癌症標誌物及癌症的判定方法與流程

2023-12-09 04:47:11 2

本發明涉及癌症標誌物及使用該癌症標誌物判定癌症的方法。
背景技術：
：將一類具有叉頭或翼螺旋DNA結合域的轉錄因子稱為叉頭框(Forkheadbox，FOX)，在人體中存在約50種。FOX主要作為生長調節因子、組織特異性調節因子、細胞周期調節因子發揮作用，但是，許多FOX的作用幾乎尚未闡明。其中，已報告了FOXB2在非洲爪蟾中參與形成胚胎神經，然而，其在哺乳動物中的功能還尚未明確。另一方面，已知DNA的甲基化與癌變有關，在日本特開2008-283947中記載有一種基於FOXB2基因的CpG島(CpG二核苷酸：-CG-序列)中的甲基化率檢測食道癌的方法。現有技術文獻專利文獻專利文獻1：日本特開2008-283947。技術實現要素：發明所要解決的問題上述專利文獻1記載了癌細胞的CpG二核苷酸中的胞嘧啶多發生甲基化，並且，還記載了採用BAMCA法(BacterialArtificialchromosomearray-basedMethylatedCpGislandAmplification，細菌人工染色體的甲基化CpG島擴增陣列法)測定食道癌的FOXB2基因並確認了CpG二核苷酸中的胞嘧啶被甲基化。然而，由於BAMCA法測定CCCGGG序列的甲基化，因此，其測定位點非常有限。另一方面，本發明人對癌細胞中CpG二核苷酸的胞嘧啶的甲基化進行了悉心研究，其結果發現：並不是癌細胞中的全部CpG二核苷酸均被甲基化，另外，其甲基化率因CpG二核苷酸的位置不同而不同。因此，如BAMCA法那樣根據多個位點的甲基化判定癌症的精度低，人們期待一種更高精度地判定細胞癌變的方法。另外，癌症發生於多種細胞中，人們期待一種癌症的判定方法，其能夠應用於各種細胞，而不僅是判定特定的細胞的癌變。於是，本發明的課題是提供一種能夠高精度地判定細胞的癌變並且能夠判定各種細胞的癌變的癌症的判定方法及癌症標誌物。解決問題的技術方案本發明人鑑於上述情況而進行悉心研究，其結果，以來自於各種正常細胞、健康人的血液以及各種癌細胞的基因組DNA為模板，採用亞硫酸氫鹽法，對FOXB2基因的特定區域進行分析時發現，該特定區域中CpG二核苷酸的胞嘧啶在各種正常細胞和健康人全血基因組DNA中呈非甲基化狀態，而在各種癌細胞中呈甲基化狀態。於是，本發明人根據該結果而完成了本發明。即，本發明涉及「癌症標誌物，由來自細胞的FOXB2基因中的由序列號1表示的鹼基序列中的一部分或全部組成，至少包含由序列號3表示的鹼基序列，鹼基序列內存在的-CG-序列中的胞嘧啶的30％以上被甲基化」、「癌症標誌物，由來自細胞的FOXB2基因中的由序列號1表示的鹼基序列中的一部分或全部組成，至少包含由序列號2表示的鹼基序列，鹼基序列內存在的-CG-序列中的胞嘧啶的30％以上被甲基化」以及「判定細胞癌變的方法，對來自細胞的FOXB2基因中的由序列號1表示的鹼基序列內存在的-CG-序列中的胞嘧啶的一部分或全部，通過亞硫酸氫鹽反應，測定胞嘧啶的甲基化率，並基於該甲基化率判定細胞的癌變」。發明效果通過以本發明的癌症標誌物為指標並且採用本發明的方法，無論何種細胞，均能夠對各種細胞判定細胞的癌變。進一步地，由於本發明的方法測定特定區域的CpG二核苷酸中的胞嘧啶的甲基化率，因此，能夠高精度地判定細胞的癌變。附圖說明圖1是表示對於實施例1的hiPS(人正常皮膚成纖維細胞)中的FOXB2基因而言，CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶還是甲基化胞嘧啶的圖。圖2是表示對於實施例1的HDF(人正常皮膚成纖維細胞)中的FOXB2基因而言，CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶還是甲基化胞嘧啶的圖。圖3是表示對於實施例1的WI-38(人正常肺成纖維細胞)中的FOXB2基因而言，CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶還是甲基化胞嘧啶的圖。圖4是表示對於實施例1的CCD-8Lu(正常人肺二倍體細胞)中的FOXB2基因而言，CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶還是甲基化胞嘧啶的圖。圖5是表示對於實施例1的HE23(正常人胚胎細胞)中的FOXB2基因而言，CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶還是甲基化胞嘧啶的圖。圖6是表示對於實施例1的全血中的FOXB2基因而言，CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶還是甲基化胞嘧啶的圖。圖7表示FOXB2啟動子區域的鹼基序列(PCR擴增區域，基因銀行登記號AL353637：106566-107058，序列號10)。圖8是表示對於實施例2的IMR-32(人腹部神經母細胞瘤細胞)中的FOXB2基因而言，CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶還是甲基化胞嘧啶的圖。圖9是表示對於實施例2的HEK293(人胚胎腎細胞)中的FOXB2基因而言，CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶還是甲基化胞嘧啶的圖。圖10是表示對於實施例2的HeLa(人子宮頸癌細胞)中的FOXB2基因而言，CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶還是甲基化胞嘧啶的圖。圖11是表示對於實施例2的HepG2(人肝癌細胞)中的FOXB2基因而言，CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶還是甲基化胞嘧啶的圖。圖12是表示對於實施例2的MDA-MB-231(人乳腺癌)中的FOXB2基因而言，CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶還是甲基化胞嘧啶的圖。圖13是表示對於實施例2的TYK-nu(人卵巢未分化癌細胞)中的FOXB2基因而言，CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶還是甲基化胞嘧啶的圖。圖14是表示對於實施例2的HCC2998(人大腸腺癌細胞)中的FOXB2基因而言，CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶還是甲基化胞嘧啶的圖。圖15是表示對於實施例2的HCT-15(人結腸腺癌細胞)中的FOXB2基因而言，CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶還是甲基化胞嘧啶的圖。圖16是表示對於實施例2的HCT116(人結腸腺癌細胞)的FOXB2基因而言，CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶還是甲基化胞嘧啶的圖。圖17是表示對於實施例2的LoVo(人結腸腺癌細胞(鎖骨淋巴結))中的FOXB2基因而言，CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶還是甲基化胞嘧啶的圖。