用於選擇高效表達重組細胞系的方法

2023-12-09 09:19:21

專利名稱：用於選擇高效表達重組細胞系的方法
技術領域：
本發明涉及一種選擇高效表達相關蛋白質的細胞系(下文中稱為「高產量克隆」) 的方法，更具體說來，涉及通過使用表達載體來選擇高產量克隆的方法，所述表達載體包括(i)包括以不可操作方式連接到多聚腺苷酸化信號(POlyA)的選擇性標記基因的基因表達盒；以及(ii)編碼相關重組蛋白並且以可操作方式連接到多聚腺苷酸化信號的基因表達盒；並且涉及所述表達載體。
背景技術：
在生物學或醫學領域中，通過將欲產生的相關蛋白質的基因插入表達載體中，將表達載體轉染到產生這種蛋白質的細胞系中，大量培養所得細胞系，並使用適合的方法分離和純化培養的細胞系，以此獲得相關蛋白質。工業上用於此目的的方法的實例包含使用二氫葉酸還原酶(dhfndihydrofolate reductase)中國倉鼠卵巢(CHO，Chinese hamster ovary)(-)細胞系、CHO Kl 細胞系、幼倉鼠腎(BHK, Baby Hamster Kidney)細胞系、NSO細胞系、SP2/0細胞系和人細胞系的方法(奧格塔(Ogata)等人，應用微生物學與生物技術(Appl. Microbiol. Biotechnol.), 1993，38 (4)，520-525 ；克拉傑(Kratje)等人，生物技術研究進展(Biotechnol. Prog.), 1994，10 (4)，410-20 ；皮克曼(Peakman)等人，人類抗體與雜交瘤(Hum. Antibodies Hybridomas)，1994，5(1-2)，65-74)。為了產生表達相關異源基因的穩定哺乳動物細胞系，一般通過轉染將異源基因與選擇性標記基因(例如，新黴素磷酸轉移酶(neomycin phosphotransferase)) 一起引入所需細胞系中。可藉助單一載體或藉助共轉染的單獨載體來同時表達異源基因和選擇性標記基因。轉染後2天到3天，將細胞轉移到含有選擇劑(例如，在使用新黴素磷酸轉移酶基因作為選擇性標記基因的情況下為G418)的培養基中，並在這些選擇條件下培養數周。隨後分離出自然產生抗性的細胞，並針對所需基因產物的表達進行研究。由於細胞隨機且非定向整合到宿主細胞基因組中，以致獲得的細胞群具有完全不同的異源基因表達率。這些細胞群也可包含表達選擇性標記物但不表達相關基因的非表達細胞。因此，為了鑑別能極高效表達相關異源基因的細胞克隆，需要檢查並測試大量克隆，而此舉是耗費時間、勞動密集且昂貴的。基因擴增是在動物細胞培養物中進行的用於產生重組蛋白的常用技術。基因擴增可以顯著提高許多哺乳動物細胞系相對較低的產率。此項技術中廣泛使用的一種擴增技術是基於二氫葉酸還原酶(dhfr)的基因擴增系統，這一系統最常用於dhfr缺陷型CHO細胞中。工業上優選dhfr缺陷型CHO細胞系的原因如下(1)蛋白質的翻譯後修飾(糖基化或磷酸化)比其它細胞更接近於人類細胞；( 不僅可能進行粘附培養，而且還可能進行懸浮培養；C3)與其它細胞相比較，這些細胞可在無血清培養基中以相對較高的濃度培養； (4)可以使用dhfr/甲氨蝶呤(MTX，methotrexate)基因擴增系統增加明顯低於微生物的相關蛋白質的生產率；和(5)經證實，這些細胞是安全的，並因此易於獲得例如FDA等相關權威機構的批准。出於上述原因，dhfr缺陷型CHO細胞系已被廣泛用於工業目的，用以構建產生相關蛋白質的重組細胞系。