置。兩條帶都顯色或標記聚積表示陽性結果，而僅對照帶顯色或有其它標記則表示陰性結果。對照帶顯色失敗或無其它標記表示條的功能不良。可以通過稀釋所用樣本來調節測試的靈敏度，調節靈敏度從而只有高於已確定的截斷值的NGAL濃度會得到陽性結果。也可通過將檢測抗體與標記的和未標記的顆粒的混合物連接來調節測試的靈敏度。可以預校準成批的條，並裝備可以用檢測裝置讀取的校準碼，從而可以從該裝置讀取定量的或半定量的結果。如本領域技術人員已知的，對於這種側向流動技術的各方面的很多變異都是可能的。實施例3:NGAL微型柱測試微型柱包含由壓縮的聚乙烯顆粒製成的、允許流體和細胞通過的玻璃料。用抗人類NGAL的捕捉抗體包被該玻璃料。將該微型柱裝入藉助自動流體處理使被稀釋的樣本以固定流速和體積上樣的裝置，之後加入與染料複合的檢測抗體。在洗滌溶液通過之後，通過光散射光度測量來讀取玻璃料的顏色強度。預校準成批的玻璃料，並且給微型柱裝備可以用裝置讀取的校準碼，從而不需要預先用標準校準就可以由該裝置顯示定量的結果。實施例4:NGAL夾心法ELISA如Kjeldsen等，(1996)所述製備用作標準和校準材料的純化重組人類NGAL。抗NGAL的抗體是Kjeldsen等，(1993;1996)所述的那些。聚苯乙烯ELISA板用在0.05M的碳酸鈉緩沖液pH9.4中、濃度為2pg/mL的抗體211-1包被在4。C過夜，以100nL/孔加入。傾空所述孔，用含0.05%Tween20的pH7.4磷酸鹽緩沖鹽水洗滌緩沖液洗三次，並吸去。將校準物稀釋液和在稀釋緩沖液(含0.1mg/mL牛清蛋白的洗滌緩衝液)中的樣本以lOOjiL的體積加到孔中，並於室溫在搖床上溫育1小時。如前述傾空、洗滌並吸乾所述孔。以100pL/孔向每孔加入在稀釋緩衝液中的0.25ng/mL的生物素化抗體211-2，並於室溫在搖床上溫育1小時。如前述傾空、洗滌並吸乾所述孔。將辣根過氧化物酶和鏈黴抗生物素的複合物(Zymed，CA)以在稀釋緩沖液中1/2000的稀釋度以100fiL/孔加入每個孔，並於室溫在搖床上溫育1小時。如前述傾空、洗滌並吸乾所述孔。然後將含四曱基聯苯胺和過氧化物(TMB-ONE,Kem-En-Tech，Denmark)的底物溶液以100iiL/孔加入每個孔，並於室溫避光溫育整整8分鐘，之後通過向每孔加入50^L的1M硫酸來終止顏色反應。然後在ELISA讀板機上讀取孔在450nm波長的光吸收度，減去在650nm的光吸收度。然後用標準曲線來計算樣本中NGAL的濃度。該標準曲線由已知濃度校準物的光吸收度讀數產生。測定的範閨為0.02ng/mL到1ng/mL,檢出限(與0的差異的95%置信界限)為2.4pg/mL,並在純化校準物的稀釋液和樣本的稀釋液間顯示平行關係。NGAL的濃度在正常人血清的匯集物中為90ng/mL，在正常人尿的匯集物中為5.4ng/mL。進一步的實施例顯示醫院重症監護病房接收的未經選擇的成年患者的血清或血漿中和尿中進行的NGAL測定的臨床和副臨床(paraclinical)相關性，以及對上述測定的腎病診斷價值的估計。通過在所有基本細節上與如上實施例4所述類似的夾心法ELISA來測定NGAL。實施例5:最初的臨床和副臨床相關性表1顯示了來自醫院重症監護病房接收的11名未經選擇的成年患者的尿和血清單個點樣本(spotsample)的NGAL濃度，其中將它們與臨床和副臨床數據相比較。表1.11名患者的尿和血清中的NGAL濃度與臨床和副臨床數據的相關性tableseeoriginaldocumentpage13tableseeoriginaldocumentpage14正常值血清-NGAL90ng/mL，尿-NGAL5.4ng/mLALL:急性淋巴性白血病；AML:急性髓細胞樣白血病；ARDS:成人呼吸窘迫症候群；ATN:急性腎小管壞死；CRP:C-反應蛋白；HRS:肝腎症候群;MT:多發損傷(multipletrauma);p:血漿；s:血清；u:尿等級相關性(rankcorrelation)(r)的Spearman's系悽丈尿-NGAL/血清-NGAL:r0.945屍《0.001尿-NGAL/血漿-肌酸酐r0.418戶0.1血清-NGAL/嗜中性粒細胞計數r0.273,不顯著血清-NGAL/血清-CRP:r0.064,不顯著所有患者的尿NGAL濃度均升高。血清和尿NGAL水平之間密切相關，但在尿NGAL和血清肌酸酐之間只中等程度相關。臨床診斷為ATN的病例被表徵為在血漿肌酸酐還沒有顯著升高時就有極高的尿NGAL。血清NGAL和嗜中性粒細胞計數之間的相關性差，顯示血清NGAL不是中性白細胞增多症的反映指標。