圖18是表示對於實施例2的SW620(人結腸腺癌細胞)中的FOXB2基因而言，CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶還是甲基化胞嘧啶的圖。圖19是表示對於實施例2的SW837(人直腸腺癌細胞)中的FOXB2基因而言，CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶還是甲基化胞嘧啶的圖。圖20是表示對於實施例2的COLO205(人結腸腺癌細胞)中的FOXB2基因而言，CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶還是甲基化胞嘧啶的圖。圖21是表示對於實施例2的WiDr(人結腸腺癌細胞)中的FOXB2基因而言，CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶還是甲基化胞嘧啶的圖。圖22是表示對於實施例2的LNCap.CloneFGC(人前列腺癌細胞)中的FOXB2基因而言，CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶還是甲基化胞嘧啶的圖。圖23是表示對於實施例2的NCI-H460(人非小細胞肺癌細胞)中的FOXB2基因而言，CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶還是甲基化胞嘧啶的圖。圖24是表示對於實施例2的ACHN(人腎腺癌細胞)中的FOXB2基因而言，CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶還是甲基化胞嘧啶的圖。圖25是表示對於實施例2的MCF-7(人乳腺癌細胞)中的FOXB2基因而言，CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶還是甲基化胞嘧啶的圖。圖26是表示對於實施例2的PANC-1(人胰腺癌細胞)中的FOXB2基因而言，CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶還是甲基化胞嘧啶的圖。圖27是表示對於實施例2的CFPAC-1(人胰腺癌)中的FOXB2基因而言，CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶還是甲基化胞嘧啶的圖。圖28是表示對於實施例2的DAUDI(人伯基特(Burkitt)淋巴瘤細胞)中的FOXB2基因而言，CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶還是甲基化胞嘧啶的圖。圖29是表示對於實施例2的HL60(人早幼粒細胞性白血病細胞)中的FOXB2基因而言，CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶還是甲基化胞嘧啶的圖。圖30是表示對於實施例2的Jurkat(人T細胞性白血病細胞)中的FOXB2基因而言，CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶還是甲基化胞嘧啶的圖。圖31是表示對於實施例2的MonoMac6(人單核細胞性白血病細胞)中的FOXB2基因而言，CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶還是甲基化胞嘧啶的圖。圖32是表示對於實施例2的THP-1(人急性單核細胞性白血病細胞)中的FOXB2基因而言，CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶還是甲基化胞嘧啶的圖。具體實施方式[本發明的癌症標誌物]本發明的癌症標誌物，由來自細胞的FOXB2基因中的啟動子區域中存在的由序列號1表示的鹼基序列中的一部分或全部組成，至少包括由序列號3表示的鹼基序列或者至少包括由序列號2表示的鹼基序列(以下也將上述鹼基序列簡稱為本發明的癌症標誌物鹼基序列)，該鹼基序列內存在的-CG-序列中的胞嘧啶的30％以上被甲基化，優選40％以上被甲基化，更優選50％以上被甲基化。作為上述本發明的癌症標誌物鹼基序列，具體而言，可舉出：序列號1所示的鹼基序列；序列號2所示的鹼基序列；序列號3所示的鹼基序列；由序列號2所示的鹼基序列以及與其3』側鄰接的1～72個鹼基中的與序列號2鄰接的至少一個鹼基組成的連續鹼基；由序列號2所示的鹼基序列以及與其5』側鄰接的1～21個鹼基中的與序列號2鄰接的至少一個鹼基組成的連續鹼基；由序列號2所示的鹼基序列和與其3』側鄰接的1～72個鹼基中的與序列號2鄰接的至少一個鹼基以及與序列號2的5』側鄰接的1～21個鹼基中的與序列號2鄰接的至少一個鹼基組成的連續鹼基(序列號1所示的鹼基序列除外)；由序列號3所示的鹼基序列以及與其3』側鄰接的1～72個鹼基中的與序列號3鄰接的至少一個鹼基組成的連續鹼基；由序列號3所示的鹼基序列以及與其5』側鄰接的1～56個鹼基中的與序列號3鄰接的至少一個鹼基組成的連續鹼基；由序列號3所示的鹼基序列和與其3』側鄰接的1～72個鹼基中的與序列號3鄰接的至少一個鹼基以及與序列號3的5』側鄰接的1～56個鹼基中的與序列號3鄰接的至少一個鹼基組成的連續鹼基(序列號1所示的鹼基序列除外)等。作為本發明的癌症標誌物鹼基序列，更具體地說，可舉出：序列號1所示的鹼基序列(圖7中的鹼基序列)；序列號2所示的鹼基序列(圖7中的鹼基序列)；序列號3所示的鹼基序列(圖7中的鹼基序列)；由序列號2所示的鹼基序列以及與該鹼基序列的3』側鄰接的23個鹼基、40個鹼基、54個鹼基或72個鹼基組成的連續鹼基序列(圖7中的鹼基序列、的鹼基序列、的鹼基序列或的鹼基序列)；由序列號2所示的鹼基序列以及與該鹼基序列的5』側鄰接的11個鹼基或21個鹼基組成的連續鹼基序列(圖7中的鹼基序列或的鹼基序列)；由序列號2所示的鹼基序列、與該鹼基序列的3』側鄰接的23個鹼基、40個鹼基、54個鹼基或72個鹼基以及與序列號2所示的鹼基序列的5』側鄰接的11個鹼基或21個鹼基組成的連續鹼基序列(圖7中的鹼基序列、的鹼基序列、的鹼基序列、的鹼基序列、的鹼基序列、的鹼基序列、的鹼基序列或的鹼基序列)；由序列號3所示的鹼基序列以及與該鹼基序列的3』側鄰接的23個鹼基、40個鹼基、54個鹼基或72個鹼基組成的連續鹼基序列(圖7中的鹼基序列、的鹼基序列、的鹼基序列或的鹼基序列)；由序列號3所示的鹼基序列以及與該鹼基序列的5』側鄰接的8個鹼基、10個鹼基、14個鹼基、32個鹼基、35個鹼基、46個鹼基或56個鹼基組成的連續鹼基序列(圖7中的鹼基序列、的鹼基序列、的鹼基序列、的鹼基序列、的鹼基序列、的鹼基序列或的鹼基序列)；由序列號3所示的鹼基序列、與該鹼基序列的3』側鄰接的23個鹼基、40個鹼基、54個鹼基或72個鹼基、以及與序列號3所示的鹼基序列的5』側鄰接的8個鹼基、10個鹼基、14個鹼基、32個鹼基、35個鹼基、46個鹼基或56個鹼基組成的連續鹼基序列(以圖7中的為5』末端且以為3』末端的鹼基序列)等，其中，優選序列號1所示的鹼基序列、序列號2所示的鹼基序列、序列號3所示的鹼基序列等，更優選序列號2所示的鹼基序列、序列號3所示的鹼基序列等，進一步優選序列號3所示的鹼基序列。