一種簡單、快速、高效的植物分子標記瓊脂糖凝膠電泳方法

2023-12-09 11:24:11 1

專利名稱：一種簡單、快速、高效的植物分子標記瓊脂糖凝膠電泳方法
技術領域：
本發明涉及一種簡單、快速且高效的瓊脂糖凝膠電泳檢測方法，該方法尤其適用於植物分子標記的檢測。
背景技術：
近年來，植物分子標記技術發展迅速，並在重要農藝性狀的遺傳作圖、基因定位、基因克隆、分子標記輔助育種、遺傳多樣性分析、親緣關係鑑定、雜種優勢機理預測等研究領域發揮了重要作用。目前，廣泛用於植物分子標記檢測技術體系包括聚丙烯醯胺凝膠和瓊脂糖凝膠電泳，二者均通過比較目標分子標記擴增條帶在凝膠上的遷移距離，而得知不同個體間在某個分子標記座位匕的長度多態性。但是，常規聚丙烯醯胺凝膠電泳從玻璃板的洗滌、晾乾、制膠、灌膠、凝固、電泳、染色到最後的顯色過程需要4~5小時，進行高通量實驗時費時、費力，嚴重影響整個實驗進展。儘管有一些經過改良的聚丙烯醯胺凝膠電泳方法報導，但依然存在著操作步驟多，時間長或解析度低等缺點。最近，國外雖有一些公司已開發出或JH在開發高效聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測儀，但由於儀器設備非常昂貴，難以在廣泛普及。
瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種雜聚多糖，是由D型和L型半乳糖以a-l,3和(3-1,4糖苷鍵交替相連形成的線狀高聚物。該多糖遇冷水膨脹，溶於熱水成溶膠，冷卻後可以形成具有剛性的濾孔凝膠，孔徑範圍從50nm到大於200nm之間，其大小決定於瓊脂糖的濃度，濃度越大濾孔孔徑越小。瓊脂糖凝膠電泳是以瓊脂凝膠作為支持物，利用核酸分子在高於其等電點的電泳緩衝液中的電荷效應和凝膠的分子篩效應，使得大小和構象不同的核酸分子的遷移率出現較大差異，從而達到分離的目的。
瓊脂糖凝膠因其親水性強、理化特性穩定且製備步驟非常簡單(配製不同濃度的凝膠時，只需稱取相應數量的瓊脂糖粉末溶解在一定體積的電泳緩衝液中，在沸水浴或微波爐中加熱充分融解，冷卻至50 6(TC'加入溴化乙錠(Ethidiura Bromide, EB)染色劑混勻，灌入水平膠模，待其充分凝固後即可進行電泳)而成為分離、鑑定和純化DNA片段最為簡便和常用的方法之一。瓊脂糖凝膠由於凝膠容易製作，實驗室中很少對其進行回收和重複利用，通常是在電泳結束、紫外凝膠成像系統記錄電泳結果後即被丟棄。這種做法一方面造成了瓊脂糖粉末和電泳緩衝液的大量浪費，顯著地增加了分析測試的成本；另一方面在製備凝膠的過程中所加入的EB是一種強致癌物質，長期接觸會對人體造成一定的傷害；最後，在處理含有EB的凝膠及電泳緩衝液時不僅給實驗室帶來不少麻煩，而且對環境也會造成極大的汙染。因此，發展和優化瓊脂糖凝膠電泳方法是一個值得特別關注的問題。

發明內容
本發明的目的是為了解決上述瓊脂糖凝膠電泳中存在的難題而提出的一種具有廣泛適用性尤其適用於高通量植物SSR標記位點遺傳變異檢測的快速、高效的瓊脂糖凝膠電泳方法。所述方法包括對經過瓊脂糖凝膠電泳檢測後的凝膠進行進一步處理的步驟，具體如下，在上一輪的檢測之後，將已記錄好圖像的凝膠放置在電泳槽中，接通電源將DNA樣品跑出膠外，對凝膠進行洗滌，以去除對下一輪電泳檢測的幹擾；然後進行染膠步驟，將洗滌完後的凝膠浸泡在含有終濃度為0.5叫/ml EB的電泳緩衝溶液中2小時，所述凝膠經過上述處理後即可用於下一輪對下一個分子標記PCR產物的檢測。
可選擇的，為了操作方便，將已記錄好圖像的凝膠用小手術刀在點樣孔上方沿著與點樣孔平行的方向將凝膠切割成四個均等的25X4.5 cm左右的長條，注意保持點樣孔的完整性，將其平行等距離放臂在電泳槽中。