具體地，尿和血清NGAL在3號患者和6號患者都升高，3號患者由於急性淋巴性白血病，其嗜中性粒細胞計數僅有2.0xl0VmL;6號患者由於急性髓細胞樣白血病，嗜中性粒細胞的數目少得無法計數。而且，與之間CRP缺乏相關性，顯示血清NGAL不僅僅是急性期蛋白。對儲存的樣本進行重複分析顯示，NGAL可能在尿樣本中具有有限的穩定性，而在血清樣本中較為穩定。此結果提示，NGAL由器官損害產生，特別是由腎臟產生，但不僅僅由腎臟產生。它溢泌入血並分泌到尿中。然而，ATN時的腎NGAL也直接進入尿中而產生很高的尿NGAL濃度。在取樣時未臨床診斷出腎病、並且他們的血漿肌酸酐在取樣時處在正常範圍以內的3和4號患者，其尿NGAL水平比2號患者高，該2號患者在主動脈瘤破裂後因為無尿接受了血液透析。這兩名患者(3和4號)由於他們的嚴重感染可能已經罹患腎臟缺血性損傷，尿NGAL升高先於血漿肌酸酐的任何升高，正如在臨床診斷出ATN的5號患者中也觀察到的那樣。實施例6:在重症監護接收的未經選擇的成年患者中，尿和血漿NGAL測定對於腎病的診斷效力每天早晨從109名醫院重症監護病房接收的連續患者(consecutivepatient)收集尿和血漿樣本，確定所述樣本中的NGAL。基於出院總結和常規血檢查的結果，有可能將這些患者中的60名分類(分類過程對NGAL數據不知情)為在住院期間腎臟患病或腎臟不患病。由於數據不完整而不可能以足夠的確定性對剩下的49名患者進行分類，這些患者被排除在分析之外。表2顯示了來自60名臨床可分類的患者的尿和血漿中的最高NGAL濃度。通過繪製尿和血漿值的受試者工作特徵(ROC)曲線，確定每名被分類的患者的尿和血漿中NGAL所達到的最高濃度對腎臟患病的診斷效力。也為每名患者繪製每日尿和血漿的NGAL值的時程，並與副臨床數據如血漿肌酸酐值作比較。表2.在重症監護接收的、可臨床分類為腎臟患病或腎臟不患病的60名患者的血漿和尿中的最高NGAL濃度tableseeoriginaldocumentpage15tableseeoriginaldocumentpage16tableseeoriginaldocumentpage17圖1顯示了最高尿NGAL值對於腎臟患病診斷的ROC曲線。曲線下的面積為0.930，並且確定截斷值在370ng/mL到329ng/mL之間，低於所述截斷值的尿NGAL濃度不診斷為腎病。截斷值在此範圍內，診斷的靈敏性為96.9%,診斷的特異性為89.3%，陽性預測值為91.2%,而陰性預測值為96.2%。圖2顯示了最高血漿NGAL值對於腎臟患病診斷的ROC曲線。曲線下的面積為0.914,並且確定截斷值在436ng/mL到355ng/mL之間，低於所述截斷值的血漿NGAL濃度不診斷為腎病。截斷值在此範圍內，診斷的靈敏性為84.8%，診斷的特異性為96.3%,陽性預測值為93.1%,而陰性預測值為83.9%。對於透析需要的診斷將腎臟患病的患者根據所觀察的最高的尿NGAL值分為兩組。第一組(11名患者)的特徵為尿NGAL值為1337ng/mL或更低，並且包括通過臨床與副臨床數據判斷出腎臟患病程度較輕的患者。此組中，3名患者接受了一些形式的血液透析。第二組(21名患者)的特徵為尿NGAL值為2672ng/mL或更高，並且包括臨床診斷出患有ATN或ATIN的17名患者。此組中，20名患者需要一些形式的血液透析。因此確定截斷值在1338到2672ng/mL之間，低於所述截斷值的尿NGAL濃度不預示有透析需要，但可以診斷出程度較輕的腎病。圖3顯示了最高的尿NGAL值對於需要透析的腎臟患病診斷的ROC曲線。曲線下的面積為0.807，並且確認截斷值在1338ng/mL到2672ng/mL之間，低於所述截斷值的尿NGAL濃度診斷為無透析需要。截斷值在此範圍內，診斷的靈敏性為87.0%,診斷的特異性為88.9%,陽性預測值為95.2%,而陰性預測值為72.7%。NGAL值的時程當給每日尿和血漿NGAL值的時程繪圖，並與各個被分類的患者的臨床和副臨床數據作比較時，觀察到尿NGAL超過之前水平86ng/mL,125ng/mL和200ng/mL與出院總結所記錄的或通過血漿肌酸酐水平升高所顯示的腎功能惡化有關。當這些升高使尿NGAL水平超過329ng/mL的截斷水平時，尿NGAL比之前的水平升高200ng/mL以上也與腎功能下降有關。能夠清楚顯示尿NGAL的這種並發升高的患者數目不夠多，因此不能對診斷值在急性腎衰竭和升高幅度的關係方面作有意義的分析。在一些病例中，在尿NGAL升高和腎功能下降造成的血漿肌酸酐升高之間存在平行關係。圖4顯示了因腹主動脈瘤破裂而急性動手術的老年男性患者中尿NGAL和血漿肌酸酐的這種平行升高。在這裡由於出血和主動脈鉗夾而對腎造成的缺血性損傷發生在取第一份血漿和尿樣本之前，因此尿NGAL和血漿肌酸酐的初始水平都表示腎衰竭的程度。