然而，即使在使用經由將編碼相關蛋白質的基因引入dhfr缺陷型CHO細胞中，隨後通過逐步增加MTX濃度處理細胞，來顯著增加相關蛋白質的產量的常規dhfr/MTX基因擴增系統時，選擇具有高產率的細胞群也是勞動密集、耗費時間和成本的，因為需要長時間用遞增濃度的MTX處理細胞的方法，而且要在此方法中篩選的細胞群數量為500到4，000個或更多。因此，已經嘗試通過各種方式來簡化此選擇。舉例來說，此項技術中的研究人員曾試圖使用以下方法來簡化選擇步驟1)通過修飾起始密碼子的附近來降低選擇性標記基因的表達的方法(雷夫(Reff)，美國專利第5，733，799號，1998) ；2)通過使選擇性標記基因突變來削弱基因功能的方法(丹羽 (Niwa)等人，基因(Gene) 108，193-200，1991 ；索特(Sauter)和恩尼克(Enenkel)，生物技術與生物工程(Biotechnol. Bioeng.) 89，530-538，2005) ；3)修飾起始密碼子本身並將經過修飾的起始密碼子與欲表達的基因連接，由此增加基因表達水平的方法(範布洛克蘭 (van Blokland)等人，生物技術雜誌(J of Biotechnology) 128，237-245，2007)；和 4)將選擇性標記基因連接到內含子並表達所述基因的方法(盧卡斯(Lucas)等人，核酸研究 (NucleicAcids Res.)24，1774-1779，1996)。

發明內容
技術問題因此，本發明一個目的是提供一種通過使用表達載體來選擇高產量克隆的方法， 所述表達載體包括以不可操作方式連接到多聚腺苷酸化信號(PolyA)的選擇性標記基因。本發明另一目的是提供一種用於所述選擇方法中的表達載體。本發明另一目的是提供一種用所述表達載體轉染的真核宿主細胞系。技術解決方案為了實現以上目的，本發明提供一種通過使用表達載體來選擇高產量克隆的方法，所述表達載體包括(i)包括以不可操作方式連接到多聚腺苷酸化信號(polyA)的選擇性標記基因的基因表達盒；以及(ii)編碼相關重組蛋白並且以可操作方式連接到polyA的基因表達盒。本發明還提供一種表達載體，其包括⑴包括以不可操作方式連接到polyA的選擇性標記基因的基因表達盒；以及(ii)編碼相關重組蛋白並且以可操作方式連接到polyA 的基因表達盒。本發明還提供一種用所述表達載體轉染的真核宿主細胞系。在下文中，將描述本發明中使用的術語的定義。本文中使用的術語「選擇性標記基因」是指已與相關蛋白質的基因連接並插入表達載體中，由此允許鑑別正常表達相關基因的細胞的標記基因。當向培養基中添加由選擇性標記基因編碼的蛋白質抑制劑時，可增加選擇性標記基因的拷貝數或連接到選擇性標記基因的相關蛋白質基因的拷貝數。選擇性標記物的實例包含dhfr基因、穀氨醯胺合成酶基因、新黴素磷酸轉移酶基因、潮黴素B磷酸轉移酶(hygromycin B phosphotransferase)基因、嘌呤黴素N-乙醯基轉移酶(puromycin-N-acetyltransferase，pac)基因和印度斯坦鏈異壁菌(Streptoalloteichus hindustanus，Sh) ble 基因。本文中使用的術語「polyA」是指引起真核mRNA 3'端的特定位點裂解並在裂解的3'端轉錄後併入具有約100到200個腺嘌呤核苷酸(多聚腺苷酸尾)的序列的信號序列。PolyA是指在裂解位點上遊約10到30個核苷酸處的一致序列AATAAA及位於下遊的序列。