另外，對於本發明的癌症標誌物鹼基序列而言，只要序列中包含的-CG-序列的胞嘧啶相同，就能夠用作相同的癌症標誌物，因此，上述具體的鹼基序列可以包括5』末端方向和/或3』末端方向的截至下一個-CG-序列中的胞嘧啶的一個鹼基前為止的鹼基序列的一部分或全部。即，例如，上述序列號1所示的鹼基序列可以包括與5』側鄰接的53個鹼基中的與序列號1鄰接的至少一個鹼基和/或與3』側鄰接的38個鹼基中的與序列號1鄰接的至少一個鹼基。例如，序列號2所示的鹼基序列可以包括與5』側鄰接的10個鹼基中的與序列號2鄰接的至少一個鹼基和/或與3』側鄰接的22個鹼基中的與序列號2鄰接的至少一個鹼基。例如，序列號3所示的鹼基序列可以包括與5』側鄰接的7個鹼基中的與序列號3鄰接的至少一個鹼基和/或與3』側鄰接的22個鹼基中的與序列號3鄰接的至少一個鹼基。當本發明的癌症標誌物鹼基序列是序列號2所示的鹼基序列或序列號3所示的鹼基序列時，該癌症標誌物的-CG-序列中的胞嘧啶的40％以上被甲基化，優選50％以上被甲基化，更優選60％以上被甲基化。在基因銀行登記號AL353637的鹼基號106812-106961中記載有上述序列號1所示的鹼基序列。在基因銀行登記號AL353637的鹼基號106833-106889中記載有上述序列號2所示的鹼基序列。在基因銀行登記號AL353637的鹼基號106868-106889中記載有上述序列號3所示的鹼基序列。對於序列號1和2所示的鹼基序列而言，還包括因物種差異、個體差異或細胞、組織差異等產生的突變而導致鹼基缺失、取代或附加的鹼基序列。本發明的癌症標誌物中的FOXB2基因只要是來自細胞的FOXB2基因即可，根據判定的癌症選擇細胞的種類。例如，當判定肝癌時，使用來自肝細胞的基因即可；當判定前列腺癌時，使用來自前列腺細胞的基因即可。另外，當判定白細胞癌變時，可以從血液中提取白細胞、或者使用血液本身，只要使用來自白細胞的基因即可。作為FOXB2基因的來源的細胞優選為來自哺乳動物的細胞，特別優選為來自人的細胞。作為優選的細胞，例如，可舉出神經母細胞、腎臟、子宮、肝臟、乳腺、卵巢、大腸(結腸、直腸)、前列腺、肺、胰臟、骨髄細胞、T細胞等。使本發明的癌症標誌物鹼基序列進行亞硫酸氫鹽反應，並檢測-CG-序列中的甲基化胞嘧啶，基於所述甲基化胞嘧啶的數量計算本發明的癌症標誌物鹼基序列內存在的-CG-序列中的胞嘧啶的甲基化率。如果使本發明的癌症標誌物鹼基序列進行亞硫酸氫鹽反應，則非甲基化胞嘧啶被轉化為尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶不轉化為尿嘧啶。因此，通過分析亞硫酸氫鹽反應後的鹼基序列並與正常的鹼基序列進行比較，能夠檢測甲基化胞嘧啶，通過用-CG-序列中的甲基化胞嘧啶的數量除以-CG-序列中的胞嘧啶的數量，能夠計算甲基化率。需要說明的是，對於亞硫酸氫鹽反應的詳細情況，在後文的本發明的癌變的判定方法一項中進行說明。對於本發明的癌症標誌物而言，例如，能夠通過從來自哺乳動物的細胞中獲取基因組DNA後、從該基因組DNA中獲取本發明的癌症標誌物鹼基序列來獲得。作為從上述細胞中獲取基因組DNA的方法，例如，按照基因工程實驗室手冊(丸善株式會社)、基因工程手冊(羊土社株式會社)等中記載的鹼性SDS法等公知的DNA提取方法、或者使用市售的基因組DNA提取試劑盒，從細胞、微生物、病毒等中提取，從而得到上述基因組DNA。作為從上述得到的基因組DNA中獲取本發明的癌症標誌物鹼基序列的方法，可以採用在本領域中使用的公知方法，例如，可舉出設計能夠獲取目標鹼基序列那樣的引物並通過聚合酶鏈反應(PolymeraseChainReaction，PCR)來獲取的方法等。作為在這種情況下使用的引物，例如，可舉出以下引物。正向引物GGTTTGGTTAAGTGTTTGGTTAGGGG(序列號4)GTAGTTAGTTTTAGTATTTAGTTTTTGG(序列號5)反向引物CCTAACTACCCCCACTAATTCCCACTC(序列號6)CCCTCTCTACTTCTCTCTCCTACCTTCTC(序列號7)作為PCR的具體方法，可以按照後述的[具有本發明的目標鹼基序列的DNA的取得]一項中記載的PCR反應來進行。[本發明的癌變的判定方法]作為本發明的癌變的判定方法，對於來自細胞的FOXB2基因中由序列號1表示的鹼基序列中的一部分或全部(以下，有時簡稱為本發明的目標鹼基序列)而言，通過亞硫酸氫鹽反應，測定該鹼基序列內存在的-CG-序列中的一部分或全部胞嘧啶的甲基化率，並基於所述甲基化率判定細胞的癌變，從而實現本發明的癌變的判定方法。具體而言，該甲基化率為30％以上、優選為40％以上、更優選為50％以上時，判定為細胞癌變。作為上述本發明的目標鹼基序列，可舉出與上述本發明的癌症標誌物鹼基序列相同的鹼基序列，其中，優選序列號2所示的鹼基序列、序列號3所示的鹼基序列，更優選序列號2所示的鹼基序列。當測定本發明的目標鹼基序列內存在的-CG-序列的一部分或全部胞嘧啶的甲基化率時，只要適當地選定用於判定癌症的-CG-序列的胞嘧啶，並測定這些胞嘧啶的甲基化率即可。作為用於判定癌症的-CG-序列的胞嘧啶的組合，例如，可舉出圖7中的⑦～⑩與的組合、⑦～⑩與的組合、⑧～⑩與的組合、⑧～⑩與的組合等，其中，優選(相當於序列號2所示的鹼基序列)、(相當於序列號3所示的鹼基序列)等，優選等。當測定上述或的-CG-序列中的胞嘧啶的甲基化時、或者序列號1所示的鹼基序列中的一部分為序列號2所示的鹼基序列或序列號3所示的鹼基序列時，在本發明的癌變的判定方法中，所述鹼基序列內存在的-CG-序列中的胞嘧啶的甲基化率為40％以上、優選為50％以上、更優選為60％以上時，判定為細胞癌變。作為本發明的癌變的判定方法，具體而言，使來自細胞的FOXB2基因的基因組DNA進行亞硫酸氫鹽反應後，獲取具有本發明的目標鹼基序列的DNA，然後，測定上述鹼基序列內存在的-CG-序列中的全部胞嘧啶的甲基化率、或者如上所述選定上述鹼基序列內存在的-CG-序列中的一部分胞嘧啶，並測定所選定的胞嘧啶的甲基化率，接著，基於所得到的甲基化率判定細胞癌變，從而實現本發明的判定癌變的方法。[基因組DNA的取得]在上述本發明的判定癌變的方法中，來自細胞的FOXB2基因的基因組DNA能夠通過下述方法得到：通過例如基因工程實驗室手冊(丸善株式會社)、基因工程手冊(羊土社株式會社)等中記載的鹼性SDS法等公知的DNA提取方法來得到，或者使用市售的基因組DNA提取試劑盒、通過從目標細胞中提取而得到。作為目標細胞，可以根據所判定的癌症進行適當選擇。該細胞優選為來自哺乳動物的細胞，特別優選為來自人的細胞。另外，上述細胞既可以是培養的細胞，也可以是從哺乳動物等中提取的細胞，提取的細胞既可以是直接提取的細胞，也可以是從血液等體液中提取的細胞。[亞硫酸氫鹽反應]作為上述本發明的癌變的判定方法中的亞硫酸氫鹽反應，可以按照本領域公知的亞硫酸氫鹽法來進行，具體而言，例如，對上述得到的基因組DNA進行單鏈化處理，使其與亞硫酸鹽反應從而將胞嘧啶磺酸化，然後使磺酸化的胞嘧啶水解，進一步地，在鹼存在的條件下進行脫磺酸化，由此進行。根據該反應，甲基化胞嘧啶不進行反應而保持原有狀態，只有非甲基化胞嘧啶轉化為尿嘧啶。在上述亞硫酸氫鹽反應中，可以在WO2013/089063記載的由下述通式[1]～[8]表示的化合物中的至少一種存在的條件下，進行亞硫酸氫鹽反應。在上述情況下，對於這些化合物中的取代基(R1～R39)的具體例、化合物的具體例、化合物的用量、使用方法而言，可以按照WO2013/089063的記載進行設定、實施。