可選擇的，所述瓊脂糖凝膠電泳檢測包括制膠、電泳、檢測步驟，制膠過程如下，準備好膠模，凝膠託盤的規格25X20cm，等距離平行插四排梳子，稱取7.5g瓊脂糖粉末至500ml的三角錐瓶中，加入250ml0.5XTBE電泳緩衝溶液中，搖勻，在微波爐中加熱至瓊脂糖完全
熔化成為溶膠，冷卻至60。C以下，再在瓶中加入50pl終濃度為0.5(ig/ml的EB，充分混勻，
將溶膠倒入膠模，凝固後即成為凝膠；電泳過程如下，小心拔出插在凝膠中的梳子，將凝M放入電泳槽中，加入0.5XTBE電泳緩衝溶液至液面覆蓋凝膠l-2mm，用移液排槍吸取4.5 pl的含上樣緩衝液的PCR產物小心加入梳子孔，待所有樣品上完樣後，接通電源，調節電壓至4-5V/cm，核酸分子從負極移到」下極，待上樣緩衝液跑到合適位置時，停止電泳，約需45-60min;檢測過程如下，將電泳完畢的瓊脂糖凝膠置於凝膠自動成像系統的平臺中間，打開紫外光，可見到發出螢光的DNA條帶，在電腦中觀察並保存圖像。
凝膠在經過所述處理後，能夠循環使用， 一塊凝膠可以重複利用IO次以上，依然能確保電泳條帶清晰，解析度高，重複性好。
本發明所述瓊脂糖凝膠電泳方法是對已使用過的瓊脂糖凝膠進行進一步跑膠、洗漆、染色等處理，實現凝膠的重複利用，從而滿足了高通量植物SSR標記位點遺傳變異的快速檢測。本發明提出的快速、高效的瓊脂糖凝膠電泳方法，是利用瓊脂糖凝膠的親水性、理化結構的穩定性和高解析度而形成的一種新的瓊脂糖凝膠電泳方法，該方法對植物並沒有特異性， 只要被研究的植物有需要通過電泳分離的分子標記，均可以採用該方法將所研究的個體基因 型區分開來，故具有廣泛的適用性。
本發明所述高通量植物SSR標記位點遺傳變異的快速檢測是按照以下操作步驟完成的 首先提取植物基因組DNA備用；然後開發和合成該植物中分子標記，利用這些引物對不同 群體或群體內不同個體的基因組DNA進行PCR擴增(聚合酶鏈式反應)，擴增產物在3%的 含有EB的瓊脂糖凝膠(凝膠託盤的規格為25X20 cm，四排梳子)上電泳檢測，用紫外凝膠
成像系統記錄電泳結果，旨輪電泳結束；將已終止電泳的凝膠用小手術刀在點樣孔上方沿著 與點樣孔平行的方向逐行將凝膠切割成四個均等的長條(25X4.5 cm，注意保持點樣孔的完
整性)，將長形凝膠平行放置在電泳槽中，接通電源繼續電泳對凝膠進行洗滌，直至凝膠中的 DNA樣品跑出膠外，以去除對下一次PCR產物檢測的幹擾；最後，將洗滌完的凝膠浸泡在
含有終濃度為0.5 pg/ml EB的電泳緩衝溶液中2個小時，即可重複利用，進行下一輪PCR產 物的檢測。由於凝膠能夠多次重複利用，從而實現了高通量植物SSR標記位點遺傳變異的快 速檢測。
本發明的有益效果
(1) 克服了國內實驗室現行的瓊脂糖凝膠電泳方法中存在著試劑藥品的過度浪費、染色劑對人 體的危害、以及凝膠和電泳緩衝液的廢棄物對環境產生極大汙染的缺點，大大提高了瓊脂 糖凝膠和電泳緩衝液的利用效率，節約了人力和成本。分析不同標記時不需重新製備凝膠， 一塊膠至少可重複利用10次，進行IO個以上標記的檢測，僅需4元左右的瓊脂糖粉，而 常規檢測需花費40元以上，節省了 IO倍以上的成本。
(2) 通過對凝膠的洗滌和染膠，避免了在多次重複利用凝膠時樣品間的交叉汙染及EB濃度的 降低導致成像模糊不清。經過洗滌和染色過的凝膠，電泳條帶清晰，解析度高，重複性好。
(3) 鑑定快速，用300個SSR標記分析一個包括200個株系的植物分離群體的遺傳變異僅需 1.5個月的時間。本發明採用改進的瓊脂糖凝膠電泳方法大大簡化凝膠製作步驟，顯著提 高了檢測效率，廣泛適用於植物遺傳作圖、基因定位和克隆、分子標記輔助育種、遺傳多 樣性分析等領域的SSR分子標記檢測。