已知各種polyA，例如tk polyA、SV40晚期和早期polyA或BGH polyA。本文中使用的術語「以可操作方式連接(operably linked) 」是指，一個核酸片段連接到另一核酸片段，使得所述核酸片段的功能或表達受所述另一核酸片段影響。術語「以可操作方式連接」還用於描述基因序列與啟動子或者其它調控或加工序列之間的連接，以致所述基因序列的轉錄由以可操作方式連接的啟動子序列所引導，所述基因序列的翻譯由以可操作方式連接的翻譯調控序列所引導，或所述基因序列的翻譯後加工由以可操作方式連接的加工序列所引導。術語「以不可操作方式連接(inoperably linked) 」的含義與術語 「以可操作方式連接」相反，且一般意欲包含由於例如裂解、缺失、點突變和胺基酸置換等所屬領域技術人員已知的方法進行的人工處理而變得不可操作的連接。 在下文中，將詳細地描述本發明。本發明人已經針對選擇高產量克隆的新穎方法進行了研究，結果發現，polyA將明顯影響mRNA的轉錄和穩定性，並且當polyA的長度隨時間推移略微變短時，mRNA開始降解， 且因此，如果polyA不能正常操作，那麼mRNA的半衰期就會比正常mRNA短得多。根據這一發現，本發明人在進行開發新穎選擇方法的研究的同時，注意到了 polyA。舉例來說，當使連接到表達載體中選擇性標記基因的polyA不能操作，接著轉染到宿主細胞中，隨後在存在由選擇性標記基因編碼的蛋白質的抑制劑的選擇條件下培養時，上面帶有不能正常操作的polyA的選擇性標記基因無法穩定產生mRNA，並因此大部分細胞將在選擇條件下被殺死，而只有用大量載體拷貝轉染過的細胞能存活下來。由於用於轉染的表達載體包含選擇性標記基因和編碼相關重組蛋白的基因，故存在的編碼相關重組蛋白的基因的較大拷貝數與選擇性標記基因的拷貝數成比例。為了說明利用連接到選擇性標記基因的polyA的可操作性作為用於選擇高產量克隆的新穎方法，在本發明中，用適合的限制性酶裂解連接到PCT107載體(參看圖1)上選擇性標記基因dhfr 3'端的polyA，以使polyA不可操作。隨後，將所得表達載體轉染到CHO DG44細胞系(測試組)中，並將由這一細胞系選擇高產量克隆的過程與由用未經限制性酶處理的PCT107載體轉染的CHO DG44細胞系(對照組)選擇高產量克隆的過程相比較。結果顯示，在測試組中，每一板中細胞生長的孔數是對照組的約1/7. 6，且生長細胞的比率為 (1/26264) (1/814815)，這表明測試組中生長細胞的比率是對照組中的1/31(參看表2)。接著，為了比較對照組與測試組之間生長細胞的產率，從每一組中選出6個顯示最高產率的細胞系，並研究其產率。研究發現，在對照組的情況下，6個ρ克隆中只有一個ρ 克隆顯示出每3天約100微克/毫升的產率，而在測試組的情況下，6個ρ克隆中有4個ρ 克隆顯示出每3天約100微克/毫升的產率(參看圖6)。另外，為了確定上述本發明的選擇方法是否也適用於除在CHO DG44細胞中使用 dhfr選擇性標記物的系統外的其它系統，使用在CHO Kl細胞中帶有pac選擇性標記物的系統來進行實驗。為此，除去PCT112載體(參看圖7和圖8)上的dhfr轉錄單元(啟動子-dhfr-polyA)，並將SV40啟動子和pac基因插入載體中，由此構建出測試載體(pCT130 載體，參看圖7)。另外，將SV40啟動子、pac基因和polyA(pac轉錄單元)插入載體中，以構建對照載體(PCTU9載體，參看圖8)。