由通式[1]表示的化合物(式中，R1～R6各自獨立地表示氫或碳數為1～6的烷基，n表示1～3的整數)由通式[2]表示的化合物(式中，Y表示碳原子、氧原子或氮原子，R7～R12各自獨立地表示氫原子或碳數為1～6的烷基，k表示0～2的整數，當Y為氧原子時，k表示0；當Y為氮原子時，k表示1；當Y為碳原子時，k表示2。)由通式[3]表示的化合物(式中，R13～R15各自獨立地表示氫原子或碳數為1～6的烷基)由通式[4]表示的化合物(式中，R17和R19各自獨立地表示氫原子、氨基或碳數為1～6的烷基，R16、R18和R20各自獨立地表示氫原子、氨基、碳數為1～6的烷基或碳數為2～6的二烷基氨基，R16、R17、與R16相鄰的碳原子以及與R17相鄰的碳原子可以共同形成苯環)由通式[5]表示的化合物(式中，R21和R22各自獨立地表示碳數為1～6的烷基，X1表示抗衡陰離子(counteranion)由通式[6]表示的化合物(式中，R23表示碳數為1～6的烷基，R24～R28各自獨立地表示氫原子或碳數為1～6的烷基，X2表示抗衡陰離子)由通式[7]表示的化合物(式中，R29～R34各自獨立地表示氫原子或碳數為1～6的烷基)由通式[8]表示的化合物(式中，Z表示氮原子或碳原子，m表示0或1的整數，當Z為氮原子時，m表示0；當Z為碳原子時，m表示1。R35～R39各自獨立地表示氫或碳數為1～6的烷基)可以以溶解有基因組DNA的溶液的形式提供上述亞硫酸氫鹽反應中的基因組DNA，作為該溶液，例如，可舉出pH為6～8的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)等兩性離子緩衝液(Good's緩衝液)；磷酸緩衝液；三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩衝液；甘氨酸緩衝液；硼酸緩衝液；碳酸氫鈉緩衝液；溶解於滅菌水等的溶液等，其中，優選溶解於滅菌水的溶液。對該溶液中的DNA量沒有特別限定，通常，1～10μL溶液中含有10～100ng的DNA。可以通過本領域公知的單鏈化處理進行亞硫酸氫鹽反應中基因組DNA的單鏈化處理。可舉出：例如，通過在通常為80～100℃、優選為85～95℃的條件下，通常加熱30秒～10分鐘、優選加熱1～3分鐘而進行的熱處理；例如，通過使DNA接觸鹼而進行的鹼處理等，優選熱處理。特別是，在由通式[1]～[8]表示的化合物的存在的條件下進行亞硫酸氫鹽反應時，即使將反應溫度設為80～100℃，也能夠在DNA不分解的情況下進行反應，因此，可以使基因組DNA在80～100℃條件下進行亞硫酸氫鹽反應，使單鏈化處理和亞硫酸氫鹽反應同時進行，簡化了處理，因此，在進行單鏈化處理的情況下，更優選該方法。作為上述鹼處理，具體而言，例如，在上述基因組DNA或含有基因組DNA的溶液中添加鹼或鹼的水溶液，通常，將溶液通常設為pH10～14的鹼性，優選設為pH12～14的鹼性，由此進行。作為該鹼，例如，可舉出氫氧化鈉、氫氧化鉀等鹼金屬氫氧化物；氫氧化鋇、氫氧化鎂、氫氧化鈣等鹼土金屬氫氧化物；碳酸鈉等鹼金屬的碳酸鹽、氨、胺類等，其中，優選氫氧化鈉、氫氧化鉀等鹼金屬氫氧化物，在這些鹼中，特別優選氫氧化鈉。在上述亞硫酸氫鹽反應中，作為DNA與亞硫酸氫鹽的反應中的亞硫酸鹽，例如，可舉出亞硫酸氫鈉、亞硫酸銨等，優選亞硫酸氫鈉。通常，對於所述亞硫酸鹽的用量而言，通常在相對於包含50～500ng的DNA的1～500μL溶液中以使反應液中的最終濃度達到1～6mol/L的方式來添加。對於該DNA與亞硫酸鹽的反應而言，在通常為30～100℃、優選為50～100℃、更優選為80～95℃的溫度條件下，使反應通常進行60分鐘～20小時，優選進行60分鐘～5小時，更優選進行60～120分鐘，由此進行該DNA與亞硫酸鹽的反應。通過該反應，胞嘧啶被磺酸化。對於上述亞硫酸氫鹽反應中磺酸化的胞嘧啶的水解而言，只要採用本領域中常用的方法即可，沒有特別的限定，在通常為30～100℃、優選為80～95℃的溫度條件下，通常加熱60分鐘～20小時，優選加熱60分鐘～5小時，更優選加熱60～120分鐘，由此進行水解。另外，該水解處理也可以與上述DNA和亞硫酸鹽的反應同時進行。在上述情況下，可以根據磺酸化的胞嘧啶的水解條件來設定DNA與亞硫酸鹽的反應中的反應溫度和反應時間。對上述已水解的DNA，優選在脫磺酸化處理前進行純化處理。該純化處理的目的在於，除去在亞硫酸氫鹽反應中使用的高濃度亞硫酸鹽等，可以按照本領域中常用的DNA純化方法進行。具體而言，可舉出：例如，在DNA或包含DNA的溶液中添加胍鹽酸鹽、碘化鈉等離液劑、並採用高效液相色譜法(HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC)等分離純化所述DNA的方法；例如，利用苯酚/氯仿/異戊醇的混合溶液提取純化的方法；醇沉澱法；利用填充了矽膠的柱進行純化的方法；利用過濾器的過濾法等，其中，優選醇沉澱法。作為所述醇沉澱法，具體內容如下。即，對於含有水解處理後的DNA的溶液10μL，通常添加40～110μL的醇、30～100μL的緩衝液，進行離心分離。離心分離後，除去上清液，用醇進行洗滌，從而能夠對DNA進行分離純化。在添加上述醇及緩衝液時，為了易於除去分離後的上清液，可以對含有DNA的溶液10μL添加0.1～1μL的Ethachinmate(乙醇沉澱核酸載體)、糖原。作為上述醇，可舉出乙醇、異丙醇、丁醇等，特別優選異丙醇。如果使用異丙醇，則能夠高效地僅使DNA沉澱，能夠高效地進行反應。作為上述緩衝液，例如，可舉出MES、HEPES等的Good’s緩衝液；磷酸緩衝液；Tris緩衝液；甘氨酸緩衝液；硼酸緩衝液；碳酸氫鈉緩衝液等，其中，優選MES、HEPES等的Good’s緩衝液；Tris緩衝液等，特別優選Tris緩衝液。這些緩衝液的pH通常為7～8，優選為7～7.5，作為緩衝液中的緩衝劑濃度，通常為0.1～5mol/L的範圍，優選為0.1～2mol/L的範圍。上述離心分離只要是本領域中通常採取的方式，就沒有特別的限定，通常，在12000～22000g的條件下進行10～30分鐘離心分離。作為上述亞硫酸氫鹽反應中的在鹼存在的條件下進行的脫磺酸化反應，可舉出與上述單鏈化處理一項中的鹼處理相同的方法，也可舉出相同的優選方式。具體而言，例如，可以如下所述地進行。即，對水解後的溶液10μL、或水解處理後進行純化處理的溶液10μL，通常添加0.5～3mol/L鹼水溶液1～10μL，優選添加1～5μL，將反應溶液的pH設為11～14，優選設為12～14，在通常為25～70℃、優選為30～50℃的溫度條件下，通常加熱5～60分鐘，優選加熱5～30分鐘，從而進行脫磺酸化反應。下面，說明上述亞硫酸氫鹽反應的優選具體例。即，例如，使用DNA提取試劑盒等從目標細胞中提取DNA，將1μg的DNA溶解在例如滅菌水5～15μL中。在該溶液3～5μL中，添加例如2～5mol/L的亞硫酸氫鈉(pH5.0～7.0)50～100μL以及由通式[1]～[8]表示的化合物或含有這些化合物的水溶液1～12μL，以使在由通式[1]～[8]表示的化合物為液體的情況下，反應溶液中的濃度成為3～10％，在由通式[1]～[8]表示的化合物為固體的情況下，反應溶液中的濃度成為1～1000mmol/L，在80～100℃的溫度條件下加熱60～120分鐘。