尿NGAL比之前的值升高200ng/mL或更多，但所到達的值仍低於329ng/mL的截斷水平，不能診斷為急性腎衰竭，因為它可能是由於不必然影響腎的其它病症如膿毒症造成的。圖5顯示了尿NGAL的此種升高，該升高與罹患不影響腎功能的膿毒症有關，這得到在重症監護病房內的整個臨床過程中血漿肌酸酐水平一直保持在正常範圍內這一事實的支持。參考文獻AulitzkyWK,SchlegelPN,WuDF,ChengCY，ChenCL,LiPS,GoldsteinM,ReidenbergM,BardinCW(1992)Measurementofurinaryclusterinasanindexofnephrotoxicity.ProcSocExpBiolMed199:93-96.HanWK,BaillyV，AbichandaniR,ThadhaniR，BonventreJV(2002)KidneyInjuryMolecule-1(KIM-1):anovelbiomarkerforhumanrenalproximaltubuleinjury.KidneyInt62:237-244.KjeldsenL,JohnsenAH，SengelovH,BorregaardN(1993)IsolationandprimarystructureofNGAL,anovelproteinassociatedwithhumanneutrophilgelatinase.JBiolChem268:10425-10432.KjeldsenL,KochC,ArnljotsK,BorregaardN(1996)CharacterizationoftwoELISAsforNGAL,anewlydescribedlipocalininhumanneutrophils,JImmunolMethods198:155-164.KotankoP，MargreiterR,PfallerW(2000)UrinaryN-acetyl-beta-D-glucosaminidaseandneopterinaidinthediagnosisofrejectionandacutetubularnecrosisininitiallynonfunctioningkidneygrafts.Nephron84:228-235.LiuQ,Nilsen-HamiltonM(1995)Identificationofanewacutephaseprotein.JBiolChem270:22565-22570.MonierF,SurlaA,GuillotM，MorelF(2000)gelatinaseisoformsinurinefrombladdercancerpatients.ClinChimActa299:11-23.MuramatsuY，TsujieM，KohdaY,PhamB，PerantoniAO,ZhaoH，JoSK,YuenPS,CraigL,HuX，StarRA(2002)Earlydetectionofcysteinerichprotein61(CYR61,CCN1)inurinefollowingrenalischemicreperfUsioninjury.KidneyInt62:1601-1610.PendersJ，DelangheJR(2004)Alpha1-microglobulin:clinicallaboratoryaspectsandapplications.ClinChimActa346:107-118.StoeszSP,GouldMN(1995)Overexpressionofneu-relatedlipocalin(NRL)inneu-initiatedbutnotrasorchemicallyinitiatedratmammarycarcinomas.Oncogene11:2233-2241.TriebelS,BlaserJ，ReinkeH,TschescheH(1992)A25kDaalpha2-microglobulin-relatedproteinisacomponentofthe125kDaformofhumangelatinase.FEBSLett314:386-388.TsuchidaT，EguchiN，EguchiY，NumabeA，NakajimaH，OdaH,SeikiK，Hakamada-TaguchiR,UradeY,UeharaY(2004)lipocalin-typeprostaglandinDsynthaseinurineinadriamycin-inducednephropathyofmice.NephronPhysiol96:42-51.YanL，BorregaardN，KjeldsenL,MosesMA(2001)Thehighmolecularweighturinarymatrixmetalloproteinase(MMP)activityisacomplexofgelatinaseB/MMP-9andneutrophilgelatinase-associatedlipocalin(NGAL).ModulationofMMP-9activitybyNGAL.JBiolChem276:37258-37265.