隨後，將構建的每一載體轉染到CHO Kl細胞中，並選擇對照細胞系和測試細胞系，隨後研究所選細胞系的產率。從圖9到圖13中可以看出， 來源於測試組(PCT130載體)的克隆的產率高於來源於對照組(pCTU9載體)的克隆的產率。已經發現，在產率明顯高於在基於孔板的選擇步驟中所獲得的產率的搖瓶分批培養物中，來自測試組的單細胞源性克隆的產率(67微克/毫升到72微克/毫升)比來自對照組的單細胞源性克隆的產率O微克/毫升到10微克/毫升)高得多。因此，本發明人發現，根據本發明實施例的選擇方法可用於減少通過使用各種選擇標記物來選擇高產量克隆的成本和時間，由此完成本發明。一方面，本發明提供一種通過使用表達載體來選擇高產量克隆的方法，所述表達載體包括(i)包括以不可操作方式連接到PolyA的選擇性標記基因的基因表達盒；以及 ( )編碼相關重組蛋白並且以可操作方式連接到PolyA的基因表達盒。在本發明一個實施例中，表達標記物可包括用包括除去了 polyA的選擇性標記基因的基因表達盒來代替包括以不可操作方式連接到polyA的選擇性標記基因的基因表達盒⑴。另一方面，本發明還提供一種選擇高產量克隆的方法，所述方法包括用適合的限制性酶裂解表達載體，所述表達載體包括(i)含有以可操作方式連接到PolyA的選擇性標記基因的基因表達盒和(ii)編碼相關重組蛋白並且以可操作方式連接到polyA的基因表達盒，由此使表達載體線性化，以致基因表達盒(i)的PolyA不能操作。在本發明一個實施例中，選擇性標記基因的實例包含(但不限於)dhfr基因、穀氨醯胺合成酶基因、新黴素磷酸轉移酶基因(neomycine phosphotransferase)、潮黴素B磷酸轉移酶基因Qiygromycin Bphosphotransferase)、嘌呤黴素N-乙醯基轉移酶(pac)基因和印度斯坦鏈異壁菌(Sti^ptoalloteichus hindustanus，Si)ble基因。除這些標記基因外，所屬領域技術人員已知的任何選擇性標記基因都可用於本發明中。在本發明一個實施例中，相關重組蛋白優選為(但不限於)單克隆抗體。在本發明一個實施例中，宿主細胞的實例包含(但不限於)真核宿主細胞，優選人類宿主細胞，包含CHO細胞、雜交瘤細胞或F2N細胞。除這些細胞外，所屬領域技術人員已知可作為產生重組蛋白的細胞系的任何細胞系都可用於本發明中。另一方面，本發明還提供一種表達載體，其包括(i)包括以不可操作方式連接到 polyA的選擇性標記基因的基因表達盒；以及(ii)編碼相關重組蛋白並且以可操作方式連接到polyA的基因表達盒。在本發明一個實施例中，表達載體可包括用包括除去了 polyA的選擇性標記基因
的基因表達盒來代替包括以不可操作方式連接到polyA的選擇性標記基因的基因表達盒 ⑴。在本發明一個實施例中，表達載體可包括用供引入編碼相關重組蛋白的基因的多克隆位點來代替編碼相關重組蛋白且以可操作方式連接到polyA的基因表達盒(ii)。在本發明一個實施例中，選擇性標記基因為可擴增選擇性標記基因，優選(但不限於)dhfr基因或穀氨醯胺合成酶基因。