通過該反應，基因組DNA成為單鏈DNA，能夠將該單鏈DNA中的胞嘧啶進行磺酸化的同時，將被磺酸化的胞嘧啶水解。然後，以40：60～60：40比例、優選以40：60～50：50的比例分別添加水解後的溶液的5～10倍的1mol/L的Tris緩衝液(pH7.0～8.0)和異丙醇，使水解後的DNA沉澱。此時，如果添加1～3μL的Ethachinmate、糖原，則容易確認DNA的沉澱。接著，在12000～20000g的條件下進行10～20分鐘的離心分離，除去上清液，用乙醇洗滌得到的DNA。由此，能夠提取純化水解後的DNA。進一步地，將得到的DNA1μg溶解在例如滅菌水30～40μL中，在該溶液中添加1～3mol/L的氫氧化鈉5～20μL，在30～40℃的溫度條件下反應20～60分鐘，進行脫磺酸化。接著，如果有需要，採用例如市售的試劑盒等除去低分子量DNA並進行純化。由此，完成了本發明的亞硫酸氫鹽反應，得到基因組DNA中的非甲基化胞嘧啶被高效轉化為尿嘧啶的DNA(以下，有時簡稱為尿嘧啶化DNA)。[具有本發明的目標鹼基序列的DNA的取得]作為由進行了亞硫酸氫鹽反應的基因組DNA取得具有本發明的目標鹼基序列(由序列號1表示的鹼基序列中的一部分或全部組成的鹼基序列)的DNA的方法，使用設計成對具有本發明目標鹼基序列的DNA進行擴增的引物，使上述尿嘧啶化DNA進行PCR反應，通過該方法，能夠將非甲基化胞嘧啶轉化為尿嘧啶，能夠得到具有目標鹼基序列的DNA的擴增產物。上述PCR反應可以按照本領域公知的方法、例如NucleicAcidsResearch,1991,Vol.19,3749,BioTechniques,1994,Vol.16,1134－1137中記載的方法進行，具體如下所述地進行：即，在作為模板的尿嘧啶化DNA的核酸量1～100ng中，分別添加通常為0.1～100pmol、優選為0.1～50pmol的兩種引物，並添加通常為1～10U、優選為2.5～5U的DNA聚合酶、以及通常為0.01～20μmol、優選為0.01～10μmol的四種混合脫氧核糖核苷三磷酸(DeoxyribonucleosideTriphosphate，dNTPs)，在pH7～9的N-三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine)緩衝液、Tris-鹽酸緩衝液等緩衝液中，例如，將(1)93～98℃、1～10分鐘→(2)93～98℃、10～30秒→(3)50～60℃、10～30秒→(4)68～72℃、30秒～5分鐘作為一次循環，進行20～40次循環，從而能夠擴增得到尿嘧啶化DNA。另外，根據所使用的DNA聚合酶，在實施上述循環後，可以在68～72℃的溫度條件下加熱1～5分鐘以附加3』腺嘌呤。在上述PCR反應中，優選在反應後採用本領域中常用的純化方法、例如利用苯酚/氯仿/異戊醇混合溶液提取、醇沉澱、柱純化、利用過濾器過濾等方法來純化得到的DNA。另外，更優選在上述純化後提取具有目標鹼基對(bp)的DNA。作為該提取方法，可舉出本領域公知的方法，例如，採用瓊脂糖凝膠電泳的方法、採用液相色譜法、採用基因工程實驗室手冊增訂版，1990，27-28中記載的採用聚丙烯醯胺凝膠等電泳的方法等。另外，對於如上所述地採用PCR反應而得到的DNA(PCR產物)，為了得到更多的量，進一步地，可以在相同的條件下進行PCR反應。作為上述PCR反應中的兩種引物，只要設計成對具有本發明的目標鹼基序列的DNA進行擴增的引物即可。核苷酸數通常為20～45，優選為22～40，更優選為25～35。作為兩種引物的具體例，例如，可舉出以下引物。正向引物GGTTTGGTTAAGTGTTTGGTTAGGGG(序列號4)GTAGTTAGTTTTAGTATTTAGTTTTTGG(序列號5)反向引物CCTAACTACCCCCACTAATTCCCACTC(序列號6)CCCTCTCTACTTCTCTCTCCTACCTTCTC(序列號7)作為上述PCR反應中的DNA聚合酶，可以是本領域中常用的任意DNA聚合酶，優選具有5』→3』聚合酶活性的DNA聚合酶，其中，更優選具有核酸外切酶活性但不具有3』→5』核酸外切酶活性的DNA聚合酶。具體而言，例如，優選KAPA2G聚合酶等突變型TaqDNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、TthDNA聚合酶，其中，特別優選KAPA2G聚合酶。只要上述PCR反應中的dNTPs是本領域中常用的四種脫氧核糖核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)的混合物，就沒有特別限定。下面，說明具有本發明的目標鹼基序列的DNA的取得方法的優選具體例。即，首先，如上述[亞硫酸氫鹽反應]一項中所述，對基因組DNA進行單鏈化處理後，進行亞硫酸氫鹽反應，得到尿嘧啶化DNA。然後，使用設計成對具有本發明的目標鹼基序列的DNA進行擴增的引物，使得到的尿嘧啶化DNA進行PCR反應。具體而言，在含有通過亞硫酸氫鹽反應得到的尿嘧啶化DNA1～100ng的溶液1～3μL中，添加作為擴增對象的1～10μmol/L的DNA正向引物(例如，GTAGTTAGTTTTAGTATTTAGTTTTTGG：序列號5)5～10μL、作為擴增對象的1～10μmol/L的DNA反向引物(例如，CCCTCTCTACTTCTCTCTCCTACCTTCTC：序列號7)5～10μL、1～5mmol/L的四種脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)的混合溶液5～10μL、以及1～5U的KAPADNA聚合酶10～20μL，例如，將93～98℃、1～10分鐘→93～98℃、10～30秒→50～60℃、10～30秒→68～72℃、68～72℃、30秒～5分鐘作為一次循環，進行20～40次循環。由此，尿嘧啶化DNA被擴增，能夠得到非甲基化胞嘧啶被轉化為尿嘧啶的、具有本發明的目標鹼基序列的DNA(以下，有時簡稱為尿嘧啶化後的具有目標鹼基序列的DNA)。另外，為了使用TA克隆法作為將後述的尿嘧啶化後的具有目標鹼基序列的DNA插入載體的方法，當利用DNA聚合酶在3』末端的腺嘌呤附加活性時，可以在上述循環反應後進一步在68～72℃的溫度條件下反應30秒～5分鐘。然後，採用例如瓊脂糖凝膠或未改性聚丙烯醯胺凝膠將所述被擴增的DNA進行電泳，提取具有目標鏈長的DNA。需要說明的是，根據需要，可以通過利用例如苯酚/氯仿/異戊醇混合溶液進行提取等方法來純化得到的DNA。[-CG-序列中胞嘧啶的甲基化率的測定及癌變的判定方法]作為-CG-序列中胞嘧啶的甲基化率的測定，採用測序儀等對尿嘧啶化後的具有目標鹼基序列的DNA進行鹼基序列分析後，將得到的鹼基序列與正常的鹼基序列作比較，測定本發明的目標鹼基序列的-CG-序列中的甲基化胞嘧啶數或本發明的目標鹼基序列中的特定CG-序列中胞嘧啶的甲基化數，基於所述值計算甲基化率，從而測定了-CG-序列中胞嘧啶的甲基化率。在癌變的判定方法中，如果上述甲基化率為30％以上，優選為40％以上，更優選為50％以上，則判定為細胞癌變。當本發明的目標鹼基序列為序列號2所示的鹼基序列或序列號3所示的鹼基序列時、或者當測定圖7中或的-CG-序列中的胞嘧啶的甲基化時，如果甲基化率為40％以上，優選為50％以上，更優選為60％以上，則能夠判定為細胞癌變，能夠更高精度地判定癌症。