權利要求1.診斷、監測或測定人的腎病可能性的方法，其中所述方法區分腎病和不影響腎臟的其它病症，所述方法包含如下步驟i)在來自人的體液樣本中測定人嗜中性粒細胞明膠酶相關性脂籠蛋白(NGAL)的濃度，ii)比較所述濃度和預定的截斷值，所述截斷值經選擇以排除與不影響腎臟的病症相關的NGAL的較低濃度，其中在所述截斷值以上的濃度表示有腎病。2.權利要求l的方法，其中所述樣本是尿樣本，並且所述截斷值是250ng/mL或更高的值，如在250ng/mL和525ng/mL之間的值。3.權利要求1的方法，其中所述樣本是血漿或血清樣本，並且所述截斷值是250ng/mL或更高的值，如在250ng/mL和525ng/mL之間的值。4.上述權利要求中任一項的方法，其中所述其它病症是炎性疾病，並且所述截斷值經選擇以排除與炎性疾病相關的NGAL的較低濃度。5.上述權利要求中任一項的方法，其中所述方法還區分腎病和感染性疾病，並且所述截斷值經選擇以排除與感染性疾病相關的NGAL的較低濃度。6.上述權利要求中任一項的方法，其中所述方法還區分腎病和癌性疾病，並且所述截斷值經選擇以排除與癌性疾病相關的NGAL的較低濃度。7.上述權利要求中任一項的監測方法，其包含將步驟i)和ii)重複一次或多次的其它步驟。8.上述權利要求中任一項的監測方法，其包含在24小時內，例如在12小時內，如在6小時內，例如在3小時內重複步驟i)和ii)的其它步驟。9.上述權利要求中任一項的監測方法，其包含在已經啟動或完成腎病治療後重複步驟i)和ii)的其它步驟。10.上述權利要求中任一項的方法，其中所述腎病是缺血後腎損傷。11.上迷權利要求中任一項的方法，其中所述腎病是可能引起急性腎衰竭、急性腎小管壞死或急性腎小管間質性腎病的病症。12.上述權利要求中任一項的方法，其中所述腎病是由腎毒劑引起的。13.上述權利要求中任一項的方法，其包含將所述濃度與第二個截斷值比較的其它步驟，所述第二個截斷值經選擇以排除NGAL的較低濃度，所述NGAL的較低濃度與病人不太可能需要通過透析來治療的腎病的程度相關，其中在該截斷值以上的濃度表示非常可能需要通過透析治療的腎病的嚴重程度。14.權利要求13的方法，其中所述第二個截斷值在1000ng/mL和3000ng/mL之間，如1250ng/mL,或1500ng/mL,或1750ng/mL,或2000ng/mL,或2250ng/mL，或2500ng/mL，或2750ng/mL。15.上述權利要求中任一項的方法，其中NGAL通過特異性結合NGAL的分子來測量。16.上述權利要求中任一項的方法，其中所述體液是尿。17.上述權利要求中任一項的方法，其中所述體液是血或血漿或血清。18.監測人腎病發作的方法，所述方法包含如下步驟i)在來自人的體液樣本中測定人嗜中性粒細胞明膠酶相關性脂籠蛋白(NGAL)的濃度，ii)對在給定時間段後自同一人取得的另一份體液樣本重複步驟i),和iii)通過比較步驟i)和ii)中獲得的濃度來評估該人是否已經罹患腎病或將要罹患腎病，其中在第二個樣本中的顯著較高的NGAL濃度表示該人已經罹患腎病或將要罹患腎病。19.權利要求18的方法，其中所述顯著較高的濃度是NGAL濃度升高了50ng/mL或更高，如100ng/mL或更高，例如150ng/mL或更高，如200ng/mL或更高，例如300ng/mL或更高，如400ng/mL或更高，例如500ng/mL或更南。20.權利要求18或19的方法，其包含將步驟ii)和iii)重複一次或多次的其它步驟。21.權利要求18-20中任一項的方法，其中所述給定時間段是24小時或更短，例如18小時或更短，如12小時或更短，例如6小時或更短，如3小時或更短。22.權利要求18-21中任一項的方法，其還具有權利要求10-17中任一項的一個或多個特徵。全文摘要本發明提供了通過測量人嗜中性粒細胞明膠酶相關性脂籠蛋白(NGAL)來診斷腎病的方法。文檔編號G01N33/68GK101163971SQ200580048175公開日2008年4月16日申請日期2005年12月20日優先權日2004年12月20日發明者克裡斯琴·班格特,拉斯·O·厄藤薩爾,瑪格麗塔·G·朱安尼斯申請人:免疫體公司