在本發明一個實施例中，選擇性標記基因為(但不限於)新黴素磷酸轉移酶基因、 潮黴素B磷酸轉移酶基因、pac基因或Si ble基因。在本發明一個實施例中，相關重組蛋白優選為(但不限於)單克隆抗體。另一方面，本發明提供一種用所述表達載體轉染的真核宿主細胞系。在本發明一個實施例中，宿主細胞優選是動物細胞。在本發明的實例中，使用CHO 細胞系，但可用於本發明中的宿主細胞不限於此。所屬領域技術人員已知的產生重組蛋白的細胞系，包含雜交瘤細胞或F2N細胞，都可用於本發明中。轉染優選使用所屬領域技術人員已知的方法進行。有利作用根據本發明，可用現有細胞系選擇方法中等於或少於1/10的細胞群選出高產量克隆。具體說來，與進行多個擴增步驟，同時增加MTX濃度的常規分步基因擴增策略相比較，可以使用較低濃度的MTX來選擇高產量克隆。因此，可以縮短細胞系的發育期，並減少選擇高產量克隆所需的勞動和成本，使得有可能更高效地產生重組蛋白。


圖1是pCT107表達載體的裂解譜圖。譜圖上所示的限制性酶Riie IXlaI和Rsr II表示裂解PCT107載體，從而使連接到pCT107表達載體所編碼的抗體的重鏈基因、輕鏈基因以及DHFR基因的polyA不能操作的位點。圖2顯示用對照組(A)、測試組(B)、測試組(C)和測試組(D)表達載體中每一個轉染的CHO細胞中IgG抗體的表達滴度的測量結果。在圖2中，對照組(A)未用限制性酶處理過的環形PCT107載體；測試組(B)通過用Rsr II處理使連接到dhfr基因的polyA不能操作的線性PCT107載體；測試組(C)通過用Riie I處理使連接到重鏈基因的polyA不能操作的線性PCT107載體；以及測試組(D)通過用Cla I處理使連接到輕鏈基因的polyA 不能操作的線性PCT107載體。在樣品不含重鏈也不含輕鏈(測試組(C)和測試組(D))的情況下，歸因於ELISA的特徵，無法測量IgG的滴度。本實驗總共進行5次，並且將誤差範圍以標準誤差表示。圖3是顯示在96孔板規模上根據連接到dhfr基因的polyA的存在或不存在來選擇細胞克隆的方法中所示滴度比較的圖。在圖3中，未切割正常的環形PCT107載體；以及RsrII切割通過用Rsr II處理使連接到dhfr基因的polyA不能操作的線性pCT107載體。圖4是顯示在M孔板規模上根據連接到dhfr基因的polyA的存在或不存在來選擇細胞克隆的方法中所示滴度比較的圖。在圖4中，未切割正常的環形PCT107載體；以及RsrII切割通過用Rsr II處理使連接到dhfr基因的polyA不能操作的線性pCT107載體。圖5是顯示在6孔板規模上根據連接到dhfr基因的polyA的存在或不存在來選擇細胞克隆的方法中所示滴度比較的圖。在圖5中，未切割正常的環形PCT107載體；以及RsrII切割通過用Rsr II處理使連接到dhfr基因的polyA不能操作的線性pCT107載體。圖6是顯示在搖瓶分批培養條件下比較來自對照組與測試組中每一個的6個ρ克隆的產率的結果的圖，其中這些P克隆是根據對照組和測試組中PolyA的存在或不存在而選出的高滴度克隆。在圖6中，未切割正常的環形PCT107載體；以及RsrII切割通過用 Rsr II處理使連接到dhfr基因的polyA不能操作的線性pCT107載體。圖7是顯示克隆pCT130表達載體的方法的示意圖。圖8是顯示克隆pCTU9表達載體的方法的示意圖。圖9是顯示在96孔板規模上比較對照組與測試組產率的結果的圖。在圖9中， PCT129 (含polyA)具有polyA活性的對照組；以及pCT130 (不含polyA)缺失polyA的測試組。圖10是顯示在M孔板規模上比較對照組與測試組產率的結果的圖。在圖10中， PCT129 (含polyA)具有polyA活性的對照組；以及pCT130 (不含polyA)缺失polyA的測試組。圖11是顯示在6孔板規模上比較對照組與測試組的產率的結果的圖。在圖11中， PCT129 (含polyA)具有polyA活性的對照組；以及pCT130 (不含polyA)缺失polyA的測試組。圖12是顯示在6孔板規模上比較對照組與測試組產率的結果的圖。圖13是顯示在使用搖瓶的分批培養中比較對照組與測試組產率的結果的圖。