作為上述鹼基序列的解析，只要採用本領域中常用的鹼基序列的分析方法，就沒有特別限定，例如，可以按照基因工程實驗室手冊、基因工程手冊等中記載的螢光染料終止法(FluorescenceDyeTerminatorMethod)、桑格雙脫氧鏈終止法(SangerMethod)等常規方法進行。具體而言，例如，將尿嘧啶化後的具有目標鹼基序列的DNA插入載體，將得到的重組載體轉化入感受態細胞，培養該感受態細胞，由此提取包含尿嘧啶化後的具有目標鹼基序列的DNA的質粒，使用該質粒，通過例如測序儀等解讀，由此進行上述鹼基序列的分析。作為將上述尿嘧啶化後的具有目標鹼基序列的DNA插入載體的方法，具體而言，例如，可舉出：採用T4DNA聚合酶等將質粒、粘粒、噬菌粒等載體以及被尿嘧啶化的具有目標鹼基序列的DNA進行平滑末端化後，採用T4DNA連接酶將尿嘧啶化後的具有目標鹼基序列的DNA插入載體的方法；在尿嘧啶化後的具有目標鹼基序列的DNA中附加腺嘌呤(A)，並採用T4DNA連接酶將附加有該腺嘌呤的、尿嘧啶化後的具有目標鹼基序列的DNA插入附加有胸腺嘧啶鹼基的載體的TA克隆法等。其中，優選不需要採用限制性酶將插入的DNA與載體切斷的簡單的TA克隆法。作為該TA克隆法，例如，具體如下所述地進行。即，對PCR反應後的尿嘧啶化後的具有目標鹼基序列的DNA100ng，添加1～5U的TaqDNA聚合酶，在55～75℃的溫度條件下反應10～30分鐘，在尿嘧啶化後的具有目標鹼基序列的DNA的3』末端附加腺嘌呤。另外，如果進行PCR反應時使用具有在3』末端附加腺嘌呤的活性的DNA聚合酶，則不需要上述附加腺嘌呤的工序。另外，在進行該反應時，對尿嘧啶化後的具有目標鹼基序列的DNA100ng，可以在反應液中添加0.01～20nmol的dATP，而在將PCR反應溶液直接用於TA克隆的情況下，由於殘留有dATP，因此，不需要添加dATP。另外，對於附加有腺嘌呤的、尿嘧啶化後的具有目標鹼基序列的DNA，優選在合成反應後通過利用苯酚/氯仿/異戊醇混合溶液提取、醇沉澱、柱純化、利用過濾器過濾等的方法，對得到的DNA進行純化。然後，對附加有腺嘌呤的、尿嘧啶化後的具有目標鹼基序列的DNA10～100ng，加入附加有胸腺嘧啶鹼基的大腸桿菌轉化用載體和T4DNA連接酶300～3000U，在10～40℃的溫度條件下反應30～90分鐘，從而能夠得到插入了尿嘧啶化後的具有目標鹼基序列的DNA的重組載體。作為將上述重組載體轉化入感受態細胞的方法，例如，可舉出在35～45℃的溫度條件下加熱20～90秒的熱衝擊法、施加1.5～2.5kV的電脈衝的電穿孔法等。作為此處所使用的感受態細胞，可以使用通常使用的大腸菌、枯草菌等中的任意細胞，可以將上述用量適當地設定在常用的範圍內。作為上述感受態細胞的培養，例如，在含有30～150μg/ml的氨苄西林的LB瓊脂培養基、或含有30～150μg/ml的氨苄西林的M9瓊脂培養基等培養基上，在30～40℃的溫度條件下，培養12～20小時，由此來進行。另外，作為上述培養基，只要含有作為微生物的營養源的碳源、氮源、無機鹽類、作為生長因子的酵母膏等，並能有效地進行轉化體的培養，就可以使用天然培養基、合成培養基等中的任意培養基。作為上述碳源，可舉出葡萄糖、果糖、蔗糖、澱粉等碳水化合物；乙酸、丙酸等有機酸；乙醇、丙醇等醇類。作為該氮源，可舉出氨、氯化銨、硫酸銨、乙酸銨、磷酸銨等無機酸或有機酸的銨鹽或其他含氮化合物，除此以外，還可舉出蛋白腖、胰蛋白腖、肉提取物、玉米漿等。作為無機鹽類，可舉出磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等。作為從培養的感受態細胞中提取含有尿嘧啶化後的具有目標鹼基序列的DNA的質粒的方法，可以通過下述方式進行，例如，首先採用菌落PCR法，對菌落中的含有尿嘧啶化後的具有目標鹼基序列的DNA的質粒來源的DNA進行擴增，然後，採用例如電泳法確認目標質粒是否在菌落中擴增，並從已確認了目標質粒的插入的菌落中提取目標質粒。作為該菌落PCR法，例如，如下所述地進行。即，在培養的菌落中，分別添加通常為0.1～100pmol、優選為0.1～50pmol的用於檢測本發明的目標鹼基序列的兩種PCR引物，添加通常為0.01～20nmol、優選為0.01～10nmol的四種混合脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、以及通常為1～10U、優選為1～5U的DNA聚合酶，在pH7～9的Tricine緩衝液、Tris-鹽酸緩衝液等緩衝液中，例如，將(1)93～98℃、1～10分鐘→(2)93～98℃、10～30秒→(3)50～60℃、10～30秒→(4)68～72℃、30秒～5分鐘作為一次循環，進行20～40次循環反應，由此進行。作為上述兩種引物，可舉出設計成能夠對目標DNA進行擴增的引物，即，可舉出含有尿嘧啶化後的具有目標鹼基序列的DNA的全部或一部分的引物、或者位於被插入的尿嘧啶化後的具有目標鹼基序列的DNA兩端的來自載體的序列等，優選位於尿嘧啶化後的具有目標鹼基序列的DNA兩端的來自載體的序列。即，在本發明的DNA擴增方法和本發明的甲基化胞嘧啶檢測方法中，由於非甲基化胞嘧啶被尿嘧啶化，且在PCR反應時該尿嘧啶被讀作胸腺嘧啶，因此，在胞嘧啶全部為非甲基化胞嘧啶的情況下，尿嘧啶化後的具有目標鹼基序列的DNA由三種鹼基構成。因此，為了高效地進行PCR反應，優選能夠由四種鹼基構成的、位於尿嘧啶化後的具有目標鹼基序列的DNA兩端的來自載體的序列。上述引物的核苷酸數通常為12～30，優選為15～25、更優選為18～22。作為上述DNA聚合酶，例如，可以是本領域中常用的任意DNA聚合酶，具體而言，例如，可舉出TaqDNA聚合酶、TthDNA聚合酶、KODDNA聚合酶等，其中，優選TaqDNA聚合酶、KODDNA聚合酶等。作為在上述菌落PCR反應後進行的電泳法，可以是本領域中常用的、能夠根據遷移率求出鹼基數的任意凝膠電泳法，優選瓊脂糖凝膠電泳法。需要說明的是，對於該電泳法中的電泳條件，可按照公知的方法適當地設定。作為從上述菌落部中提取質粒的方法，例如，可以採用基因工程實驗室手冊(丸善株式會社)、基因工程手冊(羊土社株式會社)等中記載的鹼性SDS法等公知的質粒提取方法，在振蕩培養後提取質粒。需要說明的是，可以採用市售的試劑盒進行質粒的提取。對於上述振蕩培養中的培養基而言，未使用瓊脂而使用溶液，除此以外，能夠使用與感受態細胞的培養一項中記載的培養基相同的培養基，優選的培養時間、培養溫度也與感受態細胞一項中記載的範圍相同。通過將由上述鹼基序列分析得到的、進行了亞硫酸氫鹽反應的鹼基序列與胞嘧啶未被甲基化的正常DNA的鹼基序列進行比較，能夠檢測甲基化胞嘧啶。即，由於在本發明的亞硫酸氫鹽反應中除了甲基化胞嘧啶以外的全部胞嘧啶(非甲基化胞嘧啶)均被尿嘧啶化，因此，通過在得到的鹼基序列中找出未被尿嘧啶化的胞嘧啶，能夠檢測甲基化胞嘧啶。用本發明的目標鹼基序列的-CG-序列中的甲基化胞嘧啶的數量除以-CG-序列中的胞嘧啶的數量，從而計算甲基化率。如果上述甲基化率為30％以上、優選為40％以上、更優選為50％以上，則判定為細胞癌變。另外，當本發明的目標鹼基序列為序列號2所示的鹼基序列或序列號3所示的鹼基序列時、或者當測定圖7中或的-CG-序列中的胞嘧啶的甲基化時，如果甲基化率為40％、優選為50％、更優選為60％以上，則能夠判定為癌變，能夠更高精度地判定癌症。下面，對本發明的癌變的判定方法的優選例進行說明。