綜上所述，本發明對電泳後的瓊脂糖凝膠進行跑膠、洗滌和染色後再度利用，並通過對 高粱分離群體進行大量SSR分子標記加以驗證，大大減少了瓊脂糖粉末和電泳緩衝液的使用， 節省了製備凝膠的時間、人力和物力，同時也保證了高質量的分辨效果和可重複性。相比利 用聚丙烯醯胺凝膠電泳法對植物分離群體進行大量分子標記檢測具有較大的時間和成本優勢。這個平臺的建立，不僅能夠為研究者提供有關植物遺傳作圖、分子標記輔助育種和種質 資源遺傳多樣性分析等領域中的高效SSR分子標記瓊脂糖凝膠電泳檢測方法，而且還可創建 一個資源節約型和環境友好型的實驗室。同時本發明拓展了瓊脂糖凝膠電泳的功用效能和應 用範圍，具有極大商業價值，商家可以在此發明的基礎上為滿足市場需求可直接製備並出售 不同瓊脂糖濃度的預製凝膠。


圖1:本發明所述瓊脂糖凝膠電泳方法用於植物分子標記檢測時的流程圖2:顯示第一輪第一個引物對的瓊脂糖凝膠電泳結果；
圖3:顯示第二輪第二個引物對的瓊脂糖凝膠電泳結果；
圖4:顯示第三輪第三個引物對的瓊脂糖凝膠電泳結果；
圖5:顯示第四輪第四個引物對的瓊脂糖凝膠電泳結果；
圖6:顯示第五輪第五個引物對的瓊脂糖凝膠電泳結果；
圖7:顯示第六輪第六個引物對的瓊脂糖凝膠電泳結果；
圖8:顯示第七輪第七個引物對的瓊脂糖凝膠電泳結果；
圖9:顯示第八輪第八個引物對的瓊脂糖凝膠電泳結果；
圖10:顯示第九輪第九個引物對的瓊脂糖凝膠電泳結果；
圖ll:顯示第十輪第十個引物對的瓊脂糖凝膠電泳結果。
具體實施方案
為了充分公開本發明的簡單快速瓊脂糖凝膠電泳方法，以下通過實施例對本發明作進一
步的詳細說明
1. 植物DNA樣品的提取發明中所採用的植物為禾本科高粱屬的高粱重組自交系分離
群體，用改良的CTAB小樣法提取各株系葉片的總DNA。
2. PCR體系的設置PCR體系15^1，反應液組成為10xBuffer1.5 pl， MgCl2 (25 mmol/L) 0.9|al,dNTP(10mmol/L )1.2^1,模版DNA(20ng/^1)2.5 pl，高粱SSR正反向引物(IO pmol/L) 各0.2(xl， r叫DNA聚合酶(5U/|_il) 0.1 (TaKaRa生產)，滅菌ddH20 8.4 pl。
3. PCR條件的設定與運行PCR反應程序為94。C預變性5min; 94。C變性30s， 55°C 退火30s， 72。C延伸45s; 35個循環；最後72。C延伸10 min， 4'C保存。
4. PCR產物的檢測使用本發明所述的瓊脂糖凝膠電泳方法對PCR產物進行檢測。
本發明所涉及的瓊脂糖凝膠電泳方法是對已使用過的瓊脂糖凝膠進一步進行跑膠、洗滌、染色處理，重複利用凝膠來實現的，其具體操作方法如下
(1) 制膠準備好膠模，凝膠託盤的規格25X20 cm，等距離平行插四排梳子。稱取將 7.5g瓊脂糖粉末至500ml的三角錐瓶中，加入250ml0.5XTBE電泳緩衝溶液中，搖勻。在微 波爐中加熱至瓊脂糖完全熔化成為溶膠，冷卻至6(TC以下，再在瓶中加入50pl EB (終濃度
0.5pg/ml)充分混勻，將溶膠倒入膠模，凝固後即成為凝膠。
(2) 電泳小心拔出插在凝膠中的梳子，將凝膠放入電泳槽中，加入0.5XTBE電泳緩 衝溶液至液面覆蓋凝膠l-2mm。用移液排槍吸取4.5 pl的含上樣緩衝液的PCR產物小心加入 梳子孔，待所有樣品上完樣後，接通電源，調節電壓至4-5V/cm，核酸分子從負極移到正極。 待上樣緩衝液跑到合適位置時，停止電泳，約需45-60min。
(3) 檢測將電泳完畢的瓊脂糖凝膠置於凝膠自動成像系統的平臺中間，打開紫外光， 可見到發出螢光的DNA條帶，在電腦中觀察並保存圖像，首輪檢測結束。
(4) 洗滌將已記錄好圖像的凝膠用小手術刀在點樣孔上方沿著與點樣孔平行的方向將 凝膠切割成四個均等的長條(25X4.5 cm)，注意保持點樣孔的完整性，平行等距離放置在電 泳槽中，接通電源將DNA樣品跑出膠外，對凝膠進行洗滌，以去除對下一次電泳的幹擾。