具體實施例方式縮寫dhfr 二氫葉酸還原酶CH0:中國倉鼠卵巢polyA:多聚腺苷酸化信號p-clone 非單細胞源性克隆的初級克隆MTX:甲氨蝶呤ELISA 酶連免疫吸附分析下文中，將參照實例詳細描述本發明。然而，應了解，這些實例只是出於說明的目的，而不應視為限制本發明的範圍。實例1 引入不可操作的PolyA在根據polyA的存在或不存在來檢查基因表達水平的第一步驟中，為了使以可操作方式連接到表達IgG抗體的pCT107載體(圖1)中三個轉錄單元(dhfr基因、重鏈基因和輕鏈基因)的3'端的polyA不可操作，用Rsr II、PmeI和Cla I限制性酶中每一個裂解pCT107載體。限制性酶Rsr II、Pme I和ClaI是通過特異性識別並裂解dhfr基因、重鏈基因和輕鏈基因中每一個的3'端與相應polyA之間存在的特定序列來使表達IgG抗體的載體線性化的酶。用限制性酶進行的處理是按以下方式進行。準備三個試管，並分別在試管中添加 (i)30 微克 pCT107 載體 DNA 和 10 個單位(U)Rsr II (R0501S, NEB) ； (ii) 30 微克 pCT107 載體DNA和10個單位Rne I (R0560S, NEB)；和(iii)30微克pCT107載體DNA和10個單位 Cla I(R1097S,NEB)且混合，並在37°C下培育4小時。接下來，向各試管中的總樣品中添加以樣品總體積計0. 1體積的NaOAC和3體積100%乙醇(EtOH)，並渦旋，隨後使其在_70°C下靜置30分鐘以使DNA小球沉澱。接著，以13，000轉/分鐘(rpm)離心各試管的內含物 10分鐘，以使DNA小球沉澱在試管底部上，並除去各試管中殘留的乙醇。隨後，用相同體積的70%乙醇洗滌小球，並以13，000轉/分鐘離心10分鐘，且除去各試管中殘留的乙醇。隨後，在空氣中乾燥DNA小球10分鐘。將蒸餾水添加到乾燥的小球中，並使其在室溫下靜置 10分鐘。隨後，使用吸液管再懸浮DNA小球，以使其能完全溶解於蒸餾水中。使用納諾多譜1000 (Nanodrop 1000)分光光度計(賽默科技公司(Thermo scientific))測量DNA的濃度，並進行瓊脂糖凝膠電泳以確定Rsr II, Pme I或Cla I限制性酶是否使載體DNA線性化。表達載體線性化表明，PCT107載體中連接到三個轉錄單元(重鏈基因、輕鏈基因和 dhfr基因)的polyA都變得不可操作。實例2 轉染到CHO細胞系中將根據實例1線性化的載體轉染到相同量的CHO DG44細胞中。進行下表1中所示對照組和測試組中的轉染。[表 1]
權利要求
1.一種通過使用表達載體來選擇高產量克隆的方法，所述表達載體包括(i)包括以不可操作方式連接到多聚腺苷酸化信號的選擇性標記基因的基因表達盒；以及(ii)編碼相關重組蛋白並且以可操作方式連接到多聚腺苷酸化信號的基因表達盒。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述表達載體包括用包括除去了多聚腺苷酸化信號的選擇性標記基因的基因表達盒來代替含有以不可操作方式連接到所述多聚腺苷酸化信號的所述選擇性標記基因的所述基因表達盒(i)。
3.一種用於選擇高產量克隆的方法，所述方法包括用限制性酶裂解表達載體，所述表達載體包括(i)包含以可操作方式連接到多聚腺苷酸化信號的選擇性標記基因的基因表達盒以及(ii)編碼相關重組蛋白並且以可操作方式連接到多聚腺苷酸化信號的基因表達盒，由此使所述表達載體線性化，以致所述基因表達盒(i)的所述多聚腺苷酸化信號不能操作。
4.根據權利要求1至3中任一權利要求所述的方法，其中所述選擇性標記基因是 dhfr (二氫葉酸還原酶)基因、穀氨醯胺合成酶基因、新黴素磷酸轉移酶基因、潮黴素B磷酸轉移酶基因、嘌呤黴素N-乙醯轉移酶(pac)基因或印度斯坦鏈異壁菌ble基因。
5.根據權利要求1至3中任一權利要求所述的方法，其中所述相關重組蛋白是單克隆抗體。
6.根據權利要求1至3中任一權利要求所述的方法，其中宿主細胞是真核宿主細胞。
7.根據權利要求6所述的方法，其中所述真核宿主細胞是人類宿主細胞，包含CHO細胞、雜交瘤細胞或F2N細胞。
8.—種表達載體，其包括(i)包括以不可操作方式連接到多聚腺苷酸化信號的選擇性標記基因的基因表達盒；以及(ii)編碼相關重組蛋白並且以可操作方式連接到多聚腺苷酸化信號的基因表達盒。
9.根據權利要求8所述的表達載體，其包括用包括除去了多聚腺苷酸化信號的選擇性標記基因的基因表達盒來代替包括以不可操作方式連接到所述多聚腺苷酸化信號的所述選擇性標記基因的所述基因表達盒(i)。
10.根據權利要求8所述的表達載體，其包括用供引入編碼所述相關重組蛋白的基因的多克隆位點來代替編碼所述相關重組蛋白並且以可操作方式連接到所述多聚腺苷酸化信號的所述基因表達盒(ii)。
11.根據權利要求8至10中任一權利要求所述的表達載體，其中所述選擇性標記基因是可擴增的選擇性標記基因。
12.根據權利要求11所述的表達載體，其中所述可擴增的選擇性標記基因是二氫葉酸還原酶基因或穀氨醯胺合成酶基因。
13.根據權利要求8至10中任一權利要求所述的表達載體，其中所述選擇性標記基因是穀氨醯胺合成酶基因、新黴素磷酸轉移酶基因、潮黴素B磷酸轉移酶基因、嘌呤黴素N-乙醯轉移酶基因或印度斯坦鏈異壁菌ble基因。
14.根據權利要求8至10中任一權利要求所述的表達載體，其中所述相關重組蛋白是單克隆抗體。
15.一種真核宿主細胞，其用根據權利要求8至10中任一權利要求所述的表達載體轉
16.根據權利要求15所述的真核宿主細胞，其為人類宿主細胞，包含CHO細胞、雜交瘤細胞或F2N細胞。
全文摘要
本發明涉及一種使用表達載體來選擇高效表達重組細胞系的方法，表達載體包括(i)包括以失活方式連接到多聚腺苷酸化信號的選擇性標記基因的基因表達盒；以及(ii)編碼以活性方式連接到多聚腺苷酸化信號的目標重組蛋白的基因表達盒。根據本發明的方法可用現有細胞系選擇方法中等於或少於1/10的細胞群選出高產量細胞克隆。具體說來，與增加甲氨蝶呤量及包括多個擴增相的常規相基因擴增策略相比較，本發明的方法使用較低密度的甲氨蝶呤來選擇高產量細胞克隆，以縮短細胞系的發育時間。本發明的方法使得在使用除甲氨蝶呤外的一般選擇性標記基因時，實現高效地產生蛋白質。
文檔編號C12N15/52GK102365364SQ201080013851
公開日2012年2月29日 申請日期2010年3月30日 優先權日2009年3月31日
發明者宋侑哲, 張珉碩, 曺明三, 李炫周, 金滿洙, 金鍾黙 申請人:株式會社斯特利恩