即，首先，如[亞硫酸氫鹽反應]和[具有本發明的目標鹼基序列的DNA的取得]的項目中所述，對基因組DNA進行單鏈化處理，依次進行亞硫酸氫鹽反應、PCR反應，得到尿嘧啶化後的具有目標鹼基序列的DNA。在含有所述尿嘧啶化後的具有目標鹼基序列的DNA10～100ng的滅菌水1～5μL等中，加入附加有胸腺嘧啶鹼基的10～100ng大腸桿菌轉化用載體1～3μL和300～3000U的T4DNA連接酶1～3μL，在10～20℃的溫度條件下反應30～240分鐘，得到插入有尿嘧啶化後的具有目標鹼基序列的DNA的重組載體。另外，在進行PCR反應時使用不具有腺嘌呤附加活性的聚合酶、例如α-DNA聚合酶時，在插入載體前，在尿嘧啶化後的具有目標鹼基序列的DNA中附加腺嘌呤。作為該腺嘌呤附加方法，可以通過下述方式進行，例如，在含有100ng～1μg的具有本發明的目標鹼基序列的DNA的PCR反應溶液5～10μL中，添加1～5U的TaqDNA聚合酶0.5～1μL，在55～75℃的溫度條件下反應10～30分鐘，使腺嘌呤附加在具有本發明的目標鹼基序列的DNA的3』末端。另外，優選在腺嘌呤反應後進行純化操作。在得到重組載體後，在108～109個感受態細胞中添加得到的重組載體10～100ng，在35～45℃的溫度條件下加熱20～90秒，進行轉化。進一步地，例如，在含有30～150μg/ml氨苄西林、1％(w/v)的胰蛋白腖、0.5％(w/v)的酵母提取物、1％(w/v)的氯化鈉的瓊脂培養基上，在30～40℃的溫度條件下培養12～20小時。然後，將得到的培養物進行菌落PCR。具體而言，在溶解了菌落的滅菌水1～10μL中，分別添加1～5μL的設計成能夠對目標DNA進行擴增的1～10μmol/L的兩種PCR引物，通常添加1～5mmol/L的四種混合脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)1～5μL、以及1～5U的TaqDNA聚合酶0.5～1μL，在pH7～9的Tricine緩衝液、Tris-鹽酸緩衝液等緩衝液中，例如，將(1)93～98℃、1～10分鐘→(2)93～98℃、10～30秒→(3)50～60℃、10～30秒→(4)68～72℃、30秒～5分鐘作為一次循環，進行30～40次循環反應。然後，採用瓊脂糖凝膠電泳法，確認菌落中目標DNA的存在，選取已確認了目標DNA的存在的菌落。用LB培養基對選取的菌落進行振蕩培養後，使用例如市售的質粒提取試劑盒等從培養液中提取目標DNA，採用測序儀等對DNA的鹼基序列進行解讀。將得到的鹼基序列與胞嘧啶未被甲基化的正常鹼基序列進行比較，測定本發明的目標鹼基序列中-CG-序列的胞嘧啶的甲基化率。根據上述甲基化率能夠判定細胞的癌變率。下面，通過實施例等進一步詳細說明本發明，但本發明並不受這些實施例等的任何限定。實施例實施例1正常細胞中的FOXB2基因的甲基化分析(1)基因組DNA的提取使用下述五種細胞，按照試劑盒中所附的說明書，通過QuickGeneSPDNA組織提取試劑盒(倉敷紡織株式會社)提取基因組DNA。人正常皮膚成纖維細胞(hiPS，細胞名稱：201B7)人正常皮膚成纖維細胞(HDF)人正常肺成纖維細胞(WI-38)正常人肺二倍體細胞(CCD-8Lu)正常人胚胎細胞(HE23)(2)亞硫酸氫鹽反應在(1)中得到的五種基因組DNA和作為來自健康人全血的基因組DNA的人基因組DNA(普洛麥格公司(プロメガ社)製造)各400ng中，加入蒸餾水，配製10μL水溶液。接著，使用EpiSight亞硫酸氫鹽轉化試劑盒(和光純藥工業株式會社製造)，按照說明書分別進行亞硫酸氫鹽反應。(3)FOXB2啟動子區域的擴增(PCR反應)在(2)中得到的亞硫酸氫鹽反應產物1μL中分別加入蒸餾水17.3μL、BlendTaq用10×緩衝液(10×bufferforBlendTaq)(東洋紡公司(東洋紡))2.5μL、2mM的dNTPs(東洋紡公司)2μL、BlendTaq-Plus(東洋紡公司)0.2μL(0.5U)、正向引物(10μM)1μL以及反向引物(10μM)1μL，進行混合，製成反應溶液。各引物的鹼基序列如下所示。通過這些引物擴增的鏈長為493bp。正向引物：GGTTTGGTTAAGTGTTTGGTTAGGGG(序列號4)反向引物:CCTAACTACCCCCACTAATTCCCACTC(序列號6)將上述反應溶液分別設置在熱循環儀中，在下述條件下進行反應。94℃2分鐘將94℃20秒→55℃20秒→72℃30秒作為一次循環，循環36次72℃2分鐘然後，在PCR擴增產物25μL中，分別加入5μL的6×雙色上樣緩衝液(6×LoadingBufferDoubleDye)(日本基因株式會社(ニッポンジーン)製造)，進行混合，採用1.5％瓊脂糖凝膠將混合物進行電泳。電泳後用GelRed核酸凝膠染色液(和光純藥工業株式會社製造)染色，使用QIAquick凝膠回收試劑盒(凱傑公司(キアゲン))按照試劑盒中所附的說明書回收PCR擴增產物。(4)用於在PCR擴增產物中附加限制性酶識別位點的PCR反應在(3)中得到的PCR擴增產物1μL中分別加入蒸餾水17.3μL、BlendTaq用10×緩衝液(10×bufferforBlendTaq)(東洋紡公司)2.5μL、2mM的dNTPs(東洋紡公司)2μL、BlendTaq-Plus(東洋紡公司)0.2μL(0.5U)、正向引物(10μM)1μL以及反向引物(10μM)1μL，進行混合。正向引物使用在上述PCR正向引物中附加了限制性酶識別位點(HindIII：序列中的劃線部分)而成的下述序列，反向引物使用在上述PCR反向引物中附加了限制性酶識別位點(BamHI：序列中的劃線部分)而成的下述序列。正向引物：TTACCATAAGCTTGGTTTGGTTAAGTGTTTGGTTAGGGG(序列號8)反向引物：TAATTAAGGATCCCCTAACTACCCCCACTAATTCCCACTC(序列號9)將上述反應溶液分別設置在熱循環儀中，在下述條件下進行反應。94℃2分鐘將94℃20秒→55℃20秒→72℃30秒作為一次循環，循環10次72℃2分鐘然後，在PCR擴增產物25μL中，分別加入6×雙色上樣緩衝液(6×LoadingBufferDoubleDye)(日本基因株式會社製造)5μL，進行混合，採用1.5％瓊脂糖凝膠將混合物進行電泳。電泳後用GelRed核酸凝膠染色液(和光純藥工業株式會社製造)染色，使用QIAquick凝膠回收試劑盒(凱傑公司製造)按照試劑盒中所附的說明書回收PCR擴增產物。(5)限制性酶的處理在(4)中得到的PCR擴增產物43μL中，分別加入10×緩衝液(日本基因株式會社製造)5μL、HindIII(日本基因株式會社製造)1μL以及BamHI(日本基因株式會社製造)1μL並混合後，在37℃的溫度條件下孵育1小時。同樣地，在pUC19(日本基因株式會社製造)500ng中加入蒸餾水，配製成43μL，進一步地，加入HindIII(日本基因株式會社製造)1μL和BamHI(日本基因株式會社製造)1μL並混合後，在37℃的溫度條件下孵育1小時。然後，加入結合緩衝液(5.5M胍鹽酸鹽(和光純藥工業株式會社製造)、20mM的Tris-鹽酸pH6.6(和光純藥工業株式會社製造))250μL並混合後，轉移至EconoSpin(基因設計株式會社(ジーンデザイン)製造)中，在12000×g、室溫的條件下，進行1分鐘的離心分離，除去管中的溶液。