(5) 染膠將洗滌完後的凝膠浸泡在含有終濃度為0.5 pg/mlEB的電泳緩衝溶液中2小 時，即可用於對下一個分子標記PCR產物的檢測，如此循環往復。
5.瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖2顯示了第一輪電泳的結果；圖3 — 11顯示了依次使用 經過上述處理後的凝膠所進行的第二輪到第十輪瓊脂糖凝膠電泳的結果。經驗證， 一塊凝膠 可以重複利用至少10次，依然能確保電泳條帶清晰，解析度高，重複性好。
權利要求
1.一種簡單快速，適用於高通量植物SSR標記位點遺傳變異快速檢測的瓊脂糖凝膠電泳方法，所述方法包括對經過瓊脂糖凝膠電泳檢測後的凝膠進行進一步處理的步驟，具體如下，在上一輪的檢測之後，將已記錄好圖像的凝膠放置在電泳槽中，接通電源將DNA樣品跑出膠外，對凝膠進行洗滌，以去除對下一輪電泳檢測的幹擾；然後進行染膠步驟，將洗滌完後的凝膠浸泡在含有終濃度為0.5μg/ml EB的電泳緩衝溶液中2小時，所述凝膠經過上述處理後即可用於下一輪對下一個分子標記PCR產物的檢測。
2. 根據權利要求l所述方法，為了操作方便，將已記錄好圖像的凝膠用小手術刀在點樣孔上方沿著與點樣孔平行的方向將凝膠切割成四個均等的25X4.5 cm左右的長條，注意保持點樣孔的完整性，將其平行等距離放置在電泳槽中。
3. 根據權利要求1所述方法，其中所述瓊脂糖凝膠電泳檢測包括制膠、電泳、檢測步驟，制膠過程如下，準備好膠模，凝膠託盤的規格25X20 cm,等距離平行插四排梳子，稱取7.5g瓊脂糖粉末至500ml的三角錐瓶中，加入250ml 0.5XTBE電泳緩衝溶液中，搖勻，在微波爐中加熱至瓊脂糖完全熔化成為溶膠，冷卻至60°C以下，再在瓶中加入5(^1終濃度為0.5 pg/ml的EB，充分混勻，將溶膠倒入膠模，凝固後即成為凝膠；電泳過程如下，小心拔出插在凝膠中的梳子，將凝膠放入電泳槽中，加入0.5XTBE電泳緩衝溶液至液面覆蓋凝膠l-2mm，用移液排槍吸取4.5 W的含上樣緩衝液的PCR產物小心加入梳子孔，待所有樣品上完樣後，接通電源，調節電壓至4-5V/cm，核酸分子從負極移到正極，待上樣緩衝液跑到合適位置時，停止電泳，約需45-60min;檢測過程如下，將電泳完畢的瓊脂糖凝膠置於凝膠自動成像系統的平臺中間，打開紫外光，可見到發出螢光的DNA條帶，在電腦中觀察並保存圖像。
4. 根據權利要求l所述方法，凝膠在經過所述處理後，能夠循環使用， 一塊凝膠可以重複利用至少10次，依然能確保電泳條帶清晰，解析度高，重複性好。
5. 根據權利要求l一4任一項所述的方法，當用於高通量植物SSR標記位點遺傳變異快速檢測時，進一步包括提取植物基因組DNA備用、開發和合成該植物中分子標記，和利用這些引物對不同群體或群體內不同個體的基因組DNA進行PCR擴增的步驟。
全文摘要
本發明提供了一種簡單快速，適用於高通量植物SSR標記位點遺傳變異快速檢測的瓊脂糖凝膠電泳方法，方法包括對經過瓊脂糖凝膠電泳檢測後的凝膠進行進一步處理的步驟，凝膠經過處理後即可用於下一輪對下一個分子標記PCR產物的檢測。凝膠在經過處理後，能夠循環使用，一塊凝膠可以重複利用10次以上，依然能確保電泳條帶清晰，解析度高，重複性好。從而實現了高通量植物SSR標記位點遺傳變異的快速檢測，同時克服了國內實驗室現行的瓊脂糖凝膠電泳方法中所存在著的試劑藥品過度浪費、染色劑對人體的危害、以及凝膠和電泳緩衝液的廢棄物對環境產生極大汙染的缺點，大大提高了瓊脂糖凝膠和電泳緩衝液的利用效率，節約了人力和成本。
文檔編號G01N27/447GK101671731SQ20091016039
公開日2010年3月17日 申請日期2009年8月5日 優先權日2009年8月5日
發明者松 嚴, 餘傳漲, 華 王, 翟國偉, 鄒桂花, 陶躍之 申請人:鄒桂花