然後，添加洗滌緩衝液(2mM的Tris-鹽酸pH7.5(日本基因株式會社製造)、80％乙醇(和光純藥工業株式會社製造))500μL，在12000×g、室溫的條件下，進行1分鐘的離心分離，除去管中的溶液。進一步地，在12000×g、室溫的條件下，進行1分鐘的離心分離後，換成新管，添加洗脫緩衝液(10mM的Tris-HClpH8.5)(日本基因株式會社製造)25μL，在12000×g、室溫的條件下，進行1分鐘的離心分離。由此，回收經限制性酶處理的PCR擴增產物和pUC19。(6)轉化在經限制性酶處理的PCR擴增產物1μL中，加入經限制性酶處理的pUC19、DNA連接試劑盒(MightyMix)(寶生物工程株式會社(タカラバイオ)製造)2μL，混合，在16℃的溫度條件下孵育1小時。然後，將總量4μL轉化入ECOSTM大腸桿菌DH5α感受態細胞(日本基因株式會社製造)，塗抹於添加有氨苄西林的LB瓊脂培養基上。然後，在37℃的溫度條件下，將菌落在添加有氨苄西林的LB瓊脂培養基上培養16小時。進一步地，使用質粒試劑盒SII(倉敷紡織株式會社)按照試劑盒中所附的說明書進行質粒的提取。通過寶生物工程株式會社的序列分析委託服務，使用所得到的質粒分析鹼基序列。基於鹼基序列的解讀結果，將表示CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶和甲基化胞嘧啶中的哪一種的圖示於圖1～6中。需要說明的是，圖中的○表示CpG二核苷酸中的胞嘧啶為非甲基化胞嘧啶，●表示CpG二核苷酸中的胞嘧啶為甲基化的胞嘧啶。將附圖與所用的細胞或全血的關係示於表1中。表1結果細胞或全血圖1人正常皮膚成纖維細胞(hiPS)圖2人正常皮膚成纖維細胞(HDF)圖3人正常肺成纖維細胞(WI-38)圖4正常人肺二倍體細胞(CCD-8Lu)圖5正常人胚胎細胞(HE23)圖6白細胞(全血)另外，在圖7記載的FOXB2啟動子區域的鹼基序列(PCR擴增區域，基因銀行登記號AL353637：106566-107058：序列號10)中記載圖1～6中帶圈數字的胞嘧啶的位置。將基於圖1～6的結果計算的、相當於序列號2的範圍(圖中的)的CpG二核苷酸中的胞嘧啶的甲基化率、相當於序列號1的範圍(圖中的)的CpG二核苷酸中的胞嘧啶的甲基化率與實施例2的結果一同示於表3中。實施例2癌細胞中的FOXB2基因的甲基化分析使用下述表2中的二十五種癌細胞，通過QuickGeneSPDNA組織提取試劑盒(倉敷紡織株式會社)按照試劑盒中所附的說明書提取基因組DNA。與實施例1中(2)～(6)記載的方法同樣地進行後續處理，分析各種癌細胞的FOXB2基因的鹼基序列。基於鹼基序列的解讀結果，將表示CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶和甲基化胞嘧啶中的哪一種的圖分別示於圖8～32中。需要說明的是，圖中帶圈數字的胞嘧啶的位置如圖7所述。另外，○表示CpG二核苷酸中的胞嘧啶為非甲基化胞嘧啶，●表示CpG二核苷酸中的胞嘧啶為甲基化的胞嘧啶。將附圖與所用的細胞的關係示於下述表2中。表2將基於圖8～32的結果計算的、相當於序列號2的範圍(圖7中的)的CpG二核苷酸中的胞嘧啶的甲基化率、相當於序列號1的範圍(圖7中的)的CpG二核苷酸中的胞嘧啶的甲基化率示於下述表3中。將相當於序列號3的範圍(圖7中的)的CpG二核苷酸中的胞嘧啶的甲基化率示於下述表4中。表3表4根據上述實施例1的結果可知，如果序列號2或序列號3中存在的CpG二核苷酸中的胞嘧啶的甲基化率為20％以下，則能夠判定為未癌變的正常細胞，另外，如果序列號1中存在的CpG二核苷酸中的胞嘧啶的甲基化率為15％以下，則能夠判定為未癌變的正常細胞。即，可知如果甲基化率為30％以上，則能夠判定為細胞癌變的可能性大。另外，根據實施例2的結果可知，如果序列號2或序列號3中存在的CpG二核苷酸中的胞嘧啶的甲基化率為60％以上，則能夠判定為癌變細胞，另外，如果序列號1中存在的CpG二核苷酸中的胞嘧啶的甲基化率為50％以上，則能夠判定為癌變細胞。由此可知，如果考慮正常細胞中的胞嘧啶的甲基化率至少為20％以下，則能夠非常高精度地判定癌變。進一步地，對於二十五種不同的細胞而言，可知通過測定FOXB2基因的同一區域的CpG二核苷酸中的胞嘧啶的甲基化率，能夠高精度地判定各細胞的癌變。即表明了通過本發明的方法，無論何種癌症均能夠進行判定。工業實用性使用本發明的癌症標誌物或採用本發明的方法，能夠對各種細胞判定細胞的癌變。另外，由於測定特定的CpG二核苷酸中的胞嘧啶的甲基化率，因此，能夠高精度地判定細胞的癌變。即，能夠用於癌症的復發、轉移的預防性的判定中。序列表和光純藥工業株式會社癌症標誌物及癌症的判定方法1961JP9PatentInversion3.51150DNA人FOXB21cgggggaagacgcagagaaggcggcggtaaacctggtgcactccgcccgcgactgtgcgc60gccagtcggcaaccgtcggggccagaagttgccagcttccgagagctgagtaggcccgaa120aggccaaggtcggagacaccaggcaattcg150257DNA人FOXB22cggcggtaaacctggtgcactccgcccgcgactgtgcgcgccagtcggcaaccgtcg57321DNA人FOXB22CGCGCCAGTCGGCAACCGTCG21426DNA人工序列引物4ggtttggttaagtgtttggttagggg26528DNA人工序列引物5gtagttagttttagtatttagtttttgg28627DNA人工序列引物6cctaactacccccactaattcccactc27729DNA人工序列引物7ccctctctacttctctctcctaccttctc29839DNA人工序列引物8ttaccataagcttggtttggttaagtgtttggttagggg39940DNA人工序列引物9taattaaggatcccctaactacccccactaattcccactc4010493DNA人FOXB210ggtctggctaagtgcctggccaggggcctgcgtccagggcactggaagtcctgctgtcac60tggcctccaggacagcaggcgcaaactcagatttaaagggccagagtctctactgcccag120accttcctcccagccatcttggtctgggtttccctcggacctagaaaaagcaaagaggcc180gggaggaaacacggccccttgccactctcctctgcagccagctccagcactcagtctttg240gccacccgggggaagacgcagagaaggcggcggtaaacctggtgcactccgcccgcgact300gtgcgcgccagtcggcaaccgtcggggccagaagttgccagcttccgagagctgagtagg360cccgaaaggccaaggtcggagacaccaggcaattcggagaaggcaggagagagaagcaga420gagggcctggagggcgagagggcaaagtggcgggactggaggggccgagtgggaattagt480gggggcagccagg493當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp